ES2235149T3 - Sistemas de expresion para una enzima amidante. - Google Patents
Sistemas de expresion para una enzima amidante.Info
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Abstract
SE PRODUCE ENZIMA ALFA-AMIDADO CON GRAN RENDIMIENTO DE RECUPERACION Y PUREZA, MEDIANTE TECNICAS DE RECOMBINACION DE DNA. SE PROVEEN AMBOS VECTORES DE EXPRESION, EUCARIOTICO Y PROCARIOTICO, TENIENDO UN PROMOTOR DE TRANSCRIPCION SEGUIDO POR UNA SECUENCIA DE DNA LA CUAL CODIFICA EL ENZIMA AMIDADO. EL VECTOR ELEGIDO ES UNO CAPAZ DE DETECTAR LA EXPRESION DE POLIPEPTIDOS EN EL PORTADOR SELECCIONADO, Y LOS PORTADORES PREFERIDOS SON TRASPASADOS CON LOS VECTORES DESCRITOS.
Description
Sistemas de expresión para una enzima
amidante.
Esta invención se refiere a la producción de
enzimas alfa-amidantes a través de técnicas de ADN
recombinante, y particularmente a vectores de expresión y huéspedes
capaces de expresar una enzima alfa amidante con altos rendimientos
y a una alta pureza recuperable.
El procesamiento intracelular (escisión y/o
modificación de un grupo funcional) de formas precursoras de
proteínas nativas que sigue a su traducción a partir de secuencias
codificantes de ácidos nucleicos se ha documentado claramente.
En general, células de mamíferos y otras
eucarióticas pueden realizar ciertos procedimientos de procesamiento
post-traduccionales, mientras que las procariotas
no. Ciertos procariotas, tal como E. coli, se emplean
ampliamente como huéspedes para la producción de proteínas de
mamíferos mediante tecnología de ADN recombinante (ADNr) debido a
que se pueden desarrollar fácilmente en procedimientos de
fermentación por lotes y debido a que genéticamente se caracterizan
bien. Sin embargo, muchas proteínas de mamíferos requieren algún
tipo de procesamiento post-traduccional, y si estas
proteínas se producen mediante ingeniería genética de E.
coli, por ejemplo, el procesamiento
post-traduccional debe a menudo llevarse a cabo
usando complejo, los procedimientos químicos in vitro que son
de coste prohibitivo para las aplicaciones de producción a gran
escala.
Un tipo de actividad de procesamiento implica la
amidación específica del aminoácido carboxilo terminal de un péptido
o proteína. Muchas hormonas y péptidos de origen natural contienen
tal modificación, que es a menudo esencial si la proteína va a ser
biológicamente activa. Un ejemplo es la calcitonina, donde la
sustitución de un residuo prolina no amidado por la prolina amidada
de la forma nativa da como resultado una reducción de 3000 veces de
actividad biológica. Otros péptidos biológicos que requieren
amidación post-traduccional para actividad completa
incluyen pero no se limitan a factor de liberación de hormona de
crecimiento, otras calcitoninas, y péptido relacionado con genes de
calcitonina.
La amidación específica del aminoácido carboxilo
terminal de una proteína se cataliza mediante enzimas
alfa-amidantes. Las secuencias de polipéptidos de
muchas proteínas biológicas importantes que requieren amidación para
eficacia máxima, se puede fabricar, por ejemplo, mediante técnicas
de ingeniería genética. Sin embargo, la amidación carboxilo
terminal importante y algunas veces esencial se debe realizar a
menudo in vitro. En este momento es deseable evitar técnicas
de amidación química costosas y engorrosas, y por lo tanto es
deseable utilizar una enzima amidante para realizar la amidación
específica. Sin embargo, la enzima alfa-amidante no
se obtiene fácilmente en la naturaleza.
La presencia de péptidos amidados en un tejido
particular no es necesariamente sinónimo de altos niveles de enzima
alfa-amidante. Por ejemplo, el tejido de pituitaria
anterior de rata contiene altos niveles de actividad
alfa-amidante pero no sustratos conocidos [Eipper y
col., PNAS 80, 5144-5148 (1983)]. El tejido
de pituitaria posterior de rata contiene péptidos amidados
(oxitocina y vasopresina) pero tiene muy poca actividad
alfa-amidante Eipper y col., Endo 116,
2497-2504 (1985)]. Por lo tanto, hasta que los
tejidos individuales se analicen para evaluar la actividad
alfa-amidante, la presencia de niveles potenciales
de enzima no se pueden anticipar.
Un impedimento incluso mayor para la
disponibilidad de enzima amidante obtenida de fuentes naturales es
usualmente el bajo nivel de pureza. Las enzimas amidantes obtenidas
de fuentes naturales están contaminadas con enzimas proteolíticas y
otras impurezas. La recuperación eficaz de producto amidado está en
gran medida obstaculizada cuando estas enzimas unidas a impurezas se
usan para amidar un sustrato compuesto por
L-aminoácidos. En particular, la presencia de
proteasas puede descomponer el sustrato y/o el producto amidado y/o
la propia enzima amidante. La mayoría de los polipéptidos
biológicamente importantes comprende L-aminoácidos,
y son susceptibles a esta descomposición proteolítica y a otros
impedimentos de obstaculización de amidación producidos por
impurezas en las preparaciones de enzimas amidantes.
Debido a que la naturaleza proporciona pocas
fuentes, la baja abundancia e insuficiente pureza de enzima
alfa-amidante, existe una necesidad de
procedimientos eficaces de producción en masa de enzima
alfa-amidante recuperable con alto rendimiento y
con alta pureza. La producción de enzimas amidantes mediante medios
recombinantes podría satisfacer esta necesidad. Stoffers y col.,
(Stoffers, D. A., Green, C. B. -R y Eipper, B. A. (1989) PNAS, 86,
735-739) describen el aislamiento y secuenciación de
dos ADNc que codifican polipéptidos de rata denominados
rPAM-1 y rPAM-2. También se
identificaron las diferentes regiones de la secuencia y sus
funciones. El documento EP-A-308067
describe composiciones enzimáticas purificadas de enzimas
alfa-amidantes y genes capaces de expresar las
mismas. Los documentos EP-A-299790,
WO 89/02460 y WO 90/08190 describen secuencias de aminoácidos de
enzimas amidantes de longitud completa de Xenopus, de bovinos y de
seres humanos que contienen codones de partida cadena arriba de la
región codificante. Sin embargo, todavía existe una necesidad de
expresión mejorada de enzimas alfa-amidantes.
Como se usa en esta memoria descriptiva, los
términos "enzima amidante" y "enzima
alfa-amidante" se refieren a cualquier agente
capaz de catalizar la conversión de un sustrato peptidilo a una
correspondiente peptidilamida que tiene un grupo amino en lugar del
aminoácido C-terminal de dicho sustrato.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una enzima alfa-amidante recuperable
con altos rendimientos y con alta pureza.
Es otro objeto de la invención proporcionar
organismos hospedadores capaces de expresar enzimas
alfa-amidantes recuperables con alto rendimiento a
alta pureza.
Es otro objeto de la invención proporcionar
vectores de expresión que contienen secuencias de ADN que codifican
enzima alfa-amidante.
Es otro objeto de la invención proporcionar
vectores de expresión capaces de expresar una enzima
alfa-amidante de manera en la que la enzima
expresada se puede recuperar y purificar fácilmente a niveles
eficaces para la amidación de citratos de peptidilo que comprenden
L- aminoácidos, por ejemplo, sustratos purificados a partir de
fuentes naturales, sintetizados químicamente, o producidos mediante
técnicas de ADN recombinante.
Es otro objeto de la invención proporcionar
vectores de expresión especialmente adecuados para dirigir la
expresión de enzimas alfa-amidantes en un huésped
eucariótico.
Es otro objeto de la invención proporcionar
vectores de expresión especialmente adecuados para dirigir la
expresión de enzimas alfa-amidantes en un huésped
procariótico.
Es otro objeto de la invención proporcionar un
medio para la producción en masa eficaz y rentable de una enzima
alfa-amidante.
Estos y otros objetos se llevan a cabo
proporcionando un huésped capaz de expresar la secuencia de
polipéptidos de un sistema alfa amidante, dicho huésped
comprendiendo un vector de expresión que contiene un promotor
transcripcional seguido cadena debajo de una secuencia de ADN
foráneo a dicho hospedador que codifica la peptidil glicina
\alpha-amidante monooxigenasa y tiene la
secuencia seleccionada entre:
en la que dicha secuencia de ADN
incluye un codón de parada cadena arriba de una secuencia que de
otra manera codificaría una región que atraviesa
membranas.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "condiciones rigurosas" significa 2 x SSC (cloruro
sódico 0,3 M y citrato sódico 0,03 M) a 62ºC.
La presente invención también proporciona
vectores de expresión a partir de dichos huéspedes como se ha
descrito antes en esta memoria descriptiva. Los aspectos
adicionales de la invención son como se describen en las
reivindicaciones.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "dominio que atraviesa membranas" es una secuencia de
ADN que, como se determina mediante el ensayo de Kyte y Doolittle,
J. Mol. Biol., vol. 157, pp. 105-132 (1982)
(cuya descripción entera se incorpora en esta memoria descriptiva
como referencia), codifica una secuencia de aminoácidos de
hidrofobicidad, longitud, carácter estructural suficiente, y
similares que se llegan a fijar en la membrana. Por ejemplo, esto
puede producirse cuando una proteína se sintetiza sobre un ribosoma
unido a membrana, como alternativa, la secuencia de aminoácidos
codificada por el dominio que atraviesa membrana se puede llegar a
asociar con otros áreas de la proteína de la que es parte, de manera
que la secuencia se llega a insertar en el entorno hidrófobo de la
membrana post-traduccionalmente. Los dominios que
atraviesan membranas se describen en más detalle en Von Heijne,
Sequence Análisis in Molecular Biology: Treasure Trove or
Trivial Pursuit, pp. 81-121 (Acad. Press 1987),
cuyas descripciones se incorporan en esta memoria descriptiva como
referencia.
Los números de las bases utilizados en esta
memoria descriptiva son los números establecidas específicamente
para cualquier secuencia de ADN expuestos expresamente junto con
las referencias de números de las bases. Para todas las secuencias
para cuyos números de las bases no se asignan expresamente en esta
memoria descriptiva, las bases se numerarán consecutivamente con el
número 1 de las bases siendo la primera base del primer codón que
se expresa mediante al secuencia que se está describiendo, y los
números de aminoácidos se numeran consecutivamente con el primero
siendo el aminoácido expresado por las bases
1-3.
La figura 1 es un diagrama de flujo para la
construcción de un vector de expresión de mamíferos para una enzima
alfa-amidante.
La figura 2 es un diagrama de flujo para la
construcción de un vector de expresión procariótico para una enzima
alfa-amidante.
La figura 3 es un electroforetograma de
SDS-PAGE teñido con azul de Coomasie de la fracción
proteica insoluble JM105 de E. coli que lleva los plásmidos
indicados (que tienen las características expuestas en el ejemplo 1)
cuando se cultiva con (+) o sin (-) IPTG añadido al medio de
crecimiento (C = proteínas insolubles JM105 de E. coli que
lleva pKK233-2).
La figura 4 es una transferencia de Western del
gel mostrado en la figura 3 en la que, después de la transferencia
de proteínas a nitrocelulosa, el filtro se trata con antisueros
anti AE de conejo y la Ig anti conejo conjugada con fosfatasa
alcalina, seguido de sustrato cromogénico para la fosfatasa
alcalina
De acuerdo con la invención, se preparan vectores
de expresión adecuados para sistemas procarióticos y los vectores de
expresión adecuados para sistemas eucarióticos. El ADN que codifica
una enzima amidante útil en estos vectores se puede aislar como se
indica en la solicitud EPC Nº 88307533.5 y publicada como la
publicación Nº 0308067 cuya descripción completa se incorpora en
esta memoria descriptiva como referencia. Las enzimas
alfa-amidantes se han aislado de tejido de
carcinoma de tiroide medular de rata o medios acondicionados de una
línea celular de rata, y se purificaron hasta homogeneidad como se
indica en la solicitud precursora identificada anteriormente y en
la solicitud antecesora nº de serie 655.366 presentada el 27 de
septiembre de 1984, ahora expedida como patente de Estados Unidos
4.708.934 cuya prioridad se ha incorporado en esta memoria
descriptiva como referencia. Las secuencias de aminoácidos se han
determinado para la enzima alfa-amidante purificada,
y estas secuencias se han usado para proyectar una diversidad de
sondas de oligonucleótidos que se han marcado radiactivamente y
utilizado para aislar los ADNc de la enzima amidante.
Los ADNc asilados se han usado para rastrear
genotecas preparadas, por ejemplo, a partir del ARN total de tejidos
de carcinoma de tiroides medular de rata, sus líneas celulares
derivadas o a partir de líneas celulares conocidas para producir
enzima amidante, por ejemplo, depósito biológico IVI 10028 (In Vitro
Internacional, Linthicum, Maryland) (tejido MTC de rata) o la línea
celular derivada IVI 10029. El ARN total se preparó y se
seleccionó ARN Poly-A con oligo DT celulosa. Los
ADNc se prepararon mediante procedimientos conocidos utilizando
primero transcriptasa inversa y después una ADN polimerasa. El ADNc
se usó para generar genotecas de ADNc en el vector hgt 11 y
los ADN recombinantes se empaquetaron in vitro para formar
las partículas de bacteriófago infecciosas.
Los extractos para empaquetar están
comercialmente disponibles por ejemplo en Laboratorios Promega
Biotech o Clontech o se pueden preparar según los procedimientos
bien conocidos en la técnica. El fago se rastreó con sondas de
oligonucleótidos marcados radiactivamente preparados como se ha
expuesto anteriormente. El rastreo para bacteriófago que contiene
ADNc de enzima alfa amidante ("AE ADNc") se llevó a cabo
sembrando muestras de bacteriófago y dejando el fago sobre discos
de filtros de nitrocelulosa. La hibridación con dos o más sondas de
oligonucleótidos específicas de AE marcadas radiactivamente
confirieron especificidad.
Las sondas de oligonucleótidos designadas AE4,
AE5, AE8 y AE9 en las páginas 61-64 de la solicitud
EPC Nº 88307533.5 y publicada como la publicación Nº 0308067 se
prefieren especialmente cuando se rastrean genotecas preparadas a
partir del depósito biológico IVI 10029 identificado
anteriormente.
El análisis de los ADNc de AE de muchos
bacteriófagos aislados mediante los procedimientos de rastreo de
hibridación de oligonucleótidos anteriores indicó que los ADNc se
pueden separar en una pluralidad de tipos distintos. La estructura
de un tipo se proporciona más adelante como diagrama A, donde los
nucleótidos se han numerado con la base 1 como la primera base del
codón para el iniciador metionina. Debajo de la secuencia de
nucleótidos se proporciona el código de aminoácidos de letra
individual para la traducción de la secuencia génica en la
proteína. Los números en paréntesis y el final de las líneas
indican números de aminoácidos.
Otro tipo de secuencia de ADNc aislado mediante
el rastreo de hibridación de oligonucleótidos expuesto anteriormente
se representa mediante el diagrama B más adelante donde la
numeración y otras convenciones son las mismas que las establecidas
para el tipo A anterior:
Los solicitantes han utilizado los ADNc aislados
de la manera anterior para construir los vectores de expresión tanto
procarióticos como eucarióticos y se han transfectado un número de
huéspedes con estos vectores para la expresión eficaz de una enzima
alfa-amidante.
En las realizaciones preferidas de la invención,
los solicitantes han realizado modificaciones novedosas para los
ADNc anteriormente mencionados con el fin de optimizar no solamente
la expresión, sino también la recuperación de una enzima amidante.
La naturaleza y grado de modificación puede variar con el huésped
y/o vector seleccionado. En las realizaciones de la invención, se
ha insertado un codón de parada cadena arriba de una secuencia que
de otra manera codificaría un dominio que atraviesa membranas. La
presencia de estos dominios que atraviesan membranas puede ser
indeseable para un sistema de expresión de ADN recombinante ya que
puede producir que la proteína expresada se asocie a la membrana y
posiblemente se inactive en el organismo huésped de la línea
celular. Los ejemplos de dominios que atraviesan membranas
aparecen en los dos ejemplos de ADNc expuestos en los diagramas A y
B anteriores (aproximadamente bases 2275-2355 de la
secuencia mostrada en el diagrama A y aproximadamente las bases
2587-2667 de la secuencia mostrada en el diagrama
B). Los ADNc de los diagramas A y B son sustancialmente idénticos
sobre el lateral amino de estos dominios transmembrana con la
excepción de que parecen ser una región de intrón desde la base
1178 a la base 1492 del ADN de tipo B.
Los ADNc de los diagramas A y B anteriores
codifican productos proteicos de aproximadamente 94 y 105 kD,
respectivamente. Ambas proteínas son mayores que las enzimas
maduras, activas que se han purificado a partir de extractos de
tejidos animales o secreciones de líneas celulares. Cada una de
estos productos de traducción primarios son
pre-proenzimas que contienen dominios que
atraviesan membranas en el tercio terminal C de la secuencia
codificante. Se prefiere que el codón de parada se coloque de
manera que la proteína expresada tenga un peso molecular de
aproximadamente 75 para cuando se expresa mediante el ADNc del
diagrama A (es decir la detención se coloca entre las bases 2025 y
2275) y 87 kD cuando se expresa mediante el ADNc del diagrama B, es
decir la detención se coloca entre aproximadamente las bases 2340 y
2587). El peso de una enzima amidante natural madura purificada por
los solicitantes.
Por ejemplo, para la expresión citoplásmica de la
enzima madura alfa amidante en E. coli, se prefiere que las
secuencias génicas que codifican la secuencia señal secretora
natural se eliminen, que un codón de inicio se coloque dentro de
aproximadamente 50 nucleótidos de las secuencias génicas que
codifican el inicio de la proteína madura correspondiente a la
enzima alfa-amidante, y que las secuencias génicas
que codifican el dominio que atraviesa membranas en la región
C-terminal no se traduzca mediante la inserción de
un codón de parada como se requiere de acuerdo a la invención. El
codón de inicio está por supuesto en fase con la secuencia que
codifica la enzima y, en alunas realizaciones preferidas, está
cadena arriba de la región, algunas veces inmediatamente cadena
arriba.
Cuando el ADNc de AE se expresó en E.
coli, se descubrió que la secuencia génica natural contenía un
sitio de unión a ribosomas de E. coli críptico ("RBS")
y codón de inicio interno a las secuencias de inicio naturales. Esto
dio como resultado la producción de una proteína de enzima amidante
terminalmente truncada. Aunque no prevenía la producción del
producto deseado en E. coli, la coexistencia de los
productos correctamente iniciados e internamente iniciados complica
el procesamiento y purificación del producto recombinante a una
forma útil y es por lo tanto indeseable. Para eliminar el producto
no esperado, indeseado, era necesario eliminar bien el sitio de
unión a ribosoma, el codón de inicio interno o ambos de éstos.
Por ejemplo, en ciertas realizaciones preferidas
de la invención, un codón de valina que, en sistemas procarióticos,
codifica una metionina de iniciación, se altera mediante una
mutación puntual a un codón de valina no iniciador equivalente en
las bases 661-663 (de los ADNc de bien el diagrama A
o B). En lugar de esta mutación puntual o además de la misma, los
solicitantes, en otras realizaciones preferidas, suprimen o
sustancialmente modifican una región codificante para un sitio de
unión a ribosoma que se produce justo cadena arriba de un sitio de
inicio interno, y más preferiblemente cualquier sitio de unión a
ribosoma cuando quiera que se pueda producir. Estas modificaciones
se realizan para eliminar sustancialmente el inicio interno de
manera que la proteína expresada debido a que el inicio interno no
se observa como una banda separada después de electroforesis.
Para obtener la expresión de proteína de enzima
alfa amidante secretada, activa, a partir de una línea celular
hospedadora eucariótica recombinante era necesario eliminar las
secuencias génicas que codifican el dominio transmembrana
encontrado en la región C-terminal de las secuencias
génicas naturales. Para el ADNc de tipo A esto se ha realizado
mediante truncamiento de la proteína que codifica la región a
través de la introducción de un codón de parada a o cerca de donde
la enzima amidante natural se procesa
post-traduccionalmente en algunos sistemas
naturales como se explica en detalle más adelante. Para el ADNc de
tipo B esto también se ha realizado introduciendo un nuevo codón de
parada en la región de la proteína de la enzima donde la enzima de
amidación de tipo B natural se procesa
post-traduccionalmente (véase más adelante). Esto no
se debe tomar para excluir la posibilidad de que en algunos
sistemas de células hospedadoras puede ser preferible expresar las
secuencias génicas de origen natural. Debido a que el ADNc de tipo
B contiene secuencias con las características de un intrón no
procesado puede ser una dificultad en la expresión de este ADNc en
algunas células hospedadoras eucarióticas. Estas células pueden
producir no eficazmente un ARNm a partir del gen de tipo B debido a
la presencia de los sitios dadores y aceptores de ayuste apareados.
La eliminación del sitio aceptor podría por lo tato ser necesario
para permitir la expresión eficaz del ADNc de AE de tipo B.
Los inventores han descubierto que el extremo
carboxilo de la proteína de enzima alfa amidante de 75 kD de origen
natural se produce más allá de la posición 709 de aminoácido (814
de tipo B). Para producir la proteína de 75 kD (87 kD de tipo B) en
una célula hospedadora de ADN recombinante, un codón de parada se ha
introducido en el ADNc mediante mutación del codón para la lisina
de la posición 716 de aminoácido (821 de tipo B). Esta modificación
se ha realizado usando mutagénesis específica dirigida al sitio de
oligonucleótidos. Tal mutagénesis se puede llevar a cabo de una
diversidad de formas. Los procedimientos se han revisado
extensamente en la bibliografía de biología molecular. El
procedimiento general que han usado los inventores los describieron
Taylor, J. W. y col (1985), Nucl. Acids Res., 13:
8749-8764; Taylor, J. W. y col., (1985), Nucl.
Acids Res., 13: 8764-8785; Nakamaye, K. y Eckstein,
F. (1986), Nucl. Acids Res., 14: 9679-9698. Los
reactivos necesarios para poner en práctica este procedimiento
están disponibles en forma de un kit de mutagénesis en Amersham
Corporation.
La mutación de la secuencia que han producido los
inventores cambia el codón de lisina AAA por un codón de parada TAA.
El oligonucleótido usado para la mutagénesis incorporaba este
cambio pero era por lo demás idéntico en secuencia a la secuencia
de ADNc de origen natural para la enzima respectiva (tipo A o tipo
B) que se muta.
Los inventores también han descubierto que una
forma reducida de origen natural de la proteína de enzima alfa
amidante se produce mediante el procesamiento de la proteína de
tipo B en la región interna de la proteína que es única para la
proteína de la enzima de tipo B. Esto da como resultado un producto
enzimático que es de aproximadamente 43 kD de masa molecular. Sin
intentar estar unido a ninguna teoría, se cree que la secuencia de
ADN cadena arriba de la región de intrón es suficiente para
codificar un polipéptido capaz de mostrar actividad significativa
alfa-amidante. De acuerdo a lo anterior los
polipéptidos que se recuperan fácilmente y que son capaces de
expresar la actividad alfa-amidante se puede
codificar por los ADNc que están significativamente truncados
mediante colocación de un codón de parada en algún lugar en la
región de intrón del ADNc de tipo B en justo antes o después de la
localización correspondiente donde este intrón está ausente a partir
del ADNc de tipo A. El truncamiento preferido se produce de la
colocación de un codón de parada dentro de aproximadamente 30 bases
del comienzo de la región de intrón, preferiblemente inmediatamente
cadena debajo de las mismas. Para permitir la producción de una
forma corta preferida de proteína de una enzima alfa amidante en
células hospedadoras recombinantes, se crea un ADNc modificado que
tiene un codón de parada en lugar del codón de lisina en la posición
436 de aminoácido del ADNc de tipo B. Esta mutación se llevó a
cabo mediante mutagénesis específica dirigida al sitio del ADNc de
AE de tipo B.
Aunque el acortamiento de la proteína de enzima
amidante mediante la introducción del codón de parada en la
posición 436 de aminoácido del ADNc de tipo B proporciona una
proteína que más estrechamente se aproxima a la producida
naturalmente mediante escisión proteolítica del producto de
traducción primario (o algunos otros intermedios de escisión en la
ruta biosintética), un acortamiento adicional de la proteína de
enzima amidante también puede dar como resultado la producción de
un producto activo en células hospedadoras de ADN recombinante. Los
inventores han modificado el ADNc de AE de varias otras formas para
crear tales formas más cortas de proteína. En un ejemplo, los
inventores han usado mutagénesis específica al sitio de
oligonucleótidos para convertir un codón de tirosina en la posición
396 de aminoácido del ADNc de tipo B a un codón de parada. Este
cambio dará como resultado una proteína que es aproximadamente de
39 kD cuando el ADNc se traduce y procesa. En un segundo caso, los
inventores han utilizado el sitio de reconocimiento enzimático Bam
H1 de origen natural del ADNc de tipo B que introduce un codón de
parada mediante mutagénesis de engarce. Este procedimiento se
conoce bien en biología molecular e implica simplemente la escisión
del ADNc seguido de ligamiento a un fragmento de engarce sintético
de doble cadena que es complementario a un extremo del ADNc
escindido y que se introduce en un codón de parada de fase justo
más allá del sitio de escisión. Los inventores han usado un
fragmento de oligonucleótidos con la siguiente secuencia para
llevar a cabo esta modificación:
Este engarce introduce un codón de parada después
del codón de histidina en el aminoácido 469. La traducción y
procesamiento del ADNc una vez que se ha modificado de esta manera
da como resultado la síntesis de una proteína de aproximadamente 46
kD.
La colocación preferida de un codón de parada de
truncamiento está dentro de aproximadamente 15 bases de una
secuencia de ADN que codifica residuos básicos consecutivos
(usualmente uno Lys-Lys) y especialmente
inmediatamente cadena arriba de los mismos. Sin intentar estar
unido a ninguna teoría, se cree que el polipéptido natural
codificado por los ADNc de tipo B se procesa, durante
modificaciones post-traduccionales que se producen
durante la expresión natural de una enzima amidante, en o cerca de
tales residuos básicos consecutivos, por ejemplo, las lisinas
consecutivas codificadas dentro de la región de intrón del ADNc del
diagrama B. Incluso cuando los codones de parada insertados no se
proponen truncar el polipéptido expresado de la manera descrita
anteriormente, se prefiere que el codón de parad insertado se
coloque dentro de aproximadamente 20 bases, preferiblemente
inmediatamente cadena arriba de, las secuencias de ADN que
codifican residuos de aminoácidos básicos consecutivos. La
inserción de codones de parada en estas posiciones darán como
resultado fácilmente la expresión de un polipéptido que se parecen a
ciertas enzimas amidantes naturales después de que se hayan
sometido a procesamiento post-traduccional.
Para la expresión citoplásmica en sistemas
procarióticos, cualquier secuencia señal que codifica regiones (por
ejemplo, las primeras bases del ADNc de tanto el tipo A como el
tipo B esquematizadas anteriormente) se eliminan preferiblemente y
se inserta un codón iniciador de metionina dentro de
aproximadamente 50 nucleótidos del comienzo de la región que
codifica enzimas amidantes.
Las secuencias de la invención para la expresión
procariótica pueden además alterarse para eliminar cualquier
secuencia codificante para la secuencia señal de secuencia
proenzimática mediante la inserción de un codón iniciador de
metionina dentro de aproximadamente 50 nucleótidos del comienzo de
la región que codifica una enzima amidante. En muchos ADNc de AE
naturales, esto corresponde al comienzo de la región que codifica
ser-x-ser (x siendo phe o leu).
Véase, por ejemplo, las bases 124 a 132 de la secuencia para el
ADNc de tipo A o tipo B. En algunas realizaciones puede ser
deseable la secreción de enzima alfa amidante. En este caso se
prefiere retener las regiones codificantes de la secuencias señal,
o como alternativa reemplazarlas con secuencia heterólogas que
pueden hacer la misma función, por ejemplo, las secuencias señal de
la proteína bacteriana OMP A.
Será fácilmente evidente por los expertos en la
técnica que son posibles numerosas mutaciones y truncamientos de
las secuencias de ADN expuestas en esta memoria descriptiva que
codifican una enzima amidante dentro del alcance de la invención y
que tales secuencias modificadas codificarían polipéptidos capaces
de funcionar como enzimas amidantes. De acuerdo a lo anterior, las
reivindicaciones de los solicitantes se deben construir para incluir
todos los equivalentes funcionales de las secuencias de ADN, los
vectores de expresión y células hospedadoras expuestas
específicamente.
Los ejemplos de vectores de expresión
procarióticos que se pueden modificar deseablemente para que
incluyan secuencias de ADN que codifican enzima amidante de acuerdo
con la invención incluyen pero no se limitan a pKK233-,
pKK322-2, pPROK-1, pkT279, 280,
287, pPL lambda, pYEJ001, pKC30, pPROK-C, todos
comercialmente disponibles. Los huéspedes procarióticos que se
pueden transfectar con vectores de expresión de acuerdo a la
invención incluyen pero no se limitan a C600, LE392, RR1, DH1, SF8,
todos comercialmente disponibles.
Los vectores de expresión eucarióticos que se
pueden modificar deseablemente para que incluyan secuencias de ADN
que codifican una enzima amidante de acuerdo con la invención
incluyen pero no se limitan a pMAMNeo, pdBPVMMTNeo, pRSV,
peuK-C1, pCH110, todos comercialmente disponibles.
También se pueden usar vectores de levaduras apropiados. Los
huéspedes eucarióticos preferidos se pueden transfectar con
vectores de expresión de acuerdo con la invención incluyen pero no
se limitan a IVI depósito 10029, Hela, CV1, C127, CHO (ovario de
hámster chino) y COS.
Con el fin de expresar una enzima alfa amidante
en E. coli (véase el diagrama de flujo de la figura 2), un
fragmento de ADNc que tiene la secuencia expuesta en el diagrama A,
anteriormente, se digirió con KpnI y Hind III y se aisló el
fragmento de aproximadamente 2,1 kD. Para volver a construir un
extremo amino correspondiente a una enzima madura natural, un
engarce de oligonucleótido con la secuencia
se ligó a este fragmento de ADN. El
fragmento resultante contenía un extremo adhesivo compatible Nco I y
un extremo adhesivo Hind III. El vector de expresión de E.
coli pKK233-2 se obtuvo comercialmente en
Pharmacia y se digirió con las enzimas de restricción Nco I e Hind
III. El gran fragmento lineal se aisló y se ligó al fragmento de
ADNc adaptado al engarce. La mezcla de ligamiento se usó para
transformar JM105 de E. coli competente. Los transformantes
se seleccionaron por resistencia a ampicilina y los clones aislados
se analizaron para evaluar el plásmido recombinante mediante enzima
de restricción y análisis de secuencia de ADN para confirmar la
estructura del vector de expresión (de aquí en adelante
"pAE12") que contenían. El vector de expresión contiene el
promotor híbrido trp-lac que se comprimió mediante
el represor lac e inducible mediante tratamiento de las células con
isopropiltiogalactósido (IPTG). Cadena arriba de la metionina
iniciadora el vector también contiene las secuencias de un sitio de
unión al ribosoma
fuerte.
Para obtener la expresión de la enzima alfa
amidante en E. coli, las células recombinantes se hicieron
crecer con agitación en caldo LB a 37ºC hasta una DO_{600} de
0,4. Se añadió IPTG al cultivo hasta una concentración final de 1
mM y se dejó continuar el crecimiento a 37ºC con agitación durante
tres a cinco horas. Las células se recogieron mediante
centrifugación del cultivo y se desechó el sobrenadante. Las
células se volvieron a suspender en tampón que contenía un cóctel de
inhibidores de proteasa, se trataron con lisozima y después se
sonicaron para lisar las membranas celulares. Los lisados se
centrifugaron a 12.000 x g para separar las fracciones solubles e
insolubles de las células. Cada fracción se analizó mediante
SDS-PAGE y tinción de proteínas. La proteína de
enzima alfa amidante se identifico fácilmente como un producto
inducible por IPTG en la fracción proteica insoluble. Ya que el
plásmido de expresión inicial no contenía un codón de parada
especificado por las secuencias génicas de enzima alfa amidante, el
producto inducible formado contiene secuencias especificadas por ADN
de vector cadena abajo condensado al terminal C de las secuencias
de la proteína alfa amidante. Además, la proteína insoluble
inducida también contenía una proteína específica de enzima de
amidación más pequeña que representaba un producto formado por
inicio interno de la síntesis de proteínas en un RBS críptico y un
codón de inicio (posición de aminoácido 221 de la secuencia de
enzima alfa amidante).
Para eliminar las secuencias no deseadas de la
porción C-terminal del producto expresado, se
realizó una mutación del codón de lisina en la posición 716 de la
secuencia de tipo A para generar un codón de parada TAA en esta
posición. El ADNc mutado después se digirió con Kpn I y Eco R1 y
se usó para reemplazar el fragmento original Kpn
I-Eco R1 en el vector de expresión inicial pAE12. De
una manera similar, las secuencias de ADNc de tipo B se mutaron en
la posición comparable (aminoácido 821) para crear un codón de
parada y se usó el fragmento Kpn I-Eco R1 del ADNc
de tipo B mutado para reemplazar el fragmento correspondiente en
pAE12. Los dos plásmidos de expresión así creados pAE24 (tipo A) y
pAE25 (tipo B) se usaron después para transformar JM105. Las cepas
resultantes se cultivaron para expresión como se hizo previamente
para cepas que contenían pAE12. El pAE24 se encontró que producía
dos proteínas insolubles, inducidas por IPTG de aproximadamente 75
kD y 55 kD mientras que el pAE25 se encontró que producía dos
proteínas insolubles inducibles por IPTG de aproximadamente 87 kD y
67 kD. De nuevo, la proteína pequeña en cada uno de estos pares
representa el producto no deseado amino terminal a partir de ADNc de
tipo A o de tipo B.
Para eliminar el inicio de la síntesis de
proteínas en el sitio de unión a ribosoma interno críptico y codón
de inicio, (posición de aminoácido 221) el codón de inicio GTG,
(GTG puede servir como un codón met iniciador en bacterias), se
convirtió en un codón GTT que no puede iniciar la síntesis de
proteínas pero que todavía codifica la valina que normalmente se
encuentra en esta posición en las proteínas de enzima alfa amidante
codificadas por genes naturales. Cuando la región mutada del ADNc
se sustituyó por la secuencia natural en los vectores de expresión
pAE24 y pAE25, se crearon dos nuevos vectores, pAE31 y pAE32. La
transformación de JM105 de E. coli con estos vectores y el
análisis de la producción de proteínas a partir de las cepas
recombinantes resultantes indicó que esta mutagénesis era eficaz en
la eliminación del inicio interno no deseado. El producto inducido
por IPTG a partir de las células hospedadoras que llevan pAE31 se
encontró que era de 75 kD mientras que a partir de las células
transfornmadas con pAE 32 se encontró que era de 87 kD.
Ya que los inventores han encontrado la enzima
alfa amidante de origen natural del ADNc de tipo B se procesa
post-traduccionalmente para proporcionar proteínas
de aproximadamente 43 kD, los inventores han preparado una serie de
mutaciones en el ADNc de AE de tipo B que permite la expresión de
proteínas que terminan o están cerca de la posición donde se
procesan los extremos de la enzima naturalmente. Dos de estas
mutaciones se prepararon mediante mutagénesis de oligonucleótidos
mientras un tercero se creó mediante mutación de
adatpador-engarce como se ha indicado anteriormente.
Cuando los ADNc que llevan estas mutaciones se usaron para
reemplazar los segmentos correspondientes de pAE32, transformados
en JM105 y analizados para la producción de proteínas en
experimentos similares a los descritos anteriormente, se detectaron
proteínas de enzima alfa amidante truncada. Con una mutación en la
posición 396 de aminoácido de ADNc de tipo B cambiando un codón de
tirosina natural a un codón de parada (pAE36), se encontró una
proteína de enzima de 39 kD mientras que una mutagénesis de engarce
que terminaba la traducción en el codón de histidina de aminoácido
464 daba como resultado un vector, pAE51, que producía una proteína
de enzima alfa amidante recombinante de 46 kD después de la
transformación e inducción de JM105 de E. coli.
Todas las proteínas de enzima alfa amidante
recombinante producidas en E. coli descritas anteriormente
se encontró que se segregan con la fracción insoluble de los
extractos celulares. Las enzimas se pueden hacer solubles y activas
mediante tratamiento con urea 8 M seguido de dilución rápida en
Tris-HCl 50 mM pH 7. Cuando JM105 de E. coli
que lleva pAE12 se desarrolló y se indujo con IPTG como se ha
descrito, las proteínas de enzima alfa amidante estaban presentes a
niveles de al menos 30 mgs por litro de cultivo bacteriano.
Las muestras representativas de la proteína
insoluble inducida producidas en E. coli que lleva los
plásmidos de expresión de AE se muestran en las figuras 3 y 4.
Para generar un vector de expresión de mamíferos
que expresa y secreta constitutivamente enzima alfa amidante de
tipo A de 75 kD a partir de células de mamíferos (véase el diagrama
de flujo de la figura 1), se realizó lo siguien-
te:
te:
- 1)
- El vector de expresión intermedio pdMMTNeo (comercialmente disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo) (como se ha mostrado) se digirió con Bgl II. La forma lineal se aisló y se purificó.
- 2)
- El ADNc de tipo A recombinante que contiene la secuencia perpro completa y un codón de parada artificial TAA en la posición 2146-2148 se aisló mediante digestión secuencial con Bgl I y Xho I. Después el fragmento correspondiente a la enzima alfa amidante se aisló y se purificó.
- 3)
- La inserción (enzima alfa amidante de tipo A) y el vector (pdMMTNeo) se mezclaron y los extremos correspondientes se hicieron romos usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. Los segmentos salientes en 5' se llenaron con dNTP añadido, y los segmentos salientes en 3' se volvieron a digerir para producir un extremo romo (como alternativa S1 nucleasa secuencial y Klenow + dNTP se podría utilizar para producir extremos romos). Después las moléculas de extremos romos se ligaron durante 16 horas a 15ºC.
- 4)
- Después el material ligado se transformó en RRI de E. coli. Los clones recombinantes se seleccionaron en presencia de 50 ug/ml de ampicilina. La orientación de la inserción en los clones recombinantes se verificó usando una batería de enzimas de restricción. Un clon que se denominó pdMMTNeo \alpha-AE_{A75} (clon 11) se determinó que tenía el ADNc de tipo A en la orientación correcta con respecto al promotor de MMT.
- 5)
- El ADN de plásmido pdMMTNeo \alpha-AE_{A75} recombinante (clon 11) se digirió con BamHI. El vector linealizado se aisló y se purificó y después se trató con fosfatasa alcalina bacteriana (B. A. P.) durante 2 horas a 37ºC para eliminar los 5' fosfatos. El genoma de BPV-1 se aisló y se purificó después de una digestión con B y BamHI del vector pdBPVMMTNeo. Este fragmento BamHI de ADN de BPV-1, que es aproximadamente de 8,0 kD, después se ligó al BamHi linealizado y el vector pdMMTNeo \alpha-AE_{A75} se trató con B. A. P., durante 3 horas a 14ºC. Después la mezcla de ligamiento se transformó en RR1 de E. coli, los clones recombinantes se seleccionaron sobre placas de agar LB con 50 ug/ml de ampicilina. Los plásmidos recombinantes se analizaron para ADN de BPV y también se analizaron para ADNc de AE de tipo A. El mapeo de restricción reveló que el clon 21 era aproximadamente de 17 kb y produjo un mapa de restricción como se esperaba. Este plásmido de expresión se usó después para expresión de \alpha-AE_{A75} en células C127 de ratón.
- 6)
- Las células C127 de ratón se transfectaron con 20 ug de pdBPV-MMTNeo \alpha-AE_{A75} mediante técnica de precipitación habitual con CaPO_{4}. Aproximadamente 2 semanas después de la transfección, los focos transformados de recogieron individualmente y se desarrollaron en medio de crecimiento que contenía el antibiótico G418. Cuando las células se desarrollaron hasta una capacidad suficiente en medio de Eagle modificado por Dulbecco más suero de ternera fetal, los clones se evaluaron para determinar la capacidad de secretar enzima alfa amidante midiendo la actividad enzimática en el medio de cultivo de células reacondicionado, así como midiendo la inmunorreactividad de enzima alfa amidante en el medio usando técnicas de radiomarcaje e inmunoprecipitación habituales. Los clones que secretan enzima alfa amidante activa, inmunorreactiva de 75 kD se expandieron hasta números grandes de células (intercambiadas a medio de cultivo celular con suero reducido y por lo tanto nivel reducido de proteína exógena) y están en uso para producir grandes cantidades de enzima recombinante activa a partir de medio reacondicionado de células.
Los términos y descripciones usadas en esta
memoria descriptiva, son realizaciones expuestas a modo de
ilustración solamente, y no se proponen como limitaciones de las
muchas variaciones que los expertos en la técnica reconocerán que
son posibles cuando se pone en práctica la presente invención, como
se define mediante las siguientes reivindicaciones.
Claims (18)
1. Un huésped capaz de expresar la secuencia de
polipéptidos de una enzima alfa amidante, dicho huésped
comprendiendo un vector de expresión que contiene un promotor
transcripcional seguido cadena abajo de una secuencia de ADN foráneo
a dicho huésped que codifica la peptidil glicina
\alpha-amidante monooxigenasa y tiene la
secuencia seleccionada entre:
Tipo
A
y
\newpage
Tipo
B
en el que dicha secuencia de ADn
incluye un codón de parada cadena arriba de una secuencia que de
otra manera codificaría una región que atraviesa
membranas.
2. El huésped según la reivindicación 1 en el que
dicho codón de parada está incluido entre las bases 2025 y 2275 para
la secuencia de tipo A o entre las bases 2340 y 2587 para la
secuencia de tipo B.
3. Un vector de expresión como se ha definido en
la reivindicación 1 ó 2
4. Un vector de expresión según la reivindicación
3 en el que la secuencia de ADN es de tipo A.
5. Un vector de expresión según la reivindicación
3 en el que la secuencia de ADN es de tipo B.
6. Un vector de expresión según una cualquiera de
las reivindicaciones 3 a 5 en el que dicho vector se forma ligando
dicha primera secuencia de ADN en un sistema de expresión
seleccionado entre el grupo constituido por pdBPVMMTNeo, pSV_{2},
pRSV, pMAMNeo, pueK-C1, pCH110, y los derivados de
los anteriores.
7. Un huésped procariótico que comprende el
vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a
6.
8. Un huésped eucariótico que comprende el vector
de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.
9. El huésped según la reivindicación 8, en el
que dicho huésped se selecciona entre el grupo constituido por IVI
depósito 10029 (ATCC CRL 10919), Hela, CV1, C127, CHO (ovario de
hámster chino) y COS.
10. La peptidil glicina
\alpha-amidante monooxigenasa recombinante que se
ha producido mediante la expresión del vector de una cualquiera de
las reivindicaciones 3 a 6, o a partir de la expresión de dicha
enzima a partir del huésped de una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 ó 7 a 9.
11. Un procedimiento de amidación de un sustrato
que comprende poner en contacto dicho sustrato con la peptidil
glicina \alpha-amidante monooxigenasa
recombinante que se ha producido mediante:
- i)
- expresar un vector de expresión que contiene un promotor transcripcional seguido cadena debajo de una secuencia de ADN foráneo al huésped que comprende dicho vector de expresión que codifica la peptidil glicina \alpha-amidante monooxigenasa y tiene la secuencia seleccionada entre:
\newpage
Tipo
A
y
\newpage
Tipo
B
en la que dicha secuencia de ADN
incluye un codón de parada cadena arriba de una secuencia que de
otra manera codificaría una región que atraviesa membranas,
o
- ii)
- expresar dicha enzima a partir de un huésped que comprende dicho vector de expresión.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11
en el que dicho codón de parada está incluido dentro de las bases
2025 y 2275 para la secuencia de tipo A o entre las bases 2340 y
2587 para la secuencia de tipo B.
13. Un procedimiento como se ha definido en la
reivindicación 12 en el que la secuencia de ADN es de tipo A.
14. Un procedimiento como se ha definido en la
reivindicación 12 en el que la secuencia de ADN es de tipo B.
15. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14 en el que dicho vector se forma ligando
dicha primera secuencia de ADN en un sistema de expresión
seleccionado entre el grupo constituido por pdBPVMMTNeo, pSV_{2},
pRSV, pMAMNeo, pueK-C1, pCH110, y los derivados de
los anteriores.
16. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15 en el que dicho huésped es
procariótico.
17. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15 en el que dicho huésped es
eucariótico.
18. Un procedimiento según la reivindicación 17,
en el que dicho huésped se selecciona entre el grupo constituido por
IVI depósito 10029 (ATCC CRL 10919), Hela, CV1, C127, CHO (ovario
de hámster chino) y COS.
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