JPH09511647A

JPH09511647A - シンナモイルＣｏＡレダクターゼをコードしているＤＮＡ配列、および植物のリグニンレベル調節の分野におけるそれらの用途

Info

Publication number: JPH09511647A
Application number: JP7526135A
Authority: JP
Inventors: ブデ，アラン; プティナティ，ジャクリーヌ; ゴフネ，デボラ; ハルピン，クライアー; オコンネル，アン; ロムスタン，ミッシェル; ブーイルヤン，ワウト; ルプル，ジャン−シャルル
Original assignee: サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシェ・シャンティフィク
Priority date: 1994-04-11
Filing date: 1995-04-11
Publication date: 1997-11-25
Also published as: EP0755449B1; CA2185334A1; ES2233942T3; ATE283361T1; DE69533794D1; FR2718460A1; BR9507291A; AU2347295A; WO1995027790A2; AU705401B2; WO1995027790A3; US6015943A; EP0755449A1; FR2718460B1; DE69533794T2; NZ284823A; ZA952980B

Abstract

(57)【要約】シンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）をコードしているｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列の全部もしくは一部、またはそれらの相補的なヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列の全部もしくは一部をコード領域として含むＤＮＡ配列。本発明はまた、植物のリグニン生合成を調節する方法を実施するための該配列の用途にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】シンナモイルＣｏＡレダクターゼをコードしているＤＮＡ配列、および植物のリグニンレベル調節の分野におけるそれらの用途本発明の主題は、植物のシンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）をコードしているＤＮＡ配列、もしくはこれらの配列のいかなるものであってもよいフラグメント、または後者から誘導されるいかなるものであってもよい配列、あるいはそれらの相補的配列の、植物のリグニンレベルを調節する方法の実施の範囲内での用途である。リグニンは、特定の植物細胞の細胞壁を防水しかつ強化する、複合的で不均質な芳香族ポリマーである。リグニンは、ｐ−クマリルアルコール、コニフェリルアルコールおよびシナピルアルコールのようなモノリグノール類から誘導される遊離基の重合によって形成される［Higuchi（1985年）、Biosynthesis and degradation of wood compon ents（T．Higuchi編）、141〜160頁、Academic Press，Orlando，FL発行］。リグニン類は、それらの相対的なモノリグノールレベルが、生物種の、および同一植物内の様々な組織の関数として大きく変動する。この変動は、おそらく、リグニンモノマーの生合成に必要な酵素の、様々な活性および基質特異性に起因し、そしてそれらによって制御される［Higuchi（198 5年）、前掲］。植物の構造および発生におけるその役割以外にも、リグニンは、陸生バイオマスの主要な構成要素を代表し、大きな経済的、生態学的意義を引き受けている［ Brown（1985年）、J．Appl．Biochem．、第７巻371〜387頁；WhettenおよびSede roff(1991年)、Forest Ecology and Management、第43巻301〜316頁］。バイオマスの活用については、リグニンは、何よりもまず、飼料作物の消化性および栄養収率を限定する要因であることに留意しなければならない。事実、反芻動物による飼料作物の消化性は、これらの植物のリグニンレベルに反比例し、リグニン類の性質も、この現象における決定要因であることが、明確に立証されている［BuxtonおよびRoussel（1988年）、Crop．Sci.、第28巻553〜558頁；Jun gおよびVoge1（1986年）、J. Anin．Sci．、第62巻1,703〜1,712頁］。リグニン類のレベルを下げるのに役立つと思われる主な飼料作物のうちでも、アルファルファ、ウシノケグサ（fescue）、トウモロコシ、サイレージに用いられる飼料などを挙げることができる高いリグニンレベルは、ウシの飼料を意図したヒマワリケーキの限定された品質、および園芸領域での特定の種子の生存率の低下の部分的な原因であることにも留意しなければならない。収穫後の植物器官の貯蔵の際に生じる強度の木化は、アスパラガス、ヤムイモ、ニンジン等々のような作物を、急速に消費に不適格にすることも強調され得る。その上、製紙工業での紙パルプの生産の際に、毎年５千万トンを超えるリグニン類が木材から抽出されることにも留意しなければならない。セルロースを得るのに必要なこの抽出操作は、エネルギーに関しては経費を要し、そして第２に、抽出に用いられ、環境へと出て行く化合物により汚染する［DeanおよびEriksson （1992年）、Holzforschung、第46巻135〜147頁；WhettenおよびSederoff（1991 年）、前掲］。リグニン類の比率（種によって、乾燥材料の２０〜３０％を占める）を数％（２〜５％）に下げることは、収量の増加、すなわち実質的な節約（化学製品）を意味し、環境の改善（汚染の減少）に寄与すると思われる。木材が用いられる規模を考えるならば、これらの効果は、極めて有意義な影響を有すると思われる。この場合、関係する種は、ポプラ（poplar）、ユーカリノキ（eu calyptus）、アカシアAcacia mangium、モクマオウ属Casuarina、ならびに紙パルプの製造に用いられるすべての被子植物および裸子植物であり得ると思われる。考慮される二分野で、植物（または樹木）がその剛性という特性、およびその正常な構造を保持するためには、リグニンレベルの低下は、程々でなければならないことは明らかであるが、それは、細胞壁を補強するリグニン類が、植物の直立する習性を維持するのに重要な役割を果たしているからである。同じ種について自然界で観察されるリグニン類のレベルの自然な変動（個体間で乾燥質量の６〜８％まで変動し得る差）は、上記の低下を可能にする。リグニンの分解に対する耐性、およびその抽出の際に遭遇する困難は、おそらく、モノマー間のエーテルおよび炭素−炭素結合が構成するこのポリマーの複雑な構造によるばかりでなく、リグニンと、細胞壁の他の成分との間に存在する多数の化学結合のためである［SarkanenおよびLudwig（1971年）、「Lignins: Occ urrence，Formation，Structure and Reactions」（K.V．SarkanenおよびC.H．L udwig編）、１〜18頁、Wiley-Interscience，New York］。シンナモイル−ＣｏＡから出発する、植物でのリグニン類の生合成は、下記のようにして実施される：遺伝子工学の手段を用いて植物のリグニン類のレベルを下げようとする一つのアプローチは、上記に示したこれらリグニン類の生合成連鎖の酵素のうち１種類の合成を阻害することからなると思われる。そのようなアプローチの範囲内で特に適切な手法は、これらの酵素をコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡを用い、その結果、それらに対応するｍＲＮＡからのこれらの酵素の生産を、少なくとも部分的に阻害するという手法である。そのようなアンチセンスストラテジーは、タバコでＣＡＤをコードしている遺伝子を用いて実施され、ヨーロッパ特許出願第584 117号明細書の対象であったが、これは、植物のＣＡＤをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって、これらの植物でのリグニン類の生産を阻害できるアンチセンスｍＲＮＡの使用を記載している。この方法で形質転換した植物のレベルでの結果は、ＣＡＤの活性の低下を立証するが、逆説的に、リグニンレベルは変化を全く示さない。さらなる研究は、形質転換した植物のリグニン類は、シンナミルアルデヒドがリグニンポリマーに直接組み込まれることから、対照リグニン類とは異なることを示している。本発明の目的の一つは、厳密には、植物での正常なレベルに対比しての、リグニンレベルの認識し得る低下という意味と、これらのレベルの上昇という意味とのいずれにおいても、植物でのこれらのレベルが効果的に調節されることを可能にする方法を提供することである。本発明のもう一つの目的は、そのような方法を実施するための手段、および、より詳細には、植物の形質転換に利用できる構築物を提供することである。本発明のもう一つの目的は、遺伝的に形質転換された植物、特に形質転換されていない植物より消化可能であり得る飼料作物、または、紙パルプの製造のために形質転換され、形質転換されていない樹木の場合よりリグニンの抽出が容易であり、かつ汚染することが少ない植物もしくは樹木も提供することである。本発明のもう一つの目的は、環境からの攻撃、特に寄生生物の攻撃に対して、形質転換されていない植物より耐性である形質転換された植物、または（形質転換されていない植物より）大きいか、もしくは小さいサイズの形質転換された植物も提供することである。本発明の主題は、１つ（またはそれ以上）のコード領域を有する組換えヌクレオチド配列の用途であって、この（これらの）領域が： −メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしているヌクレオチド配列であって、このｍＲＮＡ自体は植物中のシンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）をコードしている、ヌクレオチド配列；または上記のヌクレオチド配列のフラグメントであって、このフラグメントはｍＲＮＡをコードしており、このｍＲＮＡ自体は植物中のＣＣＲのフラグメントをコードしており、このＣＣＲフラグメントは上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有している、フラグメント；または特に１以上のヌクレオチドを変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換することによって上記ヌクレオチド配列から誘導されたか、もしくは上記のフラグメントから誘導されたヌクレオチド配列であって、この誘導されたヌクレオチド配列はｍＲＮＡをコードし、このｍＲＮＡ自体は上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有している誘導されたタンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列、あるいは、 −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列の全部もしくは一部、このヌクレオチド配列のフラグメントの全部もしくは一部、または、上記に定義されたようにこれらから誘導された配列の全部もしくは一部に相補的なヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡのうち一つとハイブリダイズし得るアンチセンスヌクレオチド配列（アンチセンスｍＲＮＡとも呼ばれる）をコードしている相補的な配列、で構成され、植物中で生産される正常なリグニンレベルに対比して、生産されるリグニンレベルの上昇という意味と低下という意味とのいずれにおいても、リグニン類の生合成が調節されたトランスジェニック植物を得るための、植物細胞の形質転換を目的とする用途である。先行および後続する文中での表現「誘導されたヌクレオチド配列」とは、それが誘導された配列のヌクレオチドと少なくとも約５０％相同なヌクレオチドを有するいかなるものであってもよい配列を意味する。先行および後続する文中での「誘導されたタンパク質」とは、それが誘導されたタンパク質のアミノ酸と少なくとも約５０％相同なアミノ酸を有するいかなるものであってもよいタンパク質をも意味する。組換えヌクレオチド配列中のコード領域として用いられ得るヌクレオチド配列のうちでも、下記のものを主として挙げることができる： −配列番号２で示されるユーカリノキのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号４で示されるポプラのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号６で示されるウシノケグサのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号８で示されるタバコのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号７で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号１、３、５および７によってコードされているｍＲＮＡとそれぞれハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、配列番号１、３、５または７で示されるそれらに相補的なヌクレオチド配列、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、配列番号１、３、５もしくは７で示される配列から誘導されたヌクレオチド配列であって、それぞれ配列番号２、４、６もしくは８で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、またはそれらから誘導され、植物のこれらのＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質のいずれかをコードしている誘導された配列、特に、配列番号１から誘導され、配列番号９で示されるヌクレオチド配列であって、上記ユーカリノキＣＣＲから誘導された配列番号１０で示されるタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている配列、 −１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって上記の相補的ヌクレオチド配列から誘導されたヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡのうち一つとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導された配列。本発明の、より詳細な主題は、下記のものをコード領域として含むことを特徴とするいかなるものであってもよいＤＮＡ配列である： −配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号２で示される、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号１で示される配列から、またはこの配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしているか、または後者から誘導され、植物の上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をコードしている誘導された配列、特に、配列番号１から誘導され、配列番号９で示されるヌクレオチド配列であって、上記ユーカリノキＣＣＲから誘導された配列番号１０で示されるタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている誘導された配列。本発明の、より詳細な主題は、下記のものをコード領域として含むことを特徴とするいかなるものであってもよいＤＮＡ配列である： −配列番号４で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号４で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、一特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号３で示される配列から、またはこの配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号４で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしているか、または後者から誘導され、植物の上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をコードしている誘導された配列。本発明の、より詳細な主題は、下記のものをコード領域として含むことを特徴とするいかなるものであってもよいＤＮＡ配列でもある： −配列番号６で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号６で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号５で示される配列から、またはこの配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号６で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしているか、または後者から誘導され、植物の上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をコードしている誘導された配列。本発明の、より詳細な主題は、下記のものをコード領域として含むことを特徴とするいかなるものであってもよいＤＮＡ配列である： −配列番号８で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号７で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号８で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号７で示される配列から、またはこの配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号８で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしているか、または後者から誘導され、植物の上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をコードしている誘導された配列。植物に存在するＣＣＲ、より詳細には配列番号２、４、６および８で示されるＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質とは、Eur．J．Biochem ．（1981年）、第119巻115〜127頁中のLuderitzおよびGrisebachの方法に従って測定されるようなＣＣＲ活性を有するいかなるものであってもよいタンパク質という意味である。例示するならば、この方法は、該タンパク質（ＣＣＲまたは誘導体）の還元活性の分光光度法での測定によって、すなわち３６６nmでのシンナモイルＣｏＡの消滅の監視によって、実施される。反応は、３０℃で２〜１０分間で生起する。反応媒体の組成は下記のとおりである：５００μｌの総量中、リン酸緩衝液１００mM（pH６．２５）、０．１mMのＮＡＤＰＨ、７０μMフェルロイルＣｏＡ、酵素抽出物５〜１００μｌ。本発明の主題は、下記のものをコード領域として含むことを特徴とするいかなるものであってもよいＤＮＡ配列である： −配列番号１で示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号１で示される配列によってコードされているか、または、後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的な配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは該相補的配列のフラグメントから、上記のように誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導された配列、特に配列番号９で示される配列に相補的な配列。本発明の、より詳細な主題は、下記のものをコード領域として含むことを特徴とするいかなるものであってもよいＤＮＡ配列である： −配列番号３で示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号４で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号３で示される配列によってコードされているか、または、後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的な配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号４で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは該相補的配列のフラグメントから、上記のように誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導された配列。本発明の、より詳細な主題は、下記のものをコード領域として含むことを特徴とするいかなるものであってもよいＤＮＡ配列である： −配列番号５で示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号６で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号５で示される配列によってコードされているか、または、後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的な配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号６で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは該相補的配列のフラグメントから、上記のように誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、上記のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導された配列。本発明の、より詳細な主題は、下記のものをコード領域として含むことを特徴とするいかなるものであってもよいＤＮＡ配列である： −配列番号７で示されるそれに相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号８で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号７で示される配列によってコードされているか、または、後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的な配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号７で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは該相補的配列のフラグメントから、上記のように誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、上記のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導された配列。上記本発明の、配列番号１、３、５、７および９で示される配列、相補的配列、誘導された配列ならびに配列のフラグメントは、５′から３′への方向で示されていると考慮しなければならないことが、理解されるであろう。したがって、上記のような５′から３′への方向の相補的配列の最初のヌクレオチドは、ＣＣＲ（またはＣＣＲのフラグメントもしくは誘導されたタンパク質）を５′から３′への方向でコードしている配列の最後のヌクレオチドの相補物であり、該相補的配列の２番目のヌクレオチドは、ＣＣＲをコードしている配列の最後から２番目のヌクレオチドの相補物であり、以下、ＣＣＲをコードしている配列の最初のヌクレオチドの相補物である、該相補的配列の最後のヌクレオチドまで同様である。上記の相補的配列がコードしているｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡを５′から３′への方向で示したときは、その最初のヌクレオチドは、ＣＣＲをコードしている配列の最後のヌクレオチドに対応し、そのため、後者がコードしているｍＲＮＡの最後のヌクレオチドとハイブリダイズし、一方、その最後のヌクレオチドは、ＣＣＲをコードしている配列の最初のヌクレオチドに対応し、そのため、後者がコードしているｍＲＮＡの最初のヌクレオチドとハイブリダイズする。このようにして、先行および後続する文脈中でのアンチセンスｍＲＮＡとは、前記の相補的配列がコードしているいかなるものであってもよいｍＲＮＡを意味し、ＣＣＲ（またはＣＣＲのフラグメントもしくは誘導タンパク質）をコードしている配列がコードしているｍＲＮＡが示されるのとは反対の方向（３′から５ ′へ）で示されるが、最後に挙げたこのｍＲＮＡは、依然として（５′から３′ への）方向のｍＲＮＡと呼ばれる。したがって、アンチセンスＲＮＡという用語は、メッセンジャーＲＮＡの塩基の配列に相補的なＲＮＡ配列を意味し、相補的という用語は、このようにして、アンチセンス配列（３′から５′への方向に読まれる）の各塩基（または大部分の塩基）が、メッセンジャーＲＮＡ（５′から３′への方向に読まれる配列）の対応する塩基（ＧがＣに、ＡがＵに）と対になり得ることであると理解しなければならない。本発明の範囲内でのアンチセンスＲＮＡストラテジーは、植物のリグニンレベルを改変するという目的に特に適した分子的アプローチである。アンチセンスＲＮＡは、非コード化ＤＮＡ鎖（ナンセンス鎖）の転写によって生産されるＲＮＡである。このアンチセンスストラテジーは、より詳細には、ヨーロッパ特許第240 208 号に記載されている。アンチセンスストラテジーによるタンパク質、本事例ではＣＣＲの、合成の阻害は、２つの相補的なＲＮＡ（センスおよびアンチセンス）間に二本鎖が形成され、それによりタンパク質の生産が阻害される結果であると考えられる。しかし、その機序は不明確なままである。このＲＮＡ−ＲＮＡ複合体は、ｍＲＮＡのその後の転写、あるいはプロセシング、輸送または翻訳のいずれかを妨げ、あるいはｍＲＮＡの分解を導くことさえあり得る。これらの効果の組合せも可能である。本発明はまた、本発明によるＤＮＡ配列がコードしているいかなるものであってもよいｍＲＮＡに関し、より詳細には： −配列番号１で示されるＤＮＡ配列がコードしているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列がコードしているｍＲＮＡであって、これはまた、ユーカリノキに存在し、配列番号２で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメントもしくは上記に定義されたような誘導タンパク質、特に配列番号１０で示されるタンパク質をコードできるｍＲＮＡ、 −配列番号３で示されるＤＮＡ配列がコードしているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列がコードしているｍＲＮＡであって、これはまた、ポプラに存在し、配列番号４で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメントもしくは上記に定義されたような誘導タンパク質をコードできるｍＲＮＡ、 −配列番号５で示されるＤＮＡ配列がコードしているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列がコードしているｍＲＮＡであって、これはまた、ウシノケグサに存在し、配列番号６で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメントもしくは上記に定義されたような誘導タンパク質をコードできるｍＲＮＡ、 −配列番号７で示されるＤＮＡ配列がコードしているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列がコードしているｍＲＮＡであって、これはまた、タバコに存在し、配列番号８で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメント、もしくは、上記に定義されたような誘導タンパク質をコードできるｍＲＮＡにも関する。また、本発明の主題は、上記のようなアンチセンスｍＲＮＡであり、このアンチセンスｍＲＮＡは本発明による上記のようなｍＲＮＡを構成するヌクレオチドの全部または一部のみの相補的ヌクレオチドを含み、該ｍＲＮＡとハイブリダイズ（または対合）できることを特徴とする、いかなるものであってもよいアンチセンスｍＲＮＡである。その限りで、本発明のより詳細な主題は、本発明によるＤＮＡ配列がコードしているアンチセンスｍＲＮＡであって、本発明の上記ＤＮＡ配列の相補的配列の一つの５０塩基の領域と相同な５０塩基の領域を少なくとも一つ含むアンチセンスｍＲＮＡである。本発明によるアンチセンスＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列には、大きさの上限はない。すなわち、それらは、これらの細胞で通常生産されるメッセンジャーのサイズと同程度の長さであり得、ＣＣＲのｍＲＮＡをコードしているゲノムＤＮＡ配列と同程度の長さでさえあり得る。好都合には、本発明によるアンチセンスＲＮＡをコードしているそのようなＤＮＡ配列は、約１００〜約１，０００の塩基対を有する。本発明の、より詳細な主題は、１個（もしくはそれ以上）の上記のアンチセンスｍＲＮＡ、またはこの（これらの）アンチセンスｍＲＮＡのフラグメント、および、リボザイムのための１ケ所（もしくはそれ以上）の触媒ドメインに対応する１個（もしくはそれ以上）の配列を含むいかなるものであってもよいアンチセンス配列である。その限りで、本発明の、より詳細な主題は上記のいかなるものであってもよいアンチセンス配列であって、上記の本発明のｍＲＮＡのうち一つに含まれるＧＵＸユニット（Ｘは、Ｃ、ＵまたはＡを表す）に接する配列の約８個の相補的な塩基の腕によりいずれかの側が隣接されているリボザイムのための触媒ドメインを有する、上記のいかなるものであってもよいアンチセンス配列である（標的ＲＮＡとも呼ばれる）［Haseloff J．およびGerlach W.L．（1988年）、Natur e、第334巻585〜591頁］。本発明はまた上記のアンチセンス配列をコードできるいかなるものであってもよいＤＮＡ配列であって、本発明の１以上のアンチセンスｍＲＮＡ、またはアンチセンスｍＲＮＡフラグメント（好都合には、上記の約８塩基のフラグメント）に関連するリボザイムのための少なくとも１ケ所の触媒ドメインを有するＤＮＡ配列に関する。本発明の、より詳細な主題は、下記を含むいかなるものであってもよいアンチセンス配列である： −配列番号１で示される配列に相補的なヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とし、配列番号１で示されるＤＮＡ配列がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得る、上記のいかなるものであってもよいアンチセンスｍＲＮＡ、 −配列番号３で示される配列に相補的なヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とし、配列番号３で示されるＤＮＡ配列がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得る、上記のいかなるものであってもよいアンチセンスｍＲＮＡ、 −配列番号５で示される配列に相補的なヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とし、配列番号５で示されるＤＮＡ配列がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得る、上記のいかなるものであってもよいアンチセンスｍＲＮＡ、 −配列番号７で示される配列に相補的なヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とし、配列番号７で示されるＤＮＡ配列がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得る、上記のいかなるものであってもよいアンチセンスｍＲＮＡ、 −配列番号９で示される配列に相補的なヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とし、配列番号９で示されるＤＮＡ配列がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得る、上記のいかなるものであってもよいアンチセンスｍＲＮＡ。本発明はまた、本発明のＤＮＡ配列がコードしている組換えポリペプチドであって、この組換えポリペプチドは植物中のＣＣＲの酵素活性と同等な酵素活性を有するポリペプチド、より詳細には、配列番号１、３、５および７で示される配列、またはこれらから誘導された本発明による配列、特に配列番号９がコードしている組換えＣＣＲに関する。本発明のより詳細な主題は、本発明によるＤＮＡ配列を含む上記に定義されたような組換えヌクレオチド配列を、安定的な方式で植物細胞のゲノムに、特に以下に記載のベクターを用いて組み込むことによる植物細胞の形質転換によって得られるような、組換えポリペプチド、特に組換えＣＣＲである。「組換えポリペプチド」という表現は、対応する遺伝子のＤＮＡの転写段階を用いて、遺伝子工学によって生産できるポリペプチド鎖を有するいかなるものであってもよい分子であると理解されなければならない。この転写は、ＲＮＡの取得へと続き、次いで、これが（イントロンのサプレッションによって）ｍＲＮＡへと変換され、そうして、後者はリボソームによってタンパク質の形態に翻訳されるが、そのすべては、宿主細胞の内部の適切な調節要素の制御下で実施される。したがって、用いられる「組換えポリペプチド」という表現は、該ポリペプチドが、グリコシル化された基のような他の基を有する可能性を排除しない。当然、用語「組換え」は、ポリペプチドが遺伝子工学によって生産されたことを示す。なぜならそれは、適切な宿主細胞での、該宿主細胞を形質転換するのに用いた発現ベクターに予め導入された、対応するヌクレオチド配列の発現から得られるからである。しかし、この用語「組換え」は、ポリペプチドが、異なる方法、例えば、タンパク質の合成に用いられる公知の方法による標準的な化学合成によって、または、それよりはるかに大きい分子のタンパク質分解による切断によって生産された可能性を排除しない。より詳細には、本発明は、ユーカリノキの細胞中に存在し、配列番号２で示されるようなＣＣＲ、ポプラの細胞中に存在し、配列番号４で示されるようなＣＣＲ、ヒロハノウシノケグサの細胞中に存在し、配列番号６で示されるようなＣＣＲ、またはタバコの細胞中に存在し、配列番号８で示されるようなＣＣＲに、あるいは、特に１以上のアミノ酸の付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、これらから誘導されたいかなるものであってもよいタンパク質、特にユーカリノキＣＣＲから誘導され、配列番号１０で示されるタンパク質、または該ＣＣＲもしくはそれらの誘導配列に由来するいかなるフラグメントにも関するが、ここで、該フラグメントおよび誘導配列は、上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有し得る。本発明の主題はまた、配列番号２、４、６、８もしくは１０で示されるＣＣＲをコードしているヌクレオチド配列、または、上記に定義したようにこれらから誘導されたいかなるものであってもよい配列もしくはこれらのフラグメントであり、このヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１、３、５、７もしくは９で示される配列の全部または一部に、あるいは遺伝暗号の縮重によってこれらから誘導されたいかなる配列にも対応することを特徴とするが、それにもかかわらず該ＣＣＲ、または、上記に定義されたようにこれらから誘導された配列もしくはフラグメントをコードできるヌクレオチド配列である。本発明の主題はまた、植物中のＣＣＲの全部または一部をコードできる、上記のアンチセンスｍＲＮＡと、本発明によるｍＲＮＡとの間に形成された複合体である。本発明の、より詳細な主題は、配列番号１の配列がコードしているｍＲＮＡと、配列番号１の配列に相補的な配列がコードしているアンチセンスｍＲＮＡとの間、配列番号３の配列がコードしているｍＲＮＡと、配列番号３の配列に相補的な配列がコードしているアンチセンスｍＲＮＡとの間、配列番号５の配列がコードしているｍＲＮＡと、配列番号５の配列に相補的な配列がコードしているアンチセンスｍＲＮＡとの間、配列番号７の配列がコードしているｍＲＮＡと、配列番号７の配列に相補的な配列がコードしているアンチセンスｍＲＮＡとの間、配列番号９の配列がコードしているｍＲＮＡと、配列番号９の配列に相補的な配列がコードしているアンチセンスｍＲＮＡとの間に形成された複合体である。本発明の主題は、下記のもので構成される１つ（またはそれ以上）のコード領域を有するいかなるものであってもよい組換えヌクレオチド配列でもある： −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列であって、このｍＲＮＡ自体は植物中のＣＣＲをコードしているヌクレオチド配列；または上記のヌクレオチド配列のフラグメントであって、このフラグメントはｍＲＮＡをコードしており、このｍＲＮＡ自体は植物中のＣＣＲのフラグメントをコードしており、このＣＣＲフラグメントは上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有しているフラグメント；または特に１以上のヌクレオチドを変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換することによって上記のヌクレオチド配列から誘導されたかもしくは上記のフラグメントから誘導されたヌクレオチド配列であって、この誘導されたヌクレオチド配列はｍＲＮＡをコードし、このｍＲＮＡ自体は上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有している誘導されたタンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列、あるいは、 −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列の、または該配列のフラグメントの、または、上記に定義されたようにこれらから誘導された配列の、全部もしくは一部に相補的なヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡのうち一つとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的配列。本発明の、より詳細な主題は、上記に記載されたものから選ばれ、異種配列に挿入される、本発明による少なくとも一つのＤＮＡを含むことを特徴とするいかなるものであってもよい組換えヌクレオチド配列（または組換えＤＮＡ）でもある。より詳細には、本発明は、配列番号１、３、５もしくは７で示されるヌクレオチド配列、またはフラグメントもしくは上記に定義されたようにこれらから誘導されたヌクレオチド配列をコード領域として含む、上記のいかなるものであってもよい組換えヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列または該フラグメントが異種配列に挿入され、それぞれ配列番号２、４、６もしくは８で示されるＣＣＲ、またはこれらのＣＣＲのフラグメント、もしくは、上記に定義されたようにこれらから誘導されたタンパク質をコードできる、ヌクレオチド配列に関する。より詳細には、本発明は、更に、配列番号１、３、５もしくは７で示される配列に相補的なヌクレオチド配列、またはフラグメントもしくは該相補的配列から上記に定義されたように誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列をコード領域として含む、いかなるものであってもよい組換えヌクレオチド配列であって、該相補的配列または該フラグメントが異種配列に挿入され、植物中のＣＣＲをコードしているｍＲＮＡの全部または一部と、より詳細には、それぞれ配列番号２、４、６または８で示されるＣＣＲをコードしているｍＲＮＡの全部もしくは一部とハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードできる、ヌクレオチド配列に関する。本発明による組換えＤＮＡは、更に、ＣＣＲをコードしているヌクレオチド配列の、または本発明によるアンチセンスｍＲＮＡをコードしているその相補的配列の発現を調節するのに必要な要素、特にこれらの配列の転写のプロモーターおよびターミネーターを含むことを特徴とする。本発明による組換えＤＮＡの構築に用いられ得る様々なプロモーターのうちで、下記のものを挙げることができる： −植物でのＣＣＲの発現を制御する内在性プロモーター、特にユーカリノキの配列番号１で示される配列より上流に位置するプロモーター、もしくは −構成型の強発現プロモーター、例えば：³⁵Ｓ−ＣＡＭＶ（［Benefeyら（199 0年）、EMBO J．、第９巻第６号1,677〜1,684頁］に記載）、EFlalpha（Curieら（1991年）［Nucl．Acids Res.、第19巻1,305〜1,310頁］が記載した、タンパク質合成の際の鎖伸長因子を有する遺伝子のプロモーター）、 −個々の組織での特定の発現のための特異的プロモーター、例えば：ＣＡＤプロモーター（C．Feuillet（1993年）［ツールーズ大学第三学位論文］が記載）、特定の維管束組織での発現のためのプロモーターＧＲＰ１−８（Kell erおよびBaumgartner（1991年）［Plant Cell、第３巻1,051〜1,061頁］が記載）。本発明はまた、上記のような、植物でのリグニンの生合成の一段階に関与する、ＣＣＲ以外の酵素をそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、特にシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）をコードしているｍＲＮＡの全部もしくは一部をコードしている、少なくとも一つのヌクレオチド配列もコード領域として含むか、または上記ｍＲＮＡ、特にＣＡＤをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡの全部もしくは一部をコードしている、少なくとも一つのヌクレオチド配列もコード領域として含む、いかなるものであってもよい組換えヌクレオチド配列にも関する。上記の本発明の組換えヌクレオチド配列は、植物でのリグニンの生合成に必要な酵素をコードしているＤＮＡ配列が挿入された、ベクターから好都合に得られる。例示するならば、本発明のより詳細な主題はｐＥＵＣＣＲと呼ばれるベクターであって、Bluescriptというベクター中にクローニングされた配列番号１で示される配列を含み、1994年３月17日、受託番号Ｉ−１４０５のもとにパリ（フランス国）のパスツール研究所のCollection Nationale de Culture de Micro-organ isms（ＣＮＣＭ）に、大腸菌のＤＨ５alphaという細胞中の培養物として寄託された。上記ベクターを、それらに挿入されている該ＤＮＡ配列を回収するために、適切な制限酵素を用いて、消化する。次いで、これらのＤＮＡ配列を、本発明による組換えＤＮＡ内の、発現のための適切なプロモーターより下流に、そして適切なターミネーターより上流に挿入する。より詳細には、本発明の主題は、配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号１で示される配列を含む組換えＤＮＡであって、上記ｐＥＵＣＣＲベクターの消化、本発明のＤＮＡ配列の回収、ならびに後者の、該配列の発現のプロモーターおよびターミネーターを含む異種ＤＮＡ配列への５′から３′への方向での挿入によって得られるような組換えＤＮＡである。本発明の、より詳細な主題は、配列番号１の配列に相補的な配列を含む組換えＤＮＡであって、配列番号２で示されるＣＣＲをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている組換えＤＮＡであり、上記ｐＥＵＣＣＲベクターの消化、本発明のＤＮＡ配列の回収、ならびにこのＤＮＡの、該相補配列の発現のプロモーターおよびターミネーターを含む異種ＤＮＡへの逆方向での、すなわち３′から５′への方向での挿入によって得られるような組換えＤＮＡである。そのような構築物に用いられ得るターミネーターの実例としては、Agrobacter ium tumefaciensのノパリン合成酵素の遺伝子の３′末端を挙げることができる。したがって、一般的な方式では、ＣＣＲ（またはＣＣＲフラグメントもしくは誘導タンパク質）、および／またはリグニンの生合成に必要な他の酵素をコードしているＤＮＡ配列を含む、本発明による組換えヌクレオチド配列は、上記ベクターからの該ＤＮＡ配列の回収、および異種配列への該配列の挿入によって得られるが、本発明によるアンチセンスｍＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列を含む組換えヌクレオチド配列は、上記ＤＮＡ配列の回収、および該異種配列へのこのＤＮＡの逆方向での挿入によって得られる。例示するならば、上記組換えＤＮＡを構築するために、配列番号１、３、５、７もしくは９で示される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の全部または一部、あるいはＣＣＲに対応するゲノムクローン（上記ｃＤＮＡ＋可能なイントロンに対応する）の全部または一部を用い得る。このゲノムクローンは、該ｃＤＮＡを遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いて得ることができ、遺伝子ライブラリー自体はSambrook、FritschおよびManiatis［「Molecular Clo ning Laboratory Manual」、Cold Spring Harbour Laboratory Press（1989年）発行］が記載した方法に従って得られる。本発明の主題はまた、植物の形質転換に用いられ得る組換えベクターであって、その植物ゲノムの、その複製に不可欠ではない部位のうち１ケ所に組込まれた、上記のものから選ばれる本発明による組換えヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクターである。植物の形質転換に用いられ得る上記組換えベクターのうちで、ｐＢＩＮ１９から誘導されたバイナリーベクターを挙げることができる［Bevanら（1984年）、Nucl．Acids Res.、第12巻第22号8,711〜8,721頁］。本発明による組換えベクターの構築の実例は、以下の本発明の詳細な説明に記載する。本発明の主題は、植物でのリグニンの生合成を、これらの植物で生産されるリグニンの標準の量に対比して、生産されるリグニンの量を減少または増加させることによって調節する方法であって、この方法は、以下を含むベクターを用いてこれらの植物の細胞を形質転換する段階を含む： −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列であって、このｍＲＮＡ自体は植物中のＣＣＲをコードしているヌクレオチド配列；または上記のヌクレオチド配列のフラグメントであって、このフラグメントはｍＲＮＡをコードしており、このｍＲＮＡ自体は植物中のＣＣＲのフラグメントをコードしており、このＣＣＲフラグメントは上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有しているフラグメント；または特に１以上のヌクレオチドを変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換することによって上記のヌクレオチド配列から誘導されたかもしくは上記のフラグメントから誘導されたヌクレオチド配列であって、この誘導されたヌクレオチド配列はｍＲＮＡをコードし、このｍＲＮＡ自体は上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有している誘導されたタンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列、あるいは、 −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列の、または該配列のフラグメントの、もしくは、上記に定義されたようにこれらから誘導された配列の全部もしくは一部に相補的であり、上記ｍＲＮＡのうちの一つとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的な配列。この形質転換は特に上記のベクターを用いて行われる。本発明の、より詳細な主題は、植物での生合成によって生産されるリグニンの量を減少させる方法であって、この方法はこれらの植物のゲノムに以下を組み込むことによって、形質転換することにより行われる： −配列番号２、４、６もしくは８で示されるＣＣＲ、または、これらから、上記に定義されたように誘導されたタンパク質、特に配列番号１０で示されるタンパク質をコードしているｍＲＮＡの全部もしくは一部とハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、本発明による上記の少なくとも一つのＤＮＡ配列；および、 −適切ならば、植物でのリグニン生合成の一段階に関係する、ＣＣＲ以外の酵素をコードしているｍＲＮＡ、特にＣＡＤをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、少なくとも一つのＤＮＡ配列、を組み込むことにより該形質転換が行われ、 −ＣＣＲ、または、上記に定義されたように誘導されたタンパク質をコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列と、適切ならば、上記に定義されたような、ＣＣＲ以外の酵素をコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、一つまたはそれ以上のＤＮＡ配列とを含む上記の組換えベクターを用いるか、あるいは −少なくともそのうちの一つは、ＣＣＲ、または、上記に定義されたように誘導されたタンパク質をコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列を含むが、他の組換えベクターは、上記に定義されたような、ＣＣＲ以外の酵素をコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、一つまたはそれ以上のＤＮＡ配列を含む、数個の組換えベクターを用いるかのいずれかである。植物での生合成によって生産されるリグニンの量を減少させるもう一つの方法は、これらの植物のゲノムに以下を組み込むことによって、形質転換することにより行われる： −配列番号１、３、５もしくは７で示される少なくとも一つの本発明によるＤＮＡ配列、またはフラグメント、もしくは、後者から上記に定義されたように誘導された配列、特に配列番号９で示される配列、および −適切ならば、植物でのリグニン生合成の一段階に関係する、ＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしている、少なくとも一つのＤＮＡ配列、特にＣＡＤの全部または一部をコードしているＤＮＡ配列、を組み込むことにより、この形質転換が行われ、 −本発明による上記ＤＮＡ配列、またはフラグメント、もしくは、後者から上記に定義されたように誘導された配列と、適切ならば、上記に定義されたようなＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしている一つまたはそれ以上のＤＮＡ配列とを含む、上記の組換えベクターを用いるか、あるいは −少なくともそのうちの一つは、本発明による上記ＤＮＡ配列、またはフラグメント、もしくは、後者から上記に定義されたように誘導された配列を含むが、残りの組換えベクターは、上記に定義されたようなＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしているＤＮＡ配列を含む、数個の組換えベクターを用いる。この最後の方法は、共同サプレッション（co-suppression）の機序を必要とする。共同サプレッションは、内在性遺伝子のコピーをゲノムに導入したときに観察された。共同サプレッションの機序は現在は未知であるが、最も多く受け入れられている仮説の一つは、遺伝子の発現の負の調節は、トランス遺伝子の「誤った」鎖の読みによって、トランス遺伝子から誘導された少量のアンチセンスＲＮＡの生産の結果生じ得る［Griersonら、Trend sBiotech．、第９巻122〜123頁］というものである。本発明の主題はまた、植物での生合成によって生産されるリグニンの量を減少させる方法であって、この方法は、これらの植物のゲノムに、上記本発明のＤＮＡ配列を組み込むことによる形質転換によって行われ、このＤＮＡ配列は一つ（もしくはそれ以上）の本発明のアンチセンスｍＲＮＡ、またはアンチセンスｍＲＮＡフラグメントに関連するリボザイムのための１ケ所（もしくはそれ以上）の触媒ドメインを含むアンチセンス配列をコードし、この形質転換は、本発明による組換えヌクレオチド配列（それ自体は上記ＤＮＡ配列を有する）を含む組換えベクターを用いて実施される。上記の方法は、（アンチセンスｍＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列の挿入のレベル、ゲノムに組み込まれたこのＤＮＡ配列のコピー数などによる）様々なレベルのＣＣＲ活性の低下、したがってリグニンレベルの低下を有する、形質転換された植物が生産されるのを可能にすることに留意することが重要である。したがって、形質転換体の選択は、この植物の正常な発生に適合したリグニンレベルの、制御された調整を可能にすることになる。一般的な方式では、植物のリグニンの正常な平均的レベルが、乾燥物質重量の約１５％〜約３５％の間で変動することを考慮するならば、上記方法のうちの一つを実施することによって生じるリグニンのレベルの低下は、このようにして形質転換された植物が、約１０％〜約３０％または約１２％〜約３２％の範囲で変動するリグニンの平均的レベルを有するようなものであるのが好都合である。例示するならば、植物のリグニンレベルは、Johnsonら（1961年）［T.A.P.P.I .、第44巻793〜798頁］の方法の変法に従って測定できるが、これはAlibertおよびBoudet（1979年）、Physiol．Veg．、第17巻第１号67〜74頁に詳細に記載され、その主な段階は、下記のとおりである：植物材料のリグニンを含有するベンゼンアルコール粉末を得た後に、このリグニンを臭化アセチルで可溶化し、紫外でのそれらの吸収の関数として分析する。本発明の、より詳細な主題は、植物のリグニンレベルを低下させるための上記方法の用途であって、これらの植物は正常なリグニンレベルに対比して低下したリグニンレベルを有し、このようにして、形質転換されていない同種の植物に対比してその消化性が改良されている、遺伝的に形質転換された飼料作物を得るための用途である。本発明の範囲内で形質転換できる主な飼料作物のうちで、サイレージ用のアルファルファ、ウシノケグサ、トウモロコシ等々を挙げることができる。本発明はまた、植物のリグニンレベルを低下させるための、すなわち、遺伝的に形質転換された植物、より詳細には樹木を得るための上記方法の用途に関し、これらの植物は正常なリグニンレベルに対比して低下したリグニンレベルを有し、これらの植物または樹木は、紙パルプの生産の範囲内での用途に特に好都合である。ＣＣＲ遺伝子の発現の負の調節のための上記方法の用途の第三の可能性のある分野は、形質転換された植物の成長の刺激に関する。様々な議論［Sauterおよび Kende（1992年）、Plant and Cell Physiology、第33巻第８号1,089頁］が、早期の急速な木化は、細胞の肥大、したがって植物の成長に対するブレーキとして作用することを強調している。したがって、上記方法の実施は、このようにして低下した木化で形質転換した植物の、より良好な生長、したがってより良好な収率を可能にすることができる。本発明はまた、植物での生合成によって生産されるリグニンの量を増加させる方法に関し、この方法はこれらの植物のゲノムに以下のものを組み込むことにより、ゲノムを形質転換することによって行われる： −配列番号１、３、５もしくは７で示される少なくとも一つの、本発明によるＤＮＡ配列、またはフラグメント、もしくは、上記に定義されたように後者から誘導された配列、特に配列番号９で示される配列、および −適切ならば、植物でのリグニンの生合成の一段階に関係する、ＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ配列、特に、ＣＡＤの全部または一部をコードしているＤＮＡ配列を組み込むことにより、この形質転換が行われ、 −本発明による上記ＤＮＡ配列、またはフラグメント、もしくは、上記に定義したように後者から誘導された配列、および、適切ならば、上記に定義されたような、ＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしている、一つもしくはそれ以上のＤＮＡ配列を含む、上記の組換えベクターを用いるか、あるいは −少なくともそのうち一つは、本発明による上記ＤＮＡ配列、またはフラグメント、もしくは、上記に定義されたように後者から誘導された配列を含むが、残りの組換えベクターは、上記に定義されたような、ＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしているＤＮＡ配列を含む、数個の組換えベクターを用いる。一般的な方式では、やはり、植物の正常な平均的リグニンレベルが、乾燥物質重量の約１５％〜約３５％の間で変動することを考慮するならば、上記の方法の実施によって生じるリグニンレベルの上昇は、このようにして形質転換された植物が、約２０％〜約４０％、または約１８％〜約３８％の間で変動するリグニンの平均的レベルを有するようなものであるのが好都合である。本発明の、より詳細な主題は、植物でのリグニンレベルを上昇させる上記方法（ＣＣＲ遺伝子の過剰発現法とも呼ばれる）の用途であって、植物での正常なリグニンレベルに対比して上昇したリグニンレベルを有し、こうして、環境による攻撃、特に寄生生物の攻撃に対するその耐性という特性が、形質転換されていない同種の植物に対比して改良された、遺伝的に形質転換された植物を得るための用途である。この最後の場合には、特に表面組織で、および／または損傷に応答して、発現された特異的プロモーターを上記ベクター中でＣＣＲ遺伝子または誘導配列と組み合わせて使用することが、特に好都合である。更に、本発明は、ＣＣＲ遺伝子を過剰発現させる上記方法の用途に関し、特に小型の植物を得ることが望まれる園芸または樹木栽培のような一定の分野で、このようにして遺伝的に形質転換された植物の生長を改良するための用途に関する。最後に、リグニンのベンゼン環は、セルロースのグルコース残基の脂肪族鎖より高い固有エネルギーを有する。したがって、燃料として用いられる植物内のリグニンの比率の、本発明の上記方法による増大は、このようにして形質転換したこれらの燃料植物の、潜在的エネルギーの改良を可能にする。ＣＣＲの負の調節または過剰発現という二つの場合には、この活性の調整は、形質転換された植物のリグニンレベルに対する影響を有することが当然考えられる。事実、植物ではその活性レベルが非常に低いＣＣＲは、リグニンの合成のための調節酵素を構成しているように見える。本発明の上記方法のうちの一つの実施に用いられる、形質転換の手法については、下記の手法を用いるのが好都合であろう：（Ａ）Bevan（1984年）［Nucleic Acid Research、第12巻8,711〜8, 721頁］が記載した、Agrobacterium tumefaciensのＴｉプラスミドを用いる形質転換の手法。この手法は共生培養法を基本的に用い、形質転換体の位置を決めるために選択遺伝子による同時形質転換を利用する。この手法は双子葉植物、例えばタバコ、アルファルファ、搾油用ナタネに特に適用できる。（Ｂ）Zumbrumら［（1989年）、Technique、第１巻204〜216頁］；Sanfordら［（1991年）、Technique、第３巻3〜16頁］が詳細に記載している、生物学的バリスティク（ballistics）による遺伝子の直接移入の手法。この手法は、本発明による組換えＤＮＡと、形質転換しようとする組織に向かって遺伝子銃を用いて推進される金またはタングステンの微粒子との組合わせを必要とする。アグロバクテリアに対する抵抗性の種の形質転換に、特に適用することになる。上記の二つの場合には、本発明による組換えＤＮＡの存在の確認は、オリゴヌクレオチドのプローブと、特に配列番号１、３、５、７もしくは９の配列に由来するプライマーとを用いる、サザン型ハイブリダイゼーションおよび遺伝子増幅（ポリメラーゼ連鎖反応）試験を用いて実施され得る。本発明はまた、特に上記の手法を用いて、本発明によるベクターで形質転換され、それらのゲノムに安定な様式で組み込まれた本発明のＤＮＡ配列を有する、植物細胞に関する。本発明の主題はまた、上記の形質転換された細胞を培養することによって得られるような、形質転換された植物である。そうして、上記形質転換された植物は、インビトロまたは自然の有性的方法（sexual route）もしくは栄養的方法によって繁殖させることができる。本発明の主題はまた、上記組換えベクターを用いて、本発明のＤＮＡ配列をそれらのゲノムに組み込むことによって形質転換した植物の部分、特に果実、種子、花粉である。本発明はまた、本発明の組換えポリペプチドに対する抗体、より詳細には、上記組換えＣＣＲに対する抗体に関する。そのような抗体は、これらのポリペプチドで動物を免疫した後に、形成された抗体を回収することによって、得ることができる。この生産は、ポリクローナル抗体に限定されないことが理解されるであろう。これは、一方は本発明の精製ポリペプチドのうち１種類に対して免疫した動物、特にマウスまたはラットの脾細胞と、他方は適切な骨髄腫の細胞とから、標準的方法を用いて形成され得、そして、それが動物の免疫化に最初に用いた上記ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を生産する能力によって選択され得るいかなるものであってもよいハイブリドーマによって生産されるいかなるものであってもよいモノクローナル抗体に該当する。本発明の主題はまた、これらから採取した試料から始まる植物中のＣＣＲの検出または分析法を実施するための、本発明の組換えポリペプチドに対する上記抗体の用途である。ユーカリノキ由来の精製された形態のＣＣＲ、およびユーカリノキ、ポプラ、ヒロハノウシノケグサおよびタバコのＣＣＲをコードしているｃＤＮＡの取得をたどる説明のために、本発明の、より以上の詳細を示すことにする。（Ａ）精製されたユーカリノキＣＣＲ、およびユーカリノキＣＣＲをコードするｃＤＮＡの取得Ｉ．ユーカリノキＣＣＲの精製ＣＣＲは、多くの非常に限定された研究の主題となっている。それに関連する僅かな出版物のうちで、 Wengenmayer H.、Ebel J．およびGrisebach H.（1976年）、「リグニン前駆体の酵素合成、シンナモイルＣｏＡの精製および特性：ダイズ（Glycine max）からのセルサスペンジョン培養物からのＮＡＤＰＨレダクターゼ」、Eur．J．Bioc hem.、第65巻529〜536頁、 Luderitz T．およびGrisebach H.（1981年）、「リグニン前駆体の酵素合成、シンナモイルの比較：ＣｏＡレダクターゼおよびシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ：トウヒ（Picea abies L.）およびダイズ（Glycine max L.）からのＮＡＤＰデヒドロゲナーゼ」、Eur．J.Biochem.、第119巻115〜127頁、 Sarni F.、Grand C.およびBoudet A.M.（1984年）、「ポプラの樹幹（Populus x euramericana）からのシンナモイルＣｏＡレダクターゼおよびシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼの精製および特性」、Eur．J．Biochem.、第139巻259 〜265頁、を挙げることができる。以下に記載する研究は、ユーカリノキＣＣＲの独創的で、簡単かつ迅速な精製のためのプロトコルの明確化に寄与した。このプロトコルはまた、従来文献中に記載されたものより効果的である。事実、それは、内部ペプチドの配列を得るのに充分であり、その結果、対応するｃＤＮＡのクローニングにつながる、多量の均質な精製酵素を得ることをはじめて可能にした。ＣＣＲの精製段階はすべて、４℃で実施した。１．ユーカリノキの木部の粗抽出物の取得樹齢５年のEucalyptus gunniiの枝から木部に富む組織画分を「削り取る」ことによって、植物材料を得た。予め液体窒素中で凍結させておいた木部３００ｇを、コーヒーミルを用いて粉末にした。こうして得られたホモジネートを、抽出緩衝液（１００mM Tris−ＨＣｌ（pH７．６）、２％ＰＥＧ６０００、５mMＤＴＴ、２％ＰＶＰＰ）１リットル中でホモジナイズし、２枚のMiracloth通して濾過し、硫酸アンモニウムで３０％の飽和度にした。１５，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、得られたペレットを、６０mlの緩衝液１［２０mM Tris−ＨＣｌ（pH７．５）、５mMＤＴＴ（ジチオトレイトール）、５％エチレングリコール］に再懸濁させる。こうして得られた抽出物を、１０，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって「清澄化」し、次いで、緩衝液１で平衡化したSephadexＧ２５を通過させることによって、脱塩する。２．「Red Sepharose」でのアフィニティークロマトグラフィー粗脱塩抽出物を、緩衝液１で平衡化した「Red Sepharose」のアフィニティーカラム（１．５ｘ１９cm、Pharmacia社）にかけた。５０mlの緩衝液１でカラムを最初に洗浄した後、５mMＤＴＴ、５％エチレングリコールを含有する、２０mM 〜１．５MのTris−ＨＣｌ（pH７．５）のトリスの直線勾配で、タンパク質を溶出させた。勾配の総容量は２００mlであり、流速は３６ml／時である。ＣＣＲ活性を有する画分を集め、緩衝液１で平衡化したSephadexＧ２５カラムを通過させて、脱塩する。３．MonoＱでの陰イオン交換クロマトグラフィーこのようにして捕集かつ脱塩した画分を、MonoＱの陰イオン交換カラム（ＨＲ５／５、Pharmacia社）でクロマトグラフィーする。タンパク質の溶出は、５％エチレングリコールおよび５mMＤＴＴを含有する、２０〜３００mMのTr is−ＨＣｌ（pH７．５）の直線勾配の適用によって、実施する。勾配の総容量は５０mlであり、流速は１ml／分である。前段階と同様に、活性なＣＣＲ酵素を含む画分を捕集かつ脱塩したが、本事例では、SephadexＧ２５カラムの平衡化緩衝液は、５mMＤＴＴを含有するpH７．６の２０mMリン酸緩衝液（緩衝液２）である。４．「Mimetic Red」でのアフィニティークロマトグラフィー」このようにして得られたＣＣＲ画分のグループを、Mimetic Red２Ａ６ＸＬカラム（ＡＣＬ社、Cambridge）にかける。このカラムは、８mMのＮＡＤを含有する３０mlの緩衝液２で予め洗浄されている。この洗浄の目的は、補因子としてＮＡＤと特異的に機能する酵素、例えば、前段階でＣＣＲとともに同時精製されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼを排除することである。ＣＣＲの特異的溶出は、緩衝液２中の０〜８mMのＮＡＤＰの勾配（１５ml）の適用によって得られる。活性で純粋なＣＣＲを含む画分は、安定剤（５％の最終濃度のエチレングリコール）を添加した後に、−８０℃で貯蔵する。こうして得られた精製酵素は、フェルロイルＣｏＡを基質として用いて、タンパク質１mgあたり４５１nKatの比活性を有する。得られた収率（当初の植物材料３００ｇに対して精製タンパク質３６μｇ）は、実際には、各精製段階で最大量の混入物を排除することに主要な関心があったために、植物内でのＣＣＲの比率を反映せず、非常に強いＣＣＲ活性を有する画分のみを、その次の段階で処理した。このプロトコルで得られた精製率は、２８２である。 II．ＣＣＲの特徴付けユーカリノキＣＣＲは、未変性酵素の大きさについてはSuperose６（Pharmaci a社）での排除クロマトグラフィーによって、またモノマーサブユニットの大きさについては変性電気泳動ゲル上で得られた結果のまとめによって立証されるように、３８kDのモノマーである。MonoＰ（Pharmacia社）でのクロマトグラフィーによって推定される等電点は、７に近い。 pHおよび最適緩衝液に関する研究は、最初に記載されたようなＣＣＲ活性の測定［LuderitzおよびGrisebach（1981年）］が、ユーカリノキＣＣＲの活性の測定（１００mMリン酸緩衝液（pH６．２５））に完全に適合していることを示している。一次元電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で単一のバンドの状態で存在するＣＣＲの純度は、二次元電気泳動、および銀塩での染色後に、単一のスポットを得ることによって確認された。 III．ユーカリノキＣＣＲをコードしているｃＤＮＡの取得検出できない残留混入物という潜在的な問題を避けるため、純粋な酵素を、半ば変性させる条件下で分離用(preparative)電気泳動に付し、ゲル中でインサイチュで消化した。消化は、リジン残基の後でタンパク質を特異的に切断して、比較的長いペプチドが得られるのを可能にする、エンドリジンＣを用いて実施した。消化の結果得られたペプチドを、逆相ＨＰＬＣによって分離し、それらのいくつかを、タンパク質のマイクロシーケンサー（Applied Biosystems 470）を用いて、配列決定した。これらの内部ペプチドの配列を下記に示す：ＣＣＲをコードしているｃＤＮＡは、Euclyptus gunniiの木部のメッセンジャー抽出物からλＺＡＰIIファージ（市販のベクター、Stratagene社）内に構成したｃＤＮＡライブラリー由来のオリゴヌクレオチドを用いるスクリーニングによって得た。ターミナルトランスフェラーゼを用い、³²Ｐで３′末端を標識した一群の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、６００，０００のファージをスクリーニングした。スクリーニングに用いたオリゴヌクレオチドの配列は、上記内部ペプチドの配列から決定した。エンドリジンＣによる切断によって、これらのペプチドを生成しておき、最小の縮重を有するオリゴヌクレオチドの生産を可能にするために第１位に再びリジンを付加した。事実、２個のコドンによってのみコードできるこのアミノ酸は、そのコードが最小縮重であるアミノ酸の一部であり、その結果、ペプチド配列からのオリゴヌクレオチドの生産に極めて適している。下線を施したアミノ酸から誘導されたユーカリノキｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いたオリゴヌクレオチドの配列（Ｉ−イノシン）を以下に示す：スクリーニングに用いたハイブリダイゼーション条件は、下記のとおりである：４２℃の５×ＳＳＰＥ、０．２５％脱脂粉乳、０．０５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中で、プレハイブリダイゼーションを６〜７時間実施する。ハイブリダイゼーションは、４２℃の同じ溶液中、ｄｄＡＴＰα³²Ｐで３′末端を標識した４種のオリゴヌクレオチドの存在下で、２４時間実施する。これら２４時間のハイブリダイゼーションの終わりに、フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３回、１５分間洗浄し、次いで、−８０℃で２４時間、オートラジオグラフィー用フィルムに接触させる。この群のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするファージを、更に２周期のスクリーニングによって精製した（プラーク精製）。一旦精製した後、別々に取った各々のオリゴヌクレオチドを用いて、６個の陽性クローンを試験した。１つのファージが４種のオリゴヌクレオチドと陽性に反応し、これを、製造者（Stratagene社）の指示に従って、組換えBl uescriptプラスミドを「切り出す」ように処理した。このプラスミドに含まれた挿入物（ＣＣＲをコードしている）の制限地図を、図１に図式化する。 IV．ＣＣＲのｃＤＮＡの特徴付けおよび同定このヌクレオチド配列（配列番号１で示される）から誘導されたアミノ酸配列（配列番号２で示される）は、その分子量が３６．５kDであり、その等電点が約５．８である、３３５アミノ酸のタンパク質をコードしている。精製ＣＣＲから得られたいかなるものであってもよいペプチド配列が、このｃＤＮＡのヌクレオチド配列から誘導されるペプチド配列中に再び見出されることを強調することは、重要である。利用できるすべてのタンパク質および核酸ライブラリーでＢＬＡＳＴならびにＦＡＳＴＡプログラムを用いて、既存のクローンとの相同性の検索を実施した。一つの著しい相同性が、フェノール化合物の代謝のもう一つのレダクターゼ、すなわちジヒドロフラボノールレダクターゼ（ＤＦＲ）に対して見出された。ＣＣＲのｃＤＮＡから誘導されたペプチド配列と、ライブラリーに列挙された様々なジヒドロフラボノールレダクターゼの配列との間の同一性は、約４０％であり、類似性は２０％近くであって、それにより同定されたクローンは、ＤＦＲをコードしているクローンとは異なることが確認された。Ｖ．大腸菌での活性組換えＣＣＲの生産ＣＣＲのｃＤＮＡの同定を更に続けるために、組換えタンパク質をE. coli内で生産し、その酵素活性を調べた。このアプローチの実験的詳細を以下に述べる。１−発現ベクターｐＴ７−７へのｃＤＮＡの導入Ｔ７ポリメラーゼのプロモーターの制御下で、発現ベクターｐＴ７−７（市販）でのｃＤＮＡのクローニングを可能にするために、このｃＤＮＡのＡＴＧの位置にＮｄｅ１部位を導入しなければならなかった。これは、変異させたオリゴヌクレオチドと、このｃＤＮＡの３′末端より下流のBluescriptに位置する市販のプライマーＴ７との間のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による遺伝子増幅反応の際に、Ｔａｑポリメラーゼを用いて実施した。得られた増幅産物を、Ｋｐｎ１で消化し、次いで、この部位をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて修復してから、このフラグメントをＮｄｅ１による消化に付し、次いで、５′位にＮｄｅ１部位を、そして３′位に平滑末端を有する得られたフラグメントを、予めＮｄｅ１およびＳｍａ１で開いておいたベクターｐＴ７−７に、ＤＮＡＴ４リガーゼを用いて挿入する。上記の変異させたオリゴヌクレオチドの配列を、以下に示す。下線を施し、イタリック体で示した塩基は、当初の配列と対比すると改変されておりＮｄｅ１部位（ＣＡＴＡＴＧ）の創出を可能にした：５′ＧＧＣＡＡＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣ３′。２．大腸菌ＢＬ２１でのＣＣＲの過剰発現こうして得られた構築物を、ＩＰＴＧで誘導できるプロモーターである、lac ＵＶ５プロモーターの制御下で、Ｔ７ポリメラーゼの遺伝子をその染色体に有する、E．coli ＢＬ２１株（市販されている）に導入する。この組換え培養株を、６００nmで測定したＯＤが１となるまで、３７℃で培養し、次いで、培地へのＩＰＴＧの添加（最終０．２５％）によって、ＣＣＲの生産を誘導する。誘導後の様々な時間に試料を取り出し、Grima-Pettenatiら（1993年）が記載したプロトコルに従って、細胞を溶解する。遠心分離の後、可溶性タンパク質を含む上清を用いてＣＣＲ活性を測定し、変性条件下での電気泳動の後に、ＣＣＲの生産を示す。図２では、約３８kDのポリペプチドの出現に注目しなければならないが、その強度は、誘導後の時間とともに増大し、ネガティブコントロールには存在しない（ＢＬ２１株は、挿入物のないベクターｐＴ７−７のみを有する）。その上、ＣＣＲクローンの同一性の最終的証明は、ｐＴ７−７＋ＣＣＲｃＤＮＡのみを有するＢＬ２１株に由来するタンパク質抽出物中のＣＣＲ活性（３７℃での誘導の３時間後の培養物１mlあたり約７nKat）の測定によって、与えられる。［図面の簡単な説明］図１：ユーカリノキＣＣＲをコードしているｃＤＮＡの制限地図。図２：挿入物のないベクターｐＴ７−７を有する（レーン６：ＩＰＴＧによる誘導の０時間目、７：誘導の３時間後）、およびＣＣＲのｃＤＮＡを含むベクターｐＴ７−７を有する（レーン１、２、３、４、５：それぞれ、誘導０時間目、誘導の３０分、１、２、３時間後）大腸菌ＢＬ２１の全タンパク質抽出物の、変性条件下（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でのクーマシーブルーによる電気泳動ゲルの開示。矢印はＣＣＲモノマーを示す。図３：配列番号１で示される（そしてプラスミドｐＥＵＣＣＲ内のＣＣＲで同定された）配列を有するプラスミドｐＥＵＣＣＲの模式的表示。図４：本発明によるユーカリノキＣＣＲをコードしているＤＮＡ配列を有するベクター（すなわちセンスＣＣＲベクター）の構築の模式的表示。図５：本発明によるユーカリノキＣＣＲをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得る、アンチセンスＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列を有するベクター（すなわちアンチセンスＣＣＲベクター）の構築の模式的表示。アンチセンス（またはセンス）ベクターの構築に用いたＤＮＡ供袷源についてアンチセンスＲＮＡは、クローンｐＥＵＣＣＲに含まれる配列から誘導するのが好ましい。この配列は、様々な方法で得ることができる：（１）適切な制限酵素による、ｐＥＵＣＣＲに含まれるＣＣＲのＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）の切断、（２）所望のＤＮＡフラグメントを合成するよう規定したオリゴヌクレオチドを用いる、遺伝子増幅（ＰＣＲ）の実施。こうして得られたＤＮＡフラグメントを、植物発現ベクター内で、プロモーターより下流かつターミネーターより上流にクローニングした。クローニングは、プロモーターに対して逆方向にＤＮＡフラグメントが挿入されるようにして実施した。この新たなベクターでは、当初は鋳型鎖であった鎖が、コード鎖となり、その逆も然りである。新たなベクターは、その配列が、ｐＥＵＣＣＲに含まれる配列から誘導されたメッセンジャーＲＮＡの配列に相補的であるＲＮＡをコードしている。したがって、この２種類のＲＮＡは、それらの配列によるばかりでなく、それらの配向（５′−３′）によっても、相補的である。アンチセンスＲＮＡの転写のためのＤＮＡ供給源としては、ｐＥＵＣＣＲに含まれるようなｃＤＮＡを用いるのが実用的である。クローニングの実施例（図５参照）ＣＣＲのｃＤＮＡを、二重消化（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ）によって、ベクターｐＥＵＣＣＲから得る。こうして切り離されたＤＮＡフラグメントを、アガロースゲルの電気泳動によって、クローニングベクターから物理的に分離する（ Bluescript）。このＤＮＡフラグメントを含むゲルの部分を、精製ＤＮＡを得るようにして、切断かつ処理する（上記Sambrookらに記載された「低融点アガロース」のようないくつかの方法を用いてよく、Gene Cleanのようなキットが市販されている）。ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ末端を有するフラグメントを、このｃＤＮＡが³⁵Ｓプロモーターに対して反対の配向で挿入されるようにして、選ばれたこれらの同じ酵素で予め消化しておいた植物の発現ベクターと「連結」する。該植物で転写されることになる鎖は、本事例では、非コード鎖であることになる。センスクローニングの例（図４参照）本事例では、「実用的」(practical)制限部位は、発現ベクターの³⁵Ｓプロモーターとの翻訳的融合を行うために存在してはいない。より好都合な新たな部位を、遺伝子増幅の手法（ＰＣＲ）を用いて挿入した。ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩが認識する部位の配列を付加したｃＤＮＡの５′位および３′位に、２種類のオリゴヌクレオチドを規定した（注：これらは、上記アンチセンスクローニングに用いた同じ部位であるが、５′−３′の方向に関しては異なって位置された）。遺伝子増幅は、２ケ所の制限部位が近接したｃＤＮＡをコードしている全配列を有するフラグメントを得ることにつながる。残りの手順は、アンチセンス構築物について記載したのと同一である。しかし、本事例では、プロモーターとＣＣＲのＡＴＧとの同調した融合を実施して、メッセンジャーＲＮＡの、したがってＣＣＲタンパク質の過剰発現を導かなければならない。（Ｂ）ポプラＣＣＲをコードしているｃＤＮＡの取得樹齢２年のポプラ(Populus trichocarpa)の木部のメッセンジャー抽出物からλＺＡＰIIファージ（Stratagene社）中に構築したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、ｃＤＮＡを得た。このファージは、ｄＣＴＰα³²Ｐでのランダムプライム法によって標識したEucalyptus gunniiから単離したｃＤＮＡ（ｐＥＵＣＣＲの８０４塩基対のフラグメントＸｈｏ１）を用いて、スクリーングした。スクリーングに用いたハイブリダイゼーション条件は、下記のとおりである：６８℃の６×ＳＳＣ、５×Denhardt、０．５％ＳＤＳ、サケ精子ＤＮＡ１００ μｇ中で一晩、プレハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションは、Denhardt試薬を加えずに６０℃の同じ緩衝液中で、一晩実施する。次いで、メイブレンを、６０℃の０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で２回、３０分間洗浄する。完全なｃＤＮＡを含む１クローンを精製し、サブクローニングし、両方向で配列決定した。ｃＤＮＡ配列は、配列番号３で示される配列であり、後者の誘導アミノ酸配列は、配列番号４で示される配列であった。ユーカリノキＣＣＲのアミノ酸配列とポプラのアミノ酸配列との比較は、これら２配列間で、８３％の同一性および９３％の相同性を示した。（Ｃ）ウシノケグサＣＣＲをコードしているｃＤＮＡの取得 Fetusca arundinaceaの葉のメッセンジャー抽出物からλＺＡＰIIファージ（S tratagene社）中に構築したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、ｃＤＮＡを得た。ｄＣＴＰα³²Ｐでのランダムプライム法によって標識したEuca lyptus gunniiから単離したｃＤＮＡ（ｐＥＵＣＣＲの８０４塩基対のフラグメントＸｈｏ１）を用いて、５００，０００のファージをスクリーニングした。スクリーニングに用いたハイブリダイゼーション条件は、下記のとおりである：５×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、０．１mg/mlのサケ精子ＤＮＡ、１mg／mlのF icollタイプ４００、１mg／mlのポリビニルピロリドン、１mg／mlのＢＳＡ中で６０℃で６時間、プレハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションは、ｄＣＴＰα³²Ｐで標識したプローブの存在下、６０℃の同じ緩衝液中で１６時間実施する。次いで、フィルターを、６０℃の２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で２回、１５分間、次いで６０℃の０．５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄し、最後に、−８０℃で３日間、オートラジオグラフィー用フィルムに接触させる。更に２、３回のスクリーニングラウンドによって、ファージを精製した。一旦精製したならば、製造者（Stratagene社）の指示に従って、プラスミドｐ Bluescriptを切り出した後に、３クローンを分析した。配列決定により、１クローンが排除され、残りの２クローンが同一で、配列番号６で示されたとおりのウシノケグサＣＣＲをコードしている、配列番号５で示されるヌクレオチド配列に対応することが示された。（Ｄ）タバコＣＣＲをコードしているｃＤＮＡの取得タバコの茎のメッセンジャー抽出物からλＺＡＰIIファージ（Stratagene社）中に構築したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、ｃＤＮＡを得た。ｄＣＴＰα³²Ｐでのランダムプライム法によって標識したEucalyptus gunnii から単離したｃＤＮＡ（ｐＥＵＣＣＲの８０４塩基対のフラグメントＸｈｏ１）を用いて、ファージをスクリーニングした。スクリーニングに用いたハイブリダイゼーション条件は、下記のとおりである：０．２５％Marvel、５×ＳＳＰＥ、０．０５％ＳＤＳ中で５８℃で、プレハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションは、同じ緩衝液中で、ｄＣＴＰα³²Ｐで標識したプローブ５０ngの存在下、５８℃で実施する。次いで、フィルターを、室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２０分間、５８℃の２ ×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２０分間、５８℃の１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１５分間洗浄する。ｃＤＮＡクローン（ＥｃｏＲ１アダプターを用いて、ＥｃｏＲ１部位にクローニングした）を含むプラスミドｐBluescriptＳＫ^-をインビボで切り出した。このｃＤＮＡは配列番号７で示され、このｃＤＮＡの誘導アミノ酸配列は配列番号８で示される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年４月３０日【補正内容】請求の範囲１．１ケ所、またはそれ以上のコード領域を有する組換えヌクレオチド配列の用途であって、このまたはこれらの領域が、 −メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしているヌクレオチド配列であって、このｍＲＮＡ自体は植物中のシンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）をコードしている、ヌクレオチド配列；または上記ヌクレオチド配列のフラグメントであって、このフラグメントは植物中のＣＣＲのフラグメントをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしており、このＣＣＲフラグメントは上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有している、フラグメント；または特に１以上のヌクレオチドを変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換することによって上記ヌクレオチド配列から誘導されたか、もしくは上記フラグメントから誘導されたヌクレオチド配列であって、この誘導されたヌクレオチド配列はｍＲＮＡをコードし、このｍＲＮＡ自体は上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有している誘導されたタンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列、あるいは、 −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列の、もしくはこの配列のフラグメントの、または、それら後者のものから上記に定義されたように誘導された配列の、全部もしくは一部に相補的なヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡのうち一つとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列、で構成され、植物中で生産される標準のリグニンレベルと対比して、生産されるリグニンレベルの上昇という意味と低下という意味とのいずれにおいても、リグニンの生合成が調節されているトランスジェニック植物を得ようとする、植物細胞の形質転換のための用途。２．下記のものから選ばれるヌクレオチド配列の全部もしくは一部をコード領域として有することを特徴とする請求項１に記載の組換えヌクレオチド配列の用途： −配列番号２で示されるユーカリノキのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号４で示されるポプラのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号６で示されるウシノケグサのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号８で示されるタバコのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号７で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号１、３、５および７の配列によってコードされているｍＲＮＡとそれぞれハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、配列番号１、３、５または７で示される配列に相補的なヌクレオチド配列、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、配列番号１、３、５もしくは７で示される配列から誘導されたヌクレオチド配列であって、それぞれ配列番号２、４、６もしくは８で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、あるいはそれら後者のものから誘導され、該植物中のＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質のいずれかをコードしている誘導された配列、特に、配列番号１から誘導され、上記ユーカリノキＣＣＲから誘導された配列番号１０で示されるタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号９で示されるヌクレオチド配列、 −１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって上記相補的ヌクレオチド配列から誘導されたヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡのうち一つとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。３．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号２で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号１で示される配列から、または該配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号２で示されるＣＣＲまたは、後者から誘導され、該植物中のＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている誘導された配列、特に、配列番号１から誘導され、配列番号９で示されるヌクレオチド配列であって、後者が、ユーカリノキＣＣＲから誘導された配列番号１０で示されるタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列。４．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号４で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号４で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号３で示される配列から、または該配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号４で示されるＣＣＲまたは、後者から誘導され、該植物中のＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。５．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号６で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号６で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号５で示される配列から、または該配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号６で示されるＣＣＲまたは、後者から誘導され、該植物中のＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。６．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号８で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号７で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号８で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号７で示される配列から、または該配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号８で示されるＣＣＲまたは、後者から誘導され、該植物中のＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。７．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号１で示される配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号１で示される配列によってコードされているか、または後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは、上記のような該相補的配列のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列、特に配列番号９で示される配列に相補的な配列。８．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号３で示される配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号４で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号３で示される配列によってコードされているか、または、後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号４で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは、上記のような該相補的配列のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいクレオチド配列であって、上記のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。９．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号５で示される配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号６で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号５で示される配列によってコードされているか、または、後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号５で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは、上記のような該相補的配列のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、上記のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。１０．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号７で示される配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号８で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号７で示される配列によってコードされているか、または、後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号７で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは、上記のような該相補的配列のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、上記のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。１１．請求項３〜１０のうち一項に記載のＤＮＡ配列がコードしているｍＲＮＡ、より詳細には： −配列番号１で示されるＤＮＡ配列によってコードされているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡであって、これはまた、ユーカリノキに存在する、配列番号２で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメント、もしくは請求項１に定義されたような誘導タンパク質、特に配列番号１０で示されるタンパク質をコードし得るｍＲＮＡ、 −配列番号３で示されるＤＮＡ配列によってコードされているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡであって、これはまた、ポプラに存在する、配列番号４で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメント、もしくは請求項１に定義されたような誘導タンパク質をコードし得るｍＲＮＡ、 −配列番号５で示されるＤＮＡ配列によってコードされているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡであって、これはまた、ウシノケグサに存在する、配列番号６で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメント、もしくは請求項１に定義されたような誘導タンパク質をコードし得るｍＲＮＡ、 −配列番号７で示されるＤＮＡ配列によってコードされているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡであって、これはまた、タバコに存在する、配列番号８で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメント、もしくは請求項１に定義されたような誘導タンパク質をコードし得るｍＲＮＡ。１２．請求項１１のｍＲＮＡを構成するヌクレオチドの全部または一部のみに相補的なヌクレオチドを含み、該ｍＲＮＡとハイブリダイズし得ることを特徴とする、アンチセンスｍＲＮＡ。１３．ユーカリノキ、ヒロハノウシノケグサまたはタバコの細胞中に存在するような、具体的には配列番号２、６または８で示されるＣＣＲ、あるいは、特に１以上のアミノ酸の付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、それらから誘導されたいかなるものであってもよいタンパク質、または、該ＣＣＲもしくはそれらの誘導配列に由来するいかなるものであってもよいフラグメント（ここで該フラグメントおよび誘導配列は、上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有し得る）。１４．請求項１３に記載の、配列番号２、４、６もしくは８で示されるＣＣＲまたはそれらのいかなるものであってもよい誘導配列もしくはフラグメントをコードしているヌクレオチド配列であって、それぞれ配列番号１、３、５もしくは７で示される配列の全部または一部に、または、遺伝暗号の縮重によってそれらから誘導されたいかなるものであってもよい配列に対応するが、それでもなお、請求項１３に定義されたＣＣＲまたはそれらの誘導配列もしくはフラグメントをコードし得ることを特徴とする、ヌクレオチド配列。１５．請求項１２に記載のアンチセンスｍＲＮＡと、請求項１１に記載のｍＲＮＡとの間に形成された複合体。１６．植物中のＣＣＲをそれ自体がコードし得るｍＲＮＡをコードし得、異種配列に挿入される請求項３〜６のうち一項に記載の少なくとも一つのＤＮＡ配列を有することを特徴とする、組換えヌクレオチド配列。１７．異種配列に挿入された、植物中のＣＣＲをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、請求項７〜１０のうち一項に記載の少なくとも一つの相補的ＤＮＡ配列を有することを特徴とする、組換えヌクレオチド配列。１８．請求項３〜６のうち一項に記載のヌクレオチド配列、または請求項７〜１０のうち一項に記載のその相補的配列の発現を調節するのに必要な要素、特にこれらの配列の転写のプロモーターおよびターミネーターと、適切ならば、植物中のリグニン生合成の一段階に関与する、ＣＣＲ以外の酵素の全部もしくは一部をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ配列、特にシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）をそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、あるいは上記ｍＲＮＡ、特にＣＡＤをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡの全部もしくは一部をコードしている少なくとも一つの配列とを含むことを特徴とする、請求項１６または１７に記載の組換えヌクレオチド配列。１９．そのゲノムの、その複製に不可欠ではないその部位のうち１ケ所に組み込まれた、請求項１６〜１８のうち一項に記載の組換えヌクレオチド配列を有することを特徴とする、組換えベクター。２０．植物中のリグニンの生合成を、これらの植物で生産されるリグニンの標準のレベルに対比して、生産されるリグニンのレベルの低下または上昇のいずれかによって調節する方法であって、 −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列であって、このｍＲＮＡ自体は植物中のＣＣＲをコードしているヌクレオチド配列；または上記のヌクレオチド配列のフラグメントであって、このフラグメントは植物中のＣＣＲのフラグメントをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしており、このＣＣＲフラグメントは上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有しているフラグメント；または特に１以上のヌクレオチドを変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換することによって上記のヌクレオチド配列から誘導されたかもしくは上記のフラグメントから誘導されたヌクレオチド配列であって、この誘導されたヌクレオチド配列はｍＲＮＡをコードし、このｍＲＮＡ自体は上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有している誘導されたタンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列、あるいは、 −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列の、もしくは該配列のフラグメントの、または、これらから上記に定義されたように誘導された配列の全部もしくは一部に相補的なヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡのうち一つとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列を含むベクター、特に請求項１９に記載のベクターを用いて、これらの植物の細胞を形質転換する段階を含む方法。２１．植物中のリグニンの生合成を低下させ、したがって、生産されるリグニンのレベルを、植物で生産されるリグニンの標準のレベルに対比して、低下させる方法であって、これらの植物のゲノムに、 −請求項７〜１０のうち一項に記載の少なくとも一つのＤＮＡ配列、および −適切ならば、植物中のリグニンの生合成の一段階に関係する、ＣＣＲ以外の酵素をコードしているｍＲＮＡ、特にＣＡＤをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡの全部または一部をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ配列を組み込むことにより、 −請求項１７または１８に記載の組換えヌクレオチド配列を有する、請求項１９に記載の組換えベクターを用いるか、あるいは −少なくともそのうち一つは、請求項１７に記載の組換えヌクレオチド配列を有するが、残りの組換えベクターは、上記に定義されたように、ＣＣＲ以外の酵素をコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列を含む、数個の組換えベクターを用いて、これらの植物のゲノムを形質転換することによって実施することを特徴とする方法。２２．植物中のリグニンの生合成を低下させ、したがって、生産されるリグニンのレベルを、植物で生産されるリグニンの標準のレベルに対比して、低下させる方法であって、これらの植物のゲノムに、 −請求項３〜６に記載の少なくとも一つのＤＮＡ配列、および −適切ならば、植物中のリグニンの生合成の一段階に関係する、ＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ配列、特にＣＡＤの全部または一部をコードしているＤＮＡ配列を組み込むことにより、 −請求項１６または１８に記載の組換えヌクレオチド配列を含む、請求項１９記載の組換えベクターを用いるか、あるいは −少なくともそのうち一つは、請求項１６に記載の組換えヌクレオチド配列を含むが、残りの組換えベクターは、上記に定義されたような、ＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしているＤＮＡ配列を含む、数個の組換えベクターを用いて、これらの植物のゲノムを形質転換することによって実施することを特徴とする方法。２３．植物中のリグニンの生合成を上昇させ、したがって、植物で生産されるリグニンのレベルを、植物で生産される標準のリグニンレベルに対比して、上昇させる方法であって、これらの植物のゲノムに、 −請求項３〜６に記載の少なくとも一つのＤＮＡ配列、および −適切ならば、植物中のリグニン生合成の一段階に関係する、ＣＣＲ以外の酵素をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ配列、特に、ＣＡＤをコードしているＤＮＡ配列を組み込むことにより、 −請求項１６または１８に記載の組換えヌクレオチド配列を含む、請求項１９記載の組換えベクターを用いるか、あるいは −少なくともそのうち一つは、請求項１６に記載の組換えヌクレオチド配列を含むが、残りの組換えベクターは、上記に定義されたような、ＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしているＤＮＡ配列を含む、数個の組換えベクターを用いて、これらの植物のゲノムを形質転換することによって実施することを特徴とする方法。２４．それらのゲノムに、請求項３〜１０のうち一項に記載の少なくとも一つのヌクレオチド配列を組み込むことによって形質転換した、植物、または植物の部分、特に細胞、果実、種子、花粉。２５．特に請求項１９に記載のベクターを用いて、請求項１６〜１８のうち一項に記載の組換えヌクレオチド配列を植物細胞のゲノムに安定的な形で組み込むことによる、植物細胞の形質転換によって得られるような、組換えポリペプチド、特に配列番号２、４、６または８で示される組換えＣＣＲ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ゴフネ，デボラフランス国、エフ−31320 ヴィエイユ・トゥルーズ、シマン・ドゥ・ラリエージュ（番地なし) (72)発明者ハルピン，クライアーイギリス国、ディディ８８アールジーフェイフ、セント・フォート、フォークヘッド・ハウス（番地なし) (72)発明者オコンネル，アンイギリス国、ケーティ13 ９ワイアールサリー、ウェイブリッジ、ハンガー・ヒル、コンシトン・コート７ (72)発明者ロムスタン，ミッシェルフランス国、12000 ロデス、シマン・ドゥ・ローテルン、37 (72)発明者ブーイルヤン，ワウトベルギー国、べー−9270 カルケン、ゾメルストラート 44ベー (72)発明者ルプル，ジャン−シャルルフランス国、45150 フェロル、ルート・ドゥ・ヴィリエール、30

Claims

【特許請求の範囲】１．１ケ所、またはそれ以上のコード領域を有する組換えヌクレオチド配列の用途であって、このまたはこれらの領域が、 −メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしているヌクレオチド配列であって、このｍＲＮＡ自体は植物中のシンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）をコードしている、ヌクレオチド配列；または上記ヌクレオチド配列のフラグメントであって、このフラグメントは植物中のＣＣＲのフラグメントをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしており、このＣＣＲフラグメントは上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有している、フラグメント；または特に１以上のヌクレオチドを変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換することによって上記ヌクレオチド配列から誘導されたか、もしくは上記フラグメントから誘導されたヌクレオチド配列であって、この誘導されたヌクレオチド配列はｍＲＮＡをコードし、このｍＲＮＡ自体は上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有している誘導されたタンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列、あるいは、 −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列の、もしくはこの配列のフラグメントの、または、それら後者のものから上記に定義されたように誘導された配列の、全部もしくは一部に相補的なヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡのうち一つとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列、で構成され、植物中で生産される標準のリグニンレベルと対比して、生産されるリグニンレベルの上昇という意味と低下という意味とのいずれにおいても、リグニンの生合成が調節されているトランスジェニック植物を得ようとする、植物細胞の形質転換のための用途。２．下記のものから選ばれるヌクレオチド配列の全部もしくは一部をコード領域として有することを特徴とする請求項１に記載の組換えヌクレオチド配列の用途： −配列番号２で示されるユーカリノキのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号４で示されるポプラのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号６で示されるウシノケグサのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号８で示されるタバコのＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号７で示されるヌクレオチド配列、 −配列番号１、３、５および７の配列によってコードされているｍＲＮＡとそれぞれハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、配列番号１、３、５または７で示される配列に相補的なヌクレオチド配列、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、配列番号１、３、５もしくは７で示される配列から誘導されたヌクレオチド配列であって、それぞれ配列番号２、４、６もしくは８で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、あるいはそれら後者のものから誘導され、該植物中のＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質のいずれかをコードしている誘導された配列、特に、配列番号１から誘導され、上記ユーカリノキＣＣＲから誘導された配列番号１０で示されるタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号９で示されるヌクレオチド配列、 −１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって上記相補的ヌクレオチド配列から誘導されたヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡのうち一つとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。３．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号２で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号１で示される配列から、または該配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号２で示されるＣＣＲまたは、後者から誘導され、該植物中のＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている誘導された配列、特に、配列番号１から誘導され、配列番号９で示されるヌクレオチド配列であって、後者が、ユーカリノキＣＣＲから誘導された配列番号１０で示されるタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列。４．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号４で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号４で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号３で示される配列から、または該配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号４で示されるＣＣＲまたは、後者から誘導され、該植物中のＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。５．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号６で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号６で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号５で示される配列から、または該配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号６で示されるＣＣＲまたは、後者から誘導され、該植物中のＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。６．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号８で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている、配列番号７で示されるヌクレオチド配列、あるいは、 −上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有する配列番号８で示されるＣＣＲフラグメントをコードしている、上記ヌクレオチド配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記配列番号７で示される配列から、または該配列の上記のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、配列番号８で示されるＣＣＲまたは、後者から誘導され、該植物中のＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有するタンパク質をそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。７．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号１で示される配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号１で示される配列によってコードされているか、または後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号２で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは、上記のような該相補的配列のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列、特に配列番号９で示される配列に相補的な配列。８．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号３で示される配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号４で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号３で示される配列によってコードされているか、または、後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号４で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは、上記のような該相補的配列のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいクレオチド配列であって、上記のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。９．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号５で示される配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号６で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号５で示される配列によってコードされているか、または、後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号５で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは、上記のような該相補的配列のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、上記のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。１０．下記のものをコード領域として含むことを特徴とするＤＮＡ配列： −配列番号７で示される配列に相補的なヌクレオチド配列であって、配列番号８で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、すなわち配列番号７で示される配列によってコードされているか、または、後者から、上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列、あるいは、 −上記に定義されたように、配列番号７で示されるＣＣＲをそれ自体がコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、上記の相補的配列のフラグメント、あるいは、 −特に１以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、上記の相補的配列から、もしくは、上記のような該相補的配列のフラグメントから誘導されたいかなるものであってもよいヌクレオチド配列であって、上記のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている誘導されたヌクレオチド配列。１１．請求項３〜１０のうち一項に記載のＤＮＡ配列がコードしているｍＲＮＡ、より詳細には： −配列番号１で示されるＤＮＡ配列によってコードされているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡであって、これはまた、ユーカリノキに存在する、配列番号２で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメント、もしくは請求項１に定義されたような誘導タンパク質、特に配列番号１０で示されるタンパク質をコードし得るｍＲＮＡ、 −配列番号３で示されるＤＮＡ配列によってコードされているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡであって、これはまた、ポプラに存在する、配列番号４で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメント、もしくは請求項１に定義されたような誘導タンパク質をコードし得るｍＲＮＡ、 −配列番号５で示されるＤＮＡ配列によってコードされているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡであって、これはまた、ウシノケグサに存在する、配列番号６で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメント、もしくは請求項１に定義されたような誘導タンパク質をコードし得るｍＲＮＡ、 −配列番号７で示されるＤＮＡ配列によってコードされているか、またはフラグメントもしくは上記に定義されたように誘導された配列によってコードされているｍＲＮＡであって、これはまた、タバコに存在する、配列番号８で示されるようなＣＣＲ、または該ＣＣＲのフラグメント、もしくは請求項１に定義されたような誘導タンパク質をコードし得るｍＲＮＡ。１２．請求項１１のｍＲＮＡを構成するヌクレオチドの全部または一部のみに相補的なヌクレオチドを含み、該ｍＲＮＡとハイブリダイズし得ることを特徴とする、アンチセンスｍＲＮＡ。１３．ユーカリノキ、ポプラ、ヒロハノウシノケグサまたはタバコの細胞中に存在するような、具体的には配列番号２、４、６または８で示されるＣＣＲ、あるいは、特に１以上のアミノ酸の付加および／またはサプレッションおよび／または置換によって、それらから誘導されたいかなるものであってもよいタンパク質、または、該ＣＣＲもしくはそれらの誘導配列に由来するいかなるものであってもよいフラグメント（ここで該フラグメントおよび誘導配列は、上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有し得る）。１４．請求項１３に記載の、配列番号２、４、６もしくは８で示されるＣＣＲまたはそれらのいかなるものであってもよい誘導配列もしくはフラグメントをコードしているヌクレオチド配列であって、それぞれ配列番号１、３、５もしくは７で示される配列の全部または一部に、または、遺伝暗号の縮重によってそれらから誘導されたいかなるものであってもよい配列に対応するが、それでもなお、請求項１３に定義されたＣＣＲまたはそれらの誘導配列もしくはフラグメントをコードし得ることを特徴とする、ヌクレオチド配列。１５．請求項１２に記載のアンチセンスｍＲＮＡと、請求項１１に記載のｍＲＮＡとの間に形成された複合体。１６．植物中のＣＣＲをそれ自体がコードし得るｍＲＮＡをコードし得、異種配列に挿入される請求項３〜６のうち一項に記載の少なくとも一つのＤＮＡ配列を有することを特徴とする、組換えヌクレオチド配列。１７．異種配列に挿入された、植物中のＣＣＲをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている、請求項７〜１０のうち一項に記載の少なくとも一つの相補的ＤＮＡ配列を有することを特徴とする、組換えヌクレオチド配列。１８．請求項３〜６のうち一項に記載のヌクレオチド配列、または請求項７〜１０のうち一項に記載のその相補的配列の発現を調節するのに必要な要素、特にこれらの配列の転写のプロモーターおよびターミネーターと、適切ならば、植物中のリグニン生合成の一段階に関与する、ＣＣＲ以外の酵素の全部もしくは一部をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ配列、特にシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）をそれ自体がコードしているｍＲＮＡ、あるいは上記ｍＲＮＡ、特にＣＡＤをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡの全部もしくは一部をコードしている少なくとも一つの配列とを含むことを特徴とする、請求項１６または１７に記載の組換えヌクレオチド配列。１９．そのゲノムの、その複製に不可欠ではないその部位のうち１ケ所に組み込まれた、請求項１６〜１８のうち一項に記載の組換えヌクレオチド配列を有することを特徴とする、組換えベクター。２０．植物中のリグニンの生合成を、これらの植物で生産されるリグニンの標準のレベルに対比して、生産されるリグニンのレベルの低下または上昇のいずれかによって調節する方法であって、 −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列であって、このｍＲＮＡ自体は植物中のＣＣＲをコードしているヌクレオチド配列；または上記のヌクレオチド配列のフラグメントであって、このフラグメントは植物中のＣＣＲのフラグメントをそれ自体がコードしているｍＲＮＡをコードしており、このＣＣＲフラグメントは上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有しているフラグメント；または特に１以上のヌクレオチドを変異および／または付加および／またはサプレッションおよび／または置換することによって上記のヌクレオチド配列から誘導されたかもしくは上記のフラグメントから誘導されたヌクレオチド配列であって、この誘導されたヌクレオチド配列はｍＲＮＡをコードし、このｍＲＮＡ自体は上記ＣＣＲの酵素活性と同等の酵素活性を有している誘導されたタンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列、あるいは、 −ｍＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列の、もしくは該配列のフラグメントの、または、これらから上記に定義されたように誘導された配列の全部もしくは一部に相補的なヌクレオチド配列であって、上記ｍＲＮＡのうち一つとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしている相補的なヌクレオチド配列を含むベクター、特に請求項１９に記載のベクターを用いて、これらの植物の細胞を形質転換する段階を含む方法。２１．植物中のリグニンの生合成を低下させ、したがって、生産されるリグニンのレベルを、植物で生産されるリグニンの標準のレベルに対比して、低下させる方法であって、これらの植物のゲノムに、 −請求項７〜１０のうち一項に記載の少なくとも一つのＤＮＡ配列、および −適切ならば、植物中のリグニンの生合成の一段階に関係する、ＣＣＲ以外の酵素をコードしているｍＲＮＡ、特にＣＡＤをコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡの全部または一部をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ配列を組み込むことにより、 −請求項１７または１８に記載の組換えヌクレオチド配列を有する、請求項１９に記載の組換えベクターを用いるか、あるいは −少なくともそのうち一つは、請求項１７に記載の組換えヌクレオチド配列を有するが、残りの組換えベクターは、上記に定義されたように、ＣＣＲ以外の酵素をコードしているｍＲＮＡとハイブリダイズし得るアンチセンスｍＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列を含む、数個の組換えベクターを用いて、これらの植物のゲノムを形質転換することによって実施することを特徴とする方法。２２．植物中のリグニンの生合成を低下させ、したがって、生産されるリグニンのレベルを、植物で生産されるリグニンの標準のレベルに対比して、低下させる方法であって、これらの植物のゲノムに、 −請求項３〜６に記載の少なくとも一つのＤＮＡ配列、および −適切ならば、植物中のリグニンの生合成の一段階に関係する、ＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ配列、特にＣＡＤの全部または一部をコードしているＤＮＡ配列を組み込むことにより、 −請求項１６または１８に記載の組換えヌクレオチド配列を含む、請求項１９記載の組換えベクターを用いるか、あるいは −少なくともそのうち一つは、請求項１６に記載の組換えヌクレオチド配列を含むが、残りの組換えベクターは、上記に定義されたような、ＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしているＤＮＡ配列を含む、数個の組換えベクターを用いて、これらの植物のゲノムを形質転換することによって実施することを特徴とする方法。２３．植物中のリグニンの生合成を上昇させ、したがって、植物で生産されるリグニンのレベルを、植物で生産される標準のリグニンレベルに対比して、上昇させる方法であって、これらの植物のゲノムに、 −請求項３〜６に記載の少なくとも一つのＤＮＡ配列、および −適切ならば、植物中のリグニン生合成の一段階に関係する、ＣＣＲ以外の酵素をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ配列、特に、ＣＡＤをコードしているＤＮＡ配列を組み込むことにより、 −請求項１６または１８に記載の組換えヌクレオチド配列を含む、請求項１９記載の組換えベクターを用いるか、あるいは −少なくともそのうち一つは、請求項１６に記載の組換えヌクレオチド配列を含むが、残りの組換えベクターは、上記に定義されたような、ＣＣＲ以外の酵素の全部または一部をコードしているＤＮＡ配列を含む、数個の組換えベクターを用いて、これらの植物のゲノムを形質転換することによって実施することを特徴とする方法。２４．それらのゲノムに、請求項３〜１０のうち一項に記載の少なくとも一つのヌクレオチド配列を組み込むことによって形質転換した、植物、または植物の部分、特に細胞、果実、種子、花粉。２５．特に請求項１９に記載のベクターを用いて、請求項１６〜１８のうち一項に記載の組換えヌクレオチド配列を植物細胞のゲノムに安定的な形で組み込むことによる、植物細胞の形質転換によって得られるような、組換えポリペプチド、特に配列番号２、４、６または８で示される組換えＣＣＲ。