ES2335206T3 - Liposomas llenos de gas que comprenden un gas insoluble en combinacion con un gas soluble. - Google Patents
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Abstract
Un liposoma lleno de gas que comprende un gas sustancialmente insoluble en combinación con un gas soluble, en donde al menos 1% de la cantidad total del gas es un gas sustancialmente insoluble.
Description
Liposomas llenos de gas que comprenden un gas
insoluble en combinación con un gas soluble.
Los ultrasonidos son una técnica de formación de
imágenes de diagnóstico que proporciona numerosas ventajas
importantes en comparación con otras metodologías de diagnóstico. Al
contrario que las técnicas de formación de imágenes tales como la
medicina nuclear y los rayos X, los ultrasonidos no exponen al
paciente a los efectos perniciosos de la radiación ionizante.
Además, los ultrasonidos son relativamente económicos y pueden
aplicarse como examen portátil.
En la formación de imágenes por ultrasonidos, se
transmite a un paciente o animal por medio de un transductor.
Cuando las ondas sonoras se propagan a través del cuerpo, encuentran
interfaces de tejidos y fluidos. Dependiendo de las propiedades
acústicas de los tejidos y los fluidos en el cuerpo, las sondas
sonoras ultrasónicas son reflejadas o absorbidas parcial o
totalmente. Cuando las sondas sonoras son reflejadas por una
interfaz las mismas son detectadas por el receptor en el
transductor y procesadas para formar una imagen. Las propiedades
acústicas de los tejidos y fluidos dentro del cuerpo determinan el
contraste que aparece en la imagen resultante.
La formación de imágenes por resonancia
magnética (MRI) es una técnica de formación de imágenes
relativamente nueva que, al contrario que los rayos X, no utiliza
radiación ionizante. Al igual que la tomografía computerizada, la
MRI puede obtener imágenes en corte transversal del cuerpo; sin
embargo, la MRI tiene la ventaja adicional de poder obtener
imágenes en cualquier plano de escaneo (es decir, axial, coronal,
sagital u ortogonal).
La MRI emplea un campo magnético, con gradientes
de energía de radiofrecuencia y campo magnético para obtener
imágenes del cuerpo. El contraste o las diferencias de intensidad de
señal entre los tejidos reflejan principalmente los valores de
relajación T1 y T2 y la densidad de protones (de hecho, el contenido
de agua libre) de los tejidos.
En los últimos años se han logrado avances en la
tecnología de diagnóstico por ultrasonidos y MRI. Sin embargo, a
pesar de las diversas mejoras tecnológicas, los ultrasonidos y la
MRI son todavía herramientas imperfectas en cierto número de
aspectos, particularmente en lo que respecta a la formación de
imágenes y la detección de enfermedades en el hígado y el bazo, los
riñones, el corazón y la vasculatura, con inclusión de la medida
del flujo sanguíneo. La capacidad para detectar estas regiones y
realizar tales medidas depende de la diferencia en las propiedades
acústicas (ultrasónicas) o la intensidad de las señales T1 y T2
(MRI) entre los tejidos o fluidos y los tejidos o fluidos
circundantes. De acuerdo con ello, se han buscado agentes de
contraste que aumenten estas diferencias entre tejidos o fluidos y
los tejidos o fluidos circundantes, y mejoren la formación de
imágenes ultrasónicas o por resonancia magnética y la detección de
enfermedades. Como resultado de este esfuerzo, se han desarrollado
nuevos y mejores agentes de contraste. Sin embargo, un problema
recurrente con muchos de tales agentes de contraste ha sido la
estabilidad de vida útil, lo que hace que el almacenamiento a largo
plazo constituya un problema.
La presente invención proporciona un liposoma
lleno de gas como se expone en las reivindicaciones adjuntas. Se
describe también en esta memoria un recipiente que comprende (i) una
fase de suspensión acuosa de lípido y (ii) una fase gaseosa
sustancialmente separada de la fase de suspensión acuosa de lípido.
Antes del uso, los contenidos del envase pueden agitarse,
produciendo con ello una composición de liposomas llenos de gas que
tiene utilidad excelente como agente de contraste para uso, por
ejemplo, en formación de imágenes por ultrasonidos o resonancia
magnética, así como en aplicaciones terapéuticas. La posibilidad de
preparar el agente de contraste inmediatamente antes de utilizarlo
evita los problemas de estabilidad de vida útil experimentados con
muchos agentes de contraste de la técnica anterior. La unidad
autónoma permite también una esterilización fácil.
Estos y otros aspectos y ventajas se exponen con
mayor detalle a continuación.
La Figura 1 es una vista lateral en corte
transversal de un envase lleno con una suspensión acuosa de lípidos
y un espacio de cabeza de gas sustancialmente separado.
La Figura 2 es un diagrama de un dispositivo de
agitación que puede emplearse para agitar el envase de la Figura 1,
mezclando de este modo la suspensión acuosa de lípidos y el gas y
produciendo un agente de contraste para formación de imágenes
ultrasónicas o de resonancia magnética.
La Figura 3 es una fotomicrografía de liposomas
llenos de gas producidos utilizando el envase que se muestra en la
Figura 1 y el dispositivo de agitación que se muestra en la Figura
2.
El liposoma lleno de gas de la presente
invención se expone en la reivindicación 1. Realizaciones preferidas
se exponen en las reivindicaciones subordinadas.
El envase comprende una fase de suspensión
acuosa de lípidos y una fase gaseosa sustancialmente separada.
Antes del uso, el envase y su contenido pueden agitarse, haciendo
que las fases de lípido y gas se mezclen, dando como resultado la
formación de liposomas llenos de gas que atrapan el gas. Los
liposomas llenos de gas resultantes proporcionan un agente
excelente de mejora del contraste para formación de imágenes de
diagnóstico, utilizando particularmente formación de imágenes por
ultrasonidos o resonancia magnética.
Una gran diversidad de lípidos pueden emplearse
en la fase de suspensión acuosa de lípidos. Los lípidos pueden ser
saturados o insaturados, y pueden encontrarse en forma lineal o
ramificada, según se desee. Lípidos de este tipo pueden comprender,
por ejemplo, moléculas de ácidos grasos que contienen un amplio
intervalo de átomos de carbono, comprendido de modo preferible
entre aproximadamente 12 átomos de carbono y aproximadamente 22
átomos de carbono. Pueden emplearse asimismo grupos hidrocarbonados
constituidos por unidades isoprenoides, grupos prenilo, y/o restos
esterol (v.g., colesterol, sulfato de colesterol, y análogos de los
mismos). Los lípidos pueden llevar también cadenas de polímero,
tales como los polímeros anfipáticos polietilenglicol (PEG) o
polivinilpirrolidona (PVP) o derivados de los mismos (para
direccionamiento in vivo), o aminoácidos cargados tales como
polilisina o poliarginina (para fijación de un compuesto cargado
negativamente), o carbohidratos (para direccionamiento in
vivo) tal como se describe en la patente U.S. no. 4.310.505, o
glicolípidos (para direccionamiento in vivo), o anticuerpos
y otros péptidos y proteínas (para direccionamiento in
vivo), etc., en caso deseado. Dichos compuestos de
direccionamiento o fijación pueden añadirse simplemente a la fase
de suspensión acuosa de lípidos o pueden unirse químicamente de modo
específico a los lípidos. Los lípidos pueden ser también lípidos
aniónicos o catiónicos, en caso deseado, de tal modo que pueden ser
capaces por sí mismos de fijar otros compuestos tales como productos
farmacéuticos, material genético, u otros agentes terapéuticos.
Ejemplos de clases de lípidos adecuados y
lípidos específicos adecuados incluyen: fosfatidilcolinas, tales
como dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina,
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), y diestearoilfosfatidilcolina;
fosfatidiletanolaminas, tales como dipalmitoilfosfatidiletanolamina
(DPPE), dioleoilfosfatidiletanolamina y
N-succinil-dioleoil-fosfatidiletanol-amina;
fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, esfingolípidos;
glicolípidos, tales como el gangliosido GM1; glucolípidos;
sulfátidos; glicoesfingolípidos; ácidos fosfatídicos, tales como
ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA); ácidos grasos palmíticos;
ácidos grasos esteáricos; ácidos grasos araquidónicos; ácidos
grasos láuricos; ácidos grasos mirísticos; ácidos grasos
lauroleicos; ácidos grasos fisetéricos; ácidos grasos
miristoleicos; ácidos grasos palmitoleicos; ácidos grasos
petroselínicos; ácidos grasos oleicos; ácidos grasos isoláuricos;
ácidos grasos isomirísticos; ácidos grasos isopalmíticos; ácidos
grasos isoesteáricos; colesterol y derivados de colesterol, tales
como hemisuccinato de colesterol, sulfato de colesterol, y butanoato
de colesteril-(4'-trimetil-amonio);
ésteres de ácidos grasos con polioxietileno; alcoholes de ácidos
grasos con polioxietileno; alcoholéteres de ácidos grasos con
polioxietileno; ésteres de ácidos grasos de sorbitán
polioxietilados; oxiestearato de
glicerol-polietilenglicol; ricinoleato de
glicerol-polietilenglicol; esteroles de soja
etoxilados; aceite de ricino etoxilado; polímeros
polioxietileno-polioxi-propileno-ácido
graso; polioxietileno-ácido graso-estearatos; ácido
12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)-carbonil)-metilamino)-octadeca-noico;
ácido
N-[12-(((7'-dietilamino-cumarin-3-il)-carbonil)-metil-amino)octadecanoil]-2-amino-palmítico;
1,2-dioleoil-sn-glicerol;
1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol;
1,3-dipalmitoil-2-succinil-glicerol;
y
1-hexadecil-2-palmitoil-glicerofosfo-etanolamina
y palmitoilhomocisteína; bromuro de lauriltrimetilamonio (lauril- =
dodecil-); bromuro de cetiltrimetilamonio (cetil- = hexadecil-);
bromuro de miristiltrimetilamonio (miristil- = tetradecil-);
cloruros de alquildimetilbencilamonio, tales como aquéllos en los
cuales alquil es un alquilo C_{12}, C_{14} o C_{16}; bromuro
de bencildimetildodecilamonio; cloruro de
bencildimetildodecilamonio, bromuro de bencildimetilhexadecilamonio;
cloruro de bencildimetilhexadecilamonio; bromuro de
bencildimetiltetradecilamonio; cloruro de
bencildimetiltetradecilamonio; bromuro de cetildimetiletilamonio;
cloruro de cetildimetiletilamonio; bromuro de cetilpiridinio;
cloruro de cetilpiridinio;
N-[1,2,3-dioleoiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA);
1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano
(DOTAP); y
1,2-dioleoil-e-(4'-trimetilamonio)-butanoil-sn-glicerol
(DOTB).
Como será evidente para los expertos en la
técnica, una vez provistos de las presentes descripciones, la lista
de lípidos que antecede es únicamente ilustrativa, y pueden
emplearse otros lípidos, ácidos grasos y derivados útiles y
combinaciones de los mismos, y tales compuestos adicionales deben
considerarse también dentro del alcance del término lípido, como se
utiliza en esta memoria. Como reconocerá el operario experto, tales
lípidos y/o combinaciones de los mismos pueden, después de
agitación del envase, formar liposomas (es decir, esferas de
lípidos que tienen un vacío interno) que atrapan el gas de la fase
gaseosa en su vacío interno. Los liposomas pueden estar
constituidos por una sola capa lipídica (una monocapa lipídica), dos
capas lipídicas (una bicapa lipídica) o más de dos capas lipídicas
(una multicapa lipídica).
Como cuestión general, se prefiere que los
lípidos se mantengan en el estado de gel, es decir por debajo del
estado de gel hasta la temperatura de transición de fase al estado
de cristal líquido (T_{m}) del material lipídico, particularmente
durante la agitación. Las temperaturas de transición de fase del
estado de gel al estado de cristal líquido de diversos lípidos son
bien conocidas. Tales temperaturas pueden calcularse también
fácilmente utilizando técnicas bien conocidas. La Tabla 1,
siguiente, de Derek Marsh, "CRC Handbook of Lipid Bilayers"
página 139, CRC Press, Boca Raton, Florida (1990), presenta, por
ejemplo, las temperaturas de transición de fase de la cadena
principal para una diversidad de lípidos de fosfocolina saturados
representativos.
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En una realización preferida de la invención, la
fase acuosa de lípido comprende adicionalmente un polímero,
preferiblemente un polímero anfipático, y con preferencia uno que
está unido directamente (es decir, unido químicamente) al lípido.
Preferiblemente, el polímero anfipático es polietilenglicol o un
derivado del mismo. La combinación más preferida es el lípido
dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE) unido a
polietilenglicol (PEG), especialmente PEG con un peso molecular
medio de aproximadamente 5.000 (DPPE-PEG 5.000). El
PEG u otro polímero puede estar unido a DPPE u otro lípido por un
enlace covalente, por ejemplo un eslabón amida, carbamato o
amídico. Alternativamente, pueden utilizarse eslabones éster, éter,
tioéster, tioamida o disulfuro (tioéster) (sic) con el PEG u otro
polímero para unir el polímero a, por ejemplo, colesterol u otros
fosfolípidos. Una combinación particularmente preferida de lípidos
es DPPC, DPPE-PEG 5.000 y DPPA, especialmente en una
relación de aproximadamente 82%:8%:10% (% molar),
DPPC:DPPE-PEG 5.000:DPPA.
Para preparar la fase acuosa, el lípido puede
combinarse con agua (preferiblemente agua destilada), solución
salina normal (fisiológica), solución salina tamponada con fosfato,
u otra solución de base acuosa, como será evidente para los
expertos en la técnica.
Una gran diversidad de gases diferentes pueden
emplearse en la fase gaseosa de la presente invención.
Preferiblemente los gases son sustancialmente insolubles en la fase
de suspensión acuosa de lípidos. Por sustancialmente insoluble, se
entiende que el gas mantiene una solubilidad en agua a 20ºC y 1
atmósfera de presión igual a o menor que aproximadamente 18 ml de
gas por kg de agua. Como tales, los gases sustancialmente insolubles
tienen una solubilidad que es menor que la solubilidad del
nitrógeno gaseoso. Preferiblemente, la solubilidad es igual a o
menor que aproximadamente 15 ml de gas por kg de agua, más
preferiblemente igual a o menor que aproximadamente 10 ml de gas
por kg de agua, a 20ºC y 1 atmósfera de presión. En una clase de
gases preferible, la solubilidad está comprendida entre
aproximadamente 0,001 y aproximadamente 18 ml de gas por kg de agua,
o entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 15 ml de gas por kg
de agua, o entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg de gas
por kg de agua, o entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 mg de
gas por kg de agua, o entre aproximadamente 2 y 6 ml por kg de
agua, a la temperatura y presión mencionadas anteriormente. Los
gases perfluorocarbonados y el gas fluorado hexafluoruro de azufre
son, por ejemplo, menos solubles que 10 ml de gas por kg de agua, a
20ºC y 1 atmósfera de presión, y por tanto se prefieren. Los gases
que no son sustancialmente insolubles, como se define en esta
memoria, se consideran como gases solubles.
Otros gases sustancialmente insolubles o
solubles adecuados incluyen, pero sin carácter limitante,
hexafluoroacetona, isopropilacetileno, aleno, tetrafluoroaleno,
fluoruro de boro, 1,2-butadieno,
1,3-butadieno,
1,2,3-triclorobutadieno,
2-fluoro-1,3-butadieno,
2-metil-1,3-butadieno,
hexafluoro-1,3-butadieno, butadiíno,
1-fluorobutano, 2-metilbutano,
decafluorobutano (perfluorobutano), decafluoroisobutano
(perfluoroisobutano), 1-buteno,
2-buteno,
2-metil-1-buteno,
3-metil-1-buteno,
perfluoro-1-buteno,
perfluoro-1-buteno (sic),
perfluoro-2-buteno,
4-fenil-3-buteno-2-ona,
2-metil-1-buteno-3-ino,
nitrato de butilo, 1-butino,
2-butino,
2-cloro-1,1,1,4,4,4-hexafluoro-butino,
3-metil-1-butino,
perfluoro-2-butino,
2-bromo-butiraldehído, sulfuro de
carbonilo, crotononitrilo, ciclobutano, metilciclobutano,
octafluorociclobutano (perfluorociclobutano), perfluoroisobutano,
3-clorociclopenteno, ciclopropano,
1,2-dimetilciclopropano,
1,1-dimetilciclopropano, etilciclopropano,
metilciclopropano, diacetileno,
3-etil-3-metildiaziridina,
1,1,1-trifluorodiazoetano, dimetilamina,
hexafluorodimetilamina, dimetiletilamina,
bis-(dimetil-fosfina)amina,
2,3-dimetil-2-norbornano,
perfluorodimetilamina, cloruro de dimetiloxonio,
1,3-dioxolano-2-ona,
1,1,1,1,2-tetrafluoroetano,
1,1,1-trifluoroetano,
1,1,2,2-tetrafluoroetano,
1,1,2-tricloro-1,2,2-trifluoroetano,
1,1-dicloroetano,
1,1-dicloro-1,2,2,2-tetrafluoroetano,
1,2-difluoroetano,
1-cloro-1,1,2,2,2-pentafluoroetano,
2-cloro-1,1-difluoroetano,
1-cloro-1,1,2,2-tetrafluoroetano,
2-cloro-1,1-difluoroetano,
cloroetano, cloropentafluoroetano, diclorotrifluoroetano,
fluoroetano, nitropentafluoroetano,
nitrosopentafluoro-etano,
perfluoro-etano, perfluoroetilamina,
etil-viniléter,
1,1-dicloro-etileno,
1,1-dicloro-1,2-difluoro-etileno,
1,2-difluoro-etileno, metano,
cloruro de metanosulfonilo trifluorado, fluoruro de metanosulfonilo
trifluorado, (pentafluorotio)metano trifluorado,
metano-bromo-difluoro-nitroso,
metano-bromo-fluoro,
metano-bromo-cloro-fluoro,
metano-bromo-trifluorado,
metano-cloro-difluoro-nitro,
metano-cloro-dinitro,
metano-cloro-fluoro,
metano-clorotrifluorado,
metano-cloro-difluoro,
metano-dibromo-difluoro,
metano-dicloro-difluoro,
metano-dicloro-fluoro,
difluorometano,
metano-difluoro-yodo,
metano-disilano, metano-fluoro,
metano-yodometano-yodo-trifluorado,
metanonitro-trifluorado,
metano-nitroso-trifluorado,
tetrafluorometano,
metano-tricloro-fluoro,
metano-trifluorado, cloruro de metanosulfenilo
trifluorado, 2-metil-butano,
metil-éter, metilisopropil-éter, lactato de metilo, nitrito de
metilo, sulfuro de metilo, metilviniléter, neopentano, nitrógeno
(N_{2}), óxido nitroso, ácido
1,2,3-nonadecanotricarboxílico-2-hidroxitrimetiléster,
1-noneno-3-ino,
oxígeno (O_{2}), oxígeno 17 (^{17}O_{2}),
1,4-pentadieno, n-pentano,
dodecafluoropentano (perfluoropentano), tetradecafluorohexano
(perfluorohexano), perfluoroisopentano, perfluoroneopentano,
2-pentanona-4-amino-4-metilo,
1-penteno, 2-penteno {cis},
2-penteno {trans},
1-penteno-3-bromo,
1-penteno-perfluoro, ácido
ftálico-tetracloro,
piperidina-2,3,6-trimetil-propano,
propano-1,1,1,2,2,3-hexafluoro,
propano-1,2-epoxi,
propano-2,2-difluoro,
propano-2-amino,
propano-2-cloro,
propano-heptafluoro-1-nitro,
propano-heptafluoro-1-nitroso,
perfluoropropano, propeno,
propil-1,1,1,2,3,3-hexafluor-2,3-dicloro,
propileno-1-cloro,
propileno-cloro-{trans},
propileno-2-cloro,
propileno-3-fluoro,
propileno-perfluoro, propino,
propino-3,3,3-trifluorado,
estireno-3-fluoro, hexafluoruro de
azufre, azufre (di)-decafluoro (S_{2}F_{10}),
tolueno-2,4-diamino,
trifluoro-acetonitrilo, peróxido de
trifluorometilo, sulfuro de trifluorometilo, hexafluoruro de
wolframio, vinil-acetileno, viniléter, neón,
helio, kriptón, xenón (especialmente xenón gaseoso hiperpolarizado
enriquecido en rubidio), dióxido de carbono, helio, y aire. Se
prefieren gases fluorados (es decir, un gas que contiene una o más
moléculas de flúor, tales como hexafluoruro de azufre), gases
fluorocarbonados (por ejemplo, un gas fluorado que es un carbono o
gas fluorado), y gases perfluorocarbonados (es decir, un gas
fluorocarbonado que está totalmente fluorado, tal como
perfluoropropano y perfluoro-
butano).
butano).
Si bien prácticamente cualquier gas puede
emplearse teóricamente en las fases gaseosas descritas en esta
memoria de la presente invención, puede seleccionarse un gas
particular para optimizar las propiedades deseadas del medio de
contraste resultante y ajustarse a la aplicación diagnóstica
particular. Se ha encontrado, por ejemplo, que ciertos gases hacen
más estables que otros gases los liposomas llenos de gas después de
agitación, y se prefieren gases de este tipo. Se ha encontrado
también que ciertos gases proporcionan mejores resultados de imagen
en la formación de imágenes de diagnóstico tal como por ultrasonidos
o MRI.
Como un ejemplo de estabilidad creciente de los
liposomas llenos de gas, se ha encontrado que dióxido de carbono
< oxígeno < aire < hidrógeno < neón = helio < gases
perfluorocarbonados. Por estas y otras razones se prefieren los
gases fluorados, particularmente gases perfluorocarbonados.
Asimismo, aunque en algunos casos los gases
solubles funcionarán adecuadamente como la fase gaseosa, los gases
sustancialmente insolubles tienden a dar como resultado una mayor
estabilidad que los gases de solubilidad mayor, particularmente en
cuanto a la creación del agente de contraste por agitación.
Asimismo, será más fácil mantener una fase gaseosa con tales gases
insolubles sustancialmente separados de la fase acuosa de lípido
antes de la agitación. Así pues, se prefieren los gases
sustancialmente insolubles, como se han definido anteriormente.
La calidad de las imágenes ultrasónicas y la
duración de tales imágenes está también correlacionada con la
solubilidad del gas en el medio acuoso. La disminución en la
solubilidad del gas, en general, ofrece una imagen de mejor
resolución y mayor duración en ultrasonidos.
Adicionalmente, se ha observado por regla
general que el tamaño de un liposoma lleno de gas producido por
agitación está correlacionado con la solubilidad del gas en el medio
acuoso, dando los gases de mayor solubilidad liposomas llenos de
gas de mayor tamaño. Se cree también que el tamaño de los liposomas
puede verse influenciado por la interacción del gas con la pared
interna de los liposomas. Específicamente, se cree que la
interacción en la interfaz afecta a la tensión, y por consiguiente,
a la fuerza hacia fuera del gas interior en la pared lipídica
interior del liposoma. Una disminución en la tensión permite
liposomas de menor tamaño por disminución de la fuerza ejercida por
el gas interior, permitiendo así que la fuerza ejercida sobre el
exterior del liposoma por el medio acuoso contraiga el liposoma
lleno de gas.
La solubilidad de los gases en los disolventes
acuosos puede estimarse por el uso de la Ley de Henry, dado que la
misma es aplicable generalmente a presiones hasta aproximadamente 1
atmósfera de presión y para gases que son ligeramente solubles
(Daniels, F. y Alberty, R.A., Physical Chemistry, 3ª edición, Wiley
& Sons, Inc., Nueva York, 1966). Como ejemplo, el aire
atmosférico posee una solubilidad de 18,68 ml en 1 kg de agua a
25ºC, el nitrógeno mantiene una solubilidad de aproximadamente 18,8
ml kg^{-1} a 25ºC. El hexafluoruro de azufre, por otra parte,
tiene una solubilidad de aproximadamente 5,4 ml kg^{-1} a
25ºC.
En suma, los ácidos fluorados, gases
fluorocarbonados, y gases perfluorocarbonados se prefieren por
razones de estabilidad, insolubilidad, y tamaño de los liposomas
resultantes. Se prefieren particularmente el gas fluorado
hexafluoruro de azufre, y los gases perfluorocarbonados
perfluoropropano, perfluorobutano, perfluorociclobutano,
perfluorometano, perfluoroetileno, y perfluoropentano, especialmente
perfluoropropano y perfluorobutano.
Debe indicarse que los perfluorocarbonos que
tienen menos de 5 átomos de carbono son gases a la temperatura
ambiente. El perfluoropentano, por ejemplo, es un líquido hasta
aproximadamente 27ºC. Por encima de esta temperatura, el mismo
ocupará el espacio de cabeza del envase. Sin embargo, se ha
demostrado que el perfluoropentano puede utilizarse también para
llenar el espacio de cabeza (es decir, el espacio en el vial por
encima de la fase de suspensión lipídica) incluso a la temperatura
ambiente. Por selección de un valor definido de perfluoropentano
líquido calculado para llenar el espacio de cabeza y adición del
líquido al envase a una temperatura baja, v.g., -20ºC, y
evacuando el envase (eliminando de manera eficaz el espacio de
cabeza de aire) y sellando luego el envase, el perfluoropentano
sufrirá una transición de fase líquida a fase vapor a una
temperatura inferior a su punto de ebullición a 1 atmósfera. Así, a
la temperatura ambiente, el mismo ocupará algo o la totalidad del
espacio de cabeza con gas. Como reconocerán los expertos en la
técnica, puede estimarse la disminución en la temperatura de
transición de la fase líquida a la fase vapor utilizando una
estimación común de una "regla de tanteos". Específicamente,
para cada disminución en la presión a la mitad, la temperatura de
ebullición disminuirá aproximadamente 10ºC. Alternativamente, puede
calcularse la disminución de la temperatura en función de la
presión reducida utilizando relaciones basadas en la ley de los
gases ideales basada en la ley de Boile. Otro método para llenar el
espacio de cabeza con perfluoropentano consiste en evacuar
primeramente el espacio de cabeza y llenar después el espacio de
cabeza con perfluoropentano gaseoso por encima de 27ºC. Por
supuesto, este método no se limita a perfluoropentano
exclusivamente, sino que se aplica a todos los gases
perfluorocarbonados, así como a gases en general, con tal que el
punto de ebullición del gas sea conocido.
Si se desea, pueden utilizarse dos o más gases
diferentes juntos para llenar el espacio de cabeza. Una mezcla de
gases puede presentar varias ventajas en un gran número de
aplicaciones de los liposomas llenos de gas resultantes (tales como
aplicaciones en la formación de imágenes por ultrasonidos, formación
de imágenes por MR, etc.). Se ha encontrado que una pequeña
cantidad de un gas sustancialmente insoluble puede mezclarse con un
gas soluble para proporcionar mayor estabilidad que la que sería de
esperar por la combinación. Por ejemplo, una pequeña cantidad de un
gas perfluorocarbonado (por regla general al menos aproximadamente
1% molar, por ejemplo) puede mezclarse con aire, nitrógeno,
oxígeno, dióxido de carbono u otros gases más solubles. El agente
de contraste de liposomas llenos de gas resultante producido después
de la agitación puede ser entonces más estable que el aire,
nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono u otros gases más solubles
solos.
Adicionalmente, el uso de una mezcla de gases
puede utilizarse para compensar el aumento en el tamaño de los
liposomas llenos de gas que podría ocurrir en caso contrario in
vivo en el caso de que se inyectaran in vivo liposomas
que contuvieran gases perfluorocarbonados puros. Se ha encontrado
que algunos gases perfluorocarbonados pueden tender a absorber o
embeber otros gases tales como oxígeno. Así, si el gas
perfluorocarbonado se inyecta por vía intravenosa, el mismo puede
absorber el oxígeno u otros gases solubles disueltos en la sangre
circulante. Las burbujas resultantes pueden crecer entonces in
vivo como resultado de esta absorción. Provistos del
conocimiento de este fenómeno, es posible entonces premezclar el gas
perfluorocarbonado con un gas soluble, tal como aire, nitrógeno,
oxígeno, dióxido de carbono, saturando con ello el perfluorocarbono
de sus propiedades adsorbentes o de imbibición. Por consiguiente,
esto podría retardar o incluso eliminar el potencial para la
expansión de los liposomas llenos de gas en el torrente sanguíneo.
Esto es importante teniendo en cuenta el hecho de que en caso de
que un liposoma crezca hasta un tamaño mayor que 10 \muM, pueden
producirse sucesos embólicos potencialmente peligrosos si se
administra al torrente sanguíneo. Por llenado del espacio de cabeza
con gases más solubles que el gas perfluorocarbonado, junto con el
gas perfluorocarbonado, los liposomas llenos de gas no sufrirán por
regla general este aumento de tamaño después de inyección in
vivo. Así, como resultado de la presente invención, el problema
de los sucesos embólicos como resultado de la expansión de los
liposomas puede evitarse por producción de liposomas en los cuales
dicha expansión se elimina o se retarda suficientemente.
Así, de acuerdo con la presente invención, un
gas sustancialmente insoluble puede combinarse con un gas soluble
para producir eficientemente liposomas llenos de gas muy efectivos y
estables.
La Tabla 2 siguiente proporciona un análisis de
muestras de liposomas llenos de gas preparados utilizando
porcentajes variables del gas sustancialmente insoluble
perfluoropropano (PFP) y aire como gases del espacio de cabeza. Los
gases se combinaron con una fase acuosa de lípido por agitación
durante 60 segundos a 3300 RPM. Se utilizó un instrumento Optical
Particle Sizer (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) para
analizar el tamaño de los liposomas llenos de gas y para realizar
los recuentos totales. Se utilizó un volumen de muestra de 5
microlitros para cada análisis, utilizando 4 muestras para cada
determinación.
Como se muestra en la Tabla 2, incluso cuando
sólo 20% del gas era PFP (un gas sustancialmente insoluble) y 80%
del gas era aire (una mezcla de gases solubles), se produjeron 100
veces más liposomas que cuando se utilizó aire solo (0% de PFP).
Además, cuando se utilizó aire solo (0% PFP), los liposomas eran
mucho menos estables y una fracción mayor eran superiores a 10
micrómetros. Los liposomas producidos con 20% PFP y 80% aire, en
cambio, resultaban prácticamente tan estables como los liposomas
obtenidos con 80% de PFP y 20% de aire, así como las otras muestras
con concentración de PFP intermedia, y la mezcla de 20% PFP con 80%
de aire producía aproximadamente tantos liposomas llenos de gas
como 80% PFP con 20% de aire.
En la Tabla 2, STDev = Desviación Estándar, y CV
= Coeficiente de Varianza. También en la Tabla 2, E+ denota un
exponente a una cierta potencia, por ejemplo, 5,45 E+ 05 = 5,45 x
10^{5}.
En resumen, se ha encontrado que únicamente una
pequeña cantidad de un gas relativamente insoluble (tal como PFP)
es necesaria para estabilizar los liposomas, siendo la gran mayoría
del gas un gas soluble. Aunque la solubilidad efectiva de la
combinación de dos o más gases, tal como se calcula por la fórmula
siguiente
puede ser sólo ligeramente
diferente que la solubilidad del gas soluble, existe todavía un gran
recuento de liposomas llenos de gas y estabilidad de los liposomas
llenos de gas con sólo una pequeña cantidad de gas insoluble
añadido.
Aunque no se pretende quedar ligados por teoría
de operación alguna, se cree que el gas sustancialmente insoluble
es importante para un efecto de estabilización de membrana. De
hecho, se cree que el gas sustancialmente insoluble (tal como PFP)
actúa como barrera contra la membrana lipídica, formando
posiblemente de modo eficaz una capa sobre la superficie interna de
la membrana, que retarda el escape del gas soluble (tal como aire,
nitrógeno, etc.). Este descubrimiento es a la vez sorprendente y
útil, dado que permite utilizar sólo una pequeña cantidad del gas
sustancialmente insoluble (v.g., un perfluorocarbono u otro gas
fluorado) y primariamente un gas más biocompatible (menos
potencialmente tóxico) tal como aire o nitrógeno que comprende la
mayor parte del volumen del liposoma.
La cantidad de gases sustancialmente insolubles
y gases solubles en cualquier mezcla puede variar ampliamente, como
reconocerá un experto en la técnica. De acuerdo con la presente
invención, al menos 1% de la cantidad total del gas es un gas
sustancialmente insoluble, y muy preferiblemente al menos
aproximadamente 10%. Los intervalos adecuados de gas
sustancialmente insoluble varían, dependiendo de diversos factores
tales como el gas soluble a emplear adicionalmente, el tipo de
lípido, la aplicación particular, etc. Intervalos ilustrativos
incluyen entre aproximadamente 1% y aproximadamente 99% de gas
sustancialmente insoluble, de modo preferible entre aproximadamente
1% y aproximadamente 95%, de modo más preferible entre
aproximadamente 10% y aproximadamente 90%, y de modo muy preferible
entre aproximadamente 30% y aproximadamente 85%.
Para otros usos más allá de la formación de
imágenes diagnósticas por ultrasonidos, tales como usos para la
formación de imágenes diagnósticas de resonancia magnética (MRI),
gases paramagnéticos tales como el gas fuertemente paramagnético
oxígeno 17 (^{17}O_{2}), neón, xenón (especialmente xenón
gaseoso hiperpolarizado enriquecido con rubidio), u oxígeno (que es
todavía, aunque menos fuertemente, paramagnético), por ejemplo, se
utilizan preferiblemente para llenar el espacio de cabeza, aunque
pueden utilizarse también otros gases. De modo muy preferible,
^{17}O_{2} gaseoso, neón, xenón gaseoso hiperpolarizado
enriquecido con rubidio, u oxígeno gaseoso se combina con un gas
sustancialmente insoluble tal como, por ejemplo, un gas
perfluorocarbonado. Los gases paramagnéticos son muy conocidos en
la técnica y gases paramagnéticos adecuados serán fácilmente
evidentes para los expertos en la técnica. El gas más preferido para
aplicaciones MRI, tanto si se utiliza solo como en combinación con
otro gas, es ^{17}O_{2}.
Utilizando una combinación de gases, el
^{17}O_{2} u otro gas paramagnético proporciona el contraste
óptimo y el compuesto perfluorocarbonado estabiliza el
^{17}O_{2} gaseoso dentro del gas atrapado después de
agitación. Sin la adición del gas perfluorocarbonado, gases tales
como ^{17}O_{2} son generalmente mucho menos eficaces, dado que
debido a su solubilidad el mismo se difunde fuera de la trampa de
lípido después de inyección intravenosa. Adicionalmente, el
^{17}O_{2} gaseoso es muy caro. La combinación del gas
perfluorocarbonado con ^{17}O_{2} gaseoso aumenta notablemente
la eficacia del producto y reduce el coste por un uso más eficiente
del costoso ^{17}O_{2} gaseoso. Análogamente, pueden mezclarse
otros gases con propiedades paramagnéticas deseables, tales como
neón, con los gases perfluorocarbonados.
Como revela la Tabla 3, siguiente, pueden
utilizarse una gran diversidad de gases diferentes en la aplicación
de formación de imágenes por MR. En la Tabla 3, se muestran los R2
(1/T2/mmol/L.s^{-1}) para diferentes gases en los liposomas
llenos de gas. Como muestra la Tabla 3, existen diferencias
espectaculares en la relaxividad de los diferentes liposomas llenos
de gas, siendo tanto más eficaces los liposomas como agentes de
formación de imágenes por MR cuanto mayores son los valores de
relajación R2. De los gases que se muestran, el aire tiene el valor
R2 más alto. Se cree que el aire es el más alto debido al efecto
paramagnético del oxígeno en el aire. El oxígeno puro, sin embargo,
es algo menos eficaz, debido probablemente a la mayor solubilidad
del oxígeno y la equilibración del oxígeno en el medio acuoso que
rodea los liposomas. Con aire, el nitrógeno (el aire es
aproximadamente 80% de nitrógeno) ayuda a estabilizar el oxígeno en
el interior de los liposomas. El nitrógeno tiene una solubilidad en
agua mucho menor que el aire. Como se ha indicado arriba, el PFP u
otros gases perfluorocarbonados pueden mezclarse con un gas más
activo magnéticamente tal como aire, oxígeno, ^{17}O_{2} o
xenón hiperpolarizado enriquecido con rubidio. Al hacer esto, pueden
prepararse liposomas llenos de gas estables y muy activos
magnéticamente.
El espacio de cabeza del envase puede llenarse
con el gas a la presión ambiente, a presión reducida o a presión
aumentada, según se desee.
En el envase descrito en esta memoria, la fase
gaseosa está sustancialmente separada de la fase acuosa de
suspensión lipídica. Por sustancialmente separada, se entiende que
menos de aproximadamente el 50% del gas está combinado con la fase
lipídica acuosa, antes de la agitación. Con preferencia, menos de
aproximadamente 40%, de modo más preferible menos de
aproximadamente 30%, de modo aún más preferible menos de
aproximadamente 20%, y de modo muy preferible menos de
aproximadamente 10% del gas está combinado con la fase lipídica
acuosa. La fase gaseosa se mantiene sustancialmente separada de la
fase lipídica acuosa, hasta aproximadamente el momento de su
utilización, en cuyo momento se agita el envase y la fase gaseosa y
la fase lipídica acuosa se combinan para formar una suspensión
acuosa de liposomas llenos de gas. De esta manera, se produce un
agente de contraste excelente para formación de imágenes
ultrasónicas o de resonancia magnética. Además, dado que el agente
de contraste se prepara inmediatamente antes de su utilización, se
minimizan los problemas de estabilidad de vida útil.
La agitación puede realizarse de una gran
diversidad de maneras y puede incluir agitación mecánica y/o manual,
así como agitación por otros medios tales como sonicación (ondas
sonoras). Se prefiere la agitación mecánica y/o manual. La
agitación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante sacudidas,
batido, turbulencia, vibración, etc. Preferiblemente, puede
emplearse un dispositivo de agitación tal como el representado en la
Figura 2. Específicamente, en la Figura 2, se muestra un
dispositivo de agitación mecánica (10). La agitación puede
comenzarse e interrumpirse utilizando el botón de
marcha-parada (11). El dispositivo de agitación (10)
comprende además un botón (12) que proporciona un ajuste de
velocidad (RPM) variable. Por giro del botón (12) en el sentido de
las agujas del reloj se consigue aumentar la velocidad de agitación
(en RPMs). Inversamente, girando el botón (12) en sentido contrario
a las agujas de reloj, se reduce la velocidad de agitación. El
contenido de un envase puede agitarse colocando el envase en el
módulo de alojamiento (13) del dispositivo de agitación (10). El
módulo de alojamiento (13) sirve como medio de agitación del
dispositivo de agitación (10). Para fijar el envase firmemente en
su lugar en el módulo de alojamiento para la agitación, se utiliza
un tornillo (14).
El envase empleado puede adoptar una diversidad
de formas diferentes. El mismo puede, en caso deseado, ser como se
muestra en la Figura 1, teniendo el envase (1) un cuerpo (2) y una
cápsula (3), que contiene un espacio de cabeza de gas (4) y una
suspensión acuosa de lípidos (5) sustancialmente separados uno de
otro. Alternativamente, el envase puede adoptar la forma de una
jeringuilla pre-llenada, que puede, en caso deseado,
estar provista de uno o más filtros. En este caso, las jeringuillas
están llenas con una fase gaseosa y un espacio de cabeza de un gas
preseleccionado. Las jeringuillas se colocan generalmente en el
dispositivo de agitación con sus ejes largos orientados
perpendicularmente a la dirección de sacudida. Después de la
agitación mediante sacudidas, los liposomas llenos de gas se
producen en la jeringuilla, listos para ser utilizados.
Preferiblemente, el envase, tanto si se trata de un envase del tipo
representado en la Figura 1, una jeringuilla, u otro tipo de
envase, junto con el contenido, es estéril.
Puede utilizarse una diversidad de materiales
diferentes para producir los envases, con inclusión de las
jeringuillas, tales como vidrio común, vidrio de borosilicato,
vidrio de silicato, polietileno, polipropileno,
politetrafluoretileno, poliacrilatos, poliestireno, u otros
plásticos. Los envases preferidos, con inclusión de jeringuillas,
son o bien impermeables a los gases o están envueltos interiormente
con una barrera exterior impermeable a los gases antes del llenado
con gas. Esto es deseable, por supuesto, para mantener la integridad
del gas preseleccionado dentro del envase. Ejemplos de materiales
de jeringuilla que tienen capacidades de hermeticidad a los gases
pueden incluir, pero sin carácter en absoluto limitante, vidrios de
silicato o borosilicato, provistos de jeringuillas fundidas de
sílice o jeringuillas de tipo de cierre Luer, y émbolos con punta de
teflón o recubiertos de teflón.
Como reconocería un experto en la técnica, una
vez provisto de la esencia de la presente descripción, pueden
emplearse diversos aditivos en la fase de suspensión acuosa de
lípidos para estabilizar dicha fase, o para estabilizar los
liposomas llenos de gas después de la agitación. Si se desea, estos
aditivos pueden añadirse a la fase acuosa de lípido antes de la
agitación, o pueden añadirse a la composición después de la
agitación y preparación resultante de los liposomas llenos de gas.
El uso de tales aditivos dependerá, por supuesto, de la aplicación
particular propuesta para los liposomas llenos de gas resultantes,
como será fácilmente evidente para los expertos en la técnica.
Numerosos agentes estabilizadores que pueden
emplearse en la presente invención están disponibles, con inclusión
de goma de xantano, acacia, agar, agarosa, ácido algínico, alginato,
alginato de sodio, carragenano, dextrano, dextrina, gelatina, goma
guar, tragacanto, goma de algarrobilla, bassorina, karaya, goma
arábiga, pectina, caseína, bentonita, bentonita impurificada,
bentonita purificada, magma de bentonita, coloidal (sic), celulosa,
celulosa (microcristalina), metilcelulosa, hidroxietilcelulosa,
hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa,
carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa cálcica,
carboximetilcelulosa sódica, carboximetilcelulosa sódica 12, y
otras celulosas naturales o naturales modificadas, polisorbato,
Carbomer 934P, aluminosilicato de magnesio, monoestearato de
aluminio, poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico),
povidona, polietilenglicol, propilenglicol, polivinilpirrolidona,
dióxido de silicio, y dióxido de silicio coloidal.
Asimismo, pueden utilizarse compuestos tales
como bromuro de perfluorooctilo (PFOB), yoduro de perfluorooctilo,
perfluorotripropilamina, y perfluorotributilamina en la fase
lipídica como agentes estabilizadores. Los perfluorocarbonos con
más de 5 átomos de carbono serán generalmente líquidos a la
temperatura del cuerpo, y tales perfluorocarbonos son también muy
preferidos como agentes estabilizadores. Perfluorocarbonos adecuados
incluyen perfluorohexano, perfluoroheptano, perfluorooctano,
perfluorodecalina, y perfluorododecalina.
Adicional-mente, pueden utilizarse lípidos
perfluorados o lípidos parcialmente fluorados como ayuda para la
estabilización. Como será evidente para los expertos en la técnica,
pueden utilizarse una gran diversidad de análogos perfluorados y
parcialmente fluorados de los lípidos descritos en la presente
invención. Debido a su naturaleza hidrófoba relativa con respecto a
los lípidos hidrocarbonados, tales lípidos perfluorados o
parcialmente fluorados pueden proporcionar incluso ventajas en
términos de estabilidad. Ejemplos de lípidos perfluorados o
parcialmente fluorados son F_{6}C_{11} fosfatidilcolina (PC) y
F_{8}C_{5}PC. Tales análogos se describen, por ejemplo, en
Santaella et al., Federation of European Biochemical
Societies (FEBS), vol. 336, no. 3, pp. 418-484
(1993), cuyas descripciones se incorporan como tales en esta
memoria por referencia en su totalidad.
Una gran diversidad de agentes biocompatibles
pueden utilizarse también para el propósito de favorecer la
estabilización, tales como aceite de cacahuete, aceite de canola,
aceite de oliva, aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de
almendras, aceite de algodón, aceite de Persia, aceite de sésamo,
aceite de soja, aceite mineral, aceite mineral ligero, oleato de
etilo, alcohol miristílico, miristato de isopropilo, palmitato de
isopropilo, octildodecanol, propilenglicol, glicerol, escualeno, o
cualquier otro aceite conocido comúnmente como ingerible. Estos
pueden incluir también lecitina, esfingomielina, colesterol, sulfato
de colesterol, y triglicéridos.
La estabilización puede efectuarse también por
adición de una gran diversidad de modificadores de viscosidad (es
decir, agentes que modifican la viscosidad), que pueden servir como
agentes estabilizadores de acuerdo con la presente invención. Esta
clase de compuestos incluyen, pero sin carácter en absoluto
limitante: 1) carbohidratos y sus derivados fosforilados y
sulfonados; 2) poliéteres con intervalos de peso molecular entre
400 y 8.000; 3) di- y trihidroxi-alcanos y sus
polímeros en el intervalo de pesos moleculares comprendido entre
800 y 8.000. Pueden utilizarse también liposomas en conjunción con
agentes emulsionantes y/o solubilizantes que pueden estar
constituidos, pero sin carácter en absoluto limitante, por acacia,
colesterol, dietanolamina, monoestearato de glicerilo, alcoholes
lanolínicos, lecitina, mono- y diglicéridos, monoetanolamina, ácido
oleico, alcohol oleílico, Poloxamer, estearato de
polioxietileno-50, aceite de ricino
polioxil-35, éter oleílico
polioxil-10, éter cetoestearílico
polioxil-20,
estearato-polioxil-40, polisorbato
20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80, diacetato de
propilenglicol, monoestearato de propilenglicol,
lauril-sulfato de sodio, estearato de sodio,
monolaurato de sorbitán, monooleato de sorbitán, monopalmitato de
sorbitán, monoestearato de sorbitán, ácido esteárico, trolamina,
cera emulsionante, Pluronic F61, Pluronic F64 y
Pluronic F68.
Pluronic F68.
Otros agentes que pueden añadirse incluyen
agentes de tonicidad tales como polialcoholes tales como glicerol,
propilenglicol, poli(alcohol vinílico), polietilenglicol,
glucosa, manitol, sorbitol, cloruro de sodio y análogos.
Si se desea, pueden incluirse en la formulación
agentes antibactericidas (sic) y/o conservantes. Tales agentes
incluyen benzoato de sodio, todas las sales de amonio cuaternario,
azida de sodio, metil-parabén,
propil-parabén, ácido sórbico, sorbato de potasio,
sorbato de sodio, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado,
hidroxitolueno butilado, clorobutanol, ácido deshidroacético, ácido
etilendiamina-tetraacético (EDTA), monotioglicerol,
benzoato de potasio, metabisulfito de potasio, sorbato de potasio,
bisulfito de sodio, dióxido de azufre, y sales mercuriales
orgánicas.
orgánicas.
Si se desea, puede utilizarse un agente de
osmolaridad para controlar la osmolaridad. Materiales osmóticamente
activos adecuados incluyen compuestos fisiológicamente compatibles
tales como azúcares monosacáridos, azúcares disacáridos,
alcoholes-azúcar, aminoácidos, y diversos compuestos
sintéticos. Azúcares monosacáridos o alcoholes
azúcar-adecuados incluyen, por ejemplo, eritrosa,
treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa,
manosa, idosa, galactosa, talosa, trealosa, ribulosa, fructosa,
sorbitol, manitol, y sedoheptulosa, siendo los monosacáridos
preferibles fructosa, manosa, xilosa, arabinosa, manitol y sorbitol.
Azúcares disacáridos adecuados incluyen, por ejemplo, lactosa,
sacarosa, maltosa, y celobiosa. Aminoácidos adecuados incluyen, por
ejemplo, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina,
glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina e
histidina. Compuestos sintéticos incluyen, por ejemplo, glicerol,
propilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, polietilenglicol
y polivinil-pirrolidona. Diversos otros materiales
osmóticamente activos adecuados son bien conocidos por los expertos
en la técnica, y se considera que están comprendidos dentro del
alcance del término agente osmóticamente activo como se utiliza en
esta memoria.
Una diversidad de polímeros, tales como los
arriba expuestos, pueden añadirse también para una diversidad de
propósitos y usos diferentes.
Como reconocerán los expertos en la técnica,
puede emplearse un amplio intervalo de cantidades de aditivos,
tales como los agentes de suspensión arriba descritos, en la fase de
suspensión lipídica acuosa, en caso necesario o deseado,
dependiendo del uso final particular. Tales aditivos pueden
comprender generalmente entre 0,01% en volumen y aproximadamente
95% en volumen de la formulación de agente de contraste resultante,
aunque pueden emplearse cantidades mayores o menores. A modo de
orientación general, un agente de suspensión está presente
típicamente en una cantidad de al menos aproximadamente 0,5% en
volumen, de modo más preferible al menos aproximadamente 1% en
volumen, y de modo aún más preferible al menos aproximadamente 10%
en volumen. Generalmente, el agente de suspensión está presente
típicamente en una cantidad menor que aproximadamente 50% en
volumen, de modo más preferible menor que aproximadamente 40% en
volumen, de modo aún más preferible menor que aproximadamente 30%
en volumen. Una cantidad típica de agente de suspensión podría ser
aproximadamente 20% en volumen, por ejemplo. Asimismo, típicamente,
para conseguir intervalos de osmolaridad preferidos por regla
general, se emplean menos de aproximadamente 25 g/l, de modo más
preferible menos de aproximadamente 20 g/l, de modo aún más
preferible menos de aproximadamente 15 g/l, y de modo aún más
preferible menos de aproximadamente 10 g/l de los materiales
osmóticamente activos, y en algunos casos no se emplea cantidad
alguna de materiales osmóticamente activos. Un intervalo muy
preferido de materiales osmóticamente activos está comprendido por
regla general entre aproximadamente 0,002 g/l y aproximadamente 10
g/l. Estos, así como otros, intervalos adecuados de aditivos serán
fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, una vez que se
hallen en posesión de la presente
invención.
invención.
Una gran diversidad de agentes terapéuticos y/o
diagnósticos pueden incorporarse también en la fase de suspensión
lipídica acuosa simplemente añadiendo los agentes terapéuticos o
diagnósticos deseados a dicha fase. Agentes terapéuticos y
diagnósticos adecuados, y las cantidades adecuadas de los mismos,
serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, una vez
provistos de la presente descripción. Estos agentes pueden
incorporarse en o sobre las membranas lipídicas, o encapsularse en
los liposomas resultantes.
Para mejorar adicionalmente el efecto magnético
de los liposomas llenos de gas resultantes para MRI, por ejemplo,
pueden añadirse uno o más agentes mejoradores del contraste MRI,
tales como agentes mejoradores del contraste paramagnéticos o
superparamagnéticos. Agentes mejoradores del contraste de MRI útiles
incluyen iones paramagnéticos tales como metales de transición, con
inclusión de hierro (Fe^{+3}), cobre (Cu^{+2}), y manganeso
(Mn^{+2}) y los lantánidos tales como gadolinio (Gd^{+3}) y
disprosio (Dy^{+3}), nitróxidos, óxidos de hierro
(Fe_{3}O_{4}), sulfuros de hierro y partículas paramagnéticas
tales como hidroxiapatitos sustituidos con manganeso (Mn^{+2}).
Asimismo, agentes tales como cromo (Cr^{+3}), níquel (Ni^{+2}),
cobalto (Co^{+2}) y propio (Eu^{+2}) son otros ejemplos de
iones paramagnéticos que pueden utilizarse. Pueden utilizarse otros
agentes intensificadores del contraste tales como radicales
nitróxido o cualquier otro átomo que mantenga un espín electrónico
no apareado con propiedades paramagnéticas. Idealmente, el agente
intensificador de contraste se añade a la fase lipídica acuosa
antes de la agitación, y está diseñado de tal manera que, después de
la agitación, el agente intensificador del contraste se incorpora
en o sobre la superficie del liposoma lleno de gas resultante,
aunque es también posible la adición después de la preparación de
los liposomas. El liposoma lleno de gas resultante puede tener
relaxividad notablemente incrementada, proporcionando un agente de
contraste especialmente eficaz para formación de imágenes por
resonancia magnética. A modo de ejemplo, el manganeso (Mn^{+2}) se
incorporará por sí mismo en los grupos de cabeza del lípido cuando
se utiliza fosfatidilcolina o fosfatidilserina en la fase lipídica
acuosa. Si se desea, los metales pueden encontrarse en forma de
quelatos utilizando compuestos liposolubles como se muestra, por
ejemplo, en Unger et al., patente U.S. No. 5.312.617, cuyas
descripciones se incorporan por la presente en esta memoria por
referencia, en su totalidad. Tales compuestos liposolubles son muy
útiles, dado que los mismos se incorporarán fácilmente en la
membrana liposómica. Los óxidos de hierro y otras partículas deben
ser generalmente pequeños, preferiblemente inferiores a
aproximadamente 1 \mu, más preferiblemente inferiores a
aproximadamente 200 nm, y muy preferentemente menores que 100 nm, a
fin de conseguir la incorporación óptima en o sobre la superficie
del liposoma. Para incorporación mejorada, pueden utilizarse óxidos
de hierro recubiertos con compuestos alifáticos o lipófilos, dado
que estos tenderán a incorporarse por sí mismos en el recubrimiento
lipídico de la superficie de la burbuja.
La fase de suspensión acuosa lipídica puede
contener un ingrediente que cause gelificación con los polímeros
lipídicos y metales que no se gelifican espontáneamente, o para
mejorar la gelificación, pueden emplearse agentes gelificantes
tales como cationes metálicos polivalentes, azúcares y
polialcoholes. Cationes metálicos polivalentes ilustrativos útiles
como agentes gelificantes incluyen calcio, cinc, manganeso, hierro y
magnesio. Azúcares útiles incluyen monosacáridos tales como
glucosa, galactosa, fructosa, arabinosa, alosa y altrosa,
disacáridos tales como maltosa, sacarosa, celobiosa y lactosa, y
polisacáridos tales como almidón. Preferiblemente, el azúcar es un
azúcar simple, es decir monosacárido o disacárido. Agentes
gelificantes de polialcoholes útiles en la presente invención
incluyen, por ejemplo, glicidol, inositol, manitol, sorbitol,
pentaeritritol, galacitol y poli(alcohol vinílico). Muy
preferiblemente, el agente gelificante empleado en la presente
invención es sacarosa y/o calcio. Los agentes gelificantes
particulares que pueden emplearse en las diversas formulaciones de
la presente invención serán fácilmente evidentes para los expertos
en la técnica, una vez provistos de la presente descripción. Pueden
utilizarse combinaciones de lípidos, v.g. ácido fosfatídico con
sales de calcio o magnesio y polímeros tales como ácido algínico,
ácido hialurónico, o carboximetil-celulosa para
estabilizar los lípidos. Se supone que los cationes divalentes
forman puentes metálicos entre los lípidos y los polímeros para
estabilizar los liposomas llenos de gas en el interior de los
sistemas lípido/polímero. Análogamente, pueden prepararse
suspensiones que contienen mezclas de quitosano (o materiales
basados en quitina), polilisina, polietilenimina y ácido algínico
(o sus derivados) o ácido hialurónico.
Se ha encontrado que la velocidad de agitación,
la cantidad de los lípidos que comprende la fase lipídica acuosa, y
el tamaño del envase herméticamente cerrado pueden afectar al tamaño
final de cualquier liposoma lleno de gas. Adicionalmente, se ha
encontrado que las proporciones de tales agentes pueden ser
importantes así como la distribución de tamaños de los liposomas
llenos de gas. Se cree también que la tensión superficial en la
interfase del liposoma lleno de gas y el medio acuoso es un factor
determinante adicional en el tamaño último del liposoma lleno de
gas, cuando se tiene en cuenta junto con la velocidad de sacudida,
el tamaño del vial, y la concentración de lípi-
dos.
dos.
En un envase estéril lleno con una fase acuosa y
un espacio de cabeza de gas, se ha descubierto de qué modo pueden
realizarse cambios fácil y simplemente a fin de cambiar el tamaño de
los liposomas después de la agitación y obtener con ello un
producto con liposomas de la distribución de tamaños deseada.
Adicionalmente, pueden utilizarse filtros para afinar ulteriormente
la distribución de tamaños del agente de contraste después de la
agitación mediante sacudidas. A continuación se proporciona una
revisión del modo en que pueden utilizarse cambios en los
componentes de la invención para modificar el tamaño de los
liposomas.
En primer lugar, se ha descubierto que los
diferentes materiales que comprende la fase acuosa pueden ser
importantes para controlar el tamaño de los liposomas llenos de gas
resultantes. La Tabla 4 muestra los tamaños de liposomas producidos
por agitación mediante sacudidas de envases estériles llenos con una
fase acuosa y un espacio de cabeza de nitrógeno. En todos los
casos, el tamaño de los liposomas se midió por medio de un
clasificador de partículas Particle Sizing Systems Modelo 770 con
oscurecimiento de la luz (Particle Sizing Systems, Santa Barbara,
CA). Como revelan los datos, la relación de lípidos en la fase
acuosa afecta a la distribución de tamaños de los liposomas llenos
de gas resultantes. Específicamente, la Tabla 4 siguiente muestra el
efecto de la composición de lípidos sobre el tamaño medio de los
liposomas.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 5 demuestra la dependencia de la
concentración de una mezcla de composición de lípidos definida en
el tamaño medio de los liposomas. Como se muestra en la Tabla 5, las
variaciones en las concentraciones totales de lípido son también
importantes por lo que respecta al tamaño de los liposomas después
de la agitación mediante sacudidas. En estos experimentos, la
relación de los tres componentes lípidos diferentes se mantuvo
constante y la concentración de lípido se varió entre 0,5 y 5,0 mg
ml^{-1} en la fase acuosa. El gas utilizado era nitrógeno. Las
burbujas de tamaño óptimo para la diagnosis ultrasónica con un
espacio de cabeza de perfluorobutano se produjeron cuando la
concentración de lípidos en la fase acuosa era 1,0 mg ml^{-1}.
El tamaño de los liposomas puede depender
también de la composición del gas en el espacio de cabeza además de
la concentración de los medios estabilizadores, v.g. lípidos. Por
ejemplo, se ha descubierto que una concentración de 1,0 mg
ml^{-1} de lípidos produce liposomas llenos de gas con
aproximadamente el mismo diámetro cuando se utiliza nitrógeno, que
la concentración de 5,0 mg ml^{-1} de lípidos con perfluorobutano.
Sin embargo, se ha encontrado que la mayor concentración puede dar
como resultado una distribución algo sesgada hacia liposomas llenos
de gas mayores. Este fenómeno tiende a reflejar la estabilidad
incrementada de los liposomas llenos de gas a mayor concentración
de lípidos. Se cree, por tanto, que la mayor concentración de
lípidos contribuye a la estabilidad por actuar como agente
estabilizador en la fase acuosa, o bien, la mayor concentración de
lípidos proporciona más laminillas alrededor del gas, haciéndolas
más estables, y permitiendo así que persista una mayor proporción
de los liposomas mayores. Adicionalmente, se ha descubierto que el
tamaño del espacio de cabeza de gas puede utilizarse también para
afectar al tamaño de los liposomas llenos de gas. Mayores espacios
de cabeza que contienen proporcionalmente más gas con relación al
tamaño de la fase acuosa producirán por regla general mayores
liposomas que los espacios de cabeza de menor tamaño.
La velocidad de agitación es importante para
generar los liposomas del tamaño apropiado. Se ha encontrado que
pueden utilizarse para producir liposomas velocidades de agitación
entre 100 y 10.000 revoluciones por minuto (RPMs); sin embargo,
existen valores óptimos en términos de producción rápida y
reproducible de liposomas de tamaño definido. Una revolución, como
se utiliza dicho término en esta memoria, hace referencia a un solo
movimiento hacia atrás y adelante, arriba y abajo, de lado a lado,
circular, etc., donde el movimiento comienza y termina en (es decir
vuelve a) el punto de origen. La Tabla 3 muestra los tamaños de
liposomas producidos a partir de una fase acuosa constituida por
82% molar de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), con 10% molar de
ácido dipalmitoil-fosfatídico (DPPA) y 8% molar de
dipalmitoilfosfatidil-etanolamina-PEG
5000 (DPPE-PEG 5000), y un espacio de cabeza que
comprende gas perfluoropropano. Las preparaciones se agitaron
mediante sacudidas durante dos minutos en un equipo
Wig-L-Bug^{TM} (Crescent Dental
Mfg., Lyons, Ill.). Utilizando viales de color ámbar de 2 ml
(Wheaton Industries, Millville, NJ; volumen real 3,7 ml) llenos con
una fase acuosa lipídica y un espacio de cabeza de gas, el envase
multifásico se dispuso en el
Wig-L-Bug^{TM} y se midió la
velocidad por medio de un tacómetro Co-Palmer
Modelo 08210 Pistol Grip (Code-Palmer, Nile, Ill.).
La tabla 6 proporciona los resultados, y demuestra el efecto de las
velocidades de agitación sobre el tamaño medio de los liposomas
resultantes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De hecho, se ha descubierto que existe una
velocidad de agitación óptima para producir los liposomas de tamaño
deseado. A la velocidad óptima, los liposomas llenos de gas se
forman muy rápidamente, en menos de 5 minutos, incluso dentro de
uno o dos minutos, e incluso en el transcurso de 30 segundos o
menos. Debe indicarse que el método y el movimiento de agitación
mediante sacudidas son importantes en la formación de liposomas de
tamaño apropiado. En particular, se ha encontrado que se producen
liposomas de tamaño óptimo cuando el movimiento alternativo de la
agitación mediante sacudidas tiene lugar en la forma de un arco. Se
prefiere que el grado del movimiento en arco esté comprendido entre
2º y 20º. Es aún más preferido que el grado del movimiento en arco
esté comprendido entre 4º y 10º. Es todavía más preferido que el
grado de movimiento en arco esté comprendido entre 5º y 8º. Es muy
preferido que el grado del movimiento en arco esté comprendido entre
6º y 7º. Como realización adicional, se ha descubierto que el
número de RPMs está comprendido con preferencia entre
aproximadamente 500 y aproximadamente 10.000, de modo más
preferible entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 5.000, y de
modo muy preferible entre aproximadamente 2500 y aproximadamente
4000.
Es también un descubrimiento importante que el
tamaño, la forma y la cantidad de espacio de cabeza disponible para
la agitación del contenido líquido es también vital para la
formación de liposomas llenos de gas de tamaño óptimo. Por ejemplo,
es un descubrimiento que cuando se utilizan viales de 3,7 ml de
volumen real (vidrio de borosilicato Wheaton 300, Wheaton
Industries, Millville, NJ, a los que se hace referencia como tamaño
de 2 ml, diámetro x altura = 15 mm x 32 mm), el volumen del espacio
de cabeza que contiene el gas esté comprendido preferiblemente
entre aproximadamente 10% y aproximadamente 60% del volumen total
del vial. Generalmente, el espacio de cabeza que contiene el gas en
un vial está comprendido entre aproximadamente 10% y aproximadamente
80% del volumen total de dicho vial, aunque, dependiendo de las
circunstancias particulares y la aplicación deseada, puede ser
apropiado más o menos gas. Más preferiblemente, el espacio de cabeza
comprende entre aproximadamente 30% y aproximadamente 70% del
volumen total. Por lo general, es muy preferido que el volumen del
espacio de cabeza que contiene el gas comprenda aproximadamente 60%
del volumen total del vial.
Por tanto, está claro por la discusión anterior
de la invención que el tamaño óptimo depende de una diversidad de
factores, que incluyen la intensidad y el movimiento de agitación, y
el tamaño, la forma, y el volumen de llenado real de los
viales.
Aunque pueden utilizarse una diversidad de
dispositivos de agitación diferentes para preparar los liposomas
llenos de gas, tales como mezcladores de pinturas, agitadores de
sacudidas de sobremesa y agitadores turbulentos, la geometría de la
agitación mediante sacudidas y la velocidad son importantes para
optimizar la producción de los liposomas llenos de gas. El
Wig-L-Bug^{TM} es el dispositivo
de agitación más preferido.
El tamaño del envase estéril, de la geometría
del envase y la orientación del envase con respecto al aparato de
agitación mediante sacudidas son todos ellos importantes en la
determinación del tamaño de los liposomas llenos de gas. El
dispositivo de sacudida, v.g.,
Wig-L-Bug^{TM}, sacudirá por regla
general más lentamente a medida que el peso del envase estéril
aumenta más allá de un cierto nivel. El
Wig-L-Bug^{TM} estándar sacude
más rápidamente con un vial de 2 ml (volumen real 3,7 ml) que con un
vial de 10 ml. Este experimento se realizó utilizando un vial claro
de 10 ml (Wheaton Industries, Millville, New Jersey) y un vial ámbar
de 2 ml (volumen real 3,7 ml) (Wheaton Industries, Millville, New
Jersey). Una vez más, la velocidad de sacudida se midió utilizando
un tacómetro Code-Palmer Pistol Grip
(Code-Palmer, Nile, Ill.). La Tabla 7 proporciona
los resultados.
La Tabla 7 demuestra la dependencia de la
velocidad de agitación mediante sacudidas de un agitador de
sacudidas eléctrico sobre el tamaño del vial utilizado para las
sacudidas.
En general, se utilizan envases estériles, en
los cuales la fase acuosa está presente ya en el interior de la
botella. Sin embargo, para aplicaciones seleccionadas, el medio de
estabilización puede guardarse en el interior del envase en estado
seco o liofilizado. En este caso, la solución acuosa, v.g. solución
salina estéril tamponada con fosfato, se añade al envase estéril
inmediatamente antes de la agitación mediante sacudidas. Al hacerlo
así, el medio estabilizador rehidratado contenido en la fase acuosa
interaccionará de nuevo con el espacio de cabeza de gas durante la
agitación mediante sacudidas a fin de producir liposomas llenos de
gas como anteriormente. La rehidratación de un medio de suspensión
seco o liofilizado complica necesariamente más el producto y no es
deseada por regla general, pero para ciertas preparaciones puede ser
útil a fin de prolongar adicionalmente la vida útil del producto.
Por ejemplo, ciertos agentes terapéuticos tales como ciclofosfamida,
péptidos, y materiales genéticos (tales como DNA), podrían
hidrolizarse durante el almacenamiento en medio acuoso a largo
plazo. La rehidratación de una muestra previamente liofilizada para
formar la fase acuosa y el espacio de cabeza antes de la agitación
mediante sacudidas puede hacer factible producir liposomas llenos
de gas que contengan compuestos que en caso contrario podían no
tener una vida útil suficiente.
Lo que antecede expone diversos parámetros en la
determinación del tamaño de los liposomas llenos de gas. El tamaño
de los liposomas es importante en términos de maximizar la eficacia
del producto y minimizar la toxicidad. Adicionalmente, los
liposomas deberían ser tan flexibles como sea posible a fin de
maximizar la eficacia y minimizar las interacciones adversas con
los tejidos tales como el alojamiento en los pulmones. El proceso
descrito en esta memoria crea liposomas del tamaño deseado con
membranas elásticas muy delgadas. Dado que las membranas de
liposomas son tan delgadas y flexibles, v.g. únicamente es necesario
1 mg ml^{-1} de lípido para estabilizar las membranas, se ha
encontrado que pueden utilizarse liposomas llenos de gas de mayor
diámetro sin producir hipertensión pulmonar. Por ejemplo, se han
administrado a cerdos dosis 5 veces mayores que la dosis de
formación de imágenes de diagnóstico necesaria sin evidencia alguna
de hipertensión pulmonar. En comparación, dosis mucho menores de
burbujas de aire recubiertas con albúmina de menor diámetro, causan
en estos animales hipertensión pulmonar severa. Debido a que los
liposomas de la presente invención son tan flexibles y deformables,
los mismos se deslizan fácilmente a través de los capilares
pulmonares. Adicionalmente, las tecnologías de recubrimiento
empleadas con los presentes lípidos (v.g. lípidos que llevan
polietilenglicol) reducen las interacciones pulmonares adversas al
mismo tiempo que mejoran la estabilidad y la eficacia del producto
in vitro e in vivo.
El tamaño de los liposomas llenos de gas para
uso como medios de contraste ultrasónicos generales debería ser lo
mayor posible (sin causar efectos embólicos) dado que la
retrodispersión o el efecto de los ultrasonidos es proporcional al
radio elevado a la sexta potencia cuando las frecuencias son tales
que los liposomas llenos de gas están comprendidos en el régimen de
dispersión de Raileigh. Para la MRI, se prefieren también los
liposomas de mayor tamaño de la invención. La aptitud para preparar
y emplear liposomas de mayor tamaño con menos potencial de efectos
tóxicos aumenta su eficacia con relación a otros productos.
Un parámetro adicional que influye en el
contraste por ultrasonidos es la elasticidad de la membrana de los
liposomas. Cuanto mayor es la elasticidad, tanto mayor es el efecto
de contraste. Dado que los presentes liposomas están recubiertos
por membranas ultradelgadas de lípido, la elasticidad es muy similar
a la del gas puro, y la reflectibilidad y el efecto de contraste se
maximizan.
El procedimiento de agitación produce fácilmente
liposomas a partir de una fase acuosa y un espacio de cabeza de gas
en el interior de un envase estéril. El proceso descrito en esta
memoria es suficiente para producir liposomas con propiedades muy
deseables para aplicaciones de formación de imágenes por
ultrasonidos o resonancia magnética. Para aplicaciones
seleccionadas, sin embargo, puede emplearse un filtro a fin de
producir liposomas con distribuciones de tamaños aún más homogéneas
y de diámetros deseados. Por ejemplo, para medir presiones in
vivo en ultrasonidos utilizando fenómenos armónicos de liposomas
llenos de gas, puede ser útil disponer de diámetros de liposomas
muy estrechamente definidos dentro de un intervalo de tamaños
estrecho. Esto se consigue fácilmente por inyección de los
liposomas (producidos por agitación mediante sacudidas del envase
con fase acuosa y espacio de cabeza de gas) a través de un filtro de
tamaño definido. Los liposomas resultantes no serán mayores que una
aproximación muy estrecha del tamaño de los poros del filtro en la
membrana de filtración. Como se ha indicado arriba, para muchas
aplicaciones ultrasónicas o de MRI, es deseable disponer de
liposomas llenos de gas que sean lo mayores posible. Para ciertas
aplicaciones, sin embargo, pueden ser deseables liposomas llenos de
gas mucho más pequeños. En el direccionamiento, por ejemplo, a
tumores u otros tejidos enfermos, puede ser necesario que los
liposomas llenos de gas abandonen el espacio vascular y entren en
los intersticios del tejido. Liposomas llenos de gas mucho más
pequeños pueden ser útiles para estas aplicaciones. Estos liposomas
llenos de gas más pequeños (v.g., apreciablemente inferiores a 1
micrómetro de diámetro) pueden producirse en gran proporción por
modificaciones en los compuestos de la fase acuosa (composición y
concentración), así como en el espacio de cabeza (composición del
gas y volumen del espacio de cabeza), pero también por inyección a
través de un filtro. Liposomas llenos de gas muy pequeños de tamaño
sustancialmente homogéneo pueden producirse por inyección a través
de, por ejemplo, un filtro de 0,22 micrómetros. Los liposomas llenos
de gas de tamaño nanométrico resultantes pueden poseer entonces
propiedades de direccionamiento deseables.
Los ejemplos de suspensiones lipídicas
anteriores pueden esterilizarse también por tratamiento en autoclave
sin cambio apreciable en el tamaño de las suspensiones. La
esterilización del medio de contraste puede realizarse por
tratamiento en autoclave y/o filtración estéril realizadas antes o
después del paso de agitación, o por otros medios conocidos por los
expertos en la técnica.
Después del llenado de los envases con la fase
acuosa y el espacio de cabeza del gas preseleccionado, las botellas
selladas pueden almacenarse indefinidamente. No hay necesidad alguna
de que se precipiten partículas, se rompan los liposomas de gas o
se produzcan otras interacciones adversas entre liposomas llenos de
gas, partículas, coloides o emulsiones. La vida útil del envase
lleno con la fase acuosa y el espacio de cabeza de gas depende sólo
de la estabilidad de los compuestos contenidos en la fase acuosa.
Estas propiedades de vida útil larga y susceptibilidad de
esterilización confieren ventajas sustanciales a la presente
invención con respecto a la técnica anterior. El problema de
estabilidad, tal como lo referente a la agregación y precipitación
de partículas, que era tan común en el campo de los medios de
contraste ultrasónicos, se ha abordado en esta invención.
Se ha encontrado que los liposomas llenos de gas
que se producen por la agitación del envase multifásico tienen una
utilidad excelente como agente de contraste para imágenes de
diagnóstico, tales como imágenes de ultrasonidos o resonancia
magnética. Los liposomas son útiles en la formación de imágenes de
un paciente por regla general, y/o en el diagnóstico específico de
la presencia de tejido enfermo en un paciente. El proceso de
formación de imágenes puede llevarse a cabo por administración de
un liposoma lleno de gas de la invención a un paciente, y escaneo
subsiguiente del paciente utilizando formación de imágenes
ultrasónicas o de resonancia magnética a fin de obtener imágenes
visibles de una región interna de un paciente y/o de cualquier
tejido enfermo en dicha región. Por región de un paciente se
entiende el paciente completo, o un área o porción particular del
paciente. El agente de contraste liposómico puede emplearse para
proporcionar imágenes de la vasculatura, el corazón, el hígado y el
bazo, y en la formación de imágenes de la región gastrointestinal u
otras cavidades corporales, o de cualquier otro modo, como será
evidente fácilmente para los expertos en la técnica, tal como la
identificación de un tejido, la formación de imágenes del conjunto
total de la sangre, etc. Puede emplearse cualquiera de los diversos
tipos de dispositivos de formación de imágenes por ultrasonidos o
resonancia magnética, no siendo crítico para el método el tipo o
Modelo particular del dispositivo.
Los liposomas llenos de gas de la invención
pueden emplearse también para suministrar una gran diversidad de
agentes terapéuticos a un paciente con objeto del tratamiento de
diversas enfermedades, males o afecciones, como reconocerá un
experto en la técnica.
Asimismo, pueden utilizarse liposomas
magnéticamente activos para estimación de la presión por MRI. Los
liposomas aumentan la susceptibilidad global y, de acuerdo con
ello, aumentan la relajación T_{2} pero lo hacen aún más en
cuanto a la relajación T_{2}*. Dado que los efectos o gradientes
de campo estático se ven compensados principalmente en experimentos
de eco de espín (en virtud del pulso del reenfoque de
radiofrecuencia de 180º) el efecto de los liposomas es menos
acusado sobre las secuencias de pulsos ponderados T_{2} que sobre
las T_{2}* en las cuales los efectos del campo estático no están
compensados. El aumento de presión da como resultado pérdida de
liposomas o rotura de liposomas (para los gases más solubles) así
como una disminución en el diámetro de los liposomas. De acuerdo
con ello, 1/T_{2} disminuye con la presión creciente. Después de
la reducción de la presión, algunos de los liposomas remanentes se
re-expanden y 1/T_{2} aumenta de nuevo
ligeramente. Los liposomas compuestos de aproximadamente 80% de PFP
con 20% de aire exhiben una estabilidad incrementada y un ligero
descenso en 1/T_{2} con la presión que vuelve a la línea base
después de la reducción de la presión (es decir, los liposomas son
estables pero exhiben un ligero efecto 1/T_{2} de la presión).
Cuando se obtienen imágenes de eco de gradiente y se mide la
intensidad de la señal, estos efectos son mucho más acusados. La
intensidad de señal aumenta con la presión creciente (1/T_{2}*
disminuye con la presión incrementada). Dado que el experimento se
realiza con relativa rapidez (se requiere menos de una décima parte
del tiempo para realizar las imágenes de eco de gradiente que para
medir T_{2}) (sic). La duración de la exposición a la presión es
mucho menor y los liposomas llenos de nitrógeno vuelven casi a la
línea base después de la reducción de la presión (es decir, existe
una pérdida de liposomas muy pequeña). De acuerdo con ello, la
intensidad de la señal en el eco de gradiente desciende
prácticamente a la línea base al volver a la presión ambiente. Para
medida de la presión por MRI, los liposomas pueden diseñarse de modo
que se rompan con la presión creciente o sean estables pero
disminuya el diámetro de los liposomas con la presión creciente.
Dado que el radio de los liposomas MRI afecta a 1/T_{2}*, esta
relación puede utilizarse para estimar la presión por MRI.
Como reconocería un experto en la técnica, la
administración de los liposomas llenos de gas al paciente puede
llevarse a cabo de diversas maneras, por ejemplo por vía intravenosa
o vía intraarterial por inyección, por vía oral, o por vía rectal.
La dosis útil a administrar y el modo particular de administración
variarán dependiendo de la edad, el peso y el mamífero particular y
la región del mismo a escanear o tratar, y el medio de contraste o
agente terapéutico particular a emplear. Típicamente, la dosis se
inicia a niveles inferiores y aumenta hasta que se alcanza la
mejora de contraste o el efecto terapéutico deseados. El paciente
puede ser cualquier tipo de mamífero, pero muy preferiblemente es
un humano.
Los ejemplos reales que siguen tienen por objeto
ilustrar el modo de empleo de la presente invención, e ilustrar los
principios relativos a la presente invención, así como algunas de
las áreas de utilidad extraordinaria de la invención. Estos
ejemplos son únicamente ilustrativos, y no deben interpretase como
limitantes del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
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Ejemplo
1
Se prepararon bicapas lipídicas llenas de gas en
dos viales de 20 ml con 6 ml de un diluyente que contenía solución
salina normal (fisiológica): propilenglicol:glicerol (8:1:1, v:v:v).
Se añadió a esto en una concentración final de 5 mg ml^{-1}, una
mezcla de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC):ácido
dipalmitoilfosfatídico (DPPA):dipalmitoilfosfatidileta-
nolamina-PEG 5000 (DPPE-PEG 5000) en una relación molar de 82:10:8 (% molar). Las muestras se sellaron luego con tapones de membrana herméticos y que mantenían la presión. Las muestras se purgaron luego y se evacuaron al menos 3 veces con nitrógeno gaseoso (99,98%, Arizona Welding Co., Tucson, AZ). Las muestras se trataron luego en autoclave durante 15 minutos a 121ºC en un esterilizador de vapor Barnstead Modelo C57835 (Barnstead/Thermolyne Corporation, Dubuque, Iowa) o se filtraron en condiciones estériles de 1 a 3 veces a través de un filtro Nuclepore de 0,22 \mum (Costar, Pleasanton, CA). Las muestras se retiraron luego del autoclave y se dejaron enfriar hasta aproximadamente la temperatura del ambiente. Las muestras se agitaron luego tumultuosamente en un agitador turbulento Wig-L-Bug (Crescent Dental Mfg. Co., Lyons, IL.) durante un periodo de 2 minutos. Las mezclas resultantes eran entonces significativas para la formación de bicapas llenas de gas que se asemejaban a una espuma. Las bicapas lipídicas llenas de gas se clasificaron luego por tres métodos en un detector Particle Sizing Systems Modelo 770 con oscurecimiento de la luz (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA), un microscopio óptico Reichert-Jung Modelo 150 equipado con un ocular de calibración (Cambridge Instruments, Buffalo, NY), y un Coulter Modelo (Coulter Industries, Luton Beds, Inglaterra). Las muestras exhibían un tamaño medio numérico ponderado de aproximadamente 5-7 micrómetros con al menos 95% de las partículas menores que 10 micrómetros.
nolamina-PEG 5000 (DPPE-PEG 5000) en una relación molar de 82:10:8 (% molar). Las muestras se sellaron luego con tapones de membrana herméticos y que mantenían la presión. Las muestras se purgaron luego y se evacuaron al menos 3 veces con nitrógeno gaseoso (99,98%, Arizona Welding Co., Tucson, AZ). Las muestras se trataron luego en autoclave durante 15 minutos a 121ºC en un esterilizador de vapor Barnstead Modelo C57835 (Barnstead/Thermolyne Corporation, Dubuque, Iowa) o se filtraron en condiciones estériles de 1 a 3 veces a través de un filtro Nuclepore de 0,22 \mum (Costar, Pleasanton, CA). Las muestras se retiraron luego del autoclave y se dejaron enfriar hasta aproximadamente la temperatura del ambiente. Las muestras se agitaron luego tumultuosamente en un agitador turbulento Wig-L-Bug (Crescent Dental Mfg. Co., Lyons, IL.) durante un periodo de 2 minutos. Las mezclas resultantes eran entonces significativas para la formación de bicapas llenas de gas que se asemejaban a una espuma. Las bicapas lipídicas llenas de gas se clasificaron luego por tres métodos en un detector Particle Sizing Systems Modelo 770 con oscurecimiento de la luz (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA), un microscopio óptico Reichert-Jung Modelo 150 equipado con un ocular de calibración (Cambridge Instruments, Buffalo, NY), y un Coulter Modelo (Coulter Industries, Luton Beds, Inglaterra). Las muestras exhibían un tamaño medio numérico ponderado de aproximadamente 5-7 micrómetros con al menos 95% de las partículas menores que 10 micrómetros.
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Ejemplo
2
Se prepararon bicapas lipídicas llenas de gas en
dos viales de 20 ml con 6 ml de un diluyente que contenía solución
salina normal (fisiológica):propilenglicol:glicerol (8:1:1, v:v:v).
Se añadió a esto en concentraciones finales que variaban entre 1 mg
ml^{-1} y 5 mg ml^{-1}, una mezcla de
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC):ácido
fosfatídico:dipalmitoilfosfatidiletanolamina-PEG
5000 en una relación en peso de 82:10:8 (p:p:p). Se añadieron a
esta mezcla 50 \mul (30,1 \mumoles) de perfluoropentano (PCR,
Gainesville, FL). Se prepararon las muestras a -20ºC y se sellaron
con cápsulas de membrana herméticas y que mantenían la presión. Las
muestras se trataron luego en autoclave durante 15 minutos a 121ºC
en un Esterilizador al Vapor Barnstead Modelo C57835
(Barnstead/Thermolyne Corporation, Dubuque, Iowa). Las muestras se
retiraron luego del autoclave y se dejaron enfriar a aproximadamente
40ºC. Se agitaron luego las muestras de modo turbulento en un
agitador turbulento Wig-L-Bug^{TM}
(Crescent Dental Mfg. Co., Lyons, IL) durante un periodo de 2
minutos. Las mezclas resultantes eran entonces significativas para
la formación de bicapas llenas de gas que se asemejaban a una
espuma. Se registraron el volumen y la altura de la espuma y se
introdujo una muestra en un congelador a -20ºC (Kenmore Brand,
Sears-Roebuck, Chicago, IL). La muestra se retiró
luego al cabo de 3 horas, en cuyo momento se observó que quedaba
aproximadamente el 90% del volumen original. La muestra se dejó en
el congelador durante una noche (aproximadamente 17 horas) y se
retiró, en cuyo momento se descubrió que quedaba el 50% del volumen
original. El vial remanente, utilizado como control, se mantuvo en
una incubadora a 30ºC durante el mismo periodo de tiempo. Se
encontró que no se registraba pérdida alguna de volumen, lo que era
indicativo de que el enfriamiento del gas en el interior de las
bicapas llenas de gas se había condensado (sic), reduciendo con ello
el volumen de gas. Finalmente, la muestra fría se puso luego en la
incubadora a 30ºC, encontrándose que al cabo de aproximadamente 45
minutos, se había restablecido el 20% del volumen de espuma
original. Esto es indicativo del hecho de que el gas condensado se
había volatilizado de nuevo una vez más y había expandido el tamaño
de los liposomas llenos de gas.
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Ejemplo
3
Se utilizó el mismo procedimiento que en el
Ejemplo 1 excepto que el gas utilizado era perfluoropropano (99,99%,
Alcon Surgical, Fort Worth, TX) y el tamaño del vial utilizado era
un vial ámbar de 2 ml (volumen real = 3,7 ml). (Wheaton, Millville,
NJ). Los viales se llenaron con 1,5 ml de la mezcla lípido/diluyente
vehículo. El proceso se clasificó por el mismo método del Ejemplo
1; sin embargo, esta vez se produjo un tamaño de 4-6
micrómetros, siendo más del 95% de las partículas menores que 10
micrómetros.
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Ejemplo
4
Se utilizó el mismo procedimiento que en el
Ejemplo 1 excepto que el gas utilizado era perfluorobutano (97+%,
Flura Corporation, Nashville, TN) y el tamaño del vial utilizado era
un vial ámbar de 2 ml (volumen real = 3,7 ml) (Wheaton, Millville,
NJ). Los viales se llenaron con 1,5 ml de la mezcla lípido/diluyente
vehículo. El proceso se clasificó por el mismo método que en el
Ejemplo 1; sin embargo, esta vez se produjo un tamaño de
4-6 micrómetros, siendo más del 95% de las
partículas inferiores a 10 micrómetros.
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Ejemplo
5
Se utilizó el mismo procedimiento que en el
Ejemplo 1 excepto que el gas utilizado era perfluorociclobutano
(99,8%, Pfaltz & Bauer, Waterbury, Connecticut) y el tamaño del
vial utilizado era un vial ámbar de 2 ml (volumen real = 3,7 ml)
(Wheaton, Millville, NJ). Los viales se llenaron con 1,5 ml de la
mezcla lípido/diluyente vehículo. El proceso se clasificó por el
mismo método que en el Ejemplo 1; sin embargo, esta vez se produjo
un tamaño de 4-6 micrómetros, siendo más del 95% de
las partículas inferiores a 10 micrómetros.
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Ejemplo
6
Se utilizó el mismo procedimiento que en el
Ejemplo 1 excepto que el gas utilizado era hexafluoruro de azufre
(99,99%, Alcon Surgical Fort Worth, TX) y el tamaño del vial
utilizado era un vial ámbar de 2 ml (volumen real = 3,7 ml)
(Wheaton, Millville, NJ). Se llenaron los viales con 1,5 ml de la
mezcla lípido/diluyente vehículo. El proceso se clasificó por el
mismo método que en el Ejemplo 1; sin embargo, esta vez se produjo
un tamaño de 4-6 micrómetros, siendo más del 95% de
las partículas inferiores a 10 micrómetros.
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Ejemplo
7
Se formularon bicapas lipídicas llenas de
perfluorobutano gaseoso como se describe en el Ejemplo 4. Muestras
que variaban en concentraciones de lípido entre 1 mg ml^{-1} y 5
mg ml^{-1} se dividieron en partes alícuotas de 200 \mul y se
diluyeron en relación 10.000:1 en solución salina normal como
diluyente. Las muestras se mezclaron inicialmente con un agitador
magnético para inducir homogeneidad y se dejaron luego en reposo. Se
utilizó una chapa de acero inoxidable como reflector perfecto,
situada aproximadamente a 25 cm del origen del transductor. El
transductor utilizado era un transductor de inmersión no enfocado de
banda ancha de 5,0 MHz (Panametrics Waltham, MA). Todos los datos
se transfirieron por medio de una placa de 488,2 GPIB (National
Instruments, Austin, TX) y se procesaron en un procesador Gateway
2000 80486.
Antes de la toma de muestras de las bicapas
lipídicas llenas de gas, se realizó un control de la línea base en
solución salina normal únicamente. Inmediatamente después de
establecer las condiciones de control, se añadió la parte alícuota
de 200 \mul a la solución salina y los datos se acumularon durante
90 segundos a la temperatura ambiente (20ºC). La atenuación (véase
Figura 4) del sonido era constante a todo lo largo de los 90
segundos con una atenuación de 2,0 \pm 0,5 dB cm^{-3}. Se obtuvo
una segunda muestra, en cuyo caso la presión de la muestra se elevó
luego a 120 mm Hg y se registró la atenuación. Como en el
experimento realizado a la temperatura ambiente, la atenuación se
mantenía constante con poca variación durante el periodo de test de
90 segundos; sin embargo, la atenuación era aproximadamente del
orden de 0,9 dB cm^{-1}. Se midió luego otra muestra en
condiciones de temperatura constante de 37ºC. Una vez más, a lo
largo del periodo de 90 segundos la atenuación era constante y la
atenuación se aproximaba a 0,9 dB cm^{-1}. Se midió una muestra
final a 37ºC y una presión de 120 mm Hg. Esta vez, la atenuación
disminuyó de una manera lineal con el tiempo desde 0,9 dB cm^{-1}
a 0,4 dB cm^{-1} a lo largo de 90 segundos. Esto demostró la
estabilidad incrementada de esta formulación sobre las bicapas
lipídicas llenas de nitrógeno.
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Ejemplo
8
Los experimentos se realizaron idénticamente a
los del Ejemplo 7, excepto que las bicapas lipídicas llenas de gas
se componían de nitrógeno gaseoso como se describe en el Ejemplo 1.
La atenuación era significativa para atenuación estable tanto a la
temperatura ambiente (20ºC) como la temperatura del cuerpo humano
(37ºC); sin embargo, después de la exposición de los contenidos de
la dilución a 120 mm de presión de Hg, la atenuación disminuía
bruscamente hasta cerca de los valores de control de la línea base.
Esto demostró la falta de estabilidad con las bicapas lipídicas
llenas de nitrógeno a presión comparadas con las bicapas lipídicas
llenas de perfluorobutano.
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Ejemplo
9
Se prepararon bicapas lipídicas llenas de gas
perfluorociclobutano como se describe en el Ejemplo 5, excepto que
se utilizaron 3 concentraciones diferentes de la formulación de
lípidos. La formulación estaba constituida por un diluyente que
contenía solución salina normal
(fisiológica):propilenglicol:glicerol (8:1:1, v:v:v). Se añadió a
éste, en concentraciones finales que variaban entre 1 mg ml^{-1} y
5 mg ml^{-1}, una mezcla de dipalmitoilfosfatidilcolina
(DPPC):ácido dipalmitoilfosfatídico
(DPPA):dipalmitoilfosfatidiletanolamina-PEG 5000
(DPPE-PEG 5000) en una relación molar de 82:10:8 (%
molar). Las muestras se prepararon en viales de 2 ml (volumen real
= 3,7 ml). (Wheaton Industries, Millville, NJ) y se clasificaron en
un sistema de clasificación Particle Sizing Systems Modelo 770 con
oscurecimiento de la luz. La tabla siguiente describe los
resultados.
La Tabla 9 demuestra el efecto de la
concentración de lípidos sobre el tamaño medio de bicapas lipídicas
llenas de gas perfluorocarbonado utilizando perfluorociclobutano
como el ejemplo.
Ejemplo
10
Se prepararon muestras de bicapas lipídicas
llenas de gas que contenían las mezclas de lípidos descritas en los
Ejemplos 3, 4, 5, y 6 se prepararon con concentraciones de lípidos
totales de 1 mg ml^{-1} y 3 mg ml^{-1} utilizando
perfluoropropano (PFP), perfluorociclobutano (PFCB), perfluorobutano
(PFB) y hexafluoruro de azufre (SHF). La formación de imágenes se
realizó en un perro cruzado que pesaba aproximadamente 28 kg
utilizando una máquina de ultrasonidos Acoustic Imaging Modelo
5200S equipada con un transductor de 5 megahertzios. El animal se
sedó con pentobarbital sódico, se ventiló al aire ambiente y se
monitorizó respecto a presión arterial pulmonar, presión arterial
sistémica y tasa de pulsaciones. La formación de imágenes del
corazón se realizó en la posición del eje corto y el animal recibió
dosis de tipo bolus de 5 microlitros por kg de PFP, PFCB, PFB y SHF
ensayando ambas concentraciones de lípidos de 1 mg ml^{-1} y 3 mg
ml^{-1}. Se dejaron transcurrir al menos 15 minutos entre cada
inyección para permitir el aclaramiento de cualquier cantidad de
agente de contraste residual. La totalidad de los liposomas llenos
de perfluorocarbono (PFP, PFCB y PFB) exhibían mejora de la
perfusión del miocardio a 1 mg ml^{-1} de lípido, pero PFB más
intensamente que los otros. PFP mejoraba a 3 mg ml^{-1}. Los
liposomas llenos de SHF no exhibían mejora demostrable de la
perfusión del miocardio a 1 mg por ml de lípido pero exhibían de
hecho una mejora miocárdica acusada a 3 mg por ml de lípido.
Se repitió sustancialmente lo anterior en otro
perro y se obtuvieron los mismos resultados.
Se realizaron estudios hemodinámicas en otro
perro utilizando liposomas llenos de perfluoropropano. El animal
recibió dosis múltiples por bolus rápido de hasta 300 microlitros
por kilogramo cada una, es decir 50 veces más que la dosis de
formación de imágenes. El animal no exhibía absolutamente cambio
alguno en ningún parámetro hemodinámica a pesar de ello,
demostrando las dosis múltiples la seguridad hemodinámica del
agente.
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Ejemplo
11
Se analizó un ensayo de toxicidad en ratones
Balb/C que pesaban entre aproximadamente 20 y 25 gramos. Se testaron
los valores DL_{50} de concentraciones de lípido de 1 mg
ml^{-1} de liposomas que contenían muestras de perfluoropropano
(PFP), perfluorociclobutano (PFCB), perfluorobutano (PFB), y
hexafluoruro de azufre (SHF), mediante bolus rápido. Los valores
DL_{50} de cada una de las muestras de PFCB, PFB y PFP eran en
todos los casos mayores que 12 ml kg^{-1}, y para las bicapas
lipídicas llenas con SHF gaseoso, mayores que 30 mg Kg^{-1}, lo
que indicaba índices terapéuticos mayores que 2400 a 1 y 6.000 a 1
respectivamente para estos productos útiles en diagnosis
ultrasónica.
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Ejemplo
12
Se anestesiaron Conejos Blancos de Nueva Zelanda
con una inyección intramuscular de 1 cc kg^{-1} de Mezcla Rabbit
(8:5:2, v:v:v, xilazina 20 mg ml^{-1}:quetamina, 10 mg
ml^{-1}:acepromazina, 100 mg ml^{-1}). Se obtuvieron las
imágenes de los conejos en un equipo de ultrasonidos diagnóstico
Acoustic Imaging Modelo 5200 y un instrumento Doppler de Color
diagnóstico de Acoustic Imaging Modelo 5200S (Acoustic Imaging,
Phoenix, AZ). Los conejos se inyectaron por medio de un catéter de
mariposa 23 G a través de la vena menor de oído. El conejo recibió
luego dosis comprendidas entre 0,01 cc kg^{-1} y 0,1 cc kg^{-1}
de las bicapas lipídicas llenas con perfluoropentano a lo largo de
un periodo de 5 a 10 segundos. Las vistas del eje largo utilizando
un transductor de 7,5 MHz revelaron la formación de imágenes
brillantes de las cuatro cámaras del corazón y el miocardio durante
un periodo que abarcaba desde 20 minutos hasta más de una hora. El
transductor se desplazó luego a la región del hígado, donde se
observó un contraste brillante en la vena hepática, la vena hepática
portal, así como los senos hepáticos. El transductor se puso luego
sobre el riñón, lo cual reveló contraste en las regiones de la
médula y la corteza así como la visualización de la arteria renal.
El transductor de ultrasonidos de diagnóstico se reemplazó luego
con un instrumento Doppler de color, y se observó un contraste
sostenido y brillante a lo largo de todos los tejidos vascularizados
del cuerpo del animal.
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Ejemplo
13
Muestras múltiples de soluciones de lípidos (1
mg por ml, relaciones % molares de
DPPC:DPPA:DPPE-PEG-5000, 82:10:8)
en relaciones en peso de 8:1:1 de solución salina
normal:glicerol:propilenglicol en viales de 2 ml (tamaño real 3,7
ml) Wheaton Industries (Millville, NJ) se pusieron en un
liofilizador Edwards modificado Modelo SO4 con capacidad de 4 pies
cúbicos (113 l) y se sometieron a presión reducida. Los espacios de
cabeza de los viales se instilaron luego con 80% PFP con 20% aire,
60% PFP con 40% aire, 50% PFP con 50% aire, 20% PFP con 80% aire, o
100% aire. Los porcentajes de gas en los espacios de cabeza de las
diferentes muestras se confirmaron por cromatografía de gases en un
Cromatógrafo de Gases Hewlett Packard, Modelo 1050L con interfaz de
software Hewlett Packard Chem^{TM}. El modo de detección era
detección por ionización de llama. Las muestras se agitaron luego
mediante sacudidas a 3300 RPM durante 60 segundos utilizando el
instrumento Wig-L-Bug^{TM} y los
tamaños y recuentos de liposomas se determinaron por clasificación
óptica de partículas como se ha descrito previamente. Los
resultados se muestran arriba en la Tabla 2.
Claims (9)
1. Un liposoma lleno de gas que comprende un
gas sustancialmente insoluble en combinación con un gas soluble, en
donde al menos 1% de la cantidad total del gas es un gas
sustancialmente insoluble.
2. Un liposoma lleno de gas de la
reivindicación 1, en el cual dicho gas sustancialmente insoluble es
un gas perfluorocarbonado.
3. Un liposoma lleno de gas de la
reivindicación 1, en el cual dicho gas soluble se selecciona del
grupo constituido por aire, oxígeno, nitrógeno, y dióxido de
carbono.
4. Un liposoma lleno de gas de la
reivindicación 1, en el cual dicho gas sustancialmente insoluble es
un gas perfluorocarbonado y dicho gas soluble se selecciona del
grupo constituido por aire, oxígeno, nitrógeno y dióxido de
carbono.
5. Un liposoma lleno de gas de la
reivindicación 1, en el cual dicho liposoma está constituido por una
monocapa lipídica.
6. Un liposoma lleno de gas de la
reivindicación 1, en el cual dicho liposoma está constituido por una
bicapa lipídica.
7. Un liposoma lleno de gas de cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el cual dicho gas
sustancialmente insoluble tiene una solubilidad igual a o menor que
15 ml de gas por kg de agua a 20ºC y 1 atmósfera de presión.
8. Un liposoma lleno de gas de la
reivindicación 7, en el cual dicho gas sustancialmente insoluble
tiene una solubilidad igual a o menor que 10 ml de gas por kg de
agua a 20ºC y 1 atmósfera de presión.
9. Un liposoma lleno de gas de cualquiera de
las reivindicaciones anteriores en el cual al menos 10% de la
cantidad total de gas es un gas sustancialmente insoluble.
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