ES2228052T3 - Separacion demonomeros de anticuerpos de sus multimeros utilizando cromatografia de intercambio de iones. - Google Patents

Abstract

Método para separar un monómero de anticuerpo de una mezcla que comprende monómeros de dicho anticuerpo y dímeros de dicho anticuerpo o n unidades monoméricas de dicho anticuerpo, en el que n es 3-10, o ambos, en el que el método comprende la etapa de aplicar la mezcla a una resina para cromatografía de intercambio catiónico o intercambio aniónico en un tampón, en el que si la resina es de intercambio catiónico, el pH del tampón es de aproximadamente 4-7, y en el que si la resina es de intercambio aniónico, el pH del tampón es de aproximadamente 6-9, y eluir la mezcla con un gradiente de aproximadamente 0-1 M de una sal de elución, en el que el monómero se separa de los dímeros o multímeros, o ambos, presentes en la mezcla en dicha etapa de cromatografía de intercambio de iones; en el que si se utiliza citrato como tampón, se emplea con una concentración inferior a 20 mM.

Description

Separación de monómeros de anticuerpos de sus multímeros utilizando cromatografía de intercambio de iones.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para separar monómeros de anticuerpo de dímeros y/u otros multímeros utilizando cromatografía de intercambio de iones.

Descripción de los antecedentes de la técnica y la técnica relacionada

Se han frustrado los intentos de purificar una proteína auténtica, apropiadamente plegada a partir de huéspedes recombinantes, debido a la estructura terciaria de la molécula. A este respecto, la purificación de la molécula producida de manera recombinante a menudo produce una mezcla heterogénea que consiste principalmente en dímeros, multímeros y agregados con enlaces disulfuro mal plegados, inactivos, insolubles y/o solubles. También pueden estar presentes otras moléculas aberrantes, tales como fragmentos, formas cortadas, oxidadas y glicosiladas. Por tanto, la purificación es difícil y los rendimientos del monómero auténtico son a menudo bajos. Véase, por ejemplo, Elliott et al., J. Protein Chem., 9:95-104 (1990).

Se han utilizado diferentes técnicas para corregir estos problemas. Por ejemplo, Chang y Swartz, Protein Folding: in vivo and in vitro (American Chemical Society, 1993), págs. 178-188 describen un método para solubilizar IGF-I (factor de crecimiento similar a la insulina de tipo I) agregado producido en E. coli, utilizando concentraciones bajas de urea y ditiotreitol (DTT) en un tampón alcalino. La patente US nº 5.231.178 describe un método para la purificación de IGF-I monomérico, correctamente plegado, de P. pastoris utilizando una combinación de cromatografía de intercambio catiónico, interacción hidrófoba y filtración en gel. El documento WO 96/40776 describe un método para producir IGF-I auténtico, apropiadamente plegado, a partir de levaduras utilizando una primera cromatografía de intercambio catiónico con un medio celular de levaduras, desnaturalización y cromatografía, y realizando una cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa.

La separación de monómeros proteicos y peptídicos de sus dímeros, tetrámeros y multímeros presenta un gran reto para los científicos que realizan separaciones. La cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) y la filtración de flujo tangencial (TFF) (patentes US nº 5.256.294 y nº 5.490.937) se han utilizado para separar monómeros de agregados pero tienen limitaciones. SEC puede separar monómeros de multímeros y en algunos casos monómeros de dímeros. Las principales limitaciones de SEC son 1) volúmenes de carga limitados (normalmente el 5% del volumen del lecho) lo que requiere columnas grandes o múltiples ciclos, 2) y concentración proteica de la carga (las materias primas de concentración baja requieren preconcentración o múltiples ciclos en la columna. Concentraciones proteicas superiores pueden ser más viscosas, reduciendo así la eficacia de la separación). Históricamente, TFF puede separar multímeros proteicos que sean diez veces más grandes que el monómero, patente US nº 5.256.294.

Las patentes US nº 4.228.154 y nº 5.250.663 describen separaciones de albúmina de mezclas. La patente US nº 4.229.154 describe el uso de etapas de cromatografía de intercambio catiónico y de intercambio aniónico para la purificación, sin separación del monómero de los multímeros.

La solicitud de patente japonesa H7-285885 describe un procedimiento para separar monómero de inmunoglobulina de una mezcla que contiene monómero y polímeros, en la que la mezcla de inmunoglobulinas se aplica a una resina de intercambio catiónico. Este procedimiento supone una filtración, pero no una elución de ningún material.

Jiskoot W., et al. J. Immunol. Methods, 124(1): 143-56 (1989) describen la purificación de un anticuerpo monoclonal del isotipo IgG1 de un sobrenadante de cultivo celular mediante un procedimiento cromatográfico de dos etapas, que supone una cromatografía de afinidad con proteína A y cromatografía de intercambio aniónico en Q-Sepharose. No se describe la separación de un monómero de sus dímeros o multímeros.

Lynch, P. y Londo, T. Genetic Engineering News, 1 de noviembre de 1997:17 describe que la cromatografía de intercambio catiónico es eficaz en la separación de agregados de las formas monoméricas de anticuerpos monoclonales. No se describe la separación de un monómero de sus dímeros o multímeros.

Karlson E. et al. en "Protein Purification, Principles, High-Resolution Methods, and applications", Janson J.-C. y Ryden, L. Eds., John Wiley & Sons, Inc., segunda edición, revisan el campo de la cromatografía de intercambio de iones. En la página 158, se describe que los dímeros de una neurotoxina de la cobra muestran un comportamiento cromatográfico diferente al de la forma monomérica, cuando se someten a cromatografía en Bio-Rex 70 (resina catiónica) a pH 6,5 ó en CM-52 (carboximetilcelulosa) a pH 5,2.

Existe la necesidad de una separación de monómeros de sus dímeros y multímeros que sea satisfactoria, requiera el uso de sólo una etapa de intercambio de iones y no tenga las limitaciones de SEC o TFF.

Sumario de la invención

En consecuencia, la presente invención proporciona un método para separar un monómero de anticuerpo de una mezcla que comprende dímeros y/o multímeros, en el que el método comprende aplicar la mezcla a una resina para cromatografía de intercambio catiónico o de intercambio aniónico en un tampón, en el que si la resina es de intercambio catiónico, el pH del tampón es de aproximadamente 4-7, y en el que si la resina es de intercambio aniónico, el pH del tampón es de aproximadamente 6-9, y eluir la mezcla con un gradiente de aproximadamente 0-1 M de una sal de elución, en el que el monómero se separa de los dímeros y/o multímeros presentes en la mezcla; en el que si se utiliza citrato como tampón, se emplea con una concentración inferior a 20 mM, según se define en las reivindicaciones.

En este estudio, se demuestra que la cromatografía de intercambio de iones (ya sea aniónico o catiónico) es un medio eficaz para separar monómeros proteicos o polipeptídicos de sus dímeros y/o multímeros. Las separaciones se realizan utilizando cualquier elución con gradiente lineal o escalonado. El intercambio de iones tiene varias ventajas sobre los métodos de SEC y TFF descritos anteriormente. En primer lugar, la separación es independiente de la concentración de polipéptido en la carga y, por tanto, no se requiere preconcentración. En segundo lugar, pueden cargarse las resinas hasta más de 30 mg de polipéptido/ml de resina y conseguir todavía una separación excelente. En tercer lugar, las resinas de intercambio de iones son baratas y fáciles de usar. Las separaciones habituales consiguen un enriquecimiento del monómero superior al 99,5% de pureza y rendimientos por encima del 90%.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B muestran la separación del monómero U266 de IgE, de dímeros y multímeros, en una columna de intercambio aniónico RESOURCE Q^{TM}. La columna se equilibró con Tris 25 mM/pH 8 y se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio desde 0 hasta 0,5 M en 10 volúmenes de columna. La figura 1A es a escala real; la figura 1B es una vista en primer plano que muestra los dímeros y multímeros.

Las figuras 2A1, 2A2, 2B y 2C muestran la separación del monómero de anticuerpo monoclonal anti-IgE de sus dímeros y multímeros. Las figuras 2A1 y 2A2 se llevaron a cabo en una columna de intercambio aniónico RESOURCE Q^{TM}. La figura 2A1 es a escala real; la figura 2A2 es una vista en primer plano que muestra los dímeros y multímeros. La figura 2B es una prueba con una resina Q- SEPHAROSE FAST-FLOW^{TM}. La figura 2C es una representación de monómero y dímero/multímero observados en las fracciones, en la que los puntos abiertos son monómero y los puntos rellenos son dímero. Se determinaron el monómero y dímero/multímero utilizando una columna analítica de exclusión por tamaños SUPERDEX 200 HR^{TM} 10/30 (Pharmacia Biotech). En todos los casos, las columnas se equilibraron con Tris 25 mM/pH 8. El gradiente utilizado en los paneles de la figura 2A fue cloruro de sodio de 0 a 0,5 M en 40 volúmenes de columna. El gradiente utilizado para la figura 2B (Q-SEPHAROSE FAST-FLOW^{TM}) fue NaCl de 0,05 a 0,2 M en 10 volúmenes de columna.

Las figuras 3A-C muestran la separación de monómero y dímero de BSA (albúmina sérica bovina) en una columna de intercambio aniónico RESOURCE Q^{TM} a pH 8. La columna se equilibró con Tris 25 mM/pH 8 y se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio desde 0,125 hasta 0,275 M en 40 volúmenes de columna. La figura 3A es monómero purificado. La figura 3B es dímero purificado y la figura 3C es una preparación comercial de BSA (Bayer) que contiene monómero y dímero.

Las figuras 4A-C muestran la separación de monómero y dímero de BSA en una columna de intercambio aniónico RESOURCE Q^{TM} a pH 6. La columna se equilibró con fosfato de sodio 20 mM/pH 6 y se eluyó con un gradiente lineal de cloruro de sodio desde 0 hasta 0,5 M en 10 volúmenes de columna. La figura 4A es monómero purificado, la figura 4B es dímero purificado y la figura 4C es una preparación comercial de BSA (Bayer) que contiene monómero y dímero.

Las figuras 5A y 5B muestran la separación de monómero de anticuerpo monoclonal anti-IgE de sus dímeros y multímeros en una columna de intercambio catiónico RESOURCE S^{TM} a pH 6. La columna se equilibró con fosfato de sodio 20 mM/pH 6 y se eluyó con un gradiente lineal de cloruro de sodio desde 0 hasta 0,05 M en 30 volúmenes de columna. La figura 5A es el cromatograma de la separación y la figura 5B es una representación del monómero y dímero/multímero observados en las fracciones, utilizando el mismo método descrito en la figura 2, en la que los puntos abiertos son monómero y los puntos rellenos son dímero.

Las figuras 6A y 6B muestran la separación de monómero y dímero de BSA en una columna de intercambio catiónico RESOURCE S^{TM} a pH 4,3. La columna se equilibró con acetato de sodio 20 mM/pH 4,3 y se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio desde 0 hasta 1 M en 20 volúmenes de columna. La figura 6A es monómero purificado y la figura 6B es dímero purificado.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones

Tal como se utiliza en la presente memoria, "polipéptido" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos. Preferiblemente, los polipéptidos son "exógenos", lo que significa que son "heterólogos", es decir, foráneos a la célula huésped que se está utilizando, tal como una proteína humana producida por E. coli. Sin embargo, también pueden derivarse de una fuente nativa en la que están presentes de forma natural.

Ejemplos de polipéptidos de los mamíferos incluyen moléculas tales como, por ejemplo, renina, una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana; hormona de crecimiento bovina, factor liberador de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimuladora de la tiroides; lipoproteínas; I-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; trombopoyetina; hormona estimuladora del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como el factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrands, factores anticoagulantes tales como la proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA) o de orina humana o urocinasa; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; una albúmina sérica tal como albúmina sérica humana; sustancia inhibidora de Muller; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; pro-relaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; ADNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides, un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); neurotrofina-3, 4, 5 ó 6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF; cardiotrofinas (factor de hipertrofia cardiaca) tal como cardiotrofina-I (CT-I); factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos ácido y básico); factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor transformador de crecimiento (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 ó TGF-5, factor de crecimiento similar a la insulina tipo I o II (IGF-I e IGF-II), des(1.3)IGF-I (IGF-I cerebral); proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón-alfa, beta y gamma; albúmina sérica, tal como albúmina sérica humana (HSA) o albúmina sérica bovina (BSA); factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF (factor estimulante de colonias de macrófagos), GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos) y G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos); interleucinas (IL), por ejemplo, de IL-1 a IL-10; anticuerpo anti-HER-2; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana de superficie; factor acelerador de la degradación; antígeno viral tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura del virus del SIDA; proteínas de transporte; receptores de alojamiento ("homing receptors"); adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente. Ejemplos de polipéptidos de los mamíferos incluyen enzimas, hormonas, citocinas, albúminas, quimiocinas, inmunotoxinas, componentes virales, anticuerpos, neurotrofinas y antígenos.

Los polipéptidos de la invención son anticuerpos y fragmentos de los mismos. Los anticuerpos de interés preferidos son los anticuerpos de los mamíferos. Anticuerpos de este tipo adecuados engloban anticuerpos tales como anti-IgE, anti-CD20, anti-IgG, anti-CD11a, anti-CD18, anti-VEGF y anti-HER-2. Los anticuerpos de los mamíferos particularmente preferidos incluyen, por ejemplo, anti-HER-2, anti-CD11a, anti-CD18, anti-VEGF, anti-CD20, anti-IgE y anti-IgG. El anticuerpo es más preferiblemente anti-IgE, anti-IgG, anti-2, anti-CD11a, anti-CD18, anti-CD20 o anti-VEGF.

Para los fines de la presente memoria, la "mezcla" contiene monómeros y, o bien dímeros o bien multímeros, o tanto dímeros como multímeros. Normalmente, la mezcla es un fluido biológico, lo que indica cualquier fluido derivado de o que contiene células, componentes celulares o productos celulares. Los fluidos biológicos incluyen, pero no se limitan a, caldo de fermentación, sobrenadantes de cultivo celular, lisados celulares, lisados celulares aclarados, extractos celulares, extractos titulares, sangre, plasma, suero, esputo, semen, mucosidad, leche y fracciones de los mismos. Esta definición incluye medio de cultivo celular acondicionado, lo que indica un medio de nutrientes en el que se han cultivado células y que contiene productos celulares.

Para los fines de la presente memoria, "resina para cromatografía de intercambio de iones" se refiere a un medio cromatográfico para la separación mediante intercambio aniónico o catiónico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "sal de elución" se refiere a una sal de metal alcalino, alcalinotérreo o de amonio, es decir, una sal que tiene un catión de los elementos alcalinos o alcalinotérreos o un catión de amonio y que tiene un anión inorgánico u orgánico (a base de un hidrocarburo). Ejemplos de tales sales incluyen cloruro de sodio, cloruro de amonio, citrato de sodio, citrato de potasio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, fosfato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de amonio, fosfato de magnesio, fosfato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de amonio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, sulfato de calcio, etc. Sales preferidas en la presente memoria son los cloruros o sulfatos. La sal más preferida en la presente memoria es el cloruro de sodio.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "multímeros" se refiere a n unidades monoméricas en los que n es 3-10, es decir, polímeros que no son dímeros pero que excluyen los agregados. Al contrario que los multímeros, los agregados tiene un valor de n superior a 10, y/o un peso molecular superior a 2 millones de daltons, y/o son especies contenidas en el volumen excluido de las columnas analíticas de cromatografía de exclusión por tamaños tales como SUPEROSE 6^{TM} (Pharmacia).

Modos de poner en práctica la invención

La presente invención se refiere a un método de separación de monómeros de anticuerpos de sus dímeros o multímeros o ambos. El método supone colocar la mezcla de monómeros y dímeros y/o multímeros procedente de cualquier fuente, en un tampón de equilibración a un pH en el intervalo de aproximadamente entre 4 y 9, dependiendo de si la resina utilizada para la separación cromatográfica es de intercambio catiónico o aniónico. La mezcla resultante se carga en una resina para cromatografía de intercambio catiónico o de intercambio aniónico, para capturar todos las n unidades monoméricas (monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, etc.) presentes en la mezcla. Para la cromatografía en columna de intercambio de iones, pueden utilizarse ligandos de afinidad general para conseguir las selectividades y propiedades de unión deseadas. La carga tiene lugar en un tampón a un pH de aproximadamente 6-9 si la resina es de intercambio aniónico y de aproximadamente 4-7 si la resina es de intercambio catiónico. El pH exacto dependerá, por ejemplo, del punto isoeléctrico del anticuerpo.

Si la resina es una resina de intercambio catiónico, antes de cargar la mezcla, la matriz puede equilibrarse utilizando varios volúmenes de columna de un ácido débil, diluido (por ejemplo, cuatro volúmenes de columna de ácido acético 20 mM, pH 3, o de ácido fosfórico 20 mM, pH de aproximadamente 2,8). Tras la equilibración, se añade la mezcla y la columna puede lavarse de una a varias veces, antes de la elución de la muestra, también utilizando una disolución de ácido débil tal como disolución de ácido acético o ácido fosfórico débil. El tampón utilizado para este fin depende, por ejemplo, del anticuerpo, de la naturaleza catiónica o aniónica de la resina. Para el intercambio aniónico, el tampón es preferiblemente tampón Tris o fosfato, para el intercambio catiónico, el tampón es preferiblemente tampón acetato o fosfato.

La cromatografía de intercambio de iones se lleva a cabo normalmente a una temperatura de aproximadamente 18-25ºC, preferiblemente de aproximadamente 20ºC (temperatura ambiente). La carga de la columna preferida es de aproximadamente 1 ml de resina por 20-30 mg de polipéptido total.

Tras la adsorción de las moléculas de n unidades monoméricas al intercambiador iónico, la mezcla se eluye poniendo en contacto la resina con una sal de elución que tiene una fuerza iónica apropiada para desplazar el monómero de la matriz. Se utiliza un gradiente de la sal de elución de aproximadamente 0 a 1 M. El gradiente puede ser lineal o escalonado. Preferiblemente, el gradiente es desde aproximadamente 0 hasta 500 mM de la sal de elución, más preferiblemente de 50 a 200 mM de la sal de elución y, más preferiblemente, de 0 a 50 mM de la sal de elución. Preferiblemente, la sal de elución es una sal sódica, tal como cloruro de sodio, aunque también encuentran uso en la presente memoria otras sales de elución y gradientes de concentración, conocidos por los expertos en la materia. La cantidad de tampón de elución puede variar ampliamente y generalmente estará en el intervalo de aproximadamente 2 a 40 volúmenes de columna, preferiblemente de 10 a 40 volúmenes de columna. Tras la elución, el eluato puede ensayarse para determinar la concentración monomérica total.

Resinas de intercambio catiónico adecuadas incluyen en la presente memoria una amplia variedad de materiales conocidos en la materia, incluyendo aquellos que pueden unir polipéptidos en un amplio intervalo de pH. Por ejemplo, se prefieren particularmente matrices de intercambio catiónico poliméricas de poliestireno/divinilbenceno o a base de agarosa, sulfonadas, carboximetiladas. Otros materiales de matriz útiles incluyen, pero no se limitan a, matrices de celulosa, tales como matrices fibrosas, microgranulares y con perlas; matrices de dextrano, poliacrilato, polivinilo, poliestireno, sílice y poliéter; y materiales compuestos. Estas matrices incluyen, por ejemplo, CM52 CELLULOSE^{TM} (Whatman, Inc.); S-HYPERD^{TM} y CM SPHERODEX^{TM} (Secpracor); SP SEPHAROSE FF^{TM}, DEAE SEPHAROSE FF^{TM}, CM-SEPHAROSE^{TM} y RESOURCE S^{TM} (Amersham Pharmacia Biotech AB); y JT BAKER CSx^{TM} (J.T. Baker, Inc.), así como aquellas que contienen el ligando funcional R-SO_{3}^{-}, preferiblemente resinas de sulfopropilo, tales como TOYOPEARL SP550C^{TM} (Tosohaas) y FRACTOGEL EMD^{TM} SO_{3}^{-} -650 (m) (Merck). Otros materiales adecuados para su uso en la cromatografía de intercambio catiónico son del conocimiento de los expertos en la materia.

La cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo utilizando medios apropiados para la misma, como se conocen en la materia. Los medios adecuados incluyen, por ejemplo, resinas poliméricas de poliestireno/divinilbenceno y resinas a base de agarosa, así como perlas de agarosa, perlas de dextrano, perlas de poliestireno, medios que comprenden un soporte de material particulado insoluble derivatizado con grupos amino terciarios o cuaternarios, y soportes derivatizados con grupos trimetilanoetilo. Ejemplos de medios adecuados de este tipo incluyen DE92^{TM} (dietilaminoetil-celulosa, Whatman); DEAE-CELLULOSE^{TM} (Sigma), BAKERBOND ABX 40 mu^{TM} (J.T. Baker, Inc.), resinas de DEAE (dietilaminoetilo) tales como FRACTOGEL EMD DEAE-650^{TM} (EM Separations), FRACTOGEL EMD TMAE-650 (S)^{TM} (EM Science, Cibbstown, NJ), TSK gel DEAE-SPW^{TM} (Tosohaas), DEAE-SEPHAROSE CL-6B^{TM} y chelating SEPHAROSE^{TM} (Amersham Pharmacia Biotech AB), DEAE MERE SEP. 1000^{TM} (Millipore) y DEAE SPHERODEX^{TM} (Sepracor); RESOURCE Q^{TM} y Q SEPHAROSE^{TM} (QSFF) (Amersham Pharmacia Biotech AB); MACRO-PEP Q^{TM} (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); Q-HYPERD^{TM} (BioSepra. Inc., Marlborough, Mass); y similares. Otros materiales adecuados para la cromatografía de intercambio aniónico, así como la selección y uso de estos materiales para la presente solicitud, son los convencionales en la materia.

Las fracciones purificadas de monómero obtenidas a partir de la cromatografía de intercambio de iones pueden tratarse adicionalmente sometiéndolas a cualquier técnica apropiada, diseñada para el tratamiento y la purificación aguas abajo. Esto dependerá en gran medida del tipo de anticuerpo y de su uso pretendido. Es necesaria sólo una etapa de intercambio de iones para efectuar la separación deseada del monómero de sus dímeros y/o multímeros en una mezcla, aunque la invención no excluye utilizar más etapas de este tipo, si se desea, en el tratamiento aguas arriba o aguas abajo del anticuerpo.

La invención se comprenderá con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no debe considerarse que limitan el alcance de la invención.

Ejemplo I

Este ejemplo muestra la separación de monómeros de anti-IgE y, para comparar, monómeros de albúmina sérica bovina, de dímeros y multímeros.

Materiales y métodos Resinas

Q-SEPHAROSE FAST FLOW^{TM} de Pharmacia, volúmenes del lecho de 4 ml a 235 l evaluados

RESOURCE S y RESOURCE Q^{TM} de Pharmacia; columnas preempaquetadas de 1 ml;

CSx^{TM} de JT Baker, 0,46 X 5 cm, partículas de 50 \mum

Proteínas

A. Anticuerpos monoclonales anti-IgE humanizados (IgG_{1}) disponibles de Genentech, Inc: pI-7,5, designados como E25 y E26. El documento WO 93/04173, publicado el 4 de marzo de 1993, describe anticuerpos anti-IgE humanizados, en los que se utilizó un anticuerpo murino dirigido contra una IgE humana (MaE11) para proporcionar las regiones CDR que se sustituyeron en una estructura de inmunoglobulina IgG1 (rhuMaE25). Véase también Calcia et al., Biochemistry, 35; 1897-1903 (1996) para estudios y descripciones adicionales de E-25.

B. Anticuerpo anti-IgE monoclonal preparado a partir de los sobrenadantes de cultivo de una línea celular de mieloma humano inmortalizada U266B1 (ATCC TIB 196) que utiliza purificación mediante cromatografía de afinidad del anticuerpo anti-IgE aislado (Genentech MAE1). Específicamente, se inmunizaron cinco ratones hembra BALB/c, de seis semanas de edad, en sus almohadillas de las patas con 10 \mug de IgE purificada, en adyuvante de Ribi. Se administraron inyecciones posteriores de la misma manera una y tres semanas tras las inmunizaciones iniciales. Tres días después de la inyección final, se extirparon los ganglios linfáticos inguinales y poplíteos y se reunieron; y se preparó una única suspensión celular haciendo pasar el tejido a través de una malla de acero. Las células se fusionaron con una razón de 4:1 con mieloma de ratón P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) en glucosa alta (DMEM) que contenía un 50% en p/v de polietilenglicol 4000. Alternativamente, se realizaron las inmunizaciones de una manera similar, excepto en que se utilizaron 30 \mug de IgE por inyección y se ensayó el fragmento 315-347 (Kabat) de IgE como un refuerzo antes de la fusión; o se administraron las inyecciones por vía subcutánea en dos dosis de 100 \mug y una dosis de refuerzo final de 50 \mug y las células del bazo se utilizaron para las fusiones.

Las células fusionadas se sembraron entonces en placa con una densidad de 2x105 por pocillo, en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Tras 24 horas, se añadió medio selectivo HAT (hipoxantina/aminopterina/timidina, Sigma, nº H0262). De 1440 pocillos cultivados, 365 contenían células en crecimiento tras la selección con HAT.

Quince días después de la fusión, se probaron los sobrenadantes para determinar la presencia de anticuerpos específicos para IgE humana utilizando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA). El ELISA se llevó a cabo como sigue, con todas las incubaciones realizadas a temperatura ambiente. Las placas de prueba (Nunc Immunoplate) se recubrieron durante 2 horas con IgG de rata anti-ratón (Boehringer, Mannheim, nº 605-500) a 1 \mug/ml en tampón carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6, luego se bloquearon con albúmina sérica bovina al 0,5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos, después se lavaron cuatro veces con PBS que contenía un 0,05% de TWEEN 20^{TM} (PBST). Se añadieron los sobrenadantes de prueba y se incubaron durante dos horas con agitación, luego se lavaron cuatro veces con PBST. Se añadió IgE humana (purificada de células U266, tal como se describió anteriormente) a 0,5 \mug/ml y se incubaron durante una hora con agitación, después se lavaron cuatro veces con PBST. Se añadió IgE de cabra anti-humano conjugado con peroxidasa del rábano (Kirkegarrd & Perry Labs, nº 14-10-04, 0,5 mg/ml) con una dilución 1:2500 y se incubó durante una hora, después se lavaron cuatro veces con PBST. Las placas se revelaron añadiendo 100 \mul/pocillo de una disolución que contenía 10 mg de diclorhidrato de o-fenilendiamina (Sigma, nº P8287) y 10 \mul de una disolución de peróxido de hidrógeno al 30% en 25 ml de tampón fosfato-citrato, pH 5,0 y se incubaron durante 15 minutos. La reacción se detuvo añadiendo 100 \mul/pocillo de ácido sulfúrico 2,5 M. Se obtuvieron datos leyendo las placas en un lector automático de placas de ELISA a una absorbancia de 490 nm. Para un anticuerpo, se probaron 365 sobrenadantes y 100 fueron específicos para IgE humana. Se obtuvieron frecuencias similares de especificidad por IgE cuando se examinaron los demás anticuerpos.

C. Albúmina sérica bovina: pI 4,7 y 4,0 (Radola, Biochim. Biophys, Acta, 295:412-428 (1973))

\bullet

Bayer Corp. P/N 81-024-2, "Bovine Albumin, Sulfhydryl Modified" (mezcla de BSA, bloqueada)

\bullet

ICN Biomedical Inc. P/N 810013, "Albumin Bovine" (mezcla de BSA, nativa)

\bullet

Monómero y dímero de BSA preparado de manera interna a partir de BSA de Bayer (monómero de BSA y dímero de BSA, respectivamente)

Sistemas cromatográficos

HPLC (cromatógrafo de líquidos de alta resolución) 1090^{TM} de Hewlett-Packard

FPLC (cromatógrafo de líquidos rápido para proteínas) de Pharmacia^{TM}

Detección a 215 ó 280 nm

Tampones

(véase la tabla I para más detalles)

Agua purificada

Tris\cdotHCl

Acetato de sodio

Cloruro de sodio

Fosfato de sodio

Citrato de sodio y ácido cítrico

Preparación de la muestra

Las muestras se diluyeron con el tampón utilizado para la equilibración (indicado en la tabla I de a continuación) para garantizar que el pH y la conductividad coincidían con las condiciones de partida de la columna. Todas las muestras se filtraron a través de 0,2 \mum antes de la carga.

Cromatografía

Las muestras se introdujeron en la columna utilizando un inyector manual o automático. Todas las pruebas se realizaron a temperatura ambiente. Se recogieron las fracciones manualmente o con un colector PHARMACIA FRAC 100^{TM}.

Se evaluó el rendimiento de la separación cromatográfica comparando los perfiles de elución de reactivo madre de BSA y monómero y dímero de BSA purificados; se hizo lo mismo para IgE y los anticuerpos monoclonales (MAb). Se evaluó adicionalmente la separación de IgE y MAb de sus dímeros y multímeros analizando la fracción de elución, utilizando cromatografía de exclusión por tamaños. Se produjeron representaciones del PM de MAb frente al número de fracción. Se determinó de manera espectrofotométrica la recuperación de IgE y MAb, midiendo la absorbancia a 280 nm.

Resultados

Los resultados se resumen en la tabla I, a continuación:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA I Separaciones de monómero - dímero/multímero

1

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Se evaluaron las separaciones utilizando resinas poliméricas de poliestireno/divinilbenceno (RESOURCE Q y S^{TM}), una resina a base de sílice (JT BAKER CSX^{TM}) y una resina a base de agarosa (Q-SEPHAROSE FAST FLOW^{TM}; QSFF). Aunque las separaciones se consiguieron utilizando cualquiera de estas resinas, las separaciones funcionaron especialmente bien con Q-SEPHAROSE FAST FLOW^{TM}, RESOURCE Q^{TM} y RESOURCE S^{TM}. La separación de monómero y dímero de BSA de ambos proveedores pareció ser muy similar, lo que sugiere que el material "modificado con sulfhidrilo" de Bayer no alteró la proteína de modo que las especies fuesen más fáciles de separar. Puede observarse que el tampón fosfato a pH 6 funcionó bien, pero no se unió proteína a las columnas de intercambio aniónico o catiónico cuando se utilizó tampón citrato 20 mM a pH 6 como tampón de equilibración. Se esperaba que el tampón citrato funcionase tanto para el intercambio aniónico como catiónico a una concentración inferior, por ejemplo, de aproximadamente 5 mM.

La recuperación de IgE monomérica y los MAb contra IgE en resinas de intercambio aniónico normalmente fue superior al 90% con una pureza superior al 99,5%. Las figuras 1A y 1B muestran cromatogramas de intercambio aniónico (RESOURCE Q^{TM}) en la separación de monómeros de IgE de sus dímeros y multímeros. Las figuras 2A1 y 2A2 muestran cromatogramas de intercambio aniónico (RESOURCE Q^{TM}) en la separación de monómeros de MAb anti-IgE de sus dímeros y multímeros. La figura 2B muestra un cromatograma de intercambio aniónico (Q-SEPHAROSE FAST-FLOW^{TM}) en la separación de monómeros de MAb anti-IgE de sus dímeros y multímeros. Se utilizó SEC (SUPERDEX 200 HR 10/30^{TM}) como método analítico para determinar la cantidad de monómero y multímero en las muestras de la separación mediante intercambio de iones y la figura 2C muestra el análisis mediante SEC de las fracciones de la figura 2B. La separación del monómero de BSA de su dímero se consiguió rápidamente con resinas de intercambio aniónico a pH 8 y pH 6. Véanse las figuras 3A-C y 4A-C para los cromatogramas de la separación de monómeros de BSA de sus dímeros y multímeros mediante intercambio aniónico (RESOURCE Q^{TM}) a pH 8 (tampón Tris) y a pH 6 (tampón fosfato), respectivamente.

La recuperación y la pureza del monómero de MAb procedente de la resina de intercambio catiónico fueron comparables a los de la resina de intercambio aniónico. Las figuras 5A-B muestran cromatogramas de intercambio catiónico (RESOURCE S^{TM}) en la separación de monómeros de MAb anti-IgE de sus dímeros y multímeros a pH 6 (tampón fosfato). Las separaciones de BSA en resinas de intercambio catiónico pudieron realizarse a pH 4,6 y pH 4,3, siendo algo mejores. Las figuras 6A-B muestran cromatogramas de intercambio catiónico (RESOURCE S^{TM}) en la separación de monómeros de BSA de sus dímeros y multímeros a pH 4,3 (tampón acetato).

En resumen, se sometieron mezclas de polímeros peptídicos a cromatografía de intercambio catiónico o aniónico utilizando una variedad de resinas y en una variedad de condiciones de pH y sal de elución, y se consiguió una separación satisfactoria. Basándose en los resultados de cuatro proteínas con puntos isoeléctricos básicos y ácidos (dos IgG, MAb, IgE y, para comparar, albúmina sérica), el método demuestra su aplicabilidad general para la separación de monómeros de anticuerpo de sus dímeros y multímeros.

Claims (14)

1. Método para separar un monómero de anticuerpo de una mezcla que comprende monómeros de dicho anticuerpo y dímeros de dicho anticuerpo o n unidades monoméricas de dicho anticuerpo, en el que n es 3-10, o ambos, en el que el método comprende la etapa de aplicar la mezcla a una resina para cromatografía de intercambio catiónico o intercambio aniónico en un tampón, en el que si la resina es de intercambio catiónico, el pH del tampón es de aproximadamente 4-7, y en el que si la resina es de intercambio aniónico, el pH del tampón es de aproximadamente 6-9, y eluir la mezcla con un gradiente de aproximadamente 0-1 M de una sal de elución, en el que el monómero se separa de los dímeros o multímeros, o ambos, presentes en la mezcla en dicha etapa de cromatografía de intercambio de iones; en el que si se utiliza citrato como tampón, se emplea con una concentración inferior a 20 mM.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es anti-IgE, anti-IgG, anti-Her-2, anti-CD11a, anti-CD18, anti-CD20, anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la resina de intercambio de iones es una resina de intercambio catiónico; o en el que la resina de intercambio de iones es una resina de intercambio aniónico.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el gradiente es lineal o escalonado.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sal de elución es una sal sódica; en particular, en el que la sal de elución es cloruro de sodio.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el gradiente es de sal de elución desde 0 hasta 500 mM, en particular, en el que el gradiente es de sal de elución desde 50 hasta 200 mM; o en el que el gradiente es de sal de elución desde 0 hasta 50 mM.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que si se utiliza citrato como tampón, se emplea con una concentración de aproximadamente 5 mM.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el monómero separado se obtiene con un rendimiento superior al 90%.

9. Método para separar un monómero de anticuerpo de una mezcla que comprende monómeros de dicho anticuerpo y dímeros de dicho anticuerpo o n unidades monoméricas de dicho anticuerpo, en el que n es 3-10, o ambos, en el que el método comprende la etapa de aplicar la mezcla a una resina para cromatografía de intercambio aniónico en un tampón, en el que el pH del tampón es de aproximadamente 6-9, y eluir la mezcla con un gradiente de aproximadamente 0-1 M de una sal de elución, en el que el monómero se separa de los dímeros o multímeros, o ambos, presentes en la mezcla en dicha etapa de cromatografía de intercambio aniónico; en el que si se utiliza citrato como tampón, se emplea con una concentración inferior a 20 mM.

10. Método según la reivindicación 9, que comprende además las características según se definen en cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4 a 8.

11. Método para separar un monómero de anticuerpo de una mezcla que comprende monómeros de dicho anticuerpo y dímeros de dicho anticuerpo o n unidades monoméricas de dicho anticuerpo, en el que n es 3-10, o ambos, en el que el método comprende la etapa de aplicar la mezcla a una resina para cromatografía de intercambio catiónico o intercambio aniónico en un tampón, en el que si la resina es de intercambio catiónico, el pH del tampón es de aproximadamente 4-7, y en el que si la resina es de intercambio aniónico, el pH del tampón es de aproximadamente 6-9, y eluir la mezcla con un gradiente de aproximadamente 0-1 M de una sal de elución, en el que el monómero se separa de los dímeros o multímeros, o ambos, presentes en la mezcla en dicha etapa de cromatografía de intercambio de iones; en el que si se utiliza citrato como tampón, se emplea con una concentración inferior a 20 mM, y en el que el monómero separado tiene una pureza superior al 99,5%.

12. Método según la reivindicación 11, que comprende además las características según se definen en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.

13. Uso de una resina de intercambio de iones para separar un monómero de anticuerpo de una mezcla que comprende monómeros de dicho anticuerpo y dímeros de dicho anticuerpo o n unidades monoméricas de dicho anticuerpo, en el que n es 3-10, o ambos, mediante cromatografía de intercambio de iones en un tampón, que comprende aplicar dicha mezcla a dicha resina y eluir la mezcla con un gradiente aproximadamente 0-1 M de una sal de elución; en el que si se utiliza citrato como tampón, se emplea con una concentración inferior a 20 mM.

14. Uso según la reivindicación 13, para la separación del monómero de anticuerpo con un rendimiento superior al 90%.