ES2227846T3 - Uso de inhibidores de fosfolamban para aumentar el flujo coronario. - Google Patents

Abstract

Se describe un procedimiento para obtener una dilatación directa de las arterias coronarias administrando una cantidad terapéuticamene eficaz de un inhibidor de fosfolambano. Se describe también compuestos que son eficaces para mitigar los efectos inhibitorios del fosfolambano sobre la Ca+-ATPasa del retículo sarcoplásmico cardiaco.

Description

Uso de inhibidores de fosfolamban para aumentar el flujo coronario.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere al uso de un inhibidor de la proteína fosfolamban en la fabricación de un medicamento para aumentar el flujo coronario, particularmente para conseguir una dilatación directa de las arterias coronarias.

La contracción de la célula muscular se controla por la cantidad de calcio citosólico libre que interacciona con calmodulina en las células de músculo liso o con troponina C en células del músculo cardíaco y esquelético. Estas proteínas activadas por calcio desencadenan una cascada de acontecimientos que conducen al acortamiento celular y a la contracción del músculo.

Uno de los enzimas más importantes que ayuda a finalizar o evitar la contracción del músculo es la Ca2+-ATPasa localizada en el interior de la célula en el retículo sarcoplásmico (SR). Este enzima transfiere calcio citosólico contra el gradiente de concentración al interior de los depósitos de calcio intracelulares. La función de la Ca^{2+}ATPasa del SR (SERCA) se controla por una pequeña proteína denominada fosfolamban. Cuando la proteína fosfolamban no está fosforilada, inhibe la SERCA. Por el contrario, cuando está fosforilada, la proteína fosfolamban no inhibe esta bomba de calcio. La eliminación del efecto inhibidor de la proteína fosfolamban se observa como una estimulación de la captación de calcio en el SR, ya que algunas de las moléculas de la SERCA están todo el tiempo bajo el control inhibidor de fosfolamban.

Se ha demostrado que la proteína fosfolamban tiene un importante papel en el músculo cardíaco (Lindemann, J. P. et al., "Beta-adrenergic stimulation of phospholamban phosphorylation and Ca^{2+}-ATPase activity in guinea pig ventricles", J. Biol. Chem. 258:464-471, 1983) y en los músculos esqueléticos lentos, mientras que el músculo esquelético rápido no expresa fosfolamban en absoluto (Hoh, J. F. Y, "Muscle fiber types and function", Current Opinion in Rheumatology, 4:801-808, 1992). Además, la proteína fosfolamban se expresa en aorta de ratón (Lalli, J. et al., "Targeted ablation of the phospholamban gene is associated with a marked decrease in sensitivity in aortic smooth muscle", Circ. Res. 80(4): 506-513, 1997) y por lo tanto se cree que la proteína fosfolamban controla la SERCA en tejido vascular periférico.

Por medio de sus efectos inhibidores sobre la SERCA presente en el tejido cardíaco, la proteína fosfolamban reprime tanto la velocidad de relajación como la velocidad de contracción en el corazón de mamífero. Por lo tanto, un compuesto capaz de aliviar los efectos inhibidores de la proteína fosfolamban sobre la SERCA cardíaca, por ejemplo, interrumpiendo la interacción fosfolamban-SERCA, sería útil en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca.

Muy recientemente se han proporcionado indicios de que en células endoteliales aórticas está presente PLB (Sutliff, R.L. et al., "Functional and biochemical evidence for modulation of endothelial cell function by phospholamban", FASEB Journal 12 (5): A957, 1998), en las que modula la actividad de la isoforma de la SERCA presente en el retículo endoplásmico. También se demostró que una disminución de la actividad del bombeo de calcio en el retículo endoplásmico en células endoteliales aórticas lleva a una relajación defectuosa dependiente del endotelio del músculo liso vascular aórtico (Liu, L.H. et al., "Defective endothelium-dependent relaxation of vascular smooth muscle and endothelial cell Ca^{2+} signalling in mice lacking sarco(endo)plasmic reticulum CA^{2+}-ATPase isoform 3", J. Biol.Chem. 272(48):30538-30545, 1997).

No se han publicado indicios de la presencia de fosfolamban en las células endoteliales de arterias coronarias.

Sumario de la invención

Ahora se ha descubierto que compuestos de fórmulas (I) o (II) son eficaces para aliviar los efectos inhibidores de la proteína fosfolamban sobre la Ca^{2+}-ATPasa de SR cardíaca (SERCA). Los compuestos de fórmulas (I) o (II) actúan como inhibidores de fosfolamban por medio de la unión directa a la proteína fosfolamban. Por lo tanto, los compuestos de fórmulas (I) o (II) eliminan la acción inhibidora del fosfolamban sobre la SERCA como las proteínas quinasas, ya que éstas fosforilan el fosfolamban.

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en las que

R_{1} es hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, arilalquilo, hidroxialquilo, halogenoalquilo, alcoxi, COR_{10}, CONR_{10}R_{11}, OR_{10}, S(O)_{m}R_{10}, NR_{10}COR_{11} o NR_{10}R_{11}, donde R_{10} es hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, arilalquilo, hidroxialquilo, halogenoalquilo, alcoxi o hidroxi, y R_{11} es hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo, alcoxi, ariloxi, hidroxi o acilo, o cuando X es NR_{11}, R_{1} también puede ser carboxialquilo,

R_{6} es hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo o arilalquilo,

R_{2} y R_{7} significan hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo, alquenilo, COR_{10}, CONR_{10}R_{11}, halógeno, trifluorometilo, nitro o ciano, donde R_{10} y R_{11} son como se han definido anteriormente,

R_{3} es hidrógeno, alquilo, arilo o arilalquilo,

A significa alquilo o alquilo substituido,

m es 0-2 y n es 1-3,

Y significa O, NR11 o S, donde R11 es igual que anteriormente,

X significa O, NR11 o S, donde R11 es igual que anteriormente,

R_{4}, R_{5}, R_{8} y R_{9} significan independientemente uno de los siguientes grupos:

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o en el caso en el que X es NR_{11}, R_{4}, R_{5}, R_{8} y R_{9} también pueden significar independientemente HOOC-, R_{12}OOC-, H_{2}NCO- o HOHNCO-, donde R_{12} significa alquilo, arilalquilo o arilo,

y donde cada resto arilo definido anteriormente por sí mismo o como parte de otro grupo puede estar substituido, y sales farmacéuticamente aceptables y ésteres de los mismos.

Además, se descubrió que, sorprendentemente, los inhibidores de fosfolamban de fórmula (I) o (II) aumentaban el flujo coronario en el corazón de cobaya aislado con bombeo artificial perfundido con presión constante. La magnitud del efecto sobre el flujo coronario sobrepasa en gran medida los efectos crecientes de los compuestos sobre las velocidades de relajación y contracción del ventrículo izquierdo del corazón, lo que indica que los compuestos de fórmula (I) o (II) dilatan directamente las arterias coronarias. El efecto de los compuestos (I) o (II) sobre el flujo coronario precedía a los otros efectos, confirmando que la dilatación coronaria se debía al efecto directo de los compuestos sobre las arterias coronarias. Además, se descubrió que el efecto vasodilatador de los inhibidores de fosfolamban de (I) o (II) se debe a un mecanismo con mediación endotelial. Por lo tanto, proponemos que los inhibidores de fosfolamban inducen la vasodilatación y potencian el flujo coronario bloqueando el efecto inhibidor de PLB sobre SERCA en el retículo endoplásmico de las células endoteliales de las arterias coronarias.

Al tener la capacidad inesperada de dilatar directamente las arterias coronarias, los inhibidores de fosfolamban, tales como los compuestos (I) o (II), son útiles en el tratamiento de afecciones en las que se desea un aumento del flujo coronario, por ejemplo, en la enfermedad cardíaca coronaria y en crisis hemodinámicas en las que la baja presión sanguínea aórtica reduce la presión de perfusión coronaria.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra espectros de CD de una concentración 50 \muM de PLB[1-36 a.a] (plb), PLB[1-36 a.a] (Ser16
PO_{3}^{-}, Thr17PO_{3-}) (plbPP), el compuesto de ejemplo 1c y de las mezclas de PLB[1-36 a.a] + compuesto del ejemplo 1c y PLB[1-36 a.a](Ser16PO_{3}^{-}, Thr17PO_{3}^{-}) + compuesto del ejemplo 1c en agua a temperatura ambiente.

La figura 2A muestra el efecto del compuesto del ejemplo 1c (50 y 100 \muM) sobre la velocidad de captación de Ca^{2+} en las vesículas de SR del músculo cardíaco.

La figura 2B muestra el efecto del compuesto del ejemplo 1c (50 y 100 \muM) sobre la velocidad de captación de Ca^{2+} en las vesículas de SR del músculo esquelético rápido.

La figura 3A muestra el aumento del flujo coronario mediado a través del efecto de dilatación directa del compuesto del ejemplo 1c sobre las arterias coronarias que contienen células de músculo liso vascular y células endo-
teliales.

La figura 3B muestra el efecto del compuesto del ejemplo 1c sobre la derivada positiva (dP/dt max positiva) de la presión del ventrículo izquierdo.

La figura 3C muestra el efecto del compuesto del ejemplo 1c sobre la derivada negativa (dP/dt max negativa) de la presión del ventrículo izquierdo.

La figura 4A muestra el efecto del compuesto del ejemplo 1c sobre el flujo coronario (ml/min) sin la adición de Triton x 100.

La figura 4B muestra el efecto del compuesto del ejemplo 1c sobre el flujo coronario (ml/min) con Triton x 100 usado para destruir las células endoteliales de los vasos coronarios.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona el uso de un inhibidor de fosfolamban en la fabricación de un medicamento para uso en la obtención de una dilatación directa de las arterias coronarias. Además, la invención proporciona el uso de un inhibidor de fosfolamban en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de la enfermedad cardíaca coronaria. La invención también proporciona el uso de un inhibidor de fosfolamban en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de una crisis hemodinámica en la que la presión sanguínea aórtica inferior hace disminuir la presión de perfusión coronaria.

La expresión "inhibidor de fosfolamban" significa en este documento un compuesto que alivia el efecto inhibidor de la proteína fosfolamban sobre la Ca^{2+}-ATPasa de SR por unión directa a la proteína fosfolamban.

El efecto inhibidor de un compuesto dado sobre el fosfolamban puede demostrarse midiendo el efecto del compuesto sobre la captación de calcio en las vesículas de SR preparadas a partir de tejido cardíaco y en vesículas de SR preparadas a partir de músculo esquelético rápido (músculo psoas). Ambas clases de vesículas de SR contienen Ca^{2+}-ATPasa, pero las vesículas del músculo esquelético rápido no contienen fosfolamban (Hoh JFY, "Muscle fiber types and function", Current Opinion in Rheumatology, 4:801-808, 1992). Un aumento en la captación de calcio en las vesículas de SR preparadas a partir de tejido cardíaco pero no en las vesículas de SR preparadas a partir de músculo esquelético rápido indica que el compuesto alivia el efecto inhibidor de la proteína fosfolamban sobre la Ca^{2+}-ATPasa de SR por unión directa a la proteína fosfolamban y que el compuesto es aplicable como un inhibidor de fosfolamban en el método de la invención. La unión directa de un compuesto a la proteína fosfolamban puede determinarse por espectroscopía de dicroísmo circular (CD). Los métodos para determinar si un compuesto alivia el efecto inhibidor de fosfolamban sobre la Ca^{2+}-ATPasa de SR por unión directa a la proteína fosfolamban, es decir, si es un inhibidor de fosfolamban, se ilustran con detalle en la sección experimental.

Los compuestos de fórmula (I) o (II) pueden prepararse a partir de heteroaromáticos 1,3-dihidroxi substituidos por alquilación de los compuestos dihidroxi mediante agentes de alquilación adecuados, por ejemplo mediante cloroacetonitrilo o éster bromoacético de acuerdo con el siguiente esquema 1, en el que R_{1}, R_{2}, R_{3}, X e Y son iguales a los definidos anteriormente y R' es un grupo protector para el hidroxilo, por ejemplo metilo, bencilo o tetrahidro-
piranilo.

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Esquema 1

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El compuesto ciano (IV) descrito anteriormente se usa para preparar los derivados de 1,2,4-oxadiazol y 1,2,4-tiadiazol usando los métodos descritos en J. Med. Chem. 1996, 39, 5228-5235.

Las síntesis se muestran en el esquema 2, en el que R_{1}, R_{2}, R_{3}, X e Y son iguales a los definidos anteriormente.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Esquema 2

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Los otros heterociclilos tales como los grupos R_{4}, R_{5}, R_{8} y R_{9} se preparan como se describe en Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 45-50.

Los dihidroxiaromáticos (III) se preparan usando métodos de la bibliografía. Las cumarinas (XIV), (XIV) y (XX) se preparan usando la condensación de Knoevenagel o la reacción de von Pechmann como se presenta en los esquemas 3 y 4, donde R_{1}, R_{2} y R_{3} son iguales a los definidos anteriormente, Z es alquilo, arilo, arilalquilo o alquenilo y R' es un grupo protector para los hidroxilos, por ejemplo metilo, bencilo o tetrahidropiranilo.

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Esquema 3

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Esquema 4

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Las quinolinonas se preparan por la reacción de Knorr como se describe en el Esquema 5, en el que R_{1}, R_{11} y R_{3} son iguales a los definidos anteriormente y X es un halógeno.

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Esquema 5

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De igual manera, los compuestos cíclicos (II) pueden prepararse a partir del compuesto (XXXI), que puede prepararse de acuerdo con el esquema 6, donde R_{2} y R_{6} son iguales a los definidos anteriormente y R' es un grupo protector para los hidroxilos, por ejemplo metilo, bencilo o tetrahidropiranilo.

Esquema 6

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De igual manera, los compuestos de quinolinona cíclicos (II) pueden prepararse a partir de (XXVI) usando el esquema 5.

Las sales y ésteres de los compuestos, cuando sea aplicable, pueden prepararse por métodos conocidos. Las sales fisiológicamente aceptables son útiles como medicamentos activos, sin embargo, se prefieren las sales con metales alcalinos o alcalinotérreos. Los ésteres fisiológicamente aceptables también son útiles como medicamentos activos. Son ejemplos los ésteres con alcoholes alifáticos o aromáticos.

El término "alquilo", como se emplea en este documento por sí mismo o como parte de otro grupo, incluye radicales de cadena lineal, ramificada o cíclica de hasta 18 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 8 átomos de carbono, y más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. La expresión "alquilo inferior", como se emplea en este documento por sí misma o como parte de otro grupo, incluye radicales de cadena lineal, ramificada y cíclica de 1 a 7, preferiblemente de 1 a 4, y más preferiblemente de 1 ó 2 átomos de carbono. Son ejemplos específicos de restos alquilo y alquilo inferior, respectivamente, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, terc-butilo, pentilo, ciclopentilo, hexilo, ciclohexilo, octilo, decilo y dodecilo, incluyendo los diversos isómeros de cadena ramificada de los mismos.

El término "acilo", como se emplea en este documento por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo alquilcarbonilo o alquenilcarbonilo, siendo los grupos alquilo y alquenilo como se han definido anteriormente.

El término "arilo", como se usa en este documento por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo monocíclico o bicíclico que contiene de 6 a 10 átomos de carbono en la parte del anillo. Son ejemplos específicos de grupos arilo, fenilo, naftilo y similares. "Aroílo" significa de una manera correspondiente un grupo arilcarbonilo.

El término "alcoxi", como se emplea en este documento por sí mismo o como parte de otro grupo, incluye un grupo alquilo como se ha definido anteriormente unido a un átomo de oxígeno. "Ariloxi" significa de una manera correspondiente un grupo arilo unido a un átomo de oxígeno.

El término "substituido", como se usa en este documento en relación con diversos restos, se refiere a substituyentes halógeno, tales como grupos flúor, cloro, bromo, yodo o trifluorometilo, o substituyentes amino, alquilo, alcoxi, arilo, alquilarilo, halogenoarilo, cicloalquilo, alquilcicloalquilo, hidroxi, alquilamino, alcanoilamino, arilcarbonilamino, nitro, ciano, tiol o alquiltio.

Los grupos "substituidos" pueden contener de 1 a 3, preferiblemente 1 ó 2, y aún más preferiblemente 1 de los substituyentes mencionados anteriormente.

Los inhibidores de fosfolamban tales como los compuestos de fórmula (I) o (II) pueden administrarse a un paciente en cantidades terapéuticamente eficaces que varían normalmente de aproximadamente 0,1 a 500 mg, más normalmente de aproximadamente 0,5 a 50 mg, al día, dependiendo de la edad, del peso, del estado del paciente, de la vía de administración y del inhibidor de fosfolamban usado. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa en este documento una cantidad que produce una dilatación directa de las arterias coronarias de un paciente. El compuesto activo usado en la invención, que puede ser el compuesto de fórmula (I) o (II) o cualquier compuesto que posea actividad de inhibición de fosfolamban como se ha definido anteriormente, puede formularse en formas de dosificación usando los principios conocidos en la técnica. Puede administrarse a un paciente tal cual o en combinación con excipientes farmacéuticos adecuados en forma de comprimidos, grageas, cápsulas, supositorios, emulsiones, suspensiones o soluciones. La elección de los ingredientes adecuados para la composición es una rutina para los especialistas en la técnica. Es evidente que también pueden usarse vehículos, disolventes, ingredientes de formación de gel, ingredientes de formación de dispersión o antioxidantes, colorantes, edulcorantes y compuestos humectantes adecuados, y otros ingredientes usados normalmente en este campo de tecnología. Las composiciones que contienen el compuesto activo pueden administrarse por vía entérica o parenteral, siendo preferida la vía oral. El contenido del compuesto activo en la composición es de aproximadamente el 0,5 al 100%, preferiblemente de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 20%, en peso de la composición total.

Experimentos

Se verificó el efecto sobre fosfolamban de los compuestos usados en la invención midiendo sus efectos sobre la captación de calcio en las vesículas de SR preparadas a partir de tejido cardíaco y en vesículas preparadas a partir de músculo esquelético rápido (músculo psoas). Ambas clases de vesículas de SR contienen Ca^{2+}-ATPasa, pero las vesículas procedentes del músculo esquelético rápido no contienen fosfolamban (Hoh JFY, "Muscle fiber types and function", Current Opinion in Rheumatology, 4:801-808, 1992). Estos experimentos de captación de calcio demostraron que el compuesto del ejemplo 1c era activo sólo en las vesículas preparadas a partir de tejido cardíaco, sugiriendo que el efecto se basaba en el alivio de la inhibición de fosfolamban. Además de esto, la unión directa del compuesto del ejemplo 1c a fosfolamban se demostró usando espectroscopía de dicroísmo circular. Además, la expresión de fosfolamban en arterias coronarias porcinas se demostró por mediciones de ARNm y usando anticuerpos específicos contra fosfolamban. Además, se demuestran los efectos del compuesto del ejemplo 1c sobre el flujo coronario y sobre las derivadas de la presión del ventrículo izquierdo en corazón de cobaya aislado con bombeo artificial perfundido con presión constante. Finalmente, se demuestra el mecanismo con mediación endotelial del efecto vasodilatador de los compuestos de la invención. Los métodos se describen a continuación con detalle.

Experimento 1

Efectos sobre la captación de calcio en las vesículas de SR preparadas a partir de músculo cardíaco y esquelético rápido Preparación de las vesículas de SR

Se decapitaron cobayas (10-12). se escindieron sus corazones o los músculos psoas, se lavaron en NaCl al 0,9% enfriado con hielo y se cortaron en trozos en un tampón que contenía Tris-maleato 20 mM, sacarosa 0,3 M, pH 7,0. Posteriormente, se homogeneizaron trozos de tejido con Polytron y adicionalmente con Potter (10 impulsos). El homogeneizado se centrifugó a 1000 g durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante se recogió y el sedimento se resuspendió en 5 ml del tampón (Tris-maleato 20 mM, sacarosa 0,3 M, pH 7,0) y se recentrifugó a 1000 g durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante obtenido se combinó con el sobrenadante recogido anteriormente y se centrifugaron una vez más a 10.000 g durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante final se filtró en un frasco equipado con un agitador magnético. Se añadió KCl al sobrenadante filtrado para conseguir la concentración final de 0,6 M (a 4ºC). La solución obtenida se centrifugó a 100.000 g durante 60 minutos a 4ºC. El sedimento se suspendió en 5 ml del tampón que contenía Tris-maleato 20 mM, sacarosa 0,3 M, pH 7,0 y se centrifugó a 100.000 g durante 60 minutos a 4ºC. El sedimento obtenido se suspendió en 5 ml del tampón que contenía Tris-maleato 20 mM, sacarosa 0,3 M, KCl 0,1 M, pH 7,0 y se almacenó a -80ºC hasta su uso. También se midió la concentración de proteína para estandarizar las preparaciones de vesícula preparadas por separado.

Ensayo de captación de calcio

En el ensayo de captación de calcio, se usó el indicador fluorescente fluo-3 para detectar la disminución de la concentración de Ca^{2+} extravesicular, cuando la Ca^{2+}ATPasa de SR estaba transfiriendo Ca^{2+} desde el espacio extravesicular al interior de las vesículas de SR.

Las vesículas de SR obtenidas anteriormente (50 \mug de proteína/ml) se preincubaron con o sin el compuesto de ensayo a 37ºC durante 5 minutos en el tampón de ensayo que contenía imidazol 40 mM, KCl 95 mM, NaN_{3} 5 mM, MgCl_{2} 5 mM, EGTA 0,5 mM, oxalato potásico 5 mM, rojo de rutenio 2 \muM, fluo-3 5 \muM, pH 7,0. El calcio libre se ajustó a 0,1 \muM o a 0,04 \muM por CaCl_{2}. La reacción se inició añadiendo ATP (5 mM). El volumen de reacción final fue de 1,5 ml. Se midió la fluorescencia de la mezcla de reacción durante 3 minutos usando longitudes de onda de excitación y emisión de 510 nm y 530 nm respectivamente.

Resultados

Las figuras 2A y 2B muestran el efecto del compuesto del ejemplo 1c (50 y 100 \muM) sobre la velocidad de captación de Ca^{2+} en las vesículas de SR de músculo cardíaco (A) y de músculo esquelético rápido (B). Se proporcionan las medias \pm SEM de tres experimentos por grupo. Puede verse que el compuesto del ejemplo 1c aceleró la captación de calcio en las vesículas de SR cardíacas pero no provoco ningún cambio en la captación de calcio en las vesículas de SR preparadas a partir del músculo esquelético rápido.

La tabla 1 muestra los efectos de otros diversos inhibidores de fosfolamban de fórmula (I) o (II) sobre la velocidad de captación de Ca^{2+} en vesículas de SR de músculo cardíaco (A) y de músculo esquelético rápido (B). Los experimentos se realizaron a concentraciones de calcio libre de 0,1 \muM y 0,04 \muM, respectivamente.

TABLA 1 Estimulación (%) de la captación de Ca^{2+} en las preparaciones de vesícula obtenidas a partir del miocardio ventricular (A) y músculo esquelético rápido (B) del corazón de cobaya.

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Experimento 2

Unión del compuesto del ejemplo 1c a la parte citosólica de fosfolamban demostrada por espectroscopía de dicroísmo circular (CD)

Tanto el fragmento de 36 amino ácidos N-terminal de la proteína fosfolamban humana (PLB [1-36 a.a.]) como el fragmento de 36 aminoácidos N-terminal de la proteína fosfolamban humana doble fosforilado (PLB [1-36 a.a.] (Ser16PO_{3}-, Thr17PO_{3}-)) se obtuvieron por síntesis de péptidos. Los péptidos se purificaron por HPLC en fase inversa, se analizó su homogeneidad por espectrometría de masas y se descubrió que tenían una pureza del 97%. Los péptidos se liofilizaron y después se resuspendieron en agua a la concentración final de 0,1 mM, para el análisis de CD. El pH de las dos soluciones estaba comprendido entre 3 y 4 y no se ajustó adicionalmente. El compuesto del ejemplo 1c se disolvió en agua a una concentración final de 0,1 mM. El pH se ajustó a 7,2 añadiendo NaOH 1 N.

Se adquirieron espectros de dicroísmo circular a 24ºC en muestras de 100 \mul. Los espectros se registraron en un espectropolarímetro Jasco J-720 usando una cubeta de cuarzo con una longitud de trayectoria de 1 mm. La anchura de las bandas fue 1 nm, la sensibilidad de 20 mdeg, la etapa de resolución de 0,5 nm, el tiempo de respuesta de 0,5 segundos y la velocidad de exploración de 20 nm/min (de 250 a 190 nm). Los espectros se expresaron en [\theta] x 10^{-3} x grados x cm^{2} x dmol^{-1}.

Los espectros de CD de PLB[1-36 a.a] y de las mezclas PLB[1-36 a.a] + el compuesto del ejemplo 1c demuestran que tiene lugar un cambio drástico en la estructura media del péptido después de la adición del compuesto del ejemplo 1c. Puede observarse un gran aumento de la contribución de \alpha-hélice (fig. 1). Este comportamiento se demostró para muchos péptidos de unión a calmodulina, que forman hélices en el estado undo. Los estudios de CD mostraron que cuando dichos péptidos se unen a la calmodulina, hay un aumento en la helicidad del complejo con respecto a la suma de los dos componentes individuales que no interaccionan (como revisión, véase: O'Neil, K.T. y DeGrado, W.F. "How calmodulin binds its targets: sequence independent recognition of amphiphilic \alpha-helices", TIBS 15:59-64, 1990). Además, se demostró anteriormente por RMN que el fragmento N-terminal de PLB [aa.1-25] interacciona directamente con la calmodulina (Gao, Y. et al. "Interaction of calmodulin with phospholamban and caldesmon: comparative studies by ^{1}H-NMR spectroscopy", Biochim. Biophys. Acta 1160: 22-34, 1992). Por lo tanto, el experimento de la presente invención verifica que el compuesto del ejemplo 1c forma un complejo con PLB en su dominio N-terminal.

El compuesto del Ejemplo 1c, añadido a PLB[1-36, a.a](Ser16PO_{3}-, Thr17PO_{3}-) no influye en la estructura del péptido fosforilado tanto como en el no fosforilado. Las mediciones por CD demuestran que el compuesto del ejemplo 1c interacciona con la parte citosólica del fosfolamban PLB [1-36 a.a] y no interacciona o interacciona débilmente con el fosfolamban fosforilado (PLB[1-36, a.a](Ser16PO_{3}-, Thr17PO_{3}-)). Por lo tanto, la interacción es específica para la proteína fosfolamban no fosforilada.

Experimento 3

Detención de polipéptidos de fosfolamban y Ca^{2+}-ATPasa por inmunotransferencia de tejido cardíaco porcino Métodos

Se pulverizaron en nitrógeno líquido muestras de tejido de miocardio del ventrículo izquierdo del corazón, aorta y de la arteria coronaria proximal (los primeros 2 cm de la arteria coronaria partiendo de la aorta) así como de la arteria coronaria más distal (los siguientes 2 cm) obtenidas y agrupadas de tres cerdos, y los polvos se suspendieron en tampón de homogeneización (tampón K^{+}-fosfato 50 mM pH 7,0, NaF 10 mM, EDTA 1 mM, PMSF 0,3 mM, DTT 0,5 mM, sacarosa 0,3 M). Cada muestra de tejido se homogeneizó a (1100 rpm) con un homogeneizador Potter-Elvehjelm a +4ºC 20 veces. La concentración de proteínas se midió de acuerdo con Bradford, M., (1976), Anal. Biochem., 72, 248-254. Para determinar la Ca^{2+}-ATPasa y las proteínas fosfolamban (PLB), se analizaron 30 \mug de proteína total de cada muestra de tejido mediante SDS-PAGE (13%) de acuerdo con Laemmli, U., (1970), Nature, 227, 680-685. Las proteínas se detectaron por transferencia de Western (Towbin, H. et al., (1979), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 4350-4354), sobre una membrana de nitrocelulosa de 0,45 \mum (Bio-Rad Laboratories). Las membranas para la detección de la proteína Ca^{2+}-ATPasa se incubaron con anticuerpo policlonal anti-Ca^{2+}ATPasa de SR (1:500) seguido de anticuerpo secundario anti-IgG de ratón-POD. Como alternativa, se usó anticuerpo monoclonal anti-Ca^{2+}ATPasa de SR (1:1000; Affinity Bioreagents) seguido de anticuerpo anti-IgG de ratón-POD para la detección de la Ca^{2+}-
ATPasa.

Las membranas para detectar la proteína PLB se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-PLB (Upstate Biotechnology, Inc.) a un dilución de 1:1000, las membranas se lavaron adicionalmente y se incubaron con anticuerpo anti-IgG de ratón-POD. Las membranas se revelaron por inmuno-detección ECL (Amersham Life Science) seguido de substrato estabilizado TMB para HPR (Promega Corp.).

Resultados

De acuerdo con las transferencias de Western, la Ca^{2+}ATPasa se detecta en todas las muestras de tejido. Las transferencias de Western también pusieron de manifiesto que se encuentra PLB en el miocardio del ventrículo izquierdo y en la arteria coronaria distal. Basándose en nuestras transferencias de Western, no pudo detectarse PLB en muestras de tejido procedentes de la aorta y de la parte proximal de la arteria coronaria.

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Experimento 4

Análisis de la presencia de ARNm de fosfolamban en tejidos cardíacos porcinos Métodos

Para responder a la cuestión de si las células de músculo liso o endoteliales de la arteria coronaria porcina contenía ARNm de fosfolamban (PLB), se realizó un análisis de Northern de muestras procedentes de tres corazones agrupados con respecto a la presencia de ARNm de PLB usando métodos bien conocidos en la técnica. Se realizó una purificación de ARN a pequeña escala del tejido del miocardio del ventrículo izquierdo porcino, aorta y arteria coronaria (regiones proximal y más distal) pulverizando 200-800 mg de tejido bajo nitrógeno líquido en un mortero. El polvo se suspendió en solución de desnaturalización (tiocianato de guanidinio 4 M, citrato sódico 25 mM, pH 7, N-lauroilsarcosina al 0,5%, 2-mercaptoetanol 0,1 M). Después de la extracción con fenol ácido/cloroformo, se precipitó el ARN total dos veces con isopropanol y finalmente se disolvió en agua. La concentración de ARN en las preparaciones resultantes se determinó espectrofotométricamente y su integridad se analizó en gel de agarosa no desnaturalizante teñido con bromuro de etidio.

El análisis de Northern del ARNm de PLB en estas preparaciones se realizó usando métodos convencionales (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). En resumen, se cargaron 10 \mug y 20 \mug de ARN total de cada tejido en un gel de formaldehído al 1%/agarosa. Como control se usaron 10 \mug de preparación de ARN procedente de tejido de músculo cardíaco humano, y se usaron escalas de ARN disponibles en el mercado (BRL, Gaithersburg, MD) para evaluar los pesos moleculares de los ARN. Después de la transferencia de los ARN diferentes sobre un filtro de nylon (Hybond-N, Amersham, Reino Unido), el filtro se hidridó con la región de codificación marcada con ^{32}P del gen PLB humano. Después de la hibridación, el filtro se lavó en condiciones rigurosas bien conocidas por los especialistas en la técnica y se expuso a una película Kodak X-Omat.

Resultados

Los resultados demuestran que el tejido ventricular izquierdo del corazón porcino contiene ARN que reacciona con la sonda de hibridación de PLB. También se detectó una señal en la misma posición, aunque de mucha menor intensidad, en las muestras de aorta porcina y tejidos de la arteria coronaria porcina. De esta manera, estos resultados apoyan la opinión de que el gen PLB es activo en tejido de arteria coronaria porcina.

Experimento 5

Los efectos sobre las derivadas de presión del ventrículo izquierdo y flujo coronario Métodos

En el estudio se usaron cobayas de cualquier sexo que pesaban 300-400 g. Después de sacrificar a los cobayas mediante un golpe en el cráneo y de decapitarlos, se escindió el corazón rápidamente. El corazón después se aclaró en tampón de perfusión oxigenado frío. Se insertó una cánula en la aorta y se fijó con una ligadura. Comenzó una perfusión retrógrada en cuanto el corazón se puso en una cámara de humedad controlada termostáticamente del aparato de Langendorff. Se usó solución de Tyrode modificada (37ºC), equilibrada en un oxigenador de bulbo controlado termostáticamente con carbogen (95% de O_{2} y 5% de CO_{2}) como tampón de perfusión. La composición de la solución de Tyrode fue (en mM): NaCl 135; MgCl_{2} x 6H_{2}O 1; KCl 5; CaCl_{2} x 2H_{2}O 2; NaHCO_{3} 15; Na_{2}HPO_{4} x 2H_{2}O 1; glucosa 10; pH 7,3-7,4. Los experimentos se realizaron en condiciones de presión constante (50 mmHg). Después de una corta preestabilización (10 min), se puso cuidadosamente un balón de látex (tamaño 4) en el ventrículo izquierdo a través de la vena pulmonar izquierda y de la aurícula izquierda. El balón de látex se unió a una cánula de acero inoxidable acoplada con un transductor de presión. El balón de látex, la cánula y la cámara del transductor de presión se llenaron con una mezcla de etilenglicol/agua (1:1) evitando cualquier burbuja de aire. La presión del ventrículo izquierdo isovolumétrica se registró mediante el transductor de presión. Se calcularon las derivadas máximas positiva y negativa de la presión del ventrículo izquierdo usando las señales de versión digitalizadas. Al comienzo del experimento, el volumen del balón se ajustó para obtener una presión diastólica de aproximadamente 5 mmHg. El flujo coronario (ml/min) se registró continuamente por un caudalímetro electromagnético con una sonda de flujo insertada por encima de la cánula aórtica. El corazón se bombeó artificialmente a 250 latidos/min con un electrodo coaxial localizado sobre la superficie de la aurícula derecha. Antes de comenzar el experimento, se permitió que el corazón se estabilizara adicionalmente durante 30-50 minutos con vehículo (DMSO al 0,1%) para alcanzar un flujo coronario
estable.

Después del registro de los 15 minutos iniciales, se añadieron diversas concentraciones del compuesto de ensayo del ejemplo 1c al tampón de perfusión a intervalos de 15 minutos. Se ensayó el intervalo de concentraciones de 0,3-30 \muM. La concentración del vehículo (DMSO al 0,1%) se mantuvo constante durante todo el experi-
mento.

Resultados

La figura 3A muestra el aumento del flujo coronario mediado a través del efecto de dilatación directa del compuesto del ejemplo 1c sobre las arterias coronarias que contenían células de músculo liso vascular y células endoteliales. Las figuras 3B y 3C muestran el efecto del compuesto del ejemplo 1c sobre las derivadas positivas y negativa (dP/dt max positiva y negativa) de la presión del ventrículo izquierdo. Se proporcionan las medias \pm SEM de seis corazones bombeados artificialmente a 250 latidos/minuto.

A partir de los experimentos anteriores, se deduce que el aumento en el flujo coronario está mediado por el efecto de dilatación directo sobre las arterias coronarias y que el efecto de dilatación se debe a la inhibición del fosfolamban presente en las arterias coronarias. Por lo tanto, los resultados sugieren un uso potencial de inhibidores de fosfolamban en el tratamiento de pacientes que padecen una disminución del flujo coronario.

La tabla 2 muestra valores de EC50 y efectos máximos de otros diversos inhibidores de fosfolamban de fórmula (I) o (II) sobre el flujo coronario.

TABLA 2 Valores de EC50 y efectos máximos (% de cambio a partir de la medida inicial) en el flujo coronario

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Experimento 6

Este experimento demuestra que el efecto vasodilatador del inhibidor de fosfolamban del ejemplo 1c se debe a un mecanismo con mediación endotelial. Como compuesto de referencia se usó la substancia P, un vasodilatador dependiente de endotelio. Se usó Triton x 100 para destruir las células endoteliales de los vasos coronarios.

El experimento se realizó en condiciones de presión constante (50 mmHg) con el corazón latiendo libremente. El flujo coronario (ml/min) se registró continuamente mediante un caudalímetro electromagnético con una sonda de flujo insertada por encima de la cánula aórtica.

Después del registro de los 15 minutos iniciales, se añadió una dosis en embolada de substancia P (0,1 \muM/0,3 ml) al tampón de perfusión a través de una ramificación lateral de la cánula aórtica (figura 4B). La adición de la substancia P se repitió dos veces antes de la administración de la inyección de Triton x 100 (0,05%/0,2 ml) mediante una aguja insertada en la cánula justo por encima de la aorta. Después de 85 minutos de inyección de Triton x 100 se añadió una dosis de control de substancia P dos veces al tampón de perfusión para comprobar si las células endoteliales se habían destruido. Posteriormente se ensayó el intervalo de concentraciones de 0,3 -30 \muM del compuesto del ejemplo 1c. La concentración de vehículo (DMSO al 0,1%) se mantuvo constante durante todo el experimento. En la figura 4A se muestra un experimento de control donde se observa el efecto del ejemplo 1c en el mismo intervalo de concentraciones cuando la endotelina no se altera por Triton x 100.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran la preparación de inhibidores de fosfolamban.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de 3-bencil-5,7-bis[(1H-tetrazol-5-il)-metoxi]-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona a) 3-Bencil-5,7-dihidroxi-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

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Una solución de floroflucinol dihidrato (20 g) y 2-bencilacetoacetato de etilo (27, ml) en etanol (320 ml) se trató con HCl seco a 0ºC durante cinco horas y la solución se mantuvo a esta temperatura durante una noche. La solución amarilla se concentró y se trituró con agua, los sólidos se filtraron, se lavaron con agua y se secaron. El hidrato resultante se evaporó tres veces hasta sequedad en tolueno, se trituró con éter de petróleo (pe.40-60ºC) y se filtró. Rendimiento 33,4 g (96%). Punto de fusión 258-260ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,525 (s, 3H, CH_{3}), 3,887 (s, 2H, CH_{2}Ph), 6,171 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,274 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,167-7,279 (m, 5H, Ph), 10,2 (s, 1H, OH), 10,47 (s, 1H, OH).

b) 3-Bencil-5,7-bis(cianometoxi)-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

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Se agitaron cloroacetonitrilo (6,86 g), carbonato potásico (23,9 g) y 12,2 g del producto del ejemplo 1a en 120 ml de DMF a 100ºC en atmósfera de nitrógeno durante dos horas. La mezcla de reacción se enfrió y se vertió en agua enfriada con hielo. Los sólidos se filtraron y se lavaron con agua. Rendimiento 13,8 g (88%). Punto de fusión 147-154ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,525 (s, 3H, CH_{3}), 3,969 (s, 2H, CH_{2}Ph), 5,307 (s, 2H, OCH_{2}CN), 5,314 (s, 2H, OCH_{2}CN), 6,814 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,940 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,18-7,292 (m, 5H, Ph).

c) 3-Bencil-5,7-bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

14

Se agitaron el producto del ejemplo 1b (1 g), azida sódica (0,42 g) y cloruro amónico (0,34 g) en DMF (5 ml) en atmósfera de nitrógeno a 100ºC durante 5 horas. La mezcla de reacción se dejó enfriar y después se vertió en agua enfriada con hielo. El pH de la solución se ajustó a 10-11 y después la solución se extrajo una vez con acetato de etilo o bien se filtró a través de CELITE. La solución se acidificó a pH 2 con ácido clorhídrico, se mantuvo a 5ºC y se filtró. Rendimiento 0,96 g (81%). Punto de fusión 229-233ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,468 (s, 3H, CH_{3}), 3,937 (s, 2H, CH_{2}Ph), 5,596 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 5,602 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 6,832 (d 1H, J = 2,4 Hz), 6,851 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,171-7,283 (m, 5H, Ph).

Ejemplo 2 Preparación de 7,8,9,10-Tetrahidro-1,3-bis[(1H-tetrazol-il)metoxi]-7-fenil-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona a) 7,8,9,10-Tetrahidro-1,3-dihidroxi-7-fenil-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona

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Una solución de floroglucinol (0,7 g) y 2-etoxicarbonil-3-fenilciclohexanona (1,5 g) en etanol se trató con HCl seco como se describe en el ejemplo 1a. El producto se recristalizó en primer lugar en etanol-agua (1:1) y después se trituró con éter. Rendimiento 0,61 g.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 1,38-1,52 (m, 1H), 1,57-1,66 (m, 1H), 1,69-1,78 (m, 1H), 1,86-1,96 (m, 1H), 2,9-3,02 (m, 1H), 3,3-3,4 (m,1H), 4,050 (a, 1H), 6,157 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,297 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,.076-7,265 (m,5H), 10,153 (s, 1H), 10,456 (s, 1H).

b) 7,8,9,10-Tetrahidro-1,3-bis(cianometoxi)-7-fenil-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona

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El producto del ejemplo 2a (0,5 g) se trató con cloroacetonitrilo (0,25 g) y carbonato potásico (1,12 g) en DMF (5 ml) como se describe en el ejemplo 1b. Rendimiento 0,6 g.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 1,38-1,58 (m, 1H), 1,6-1,7 (m, 1H), 1,7-1,76 (m, 1H), 1,89-1,99 (m, 1H), 2,9-3,03 (m,1H), 3,2-3,28 (m 1H), 4,111 (a, 1H), 5,314 (s, 2H), 5,349 (s, 2H), 6,840 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,925 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,108-7,274 (m, 5H).

c) 7,8,9,10-Tetrahidro-1,3-bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-7-fenil-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona

17

El producto del ejemplo 2b (0,6 g) se trató con azida sódica (0,2 g) y cloruro amónico (0,17 g) en DMF (5 ml) como en el ejemplo 1c. El producto se recristalizó en una mezcla de DMF, etanol y agua (aproximadamente 1:2:3). Rendimiento 0,41 g. Punto de fusión: 153-154ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 1,38-1,5 (m, 1H), 1,5-1,6 (m, 1H), 1,69-1,76 (m, 1H), 1,87-1,96 (m, 1H), 2,9-3,05 (m, 1H), 3,2-3,3 (m, 1H), 4,094 (a, 1H), 5,602 (s, 2H), 5,643 (s, 2H), 6,832 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,851 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,089-7,212 (m, 5H).

Ejemplo 3 Preparación de 3-Bencil-5,7-bis[(2,5-dihidro-5-oxo-4H-1,2,4-oxadiazol-3-il)-metoxi]-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona a) 3-Bencil-5,7-bis[(hidroxiamidino)metoxi]-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

18

Se añadió trietilamina (1,94 ml) se añadió a una suspensión de clorhidrato de hidroxilamina (0,97 g) en DMSO (2 ml) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante treinta minutos. Los cristales se filtraron y se lavaron con THF. El filtrado se concentró y se le añadió el producto del ejemplo 1b (0,5 g). Esta solución se mantuvo a 75ºC durante una noche. La mezcla de reacción se trató con agua enfriada con hielo, el pH se ajustó a 11 y los sólidos se filtraron, se lavaron con agua y se secaron. Rendimiento 0,5 g. Punto de fusión: 155-160ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,56 (s, 3H, CH_{3}), 3,938 (s, 2H), 4,466 (s, 2H), 4,486 (s, 2H), 5,565 (s, H, NH_{2}), 5,709 (s, 2H, NH_{2}), 6,658 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,692 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,168-7,284 (m, 5H, Ph), 9,346 (s, 1H, OH), 9,362 (s, 1H, OH).

b) 3-Bencil-5,7-bis[(etoxicarboniloxiamidino)metoxi]-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

19

Se añadió cloroformiato de etilo (0,45 ml) a una solución del producto del ejemplo 3a (1 g) y piridina (0,38 ml) en DMF (5 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción se mantuvo a esta temperatura durante 30 minutos más y después se añadió agua enfriada con hielo. Los sólidos se filtraron y se lavaron con agua. Rendimiento 1,63 g. Punto de fusión 87-92ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 1,215-1,256 (m, 6H), 2,553 (s, 3H), 3,947 (s, 2H), 4,140-4,198 (m, 4H), 4,566 (s, 2H), 4,599 (s, 2H), 6,688 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,718 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,792 (a, 2H, NH_{2}), 6,818 (a, 2H, NH_{2}), 7,171-7,285 (m, 5H).

c) 3-Bencil-5,7-bis[(2,5-dihidro-5-oxo-4H-1,2,4-oxadiazol-3-il)-metoxi]-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

20

El producto del ejemplo anterior (1,5 g) y DBU (0,8 ml) en DMF (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se trató con agua enfriada con hielo y se acidificó. Los sólidos se filtraron y se lavaron con agua. La masa del sólido resultante se recogió en solución de hidróxido sódico 0,1 N, se trató con carbono activado y finalmente se acidificó. Rendimiento 0,64 g. Punto de fusión: 130-136ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,524 (s, 3H), 3,954 (s, 2H), 5,187 (s, 2H), 5,215 (s, 2H), 6,748 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,834 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,158-7,289 (m, 5H), 12,8 (a, 2H).

Ejemplo 4 Preparación de 7,8,9,10-Tetrahidro-bis[(1H-tetrazol-il)metoxi]-1,3-dihidroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona a) 7,8,9,10-Tetrahidro-1,3-dihidroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona

21

Se agitaron floroglucinol (1 g) y 2-oxociclohexano carboxilato de etilo (1,32 g) en ácido sulfúrico al 75% (10 ml) durante una noche, la mezcla se vertió en agua enfriada con hielo y se filtró. Rendimiento: 1,55 g.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 1,65 (a, 4H), 2,345 (a, 2H), 3,037 (a, 2H), 6,138 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,245 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 10,069 (a, 1H, OH), 10,322 (s, 1H, OH).

b) 7,8,9,10-Tetrahidro-bis(cianometoxi)-1,3-dihidroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona

22

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Se hicieron reaccionar el producto del ejemplo anterior (0,5 g), cloroacetonitrilo (0,34 g) y carbonato potásico (1,5 g) en DMF (5 ml) como en el ejemplo 1b. Rendimiento: 0,44 g.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 1,68 (a, 4H), 2,41 (a, 2H), 3,00 (a, 2H), 5,297 (s, 2H), 5,309 (s, 2H), 6,797 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,899 (d, 1H, J = 2,4 Hz).

c) 7,8,9,10-Tetrahidro-bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-1,3-dihidroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona

23

El producto del ejemplo anterior (0,4 g) se trató con azida sódica (0,18 g) y cloruro amónico (0,14 g) en DMF (2,5 ml) como en el ejemplo 1c. El producto se recristalizó en etanol-DMF (1:1). Rendimiento 0,17 g. Punto de fusión 283-286ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 1,626 (a, 4H), 2,393 (a, 2H), 2,971 (a, 2H), 5,583 (s, 2H), 5,599 (s, 2H), 6,811 (s, 2H).

Ejemplo 5 Preparación de 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-4-fenil-2H-1-benzopiran-2-ona a) 5,7-Dihidroxi-4-fenil-2H-1-benzopiran-2-ona

24

Una solución de floroglucinol (2,00 g) y benzoilacetato de etilo (3,05 g) en etanol (30 ml) se trató con HCl seco como se describe en el ejemplo 1a. El producto se recristalizó en etanol-agua (1:1). Rendimiento 3,0 g (75%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 5,739 (s, 1H, CH=C), 6,155 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,263 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,305-7,381 (m, 5H, Ph), 10,084 (s, 1H, OH), 10,368 (s, 1H, OH).

b) 5,7-Bis(cianometoxi)-4-fenil-2H-1-benzopiran-2-ona

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El producto del ejemplo anterior (1,00 g) se trató con cloroacetonitrilo (0,62 g) y carbonato potásico (2,72 g) en DMF (5 ml) como se describe en el ejemplo 1b. La mezcla de reacción se vertió en agua enfriada con hielo y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. El acetato de etilo se lavó con NaOH 1 M, se secó con sulfato sódico y se evaporó. El producto se recristalizó en isopropanol. Rendimiento 0,41 g (31%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 4,845 (s, 2H, OCH_{2}CN), 5,344 (s, 2H, OCH_{2}CN), 6,086 (s, 1H, CH=C), 6,770 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,040 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,320-7,443 (m, 5H, Ph).

c) 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-4-fenil-2H-1-benzopiran-2-ona

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El producto del ejemplo anterior (0,40 g) se trató con azida sódica (0,16 g) y cloruro amónico (0,14 g) en DMF (2 ml) a 100ºC durante 2 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1c. Rendimiento: 0,40 g (79%). Punto de fusión 222-224ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 5,148 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 5,649 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 5,968 (s, 1H, CH=C), 6,811 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,962 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,994-7,185 (m, 5H, Ph).

Ejemplo 6 Preparación de 7,8,9,10-Tetrahidro-1,3-bis[(1H-tetrazol-il)metoxi]-8-fenil-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona a) 7,8,9,10-Tetrahidro-l,3-dihidroxi-8-fenil-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona

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Una solución de floroglucinol (1,56 g) y 2-oxo-5-fenilciclohexano-carboxilato de etilo (2,52 g) en etanol (25 ml) se trató con HCl seco como se describe en el ejemplo 1a. El precipitado se filtró y se lavó con agua y EtOH. Rendimiento 1,0 g (32%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 1,72-1,82 (m, 1H), 2,01 (a, 1H), 2,317-2,387 (m, H), 2,707-2,763 (m, H), 2,830 (a, 1H), 3,041 (a, H), 3,35 y 3,40 (a, 1H), 6,174 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,277 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,200-7,350 (m, 5H, Ph), 10,131 (s, 1H, OH), 10,401 (s, 1H, OH).

b) 7,8,9,10-Tetrahidro-1,3-bis(cianometoxi)-8-fenil-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona

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El producto del ejemplo anterior (1,0 g) se trató con cloroacetonitrilo (0,57 g) y carbonato potásico (1,0 g) en DMF (5 ml) como se describe en el ejemplo 1b. La DMF se evaporó y el residuo se disolvió en EtOAc. El acetato de etilo se lavó con NaOH 1 M, se secó con sulfato sódico y se evaporó. El producto se recristalizó en acetona-isopropanol (1:3). Rendimiento 0,50 g (40%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 1,75-1,88 (m, 1H), 2,05 (a, 1H), 2,38-2,48 (m, 1H), 2,77-2,85 (m, 1H), 2,90 (a, 1H), 3,07 (a, 1H), 3,22 y 3,28 (a, 1H), 5,316 (s, 2H, OCH_{2}CN), 5,331 (s, 2H, OCH_{2}CN), 6,829 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,939 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,210-7,380 (m, 5H, Ph).

c) 7,8,9,10-Tetrahidro-1,3-bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-8-fenil-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona

29

El producto del ejemplo anterior (0,30 g) se trató con azida sódica (0,10 g) y cloruro amónico (0,09 g) en DMF (2 ml) a 100ºC durante 3,5 horas. El producto se aisló de la misma manera que en el ejemplo 1c. Rendimiento 0,30 g (82%). Punto de fusión 235-245ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 1,70-1,80 (m, 1H), 1,96 (a, 1H), 2,38-2,446 (m, 1H), 2,836 (m, 2H), 3,052 (a, 1H), 3,252 y 3,301 (a, 1H), 5,604 (s, 2H, OCH_{2}CN), 5,632 (s, 2H, OCH_{2}CN), 6,827 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,858 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,209-7,351 (m, 5H, Ph).

Ejemplo 7 Preparación de 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-metil-3-(2-feniletil)-2H-1-benzopiran-2-ona a) 5,7-Dihidroxi-4-metil-3-(2-feniletil)-2H-1-benzopiran-2-ona

30

Una solución de floroglucinol (0,87 g) y 2-(2-feniletil)acetoacetato de etilo (1,62 g) en etanol (30 ml) se trató con HCl seco como se describe en el ejemplo la. Rendimiento: 1,77 g (87%). Punto de fusión 248-252ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,413 (s, 3H, CH_{3}), 2,652-2,782 (m, 4H, CH_{2}CH_{2}), 6,151 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,256 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,183-7,304 (m, 5H, Ph), 10,137 (s, 1H, OH), 10,369 (s, 1H, OH).

b) 5,7-Bis(cianometoxi)-4-metil-3-(2-feniletil)-2H-1-benzopiran-2-ona

31

El producto del ejemplo anterior (0,90 g) se trató con cloroacetonitrilo (0,48 g) y carbonato potásico (2,1 g) en DMF (5 ml) a 100ºC durante 0,5 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1b. Rendimiento 1,00 g (88%). Punto de fusión 179-183ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,384 (s, 3H, CH_{3}), 2,699-2,754 (m, 2H, CH_{2}CH_{2}), 2,805-2,841 (m, 2H, CH_{2}
CH_{2}), 5,302 (s, 4H, OCH_{2}CN), 6,790 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,909 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,190-7,307 (m, 5H, Ph).

c) 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-4-metil-3-(2-feniletil)-2H-1-benzopiran-2-ona

32

El producto del ejemplo anterior (0,40 g) se trató con azida sódica (0,15 g) y cloruro amónico (0,12 g) en DMF (2 ml) a 100ºC durante 2,5 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 10. Rendimiento 0,385 g (78%). Punto de fusión 248-250ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,368 (s, 3H, CH_{3}), 2,668-2,707 (m, 2H, CH_{2}CH_{2}), 2,783-2,822 (m, 2H, CH_{2}
CH_{2}), 5,593 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 5,604 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 6,819 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,834 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,161-7,291 (m, 5H, Ph).

Ejemplo 8 Preparación de 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-1,3-dibencil-4-metil-2(1H)-quinolinona a) 3,5-dimetoxianilida del ácido 2-bencil-3-oxobutanoico

33

Se añadió 3,5-dimetoxianilina (5 g) en porciones a 2-bencilacetoacetato de etilo (15 ml) precalentado (160ºC) en atmósfera de nitrógeno y se mantuvo a esta temperatura durante 60 minutos. La solución enfriada se diluyó con éter de heptanoetilo y se filtró. Rendimiento 5,2 g (49%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,183 (s, 3H), 3,069 (d, 2H, J = 7,2 Hz), 3,923 (t, 1H, J = 7,2 Hz), 6,616 (dd, 1H, J = 2,3 Hz), 6,765 (d, 2H, J = 2,3 Hz), 7,13-7,3 (m,5H), 10,123 (s, 1H).

b) 3-Bencil-5,7-dimetoxi-4-metil-2(1H)-quinolinona

34

El producto del ejemplo anterior (1,2 g) se añadió a ácido metanosulfónico (3,5 ml) precalentado (85ºC) y se mantuvo a esta temperatura durante 15 minutos. La solución se permitió enfriar y después se trató con agua enfriada con hielo. El producto se filtró, se lavó con bicarbonato sódico y agua. Rendimiento 1,08 g (95%).

^{1}H-RMN (300 MHz): 2,486 (s, 3H), 3,785 (s, 3H), 3,808 (s, 3H), 3,985 (s, 2H), 6,315 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,472 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,1-7,3 (m, 5H), 11,52 (s, H).

c) 3-Bencil-5,7-dihidroxi-4-metil-2(1H)-quinolinona

35

El producto del ejemplo anterior (1 g) se calentó a reflujo en atmósfera de nitrógeno en clorhidrato de piridina (5 g) durante veinte minutos. La mezcla de reacción se trató con agua y el producto se filtró. Rendimiento 0,9 g (100%). Punto de fusión: 307-312ºC.

^{1}H-RMN (300 MHz): 2,503 (s, 3H), 3,942 (s, 2H), 6,102 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,187 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,1-7,25 (m, 5H), 9,725 (s, 1H), 9,984 (s, 1H), 11,285 (s, 1H).

d) 1,3-Dibencil-5,7-dimetoxi-4-metil-2(1H)-quinolinona

36

El producto del ejemplo 8b (1 g), t-butóxido potásico (0,62 g) y bromuro de bencilo (0,68 ml) se agitaron en DMSO (10 ml) a 60ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se trató con agua, se extrajo con tolueno y se evaporó. El producto se trituró con éter etílico y se filtró. Rendimiento 0,5 g (39%).

^{1}H-RMN (400 MHz): 2,537 (s, 3H), 3,708 (s, 3H), 3,826 (s, 3H), 4,124 (s, 2H), 5,56 (a, 2H), 6,413-6,434 (m, 2H), 7,154-7,332 (m, 10H).

e) 1,3-Dibencil-5,7-dihidroxi-4-metil-2(1H)-quinolinona

37

El producto del ejemplo anterior (2 g) se trató con clorhidrato de piridina (10 g) como se describe en el ejemplo 8c. El producto se extrajo con acetato de etilo y se evaporó. Rendimiento 1,4 g (75%).

^{1}H-RMN (400 MHz): 2,570 (s, 3H), 4,076 (s, 2H), 5,450 (a, 2H), 6,135 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 6,199 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 7,128 - 7,333 (m, 10H), 9,83 (a, 1H), 10,166 (s, H).

f) 5,7-Bis(cianometoxi)-1,3-dibencil-4-metil-2(1H)-quinolinona

38

El producto del ejemplo anterior (1,4 g) se trató con cloroacetonitrilo (0,76 g) y K_{2}CO_{3} (2,5 g) en DMF (20 ml) como se describe en el ejemplo 1b. Rendimiento 1,5 g (89%).

^{1}H-RMN (400 MHz): 2,555 (s, 3H), 4,146 (s, 2H), 5,214 (s, 2H), 5,275 (s, 2H), 5,578 (s, 2H), 6,735 (s, 2H), 7,13-7,33 (m, 10H).

g) 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-1,3-dibencil-4-metil-2(1H)-quinolinona

39

El producto del ejemplo anterior (1,3 g) se trató con azida sódica (0,41 g) y cloruro amónico (0,34 g) como se describe en el ejemplo 1c. Rendimiento: 0,69 g (45%).

^{1}H-RMN (400 MHz): 2,471 (s, 3H), 4,113 (s, 2H), 5,477 (s, 2H), 5,55 (a, 2H), 5,574 (s, 2H), 6,670 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 6,775 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 7,13-7,32 (m, 10H).

Ejemplo 9 Preparación de 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-3-bencil-1,4-dimetil-2(1H)-quinolinona a) 3-Bencil-5,7-dimetoxi-1,4-dimetil-2(1H)-quinolinona

40

El producto del ejemplo 8b (0,5 g), t-BuOK (0,2 g) y yoduro de metilo (0,4 ml) se agitaron en DMSO (5 ml) a 35ºC durante dos días. La mezcla de reacción se trató con agua y se extrajo con tolueno. El producto se purificó por cromatografía en columna usando tolueno-acetato de etilo-ácido acético 8:2:1 como eluyente. Rendimiento 0,24 g (46%).

^{1}H-RMN (300 MHz): 2,51 (s, 3H), 3,632 (s, 2H), 3,846 (s, 3H), 3,896 (s, 3H), 4,047 (s, 2H), 6,468 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,558 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,1-7,26 (m, 5H).

b) 3-Bencil-5,7-dihidroxi-1,4-dimetil-2(1H)-quinolinona

41

El producto del ejemplo anterior (0,2 g) se trató con clorhidrato de piridina (2 g) como se describe en el ejemplo 8c y el producto se extrajo con acetato de etilo. Rendimiento 0,16 g (89%).

^{1}H-RMN (400 MHz): 2,567 (s, 3H), 3,515 (s, 3H), 4,005 (s, 2H), 6,244 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,268 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,08-7,25 (m, 5H), 9,879 (s,1 10,113 (s,1H).

c) 5,7-Bis(cianometoxi)-3-bencil-1,4-dimetil-2(1H)-quinolinona

42

El producto del ejemplo anterior (0,15 g), cloroacetonitrilo (0,08 g) y K_{2}CO_{3} (0,28 g) se hicieron reaccionar en DMF (2 ml) como se describe en el ejemplo 1b. Rendimiento 0,16 g (84%).

^{1}H-RMN (400 MHz): 2,524 (s, 3H), 3,658 (s, 3H), 4,079 (s, 2H), 5,292 (s, 2H), 5,379 (s, 2H), 6,766 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,855 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,13-7,24 (m 5H).

d) 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-3-bencil-1,4-dimetil-2(1H)quinolinona

43

El producto del ejemplo anterior (0,15 g) se trató con NaN_{3} (57 mg) y NH_{4}Cl (47 mg) en DMF (2 ml) como se describe en el ejemplo 1c. Rendimiento 0,115 g. Punto de fusión: 250-253ºC.

^{1}H-RMN (400 MHz): 2,451 (s, 3H), 3,649 (s, 3H), 4,042 (s, 2H), 6,792 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 6,833 (d, 1H, J = Hz), 7,1-7,25 (m, 5H).

Ejemplo 10 Preparación de 3-Bencil-5,7-bis[(2-metil-1H-tetrazol-il)metoxi]-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona y los tres isómeros

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44

Se añadieron 0,07 ml de yoduro de metilo a una solución de 0,2 g del producto del ejemplo 1c y 0,31 g de K_{2}CO_{3} en 2 ml de DMF y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se vertió en agua enfriada con hielo y se filtró. Rendimiento 0,2 g en forma de una mezcla de cuatro regioisómeros, punto de fusión 71-76ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,47 (s, CH_{3}), 2,48 (s, CH_{3}), 3,93 (s, CH_{2}Ph), 4,11 (s, NCH_{3}), 4,12 (s, NCH_{3}), 4,15 (s, NCH_{3}), 4,38 (s, NCH_{3}), 4,40 (s, NCH_{3}), 5,51 (s, OCH_{2}), 5,52 (s, OCH_{2}), 5,62 (s, OCH_{2}), 5,67 (s, OCH_{2}), 6,84-6,91 (m, 2H), 7,16-7,28 (m, 5H, Ph).

Ejemplo 11 Preparación de 3-Bencil-5,7-bis[1-(1H-tetrazol-il)etoxi]4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona, mezcla de estereoisómeros a) 3-Bencil-5,7-bis-[(1-ciano)etoxi)-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

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45

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El producto del ejemplo 1a (1 g), 2-clorpropionitrilo (0,7 g) y carbonato potásico (2 g) se calentaron en DMF (15 ml) en atmósfera de nitrógeno a 110ºC durante sesenta minutos. La mezcla se trató con agua, se filtró y se lavó con NaOH 1 N y agua. Rendimiento 1,2 g.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 1,74-1,78 (t + t, 6H, CH-CH_{3}), 2,53 (s, 3H), 3,97 (s, 2H), 5,58-5,66 (m, 2H, CH-CH_{3}), 6,87 (m, 1H), 6,99 (d, 1H), 7,18-7,31 (m, 5H).

b) 3-Bencil-5,7-bis[1-(1H-tetrazol-5-il)etoxi]4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona, mezcla de estereoisómeros

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46

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El producto del ejemplo anterior (0,5 g), azida sódica (0,18 g) y cloruro amónico (0,15 g) se calentaron en DMF (7 ml) a 100ºC durante 90 minutos. El producto se trató con agua, se extrajo con acetato de etilo y se evaporó. Rendimiento 0,57 g. Punto de fusión 91-104ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 1,69-1,77 (m, 6H, CH-CH_{3}), 2,54 (s, 3H), 3,94 (s, 2H), 6,10-6,17 (m, 2H, CH-CH_{3}), 6,65 (dd, 1H), 6,74 (dd, 1H), 7,13-7,30 (m, 5H).

Ejemplo 12 Preparación de 5,7-Bis(carboximetoxi)-1,3-dibencil-4-metil-2(1H)-quinolinona

47

El producto del ejemplo 8f (0,2 g) se calentó a reflujo en a solución de ácido clorhídrico concentrado (3 ml) y ácido acético (2 ml) durante una hora. El producto se filtró a 25ºC. Rendimiento 0,14 g.

^{1}H-RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}): 2,63 (s, CH_{3}), 4,14 (s, 2H, CH_{2}Ph), 4,66 (s, 2H, OCH_{2}COOH), 4,79 (s, 2H, OCH_{2}COOH), 5,53 (s, 2H, NCH_{2}Ph), 6,41 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 6,45 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 7,13-7,34 (m, 10H, Ph).

Ejemplo 13 Preparación de 3-Bencil-5,7-bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-1-(4-fluorobencil)-4-metil-2(1H)-quinolinona a) 1-Bencil-5,7-dimetoxi-3-(4-fluorobencil)-4-metil-2(1H)quinolinona

48

El producto del ejemplo 8b (2 g), terc-butóxido potásico (0,87 g) y cloruro de 4-fluorobencilo (1,12 g) se calentaron en DMSO (20 ml) a 60ºC durante tres horas como en el ejemplo 8d. Rendimiento 1,28 g.

^{1}H-RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}): 2,53 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 3,83 (s, 3H), 5,55 (s, 2H), 6,43 (s, 2H), 7,12-7,2 (m, 5H), 7,26-7,28 (m, 4H).

b) 3-Bencil-5,7-dihidroxi-1-(4-fluorobencil)-4-metil-2(1H)quinolinona

49

El producto del ejemplo anterior (1,25 g) se calentó en clorhidrato de piridina (12,5 g) a aproximadamente 225ºC durante 9 minutos. Rendimiento 1 g.

^{1}H-RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}): 2,56 (s, 3H), 4,07 (s, 2H), 5,4 (a, 2H), 6,13 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 6,20 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 7,12-7,28 (m,9H), 9,88 (s,1H), 10,22 (s, 1H).

c) 3-Bencil-5,7-Bis(cianometoxi)-1-(4-fluorobencil)-4-metil-2(1H)-quinolinona

50

El producto del ejemplo anterior (1 g), ClCH_{2}CN (0,43 g) y K_{2}CO_{3} (1,42 g) se calentaron en DMF (8 ml) a 120ºC durante una hora. Rendimiento 0,94 g.

^{1}H-RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}): 2,55 (s, 3H), 4,14 (s, 2H), 5,25 (s, 2H), 5,28 (s, 2H), 5,57 (s, 2H), 6,74 (s, 2H, ArH), 7,1-7,3 (m, 9H).

d) 3-Bencil-5,7-bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-1-(4-fluorobencil)-4-metil-2(1H)-quinolinona

51

El producto del ejemplo anterior (0,5 g), azida sódica (0,14 g) y cloruro amónico (0,12 g) se calentaron en DMF (5 ml) a 120ºC durante 90 min. El producto se trituró con acetonitrilo. Rendimiento 0,28 g. Punto de fusión: 126-132ºC.

^{1}H-RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}): 2,48 (s, 3H), 4,11 (s, 2H), 5,51 (s, 2H), 5,55 (s, 2H), 5,58 (s, 2H), 6,67 (d, 1H, J =
2,1 Hz), 6,78 (d, 1H, J = 2,1 Hz).

Ejemplo 14 Preparación de 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-3-(4-clorobencil)-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona a) 3-(4-Clorobencil)-5,7-dihidroxi-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

52

Una solución de floroglucinol (1,57 g) y 2-(4-clorobencil)acetoacetato de etilo (3,18 g) en etanol (25 ml) se trató con HCl seco a 0ºC durante 1,5 horas y la solución se mantuvo a esta temperatura durante una noche. El disolvente se evaporó y el precipitado se trituró con agua. Rendimiento 3,87 g (98%). Punto de fusión 270-278ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,52 (s, 3H, CH_{3}), 3,87 (s, 2H, CH_{2}), 6,17 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,28 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,18-7,34 (m, 4H, Ph), 10,21 (s, 1H, OH), 10,48 (s, 1H, OH).

b) 5,7-Bis(cianometoxi)-3-(4-clorobencil)-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

53

El producto del ejemplo anterior (1,00 g), cloroacetonitrilo (0,50 g) y carbonato potásico (2,18 g) se calentaron en DMF (5 ml) a 100ºC durante 30 minutos. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1b. Rendimiento 0,90 g (72%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,52 (s, 3H, CH_{3}), 3,95 (s, 2H, CH_{2}), 5,308 (s, 2H, OCH_{2}CN), 5,312 (s, 2H, OCH_{2}CN), 6,81 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,94 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,22-7,33 (m, 4H, Ph).

c) 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-3-(4-clorobencil)-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

54

El producto del ejemplo anterior (0,40 g), azida sódica (0,14 g) y cloruro amónico (0,11 g) se calentaron en DMF (2 ml) a 100ºC durante 2 horas. El producto se aisló como en el ejemplo 1c. Rendimiento 0,40 g (82%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,46 (s, 3H, CH_{3}), 3,92 (s, 2H, CH_{2}), 5,602 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 5,609 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 6,83 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,85 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,20-7,33 (m, 4H, Ph).

Ejemplo 15 Preparación de 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-3-(4-nitrobencil)-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona a) 5,7-Dihidroxi-4-metil-3-(4-nitrobencil)-2H-1-benzopiran-2-ona

55

Una solución de floroglucinol (0,48 g) y 2-(4-nitrobencil)acetoacetato de etilo (1,00 g) en etanol (150 ml) se trató con HCl seco a 0ºC durante 7,5 horas y la solución se mantuvo a esta temperatura durante una noche. El disolvente se evaporó y el precipitado se trituró con agua. Rendimiento 0,63 g (51%). Punto de fusión 280-285ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,53 (s, 3H, CH_{3}), 4,03 (s, 2H, CH_{2}), 6,19 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,29 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,40-7,51 y 8,11-8,17 (m, 4H, Ph), 10,25 (s, 1H, OH), 10,52 (s, 1H, OH).

b) 5,7-Bis(cianometoxi)-3-(4-nitrobencil)-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

56

El producto del ejemplo anterior (0,57 g), cloroacetonitrilo (0,27 g) y carbonato potásico (1,20 g) se calentaron en DMF (2 ml) a 100ºC durante 50 minutos. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1b. Rendimiento 0,47 g (67%). Punto de fusión 178-185ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,53 (s, 3H, CH_{3}), 4,11 (s, 2H, CH_{2}), 5,319 (s, 2H, OCH_{2}CN), 5,323 (s, 2H, OCH_{2}CN), 6,83 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,96 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,48-7,53 y 8,12-8,16 (m, 4H, Ph).

c) 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-3-(4-nitrobencil)-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

57

El producto del ejemplo anterior (0,38 g), azida sódica (0,12 g) y cloruro amónico (0,11 g) se calentaron en DMF (3 ml) a 100ºC durante 2 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1c. Rendimiento 0,25 g (54%). Punto de fusión 240-244ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,47 (s, 3H, CH_{3}), 4,08 (s, 2H, CH_{2}), 5,611 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 5,623 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 6,85 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,87 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,46-7,50 y 8,12-8,16 (m, 4H, Ph).

Ejemplo 16 Preparación de 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-3-ciclopentil-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona a) 3-Ciclopentil-5,7-dihidroxi-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

58

Una solución de floroglucinol (2,00 g) y 2-ciclopentilacetoacetato de etilo (3,14 g) en etanol (40 ml) se trató con HCl seco a 0ºC durante 2,5 horas y la solución se mantuvo a esta temperatura durante una noche. El disolvente se evaporó y el precipitado se purificó con cromatografía ultrarrápida eluyendo con tolueno-EtOAc-AcOH (8:1:1). Rendimiento 1,22 g (29%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 1,50-1,88 (m, 8H, -(CH_{2})_{4}-), 2,57 (s, 3H, CH_{3}), 3,25 (m, 1H, CH), 6,11 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,25 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 10,25 (a, 2H, OH).

b) 5,7-Bis(cianometoxi)-3-ciclopentil-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

59

El producto del ejemplo anterior (0,50 g), cloroacetonitrilo (0,31 g) y carbonato potásico (0,61 g) se calentaron en DMF (2 ml) a 80ºC durante 40 minutos. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1b. Rendimiento 0,56 g (86%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 1,55-1,90 (m, 8H, -(CH_{2})_{4}-), 2,56 (s, 3H, CH_{3}), 3,37 (m, 1H, CH), 5,29 (s, 2H, OCH_{2}CN), 5,31 (s, 2H, OCH_{2}CN), 6,75 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,88 (d, 1H, J = 2,5 Hz).

c) 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il) metoxi]-3-ciclopentil-4-metil-2H-1-benzopiran-2-ona

60

El producto del ejemplo anterior (0,30 g), azida sódica (0,13 g) y cloruro amónico (0,11 g) se calentaron en DMF (1 ml) a 100ºC durante 1,5 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 10. Rendimiento 0,30 g (80%). Punto de fusión 248-252ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 1,53-1,89 (m, 8H, -(CH_{2})4-), 2,51 (s, 3H, CH_{3}), 3,34 (m, 1H, CH), 5,59 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 5,61 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 6,80 (s, 2H).

Ejemplo 17 Preparación de 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-metil-3-(1-naftilmetil)-2H-1-benzopiran-2-ona a) 5,7-dihidroxi-4-metil-3-(1-naftilmetil)-2H-1-benzopiran-2-ona

61

\vskip1.000000\baselineskip

Una solución de floroglucinol (0,47 g) y 2-(1-naftilmetil)acetoacetato de etilo (1,00 g) en etanol (20 ml) se trató con HCl seco a 0ºC durante 3 horas y la solución se mantuvo a esta temperatura durante una noche. El disolvente se evaporó y el precipitado se trituró con agua y se recristalizó en isopropanol-agua (1:1). Rendimiento 0,96 g (78%). Punto de fusión 275-280ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,45 (s, 3H, CH_{3}), 4,32 (s, 2H, CH_{2}), 6,23 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,32 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,97-8,25 (m, 7H, Naph), 10,26 (s, 1H, OH), 10,53 (s, 1H, OH).

b) 5,7-Bis(cianometoxi)-4-metil-3-(1-naftilmetil)-2H-1-benzopiran-2-ona

62

El producto del ejemplo anterior (0,80 g), cloroacetonitrilo (0,36 g) y carbonato potásico (0,66 g) se calentaron en DMF (4 ml) a 100ºC durante 1 hora. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1b. Rendimiento 0,30 g (30%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,45 (s, 3H, CH_{3}), 4,40 (s, 2H, CH_{2}), 5,34 (s, 2H, OCH_{2}CN), 5,36 (s, 2H, OCH_{2}CN), 6,86 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,010 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 7,016-8,27 (m, 7H, Naph).

c) 5,7-Bis[(1H-tetrazol-5-il)metoxi]-4-metil-3-(1-naftilmetil)-2H-1-benzopiran-2-ona

63

El producto del ejemplo anterior (0,25 g), azida sódica (0,080 g) y cloruro amónico (0,072 g) se calentaron en DMF (2 ml) a 100ºC durante 2,5 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 10. Rendimiento 0,11 g (36%). Punto de fusión 164-174ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,40 (s, 3H, CH_{3}), 4,37 (s, 2H, CH_{2}), 5,63 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 5,65 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 6,87 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,92 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 6,98-8,26 (m, 7H, Naph).

Ejemplo 18 Preparación de 1-Bencil-5,7-bis-[(1H-tetrazol-5-il)-metoxi]-4-metil-2(1H)-quinolinona a) 5,7-Dimetoxi-4-metil-2(1H)-quinolinona

64

Se calentó acetoacetato de terc-butilo (1,58 g) a 120ºC y se añadió 3,5-dimetoxianilina (1,53 g) disuelta en xileno (4 ml). La mezcla se calentó a 120-130ºC durante 20 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió ácido metanosulfónico (2 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadió agua (40 ml) y el precipitado se filtró y se secó. Rendimiento 1,31 g (60%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,50 (s, 3H, CH_{3}), 3,79 (s, 3H, OCH_{3}), 3,83 (s, 3H, OCH_{3}), 6,03 (s, 1H, CH=C), 6,31 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,45 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 11,4 (a, 1H, NH).

b) 1-Bencil-5,7-dimetoxi-4-metil-2(1H)-quinolinona

65

El producto del ejemplo anterior (1,20 g) se suspendió en DMSO (15 ml) y se añadieron t-BuOK (0,68 g) y bromuro de bencilo (1,03 g). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Se añadió agua y el producto se extrajo con EtOAc. El EtOAc se secó y se evaporó hasta sequedad. El producto se recristalizó en tolueno. Rendimiento 0,80 g (47%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,55 (d, 3H, J = 1,1 Hz, CH_{3}), 3,71 (s, 3H, OCH_{3}), 3,84 (s, 3H, OCH_{3}), 5,48 (a, 2H, NCH_{2}), 6,29 (d, 1H, J = 1,1 Hz, CH=C), 6,4 (s, 2H), 7,18-7,33 (m, 5H, Ph).

c) 1-Bencil-5,7-dihidroxi-4-metil-2(1H)-quinolinona

66

El producto del ejemplo anterior (0,69 g) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (14 ml) y la mezcla de reacción se enfrió a -20ºC. Se añadió BBr_{3} (2,4 g) en CH_{2}Cl_{2} (solución 1 M) y la mezcla se permitió calentar hasta temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se filtró, se lavó con CH_{2}Cl_{2} y se disolvió en EtOAc. El EtOAc se lavó con HCl diluido, se secó y se evaporó hasta sequedad. Rendimiento 0,34 g (54%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,56 (d, 3H, J = Hz, CH_{3}), 5,33 (a, 2H, NCH_{2}), 6,11 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 6,13 (d, 1H, J = 1,0 Hz, CH=C), 6,17 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 7,12-7,34 (m, 5H, Ph), 9,90 (a, 1H, OH), 10,22 (s, 1H, OH).

d) 1-Bencil-5,7-bis(cianometoxi)-4-metil-2(1H)-quinolinona

67

El producto del ejemplo anterior (0,34 g), cloroacetonitrilo (0,13 g) y carbonato potásico (0,34 g) se calentaron en DMF (2 ml) a 100ºC durante 1,5 horas. Se añadió agua y el precipitado se filtró y se secó. El producto se recristalizó en isopropanol. Rendimiento 0,20 g (46%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,57 (s, 3H, CH_{3}), 5,22 (s, 2H, OCH_{2}CN), 5,30 (s, 2H, OCH_{2}CN), 5,50 (a, 2H, NCH_{2}), 6,42 (s, 1H, CH=C), 6,70 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 6,73 (d, 1H, J = 2,1 Hz),7,21-7,32 (m, 5H, Ph).

e) 1-Bencil-5,7-bis-[(1H-tetrazol-5-il) metoxi]-4-metil-2(1H)quinolinona

68

El producto del ejemplo anterior (0,20 g), azida sódica (0,072 g) y cloruro amónico (0,060 g) se calentaron en DMF (2 ml) a 100ºC durante 3 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1c. Rendimiento 0,21 g (85%). Punto de fusión 246-249ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,50 (s, 3H, CH_{3}), 5,48 (a, 4H, OCH_{2}Tet, NCH_{2}), 5,60 (s, 2H, OCH_{2}Tet), 6,34 (s, 1H, CH=C), 6,64 (d, 1H, J =1,9 Hz), 6,77 (d, 1H, J =1,9 Hz), 7,18-7,32 (m, 5H, Ph).

Ejemplo 19 Preparación de 1-Bencil-5,7-bis[1H-tetrazol-5-il)metoxi]-3-(2-fluorobencil)-4-metil-2(1H)-quinolinona a) 5,7-Dimetoxi-3-(2-fluorobencil)-4-metil-2(1H)-quinolinona

69

Se calentó 2-(2-fluorobencil)acetoacetato de etilo (2,5 g) en xileno (1 ml) a 150ºC y se añadió 3,5-dimetoxianilina (1,46 g) en xileno (4 ml) en pequeñas porciones durante 30 minutos. La mezcla de reacción se calentó a 160ºC durante 3 horas y después se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió ácido metanosulfónico (1,7 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió agua y el precipitado se filtró y se secó. El producto se trituró con etanol templado. Rendimiento 0,64 g (21%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,45 (s, 3H), 3,79 (s, 3H), 3,82 (s, 3H), 3,97 (s, 2H), 6,33 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,48 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,90-7,25 (m, 4H), 11,61 (s, 1H).

b) 1-Bencil-5,7-dimetoxi-3-(2-fluorobencil)-4-metil-2(1H)quinolinona

70

El producto del ejemplo anterior (0,62 g) se trató con t-BuOK (0,23 g) y bromuro de bencilo (0,36 g) en DMSO (12 ml) a 60ºC durante 2,5 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 18b. Rendimiento 0,39 g (49%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,51 (s, 3H), 3,72 (s, 3H), 3,84 (s, 3H), 4,11 (s, 2H), 5,55 (a, 2H), 6,433 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 6,443 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 6,97-7,33 (m, 9H).

c) 1-Bencil-5,7-dihidroxi-3-(2-fluorobencil)-4-metil-2(1H)quinolinona

71

El producto del ejemplo anterior (0,34 g) se trató con BBr_{3} (8,48 g) en CH_{2}Cl_{2} (7 ml) como en el ejemplo 18c. Rendimiento 0,30 g (82%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,55 (s, 3H), 4,06 (s, 2H), 5,40 (a, 2H), 6,13 (d, 1H,J = 2,1 Hz), 6,22 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 6,97-7,33 (m, 9H), 10,3 (a, 2H).

d) 1-Bencil-5,7-bis(cianometoxi)-3-(2-fluorobencil)-4-metil-2(1H)quinolinona

72

El producto del ejemplo anterior (0,21 g), cloroacetonitrilo (0,086 g) y carbonato potásico (0,37 g) se calentaron en DMF (2 ml) a 100ºC durante 2 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1b. Rendimiento 0,18 g (71%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,53 (s, 3H), 4,13 (s, 2H), 5,23 (s, 2H), 5,29 (s, 2H), 5,57 (a, 2H), 6,746 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,756 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,00-7,32 (m, 9H).

e) 1-Bencil-5,7-bis[1H-tetrazol-5-il)metoxi]-3-(2-fluorobencil)-4-metil-2(1H)-quinolinona

73

El producto del ejemplo anterior (0,17 g), azida sódica (0,051 g) y cloruro amónico (0,042 g) se calentaron en DMF a 100ºC durante 3 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1c. Rendimiento 0,17 g (85%). Punto de fusión 135-140ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,46 (s, 3H), 4,10 (s, 2H), 5,48 (s, 2H), 5,51 (a, 2H), 5,59 (s, 2H), 6,68 (d, 1H, J =
2,2 Hz), 6,79 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 6,99-7,32 (m, 9H).

Ejemplo 20 Preparación de 1-Bencil-5,7-bis[1H-tetrazol-5-il)metoxi]-4-metil-3-(2-feniletil)-2(1H)-quinolinona a) 5,7-Dimetoxi-4-metil-3-(2-feniletil)-2(1H)-quinolinona

74

Se trató 2-(2-feniletil)acetoacetato de etilo (2,70 g) en xileno (5 ml) con 3,5-dimetoxianilina (1,60 g) a 150ºC como se describe en el ejemplo 19a. Se añadió ácido metanosulfónico (4,0 ml) a temperatura ambiente y la mezcla se calentó a 80ºC durante 1 hora. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 19a. Rendimiento 1,38 g (41%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,45 (s, 3H), 2,64-2,68 (m, 2H), 2,82-2,86 (m, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,81 (s, 3H), 6,30 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,45 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,18-7,30 (m, 5H), 11,45 (s, H).

b) 1-Bencil-5,7-dimetoxi-4-metil-3-(2-feniletil)-2(1H)quinolinona

75

El producto del ejemplo anterior (0,61 g), t-BuOK (0,24 g) y bromuro de bencilo (0,36 g) se calentaron en DMSO (12 ml) a 60ºC durante 2 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 18b. Rendimiento 0,31 g (40%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,51 (s, 3H), 2,73-2,77 (m, 2H), 2,96-3,00 (m, 2H), 3,70 (s, 3H),3,83 (s, 3H), 5,55 (a, 2H), 6,40 (s, 2H),7,17-7,33 (m, 10H).

c) 1-Bencil-5,7-dihidroxi-4-metil-3-(2-feniletil)-2(1H)quinolinona

76

El producto del ejemplo anterior (0,31 g) se trató con BBr3 (0,75 g) en CH_{2}CI2 (5 ml) como se describe en el ejemplo 18c. Rendimiento 0,26 g (89%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): 2,56 (s, 3H), 2,69-2,75 (m, 2H), 2,90-2,95 (m, 2H), 5,39 (a, 2H), 6,08 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 6,19 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,11-7,33 (m, 10H), 10,2 (a, 2H).

d) 1-Bencil-5,7-bis(cianometoxi)-4-metil-3-(2-feniletil)-2(1H)-quinolinona

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77

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El producto del ejemplo anterior (0,22 g), cloroacetonitrilo (0,091 g) y carbonato potásico (0,39 g) se calentaron a 100ºC durante 2 horas. El producto se aisló como en el ejemplo 1b. Rendimiento 0,20 g (76%).

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,50 (s, 3H), 2,73-2,77 (m, 2H), 2,98-3,02 (m, 2H), 5,21 (s, 2H), 5,29 (s, 2H), 5,56 (a, 2H), 6,70 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 6,72 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 7,18-7,33 (m, 10H).

e) 1-Bencil-5,7-bis[1H-tetrazol-5-il)metoxi]-4-metil-3-(2-feniletil)-2(1H)-quinolinona

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78

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El producto del ejemplo anterior (0,19 g), azida sódica (0,057 g) y cloruro amónico (0,047 g) se calentaron en DMF a 100ºC durante 3 horas. El producto se aisló como se describe en el ejemplo 1c. Rendimiento 0,18 g (78%). Punto de fusión 215-218ºC.

^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): 2,46 (s, 3H), 2,70-2,74 (m, 2H), 2,95-2,99 (m, 2H), 5,47 (s, 2H), 5,54 (a, 2H), 5,57 (s, 2H), 6,64 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 6,77 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,16-7,33 (m, 10H).

Ejemplo 21 Preparación de 5,7-Bis(aminocarbonilmetoxi)-1,3-dibencil-4-metil-2(1H)-quinolinona

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79

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La mezcla de 5,7-dihidroxi-1,3-dibencil-4-metil-2(1H)-quinolinona (0,5 g), carbonato potásico (0,9 g) y 2-cloroacetamida (0,25 g) en DMF (6,5 ml) se hicieron reaccionar a 100ºC durante dos horas. La mezcla de reacción se trató con agua enfriada con hielo y se filtró. El producto se trituró con etanol caliente. Rendimiento: 0,32 g. Punto de fusión 252-253ºC.

^{1}H-RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}): 2,63 (s, 3H, CH_{3}), 4,13 (s, 2H, PhCH_{2}), 4,37 (s, 2H, OCH_{2}), 4,55 (s, 2H, OCH_{2}), 5,54 (s, 2H, NCH_{2}Ph), 6,40 (d, 1H, J = 2 Hz, ArH), 6,53 (d, 1H, J = 2 Hz, ArH), 7,13-7,33 (m, 10H, Ph), 7,44 (d, 2H, J = 65 Hz, CONH_{2}), 7,47 (d, 2H, J = 68 Hz, CONH_{2}).

Ejemplo 22 Preparación de 5,7-Bis(etoxicarbonilmetoxi)-1,3-dibencil-4-metil-2(1H)-quinolinona

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La mezcla de 5,7-dihidroxi-1,3-dibencil-4-metil-2(1H)-quinolinona (1 g), 2-bromoacetato de etilo (0,63 ml) y carbonato potásico (1,49 g) en DMF (5 ml) se calentó en atmósfera de nitrógeno a 110ºC durante tres horas, se vertió en agua enfriada con hielo y se filtró. El material sólido resultante se trituró con éter y se filtró de nuevo. Rendimiento: 1,03 g, Punto de fusión 113-116ºC.

^{1}H-RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}): 1,15 (t, 3H, CH_{3}CH_{2}, J = 7,1 Hz), 1,20 (t, 3H, CH_{3}CH_{2}, J = 7,1 Hz), 2,63 (s, 3H, CH_{3}), 4,03 (c, 2H, CH_{2}CH_{3}, J = 7,1 Hz), 4,13 (s, 2H, CH_{2}Ph), 4,17 (c, 2H, CH_{2}CH_{3}, J = 7,1 Hz), 4,78 (s, 2H, OCH_{2}), 4,90 (s, 2H, OCH_{2}), 6,41 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 6,44 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 7,13-7,33 (m, 10H, Ph).

Ejemplo 23 Preparación de 5,7-Bis(hidroxiaminocarbonilmetoxi)-1,3-dibencil-4-metil-2(1H)-quinolinona

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El producto del ejemplo anterior (0,3 g), clorhidrato de hidroxilamina (0,32 g) y NaOH 5 N (1,05 ml) se hicieron reaccionar en etanol (8 ml) a 50ºC durante seis horas. La mezcla de reacción se trató con agua y se basificó (pH 10) y se filtró. El filtrado se acidificó a pH 2 y se filtró. Rendimiento: 0,2 g, Punto de fusión 121-127ºC.

^{1}H-RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}): las formas tautoméricas del ácido hidroxámico se observan en las señales de OCH_{2}: 2,63 (s,3H, CH_{3}), 4,13 (S, 2H, CH_{2}Ph), 4,41 (s, 2H, OCH_{2}), 4,54 (s, 2H,OCH_{2}), 4,64 (s, 2H, HON=C(OH)CH_{2}O), 4,65 (s, 2H, HON=C(OH)CH_{2}O), 4,77 (s, 2H, HON=C(OH)CH_{2}O), 4,78 ((s,2H, HON=C(OH)CH_{2}O), 5,54 (s, 2H, NCH_{2}Ph), 6,38-6,54 (m, 2H, ArH), 7,14-7,34 (m, 10H, Ph), 9,05 (a, 2H, NOH), 10,84 (s, 1H, HONHCO), 10,88 (s, 1H, HONHCO).

Claims (4)

1. Uso de un inhibidor de fosfolamban en la fabricación de un medicamento para uso en la dilatación directa de las arterias coronarias.

2. Uso de un inhibidor de fosfolamban en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de la enfermedad cardíaca coronaria.

3. Uso de un inhibidor de fosfolamban en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de crisis hemodinámica donde la baja presión sanguínea aórtica hace disminuir la presión de perfusión coronaria.

4. Un compuesto de fórmula

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y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.