ES2225844T3 - Envase con una composicion polifasica para uso en aplicaciones diagnosticas y terapeuticas. - Google Patents

Envase con una composicion polifasica para uso en aplicaciones diagnosticas y terapeuticas.

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ES2225844T3
ES2225844T3 ES95927429T ES95927429T ES2225844T3 ES 2225844 T3 ES2225844 T3 ES 2225844T3 ES 95927429 T ES95927429 T ES 95927429T ES 95927429 T ES95927429 T ES 95927429T ES 2225844 T3 ES2225844 T3 ES 2225844T3
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Terry O. Matsunaga
David Yellowhair
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Abstract

SE MUESTRA UN CONTENEDOR QUE INCLUYE UNA SUSPENSION LIPIDICA ACUOSA Y UNA FASE GASEOSA BASICAMENTE SEPARADAS DE LA FASE ESTABILIZANTE ACUOSA, UTIL EN LA VISUALIZACION DIAGNOSTICA COMO LA RESONANCIA ULTRASONICA Y MAGNETICA Y EN APLICACIONES TERAPEUTICAS.

Description

Envase con una composición polifásica para uso en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.
La presente invención se refiere a envases que comprenden componentes que forman liposomas tras agitación, útiles para el diagnóstico por imagen.
Antecedentes de la invención
Los ultrasonidos son una técnica de diagnóstico por imagen que proporciona numerosas ventajas significativas frente a otra metodología diagnóstica. A diferencia de técnicas de diagnóstico por imagen como la medicina nuclear y los rayos X, los ultrasonidos no exponen el paciente a los efectos dañinos de la radiación ionizante. Más aún, los ultrasonidos son relativamente baratos y pueden llevarse a cabo como examen portátil.
En la ecografía, el sonido se transmite al interior de un paciente o animal mediante un transductor. Cuando las ondas de sonido se propagan a través del cuerpo, encuentran interfases entre los tejidos y los fluidos. Dependiendo de las propiedades acústicas de los tejidos y fluidos del cuerpo, las ondas de sonido ultrasónico se reflejan de forma parcial o completa, o bien se absorben. Cuando las ondas de sonido se reflejan en una interfase, se detectan mediante el receptor sito en el transductor, y se procesan para formar una imagen. Las propiedades acústicas de los tejidos y fluidos del interior del cuerpo determinan el contraste que aparece en la imagen resultante. El documento WO 94/5780 describe liposomas gaseosos rellenos de precursor que son útiles, por ejemplo, en aplicaciones de imagen por ultrasonidos.
La tomografía por resonancia magnética (MRI) es una técnica de imagen relativamente novedosa que, a diferencia de los rayos X, no utiliza radiación ionizante. Similar a la tomografía computerizada, la MRI puede obtener imágenes de seccionas del cuerpo, sin embargo, la MRI tiene la ventaja adicional de ser capaz de tomar imágenes en cualquier plano de escaneo (es decir, axial, coronal, sagital u ortogonal).
La MRI emplea un campo magnético, energía de radiofrecuencia y gradientes de campo magnético para capturar imágenes del cuerpo. El contraste, o las diferencias de intensidad de la señal entre los tejidos, reflejan principalmente los valores de relajación T1 y T2 así como la densidad de protones (de forma efectiva, el contenido en agua libre) de los tejidos.
Se han realizado avances en años recientes en las tecnologías de diagnóstico por ultrasonidos y MRI. Sin embargo, a pesar de las diferentes mejoras tecnológicas, los ultrasonidos y la MRI siguen siendo herramientas imperfectas en diferentes aspectos, particularmente en relación con las imágenes y detección de enfermedades en el hígado y bazo, riñones, corazón y sistema vascular, incluyendo la medida del flujo sanguíneo. La capacidad de detectar estas regiones y realizar dichas medidas depende de las diferencias en las propiedades acústicas (ultrasonido) o intensidad de las señales T1 y T2 (MRI) entre los tejidos o fluidos y los tejidos o fluidos circundantes. De acuerdo con ello, se ha sugerido el uso de agentes que incrementen estas diferencias entre tejidos o fluidos y los tejidos o fluidos circundantes. Como resultado de este esfuerzo se han desarrollado nuevos y mejores agentes de contraste. Sin embargo, un problema recurrente con muchos de estos agentes de contraste es la estabilidad durante el periodo de almacenamiento, haciendo que el almacenaje a largo plazo sea un problema.
La presente invención se dirige a estos y otros puntos de interés proporcionando un envase apropiado que comprende una fase acuosa de lípido en suspensión, y una fase gaseosas separada sustancialmente de la fase acuosa de lípido en suspensión que, tras agitación antes de uso, produce un excelente agente de contraste de liposomas rellenos de gas aptos para uso en aplicaciones tales como diagnóstico por ecografía o tomografía de resonancia magnética, así como para otros usos. Puesto que el agente de contraste se prepara inmediatamente antes del uso, se evitan los problemas de estabilidad durante el periodo de almacenamiento.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un envase sellado que contiene en su interior una composición estéril que comprende una fase acuosa de lípidos en suspensión con una cámara de gas sustancialmente separada que contiene un gas sustancialmente insoluble combinado con un gas soluble, la mencionada fase acuosa de lípido en suspensión comprende fosfolípidos, y dicha composición estéril, tras agitación antes del uso, produce liposomas rellenos de gas para uso como agente de contraste. La capacidad de acuerdo con la presente invención para preparar el agente de contraste inmediatamente antes de usar evita problemas de estabilidad durante el periodo de almacenamiento que se experimentan con la mayor parte de los agentes de contraste. La unidad autocontenida de la invención también permite una esterilización sencilla.
Estos y otros aspectos y ventajas de la presente invención se describirán con más detalle a continuación.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una vista en sección lateral de un envase relleno con una suspensión acuosa de lípidos y una cámara de gas substancialmente separada.
La Figura 2 es un diagrama de un dispositivo de agitación que puede emplearse para agitar el envase de la Figura 1, mezclando de esta forma la suspensión acuosa de lípido y el gas, y produciendo un agente de contraste para ecografía o tomografía de resonancia magnética.
La Figura 3 es una fotomicrografía de liposomas rellenos de gas producidos usando el envase mostrado en la Figura 1 y el dispositivo de agitación mostrado en la Figura 2.
Descripción detallada de la invención
El envase de la presente invención comprende una fase acuosa de lípido en suspensión, y una fase gaseosa sustancialmente separada. Antes del uso, el envase y su contenido se agitan, haciendo que las fases de lípido y gas se mezclen, dando como resultado la formación de liposomas rellenos de gas que atrapan el gas. Los liposomas rellenos de gas resultantes proporcionan un excelente agente para la mejora del contraste en imágenes para diagnóstico, en particular el diagnóstico por ecografía o resonancia magnética.
Pueden emplearse una amplia variedad de lípidos en la fase acuosa de lípido en suspensión. Los lípidos pueden ser saturados o insaturados, y pueden estar en forma linear o ramificada, como se desee. Dichos lípidos pueden comprender, por ejemplo, moléculas de ácidos grasos que contienen una amplia variedad de átomos de carbono, preferiblemente entre 12 átomos de carbono y aproximadamente 22 átomos de carbono. Los grupos de hidrocarburos que consisten en unidades isoprenoides, grupos frenilo, y/o fracciones de esterol (por ejemplo, colesterol, sulfato de colesterol, y análogos de los anteriores adecuados para lo mismo) pueden emplearse igualmente. Los lípidos pueden también contener cadenas poliméricas, tales como los polímeros anfitéticos polietilénglicol (PEG) o polivinilpirrolidona (PVP) o derivados de los anteriores adecuados para lo mismo (para administración objetiva in vivo), o aminoácidos cargados tales como polilisina o poliarginina (para enlazar un compuesto de carga negativa), o hidratos de carbono (para administración objetiva in vivo), tales como se describe en la Patente de los Estados Unidos nº 4.310.505, o glicolípidos (para administración objetiva in vivo), etc, según se desee, o anticuerpos y otros péptidos y proteínas (para administración objetiva in vivo), como se desee. Dichos compuestos enlazantes o para administración objetiva puede añadirse simplemente a la fase acuosa de lípido en suspensión o puede estas específicamente ligada de forma química a los lípidos. Los lípidos también pueden ser lípidos aniónicos o catiónicos, si se desea, de forma que pueden ellos mismos ser capaces de enlazar otros compuestos tales como compuestos farmacéuticos, material genético, u otros elementos terapéuticos.
Entre los ejemplos de clases de lípidos adecuados y lípidos específicos se incluyen: fosfatidilcolinas, tales como dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), y distearoilfosfatidilcolina; fosfatidiletanolaminas, tales como dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dioleoilfosfatidiletanolamina y N-succinil-dioleil-fosfatidil etanolamina; fosfatidilserinas; fosfatidilgliceroles; esfingolípidos; glicolípidos, tales como el gangliósido GM1; glucolípidos; sulfátidos; glicoesfingolípidos; ácidos fosfatídicos, tales como el ácido dipalmitoil fosfatídico (DPPA); ácidos grasos palmíticos; ácidos grasos esteáricos; ácidos grasos miristoléicos; ácidos grasos lauroleicos; ácidos grasos fisetéricos; ácidos gradomiristoleicos; ácidos gradopalmitoleicos; ácidos gradopetroselínicos; ácidos grasos oleicos; ácidos grasos isoláuricos, ácidos grasos isomirísticos; ácidos grasos isopalmiticos; ácidos grasos isosteáricos; colesterol derivados de colesterol, tales como hemisuccinato de colesterol, sulfato de colesterol, y colesteril-4(4'-trimetilamonio)-butanoato; ésteres de ácido graso de polioxietileno; alcoholes de ácido graso de polioxietileno; éteres de alcohol de ácido graso de polioxietileno; ésteres de ácido graso de sorbitán polioxietilenado; oxiestearato de glicerol de polietilén glicol; ricinoleato de glicol de polietilén glicerol; esteroles etoxilados de soja; aceite de castor etoxilado; polímeros de ácido graso de polioxietileno-polioxipropileno; estearatos de ácido graso de polioxietileno; ácido 12-(((7'-dietilaminocumarina-3-ilo)-carbonilo)-metilamino)-octadecanoico; ácido N-[(((7'-dietilamino-cumarina-3-ilo)-carbonilo)metil-amino) octadecanoilo]-2-amino-palmítico; 1,2-dioleil-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol; 1,3-dipalmitoil-2-succinil-glicerol; y 1-hexadecil-2-palmitoil-glicerofosfoetanolamina y palmitoilhomocisteína; bromuro de lauriltrimetil amonio (laurilo- = docecilo-); bromuro de cetiltrimetil amonio (cetilo- = hexadecilo-); bromuro de miristiltrimetil amonio (miristilo- = tetradecilo-); cloruros de alquildimerilbencil amonio, tales como aquellos en los que alquilo es un alquilo C_{12}, C_{14} o C_{16}; bromuro de bencildimetiltetradecil amonio; cloruro de bencildimetildocecil amonio, cloruro de bencildimetilhexadecil amonio, bromuro de bencildimetilhexadecil amonio, cloruro de bencildimetilhexadecil amonio; bromuro de bencildimetiltetradecil amonio, cloruro de bencildimetiltetradecil amonio, bromuro de cetildimetiletil amonio, cloruro de cetildimetiletil amonio, bromuro de cetilpiridinio, cloruro de cetilpiridinio; cloruro de N-[(1-2,3-dioleoiloxi)-propil]-N,N,N-trimetil amonio (DOTMA); 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP); y 1,2-dioleoil-e-(4'-trimetiolamonio)-butanoil-sn-glicerol (DOTB).
Como será evidente para aquellos expertos en la técnica, una vez vista la descripción real, la lista anterior de lípidos es sólo a modo de ejemplo, y pueden emplearse otros lípidos útiles, ácidos grasos, y derivados y combinaciones de los anteriores adecuados para lo mismo, y también se pretende que dichos compuestos adicionales entren dentro del alcance del término lípido, tal como se emplea en la presente invención. Tal como reconocerá el técnico experto, dichos lípidos y/o combinaciones de los anteriores adecuados para lo mismo pueden, tras agitación del envase, formar liposomas (esto es, esferas de lípidos que tienen un hueco en el interior) que atrapen el gas de la fase gaseosa en su espacio interno. Los liposomas pueden estar comprendido entre una única capa de lípido (una monocapa de lípido), dos capas de lípidos (una bicapa de lípidos) o más de dos capas de lípidos (una multicapa de lípidos).
Como caso general, se prefiere que los lípidos permanezcan en estado de gel, esto es, por debajo de la temperatura de transición (T_{m}) del estado de gel al estado de fase de cristal líquido, de forma particular durante la agitación. Las temperaturas de transición (T_{m}) del estado de gel al estado de fase de cristal líquido son bien conocidas. Dichas temperaturas pueden también calcularse de manera sencilla mediante técnicas bien conocidas. La Tabla 1 siguiente, de Derek Marsh "CRC Handbook de Lipid Bilayers", página 139 CRC Press, Boca Raton, Florida (1990), muestra, por ejemplo, las temperaturas principales de cambio de fase para diferentes lípidos de fosfocolina representativos.
TABLA 1 Diacil-sn-glicero-(3)-fosfocolinas saturadas: Transiciones de fusión de la cadena principal
Nº de átomos de carbono en las cadenas Transición de fase principal
de acilo Temperatura, ºC
1,2 - (12:0) -1,0
1,2 - (13:0) 13,7
1,2 - (14:0) 23,5
1,2 - (15:0) 34,5
1,2 - (16:0) 41,4
1,2 - (17:0) 48,2
1,2 - (18:0) 55,1
1,2 - (19:0) 61,8
1,2 - (20:0) 64,5
1,2 - (21:0) 71,1
1,2 - (22:0) 74,0
1,2 - (23:0) 79,5
1,2 - (24:0) 80,1
En una forma preferida de realización de la invención, la fase de lípido acuoso además comprende un polímero, de forma preferible un polímero anfipático y de forma preferible uno que esté enlazado directamente (es decir, ligado de manera química) al lípido. De forma preferible, el polímero anfipático es polietilénglicol o un derivado adecuado para lo mismo. La combinación más preferida es el lípido dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) enlazado a polietilén glicol (PEG), especialmente (PEG) de peso molecular medio de aproximadamente 5.000 (DPPE-PEG5000). El PEG u otro polímero puede estar ligado al DPPE o a otro lípido a través de un enlace covalente, como a través de una unión con amida, carbamato o amina. Alternativamente, pueden usarse uniones éter, éster, tioéster, tioamida o disulfuro (tioéster) con el PEG u otro polímero para enlazar el polímero a, por ejemplo, colesterol u otros fosfolípidos. Una combinación de lípidos particularmente preferida es DPPC, DPPE-PEG5000 y DPPA, especialmente en una relación de aproximadamente 82%:8%:10% (% en moles) de DPPC, DPPE-PEG5000 y DPPA.
Para preparar la fase acuosa, el lípido puede combinarse con agua (preferiblemente agua destilada), solución salina normal (suero fisiológico), solución salina tamponada con fosfato, u otra solución acuosa, tal como será evidente para los que sean expertos en la técnica.
Pueden emplearse una amplia variedad de gases diferentes en la fase gaseosa de la presente invención. De forma preferible, los gases son sustancialmente insolubles en la fase acuosa con lípidos en suspensión. Por sustancialmente insoluble se indica que el gas mantiene una solubilidad en agua a 20ºC y 1 atmósfera de presión igual o inferior a aproximadamente 18 ml de gas por kg de agua, que es inferior a la solubilidad del nitrógeno gaseoso. De esta forma, los gases sustancialmente insolubles tienen una solubilidad inferior a la solubilidad del nitrógeno gaseoso, preferiblemente, la solubilidad es igual o inferior a aproximadamente 15 ml de gas por kg de agua, más preferible igual o inferior a menos de aproximadamente 10 ml de gas por kg de agua, a 20ºC y 1 atmósfera de presión. En una clase preferible de gases, la solubilidad está comprendida entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 18 ml de gas por kg de agua, o entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1,5 ml de gas por kg de agua, o entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg de gas por kg de agua, o entre aproximadamente 1, y aproximadamente 8 mg gas por kg de agua, o entre aproximadamente 2 y 6 ml por kg -de agua, a la temperatura y presión anteriormente mencionadas. Los gases de perfluorocarburo y el gas fluorado hexafluoruro de azufre son, por ejemplo, menos solubles que 10 ml de gas por kg de agua, a 20ºC y 1. atmósfera de presión, y esto se prefiere. Los gases que no sean sustancialmente insolubles tal como se define en la presente invención, se consideran gases solubles.
Otros gases adecuados sustancialmente insolubles o solubles incluyen, pero no se limitan a, hexafluoroacetona, isopropil acetileno, aleno, tetrafluoroaleno, trifluoruro de boro, 1,2-butadieno, 1,3-butadieno, 1,2,3-triclorobutadieno, 2-fluoro-1,3-butadieno, 2-metil-1,3 butadieno, hexafluoro-1,3-butadieno, butadiino, 1-fluorobutano, 2-metilbutano, decafluorobutano (perfluorobutano), decafluoroisobutano (perfluoroisobutano), 1-buteno, 2-buteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-buteno, perfluoro-1-buteno, perfluoro-1-buteno, perfluoro-2-buteno, 4-fenil-3-buteno-2-ona, 2-metil-1-buteno-3-ino, nitrato de butilo, 1-butino, 2-butino, 2-cloro-1,1,1,4,4,4-hexafluoro-butino, 3-metil-1-butino, perfluoro-2-butino, 2-bromo-butiraldehido, sulfuro de carbonilo, crotonitrilo, ciclobutano, metilciclobutano, octafluorociclobutano {perfluorociclobutano}, perfluoroisobutano, 3-clorociclopenteno, ciclopropano, 1,2-dimetilciclopropano, 1,1-dimetilciclopropano, etil ciclopropano, metilciclopropano, diacetileno, 3-etil-3-metildiaziridina, 1,1,1-trifluorodiazoetano, dimetilamina, hexafluorodimetilamina, dimetiletilamina, bis-(dimetil fosfina) amina, 2,3-dimetil-2-norbornano, perfluoro-dimetilamina, cloruro de dimetiloxonio, 1,3-dioxolano-2-ona, 1,1,1,1,2-tetrafluoroetano, 1,1,1-trifluoroetano, 1,1,2,2-tetrafluoroetano, 1,1,2-tricloro-1,2,2-trifluoroetano, 1,1-dicloroetano, 1,1-dicloro-1,2,2,2-tetrafluoroetano, 1,2-difluoroetano, 1-cloro-1,1,2,2,2-pentafluoroetano, 2-cloro-1,1-difluoroetano, 1-cloro-1,1,2,2-tetrafluoro-etano, 2-cloro-1,1-difluoroetano, cloroetano, cloro-pentafluoroetano, diclorotrifluoroetano, fluoroetano, nitropentafluoroetano, nitrosopentafluoro-etano, perfluoroetano, perfluoroetilamina, etil vinil éter, 1,1-dicloroetileno, 1,1-dicloro-1,2-difluoro-etileno, 1,2-difluoroetileno, metano, metano-sulfonil-cloruro-trifluoro, metano-sulfonil-fluoruro-trifluoro, metano-(pentafluorotio)trifluoro, metano-bromo-difluoro-nitroso, metano-bromo-fluoro, metano-bromo-cloro-fluoro, metano-bromo-trifluoro, metano-cloro-difluoro-nitro, metano-cloro-dinitro, metano-cloro-fluoro, metano-cloro-trifluoro, metano-cloro-difluoro, metano-dibromo-difluoro, metano-dicloro-difluoro, metano-dicloro-fluoro, metano-difluoro, metano-difluoro-iodo, metano-disilano, metano-fluoro, metano-iodometano-iodo-trifluoro, metano-nitro-trifluoro, metano-nitroso-trifluoro, metano-tetrafluoro, metano-tricloro-fluoro, metano-trifluoro, metanosulfenilcloruro-trifluoro, 2-metil butano, metil éter, metil isopropil éter, lactato de metilo, nitrito de metilo, sulfuro de metilo, metil vinil éter, neopentano, nitrógeno (N_{2}), óxido nitroso, ácido 1,2,3-nonadecanetricarboxílico 2-hidroxitrimetil éster, 1-nonano-3-ino, oxígeno (O_{2}), oxígeno 17 (^{17}O_{2}), 1,4-pentadieno, n-pentano, dodecafluoropentano (perfluoropentano), tetradecafluorohexano (perfluorohexano), perfluoroisopentano, perfluoroneopentano, 2-pentanona-4-amino-4-metil, 1-penteno, 2-penteno {cis}, 2-penteno {trans}, 1-penteno-3-bromo, 1-penteno-perfluoro, ácido tetracloroftálico, 2,3,6-trimetilpiperidina, propano, propano-1,1,1,2,2,3-hexafluoro, propano-1,2-epoxi, 2,2-difluoropropano, 2-aminopropano, -2-cloropropano, heptafluoro de 1-nitro propano, heptafluoro de 1-nitroso propano, perfluoropropano, propeno/propilo 1,1,1,2,3,3-hexafluoro-2,3 dicloro, 1-cloro propileno, cloro-propileno {trans}, 2-cloro-propileno, 3-fluoro-propileno, perfluoropropileno, propino, 3,3,3-trifluoro-propino, 3-fluoro-estireno, hexafluoruro de azufre, decafluoro de diazufre (S_{2}F_{10}), 2,4-diamino tolueno, trifluoroacetonitrilo, peroxido de trifluorometilo, sulfuro de trifluorometilo, hexafluoruro de tungsteno, vinil acetileno, vinil éter, neón, helio, kriptón, xenón (especialmente gas xenón hiperpolarizado enriquecido con rubidio), dióxido de carbono, helio, y aire. Se prefieren los gases fluorados, (esto es, un gas que contiene una o más moléculas de flúor, tales como hexafluoruro de azufre), gases de fluorocarburo (esto es, un gas fluorado que es un carbono fluorado), y gases de perfluorocarburo (esto es, un gas de fluorocarburo que está completamente fluorado, tal como perfluoropropano y perfluorobutano).
Aunque virtualmente se puede usar de manera teórica en la fase gaseosa de la presente invención, puede elegirse un gas en particular para optimizar las propiedades deseadas del medio de contraste resultante para ajustarse a la aplicación de diagnostico concreta. Se ha encontrado, por ejemplo, que algunos gases producen liposomas rellenos de gas más estables tras al agitado que otros gases, y se prefieren dichos gases. También se ha encontrado que algunos gases proporcionan mejores resultados de imagen en diagnóstico por imagen tal como ecografía o MRI.
Como un ejemplo de la mayor estabilidad de los liposomas rellenos de gas, se ha encontrado que dióxido de carbono < oxígeno < aire < nitrógeno < neón = helio < gases de perfluorocarburo. Por esta razón, así como por otras, se prefieren los gases fluorados, en particular los gases de perfluorocarburo
Igualmente, aunque en algunos casos los gases solubles funcionarán adecuadamente como la fase gaseosa en la presente invención, los gases sustancialmente insolubles tienen a dar como resultado una mayor estabilidad que los gases con mayor solubilidad, en particular para la creación por agitación del agente de contraste. Igualmente, será más fácil mantener una fase gaseosa con dichos gases insolubles sustancialmente separa de la fase acuosa con lípidos antes de la agitación, de acuerdo con la presente invención. De esta forma, se prefieren los gases sustancialmente insolubles, tal como han definido con anterioridad.
La calidad de las imágenes por ultrasonidos, y la duración de dichas imágenes también se correlaciona con la solubilidad del gas en medio acuoso. Una disminución en la solubilidad del gas, en general, ofrece una imagen mejor resuelta de mayor duración del ultrasonido.
Adicionalmente se ha observado de manera general que el tamaño de los liposomas rellenos de gas producido tras agitación se correlaciona con la solubilidad del gas en medio acuoso, dando como resultado los gases de mayor solubilidad liposomas rellenos de gas de mayor tamaño. Se cree también que el tamaños de los liposomas puede estar influenciado por la interacción del gas con interior de la pared de los liposomas. De forma específica, se cree que la interacción en la interfase afecta a la tensión y, por consecuencia, la fuerza externa del gas del interior sobre la pared lipídica interior del liposoma. Una disminución en la tensión permite liposomas más pequeños disminuyendo la fuerza ejercida sobre el exterior del liposoma por el medio acuoso para contraer el liposoma relleno de gas.
La solubilidad de los gases en disolventes acuosos se puede estimar mediante el uso de la Ley de Henry, que resulta de aplicabilidad general a presión de hasta 1 atmósfera de presión, y para gases que sean ligeramente solubles
(Daniels, F y Alberty, R.A., Physical Chemistry, 3ª edición, Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1966): Como ejemplo, el aire atmosférico tiene una solubilidad de 18,68 ml en 1 kg de agua a 25ºC, el nitrógeno mantiene una solubilidad de aproximadamente 18,8 ml kg^{-1} a 25ºC. Por otra parte, el hexafluoruro de azufre tiene una solubilidad de aproximadamente 5,4 ml kg^{-1} a 25ºC.
En suma, los gases fluorados, gases de fluorocarburo y gases de perfluorocarburo se prefieren por razones de estabilidad, insolubilidad, y tamaño resultante del liposoma. Se prefieren en particular el gas fluorado hexafluoruro de azufre, y los gases de perfluorocarburo perfluoropropano, y perfluorobutano, perfluorociclobutano, perfluorometano, perfluoroetano y perfluoropentano, especialmente perfluoropropano y perfluorobutano.
Debe tenerse en cuenta que los perfluorocarburos con menos de cinco átomos de carbono son gases a temperatura ambiente. Perfluoropentano, por ejemplo, es líquido hasta aproximadamente 27ºC. Por encima de dicha temperatura, ocupará toda la cámara de aire del contendor. Se ha demostrado que el perfluoropentano también puede usarse para rellenar la cámara de gas (esto es, el espacio en el vial por encima de la fases de lípidos en suspensión), incluso a temperatura ambiente, por cierto. Seleccionando un valor definido de perfluoropentano líquido calculado para rellenar la cámara de gas, y añadiendo el líquido al envase a una temperatura baja, por ejemplo, -20ºC, y a continuación practicando el vacía en el envase (eliminando de forma efectiva todo el aire de la cámara de gas), y a continuación sellando el envase, el perfluoropentano sufrirá una transición desde la fase líquida a la fase de vapor a una temperatura inferior a la de su punto de ebullición a 1 atmósfera. Así, a temperatura ambiente, ocupara parte o toda la cámara con gas. Como aquellos expertos en la técnica reconocerán, se puede estimar la disminución de la temperatura de transición entre la fase líquida y la fase de vapor usando una regla práctica de estimación. De forma especifica, cada disminución de la presión en una mitad, la temperatura de ebullición disminuirá en aproximadamente 10ºC. De forma alternativa, se puede calcular el descenso en la temperatura como una función de la disminución de la presión usando ecuaciones basadas en la Ley de Boyle de los gases ideales. Otro procedimiento para rellenar la cámara de gas con perfluoropentano es evacuar en primer lugar la cámara y rellenarla a continuación con gas perfluoropentano por encima de 27ºC, Por supuesto, este procedimiento no está limitado únicamente al perfluoropentano, sino que se aplica a todos los gases de perfluoropentano, así como a los gases en general, siempre que se conozca el punto de ebullición del gas.
Si se desea, se pueden usar conjuntamente dos o más gases diferentes para rellenar la cámara de gas. Una mezcla de gases puede tener ciertas ventajas para una amplia variedad de los liposomas rellenos de gas resultantes (tales como aplicaciones en ecografía, tomografía de MR, etc.). Se ha encontrado que una pequeña cantidad de un gas sustancialmente insoluble puede mezclarse con un gas soluble para proporcionar mayor estabilidad de la que se esperaría de la combinación. Por ejemplo, se puede mezclar una pequeña cantidad de un gas de perfluorocarburo (generalmente al menos 1% en moles, por ejemplo) con aire, nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono u otros gases más solubles. El agente de contraste con liposomas rellenos de gas que se produce tras la aireación puede ser, entonces, más estable que el aire nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono u otros gases más solubles en solitario.
De forma adicional, el uso de una mezcla de gases puede usarse para compensar el incremento en el tamaño del liposoma relleno de gas que por otra parte podría producirse in vivo cuando se inyectan in vivo liposomas que contienen gas de perfluorocarburo. Se ha encontrado que algunos gases de perfluorocarburo pueden tener tendencia a absorber o embeber otros gases, tales como el oxígeno. De esta forma, si el gas de perfluorocarburo se inyecta por vía intravenosa, puede captar el oxígeno, u otros gases solubles disueltos en la corriente sanguínea. Las burbujas resultantes pueden entonces crecer in vivo como resultado de esta captación. Sabido este fenómeno, se puede premezclar el gas de perfluorocarburo con un gas soluble, tal como aire, nitrógeno, oxígeno dióxido de carbono, saturando de esta forma el perfluorocarburo en sus propiedades absortivas o embebedoras. Por consecuencia, esto retardaría o incluso eliminaría la posible expansión de los liposomas rellenos de gas en la corriente sanguínea. Esto es significativo a la luz del hecho que si un liposoma crece hasta un tamaño superior a 10 \muM pueden suceder episodios de embolia potencialmente peligrosos si se administran en la corriente sanguínea. Rellenando la cámara de gas con gases más solubles que el gas de perfluorocarburo, junto con el gas de perfluorocarburo, los liposomas rellenos de gas no sufrirán por lo general este aumento de tamaño tras la inyección in vivo. Así, como un resultado de la presente invención, puede eludirse el problema de episodios de embolia como resultado de la expansión de liposomas mediante la producción de liposomas en los que dicha expansión se elimina o retrasa lo suficiente.
Así, de acuerdo con la presente invención, si se desea, se puede combinar un gas sustancialmente insoluble con un gas soluble para producir de forma eficiente liposomas rellenos de gas altamente efectivos y estables.
La Tabla 2 siguiente proporciona un análisis de muestras de liposomas rellenos de gas preparados con diferentes porcentajes del gas de perfluorocarburo sustancialmente insoluble (PFP) y aire como gases de la cámara. Los gases se combinaron con una fase acuosa de lípidos agitando durante 60 segundos a 3.300 RPM. Se utilizó un dimensionador óptico de partículas (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) para analizar el tamaño y número total de los liposomas rellenos de gas. Se usó una muestra de 5 microlitros para cada análisis, con cuatro muestras para cada determinación.
Como se muestra en la Tabla 2, incluso cuando sólo el 20% del gas era PFP (un gas sustancialmente insoluble) y el 80% del gas era aire (una mezcla de gases solubles) se produjeron 100 veces más liposomas que cuando se uso aire en solitario (0% PFP). Más aún, con aire solo (0% PFP), los liposomas fueron mucho menos estables, y una gran parte estuvieron por encima de las 10 micras. Los liposomas con 20% de PFP y 80% de aire, sin embargo, aparecieron tan estables como los liposomas de 80% de PFP y 20% de aire, así como otras muestras con concentraciones intermedia de PFP, y 20% de PFP y 80% de aire produjo prácticamente tantos liposomas rellenos de gas como 80% de PFP y 20% de aire.
TABLA 2 Efecto del porcentaje de perfluoropropano sobre el tamaño y número de las burbujas
1 
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En la Tabla 2, Dev. Est. = desviación estándar, y CV = coeficiente de varianza. También en la Tabla 2, E+ denota el exponente de una potencia determinada, por ejemplo, 5,45 E+05 = 5,45 x 10^{5}.
En resumen, se ha encontrado que sólo se necesita una cantidad pequeña de gas relativamente insoluble (como PFP) para estabilizar los liposomas, mientras que la gran parte del gas es un gas soluble. Aunque la solubilidad efectiva de la combinación de dos o más gases, según se calcula mediante la fórmula siguiente:
\frac{(solubilidad \ del \ gas \ A) \ x \ (porcentaje \ de \ moles \ de \ A) \ + \ (solubilidad \ del \ gas \ B) \ x \ (porcentajes \ de \ moles \ B)}{100}
puede ser sólo ligeramente distinta de la solubilidad del gas soluble, sigue existiendo un elevado número de liposomas rellenos de gas y de estabilidad de los liposomas rellenos de gas con únicamente una pequeña cantidad añadida de gas insoluble.
Aunque sin pretender quedar ligado por ninguna teoría de funcionamiento, se cree que el gas sustancialmente insoluble es importante para un efecto de estabilización de la membrana. Por tanto, se cree que el gas sustancialmente insoluble 8tal como PFP) actúa como una barrera frente a la membrana lipídica, posiblemente formando de forma efectiva una membrana sobre la superficie interna de la membrana que retarde la salida del gas soluble (tal como aire, nitrógeno, etc.). Este descubrimiento es al mismo tiempo sorprendente y útil, ya que permite usar solamente una pequeña cantidad del gas sustancialmente insoluble (por ejemplo, un perfluorocarburo u otro gas fluorado) y de forma principal un gas más biocompatible (potencialmente menos tóxico) como el aire o el nitrógeno para formar la mayor parte del volumen del liposoma.
La cantidad de gases sustancialmente insolubles y de gases solubles en cualquier mezcla puede variar ampliamente, tal como reconocerá alguien experto en la técnica. Típicamente, sin embargo, al menos aproximadamente 0,01% de la cantidad total del gas es un gas sustancialmente insoluble, de forma más preferible aproximadamente 0,1%, incluso más preferible al menos el 1% y lo más preferible al menos aproximadamente 10%. Los intervalos adecuados de gas sustancialmente insolubles variarán dependiendo de diferentes factores tales como el gas soluble a emplear, el tipo de lípido, la aplicación concrete, etc. Entre los intervalos de ejemplo se incluyen entre aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente 99% de gas sustancialmente insoluble, de forma preferible entre aproximadamente 1% y aproximadamente 95%, más preferible entre aproximadamente 10 y aproximadamente 90% y lo más preferible entre aproximadamente 30% y aproximadamente 85%.
Para otros usos más allá del diagnóstico por ecografía, tal como el diagnóstico por tomografía de resonancia magnética (MRI), los gases paramagnéticos, tales como el fuertemente paramagnético gas oxígeno 17 (^{17}O_{2}), neón, xenón (especialmente gas xenón hiperpolarizado enriquecido con rubidio) u oxígeno (que sigue siendo paramagnético, aunque menos intensamente), por ejemplo, son preferibles para rellenar la cámara de gas, aunque también pueden usarse otros gases. De manera más preferible, ^{17}O_{2}, neón, gas xenón hiperpolarizado enriquecido con rubidio u oxígeno se combinan con un gas sustancialmente insoluble como, por ejemplo, un gas de perfluorocarburo. Los gases paramagnéticos son bien conocidos en la técnica y los gases paramagnéticos adecuado serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica. El gas más preferido para aplicaciones MRI, ya sea usado en solitario o en combinación con otro gas, es ^{17}O_{2}.
Usando una combinación del gases, el ^{17}O_{2} u otro gas paramagnético proporciona el contraste óptimo mientras que el perfluorocarburo estabiliza el gas ^{17}O_{2} del gas atrapado tras agitación. Sin la adición del gas de perfluorocarburo, los gases como el ^{17}O_{2} son mucho menos efectivos, puesto que su solubilidad les hace difundir fuera de la trampa de lípido tras una inyección intravenosa. Además, el gas ^{17}O_{2} es bastante caro. Combinando el gas de perfluorocarburo con el gas ^{17}O_{2} aumente mucho la eficacia del producto y disminuye el coste debido a un uso más eficiente del costoso gas ^{17}O_{2}. De forma similar, otros gases con propiedades paramagnéticas deseables, como el neón, pueden mezclarse como los gases de perfluorocarburo.
La Tabla 3, a continuación, muestra una amplia variedad de gases diferentes que se pueden usar en aplicaciones de tomografía MR. En la Tabla 3, se muestra el R2 (1/T2/mmol/l.s^{-1}) para diferentes gases en liposomas rellenos de gas. Como muestra la Tabla 3, existen diferencias dramáticas en la capacidad de relajación de los distintos liposomas rellenos de gas, el mayor valor de relajación R2 indica mayor efectividad de los liposomas como agentes para diagnóstico por imagen MR. De los gases mostrados, el aire tiene el mayor valor R2. Se cree que el aire es el superior debido al efecto paramagnético del oxígeno del aire. El oxígeno puro, sin embargo, es un poco menos efectivo, quizá debido a la elevada solubilidad del oxígeno y al equilibrio del oxigeno en el medio acuoso que rodea los liposomas. Con aire, el nitrógeno (el aire contiene aproximadamente un 80% de nitrógeno) ayuda a estabilizar el oxígeno en el interior de los liposomas. El nitrógeno es mucho menos soluble en agua que el aire. Como se ha indicado anteriormente, PFO u otros gases de perfluorocarburo pueden mezclarse con un gas activo más activo magnéticamente, tal como aire, oxígeno, ^{17}O_{2}, o xenón hiperpolarizado enriquecido con rubidio. Haciendo esto, se pueden preparar liposomas rellenos de gas estables y muy activos magnéticamente.
TABLA 3 Distribución por tamaños y capacidad de relajación
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La cámara de gas del envase se puede rellenar con el gas a presión ambiental, disminuida o incrementada, según se desee.
En el envase de la invención, la fase gaseosa está separada de la fase acuosa de lípidos en suspensión, Por sustancialmente separada, se significa que menos de aproximadamente el 50% del gas se combina con la fase de lípidos acuosos, antes de la agitación. De forma preferible, menos del 40%, más preferible menos de aproximadamente el 30%, incluso más preferible menos de aproximadamente el 20% y los más preferible menos del 10% del gas se combina con la fase de lípidos acuosos. La fase gaseosa se mantiene sustancialmente separada de la fase de lípidos acuosos hasta aproximadamente cerca del momento del uso, momento en el que el envase sea agita y se combinan la fase gaseosa y la fase de lípidos acuosos para formar una suspensión acuosa de liposomas rellenos de gas. De esta forma, se produce un excelente agente de contraste para diagnóstico por imagen por ultrasonidos o por resonancia magnética. Más aún, puesto que el agente de contraste se prepara inmediatamente antes de usar, se minimizan los problemas de estabilidad durante la vida en almacenamiento.
La agitación puede llevarse a cabo en una aplica variedad de formas y puede incluir agitación mecánica y/o manual, así como agitación por otros procedimientos, como la sonicación (ondas de sonido). Se prefiere la agitación manual y/o mecánica. La agitación puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, agitando, removiendo, rotando, vibrando, etc. De forma preferible, se puede emplear un dispositivo de agitación cuyo despiece se muestra en la Figura 2. De forma específica, se muestra en la Figura 2 un dispositivo para agitación mecánica (10). La agitación se inicia y detiene mediante el botón (11) de arranque-parada. El dispositivo para agitación (10) también comprende un mando (12) que proporciona el ajuste de la velocidad variable (RPM). Haciendo girar el mando (12) en el sentido de la agujas del reloj se consigue aumentar la velocidad de agitación (en RPM). Inversamente, haciendo girar el mando (12) en el sentido contrario al de las agujas del reloj se consigue disminuir la velocidad de agitación. El contenido del envase de la invención se puede agitar colocando el envase en el módulo de alojamiento (13) del dispositivo para agitación (10). El módulo de alojamiento (13) sirve como medio de agitación del dispositivo para agitación (10). Para asegurar firmemente en su lugar el módulo de alojamiento para agitación se usa un tornillo (14).
El envase empleado en la presente invención puede tomar diferentes formas. Puede, si se desea, ser como se muestra en la figura 1, el envase (1) tiene un cuerpo (2) y una tapa (3), y tiene una cámara de gas (4) y una suspensión acuosa de lípidos (5), sustancialmente separadas entre sí. De forma alternativa, el envase puede tomar la forma de una jeringa pre-llena, que puede, si se desea, equiparse con uno o más filtros. En este caso, las jeringas se llenan con una fase acuosa y con un gas preseleccionado en la cámara. Las jeringas se montan generalmente en el dispositivo para agitación con el eje más largo en orientación perpendicular ala dirección de agitación. Tras la agitación, se producen en el interior de la jeringa liposomas rellenos de gas, listos para usar. De forma preferible, el envase, ya sea un envase del tipo que se muestra en la Figura 1, una jeringa u otro tipo de envase, junto con su contenido, son estériles.
Pueden usarse una variedad de diferentes materiales para producir los envases de la invención, incluyendo las jeringas, tales como vidrio, vidrio borosilicatado, vidrio de silicato, polietileno, polipropileno, politetrafluoroetileno, poliacrilatos, poliestireno u otros plásticos. Los envases preferidos, incluyendo las jeringas, pueden ser impermeables a los gases o bien envueltos en una barrera externa que sea impermeable a los gases antes de llenar los envases con gas. Esto es, por supuesto, deseable para mantener la integridad del gas pre-seleccionado en el interior del envase. Entre los ejemplos de materiales para jeringa que tienen capacidades estancas para el gas se incluye, pero no se limitan a, vidrios de silicato o borosilicato, equipados con jeringas de sílice fundido o jeringas con cierre luar, así como émbolos con punta de teflón o recubiertos de teflón.
Tal como reconocerá alguien que sea experto en la técnica, una vez armado con la sustancia de la presente descripción, pueden emplearse diferentes aditivos en la fase acuosa de suspensión de lípidos de la invención para estabilizar la fase gaseosa, o para estabilizar los liposomas rellenos de gas tras la agitación. Si se desea, estos aditivos puede añadirse a la fase de lípidos acuosos antes de la agitación, o pueden añadirse a la composición tras la agitación y producción de los liposomas rellenos de gas. El uso de dichos aditivos será, por supuesto, dependiente de la aplicación concreta para la que se pretenden los liposomas rellenos de gas resultantes, tal como será evidente para aquellos que sean expertos en la técnica.
Están disponibles distintos agentes estabilizantes que pueden emplearse en la presente invención, entre los que se incluyen goma xantana, acacia, agar, agarosa, ácido algínico, alginato, alginato de sodio, carragenina, dextrano, dextrina, gelatina, goma guar, tragacanto, semilla de algarroba, basorín, goma karaya, goma arábiga, pectina, caseína, bentonita, bentonita sin purificar, bentonita purificada, magma de bentonita, celulosa coloidal, celulosa microcristalina, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa cálcica, carboximetilcelulosa sódica, carboximetilcelulosa sódica 12, así como otras celulosas naturales o modificadas, polisorbato, carbomer 934P, silicato de aluminio y magnesio, monoestearato de aluminio, oxido de polietileno, alcohol de polivinilo, povidona, polietilénglicol, propilénglicol, polivinilpirrolidona, dióxido de silicio, dióxido de silicio coloidal.
Igualmente se pueden emplear como agentes estabilizantes en la fase lipídica compuestos tales como perfluorooctilbromuro (PFOB), perfluorooctilyoduro, perfluorotripropilamina, y perfluorotributilamina . Los perfluorocarburos con más de cinco átomos de carbono serán generalmente líquidos a temperatura corporal, y dichos perfluorocarburos también son muy preferidos como agentes estabilizantes. Entre los perfluorocarburos adecuados se incluyen perfluorohexano, perfluorohepteno, perfluorooctano, perfluorodecalina, y perfluorododecalina. Además, pueden usarse también lípidos perfluorados o parcialmente fluorados paya ayudar en la estabilización. Como será evidente para los que sean expertos en la técnica, pueden usarse la amplia variedad de lípidos fluorados o parcialmente fluorados que se describen en la presente invención. Debido a su naturaleza relativamente hidrofóbica, con respecto a los lípidos hidrocarbonados, dichos lípidos fluorados o parcialmente fluorados pueden incluso proporcionar ventajas en términos de estabilidad. Son ejemplos de lípidos fluorados o parcialmente fluorados F_{6}C_{11} fosfatidil colina (PC) y F_{8}C_{5}PC. Dichos análogos se describen, por ejemplo, en Santaella y col., Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Vol. 336, número 3, pp. 418-484 (1993).
Puede también usarse una amplia variedad de aceites biocompatibles con el objetivo de ayudar en la estabilización, tales como aceite de cacahuete, aceite de colza canadiense, aceite de oliva, aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de almendra, aceite de semilla de algodón, aceite de perejil, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite mineral, aceite mineral ligero, oleato de etilo, alcohol de miristilo, miristato de isopropilo, glicerol, escualeno, o cualquier otro aceite que se sepa que es comestible. Entre estos también se puede incluir lecitina, esfingomielina, colesterol, sulfato de colesterol, y triglicéridos.
La estabilización puede afectarse también mediante la adición de una amplia variedad de modificadores de la viscosidad (es decir, agentes modificadores de la viscosidad), que pueden servir como agentes estabilizantes de acuerdo con la presente invención. Esta clase de compuestos incluyen, pero de forma alguna se restringe a; 1) carbohidratos y sus derivados fosforilados y sulfonados; 2) poliéteres con pesos moleculares comprendidos entre 400 y 8.000; 2) di- y tri-hidroxi alcanos, y sus polímeros, con pesos moleculares comprendidos entre 800 y 8.000. Pueden también usarse liposomas junto con agentes emulsionantes y/o solubilizantes que pueden consistir en, pero de forma alguna se restringe a, acacia, colesterol, dietanolamina, monoestearato de glicerilo, alcoholes de lanolina, lecitina, mono- y diglicéridos, monoetanolamina, ácido oleico, alcohol de oleílo, poloxamer, estearato de polioxietileno 50, aceite de castor polioxilado 35, éter de oleílo polioxilado 10, éter de cetoestearilo polioxilado 20, estearato de polioxilo 20, polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80, diacetato de propilén glicol, monoestearato de propilén glicol, lauril sulfato de sodio, estearato de sodio, monolaurato de sorbitán, monooleato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, ácido esteárico, trolamina, cera emulsionante, Pluronic F61, Pluronic F64 y Pluronic F68.
Otros agentes que pueden añadirse incluyen agentes tonificantes, tales como polialcoholes como glicerol, propilénglicol, alcohol de polivinilo, polietilénglicol, glucosa, manitol, sorbitol, cloruro de sodio y similares.
Si se desea, pueden incluirse agentes antibacterianos y/o conservantes en la formulación. Dichos agentes incluyen benzoato de sodio, todas las sales de amonio cuaternario, azida de sodio metil parabeno, propil parabeno, ácido sórbico, sorbato de potasio, sorbato de socio, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, clorobutanol, ácido deshidroacético, ácido etilendiamino tetracético (EDTA), monotioglicerol, benzoato de potasio, bisulfito de sodio, dióxido de azufre, y sales orgánicas de mercurio.
Si se desea, puede utilizarse un agente de osmolaridad para controlar la osmolaridad. Entre los materiales adecuados osmóticamente activos se incluyen compuestos fisiológicamente compatibles como azúcares monosacáridos, azúcares disacáridos, alcoholes de azúcar, aminoácidos, y diferentes compuestos sintéticos. Entre los azúcares monosacáridos y azúcares disacáridos se encuentran, por ejemplo, eritrosa, terrosa, ribosa, arabinosa, xilosa, alosa, altrosa, glucosa, manosa, idosa, galactosa, talosa, trehalosa, ribulosa, fructosa, sorbitol, manitol, y seudoheptulosa, siendo los monosacáridos preferibles fructosa, manosa, xilosa, arabinosa, manitol y sorbitol. Entre los azúcares disacáridos se incluyen, por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa, y celobiosa. Entre los aminoácidos adecuados se incluyen, por ejemplo, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina e histidina. Entre los compuestos sintéticos incluyen, por ejemplo, glicerol, propilénglicol, polipropilénglicol, etilénglicol, polietilénglicol y polivinil pirrolidona. Hay otros materiales osmóticamente son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y se pretende que entren en el alcance del término de agente osmóticamente activo, tal como se usa en la presente invención.
También pueden añadirse diversos polímeros, tales como los discutidos anteriormente, para una serie de diferentes propósitos.
Como aquellos que sean expertos en la técnica reconocerán, pueden emplearse en la fase acuosa de lípidos en suspensión de la invención una amplia variedad de cantidades de aditivos, tales como los agentes suspensores descritos anteriormente, según se necesite o desee, dependiendo del uso final concreto. Dichos aditivos, generalmente, pueden comprender entre 0,01% en volumen hasta aproximadamente 95% en volumen de la resultante formulación del agente de contraste, aunque pueden emplearse cantidades más altas o más bajas. A efectos de guía general, está presente un agente suspensor en cantidad de al menos 0,5% en volumen, de forma más preferible al menos el 1% en volumen, incluso de forma más preferible al menos el 10% en volumen. De manera general, el agente suspensor está presente habitualmente en una cantidad inferior al 50% en volumen, más preferiblemente memos de aproximadamente el 30% en volumen. Una cantidad típica de agente suspensor puede estar en torno del 20% en volumen, por ejemplo. También, de manera típica, para conseguir intervalos de osmolaridad generalmente referido, menos de aproximadamente 25 g/l, más preferible que aproximadamente 20 g/l, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 15 g/l, y aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10 g/l de los materiales osmóticamente activos. Un intervalo más preferido de materiales osmóticamente activos está comprendido entre 0,002 g/l y aproximadamente 10 g/l. Estos, así como otros, intervalos de adecuados de aditivos, será fácilmente evidente para aquellos que sean expertos en la técnica, una vez en posesión de la presente invención.
Puede emplearse también una amplia variedad de agentes terapéuticos y/o de diagnóstico en la fase acuosa de lípidos en suspensión, simplemente mediante la adición del agente terapéutico o de diagnostico deseado a dicha fase. Entre los agentes terapéuticos y de diagnóstico adecuados, y sus cantidades correspondientes, serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica, una vez armados de la presente descripción. Estos agentes pueden incorporarse en el interior o sobre las membranas lipídicas, o encapsularse en los liposomas resultantes.
Para mejorar todavía más el efecto magnético de los resultantes liposomas rellenos de gas en la MRI, por ejemplo, se pueden añadir uno o más agentes mejorantes del contraste MRI, tales como agentes paramagnéticos o superparamagnéticos que aumenten el contraste. Entre los agentes útiles que mejoran el contraste MRI se incluyen iones paramagnéticos tales como metales de transición, entre los que se incluyen hierro (Fe^{+3}), cobre (Cu^{+2}) y manganeso (Mn^{+2}), y los lantánidos, tales como gadolinio (Gd^{+3}) y disprosio (Dy^{+3}), nitróxidos, óxidos de hierro (Fe_{3}O_{4}), sulfuros de hierro y partículas paramagnéticas tales como hidroxiapatitas sustituidas con manganeso (Mn^{+2}). Igualmente, son otros ejemplos de iones paramagnéticos que pueden usar el cromo (Cr^{+3}), níquel (Ni^{+2}), cobalto (Co^{+2}) y europio (Eu^{+2}). Pueden usarse otros agentes mejorantes del contraste, tales como radicales nitroxilo u otros átomos que mantenga un espín electrónico desapareado con propiedades paramagnética. De manera ideal, el agente mejorante del contraste se añade ala fase de lípido acuoso antes de la agitación, y se diseña de forma que tras la agitación, el agente mejorante del contraste se incorpore en o sobre la superficie del liposoma relleno de gas resultante, aunque también es posible la adición tras la preparación del liposoma. El liposoma relleno de gas resultante puede tener una capacidad de relajación muy mejorada, proporcionando un agente de contraste especialmente efectivo para diagnóstico por imagen de resonancia magnética. Por ejemplo, el manganeso (Mn+2) se incorporará entre los grupos principales del lípido cuando se use fosfatidilcolina o fosfatidolserina en la fase de lípido acuoso. Si se desea, los materiales pueden quelarse usando compuestos liposolubles como los que muestran, por ejemplo, Unger y col., Patente de los Estados Unidos nº 5.312.617. Dichos compuestos liposolubles son bastante útiles, ya que se incorporan fácilmente en la membrana del liposoma. Los óxidos de hierro y el resto de las partículas deben ser por lo general de pequeño tamaño, de forma preferible menos de aproximadamente 1 \mu, más preferiblemente de menos de aproximadamente 200 nm y, lo más preferible, de menos de aproximadamente 100 nm para conseguir la incorporación óptima en o sobre la superficie del liposoma. Para mejorar la incorporación, pueden usarse óxidos de hierro recubiertos con compuestos alifáticos o lipófilos, ya que tenderán a incorporarse por si mismo en el recubrimiento lípido de la superficie de la burbuja.
Entra también en el alcance de la presente invención el que la fase acuosa de lípidos en suspensión contenga un ingrediente que cause la gelificación con lo polímeros lipídicos y metales que no gelifiquen de manera espontánea, o para mejorar la gelificación, pueden emplearse agentes gelificantes tales como cationes de metales polivalentes, azúcares y polialcoholes. Entre los cationes metálicos polivalentes útiles como agentes gelificantes se incluyen calcio, zinc, manganeso, hierro y magnesio. Entre los azúcares útiles se incluyen monosacáridos como glucosa, galactosa, fructosa, arabinosa, alosa y altrosa, disacáridos como maltosa, sacarosa, celobiosa y lactosa, y polisacáridos como el almidón. De forma preferible, el azúcar es un azúcar simple, esto es un monosacárido o disacárido. Entre los agentes gelificantes de polialcohol a emplear en la presente invención se incluyen, por ejemplo, glicidol, inositol, manitol, sorbitol, metaeritritol, galacitol y alcohol de polivinilo. De forma más preferible, el agente gelificante empleado en la presente invención es sacarosa y/o calcio. Los agentes gelificantes concreto que se pueden emplear en las distintas formulaciones de la presente invención será rápidamente evidentes para alguien experto en la técnica, una vez armado con la presente descripción. Pueden usarse para estabilizar lípidos combinaciones de lípidos, por ejemplo, ácido fosfatídico con sales de calcio y magnesio y polímeros tales como ácido algínico, ácido hialurónico o carboximetil celulosa. Se teoriza que los cationes divalentes forman puentes metálicos entre los lípidos y polímeros para estabilizar los liposomas rellenos de gas en el interior de los sistemas lípido/polímero. De forma similar, puede prepararse suspensiones que contengan mezclas de chitosán (o materiales basados en quitina) polilisina, polietileneimida, y ácido algínico (o sus derivados), o ácido hialurónico.
Se ha encontrado que la velocidad de agitación, la cantidad de lípidos que comprende la fase acuosa de lípidos y el tamaño del envase cerrado puede afectar al tamaño final de cualquier liposoma relleno con gas. Se cree también que la tensión superficial en la interfase del liposoma relleno con gas con el medio acuoso en un factor determinante adicional del tamaño final del liposoma relleno con gas, cuando se tiene en cuenta junto con la velocidad de agitación, el tamaño del vial y la concentración de lípido.
En un envase estéril lleno con una fase acuosa y una cámara de gas, se ha descubierto cómo pueden realizarse cambios fácil y simplemente para cambiar el tamaño de los liposomas tras la aireación, y obtener de esta forma un producto con liposomas que tengan la distribución por tamaños deseada. De forma adicional, pueden emplearse filtros para refinar todavía más la distribución por tamaños del agente de contraste tras la agitación. Lo siguiente proporciona una revisión de cómo los cambios en los componentes de la invención pueden usarse para modificarse para modificar el tamaño del liposoma.
En primer lugar, se ha descubierto que distintos materiales en la fase acuosa pueden ser importantes para controlar el tamaño del liposoma relleno con gas resultante. La Tabla 4 muestra los tamaños de liposomas producidos por agitación de envases estériles llenos con una fase acuosa y una cámara de gas con nitrógeno. En todos los casos, el tamaño del liposoma se determinó mediante un analizador de tamaños de partícula Particle Sizing System modelo 770, por oscurecimiento de luz (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA). Como los datos indican, la relación de lípidos en la fase acuosa afecta la distribución por tamaño de los liposomas rellenos con gas resultantes. De forma específica, la Tabla 4 siguiente muestra en efecto de la composición de lípidos sobre el tamaño medio de los liposomas
TABLA 4 Efecto de la composición de lípidos sobre el tamaño medio de los liposomas 
\vskip1.000000\baselineskip
Composición de lípidos* Tamaño medio del liposoma
77,5:15:7,5 5,26 \mum
77,5:20:2,5 7,33 \mum
82:10:8 6,02 \mum
* relación de dipalmitoilfosfatidilcolina : ácido dipalmitoilfosfatídico: dipalmitoilfosfatidiletanolamina-
PEG5000, en % en moles 
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 5 muestra la dependencia de la concentración de una mezcla de lípidos de composición definida sobre el tamaño medio del liposoma. Como se muestra en la Tabla 5, las variaciones en las concentraciones totales de lípido son también importantes en la influencia sobre el tamaño del liposoma tras la agitación. En estos experimentos, la relación entre los tres diferentes componentes lipídicos se mantuvo constante, y la concentración de lípidos se hizo variar entre 0,5 y 5.0 mg ml^{-1} en la fase acuosa. El gas usado fue nitrógeno. El tamaño óptimo de burbuja para diagnostico por ultrasonido con una cámara de gas con perfluorobutano se produjo cuando la concentración de lípido en la fase acuosa fue 1,0 mg ml^{-1}.
TABLA 5 Efecto de la concentración de lípidos sobre el tamaño medio de los liposomas
Composición de lípidos* Tamaño medio del liposoma
1 mg ml^{-1} 1,8 \mum
3 mg ml^{-1} 4,0 \mum
5 mg ml^{-1} 7,2 \mum
* La concentración de lípido para todas las muestras se basó en una relación (en % en moles) de dipalmi-
toil fosfatidil colina: ácido dipalmitoilfosfatídico: dipalmitoilfosfatidiletanolamina-PEG5000 de 82:10:8.
Se uso nitrógeno gas.
El tamaño de los liposomas puede también depender de la composición de gas en la cámara, además de la concentración de medio estabilizante, por ejemplo, lípidos. Por ejemplo, se ha descubierto que una concentración de lípido de 1,0 mg ml^{-1} produce liposomas rellenos con gas de aproximadamente el mismo diámetro cuando se usa nitrógeno, que una concentración de lípidos de 5,0 mg ml^{-1} con perfluorobutano. Sin embargo, se ha encontrado que la concentración más elevada puede dar como resultado una distribución ligeramente asimétrica hacia liposomas rellenos con gas más grandes. Este fenómeno tiene a reflejar la mayor estabilidad de los liposomas rellenos con gas a mayor concentración de lípidos. Se cree además que la mayor concentración de lípidos puede bien contribuir a la estabilidad actuando como un agente estabilizante en la fase acuosa, o bien, la mayor concentración de lípidos proporciona más lamelas alrededor del gas, habiéndolo más estable, y permitiendo de esta forma que se mantenga una proporción mayor de liposomas de gran tamaño. De manera adicional, se ha descubierto que el tamaño de la cámara de gas también puede usarse para afectar al tamaño de los liposomas rellenos con gas. Una cámara de mayor tamaño contiene en proporción más gas en relación con el tamaño de la fase acuosa, lo que producirá por lo general liposomas de mayor tamaño que las cámaras más pequeñas.
La velocidad de agitación es importante para generar liposomas con el tamaño adecuado. Se ha encontrado que pueden usarse para fabricar liposomas velocidades de agitación comprendidas entre 100 y 10.000 revoluciones por minuto (rpm), sin embargo, existen óptimos en términos de facilidad y reproducibilidad de la producción de liposomas de una tamaño definido. Una revolución, tal como se emplea en el presente documento, se refiere a un único movimiento adelante y atrás, arriba y abajo, de lado a lado, circular, etc., en el que dicho movimiento comienza y finaliza (es decir, regresa) al punto de partida. La Tabla 3 muestra los tamaños de liposomas producidos a partir de una fase acuosa de 82% en moles de dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC) con 10% en moles de ácido dipalmitoil fosfatídico y 8% en moles de dipalmitoil fosfatidil etanolamina-PEG5000 (DPPE-PEG5000) usando una cámara de gas que contenía gas perfluoropropano. Las preparaciones se agitaron durante dos minutos en un Wig-L-Bug^{TM} (Crescent Dental Mfg, Lyons Ill.,). Utilizando viales de 2 ml color ámbar (Wheaton Industries, Millville, NJ; volumen real 3,7 ml) rellenos con una fase de lípido acuosa y una cámara de gas, el envase multifase de la presente invención se colocó en el Wig-L-Bug^{TM} y se midió la velocidad mediante un tacómetro Co-Palmer Modelo 08210 Pistol Grip (Code-Palmer, Nile, Ill.). La Tabla 6 proporciona los resultados, y demuestra el efecto de las velocidades de agitación sobre el tamaño promedio de los liposomas resultantes.
TABLA 6 Efecto de la velocidad de agitación sobre el tamaño medio de los liposomas
Velocidad (rpm)* Tamaño medio del liposoma
1.500 3,4 \mum
2.800 3,3 \mum
3.300 2,9 \mum
Por tanto, se ha descubierto que existe una velocidad de agitación óptima para producir liposomas del tamaño deseado. A la velocidad óptima, los liposomas rellenos con gas se forman muy rápidamente, en menos de 5 minutos, incluso entre un minuto o dos, e incluso en 30 segundos o menos. Se anota que el procedimiento y medio de agitación es significativo en la formación de liposomas con el tamaño adecuado. En particular, se ha encontrado que los liposomas con el tamaño óptimo aparecen cuando el movimiento recíproco de agitación se produce en forma de un arco. Se prefiere que el grado del movimiento en ángulo esté comprendido entre 2º y 20º. Se prefiere más que el grado del movimiento en ángulo esté comprendido entre 4º y 10º. Se prefiere incluso más que el grado del movimiento en ángulo esté comprendido entre 4º y 8º. Lo que más se prefiere es que el grado del movimiento en ángulo esté comprendido entre 6º y 7º. Como forma adicional de realización de la presente invención, se ha descubierto que el número de rpm está comprendido, de forma preferible, entre aproximadamente 500 y aproximadamente 10.000, más preferible, entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 5.000, y lo más preferible, entre aproximadamente 2.500 y aproximadamente 4.000.
Es también un descubrimiento importante de esta invención que el tamaño, forma, y cantidad de cámara disponible para que el contenido líquido pueda agitarse es también vial para la formación de liposomas rellenos con gas del tamaño adecuado. Por ejemplo, es un descubrimiento de esta invención que cuando se usan viales de 3,7 ml de tamaño real (Wheaton 300 Borosilicate glass, Wheaton Industries, Millville, NJ, denominados de tamaño 2 ml, diámetro x altura = 15mm x 32 mm), el volumen de la cámara de gas en el vial está comprendido entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 80% del volumen total del vial, aunque dependiendo de las circunstancias particulares y aplicación deseada, será apropiada más o manos cantidad de gas. De forma más preferible, la cámara de gas comprende entre aproximadamente 30% y aproximadamente 70% del volumen total. Por lo general, lo que más se prefiere es que el volumen de la cámara de aire comprenda aproximadamente el 60% del volumen total del vial.
Por tanto, resulta evidente de la discusión anterior de la invención que el tamaño óptimo depende de diferentes factores, entre los que se incluyen la intensidad y movimiento de agitación, y el tamaño, forma y llenado real de los viales.
Aunque pueden emplearse diferentes dispositivos de agitación para preparar los liposomas rellenos con gas, tales como mezcladores de pintura, agitadores de sobremesa y de tipo vórtex, la geometría de la agitación y su velocidad son importantes para la optimización de la producción de liposomas rellenos con gas. El dispositivo para agitación más preferido es el Wig-L-Bug^{TM}.
El tamaño del envase estéril, su geometría y la orientación del envase con respecto al equipo de agitación son todos importantes en la determinación del tamaño de los liposomas rellenos con gas. El equipo de agitación, es decir, Wig-L-Bug^{TM}, generalmente agitara más lentamente a medida que el peso del contendedor estéril aumenta más allá de un cierto nivel. El Wig-L-Bug^{TM} estándar agita más rápidamente con viales de 2 ml (volumen real 3,7 ml) que un vial de 10 ml. Estos experimentos se realizaron usando un vial transparente de 10 ml (Wheaton Industries, Millville, New Jersey) y un vial ámbar de 2 ml (volumen real 3,7 ml) (Wheaton Industries, Millville, New Jersey). Una vez más, se midió la velocidad de agitación con un tacómetro Code-Palmer, Nile, Ill.). La Tabla 7 lista los resultados.
La Tabla 7 demuestra la dependencia de la velocidad de agitación de un agitador eléctrico con el tamaño del vial usado para la agitación.
TABLA 7 Efecto del tamaño del vial sobre la velocidad de agitación del Wig-L-Bug^{TM}
Tamaño del vial Velocidad determinada (rpm)
Vial de 2 ml 3.250
Vial de 10 ml 2.950
Por lo general, la invención se lleva a cabo con envases estériles en los que la fase acuosa ya está presente en el interior de la botella. Para aplicaciones concretas, sin embargo, es medio estabilizante puede almacenarse en el interior del envase en un estado seco o liofilizado. En este caso, la solución acuosa, por ejemplo, solución salina en tampón fosfato, se añade al envase estéril inmediatamente antes de la agitación. Haciendo esto, el medio estabilizante rehidratado en el interior de la fase acuosa interactuara con el gas de la cámara durante la agitación, de forma que se producirán liposomas rellenos con gas como anteriormente. La rehidratación de un medio suspensor seco o liofilizado complica necesariamente de forma adicional el producto, y por lo general no se desea salvo para ciertas preparaciones, en las que puede resultar útil para prolongar adicionalmente la vida en almacenamiento del producto. Por ejemplo, ciertos agentes terapéuticos, como ciclosfamida, péptidos y materiales genéticos (como el ADN) pueden hidrolizarse un almacenamiento a largo plazo. La rehidratación de una muestra previamente liofilizada para formar la fase acuosa y cámara antes de la agitación puede resultar practico para producir liposomas rellenos con gas que contengan compuestos que de otra forma no tendrían una vida en almacenamiento suficientemente prolongada.
Lo anterior establece varios parámetros para determinar el tamaño de los liposomas rellenos con gas. El tamaño de los liposomas es importante en términos de maximizar la eficacia del producto y minimizar su toxicidad. De forma adicional, los liposomas deberían ser tan flexibles como sea posible para, al mismo tiempo, maximizar la eficacia y minimizar las interacciones adversas de tejido, tal como alojarse en los pulmones. La presente invención crea liposomas del tamaño deseado con membranas elásticas muy delgadas, por ejemplo, solamente es necesario 1 mg ml^{-1} de lípido para estabilizar las membranas, se ha encontrado que los liposomas rellenos con gas de mayor diámetro pueden usarse sin que produzcan hipertensión pulmonar. Por ejemplo, se administró a cobayas dosis de hasta cinco veces la dosis necesaria para diagnóstico por imagen sin evidencia ninguna de hipertensión pulmonar. En comparación, dosis muy inferiores de burbujas de aire recubiertas de albúmina de tamaño inferior provocan hipertensión pulmonar grave. Debido a que los liposomas de la presente invención son tan flexibles y deformables, pueden deslizarse fácilmente a través de los capilares pulmonares. De forma adicional, las tecnologías de recubrimiento que se emplean con los presentes lípidos (por ejemplo, lípidos que contienen polietilén glicol) disminuye las interacciones pulmonares adversas y al mismo tiempo mejoran la estabilidad y eficacia del producto, tanto in vitro como in vivo.
El tamaño de los liposomas rellenos con gas para uso como medio de contraste genérico para ultrasonidos debe ser tan grande como sea posible (sin causar efectos embólicos) debido a que la retrodifusión, o efecto ultrasónico, es proporcional al radio elevado a la sexta potencia cuando las frecuencias son tales que los liposomas rellenos con gas están dentro del régimen de dispersión de Rayleigh. Para MRI, se prefieren también los liposomas más grandes de la invención. La capacidad de la presente invención para preparar y emplear liposomas de gran tamaño con menor potencial de efectos tóxicos incrementa su eficacia en relación con otros productos.
Un parámetro adicional con influencia sobre el contraste de los ultrasonidos es la elasticidad de la membrana del liposoma. Cuanto mayor sea la elasticidad mayor es el efecto de contraste. Puesto que los liposomas presente está recubiertos por membranas ultrafinas de lípidos, su elasticidad es muy similar al del gas desnudo y se maximizan la reflectividad y el efecto de contraste.
El procedimiento de agitación de la presente invención produce fácilmente liposomas a partir de una fase acuosa y una cámara de gas en el interior de un envase estéril. La invención es suficiente para producir liposomas con propiedades altamente deseables en aplicaciones de diagnostico por imagen mediante ultrasonidos o resonancia magnética. Para aplicaciones seleccionadas, sin embargo, puede emplearse un filtro para producir liposomas con una distribución por tamaños de partícula incluso más homogénea y del diámetro deseado,. Por ejemplo, para medir in vivo presiones de ultrasonidos usando el fenómeno armónico de los liposomas rellenos con gas, puede resultar útil tener un diámetro de liposoma muy bien definido entre un intervalo estrecho de tamaños. Esto se lleva a cabo de manera sencilla inyectado los liposomas (producidos agitando el envase con fase acuosa y cámara de gas) a través de un filtro de tamaño definido. Los liposomas resultantes no serán más grandes que una aproximación muy cercana al tamaño de los poros de la membrana del filtro. Como se ha indicado anteriormente, para muchas aplicaciones de ultrasonidos o MRI, se desea tener liposomas rellenos con gas tan grandes como sea posible. Para ciertas aplicaciones, sin embargo, se desean liposomas rellenos con gas mucho más pequeños. Para enfocar, por ejemplo, sobre tumores u otros tejidos enfermos, puede que sea necesario que los liposomas rellenos con gas abandonen el espacio vascular y penetren en los intersticios del tejido. Mucho liposomas rellenos con gas más pequeños puede resultar útiles para estas aplicaciones. Estos liposomas rellenos con gas más pequeños (por ejemplo, menores de una micra de diámetro) puede producirse en grandes cantidades por modificaciones en los compuestos de la fase acuosa (composición y concentración), así como de la cámara de gas (composición del gas y volumen de la cámara), pero también por inyección a través de un filtro. Se pueden producir liposomas rellenos con gas muy pequeños de tamaño sustancialmente uniforme por inyección a través de un filtro, por ejemplo, de 0,22 micras. Los liposomas rellenos con gas resultantes, de tamaño nanométrico, puede tener entonces propiedades de focalización deseables.
Los ejemplos anteriores de suspensiones de lípidos pueden también esterilizarse en autoclave sin cambio apreciable en el tamaño de las suspensiones. La esterilización del medio de contraste puede llevarse a cabo en autoclave y/o esterilización por filtración realizada tanto antes como después de la etapa de agitación, o mediante otros procedimientos conocidos de los expertos en la técnica.
Tras rellenar los envases con la fase acuosa, y la cámara de gas con el gas preseleccionado, las botellas selladas pueden almacenarse de manera indefinida. No debe haber partículas que precipiten, que aparezcan liposomas rellenos con gas, o se produzcan otras interacciones indeseadas entre liposomas rellenos con gas, partículas, coloides o emulsiones. La vida en almacenamiento del envase relleno con la fase acuosa y la cámara de gas depende únicamente de la estabilidad de los compuestos en la fase acuosa. Estas propiedades de larga vida en almacenamiento y posibilidad de esterilización confieren propiedades sustanciales a la presente invención sobre la técnica anterior. El problema de la estabilidad, tanto por agregación como por precipitación de partículas, que es tan habitual en el campo de los medio de contraste para ultrasonidos, puede solventarse mediante la presente invención.
Se ha encontrado que los liposomas rellenos con gas que se producen por agitación del contendedor multifase de la invención tienen utilidad excelente como agentes de contraste para diagnóstico por imagen, tal como el diagnóstico por ecografía o resonancia magnética. Los liposomas son útiles para diagnostico de un paciente genérico, y/o para diagnosticar de forma específica la presencia de tejido enfermo en un paciente. El proceso de diagnóstico por imagen puede llevarse a cabo administrando al paciente liposomas rellenos con gas de la invención a un paciente, y analizando a continuación a paciente usando diagnostico por ecografía o resonancia magnética para obtener imágenes visibles de una región interna de un paciente y/o de cualquier tejido enfermo en dicha región. Por región o paciente, se define el paciente completo, o una zona o porción concreta del paciente. El agente de contraste liposómico puede emplearse para proporcionar imágenes del sistema vascular, corazón, hígado y bazo, y diagnosticar por imagen la región gastrointestinal u otras cavidades del cuerpo, o bien de otras maneras que serán evidentes para los expertos en la técnica, tal como en caracterización de tejidos, diagnóstico por imagen de acumulaciones de sangre, etc. Puede emplearse cualquiera de los diferentes tipos de dispositivos para diagnostico por ecografía o resonancia magnética para la practica de la presente invención, no siendo crítico el tipo concreto o modelo del dispositivo para el procedimiento de la invención.
Los liposomas rellenos con gas de la invención pueden emplearse también para liberar una amplia variedad de agentes terapéuticos a un paciente para el tratamiento de diferentes enfermedades, trastornos o afecciones, tal como reconocerá alguien experto en la técnica.
De igual forma los liposomas magnéticamente activos pueden usarse para estimar presión mediante MRI. Los liposomas incrementen la susceptibilidad global y, de acuerdo con ello, incrementan la relajación T_{2}, pero incluso más la relajación T_{2}*. Debido a que los efectos de los gradientes del campo estático se compensan principalmente en los experimentos de eco de espín (en virtud del pulso reenfocador de radiofrecuencia a 180º), el efecto de los liposomas está menos marcado sobre T_{2} que sobre el T_{2}* en las secuencias de pulsos ponderados cuando los efectos de los campos estáticos no están compensados. Incrementar la presión da como resultado una perdida de liposomas o disrupción de estos (para los gases más solubles), así como una disminución en el diámetro de los liposomas. De acuerdo con ello, 1/T_{2} disminuye cuando aumenta la presión. Tras relajar la presión, algunos de los liposomas restantes se vuelven a expandir, y 1/T_{2} se incrementa de nuevo ligeramente. Los liposomas compuestos de aproximadamente el 80% de PFP con el 20% de aire muestran estabilidad mejorada y disminuyen ligeramente en al 1/T_{2} con la presión, que vuelve a la línea base tras la relajación de la presión (es decir, los liposomas son estables pero muestran un ligero efecto 1/T_{2}). Cuando se obtienen imágenes de eco de gradiente y se mide la intensidad de la señal, estos efectos son mucho más marcados. La intensidad de la señal se incrementan con el aumento de la presión (1/T_{2}* disminuye con el aumento de la presión). Puesto que el experimento se realiza relativamente rápido (se tarda menos de una décima del tiempo para conseguir las imágenes de eco de gradiente que para medir T_{2}), la duración de la exposición a la presión es mucho menor, y los liposomas rellenos con nitrógeno retornan muy cerca de la línea base tras la relajación de la presión (es decir, hay muy poca pérdida de liposomas). De acuerdo con ello, la intensidad de la señal sobre el eco de gradiente vuelve a caer muy cerca de la línea base y vuelve a la presión atmosférica. Para medidas de la presión mediante MRI, los liposomas pueden diseñarse bien para separarse con el incremento de presión o para permanecer estable, pero disminuir el diámetro de los liposomas con el aumento en la presión. Puesto que el radio de los liposomas MRI afecta a 1/T_{2}*, esta relación puede emplearse para estimar la presión mediante MRI.
Como reconocerá alguien experto en la técnica, la administración de los liposomas rellenos con gas al paciente puede llevarse a cabo de diferentes formas, tales como una inyección intravenosa o intrarterial, por vía oral o rectal. La dosis útil a administrar y el modo concreto de administración variará dependiendo de la edad, peso y del mamífero y regio del mismo a escanear o tratar, y el medio de contraste o terapéutico concreto a emplear. De forma típica, la dosificación se inicia a los niveles más bajos y se incremente hasta que se consigue la mejora deseada en el contraste o el efecto terapéutico deseado. El paciente puede ser cualquier tipo de mamífero, aunque de forma más preferible es un ser humano.
Se pretende que los siguientes ejemplos reales ilustren cómo se usa la presente invención, así como algunas de las áreas de utilidad extraordinaria de la invención.
Ejemplos Ejemplo 1
(Ejemplo comparativo)
Formación de liposomas rellenos con gas nitrógeno
Se prepararon bicapas rellenas de gas en dos viales de 20 ml con 6 ml de diluyente conteniendo suero salino normal (fisiológico) propilénglicol; glicerol (8:1:1, v:v:v). Se añadió a lo anterior hasta una concentración final de 5 mg ml^{-1} una mezcla de dipalmitoilfosfatidil colina (DPPC): ácido dipalmitoilfosfatídico : dipalmitoilfosfatidiletanolamina-PEG5000 (DPPE-PEG5000) en una relación molar de 82:10:8 (% en moles). A continuación se sellaron las muestras con tapones tipo septum herméticos y capaces de soportar presión. A continuación se purgaron y evacuaron al menos tres veces con gas nitrógeno (99,98%, Arizona Welding Co., Tucson, AZ). A continuación, las muestras bien se autoclavaron durante 15 minutos a 121ºC en un esterilizador por vapor Barnstead Model C57835 (Barnstead/ Thermolyne Corporation Dubuque, Iowa), o se filtraron a esterilidad de una a tres veces a través de un filtro de 0,22 \mum Nuclepore (Costar, Pleasanton, CA). A continuación, las muestras se retiraron del autoclave y se dejaron enfriar hasta aproximadamente temperatura ambiente. A continuación, las muestras se agitaron en vórtex mediante un vortizador Wig-L-Bug^{TM} (Crescent Dental Mfg. Co., Lyons, IL) durante unos dos minutos. Las mezclas resultantes fueron significativas para la formación de bicapas cuando se dimensionaron mediante tres procedimientos en un Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA), un microscopio óptico Reichert-Jung Model 150 equipado con un ocular de calibración (Cambridge Instruments, Buffalo, NY) y un Coulter Model (Coulter Industries, Luton Beds, England): Las muestras presentaron un tamaño medio ponderado en número de aproximadamente 5-7 micras con un mínimo del 95% de las partículas menores de 10 micras.
Ejemplo 2 Formación de liposomas rellenos con gas perfluoropentano
Se prepararon bicapas rellenas de gas en dos viales de 20 ml con 6 ml de diluyente conteniendo suero salino normal (fisiológico) propilénglicol; glicerol (8:1:1, v:v:v). Se añadió a lo anterior hasta una concentración final de 5 mg ml^{-1} una mezcla de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC): ácido dipalmitoilfosfatídico : dipalmitoilfosfatidiletanolamina-PEG5000 (DPPE-PEG5000) en una relación molar de 82:10:8 (% en moles). A dichas muestras se añadieron 50 \mul (30,1 \mumoles) de perfluoropentano (PCR, Gainesville, FL). Las muestras se fabricaron a -20ºC y se sellaron con tapones tipo septum herméticos y capaces de soportar presión. A continuación, las muestras se autoclavaron durante 15 minutos a 121ºC en un esterilizador por vapor Barnstead Model C57835 (Barnstead/ Thermolyne Corporation Dubuque, Iowa). A continuación, las muestras se retiraron del autoclave y se dejaron enfriar hasta aproximadamente temperatura ambiente. A continuación, las muestras se agitaron en vórtex mediante en un aparato Wig-L-Bug^{TM} (Crescent Dental Mfg. Co., Lyons, IL) durante unos dos minutos. Las mezclas resultantes resultaron entonces significativas para la formación de bicapas rellenas de gas con apariencia se espuma. Se registraron el volumen y altura de la espuma y una de las muestras se colocó en un congelador a -20ºC (Kenmore Brand, Sears-Roebuck, Chicago IL). La muestra se retiró después de tres horas, y con el tiempo, se anoto que permanecía aproximadamente el 90% del volumen inicial de la espuma. Se dejó la muestra en el congelador durante toda la noche (aproximadamente 17 horas) y se elimino en el momento que se descubrió que permanecía el 50% del volumen original. Los restantes viales, usados como control, se mantuvieron en un incubador a 30º c durante el mismo periodo de tiempo. Se encontró que no se producía pérdida de volumen, indicativo que el enfriamiento del gas en el interior de las bicapas rellenas de gas se había condensado, disminuyendo de esta forma el volumen de gas. Finalmente, la muestra fría se situó a continuación en la incubador a 30ºC, y se encontró que, tras aproximadamente 45 minutos, el 20% del volumen original de la espuma se había restaurado. Esto es indicativo del hecho que el gas condensado se había volatilizado nuevamente y se había expandido el tamaño de los liposomas rellenos con gas.
Ejemplo 3 Formación de liposomas rellenos con gas perfluoropropano
Se usó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, excepto en que el gas usado fue perfluoropropano (99,99%, Alcon Surgical, Fort Worth, TX) y que el tamaño del vial usado fue un vial color ámbar de 2 ml (volumen real = 3,7 ml) (Wheaton, Millville, NJ). Se rellenaron los viales con 1,5 ml de la mezcla lípido diluyente. El procesó se dimensionó mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, sin embargo, esta vez, se produjo un tamaño comprendido entre 4-6 micras, con más del 95% de las partículas de menos de 10 micras.
Ejemplo 4 Formación de liposomas rellenos con gas perfluorobutano
Se usó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, excepto en que el gas usado fue perfluorobutano (+97%, Flura Corporation, Nashville, TN) y que el tamaño del vial usado fue un vial color ámbar de 2 ml (volumen real = 3,7 ml) (Wheaton, Millville, NJ). Se rellenaron los viales con 1,5 ml de la mezcla lípido diluyente. El proceso se dimensionó mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, sin embargo, esta vez, se produjo un tamaño comprendido entre 4-6 micras, con más del 95% de las partículas de menos de 10 micras.
Ejemplo 5 Formación de liposomas rellenos con gas perfluorociclobutano
Se usó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, excepto en que el gas usado fue perfluorociclobutano (99,8%, Pfaltz & Bauer, Waterbury, Connecticut) y que el tamaño del vial usado fue un vial color ámbar de 2 ml (volumen real = 3,7 ml) (Wheaton, Millville, NJ). Se rellenaron los viales con 1,5 ml de la mezcla lípido diluyente. El proceso se dimensionó mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, sin embargo, esta vez, se produjo un tamaño comprendido entre 4-6 micras, con más del 95% de las partículas de menos de 10 micras.
Ejemplo 6 Formación de liposomas rellenos con gas hexafluoruro de azufre
Se usó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, excepto en que el gas usado fue hexafluoruro de azufre (99,99%, Alcon surgical, Fort Worth, TX) y que el tamaño del vial usado fue un vial color ámbar de 2 ml (volumen real = 3,7 ml) (Wheaton, Millville, NJ). Se rellenaron los viales con 1,5 ml de la mezcla lípido diluyente. El procesó se dimensionó mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, sin embargo, esta vez, se produjo un tamaño comprendido entre 4-6 micras, con más del 95% de las partículas de menos de 10 micras.
Ejemplo 7 Ensayo de estabilidad de liposomas rellenos con gas perfluorobutano bajo presión usando atenuación acústica in vitro
Se prepararon bicapas rellenas de gas perfluorobutano formuladas como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se tomaron muestras que variaron en concentraciones de lípidos entre 1 mg ml^{-1} y 1 mg ml^{-1} en alícuotas de 200 \mul que se diluyeron 10.000:1 en suero salino normal como diluyente Las muestras se mezclaron inicialmente con un agitador magnético para inducir homogeneidad, y a continuación se apagó el equipo. Se uso una placa de acero inoxidable como un reflector perfecto, situado aproximadamente a 25 cm del origen del transductor. El transductor empleado fue un transductor de inmersión no focalizado de banda ancha de 5,0 MHz (Panametrics, Waltham, MA). Todos los datos se transfirieron mediante un conector 488.2 GPIB (National Instruments, Austin, TX) y se procesaron en un procesador Gateway 2000 80486.
Antes de muestrear las bicapas lipídicas rellenas de gas, se realizó un control de línea base en suero salino normal, únicamente inmediatamente después de establecer las condiciones de control, se añadió una alícuota de 200 \mul a la solución salina, y se acumularon datos durante 90 segundos a temperatura ambiente (20ºC). La atenuación del sonido (ver Figura 4) fue constante a lo largo de los 90 segundos con una atenuación de 2,0 + 0,5 dB cm^{-1}. Se obtuvo una segunda muestra en la que la se hizo ascender la presión de la muestra hasta 120 mm Hg, y se registró la atenuación. Como en el experimento de la temperatura ambiente, la atenuación permaneció constante con pocas variaciones durante el periodo de ensayo de 90 segundos, sin embargo, la atenuación fue de aproximadamente unos 0,9 db cm^{-1}. Otra muestra se midió a continuación a 37ºC. De nuevo, durante el periodo de ensayo de 90 segundos, la atenuación fue constante y en torno a 0,9 db cm^{-1}. Se midió una muestra final a 37ºC y una presión de 120 mm Hg. Esta vez, la atenuación descendió de forma lineal con el tiempo desde 0,9 db cm^{-1} hasta 0,4 db cm^{-1} durante 90 segundos. Esto demostró la estabilidad incrementada de esta formulación respecto de las bicapas lipídicas rellenas de nitrógeno.
Ejemplo 8
(Ejemplo comparativo)
Ensayo de estabilidad de liposomas rellenos con gas nitrógeno bajo presión usando atenuación acústica in vitro
Se realizaron experimentos análogos a los del ejemplo 7, excepto en que las bicapas lipídicas rellenas de gas estuvieron rellenas de gas nitrógeno, según se describe en el Ejemplo 1. La atenuación fue significativa respecto de la estabilidad de la atenuación, tanto para temperatura ambiente 820ºC) como para temperatura corporal humana (37ºC), sin embargo, tras exposición del contenido de la dilución a presión de 120 mm Hg, la atenuación disminuyó súbitamente hasta los valores de la línea base de control. Esto demuestra la falta de estabilidad de las bicapas lipídicas rellenas con nitrógeno bajo presión, en comparación con las bicapas lipídicas rellenas de perfluorobutano.
Ejemplo 9 Efecto de la concentración de lípido sobre el tamaño promedio ponderado en número de liposomas rellenos con gas perfluorociclobutano
Se prepararon bicapas rellenas de gas perflurociclobutano como se describe en el Ejemplo 5, excepto que se emplean 3 concentraciones distintas de formulación lipídica. La formulación estaba comprendida en un diluyente que contenía solución salina normal (suero fisiológico) : propilén glicol: glicerol (8:1:1, v:v:v). Se añadió a lo anterior hasta una concentración final de entre 1 y 5 mg ml^{-1} una mezcla de dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC) : ácido dipalmitoil fosfatídico : dipalmitoil fosfatidil etanolamina-PEG5000 (DPPE-PEG5000) en una relación molar de 82:10:8 (% en moles). Las muestras se prepararon en viales de 2 ml (volumen real = 3,7 ml) (Wheaton Industries, Millville, NJ) y se dimensionaron en un sistema dimensionador de partículas por oscurecimiento de luz Particle Sizing Systems Model 770. La siguiente Tabla describe los resultados.
La Tabla 9 demuestra el efecto de la concentración de lípidos sobre el tamaño promedio de las bicapas lipídicas rellanes con perfluorocarburo, empleando perfluorociclobutano como gas de ejemplo.
TABLA 9 Efecto de la concentración de lípidos sobre los liposomas rellenos con gas perfluorociclobutano
Concentración de lípidos Tamaño medio del liposoma ponderado
por número
1,0 mg ml^{-1} 3,1 \mum
3,0 mg ml^{-1} 3,8 \mum
5,0 mg ml^{-1} 4,7 \mum
Ejemplo 10 Demostración de la falta de cambios hemodinámicos usando liposomas rellenos con gas sustancialmente insoluble
Se prepararon muestras de bicapas lipídicas rellenas de gas que contenían las mezclas de lípidos que se describen en los ejemplos 3, 4, 5 y 6, con concentraciones totales de lípidos de 1 mg ml^{-1} y 3 mg ml^{-1} de lípido, usando perfluoropropano (PFP), perfluorociclobutano (PFCB). Perfluorobutano (PFB) y hexafluoruro de azufre (SHF). Se realizó un diagnostico por imagen de un perro mezcla de razas que pesaba 28 kg aproximadamente mediante una máquina de ultrasonidos Model 5200S Acustic Imaging, equipada con un transductor de 5 megahercios. El animal fue sedado con pentobarbital sódico, ventilado con aire ambiente y se monitorizaron su presión arterial pulmonar, presión arterial sistémica y pulso. Se realizó un diagnóstico por imagen del corazón en la posición del eje corto, y el animal recibió dosis de ensayo de 5 microlitros por kg de PFP, PFCB, PFB y SHF, a concentraciones tanto de 1 mg ml^{-1} como de 3 mg ml^{-1}. Todos los liposomas rellenos con perfluorocarburo (PFP, PFCB, y PFB) mostraron mejoras en la perfusión del miocardio a 1 mg ml^{-1} pero PFB fue más intenso que los demás. PFP mejoró a 3 mg ml^{-1}. Los liposomas rellenos con HSF no demostraron una mejora apreciable en la perfusión del miocardio a 1 mg por ml de lípido, pero mostraron una pronunciada mejora en el miocardio a 3 mg por ml de lípido.
Lo anterior se repitió sustancialmente con otro perro, obteniéndose los mismos resultados.
Los estudios hemodinámicos se llevaron a cabo en otro perro usando liposomas rellenos con perfluoropropano. El animal recibió múltiples dosis rápidas de hasta 300 microlitros por kilogramo cada una, es decir, 50 veces superior a la dosis para diagnostico por imagen. El animal no mostró cambio alguno en ningún parámetro hemodinámico, por lo que las múltiples dosis demuestran la elevada seguridad hemodinámica del agente.
Ejemplo 11 Determinación del índice terapéutico (ventana) basado en los ensayos de toxicidad sobre ratones Balb/C
Se realizaron ensayos de toxicidad en ratones Balb/C que pesaban entre aproximadamente 20 y 25 gramos. Ensayó mediante dosis de absorción rápida las DL_{50} de concentraciones de lípido de 1 mg ml^{-1} para liposomas que atrapaban muestras de perfluoropropano (PFP), perfluorociclobutano (PFCB), perfluorobutano (PFB) y hexafluoruro de azufre (SHF). Las DL_{50} de cada uno de los PFP, PFCB y PFB fueron cada una mayores de 12 mg kg^{-1}, mientras que para las bicapas lipídicas rellenas de gas SHF fue superior a 30 mg kg^{-1}, indicando que los índices terapéuticos son superiores que 2.400 a 1 y 6.000 a 1, respectivamente, para estos productos útiles en el diagnóstico por ultrasonidos.
Ejemplo 12 Uso de liposomas rellenos con gas perfluoropentano como agente de contraste para ultrasonidos
Se anestesiaron conejos New Zealand White con una inyección intramuscular de 1 cc kg^{-1} de Rabbit mix (8:5:2:, v:v:v, xilacina, 20 mg ml^{-1} : cetamina, 10 mg ml^{-1} :acepromacina, 100 mg ml^{-1} ) Los conejos se sometieron a diagnostico por imagen de ultrasonidos mediante un Acoustic Imaging Model 5200 y un analizador con efecto Doppler Acoustinc Imaging Model 5200S Color Doppler (Acoustic Imaging, Phoenix, AZ). Los conejos fueron inyectados mediante un catéter tipo mariposa 23 G a través de la vena marginal de la oreja. Se proporciono a los conejos dosis comprendidas entre 0,1 cc kg^{-1} hasta 0,1 cc kg^{-1} de las bicapas lipídicas rellenas con perfluoropentano a lo largo de 5-10 segundos. Las vistas del eje mayor usando un transductor de 7,5 mHz revelaron imágenes brillantes de las cuatro cámaras del corazón y el miocardio en un periodo entre aproximadamente 20 minutos hasta aproximadamente una hora. El transductor se movió entonces sobre la región del hígado, donde se observó un brillante contraste en la vena hepática, vena porta hepática, así como en los senos hepáticos. A continuación, se coloco el transductor sobre el riñón, lo que reveló contraste en las regiones de la médula y el córtex, así como en la visualización de la arteria renal. El transductor de imágenes por ultrasonidos se sustituyó por un doppler color, y se observó un contraste brillante y mantenido en todos los tejidos vascularizados del cuerpo animal.
Ejemplo 13 Efecto de diferentes concentraciones de perfluoropropano y aire sobre el número y tamaño de los liposomas rellenos con gas
Se prepararon muestras múltiples de soluciones de lípidos (1 mg por ml; relación molar en % de 82:10:8 DPPC:
DPPA:DPPE-PEG-5000) en relaciones ponderales de 8:1:1 de suero salino normal :glicerol :propilén glicol en viales de 2 ml (tamaño real 3,7 ml) (Wheaton Industries, Millville, NJ) y se colocaron en un liofilizador modificado Edwards Modelo SO4 con cuatro pies cúbicos de capacidad y se sometieron a presión reducida. Las cámaras de los viales re rellenaron a continuación con 80% de PFP y 20% de aire, 60% de PFP y 40% de aire, 50% de PFP y 50% de aire, 20% de PFP y 80% de aire o 100% de aire. Los porcentajes de vas en las cámaras de las diferentes muestras se confirmaron mediante cromatografía de gases en un Hewlett Packard Gas Chromatograph model 1050L con software de interfase Hewlett Packard Chem^{TM}. La detección fue por ionización de llama. A continuación, las muestras de agitaron a 3.300 rpm durante 60 segundos usando el Wig-L-Bug^{TM}, y los tamaños de liposomas se determinaron mediante dimensionamiento óptico de partículas, tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados se mostraron anteriormente en la Tabla 2.

Claims (17)

1. Un envase hermético que tiene una composición estéril contenida en su interior, donde dicha composición estéril comprende una fase acuosa de lípidos en suspensión con una cámara de gas sustancialmente separada que contiene un gas sustancialmente insoluble combinado con un gas soluble, dicha fase acuosa de lípidos en suspensión comprende fosfolípidos, y la mencionada composición estéril, tras agitación previa al uso, produce liposomas rellenos de gas para uso como agente de contraste.
2. Un envase hermético de acuerdo con la Reivindicación 1 en el que el mencionado gas sustancialmente insoluble se selecciona entre el grupo constituido por hexafluoruro de azufre, perfluoropropano, perfluorobutano, perfluorociclobutano, perfluorometano, perfluoroetano y perfluoropentano.
3. Un envase hermético de acuerdo con la Reivindicación 2 en el que el mencionado gas sustancialmente insoluble se selecciona entre el grupo constituido por perfluoropropano y perfluorobutano.
4. Un envase hermético de acuerdo con la Reivindicación 3 en el que el mencionado gas sustancialmente insoluble es perfluoropropano.
5. Un envase hermético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el mencionado gas soluble se selecciona entre el grupo constituido por aire, oxígeno, dióxido de carbono y nitrógeno.
6. Un envase hermético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el mencionado fosfolípido se selecciona entre el grupo constituido por dipalmitoilfosfatidilcolina, ácido dipalmitoilfosfatídico y dipalmitoilfosfatidiletanolamina.
7. Un envase hermético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la mencionada suspensión acuosa de lípidos comprende además un ligando flecha.
8. Un envase hermético de acuerdo con la Reivindicación 7 en el que el mencionado ligando flecha es polietilénglicol
9. Un envase hermético de acuerdo con la Reivindicación 7 u 8 en el que la mencionada fase de lípido en suspensión comprende dipalmitoilfosfatidilcolina, ácido dipalmitoilfosfatídico o dipalmitoilfosfatidiletanolamina-PEG5000.
10. Un envase hermético de acuerdo con la Reivindicación 9 en el que la mencionada fase acuosa de lípido en suspensión comprende dipalmitoilfosfatidilcolina, ácido dipalmitoilfosfatidico y dipalmitoilfosfatidiletanolamina-PEG5000 en una relación de aproximadamente 82%:10%:8 en porcentaje de moles.
11. Un envase hermético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la mencionada fase acuosa de lípido en suspensión comprende además un agente suspensor.
12. Un envase hermético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la mencionada fase acuosa de lípido en suspensión comprende además un agente modificador de la viscosidad.
13. Un envase hermético de acuerdo con la Reivindicación 12 en el que el mencionado agente modificador de la viscosidad se selecciona entre el grupo constituido por glicerol, propilén glicol y alcohol de polivinilo.
14. Un envase hermético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la mencionada fase acuosa de lípido en suspensión comprende además un agente terapéutico o de diagnóstico.
15. Un envase hermético de acuerdo con la Reivindicación 14 en el que el mencionado agente de diagnóstico es un agente mejorador del contraste en MRI.
16. Un envase hermético de acuerdo con la Reivindicación 15 en el que el mencionado agente mejorador del contraste en MRI es un ion paramagnético.
17. Un envase hermético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la mencionada fase acuosa de lípido en suspensión comprende además un polímero.
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