ES2242270T3 - Cristalizacion de proteinas. - Google Patents

Cristalizacion de proteinas.

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ES2242270T3
ES2242270T3 ES98901323T ES98901323T ES2242270T3 ES 2242270 T3 ES2242270 T3 ES 2242270T3 ES 98901323 T ES98901323 T ES 98901323T ES 98901323 T ES98901323 T ES 98901323T ES 2242270 T3 ES2242270 T3 ES 2242270T3
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Jean Lesley Whittingham
Per Balschmidt
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Novo Nordisk AS
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Abstract

UN PROCEDIMIENTO PARA OBTENER CRISTALES QUE CONTENGAN ZINC DE UNA PROTEINA DERIVADA QUE TIENE UN RESIDUO LISINA QUE PORTA UN SUSTITUYENTE LIPOFILO EN EL GRUPO EP - AMINO QUE CONSISTE EN: A) FORMAR UNA SOLUCION DE LA PROTEINA DERIVADA EN UN TAMPON ALCALINO QUE CONTIENE ADEMAS UNA SAL DE ZINC; B) AJUSTAR EL PH DE LA SOLUCION A UN VALOR DE ENTRE 7 Y 10 Y C) AISLAR LOS CRISTALES FORMADOS.

Description

Cristalización de proteínas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para proporcionar cristales filtrables de complejos de zinc a partir de proinsulinas, insulinas y análogos de insulina que tienen un residuo de lisina portador de un sustituyente lipofílico en el grupo \varepsilon-amino.
Antecedentes de la invención
El aislamiento de proteínas farmacéuticas en el estado cristalino es importante, ya que los cristales pueden ser secados fácilmente y posteriormente almacenados a temperatura baja en condiciones en las que la estabilidad de la proteína bruta es óptima. Las insulinas y los análogos de insulina, donde el grupo \varepsilon-amino de un residuo de lisina contenido en la misma tiene un sustituyente lipofílico p. ej. en forma de un grupo acilo, tienen un perfil de acción prolongada y son prometedoras para el uso en la terapia basal de larga duración en el tratamiento de la DMID (diabetes mellitus insulinodependiente) y la DMNI (diabetes mellitus no insulinodependiente). La preparación de este tipo de insulinas aciladas y análogos de insulina se describe, entre otras, en la solicitud de patente japonesa 1-254,699 (Kodama), en WO 95/07931 (Novo Nordisk), en EP 0 712 862 A2 (Eli Lilly) y en WO 96/29344 (Novo Nordisk). Desafortunadamente, se ha observado que este tipo de insulinas aciladas y análogos de insulina son menos propensos a cristalizar que los compuestos originales no modificados.
Las proinsulinas, insulinas y análogos de insulina son proteínas bastante lábiles y su estabilidad depende, entre otras cosas, de la pureza de la preparación particular. Se puede esperar una estabilidad óptima cuando una preparación pura es mantenida en forma sólida, en particular en forma de cristales. Desafortunadamente, la precipitación de estos compuestos a partir de soluciones normalmente origina precipitados amorfos que son difíciles o imposibles de aislar por filtración. En cambio, pueden ser aislados por centrifugado. No obstante, cuando son aislados por centrifugado resulta difícil liberar eficientemente las partículas de la solución madre. Incluso aunque se puedan aislar partículas amorfas por filtración, el material amorfo normalmente será menos puro que los cristales correspondientes, ya que hay más impurezas introducidas en el material amorfo que en los cristales.
La preparación de cristales de insulina humana N\varepsilonB^{29}-(miristoil)des(B30) se describe en la solicitud de patente europea Nº 94926816.3 (EP 0 792290 B), cuya información técnica es presentada en el expediente (Ejemplo 33). Estos cristales sin zinc fueron precipitados con pH 9 a partir de etanol acuoso al 20% con contenido de cloruro sódico 0.625 M. Un método para la recuperación de proteínas aciladas, especialmente ciertas insulinas aciladas de ácidos grasos, por precipitación y filtración en forma de un polvo fluido, se describe en EP 0 747 391 A2 (Eli Lilly). Según este método, se obtiene un precipitado filtrable de una proteína ajustando el pH de una solución acuosa que contiene la proteína y añadiendo una cantidad adecuada de alcohol. No se menciona la formación de cristales.
JL Wittigham et al. (Biochemistry 36 (1997) 2826 - 2831) describen la cristalización de un complejo de zinc de insulina humana LysB^{29}tetradecanoil des(B30). Se descubrió que la presencia de fenol es esencial para la cristalización.
Para el uso en una terapia, las proteínas deben estar preparadas en una forma altamente purificada y las condiciones de almacenamiento deben asegurar que la degradación durante el almacenamiento sea mínima. Una insulina acilada o un análogo de insulina acilado en una forma altamente purificada se administra en forma de una solución de un complejo de zinc de la misma, en una composición que además comprende un compuesto fenólico. En consecuencia, sería conveniente en la producción almacenar la insulina acilada bruta, o el análogo de insulina acilado, en forma de cristales filtrables que contienen la insulina o el análogo de insulina, zinc y un compuesto fenólico.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un método mediante el cual se pueden obtener complejos de zinc de una insulina acilada o un análogo de insulina acilado, conteniendo también un compuesto fenólico, de forma filtrable y cristalina.
Según la invención, este objeto se alcanza mediante la precipitación de la insulina acilada o el análogo de insulina acilado a partir de un tampón acuoso.
Resumen de la invención
En consecuencia, en su aspecto más general, la presente invención se refiere a un método para proporcionar cristales que contienen zinc a partir de un derivado de proteína, que es proinsulina, una insulina o un análogo de insulina, cada uno con un residuo de lisina portador de un sustituyente lipofílico en el grupo \varepsilon-amino, dicho método comprendiendo
a)
proporcionar una solución del derivado en un tampón alcalino que además contiene una sal de zinc y un fenol,
b)
ajustar el valor de pH de la solución en un valor entre 7 y 10, y
c)
aislar los cristales formados.
En una forma de realización preferida, el derivado de proteína que tiene un residuo de lisina portador de un sustituyente lipofílico en el grupo \varepsilon-amino es una proinsulina, una insulina o un análogo de insulina, donde el grupo \varepsilon-amino de un residuo de lisina es portador de un grupo acilo.
En otra forma de realización preferida, el derivado de proteína es un derivado de insulina seleccionado del grupo que comprende insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30), insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil), insulina humana N^{\varepsilon B29}-(palmitoil), insulina humana N^{\varepsilon B28}-(miristoil)Lys^{B28}Pro^{B29}, insulina humana N^{\varepsilon B28}-(palmitoil)Lys^{B28}Pro^{B29}, insulina humana N^{\varepsilon B30}-(miristoil)Thr^{B29}Lys^{B30}, insulina humana N^{\varepsilon B30}-(palmitoil)Thr^{B29}Lys^{B30}, insulina humana N^{\varepsilon B29}-(N-palmitoil-\gamma-glutamil)des(B30), insulina humana N^{\varepsilon B29}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)des(B30) e insulina humana N^{\varepsilon B29}-(\omega-carboxiheptadecanoil)des(B30).
En otra forma de realización preferida, se añade una cantidad de fenol de aproximadamente un 1.5% (p/p) a aproximadamente un 10% (p/p), preferiblemente de aproximadamente un 1.5% (p/p) a aproximadamente un 3% (p/p), de la cantidad de proteína presente en la solución.
En otra forma de realización preferida, se añade un fenol seleccionado del grupo que comprende hidroxibenzeno, m-cresol, metilparabeno y etilparabeno.
En otra forma de realización preferida, el grupo lipofílico en el grupo \varepsilon-amino del residuo de lisina es un grupo acilo que tiene de 4 a 40, más preferiblemente de 10 a 40 átomos de carbono.
En otra forma de realización preferida, el grupo lipofílico en el grupo \varepsilon-amino del residuo de lisina es un grupo acilo de cadena recta.
En otra forma de realización preferida, el tampón está compuesto por amonio o una amina y un ácido.
En otra forma de realización preferida, el tampón está compuesto por amonio y ácido fosfórico.
En otra forma de realización preferida, el tampón está compuesto por amonio y un ácido carboxílico.
En otra forma de realización preferida, el tampón está compuesto por una amina y ácido fosfórico.
En otra forma de realización preferida, el tampón está compuesto por una amina y un ácido carboxílico.
En otra forma de realización preferida, si el tampón está compuesto por una amina y un ácido, la amina está seleccionada del grupo que comprende tris(hidroximetil)aminometano, 2-amino-2-metil-1,3-propandiol, 2-hidroxietilamina, y tris(2-hidroxietil)amina.
En otra forma de realización preferida, el tampón está compuesto por un compuesto anfolítico, preferiblemente ácido aspártico o N-tris(hidroximetil)metilglicina, y opcionalmente un ácido.
En otra forma de realización preferida, si el tampón está compuesto por amonio y un ácido carboxílico o una amina y un ácido carboxílico, el ácido carboxílico está seleccionado del grupo que comprende ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tartrónico y ácido tricarbalílico.
En otra forma de realización preferida, la concentración del amonio o la amina en el tampón es entre 0.1 M y 1 M, preferiblemente entre 0.2 M y 0.6 M.
En otra forma de realización preferida, la concentración del ácido fosfórico o el ácido carboxílico en el tampón es entre 0.05 M y 0.5 M, preferiblemente entre 0.05 M y 0.2 M.
En otra forma de realización preferida, la sal de zinc añadida a la solución es cloruro de zinc o una sal de zinc de un ácido carboxílico, preferiblemente una sal de zinc de uno de los ácidos siguientes: ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tartrónico y ácido tricarbalílico.
En otra forma de realización preferida, la sal de zinc se añade en una cantidad molar que se sitúa entre el 33% y el 150% de la cantidad molar del monómero péptido.
En otra forma de realización preferida, si el derivado de proteína que tiene un residuo de lisina portador de un sustituyente lipofílico en el grupo \varepsilon-amino es una proinsulina, una insulina o un análogo de insulina, donde el grupo \varepsilon-amino de un residuo de lisina es portador de un grupo acilo, el valor del pH de la solución en la que se lleva a cabo la precipitación de cristales es ajustado en un valor en la gama de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 8.5.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Tal y como se usa en el presente texto, la designación "insulina" se utiliza para designar cualquier insulina de origen natural. La designación "análogo de insulina" se utiliza para designar un péptido con actividad insulínica, formalmente derivado de una insulina de origen natural mediante el intercambio de uno o más residuos aminoácidos y/o la eliminación de uno o más residuos aminoácidos y/o la adición de uno o más residuos aminoácidos. Una "insulina acetilada" (o análogo de insulina) es una insulina (o análogo de insulina) que tiene un grupo acilo en el grupo \varepsilon-amino de un residuo de lisina contenido en dicha insulina (o análogo de insulina).
Formas de realización preferidas
La precipitación de los cristales según el presente método se realiza en agua, que opcionalmente contiene un co-solvente. Cuando se usa un co-solvente, este es preferiblemente un solvente miscible en agua p. ej. un alcohol.
Las operaciones que preceden a la precipitación de los cristales se realizan preferiblemente más o menos a la temperatura ambiente Después de permanecer de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 40 horas aproximadamente a temperatura ambiente, la mezcla reactiva es enfriada hasta una temperatura cercana a 0ºC, hasta que ya no se produce más precipitación de cristales, y los cristales son recogidos en un filtro. Si se desea, los cristales pueden ser lavados con una solución tampón helada correspondiente a la solución a partir de la cual se produjo la precipitación y con etanol helado.
Los componentes de la solución tampón deberían ser preferiblemente menos propensos a formar complejos de zinc que la insulina.
La presente invención está ilustrada con mayor detalle por medio de los ejemplos siguientes, los cuales, no obstante, no deben ser interpretados como limitadores del ámbito de protección tal y como se describe en las reivindicaciones anexas.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se utilizaron tres soluciones madre a), b) y c) durante la preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30). Estas soluciones ser prepararon de la siguiente manera:
Solución madre a)
Se disolvieron 12.11 g de tris(hidroximetil)aminometano en 80 ml de agua y el valor de pH de la solución fue ajustado en 8.30 mediante aproximadamente 7 ml de ácido clorhídrico 5 N. Entonces se añadió agua hasta un volumen final de 100 ml.
Solución madre b)
Se disolvieron 14.71 g de citrato trisódico dihidrato y 0.11 g de acetato de zinc dihidrato en agua y se añadieron 6.25 ml de una solución de fenol al 3% (p/v) en agua, y el volumen final de la solución fue ajustado hasta 100 ml.
Solución madre c)
Se disolvieron 1.471 g de citrato trisódico dihidrato y 2.422 g de tris(hidroximetil)aminometano en agua, y el volumen de la solución fue ajustado hasta 40 ml. El valor de pH fue ajustado en 8.1 usando ácido clorhídrico 5 N y finalmente el volumen fue ajustado con agua hasta 50 ml.
Cristalización de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30)
Se dispersó 1.00 g de polvo de insulina humana N^{B29}-(miristoil)des(B30) amorfa, obtenido como se describe en WO 95/07931, en una mezcla de 38 ml de agua y 2 ml de etanol absoluto, y se añadieron 40 ml de la solución madre a) con agitación. Cuando la insulina se disolvió, se añadieron 20 ml de la solución madre b) y el valor de pH de la mezcla fue ajustado en la gama de 8.1-8.2 mediante la adición de aproximadamente 1 ml de ácido clorhídrico 5 N. La mezcla fue dejada a temperatura ambiente con agitación lenta durante toda la noche y luego fue enfriada hasta 4ºC. Los cristales formados fueron recogidos en un filtro de 50 mm y rápidamente lavados con la solución madre c) helada. Una vez drenados, los cristales fueron lavados con 20 ml de etanol absoluto helado y los cristales drenados fueron secados al vacío.
Ejemplo 2 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando 2-amino-2-metil-1,3-propandiol en lugar de tris(hidroximetil)aminometano.
Ejemplo 3 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando 2-hidroxietilamina en lugar de tris(hidroximetil)aminometano.
Ejemplo 4 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando amonio en lugar de tris(hidroximetil)aminometano.
Ejemplo 5 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando tris(2-hidroxietil)amina en lugar de tris(hidroximetil)aminometano.
Ejemplo 6 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando N-tris(hidroximetil)metil-glicina en lugar de tris(hidroximetil)aminometano.
Ejemplo 7 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando ácido L-aspártico en lugar de tris(hidroximetil)aminometano.
Ejemplo 8 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando ácido L-aspártico en lugar de tris(hidroximetil)aminometano y ácido cítrico.
Ejemplo 9 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando acetato sódico en lugar de citrato trisódico.
Ejemplo 10 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando tartrato disódico en lugar de citrato trisódico.
Ejemplo 11 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando succinato disódico en lugar de citrato trisódico.
Ejemplo 12 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando fosfato de hidrógeno disódico en lugar de citrato trisódico.
Ejemplo 13 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando malato disódico en lugar de citrato trisódico.
Ejemplo 14 Preparación de cristales de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30) conteniendo zinc y fenol
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando malonato disódico en lugar de citrato trisódico.
Ejemplo 15 Cristalización de insulina humana N^{\varepsilon B28}-(miristoil)Lys^{B28}Pro^{B29}
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando insulina humana N^{\varepsilon B28}-(miristoil)Lys^{B28}
Pro^{B29} en lugar de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30).
Ejemplo 16 Cristalización de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(\omega-carboxiheptadecanoil)des(B30)
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando insulina humana N^{\varepsilon B29}-(\omega-carboxiheptadecanoil)des(B30) en lugar de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30).
Ejemplo 17 Cristalización de insulina humana N\varepsilonB^{29}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)des(B30)
Se repitió el procedimiento de cristalización según el ejemplo 1 usando insulina humana N\varepsilonB^{29}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)des(B30) en lugar de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30).
Ejemplo 18 Cristalización de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30)
El método de cristalización según el ejemplo 1 fue realizado usando cloruro sódico en lugar de tris(hidroximetil)aminometano siguiendo el procedimiento descrito a continuación.
Se usaron dos soluciones madre d) y e) durante el procedimiento de cristalización. Estas soluciones fueron preparadas de la siguiente manera:
Solución madre d)
Se disolvieron 14.71 g de citrato trisódico dihidrato, 5.844 g de cloruro sódico y 0.11 g de acetato de zinc dihidrato en aproximadamente 75 ml de agua y, después de la adición de 6.25 ml de una solución de fenol al 3% (p/v) en agua, el valor de pH fue ajustado en 8.1 usando hidróxido sódico 2 N y el volumen final de la solución fue ajustado hasta 100 ml.
Solución madre e)
Se disolvieron 1.471 g de citrato trisódico dihidrato y 2.922 g de cloruro sódico en aproximadamente 35 ml de agua. El valor de pH fue ajustado en 8.1 usando hidróxido sódico 2 N y finalmente el volumen fue ajustado con agua hasta 50 ml.
\newpage
Procedimiento de cristalización
Se dispersó 1.00 g de polvo de insulina humana N^{B29}-(miristoil)des(B30) amorfa en una mezcla de 78 ml de agua y 2 ml de etanol absoluto y el pH fue ajustado en 8.3 con NaOH 0.1 M. Cuando la insulina se disolvió, se añadieron 20 ml de la solución madre d) y el valor de pH de la mezcla fue ajustado en la gama de 8.1-8.2 mediante la adición de ácido clorhídrico 1 N. La mezcla fue lentamente agitada durante toda la noche a temperatura ambiente y luego enfriada hasta 4ºC. Los cristales formados fueron recogidos en un filtro plano de 50 mm y rápidamente lavados con la solución madre e) helada. Después del drenaje, los cristales fueron lavados con 20 ml de etanol absoluto helado y los cristales drenados fueron secados al vacío.

Claims (20)

  1. \global\parskip0.930000\baselineskip
    1. Método para proporcionar cristales que contienen zinc a partir de una proteína que es un derivado de proinsulina, insulina o un análogo de insulina, que tiene un residuo de lisina portador de un grupo acilo lipofílico en el grupo \varepsilon-amino, dicho método comprendiendo
    a)
    proporcionar una solución del derivado de proteína en un tampón alcalino, que además contiene una sal de zinc y un fenol,
    b)
    ajustar el valor de pH de la solución en un valor entre 7 y 10, y
    c)
    aislar los cristales formados.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el derivado de proteína es un derivado de insulina seleccionado del grupo que comprende insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil)des(B30), insulina humana N^{\varepsilon B29}-(miristoil), insulina humana N^{\varepsilon B29}-(palmitoil), insulina humana N^{\varepsilon B28}-(miristoil)Lys^{B28}Pro^{B29}, insulina humana N^{\varepsilon B28}-(palmitoil)Lys^{B28}Pro^{B29}, insulina humana N^{\varepsilon B30}-(miristoil)Thr^{B29}Lys^{B30}, insulina humana N^{\varepsilon B30}-(palmitoil)Thr^{B29}Lys^{B30}, insulina humana N^{\varepsilon B29}-(N-palmitoil-\gamma-glutamil)des(B30), insulina humana N^{\varepsilon B29}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)des(B30) e insulina humana N^{\varepsilon B29}-(\omega-carboxiheptadecanoil)des(B30).
  3. 3. Método según la reivindicación 1, en el que la cantidad de fenol añadida es de aproximadamente un 1.5% (p/p) a aproximadamente un 10% (p/p), preferiblemente de aproximadamente un 1.5% (p/p) a aproximadamente un 3% (p/p), de la cantidad de proteína presente en la solución.
  4. 4. Método según la reivindicación 1, en el que el fenol es seleccionado del grupo que comprende hidroxibenzeno, m-cresol, metilparabeno y etilparabeno.
  5. 5. Método según la reivindicación 1, en el que el grupo lipofílico es un grupo acilo que tiene de 4 a 40, más preferiblemente de 10 a 40 átomos de carbono.
  6. 6. Método según la reivindicación 1, en el que el grupo lipofílico es un grupo acilo de cadena recta.
  7. 7. Método según la reivindicación 1, en el que el tampón alcalino es un tampón que contiene nitrógeno.
  8. 8. Método según la reivindicación 7, en el que el tampón está compuesto por amonio o una amina y un ácido.
  9. 9. Método según la reivindicación 7, en el que el tampón está compuesto por amonio y ácido fosfórico.
  10. 10. Método según la reivindicación 7, en el que el tampón está compuesto por amonio y un ácido carboxílico.
  11. 11. Método según la reivindicación 7, en el que el tampón está compuesto por una amina y ácido fosfórico.
  12. 12. Método según la reivindicación 7, en el que el tampón está compuesto por una amina y un ácido carboxílico.
  13. 13. Método según la reivindicación 7, en el que el tampón está compuesto por un compuesto anfolítico, preferiblemente ácido aspártico o N-tris(hidroximetil)metilglicina, y opcionalmente un ácido.
  14. 14. Método según la reivindicación 11 o 12, en el que la amina está seleccionada del grupo que comprende tris(hidroximetil) aminometano, 2-amino-2-metil-1,3-propanodiol, 2-hidroxietilamina, y tris(2-hidroxietil)amina.
  15. 15. Método según la reivindicación 10 o 12, en el que el ácido carboxílico está seleccionado del grupo que comprende ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tartrónico y ácido tricarbalílico.
  16. 16. Método según la reivindicación 8, en el que la concentración del amonio o la amina en el tampón es entre 0.1 M y 1 M, preferiblemente entre 0.2 M y 0.6 M.
  17. 17. Método según la reivindicación 8, en el que la concentración del ácido fosfórico o el ácido carboxílico en el tampón es entre 0.05 M y 0.5 M, preferiblemente entre 0.05 M y 0.2 M.
  18. 18. Método según la reivindicación 1, en el que la sal de zinc añadida a la solución es cloruro de zinc o una sal de zinc de un ácido carboxílico, preferiblemente una sal de zinc de uno de los ácidos mencionados en la reivindicación 15.
  19. 19. Método según la reivindicación 1, en el que la sal de zinc se añade en una cantidad molar entre el 33% y el 150% de la cantidad molar del monómero péptido.
  20. 20. Método según la reivindicación 1, en el que el valor de pH está ajustado en un valor en la gama de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 8.5.
ES98901323T 1997-02-07 1998-02-03 Cristalizacion de proteinas. Expired - Lifetime ES2242270T3 (es)

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DK14697 1997-02-07
DK14697 1997-02-07

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