ES2819288T3 - Cadena ligera de enteroquinasa modificada - Google Patents

Cadena ligera de enteroquinasa modificada Download PDF

Info

Publication number
ES2819288T3
ES2819288T3 ES12816050T ES12816050T ES2819288T3 ES 2819288 T3 ES2819288 T3 ES 2819288T3 ES 12816050 T ES12816050 T ES 12816050T ES 12816050 T ES12816050 T ES 12816050T ES 2819288 T3 ES2819288 T3 ES 2819288T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
light chain
analog
enterokinase
enterokinase light
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12816050T
Other languages
English (en)
Inventor
Helle Fabricius Wöldicke
Xujia Zhang
Yun Liu
Weiwei Tong
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Application granted granted Critical
Publication of ES2819288T3 publication Critical patent/ES2819288T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21009—Enteropeptidase (3.4.21.9), i.e. enterokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1, en donde dicho análogo comprende las sustituciones C112A, L134K e I135K, dicho análogo comprende menos de 10 modificaciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1, y dicho análogo tiene actividad de enteroquinasa proteasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Cadena ligera de enteroquinasa modificada
Campo técnico
La presente invención se relaciona con nuevos análogos de enteroquinasa de mamífero, métodos para prepararlos y el uso de dichos análogos de enteroquinasa de mamífero para escindir proteínas que tienen un sitio de escisión de enteroquinasa.
Antecedentes de la invención
La serina proteasa enteroquinasa (en abreviatura enteroquinasa o EK), también conocida como enteropeptidasa, es una glicoproteína heterodimérica, una enzima de mamífero que cataliza la conversión de tripsinógeno en tripsina activa. La enteroquinasa tiene preferencia por la secuencia de sustrato Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ((Asp)4-Lys, DDDDK), donde escinde selectivamente después de la lisina. La enteroquinasa aislada de la mucosa duodenal bovina presenta un peso molecular (MW) de 150000 y un contenido de carbohidratos del 35 por ciento. La enzima está compuesta por una cadena pesada (MW~115,000) y una cadena ligera unida por disulfuro (MW ~ 35000) (Liepnieks y otros, J. Biol. Chem., 254(5): 1677-1683 (1979)). La función de la cadena pesada es anclar la enzima a la membrana mucosa. La cadena ligera actúa como subunidad catalítica.
Tan y otros, (Protein, expression and purification, academic press, San Diego, CA, vol. 56, núm. 1, 3 de octubre de 2007 (03-10-2007), páginas 40-47) describen la optimización de purificación y replegamiento de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina recombinante sobreexpresada en Escherichia coli.
Gasparian M y otros, (Protein expression and purification, academic press, San Diego, CA, vol. 31, núm. 1, 1 de septiembre de 2003 (01-09-2003), páginas 133-139) describe la expresión, purificación y caracterización de la subunidad catalítica de enteropeptidasa humana en Escherichia coli.
EL documento CN1470634 describe una variante de la cadena ligera de enteropeptidasa con alta actividad y alta estabilidad.
En E. coli, muchas proteínas de mamíferos se expresan como proteínas de fusión, que deben escindirse para liberar la proteína activa madura. Para ello se necesita una enzima de procesamiento, preferentemente una que escinda directamente en la unión sin dejar aminoácidos adicionales en el producto. La enteroquinasa es una enzima de este tipo, y se ha realizado un gran esfuerzo para establecer un proceso recombinante para obtener enteroquinasa o análogos de enteroquinasa en E. coli. Sin embargo, los resultados hasta ahora han sido bastante pobres: Los productos comerciales disponibles son caros y de baja actividad específica, debido a la renaturalización ineficaz de la EK precipitada o la secreción ineficaz de la EK soluble.
Un proceso en E. coli que apunta a un producto de EK soluble conduce a una mezcla de proteína soluble e insoluble, lo que requiere 2 vías de purificación, columnas de afinidad caras y rendimientos bajos en total.Para obtener un producto uniforme, la EK debe producirse como material insoluble en cuerpos de inclusión. Estos son fáciles de aislar, pero difíciles de renaturalizar con rendimientos satisfactorios, debido a la posible agregación de la proteína.
Un objeto de la invención es obtener un análogo de enteroquinasa de mamífero con propiedades mejoradas.
Breve descripción de la invención
La presente invención se relaciona con análogos de enteroquinasa de mamíferos mutados en sitios apropiados. Una o más sustituciones de un análogo de enteroquinasa de la invención pueden ser, por ejemplo, de aminoácidos cargados hidrofóbicos a hidrofílicos con respecto a los aminoácidos en la enteroquinasa de mamífero parental (tipo salvaje).
En un aspecto de la invención, se obtiene un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1, en donde dicho análogo comprende las sustituciones C112A, L134K e I135K, dicho análogo comprende menos de 10 modificaciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1, y dicho análogo tiene actividad de enteroquinasa proteasa.
La invención también se relaciona con un método para obtener una solubilidad mejorada en un proceso de renaturalización de un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa que comprende la etapa de mutar los aminoácidos hidrofóbicos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje a aminoácidos hidrofílicos y, opcionalmente, mutar otros aminoácidos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje, en donde los aminoácidos hidrofóbicos sometidos a la mutación están presentes en la superficie de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje plegada, dicho análogo comprende las sustituciones C112A, L134K e I135K, dicho análogo comprende menos de 10 modificaciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1, y dicho análogo tiene actividad de enteroquinasa proteasa.
En un aspecto, la invención proporciona un proceso de producción mejorado para la obtención de análogos de enteroquinasa de mamíferos. También o alternativamente, en un segundo aspecto, la invención proporciona un proceso de producción mejorado que resulta en un rendimiento de producción mejorado.
En un aspecto de la invención, el método para la producción de un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina comprende las etapas:
a) cultivar las células huéspedes en un medio de crecimiento que comprende un inductor, en donde las células huéspedes comprenden una secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos del análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa;
b) recuperar las células con el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa en cuerpos de inclusión
c) solubilizar y replegar el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa; y
d) purificar el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa.
En un aspecto, la invención proporciona un método para producir de manera recombinante un péptido o proteína en una célula huésped bacteriana o de levadura. En un aspecto, el método comprende:
a) expresar en levadura o bacteria una proteína de fusión que comprende el péptido o proteína a producir;
b) escindir la proteína de fusión con un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1-9; y
c) aislar el péptido o proteína producidos.
La invención puede resolver, además, otros problemas que resultarán evidentes a partir de la descripción de las modalidades ilustrativas.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Dependencia de la expresión de Trx-EKL (A) y Trx-EKLM (B) con el tiempo de inducción. M: Marcador; BI:
Antes de la inducción; I2, I3, I4 e I6 representan el tiempo de inducción (h) por IPTG, respectivamente; gel al 15 %; se usó Medio definido de fermentación (FDM).
Figura 2: Diagrama de flujo para la purificación de EK
Figura 3:Figura 3: % de rendimiento de replegamiento (figura 3A) y cantidad de EKl purificada y EKlm en tampón de replegamiento de 1l (mg, figura 3B) en función de la concentración de T rx-enlazador-EKL y T rx-enlazador-EKLM durante el replegamiento. A /A : Trx- enlazador-EKL, cuerpo de inclusión (IB) 1 mg/ml; •/o: Trx- enlazador-EKLM, IB 6 mg/ml; ♦ /A : Trx- enlazador-EKLM, IB 4 mg/ml. 1,3 g de sedimento celular de Trx-enlazador-EKLM o Trx-enlazador-EKL se lisaron y los cuerpos de inclusión se solubilizaron a diferentes concentraciones, es decir, 1 mg/ml para Trx-enlazador-EKL, 4 mg/ml o 6 mg/ml para Trx-enlazador-EKLM en tampón que contiene Tris 20 mM, urea 8 M, pH 8,0, DTT 20 mM. Después de la dilución a las concentraciones indicadas en el tampón de replegamiento que contiene Tris 20 mM, urea 1 M, GSSG 1 mM, GSH 3 mM, pH 8,3 e incubación a 20 °C durante 24 horas, la EKlm/ EKl se sometió a purificación mediante cromatografía Q HP como se describe en Experimentos.
Figura 4:El rendimiento de replegamiento de T rx-EKL aumenta con el tiempo de incubación. 1,3 g de sedimento celular de Trx-EKL se lisaron y los cuerpos de inclusión se solubilizaron a 1,6 mg/ml en tampón que contiene Tris 20 mM, urea 8 M, pH 8,0, DTT 20 mM. Después de una dilución de 100 veces en el tampón de replegamiento que contiene Tris 20 mM, urea 1 M, GSSG 1 mM, GSH 3 mM, pH 8,3 y la incubación a 20°C durante 24 horas o 48 horas, respectivamente, se evaluó la actividad enzimática como se describe en Experimentos.
Figura 5:Dependencia del rendimiento de replegamiento con la concentración de urea. 1,3 g de sedimento celular de Trx-EKL se lisaron y los cuerpos de inclusión se solubilizaron a 1,6 mg/ml en tampón que contiene Tris 20 mM, urea 8 M, pH 8,0, DTT 20 mM. Después de una dilución de 100 veces en el tampón de replegamiento que contiene Tris 20 mM, GSSG 1 mM, GSH 3 mM, pH 8,3 y urea 0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 1,5 mM o 2 mM, respectivamente, y la incubación a 20°C durante 24 horas, se evaluó la actividad enzimática como se describe en Experimentos.
Figura 6: Dependencia del rendimiento de replegamiento con la relación redox GSSG/GSH. 1,3 g de sedimento celular de Trx-EKL se lisaron y los cuerpos de inclusión se solubilizaron a 1,6 mg/ml en tampón que contiene Tris 20 mM, urea 8 M, pH 8,0, DTT 20 mM. Después de una dilución de 100 veces en el tampón de replegamiento que contiene Tris 20 mM, urea 1 M, pH 8,3 y GSSG/GSH como se indica, y la incubación a 20°C durante 24 horas, se evaluó la actividad enzimática como se describe en Experimentos.
Figura 7: Purificación de EKlm por cromatografía Q HP. (A): Un cromatograma. EKlm se eluyó mediante gradiente de sodio, como se muestra en P2. Se indicaron las fracciones que contienen actividad enzimática de EK. (B): SDS-PAGE de EKlm en cada etapa en condiciones reducidas. EK lm : EKlm de alta pureza (>90 %) obtenida a partir de la purificación adicional de P2 mediante Cromatografía de Interacción Hidrofóbica; M: Marcador, BI: Antes de la inducción, Total:
Lisados totales; Sob.: Sobrenadante después de la lisis de las células; IB: Cuerpos de inclusión sometidos a replegamiento y purificación; App: Muestras aplicadas a la columna Q HP después del replegamiento y la autoactivación; P1, P2 y P3 representan las fracciones agrupadas de cada pico indicado en la Figura 7A. (C): Actividad enzimática. A:P1. 1 ul de muestra añadido a 100 ul de tampón de reacción; •: P2. Después de una dilución de 5 veces de P2, se añadió 1 ul de muestra diluida a 100 ul de tampón de reacción; o: P3. 1 ul de muestra añadido a 100 ul de tampón de reacción; ■: Blanco. Se añadió 1 ul de tampón (Tris 20 mM, pH 8,0) a 100 ul de tampón de reacción. 1,3 g de sedimento celular de Thk-EKlm se lisaron y los cuerpos de inclusión se solubilizaron a 4 mg/ml en tampón que contiene Tris 20 mM, urea 8 M, pH 8,0, DTT 20 mM. Después de una dilución de 80 veces en tampón de replegamiento que contiene Tris 20 mM, urea 1 M, GSSG 1 mM, GSH 3 mM, pH 8,3 y la incubación a 20°C durante 24 horas, la EKlm se sometió a purificación mediante cromatografía Q HP como se describe en Experimentos.
Figura 8: Actividad enzimática específica similar entre EKl y EKlm.25EU de EKl y EKlm purificadas se aplicó en SDS-PAGE.
Figura 9: EKlm es estable durante al menos 3 meses a -80 0C o 4 0C. La EKlm purificada como se describe en Experimentos se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 0C o 40C. Después de 3 meses, 5 |jg de EKlm de cada temperatura se aplicó en SDS-PAGE en condiciones reducidas y no reducidas, y se comparó con EKlm recién purificada (Fresca).
Figura 10: Comparación de las secuencias de aminoácidos de trxEKLM (SEQ ID No: 9) y trx-enlazador-EKLM (SEQ ID No: 8). En trx-enlazador-EKLM el espaciador entre trx y EKLM es 37 aminoácidos más largo que en trxEKLM.
Figura 11: La eficiencia de replegamiento de Trx-enlazador-EKLM aumenta con PEG1000 o ciclodextrina añadida en el tampón de replegamiento. El cuerpo de inclusión se solubilizó en 7,3 mg/ml y se diluyó en una relación de 1 a 20 en el tampón de replegamiento. La concentración final de PEG1000 y ciclodextrina en el tampón de replegamiento es 1 % y 1,5 % respectivamente.
Descripción
La presente invención se relaciona con análogos de enteroquinasa de mamíferos mutados en sitios apropiados. Una o más sustituciones de un análogo de enteroquinasa de la invención pueden ser, por ejemplo, de aminoácidos cargados hidrofóbicos a hidrofílicos con respecto a los aminoácidos en la enteroquinasa de mamífero parental (tipo salvaje). En un aspecto, una o más sustituciones de un análogo de la enteroquinasa de mamífero de la invención es de aminoácidos cargados hidrofóbicos a hidrofílicos con respecto a los aminoácidos de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje. En un aspecto, los aminoácidos hidrofóbicos sometidos a mutación están presentes en la superficie de la cadena ligera de la enteroquinasa de mamífero de tipo salvaje plegada tal como la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje plegada.
La cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje generalmente presenta una buena actividad en presencia de varios detergentes y desnaturalizantes en un amplio intervalo de pH (4,5-9,5) e intervalo de temperatura (4-45 °C). Por tanto, la cadena ligera de la enteroquinasa como herramienta poderosa se ha usado en biotecnología para la escisión in vitro de proteínas de fusión.
Sin embargo, los complicados procesos de producción y el bajo rendimiento de producción extraída de animales, tal como porcinos y bovinos, ha establecido una limitación para la aplicación de EK en biotecnología. Recientemente, se ha obtenido en E. coli la cadena ligera de la enteroquinasa recombinante mediante secreción de la cadena ligera de la enteroquinasa activa o mediante acumulación intracelular de cuerpos de inclusión de la cadena ligera de la enteroquinasa inactiva, el replegamiento y la activación. Además, se ha demostrado que la sustitución de Cys112 por Ala de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina potenció la actividad enzimática, presumiblemente debido a un replegamiento facilitado. Cys112 une la cadena ligera a la cadena pesada en la holoenzima y no es una parte esencial de la cadena ligera.
En un aspecto de la invención, el análogo de la enteroquinasa de mamífero es un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa de mamífero tal como un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina. En un aspecto de la invención, el análogo de la enteroquinasa de mamífero es un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina. En un aspecto, el análogo de la cadena ligera bovina comprende la(s) sustitución(ones) en la posición 134 y/o en la posición 135. En un aspecto el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina comprende sustituciones en las posiciones 112, 134 y/o 135. En un aspecto, el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina comprende al menos dos sustituciones. En un aspecto, el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina comprende al menos tres sustituciones. En un aspecto el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina comprende sustituciones en las posiciones 112, 134 y 135. En un aspecto, el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina comprende las sustituciones C112A, L134K e I135K.
Los análogos novedosos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina incluyen aquellos que tienen la conformación estructural primaria (es decir, la secuencia de aminoácidos) de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje. La cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje tiene la secuencia sustancialmente como se establece en la SEQ ID NO: 1.
1 IVGGSDSREG AWPWVVALYF DDQQVCGASL VSRDWLVSAA HCVYGRNMEP
5 1SKWKAVLGLH MASNLTSPQI ETRLIDQIVI NPHYNKRRKN NDIAMMHLEM
101 KVNYTDYIQP ICLPEENQVF PPGRICSIAG WGALIYQGST ADVLQEADVP
151 LLSNEKCQQQ MPEYNITENM VCAGYEAGGV DSCQGDSGGP LMCQENNRWL
201 LAGVTSFGYQ CALPNRPGVY ARVPRFTEWI QSFLH
SEQ ID NO: 1
De acuerdo con un aspecto, los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la invención tienen actividad de enteroquinasa proteasa. También se encuentran disponibles anticuerpos para tales proteasas.
El análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina descrito por la presente invención mantiene la actividad de proteasa de la enteroquinasa de tipo salvaje para su uso como una proteasa de restricción para escindir específicamente proteínas de fusión.
El término "enteroquinasa bovina" como se usa en la presente descripción significa la enzima enteroquinasa bovina cuya estructura y propiedades son bien conocidas. Las enteroquinasas de mamíferos son heterodímeros que contienen carbohidratos con una cadena pesada de 650-800 aminoácidos y una cadena ligera catalítica de alrededor de 235 aminoácidos y una homología global de 75-80 % (Liepniecks y otros, J. Biol. Chem. 254, 1677 (1979), Matsushima y otros, J. Biol. Chem. 269 (31), 19976 (1994), Kitamoto y otros, Biochemistry 34, 4562 (1995) para la enteroquinasa bovina, porcina y humana, respectivamente). Se informan estudios adicionales de las cadenas ligeras catalíticas en LaVallie y otros, J. Biol. Chem. 268 (31), 23311-17 (1993) sobre la EK bovina y en Matsushima y otros, J. Biochem. 125, 947, (1999) sobre la EK porcina.
El término "cadena ligera de la enteroquinasa bovina" como se usa en la presente descripción significa la cadena ligera de la enteroquinasa bovina que tiene 4 puentes disulfuro. La cadena ligera de la enteroquinasa bovina se describe, por ejemplo, en LaVallie y otros, arriba.
Cuando se usa en la presente descripción, el término "superficie” en relación con los aminoácidos presentes en lasuperficie de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje plegada significa los aminoácidos identificados como presentes en la superficie de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje plegada en una estructura 3D como, por ejemplo, se describe en Mod Base P 98072.
"Una cadena ligera de la enteroquinasa" de acuerdo con la invención debe entenderse en la presente descripción como la cadena ligera de la enteroquinasa bovina o una cadena ligera de la enteroquinasa de otra especie tal como la cadena ligera de la enteroquinasa porcina o humana.
El término "péptido de la cadena ligera de la enteroquinasa" como se usa en la presente descripción significa un péptido que es la cadena ligera de la enteroquinasa bovina o un análogo o derivado de la misma con actividad de enteroquinasa.
Como se usa en la presente descripción, la actividad de enteroquinasa significa la capacidad de escindir sustratos peptídicos o proteicos en un sitio específico; para sustratos proteicos, este generalmente sigue la secuencia (Asp)4-Lys, o una secuencia similar tal como las descritas en Light y otros, Anal. Biochem. 106: 199(1980); (un grupo de aminoácidos cargados negativamente seguido por un aminoácido cargado positivamente). Típicamente, tal actividad se mide mediante la activación del tripsinógeno al escindir el propéptido N-terminal (que contiene (Asp)4-Lys) con la enteroquinasa o el análogo de la enteroquinasa y subsecuentemente al evaluar la cantidad de tripsina activa generada mediante el uso del tosil-arginina-metiléster (TAMe ). Alternativamente, la actividad de la enteroquinasa se puede medir directamente al incubar la enzima con el sustrato peptídico Gly (Asp)4-Lys-ss-naftilamida y medir el aumento de fluorescencia (excitación a 337 nm, emisión a 420 nm) generada por la escisión y liberación del resto ss-NA (ssnaftilamida). Véase, por ejemplo, Grant y otros, Biochem. Biophys. Acta. 567:207(1979). La enteroquinasa bovina también es activa en algunos sustratos de tripsina como TAME y BAEE (bencil-arginina-etil-éster).
El término "cadena ligera de la enteroquinasa de tipo salvaje" como se usa en la presente descripción pretende significar una cadena ligera de la enteroquinasa antes de que se le haya aplicado cualquier sustitución de acuerdo con la invención.
El término "análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa" o "análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina" como se usa en la presente descripción significa una cadena ligera de la enteroquinasa bovina modificada en donde uno o más residuos de aminoácidos de la cadena ligera de la enteroquinasa han sido sustituidos por otros residuos de aminoácidos y/o en donde uno o más residuos de aminoácidos de la cadena ligera de la enteroquinasa se han eliminado y/o en donde uno o más residuos de aminoácidos se han añadido y/o insertado en la cadena ligera de la enteroquinasa.
En una modalidad, un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa comprende menos de 10 modificaciones de aminoácidos (sustituciones, deleciones, adiciones (que incluyen inserciones) y cualquier combinación de las mismas) con respecto a la cadena ligera de la enteroquinasa bovina, alternativamente menos de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 modificaciones con respecto a la cadena ligera de la enteroquinasa bovina. En un aspecto, un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa comprende 5 modificaciones de aminoácidos, en un aspecto 4 modificaciones de aminoácidos, en un aspecto 3 modificaciones de aminoácidos, en un aspecto 2 modificaciones de aminoácidos y en un aspecto 1 modificación de aminoácido con respecto a la cadena ligera de la enteroquinasa bovina.
Las modificaciones en la cadena ligera de la molécula de enteroquinasa se indican a través de la posición y el código de una o tres letras para el residuo de aminoácido que sustituye el residuo de aminoácido nativo. Mediante el uso de los códigos de una letra para los aminoácidos, los términos como 134K y 135K designan que el aminoácido en la posición 134 y 135, respectivamente, es K. Mediante el uso de los códigos de tres letras para los aminoácidos, las expresiones correspondientes son 134Lys y 135Lys, respectivamente. Así, por ejemplo, cadena ligera de la enteroquinasa bovina 112Ala, 134Lys, 135Lys es un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina donde el aminoácido en la posición 112 se sustituye por alanina, el aminoácido en la posición 134 se sustituye por lisina y el aminoácido en la posición 135. se sustituye por lisina.
En la presente descripción, el término “residuo de aminoácido” es un aminoácido del cual, formalmente, un grupo hidroxi se ha eliminado de un grupo carboxi y/o del cual, formalmente, un átomo de hidrógeno se ha eliminado de un grupo amino.
Los ejemplos de análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina son aquellos en donde la Leu en la posición 134 está sustituida con Lys u otro aminoácido cargado, en la posición 135 donde la Ile está sustituida con Lys u otro aminoácido cargado. Además, la Cys en la posición 112 puede estar sustituida con varios aminoácidos que incluyen Ala y Ser.
Otros ejemplos de análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina incluyen, sin limitación: cadena ligera de la enteroquinasa bovina 134Lys; cadena ligera de la enteroquinasa bovina 135Lys; cadena ligera de la enteroquinasa bovina 134Lys,135Lys; cadena ligera de la enteroquinasa bovina 112Ala,134Lys,135Lys; 112Ala,134Lys cadena ligera de la enteroquinasa bovina; 112Ala,135Lys cadena ligera de la enteroquinasa bovina y cualquier combinación de este tipo, que incluye las sustituciones con otros aminoácidos cargados.
En un aspecto, se obtiene un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina que tiene una solubilidad mejorada en un proceso de renaturalización con respecto a la cadena ligera de la enteroquinasa bovina natural. En un aspecto, un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención tiene uno o más aminoácidos hidrofóbicos orientados a la superficie que han sido mutados a aminoácidos cargados hidrofílicos en donde se obtiene una solubilidad mejorada en un proceso de renaturalización con respecto a la cadena ligera de la enteroquinasa bovina natural. En un aspecto, los aminoácidos hidrofóbicos orientados a la superficie para la sustitución por aminoácidos cargados hidrofílicos se seleccionan después de alinear la cadena ligera de la enteroquinasa bovina con otras serina proteasas y escanear las superficies accesibles al solvente a través de un modelo computacional 3D de enteroquinasa.
El método para replegar un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención es conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, el replegamiento puede realizarse mediante desnaturalización en urea, seguido por replegamiento oxidativo en glutatión u otro entorno redox.
En un aspecto, se usa un tampón (tampón de replegamiento) durante el proceso de replegamiento. En un aspecto de la invención, el tampón de replegamiento comprende urea. En un aspecto, el tampón de replegamiento comprende urea entre 0 M y 2 M. En un aspecto, el tampón de replegamiento comprende urea entre 0,5 M y 2 M, urea entre 0 M y 1,5 M o urea entre 0,5 M y 1,5 M. En un aspecto, el tampón de replegamiento comprende aproximadamente urea 1 M.
La concentración inicial de cuerpos de inclusión puede afectar el rendimiento del replegamiento. En un aspecto de la invención, la concentración de cuerpos de inclusión está entre 1 y 4 mg/ml.
En un aspecto de la invención, la etiqueta de tiorredoxina (Trx) se elimina durante el replegamiento, es decir, durante la dilución y la incubación en condiciones de replegamiento. Por tanto, se ha descubierto que el replegamiento y la activación pueden obtenerse sin la adición de una enzima de activación. En un aspecto de la invención, el enlazador que conecta la etiqueta de trx y el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la invención se elimina mediante autoescisión. Por tanto, los inventores han descubierto sorprendentemente que el enlazador que conecta la etiqueta de trx y el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la invención facilita el replegamiento.
En un aspecto, se obtiene menos agregación durante el proceso de renaturalización de un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención con respecto a la agregación obtenida durante el proceso de renaturalización de EK de tipo salvaje. En un aspecto, un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención tiene las sustituciones L134K e I135K, donde el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina es más soluble durante el proceso de renaturalización con respecto a la EK de tipo salvaje. En un aspecto, un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención tiene además la sustitución C112A. Los inventores creen que al mutar la cisteína sola en la posición 112, que en el heterodímero de EK de tipo salvaje está implicada en la unión disulfuro de la cadena ligera a la cadena pesada, la formación de los 4 puentes disulfuro en la cadena ligera de EK puede facilitarse.
En un aspecto, un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la invención tiene una actividad de enteroquinasa completa en comparación con la enteroquinasa bovina de tipo salvaje. En un aspecto, un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la invención tiene una actividad funcional o biológica sustancialmente equivalente a la de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje. Por ejemplo, un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina tiene actividades funcionales o biológicas sustancialmente equivalentes (es decir, es un equivalente funcional) del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, tiene actividades de enteropeptidasa sustancialmente equivalentes).
Las formas de ácido nucleico que codifican análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa también se describen en la presente descripción. Los ácidos nucleicos incluyen ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc), ADN sintético preparado mediante síntesis química, así como también ADN con deleciones o sustituciones, variantes alélicas y secuencias que se hibridan con ellos en condiciones estrictas siempre que codifiquen análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa.
En una modalidad, se proporciona un ácido nucleico en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos, y en donde dicho ácido nucleico codifica un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa de mamífero tal como un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención. En una modalidad, el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor inducible. En una modalidad, se proporciona un vector recombinante que comprende el ácido nucleico unido operativamente al promotor inducible. En una modalidad, el promotor inducible se selecciona de un grupo que consiste en AraB, T7, trp, lac, tac.
Una modalidad adicional de la invención proporciona una célula huésped que comprende el vector recombinante que comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa de mamífero tal como un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención.
Un aspecto adicional de la invención proporciona la célula huésped que comprende el vector recombinante que comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que codifica un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa de mamífero tal como un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención. En una modalidad, la célula huésped se selecciona de un grupo que consiste en E. coli, B. subtilis, S. saccaromyces y A.oryzae.
La producción de polipéptidos, por ejemplo, cadena ligera de la enteroquinasa, es bien conocida en la técnica. El análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina puede producirse, por ejemplo, mediante síntesis clásica de péptidos, por ejemplo, síntesis de péptidos en fase sólida mediante el uso de química t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, ver, por ejemplo, Greene y Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Hijos, 1999. El análogo de la cadena ligera de la enterocinasa bovina también puede producirse mediante un método que comprende cultivar una célula huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica el análogo y es capaz de expresar el análogo de la cadena ligera de la enterocinasa bovina en un medio nutritivo adecuado en condiciones que permitan la expresión del análogo de la cadena ligera de la enterocinasa bovina. Se pueden usar varios métodos recombinantes en la producción de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina y análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina. Los ejemplos de métodos que pueden usarse en la producción de enteroquinasa en microorganismos tales como, por ejemplo, Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae se describen, por ejemplo, en el documento núm. WO 94/16083.
Normalmente, el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina se produce al expresar una secuencia de ADN que codifica el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina en cuestión o un precursor del mismo en una célula huésped adecuada mediante una técnica bien conocida como se describe en, por ejemplo, el documento WO 94/16083
Los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la invención pueden recuperarse del medio de cultivo celular o de las células. Los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la presente invención pueden purificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromato enfoque, y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativa (IEF), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación por sulfato de amonio) o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).
En un aspecto, los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la presente invención se purifican mediante el uso de cromatografía de intercambio aniónico. En un aspecto adicional, la cromatografía de intercambio aniónico va seguida de una cromatografía de interacción hidrofóbica. En un aspecto, los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la presente invención se purifican mediante el uso de cromatografía de intercambio aniónico Q HP. En un aspecto adicional, a la cromatografía de intercambio aniónico Q HP le sigue la cromatografía de interacción hidrofóbica con Fenil FF.
En un aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso mejorado para la producción de un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa de mamífero tal como un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina, en donde dicho método comprende las etapas:
a) cultivar las células huéspedes en un medio de crecimiento que comprende un inductor, en donde las células huéspedes comprenden una secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos del análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa;
b) recuperar las células con el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa en cuerpos de inclusión
c) solubilizar y replegar el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa; y
d) purificar el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa.
La invención proporciona un nuevo proceso recombinante para la producción de un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa de mamífero tal como un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina en E. coli de una manera muy eficiente y económica.
La expresión de un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención puede, por ejemplo, localizarse en los cuerpos de inclusión de E. coli o en el material secretado de la levadura. En una modalidad, la expresión de la enteroquinasa se localiza en los cuerpos de inclusión de E. coli.
También son bien conocidas en la técnica diversas cepas de E. coli que son útiles como células huéspedes para la producción de actividad de enteroquinasa homogénea no glicosilada. Una lista no exclusiva de tales cepas incluye E.coli B BL21 DE3, E.coli K12 W3110, MC1061, DH1, K803, HB101, JM101 y otras cepas similares a K12. Alternativamente, se pueden usar otras especies bacterianas, incluyendo B. subtilis, diversas cepas de Pseudomonas, otros bacilos y similares.
Muchas cepas de células de levadura, conocidas por los expertos en la técnica, también están disponibles como células huéspedes para la expresión de la actividad de enteroquinasa de la presente invención. Las células de levadura son especialmente útiles como huéspedes para la fusión pre/pro con enteroquinasa madura. Cuando se expresa mediante el uso de un vector de levadura adecuado, la fusión se secreta en virtud de un péptido señal.
Cuando el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de esta invención se expresa en células bacterianas, puede expresarse intracelularmente usualmente como cuerpos de inclusión, o puede secretarse de las células bacterianas en forma activa si se incluye una señal secretora. Cuando sea necesario o deseado, como cuando se observa una bioactividad reducida, la actividad de enteroquinasa puede obtenerse mediante métodos convencionales como la solubilización de proteína en urea o HCl de guanidina, seguida de dilución para reducir la concentración de estos reactivos y el tratamiento con agentes oxidantes tal como ditiotreitol o ss-mercapto etanol para mejorar el replegamiento.
En una modalidad, los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención son proteasas enzimáticamente activas que escinden específicamente después de una secuencia (Asp)4-Lys (DDDDK) en varios números de productos proteicos fusionados entre la etiqueta de afinidad y la proteína madura. En una modalidad, los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención han retenido la actividad enzimática
En un aspecto de la invención, se obtiene un proceso para preparar un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina en células de E. coli, en donde las células de E. coli se transforman con un plásmido que porta el gen análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina y un promotor inducible por fermentación que implica etapas discontinuas y semicontinuas y aislamiento y purificación de la proteína expresada de los cultivos.
En un aspecto de la invención, se obtiene un proceso de replegamiento para un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención, en donde la expresión del análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa está en forma de cuerpos de inclusión en E. coli recombinantes. En una modalidad, se usa la desnaturalización seguida de replegamiento en un sistema redox.
Los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa de la invención pueden usarse en un método para escindir proteínas que tienen un sitio de escisión de enteroquinasa, y especialmente proteínas de fusión que tienen tal un sitio de escisión modificado en su secuencia. Las cantidades necesarias se determinan fácilmente de manera empírica por un experto en la técnica.
El término "proteína de fusión", como se usa en la presente descripción, se refiere a una proteína creada mediante ingeniería genética a partir de dos o más proteínas o péptidos. Como se usa en la presente descripción, una proteína de fusión puede referirse a una proteína en la que se ha introducido intencionalmente una secuencia Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (D4K) para una escisión específica. Generalmente, la escisión de la proteína de fusión genera dos polipéptidos. Una proteína de fusión de acuerdo con la invención puede ser una proteína de fusión recombinante. En modalidades particulares, se puede generar una proteína de fusión, por ejemplo, a partir de la adición de un péptido de residuo derivado de un vector en un terminal, por ejemplo el N-terminal, además de la secuencia de aminoácidos de la proteína de tipo salvaje de interés. De esta manera, por ejemplo, se puede construir una proteína de fusión recombinante para que tenga un sitio de escisión Asp-Asp-Asp-Lys (D4K) en el vector corriente arriba unida a la proteína de interés.
El término "operativamente enlazado" denota en la presente descripción una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de la secuencia polinucleotídica de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.
El término "proteasa" pretende incluir cualquier polipéptido/s, solo o en combinación con otros polipéptidos, que rompen enlaces peptídicos entre los aminoácidos de proteínas.
El término "actividad proteolítica" se refiere a la actividad de escisión de un sustrato por una enzima. En modalidades particulares, el término se refiere a la escisión enzimática por enteropeptidasas. En modalidades ilustrativas, el término se refiere a la actividad específica de un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la invención para sitios de escisión Asp-Asp-Asp-Asp-Lys. "Actividad proteolítica no específica" se refiere a la actividad de escisión que no se dirige a un sitio de escisión específico. "Actividad proteolítica específica" se refiere a la actividad de escisión que se dirige a un sitio de escisión específico.
De hecho, como se describe en la presente descripción, un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención es superior para la escisión de proteínas de fusión en comparación con la forma de dos cadenas derivada de bovino.
Como otro aspecto de la invención, el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa de la invención se incorpora como una de las proteínas de fusión asociadas a otra proteína más. Como tal, con la adición de una cantidad mínima de actividad de enteroquinasa exógena al recipiente de reacción, la proteína de fusión da como resultado la liberación de actividad de enteroquinasa adicional que a su vez puede catalizar muchas más escisiones proteolíticas de proteínas de fusión. De esta manera, pueden producirse grandes cantidades de actividad de enteroquinasa a partir de una proteína de fusión de manera autocatalítica.
Otro aspecto particular de la invención enseña un método para la escisión de una proteína que contiene un sitio de escisión Asp-Asp-Asp-Asp-Lys mediante el uso de cualquiera de los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la invención descritos en la presente descripción, el método que comprende poner en contacto la proteína con cualquiera de los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la invención, y en donde el contacto de la proteína con el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina da como resultado una escisión específica.
En una modalidad, la proteína es una proteína de fusión. En otra modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión recombinante. En una modalidad adicional, la proteína se produce de manera bacteriana. En una modalidad más particular, la proteína es una proteína sintética.
En un aspecto adicional, la invención enseña un método para la preparación de proteína recombinante mediante el uso de cualquiera de los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la invención como se describe en la presente descripción, el método que comprende proporcionar una proteína de fusión recombinante que contiene un sitio de escisión Asp-Asp-Asp-Asp-Lys y poner en contacto la proteína de fusión con cualquiera de los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de la invención, en donde el contacto de la proteína de fusión recombinante con el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina da como resultado la escisión específica de Asp-Asp-Asp-Asp-Lys y la preparación de proteína recombinante.
Todos los encabezamientos y sub-encabezamientos se usan en la presente solo por conveniencia y no deben interpretarse como limitantes de la invención de ninguna manera.
Ejemplos
En la presente descripción se ha desarrollado un proceso de producción para fabricar análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina. Los análogos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina se fusionaron con la etiqueta de tiorredoxina expresados como cuerpos de inclusión en E. coli. Después del replegamiento y la autoactivación, el análogo activo de la cadena ligera de la enteroquinasa se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico Q HP. Además, se encontró que las sustituciones triples (C112A, L134K e I135K) de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina (EKlm), que mejoraron las propiedades hidrofílicas de la superficie, aumentó 4 veces el rendimiento del replegamiento sin perder actividad. El rendimiento del análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa purificado fue 800 mg/l de un cultivo de 4 g/l, y la actividad específica se determinó como 5000 ± 10 EU/mg. Así, nuestro proceso de producción del análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa proporciona una herramienta valiosa para procesar proteínas de fusión terapéuticas y otras proteínas de fusión.
Abreviaturas:
EK: Enteroquinasa
EKl: Cadena ligera de la enteroquinasa bovina con mutación C112A
EKlm (alternativamente denominada en la presente descripción EKm o EKlm(C112A, L134K, I135K)): Cadena ligera de la enteroquinasa bovina con mutaciones en las posiciones 112 a Ala, 134 a Lys y 135 a Lys.
TrxEKLM : EKlm fusionada con etiqueta de tiorredoxina N-terminal con un enlazador de 12AA
Trx-Enlazador-EKLM : EKlm fusionada con etiqueta de tiorredoxina N-terminal con un enlazador más largo de 49AA Trx-Enlazador-EKL : EKl fusionada con etiqueta de tiorredoxina N-terminal con un enlazador más largo de 49AA IPTG: Isopropil p-D-1-tiogalactopirananósido
T ris: T ris(hidroximetil)aminometano
DTT: Ditiotreitol
GSSG: Disulfuro de glutatión
GSH: Glutatión
FDM: Medio definido de fermentación
Trx: Tiorredoxina
LC-MS: Cromatografía Líquida-Espectrometría de Masas
SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio
BL21: E. coli cepa E. coli B BL21 DE3
Reacción de PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
PEG bajo: Polietilenglicol de bajo peso molecular tal como polietilenglicoles con un peso molecular de hasta 1000 PEG1000: Polietilenglicol 1000, un polietilenglicol con un peso molecular aproximado de 1000.
Ejemplo 1. Construcción de plásmido de Trx-enlazador-EKL y Trx-enlazador-EKLM
La secuencia de ADN que codifica la subunidad catalítica de la enteroquinasa bovina se amplificó con los siguientes cebadores:
5'-ggcggtaccgacgacgacgacaagattgtcggaggaagtgac-3' SEQ ID NO: 2
5'- ggcgaattcctaatgtagaaaactttgtatccactctgtgaacc-3' SEQ ID NO: 3
Estos dos cebadores contenían sitios para las enzimas de restricción Kpn I y EcoR I, respectivamente. El fragmento diana se introdujo en pET32a (Novagen) desde el sitio KpnI y EcoRI. La reacción de PCR de rutina se realizó mediante el uso de la a Dn polimerasa Pfu de Stratagene. La secuencia del plásmido pET32a-EKL se confirmó mediante secuenciación. Se introdujeron tres sitios de sustitución, es decir, C112A, L134K, I135K mediante el uso del kit de mutagénesis sitio dirigida QuikChange® XL de Stratagene con los cebadores:
C112AF 5'-acacagattatatacagcctat tgcgttaccagaagaaaatcaag-3' SEQ ID NO: 4
C112AR 5'-cttgattttcttctggtaacgcaataggctgtatataatctgtgt-3' SEQ ID NO: 5
L134K,I135KF 5'-ctattgctggctggggggcaaagaaatatcaaggttctactgcagacg-3' SEQ ID NO: 6
L134K,I135KR5'-cgtctgcagtagaaccttgatatttctttcccc ccagccagcaatag-3' SEQ ID NO: 7
Secuencia de aminoácidos de Trx-enlazador-EKi_M:
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLL FKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDD DKIVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIET RLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPIALPEENQVFPPGRICSIAGWGAKKYQGSTADVLQEADVP LLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARV PRFTEWIQSFLH SEQ ID NO: 8
Subrayada: Trx; Regular: enlazador; Negrita cursiva: EKlm
Secuencia de aminoácidos de Trx-EKLM:
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLL FKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGGTDDDDKIVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRD WLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPI ALPEENQVFPPGRICSIAGWGAKKYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGD SGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH SEQ ID NO: 9
Subrayada: Trx; Regular: enlazador; Negrita cursiva: EKlm
Ejemplo 2. Fermentación y expresión de Trx-enlazador-EKL y Trx-enlazador-EKLM
Se inocularon células de una solución madre de glicerol en una placa EC1, se cultivaron durante toda la noche a 37 °C y se lavaron con cloruro de sodio (NaCl) al 0,9 % para suspender las células. Se dejó que el cultivo creciera en un fermentador que contenía medio definido de fermentación (f Dm ) a 37 °C durante 16 horas, y se indujeron con IPTG 1,0 mM a una OD600 de 150, y luego se cultivó durante 6 horas a 37 °C antes de cosechar por centrifugación. Ambos Trx-enlazador-EKL y Trx-enlazador-EKLM en E. coli BL21 se expresaron en fermentación semicontinua. Como se muestra en la Figura 1, no se observó expresión aparente de fuga juzgada por la SDS-PAGE antes de la inducción con IPTG. Apareció una banda inducida por IPTG justo por encima de 43 kD en SDS-PAGE, y se confirmó mediante LC-MS que esta banda representaba la proteína diana. Además, el nivel de expresión de la proteína diana fue dependiente del tiempo de inducción. Con 4 horas o 6 horas de inducción para Trx-enlazador-EKL y Trx-enlazador-EKLM mediante el uso de medio definido de fermentación (FDM), respectivamente, se obtuvo una expresión aceptable, y se logró ~ 4 g/l de las proteínas diana.
Ejemplo 3. Replegado, activación autocatalítica y purificación
Las células de la fermentación se resuspendieron en tampón de lisis (1:10, p/p) que contenía Tris 20 mM, pH 8,0, y se lisaron mediante prensa francesa. Los cuerpos de inclusión se sedimentaron a 20000 g durante 1 hora a 4 °C, y luego se lavó una vez con el uso de tampón de lisis. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron a 3,2 mg/ml en tampón que contenía Tris 20 mM, urea 8 M, pH 8,0, DTT 20 mM y se incubaron a 4 °C durante 3 horas. Después de centrifugar a 20 000 g durante 30 min, la EK solubilizada (es decir, Trx-enlazador-EKL y/o Trx-enlazador-EKLM) se diluyó 80 veces en tampón de replegamiento que contenía Tris 20 mM, urea 1 M, GSSG 1 mM, GSH 3 mM, pH 8,3 y se incubó a 20 °C durante 24 horas.
Durante la dilución e incubación del procedimiento de replegamiento, se produjo la escisión autocatalítica y se liberó la enzima completamente activa sin la etiqueta de tiorredoxina (Trx). Finalmente, la enzima se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico Q HP.
El esquema del proceso se muestra en la Figura 2. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en el tampón que contenía urea 5-8 M y DTT 10-20 mM. Cabe señalar que la concentración de los cuerpos de inclusión afectó al rendimiento del replegamiento. Se encontró que el rendimiento del replegamiento de 4 mg/ml de Trx-enlazador-EKLM fue 2 veces mayor que el de 6 mg/ml de Trx-enlazador-EKLM (Figura 3A).
El replegamiento se produjo por dilución. La cantidad de enzima purificada a partir de un volumen fijo también fue dependiente de la concentración de Trx enlazador EK en el tampón de replegamiento, y alcanzó un máximo cuando la concentración de Trx-enlazador-EKLM fue de 120 pg/ml.
La activación autocatalítica se produjo de manera concomitante con el proceso de replegamiento. La EK activa se liberó de Trx-enlazador-EK por la EK activa de escape, que escindió específicamente la etiqueta de Trx en el sitio de reconocimiento de DDDDK justo antes de la EK madura. El proceso de replegamiento y activación autocatalítica pareció óptimo a las 48 horas (Figura 4). Considerando la inhibición de EK por urea, se encontró que el rendimiento del replegamiento se redujo en gran medida si estaba por encima de 2 M de urea en tampón de replegamiento. Nuestro resultado mostró que la urea 1 M en tampón de replegamiento fue óptima (Figura 5).
El rendimiento de replegamiento fue dependiente del sistema redox. Se encontró que GSSG/GSH en la relación 1:3 fue óptima y mejor que Cistina/cisteína (Figura 6).
La EK activa después del replegamiento y la autoactivación se purificó y se concentró mediante purificación cromatográfica de intercambio aniónico en una etapa (columna QHP, Figura 7A). Se encontró que la etiqueta de Trx estaba en P1, EKlm estaba principalmente en P2 junto con la impureza de la etiqueta de Trx, y P3 contenía cantidades trazas de EKlm, que se confirma mediante el ensayo de actividad mostrado en la Figura 7C. Cabe señalar que EKlm de alta pureza (>90 %) se obtuvo mediante purificación adicional de P2 mediante el uso de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) (Figura 7B). Además, la actividad enzimática de cada fracción también se ensayó (Figura 7C) y se agrupó. Para Trx-enlazador-EKL, el rendimiento de replegamiento fue bastante bajo más allá de 40 pg/ml de Trx-enlazador-EKL durante el proceso de replegamiento (4,4 % a 40 pg/ml), lo que dificultaba prácticamente este proceso. En otras palabras, se requiere un tanque de almacenamiento enorme para producir una gran cantidad de EK (~ 1000 g).
El bajo rendimiento de replegamiento podría deberse a la agregación de proteínas causada por interacciones hidrofóbicas de proteínas. Después del mapeo de hidrofobicidad superficial de EKl basado en su estructura 3D, se encontró que el 133ALIY es uno de los parches más hidrofóbicos de la superficie. Por tanto, EKlm con 3 sustituciones (C112A, L134K e I135K) se construyó y se sometió a estudio. Mediante el uso de exactamente el mismo proceso, EKlm mejoró enormemente el rendimiento de replegamiento, especialmente cuando la concentración de EKlm en el tampón de replegamiento fue superior a 40 pg/ml, que es el punto débil para la producción a gran escala de EKl (Figura 3A). Como se muestra en la Figura 3A, a 40 pg/ml de concentración de Trx-enlazador-EKLM en el tampón de replegamiento, el rendimiento de replegamiento de Trx-enlazador-EKLM (17 %) fue 4 veces mayor que el de Trxenlazador-EKL (4,4 %). Además, ~ 16 mg de EKlm activa podría purificarse con un tanque de replegamiento de 1l en el que la concentración de EKlm es de 120 pg/ml.
La actividad enzimática específica entre EKl y EKlm se comparó como en la Figura 8. Las triples sustituciones de EKlm no tuvo ningún efecto aparente sobre la actividad enzimática, lo que se puso de manifiesto por el hecho de EKl y EKlm tienen bandas similares en SDS-PAGE si se aplican con la misma actividad. Además, EKlm era bastante estable si se almacenaba en tampón que contenía Tris 20 mM, NaCl 200 mM a -80 °C o 4 °C. No se observó degradación aparente ni disminución de la actividad hasta los 3 meses (Figura 9).
Ejemplo 4. Ensayos de enzimas
La actividad enzimática se midió directamente mediante el uso de un sustrato fluorogénico, GDDDDK-Beta-naftilamida. La reacción se inició con la adición de 1 ul de muestra en cada pocillo de una placa fluorescente de 96 pocillos que contenía 100 ul de tampón de reacción. Después de mezclar durante 10 segundos, se midió la fluorescencia con Fluostar OPTIMA (excitación a 340 nM y emisión a 420 nM). La actividad enzimática se definió por unidad arbitraria (EU), que se deriva de la pendiente*60/30000, donde la pendiente representa el intervalo lineal.
Ejemplo 5. Región enlazadora
Dos secuencias de aminoácidos de EKlm se produjeron conectadas a trx donde la región enlazadora difería, trxEKLM y trx-enlazador-EKLM (ver figura 10). En trx-enlazador-EKLM el espaciador entre trx y EKLM es 37 aminoácidos más largo que en trxEKLM.
TrxEKLM
Ruptura celular y solubilización de IB
7,41 g de sedimento celular de T hkEKlm se resuspendió en 100 ml de tampón de lisis (T ris 20 mM, pH 8,0) y las células se rompieron mediante el uso de un homogeneizador a una presión de 30 000 psi. Después de descartar el sobrenadante, los IB pesaron 3,53 g. Los IB aislados se resuspendieron en 70 ml de tampón de solubilización (Tris 20 mM, urea 8 M, pH 8,0, DTT 20 mM (recién añadido)) y se incubaron a 4°C durante 4 horas. Las muestras solubilizadas se clarificaron mediante centrifugación.
Replegado de ThkEKlm
Se diluyeron 16 ml de solución de IB en 500 ml de tampón de replegamiento (Tris 20 mM, GSSG 1 mM, GSH 3 mM, urea 1 M, pH 8,0) y se agitó a 20°C durante 54 horas. La concentración de proteína durante el replegamiento es de 60 |jg/ml.
Purificación de ThkEKlm
Columna: Columna Q HP
Tampón de muestra: Tris 20 mM, GSSG 1 mM, GSH 3 mM, DTT 0,62 mM, urea 1 M, pH 8,0 Tampones: Tampón A: Tris 20 mM, pH 8,0
Tampón B: Tris 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,0
Procedimiento: 10 CV 100 % A
Aplicación a 10 ml/min
5 CV 100 % A
7 CV 0 % B-70 % B
1 CV 70 % B-100 % B
1,5 CV 100 % B
Volumen de columna: 28 ml
Velocidad: 10ml/min
Las fracciones de elución con mayor actividad enzimática se combinaron dando como resultado un volumen agrupado de 30 ml y una actividad enzimática total de 14100 EU. La cantidad de proteína fue 2,82 mg.
T rx-enlazador-EKLM
Ruptura celular y solubilización de IB
66,9 g de sedimento celular de Trx-enlazadorEKLM se resuspendió en 1000 ml de tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 8,0) y las células se rompieron mediante el uso de un homogeneizador a una presión de 30000 psi. Después de descartar el sobrenadante, los IB pesaron 22 g y se lavaron una vez con 1000 ml de Tris 20 mM, pH 8,0. Después del lavado, la solución de IB se dividió en 6 botellas para centrifugación. Después de descartar el sobrenadante, se añadieron 41 ml de tampón de solubilización (Tris 20 mM, urea 8 M, pH 8,0, DTT 20 mM (recién añadido)) en una botella y se incubaron a 4°C durante 3 horas. Los IB solubilizados se clarificaron mediante centrifugación y el volumen final fue de 43 ml.
Replegado de Trx-enlazador-EKLM
Se diluyeron 9 ml de solución de IB en 500 ml de tampón de replegamiento (T ris 20 mM, urea 1 M, GSSG 1 mM, GSH 3 mM, pH 8,0) y se agitó a 20°C durante 18 horas. La concentración de proteína durante el replegamiento fue de 60 jg/ml.
Purificación de Trx-enlazador-EKLM
Columna: Columna Q HP
Tampón de muestra: Tris 20 mM, urea 1 M, GSSG 1 mM, GSH 3 mM, DTT 0,296 mM, pH 8,0 Tampones: Tampón A1: Tris 20 mM, urea 1 M, pH 8,0
Tampón A2: Tris 20 mM, pH 8,0
Tampón B: Tris 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,0
Procedimiento: 10 CV 100 % A1
Aplicación a 10 ml/min
5 CV 100 % A1
5 CV 100 % A2
7 CV 0 % B-70 % B (100 % A2-30 % A2)
1 CV 70 % B-100 % B (30 % A2-0 % A2)
1,5 CV 100 % B

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1, en donde dicho análogo comprende las sustituciones C112A, L134K e I135K, dicho análogo comprende menos de 10 modificaciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1, y dicho análogo tiene actividad de enteroquinasa proteasa.
  2. 2. Un método para obtener una solubilidad mejorada en un proceso de renaturalización de un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa que comprende la etapa de mutar los aminoácidos hidrofóbicos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1 a aminoácidos hidrofílicos y opcionalmente mutar otros aminoácidos de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje, en donde los aminoácidos hidrofóbicos sometidos a la mutación están presentes en la superficie de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de tipo salvaje plegada, dicho análogo comprende las sustituciones C112A, L134K e I135K, dicho análogo comprende menos de 10 modificaciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1, y dicho análogo tiene actividad de enteroquinasa proteasa.
  3. 3. Un método para la producción de un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina, en donde el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina es un análogo de acuerdo con la reivindicación 1, y en donde dicho método comprende las etapas:
    a) cultivar las células huéspedes en un medio de crecimiento que comprende un inductor, en donde las células huéspedes comprenden una secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos del análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa;
    b) recuperar las células con el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa en cuerpos de inclusión; c) solubilizar y replegar el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa; y
    d) purificar el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa.
  4. 4. Un método para producir de manera recombinante un péptido o proteína en una célula huésped bacteriana o de levadura, que comprende:
    a) expresar en levadura o bacteria una proteína de fusión que comprende el péptido o proteína a producir; b) escindir la proteína de fusión con el análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina de acuerdo con la reivindicación 1; y
    c) aislar el péptido o proteína producida.
  5. 5. Un método para producir de manera recombinante un péptido o proteína de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la proteína de fusión expresada en la etapa a) comprende además un sitio de escisión Asp-Asp-Asp-Asp-Lys.
  6. 6. Un método para producir de manera recombinante un péptido o proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en donde la célula huésped es E. coli.
  7. 7. Un método para producir de manera recombinante un péptido o proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el péptido o proteína a producir es un péptido de GLP-1.
ES12816050T 2011-12-23 2012-12-20 Cadena ligera de enteroquinasa modificada Active ES2819288T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011002169 2011-12-23
PCT/EP2012/076372 WO2013092855A1 (en) 2011-12-23 2012-12-20 Modified enterokinase light chain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2819288T3 true ES2819288T3 (es) 2021-04-15

Family

ID=47561561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12816050T Active ES2819288T3 (es) 2011-12-23 2012-12-20 Cadena ligera de enteroquinasa modificada

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9611466B2 (es)
EP (1) EP2794875B1 (es)
JP (1) JP6138151B2 (es)
CN (1) CN103998606B (es)
ES (1) ES2819288T3 (es)
WO (1) WO2013092855A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3083701B1 (en) * 2013-12-17 2019-08-07 Novo Nordisk A/S Enterokinase cleavable polypeptides
CN104911166A (zh) * 2014-12-15 2015-09-16 上海张江生物技术有限公司 一种新型重组鳉鱼肠激酶轻链蛋白质
WO2017118752A1 (en) * 2016-01-07 2017-07-13 Novo Nordisk A/S Modified enterokinase light chain and its preparation method
CN108265042A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 江苏万邦生化医药集团有限责任公司 一种重组肠激酶的制备方法
CN109136209B (zh) * 2018-07-18 2021-07-06 上海雅心生物技术有限公司 肠激酶轻链突变体及其应用
CN114774397B (zh) * 2022-06-20 2022-10-04 北京惠之衡生物科技有限公司 牛肠激酶轻链蛋白突变体及重组融合蛋白
CN114807101B (zh) * 2022-06-20 2022-09-16 北京惠之衡生物科技有限公司 包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU675506B2 (en) 1993-01-15 1997-02-06 Genetics Institute, Llc Cloning of enterokinase and method of use
KR19990073067A (ko) 1999-03-13 1999-10-05 문정복 레일천공기
KR100507980B1 (ko) 2002-06-18 2005-08-17 프로테온 주식회사 엔테로키나제 경사슬의 아미노말단 또는 카르복실말단이 변형된 재조합 엔테로키나제
CN1214107C (zh) * 2002-07-26 2005-08-10 刘建宁 一种具有高活性和高稳定性的肠激酶轻链变体
CN1869236A (zh) 2005-05-24 2006-11-29 上海新生源医药研究有限公司 一种重组牛肠激酶的生产方法
WO2008136014A1 (en) 2007-05-07 2008-11-13 Usv Limited Cloning and expression of enterokinase and its process for production
CN101624588B (zh) 2007-05-11 2012-02-22 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 重组牛肠激酶轻链突变体
CN102061302B (zh) 2010-11-26 2012-07-04 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 肠激酶轻链基因的合成及其表达产物的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20150064744A1 (en) 2015-03-05
JP2015502167A (ja) 2015-01-22
EP2794875B1 (en) 2020-07-22
JP6138151B2 (ja) 2017-05-31
WO2013092855A1 (en) 2013-06-27
EP2794875A1 (en) 2014-10-29
CN103998606B (zh) 2018-04-17
CN103998606A (zh) 2014-08-20
US9611466B2 (en) 2017-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2794875B1 (en) Modified enterokinase light chain
JP4538501B2 (ja) ポリペプチドのｃ末端修飾
BRPI0616054B1 (pt) Processo para a preparação de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, tripsina porcina, método para sua produção, dna e vetor
US20160083713A1 (en) Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases
WO2012104099A1 (en) Process for the production of recombinant trypsin
AU2004232405B2 (en) Cleavage of fusion proteins using granzyme B protease
Tan et al. Purification and refolding optimization of recombinant bovine enterokinase light chain overexpressed in Escherichia coli
Hauser et al. Expressed protein ligation using an N-terminal cysteine containing fragment generated in vivo from a pelB fusion protein
KR101634078B1 (ko) 봉입체 형성 단백질의 제조방법
KR20160077750A (ko) 재조합 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산 방법
Lu et al. The N-terminal α-helix domain of Pseudomonas aeruginosa lipoxygenase is required for its soluble expression in Escherichia coli but not for catalysis
ES2337684T3 (es) Carboxipeptidasa b recombinante y su purificacion.
CN112824527B (zh) 人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法
WO2017118752A1 (en) Modified enterokinase light chain and its preparation method
DK2643457T3 (en) COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR YOUR ENTEROKINASE PREPARATION
TW200531978A (en) Removal of n-terminal methionine from proteins by engineered methionine aminopeptidase
Austin et al. The substrate specificity of Metarhizium anisopliae and Bos taurus carboxypeptidases A: insights into their use as tools for the removal of affinity tags
TWI591177B (zh) 一種胰高血糖素胜肽－２（ｇｌｐ－２）類似物的製備方法
Zhang et al. Determination of the second autoproteolytic cleavage site of cephalosporin C acylase and the effect of deleting its flanking residues in the α-C-terminal region
Feeney et al. Novel protein purification system utilizing an N-terminal fusion protein and a caspase-3 cleavable linker
US20110045557A1 (en) Novel Fusion Carbonic Anhydrase/Cellulose Binding Polypeptide Encoded by a Novel Hybrid Gene, and Method of Creating and Using the Same
KR20210079235A (ko) Whep 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 수용성 증진 방법
Franke et al. Engineering the oxyanion hole of trypsin for promoting the reverse of proteolysis
CN114807101B (zh) 包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌
RU2495934C2 (ru) ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНЫЙ МУТЕИН [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА