ES2227564T3 - Elemento analitico multicapa. - Google Patents

Elemento analitico multicapa.

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ES2227564T3 ES95940097T ES95940097T ES2227564T3 ES 2227564 T3 ES2227564 T3 ES 2227564T3 ES 95940097 T ES95940097 T ES 95940097T ES 95940097 T ES95940097 T ES 95940097T ES 2227564 T3 ES2227564 T3 ES 2227564T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN ELEMENTO ANALITICO MULTICAPA PARA MEDIR CUANTITATIVAMENTE UN COMPONENTE DE UNA MUESTRA EN PRESENCIA DE UN REACTIVO CAPAZ DE INTERACCIONAR CON LA MUESTRA. EL ELEMENTO ANALITICO MULTICAPA DE LA INVENCION INCLUYE UN SOPORTE SOLIDO Y SOBRE EL UNA CAPA HIDROFILA CONSTITUIDA POR GELATINA, ALCOHOL POLIVINILICO O UNA MEZCLA DE AMBOS Y QUE CONTIENE UN AGENTE DE DESARROLLO Y UN AGENTE QUE PRODUCE COLORACION EN UNA CANTIDAD IGUAL A ENTRE EL 5 Y EL 30 % EN PESO Y EN UNA PROPORCION DE 1:0,3 A 1:3,0. EL AGENTE DE DESARROLLO ES CAPAZ DE EXPERIMENTAR OXIDACION CAUSADA POR EL REACTIVO EN PRESENCIA DE UN AGENTE OXIDANTE, REACCIONANDO EL AGENTE DE DESARROLLO EN FORMA OXIDADA CON EL AGENTE PRODUCTOR DE COLOR PARA FORMAR UN PRODUCTO COLOREADO. EL ELEMENTO ANALITICO MULTICAPA DE LA INVENCION SE PUEDE UTILIZAR EN MEDICINA Y FARMACOLOGIA, ASI COMO EN CRIMINOLOGIA. SE PUEDE UTILIZAR PARA DETERMINAR COLESTEROL, IONES CLORURO Y GLUCOSA, PERMITIENDO, POR TANTO, DIAGNOSTICAR HIPERCOLESTEROLEMIA, FIBROSIS QUISTICA Y DIABETES.

Description

Elemento analítico multicapa.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a mejoras en el campo del análisis de materiales. Más particularmente, la invención se refiere a un elemento analítico multicapa para la medida del nivel de colesterol en la piel humana o en otro material sólido.
El documento SU Nº 1.054.784 describe un elemento analítico que es usado en cromatografía de capa fina de lípidos y que consiste en un soporte (tal como una placa de vidrio), que tiene sobre ella una capa de un material adsorbente tal como una mezcla de gel de sílice, yeso, sulfato amónico y acetato de cobre. Dicho elemento químico no es adecuado para medir el colesterol en la piel humana.
El documento SU Nº 1.495.378 describe un elemento analítico de dos capas que comprende un soporte tal como una película de polietileno y una capa de gelatina que tiene como enzima oxidasa inmovilizada. El elemento cambia de color cuando entran en contacto con la capa de gelatina aminas o disoluciones acuosas suyas. Dicho elemento analítico tampoco es adecuado para medir el colesterol en la piel humana.
La patente canadiense Nº 1.335.968 describe un método para medir el colesterol poniendo en contacto la piel u otra superficie que contenga colesterol con un compuesto enzimático de afinidad de fórmula general A-C-B, en el que A es un agente detector que presenta afinidad por el colesterol, B es un agente enzimático de visualización capaz de reaccionar con un agente generador de color para formar un producto coloreado, y C es un agente de unión que une los agentes de detección y de visualización.
La presencia de colesterol se determina mediante un cambio de color del agente productor de color. Dicho método tiene la desventaja de que las disoluciones y el producto de reacción coloreado no son suficientemente estables y que, a bajos niveles de colesterol, la sensibilidad y la reproducibilidad son bastante pobres.
Debido a las desventajas asociadas con los elementos analíticos conocidos anteriores y con el método de medida de colesterol conocido anterior, es necesario desarrollar un elemento analítico que combine las ventajas del método de fase líquida conocido para el ensayo de colesterol y la comodidad de la aplicación práctica de elementos analíticos multicapa utilizando soportes sólidos.
Se ha propuesto un elemento analítico multicapa en la Patente de EE.UU. Nº 4.895.704, que comprende un soporte sólido impermeable al agua transparente a la luz y una capa hidrófila que contiene al menos un reactivo capaz de reaccionar con un componente de una muestra para formar una sustancia que pueda ser detectada mediante radiación luminosa. El elemento analítico incluye una capa adicional que contiene partículas de dispersión de la luz en una cantidad que asegura la transmitancia de luz en el intervalo de 10 a 2,5%. Las desventajas de dicho elemento analítico multicapa conocido son su no adecuabilidad para medir niveles de colesterol en la piel, baja intensidad de la reacción de color y elevado contraste del efecto analítico a bajos niveles de la sustancia que se esté ensayando.
La Patente de EE.UU. Nº 4.826.761 describe un elemento analítico multicapa para el análisis del colesterol contenido en una muestra líquida acuosa tal como la sangre u otros fluidos corporales. Dicho elemento analítico comprende un soporte impermeable al agua transparente a la luz, una capa hidrófila y una capa de extensión que contiene estearasa de colesterol y oxidasa de colesterol, superpuestos en este orden. El elemento analítico además contiene peroxidasa y una composición de reactivo colorante que puede estar presente tanto en la capa hidrófila como en la capa de extensión. Como composición de reactivo colorante, se emplea una combinación de 4-aminoantipirina o de su derivado y de ácido 2-hidroxi-3,5-diclorobencenosulfónico. La peroxidasa oxida la 4-aminoantipirina utilizando el peróxido de hidrógeno producido por las reacciones del colesterol para acoplarse con el ácido 2-hidroxi-3,5-diclorobencenosulfónico, proporcionando con ello un cambio de color o una coloración en el elemento analítico multicapa. Puesto que la 4-aminoantipirina actúa como un agente productor de color y es un compuesto hidrófilo, sería eliminada de la capa hidrófila tras el contacto del elementoanalítico con la piel.
La Solicitud de Patente Europea publicada Nº 60.518 describe un método fluorescente para determinar el peróxido de hidrógeno formado como resultado de reacciones catalizadas por enzimas para determinados sustratos tales como la glucosa y el colesterol. El Ejemplo 4 se refiere a colesterol que se determina en fase líquida sometiendo el colesterol a la acción de oxidasa de colesterol para formar peróxido de hidrógeno y midiendo cuantitativamente el peróxido de hidrógeno así formado haciendo reaccionar el mismo con un dador de hidrógeno, peroxidasa y un reactivo compuesto de un resto que presenta un residuo formado por eliminación de un hidrógeno de un grupo metileno activo o de un grupo metino activo y un resto fluorescente. Se mide la fluorescencia emitida por el material fluorescente formado mediante la reacción. La reacción del dador de hidrógeno (es decir, del agente de desarrollo) con el reactivo (es decir, el agente productor del color) se produce en fase líquida, y no es fase sólida.
La Solicitud de Patente Europea publicada Nº 285.998 describe un método para la determinación de deshidrogenasa o de su sustrato, y por tanto no se refiere a la determinación de colesterol. Todas las reacciones son llevadas a cabo en fase líquida. El peróxido de hidrógeno formado por la reacción de la deshidrogenasa se hace reaccionar con una peroxidasa y un cromógeno para formar un colorante, y el colorante es medido mediante espectrofotometría. Los cromógenos que se describen en la publicación, y pueden incluir 4-aminoantipirina/derivados de anilina, 4-aminoantipirina/derivados de fenol y derivados de benzotiazolinona hidrazona/derivados de anilina, son todos compuestos hidrófilos.
Sumario de la invención
Por tanto, el objetivo de la presente invención es potenciar la sensibilidad, reproducibilidad e intensidad de la reacción de color de elementos analíticos, para incrementar el intervalo de tiempo durante el cual se conserva el color desarrollado durante la reacción enzimática, para intensificar el procedimiento de medida de niveles de colesterol en la piel y para ampliar las posibilidades de una diagnosis urgente del colesterol.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un elemento analítico multicapa para determinar el nivel de colesterol en tejidos animales y que está adaptado para su uso con peróxido de hidrógeno y un compuesto enzimático de afinidad con fórmula A-C-B, en el que A es un agente detector que presenta afinidad por el colesterol, B es un agente de visualización enzimático que consiste en peroxidasa y C es un agente de unión que une a los agentes de detección y de visualización. El elemento analítico multicapa de la invención comprende un soporte sólido y una capa hidrófila sobre él, estando formada la capa hidrófila por gelatina, por alcohol de polivinilo o por una mezcla, y que contiene un agente de desarrollo y un agente productor de color hidrófobo en una cantidad total de 5 a 30% en peso, estando presentes el agente de desarrollo y el agente productor de color en una relación másica de 1:0,3 a 1:3,0. El agente de desarrollo puede ser oxidado por el peróxido de hidrógeno en presencia de la peroxidasa unida a través de los agentes de unión y de detección al colesterol del tejido animal, por lo cual el agente de desarrollo en forma oxidada reacciona con el agente productor de color para formar un producto coloreado que tiene un color indicativo del nivel de colesterol.
Descripción de las realizaciones preferidas
El agente de desarrollo usado preferiblemente es un compuesto con la fórmula:
1
en la que R, R' y R'' son idénticos o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo o alcanol. Ejemplos de dichos compuestos incluyen l N,N-dietil-parafenilendiamina, la para-etilamino-ortotoluidina, la para-[N-etil-N-(\beta-metilsulfonilaminoetil)amino]-orto-toluidina, la para-[N-etil-N-(\beta-hidroxietil)amino]-orto-toluidina y la para-[N-butil-N-(\gamma-sulfopropil)-amino]-anilina.
Como agente de desarrollo también se puede hacer uso de la dietil-p-tolilendiamina, de la etiloxietil-p-fenilendiamina, de la etilmetanosulfoaminoetil-p-tolilendiamina, de la etiloxietil-p-tolilendiamina, de la butilsulfopropil-p-fenilendiamina o de la dietil-p-fenilendiamina.
Como agentes productores de color, se pueden usar derivados de la pirazolona-5, del ácido benzoilacético o del ácido naftoico. Ejemplos de agentes productores de color adecuados incluyen la 1-(2,4,6-triclorofenil)-3-pentadecilamino-fenil-aminopirazolona, el ácido 3,5-dicarboxifeniloctadecilamida-1-oxi-2-naftoico, el ácido 2-cloro-5-[\gamma-(2,4-ditetraminfenoxi)-butiroilamino]-anilida-\alpha-N-benzoilhidantoilpivaloilacético, el ácido meta-(N-metil-N-octadecil)-amino-parabenzoilacetamidobencensulfónico, el ácido metacarboxi-meta-{N-[paraclorometa-(N-ortooctadecil- oxibenzoilacetil)amido]bencensulfonilamido}-carboxílico, el ácido ortofenoxi-meta(5-oxo-1,2-pirazol-3-ino)bencensulfónico, el ácido 2'-metiloctadecil-amino-5'-sulfanilidebenzoilacético, el ácido 2'-cloro-5'-(3'',5''-dicarboxifenilsulfamida)-anilida-2-octadeciloxibenzoilacético, el ácido octadecilamida-1-oxi-4-sulfo-2-naftoico, el ácido 2'-metiloctadecilamino-5'-sulfanilida-1,2-oxinaftoico y la 1-(4'-fenoxi-3'-sulfofenil)-3-esteroil-aminopirazolona.
Los agentes productores de color son distribuidos uniformemente en la capa hidrófila como microcápsulas, como micropartículas o como moléculas separadas dependiendo de la naturaleza del agente productor de color. Para alcanzar una distribución microparticular o molecular del agente productor de color en la capa hidrófila, se usan compuestos con cadenas laterales hidrófilas (polares). Para alcanzar una distribución microcapsular del agente productor de color, se usan compuestos con cadenas laterales hidrófobas (no polares).
Como soporte, preferiblemente se hace uso de una película hidrofilizada de polietilentereftalato, de polietileno o de trinitrocelulosa. También se puede usar un polímero no coloreado, un papel o un papel recubierto de polietileno.
La capa hidrófila también puede contener agentes humectantes y de curtido. Los agentes humectantes aseguran una aplicación uniforme sobre el soporte de una capa hidrófila con un espesor constante, preferiblemente de 2 a 100 micrómetros. Los agentes de curtido aseguran el nivel requerido de propiedades físico-mecánicas del elemento analítico multicapa. Como agentes de curtido se puede usar acetato de cromo y la sal monosódica de 2,4-dicloro-6-hidroxitriacina-1,3,5.
El elemento analítico multicapa de acuerdo con la invención puede ser usado en medicina y farmacología así como en criminología.
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran en mayor profundidad la invención.
Ejemplo 1
Se produjo un elemento analítico multicapa para la determinación de colesterol en la piel aplicando sobre un soporte sólido que consiste en una película de polietilentereftalato que tiene un espesor de 50 \mum, una capa de gelatina fotográfica que contiene un 7,5% en peso de un agente hidrófobo productor de color violeta que consiste en 1-(2,4,6-triclorofenil)-3-pentadecil-aminofenil-amino-pirazolona. El agente productor de color tenía un tamaño de partícula medio inferior a 0,1 \mum. La capa de gelatina contenía un 7,5% en peso de N,N-dietil-parafenilendiamina como agente de desarrollo distribuida a nivel molecular. La capa también contenía acetato de cromo como agente de curtido.
Este elemento analítico multicapa fue usado para la determinación del nivel de colesterol en integumento de piel procedente de la mano de un paciente que sufre arterosclerosis así como en la piel de una persona sana. Sobre la piel de la palma de la mano de cada persona se aplicó una gota de una disolución acuosa de un compuesto enzimático de afinidad con la fórmula A-C-B tal como se ha definido anteriormente, en el que el agente de visualización enzimático B es una peroxidasa. Se llevó a cabo la incubación durante 1 minuto, a continuación se eliminó el líquido con la ayuda de tampones secos y humedecidos alternativamente. En la misma área, se aplicó una gota de peróxido de hidrógeno e inmediatamente después se colocó firmemente el elemento analítico multicapa y fue presionado contra la superficie de la piel durante 1 minuto. El elemento analítico fue lavado a continuación durante 15-20 segundos en agua corriente. El resultado del ensayo fue determinado comparando el color impreso obtenido con una escala graduada o midiendo la intensidad de la mancha de color espectrofotométricamente con por ejemplo un espectrofotómetro LCD (de pantalla de cristal líquido).
La Tabla 1 muestra los resultados obtenidos usando los métodos en fase líquida conocidos para la medida de los niveles de colesterol en sangre y en la piel así como usando el elemento analítico multicapa de acuerdo con la invención.
TABLA 1
2
La reproducibilidad de la reacción de color fue estudiada en los mismos pacientes usando 10 ensayos consecutivos. La desviación estándar no fue superior al 8%.
Las medidas realizadas usando elementos analíticos multicapa que fueron almacenadas durante 1 semana o durante 6 meses mostraron la misma reproducibilidad de los resultados.
El ensayó llevó de 2 a 3 minutos, y la preparación del ensayo llevó aproximadamente 3 minutos. De este modo se pueden fabricar kits para pacientes que se hagan el análisis a sí mismos, incorporando el elemento analítico multicapa.
Ejemplo 2
Un elemento analítico multicapa para la medida del nivel de colesterol en la piel fue producido aplicando sobre un soporte que consiste en un papel fotográfico blanco recubierto de polietileno, una capa de alcohol de polivinilo que contiene un agente productor de color azul que consiste en ácido 3,5-dicarboxifeniloctadecilamida-1-oxi-2-naftoico. La capa de alcohol de polivinilo también contenía para-etilamino-ortotoluidina como agente de desarrollo.
Este elemento analítico multicapa fue usado para medir el colesterol en la piel, de acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Se obtuvieron esencialmente los mismos resultados.

Claims (9)

1. Un elemento analítico multicapa para determinar un nivel de un analito sobre un sustrato y adaptado para su uso con peróxido de hidrógeno y con un compuesto enzimático de afinidad con la fórmula A-C-B, en la que A es un agente detector que presenta afinidad por dicho analito, B es un agente enzimático de visualización que consiste en peroxidasa y C es un agente de unión que une los agentes de detección y de visualización, comprendiendo dicho elemento analítico multicapa un soporte sólido y una capa hidrófila sobre él, estando formada dicha capa hidrófila por gelatina, por alcohol de polivinilo o por una mezcla, y que contiene un agente de desarrollo y un agente hidrófobo productor de color en una cantidad total de 5 a 30% en peso, estando presentes dicho agente de desarrollo y dicho agente productor de color en una relación másica de 1:0,3 a 1:3,0, siendo capaz dicho agente de desarrollo de ser oxidado por el peróxido de hidrógeno en presencia de dicha peroxidasa unida a través de dichos agentes de unión y de detección a dicho analito sobre dicho sustrato, por lo que el agente de desarrollo en su forma oxidada reacciona con dicho agente productor de color para formar un producto coloreado que presenta un color indicativo del nivel de dicho analito, siendo el agente de desarrollo un compuesto con la fórmula:
3
en la que R, R' y R'' son idénticos o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo o alcanol seleccionado del grupo que consiste en para-[N-etil-N-(\beta-metilsulfonilaminoetil) amino]-ortotoluidina, para-[N-butil-N-(\gamma-sulfopropil)-amino]-anilina, etil-metanosulfoaminoetil-p-tolilendiamina, butilsulfopropil-p-fenilendiamina; y siendo dicho agente productor de color un compuesto seleccionado del grupo que consiste en derivados de pirazolona-5, ácido benzoilacético y ácido naftoico.
2. Un elemento analítico multicapa como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que dicho agente de desarrollo es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en N,N-dietil-para-fenilendiamina, paraetilamino-ortotoluidina, para-[N-etil-N-\beta-hidroxietil) amino]-ortotoluidina, dietil-p-tolilendiamina, etiloxietil-p -fenilendiamina, etiloxi-etil-p-tolilendiamina y dietil-p-fenilendiamina.
3. Un elemento analítico multicapa como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que dicho agente productor de color es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 1-(2,4,6-triclorofenil)-3-pentadecilamino-fenil-amino-pirazolona, ácido 3,5-dicarboxifeniloctadecilamida-1-oxi-2-naftoico, ácido 2-cloro-5-[\gamma-( 2,4-ditetraminfenoxi)-butiroilamino]-anilida-\alpha-N-benzoilhidantoilpivaloilacético, ácido meta-(N-metil-N-octadecil)-amino-parabenzoilacetamido-bencensulfónico, ácido metacarboxi-meta-{N-[paraclorometa-(N-ortooctadecil-oxibenzoilacetil)amido]bencensulfonilamido}-carboxílico, ácido ortofenoxi-meta(5-oxo-1,2-pirazol-3-ino) bencensulfónico, ácido 2'-metiloctadecil-amino-5'-sulfanilidebenzoilacético, ácido 2'-cloro-5'-(3'',5''-dicarboxifenilsulfamida)-anilida-2-octadeciloxibenzoilacético, ácido octadecilamida-1-oxi-4-sulfo-2-naftoico, 2'-metiloctadecilamino-5'-sulfanilida-1,2-oxinaftoico y la 1-(4'-fenoxi-3'-sulfofenil)-3-esteroil-aminopirazolona.
4. Un elemento analítico multicapa como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que dicho agente productor de color es un compuesto hidrófobo que tiene un tamaño de partícula inferior a 0,1 \mum.
5. Un elemento analítico multicapa como el reivindicado en la reivindicación 4, en el que dicho compuesto hidrófobo es 1-(2,4,6-triclorofenil)-3-pentadecilaminofenil-aminopirazolona o ácido 2-cloro-5-[\gamma-(2,4-ditetraminfenoxi)-butiroilamino]-anilida-\alpha-N-benzoilhidantoilpivaloilacético.
6. Un elemento analítico multicapa como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que dicha capa hidrófila tiene un espesor que oscila entre 2 y 100 \mum.
7. Un elemento analítico multicapa como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que dicha capa hidrófila además contiene al menos un agente humectante.
\newpage
8. Un elemento analítico multicapa como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que dicha capa hidrófila además contiene al menos un agente de curtido.
9. Un elemento analítico multicapa como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho analito es colesterol y dicho sustrato es piel.
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