ES2235200T3

ES2235200T3 - Mutante de hgf y su uso como agente anticanceroso.

Info

Publication number: ES2235200T3
Application number: ES96935432T
Authority: ES
Inventors: Toshikazu Nakamura
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-10-24
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2016-10-23
Also published as: DE69634138D1; ATE285785T1; EP0890361A4; JPH09110716A; DE69634138T2; WO1997016205A1; CA2235805C; EP0890361A1; CA2235805A1; EP0890361B1; JP3832674B2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN AGENTE ANTITUMORAL QUE CONTIENE LA PROTEINA DE CADENA AL (FRAGMENTO AL ) DE UN HGF (FAC TOR DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS), COMO INGREDIENTE ACTIVO. DICHO FRAGMENTO AL QUE ACTUA A MODO DE INGREDIENTE ACTIVO FUN CIONA COMO ANTAGONISTA, INHIBIENDO ESPECIFICAMENTE LA CAPACIDAD DE LAS CELULAS CANCEROSAS PARA INVADIR O METASTATIZAR POR MEDIO DE HGF. EL CITADO MEDICAMENTO ES ESPECIFICAMENTE EFECTIVO PARA INHIBIR LA INVASION Y METASTASIS DE CELULAS CANCEROSAS, P. EJ. DE CANCER DE VESICULA BILIAR Y PULMON, QUE SON ALTAMENTE METASTATICAS Y PRODUCEN UNA ELEVADA LETALIDAD. EL MEDICAMENTO DESCRITO SE EMPLEA COMO AGENTE PARA LA TERAPIA, PREVENCION, ETC. DEL CANCER, Y ES ALTAMENTE UTIL EN EL AREA CLINICA.

Description

Mutante de HGF y su uso como agente anticanceroso.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un agente anticanceroso. Más específicamente, se refiere a un nuevo agente anticanceroso que contiene una cadena \alpha del HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) como ingrediente activo, capaz de suprimir carcinomas, en especial la invasión y metástasis del carcinoma, sobre la base de su actividad antagonista del receptor c-Met/HGF.

Técnica anterior

El control del cáncer es un objetivo de la mayor importancia en la medicina de hoy y un nuevo tratamiento del cáncer y nuevos agentes anticancerosos son temas del mayor interés entre los investigadores médicos y farmacéuticos. En la actualidad, la principal causa de muerte en Japón es el cáncer y cada año aparecen muchos nuevos pacientes.

Sustancias de modificación biorreactiva derivadas de microorganismos representadas por Picibanil (marca de Ghugai Pharmaceutical, Japón) y Krestin (marca de Sankyo Pharmaceutical, Japón) aparecieron como agentes anticancerosos usados en quimioterapia, aparte de los agentes alquilantes convencionales, los antagonistas metabólicos y los antibióticos. Al principio, los compuestos existentes tales como los agentes alquilantes usaron la citotoxicidad y los usos estaban considerablemente limitados debido a los claros efectos secundarios, sin embargo, el Picibanil y otras últimas sustancias de modificación biorreactiva poseen acciones de potenciación de la función inmunitaria del cuerpo y eliminan las células cancerosas. Sin embargo, dado que se han reconocido sus límites, la atención se ha dirigido hacia proteínas bioactivas derivadas de animales superiores, tales como el interferón, la interleuquina-2 y el TNF (factor de necrosis tumoral). Sin embargo, en realidad sus espectros de acción eran, con mucho, más amplios de lo que se había estimado previamente, y se perdió la creencia de que no poseían efectos secundarios.

En este contexto, al menos es cierto que el tratamiento del cáncer está cambiando de dirección, es decir, desde la evaluación convencional de la simple lucha contra el centro del cáncer al concepto de considerar la "calidad de vida" para evaluar el tratamiento en el proceso de la mejoría de la función total del cuerpo, y ya se ha comunicado que el HGF descubierto por el presente inventor es un ingrediente activo para el agente anticanceroso (patente japonesa abierta a consulta por el público nº 6-25010).

Como se ha mencionado antes, los agentes anticancerosos existentes están muy lejos de ser un remedio decisivo a causa de los efectos secundarios y las dudas existentes acerca de la propia acción anticancerosa, y las proteínas bioactivas de la siguiente generación son principalmente factores relacionados con el sistema inmunológico hasta los desarrollados en el pasado y no siempre cabe esperar que se usen ampliamente como principales agentes anticancerosos. En consecuencia, entre las proteínas bioactivas producidas en el cuerpo, en particular entre las que poseen acción fisiológica y sometidas a la suficiente investigación del espectro de su actividad, es necesario descubrir un agente anticanceroso verdadero. Especialmente, dado que las proteínas bioactivas, interferones e interleuquinas desarrollados hasta ahora son principalmente factores relacionados con el sistema inmunológico, los factores biológicos que tienen una acción completamente diferente parecen importantes como futuros agentes anticancerosos.

En Japón, como se ha mencionado antes, el cáncer es la principal causa de muerte, pero se puede decir que su riesgo depende de la invasión y metástasis de las células cancerosas. Se ha indicado que varios factores de crecimiento están relacionados con la capacidad de invasión y metástasis de las células cancerosas y recientemente se ha desvelado que el HGF es un potente factor de inducción de la capacidad de la invasión y metástasis a varias células cancerosas (H. Shimura y col., J. Jap. Cancer Res. 86, 662-669, 1995). En realidad, se ha confirmado que la capacidad de invasión del cáncer de pulmón y del cáncer de vesícula biliar, de los que se sabe que tienen una malignidad extremadamente elevada, está inducida por el HGF, y se sabe que el nivel del HGF en los tejidos primarios del cáncer de pulmón es un factor de riesgo que se correlaciona estrechamente con la malignidad y la mortalidad del cáncer de pulmón.

El HGF es una proteína que se ha descubierto como un factor de proliferación de las células parenquimatosas hepáticas in vitro (Biochem Biophys Res Commun. 122, 1450, 1984; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6489, 1986; FEBS Letter, 22, 311, 1987; Nature, 342, 440, 1989; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990). Como resultado de estudios recientes llevados a cabo por el presente inventor y muchos otros investigadores se ha descubierto que este HGF, primero descubierto como factor para la proliferación específicamente de las células hepáticas parenquimatosas, muestra varias actividades en el cuerpo tales como cicatrización tisular de heridas, y se espera aplicar como remedio en seres humanos y animales, así como el sujeto de estudio. En cuanto al un receptor de tal HGF, en estudios recientes se ha revelado que el oncogen c-Met prot codifica el receptor de HGF (Bottaro y col., Science, 251, 802-804, 1991; Naldini y col., Oncogen, 6, 501-504, 1991).

Por tanto, está claro que el HGF es un factor para la potente inducción de la capacidad de invasión y metástasis en varias células cancerosas, y el desarrollo de un antagonista e inhibidor para el bloqueo específico de la capacidad de invasión y metástasis de las células cancerosas por el HGF parece ser un sujeto de estudio extremadamente importante desde el punto de vista del control del cáncer.

Descripción de la invención

Como resultado de intensos estudios desde tal punto de vista, el inventor descubrió una sustancia que tenía una actividad de supresión de la capacidad de invasión y metástasis de las células cancerosas inducida por el HGF (es decir, la actividad antagonista del receptor c-Met/HGF de la célula) y encontró que esta sustancia suprime la capacidad de invasión y metástasis de las células cancerosas y, por tanto, es extremadamente útil como agente anticanceroso, y de este modo completó la presente invención. Por tanto, un objeto de la presente invención es presentar una medicina extremadamente útil como agente anticanceroso sobre la base de la actividad antagonista del receptor c-Met/HGF de la célula.

Es decir, la invención proporciona un agente anticanceroso que contiene una proteína que posee las siguientes propiedades fisicoquímicas y actividades fisiológicas (en lo sucesivo denominado fragmento \alpha) como ingrediente activo:

a): compuesto por la cadena \alpha del HGF que se puede obtener mediante la digestión del HGF con elastasa;

b): que tenga un peso molecular de 55-69 kDa; y

c): que tenga actividad antagonista del receptor c-Met/HGF.

Otras formas de realización de la presente invención se refieren al uso del fragmento \alpha como se ha definido anteriormente para fabricar un agente anticanceroso.

Breve descripción de las figuras

La fig. 1 es un cromatograma obtenido cuando se purifica el HGF digerido por la enzima mediante HPLC de fase inversa.

La fig. 2 es una fotografía de electroforesis que muestra el resultado de la electroforesis (SDS-PAGE, en condiciones de reducción) del HGF digerido con la enzima purificado mediante HPLC de fase inversa.

La fig. 3 es un fotografía que muestra el efecto de dispersión del fragmento \alpha en células MDKC.

La fig. 4 es un fotografía que muestra el efecto de dispersión del fragmento \alpha en células MDKC en presencia de HGF.

La fig. 5 es un gráfico que muestra los efectos del HGF, el EGF y el fragmento \alpha sobre la síntesis de ADN de células hepáticas de rata. En el gráfico, (a) es un sistema de adición de HGF, (b) es un sistema de adición de fragmento \alpha, (c) es un sistema de adición de fragmento \alpha en coexistencia de 10 ng/ml de EGF.

La fig. 6 es una fotografía que muestra el efecto del fragmento \alpha sobre la invasión de las células GB-d1.

La fig. 7 es una fotografía que muestra el efecto del fragmento \alpha sobre la invasión de las células GB-d1 en coexistencia de HGF.

La fig. 8 es una expresión gráfica de los resultados de la Fig. 6 y la Fig. 7.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Como se ha mencionado antes, el inventor ha estado estudiando los factores de crecimiento de las células hepáticas parenquimatosas durante años y ha tenido éxito en el aislamiento y purificación del HGF. Inicialmente, el HGF es un polipéptido del que se ha descubierto que es un factor para la estimulación de la proliferación de las células hepáticas parenquimatosas y el inventor ha descubierto que también funciona como motógeno para estimular la motilidad celular, además de la función de control del crecimiento celular (T. Nakamura, Prog. Growth Factor Res., 3, 67-85, 1991). La estimulación de la motilidad celular por parte del HGF está relacionada con la disminución de la adherencia entre las células a través de la cadherina mediante la fosforilación de la \beta-catenina y el sistema de transmisión de información a través de la activación de la proteína G rho pequeña. Más recientemente, se ha descrito que la p125FAK (quinasa de adherencia focal) se localiza en sentido proximal de rho, de forma que el HGF produce la fosforilación transitoria de p125FAK (K. Matsumoto y col., J. Biol. Chem. 269, 31807-31813, 1994). Después de la estimulación del HGF, la fosforilación de p125FAK contribuye a la formación inicial de adherencia focal y reconstrucción del esqueleto celular, y la estimulación de la motilidad celular por parte del HFF, se considera que la interacción entre las células y la matriz está regulada a través de p125FAK.

Tradicionalmente se ha sabido que la proliferación y la capacidad de invasión y metástasis de las células cancerosas depende en gran medida de la interacción entre las células cancerosas y las células estromales adyacentes (relación tumor-huésped). El inventor descubrió que el HGF derivado de intersticio del huésped y el factor inductor de HGF derivado de las células cancerosas (insulina) contribuyen al agravamiento del cáncer (proliferación, invasión y metástasis) (K. Matsumoto y col., Gann Monograph nº 42: Growth Factors: Cell growth. Morphogenesis and Transformation, CRC press 92-112, 1994; K Rygaard y col., Intern. J. Oncology, 2, 991-996, 1993; W. G. Jiang y col., Clin & Exp. Metastasis, 11, 235-242, 1993; S. P. Seslar y col., Cancer Res., 58, 1233-1238, 1993; N. Rahimi y col., DNA and Cell biol., 13, 1189-1197, 1994; S. Bellusci y col., Oncogene, 9, 1091-1099, 1994).

En general, el cáncer de vesícula biliar es un cáncer maligno con una tasa de metástasis y un índice de mortalidad elevados. Las células cancerosas de vesícula biliar humana muestran una invasión elevada de las células estromales del huésped, pero no invaden el gel del cultivo en gel de colágeno in vitro. Sin embargo, en cultivo simultáneo con fibroblastos estromales normales y gel de colágeno, las células de cáncer de vesícula biliar invaden de forma activa el gel y la capacidad de invasión de las células de vesícula biliar está inducida por la interacción con las células estromales a través de un factor líquido. Además, la invasión de las células cancerosas en el cocultivo se ve completamente inhibida por la adición de anticuerpo antiHGF y se ha encontrado que el factor de invasión derivado del estroma es el HGF. Esta invasión de las células de cáncer de vesícula biliar en el gel no está inducida por factores de crecimiento representativos tales como EGF, TFG-\beta, PDGF y bFGF, y es específica del HGF. Por otro lado, las células de cáncer de vesícula biliar producen y secretan factores para la inducción del la producción de HGF de los fibroblastos estromales y se descubrió que la sustancia de este inductor de HGD era la IL-1\beta. Se ha descubierto que la sustancia del factor de invasión derivado del estroma, no sólo en las células de cáncer de vesícula biliar sino también en células de muchos carcinomas tales como células de cáncer epitelial de la mucosa oral, es el HGF (K. Rygaard y col., Intern. J. Oncology, 2, 991-996, 1993; W. G. Jiang y col., Clin. & Exp. Metastasis, 11, 235-242, 1993; S. P. Seslar y col., Cancer Res., 58, 1233-1238, 1993; N. Rahimi y col., DNA and Cell Biol., 13, 1189-1197, 1994).

Se dice que la mortalidad por causa del cáncer se puede disminuir mediante la prevención de la invasión y la metástasis de las células cancerosas. Más del 80% del cáncer es carcinoma y la mayor parte son células diana del HGF que expresan el receptor c-Met/HGF. Por tanto, es importante desarrollar un antagonista para bloquear la función de invasión y metástasis de las células cancerosas causada por el HGF.

El inventor ha descrito los siguientes puntos en los estudios secuenciales sobre el HGF. En primer lugar, el HGF es un heterodímero que comprende aproximadamente 69 kDa de cadena \alpha y aproximadamente 34 kDa de cadena \beta. La cadena \alpha del HGF contiene un dominio en horquilla en el extremo N y cuatro dominios en forma de garrucho, y la cadena \beta contiene un dominio del tipo serin proteasa, y, por tanto, el HGF es un factor de crecimiento que tiene una estructura en dominios muy peculiar. El inventor ya ha preparado varios HGF en los que ha eliminado estructuras de dominio del tipo de deleción mediante técnicas de ingeniería genética y descubrió que los dominios en horquilla en el extremo N y el primero y el segundo dominio en forma de garrucho de la cadena \alpha es un dominio pequeño que se une al receptor c-Met/HGF. Por tanto, al introducir genéticamente la mutación en este pequeño dominio de unión se considera posible fabricar un antagonista del receptor de HGF. Hasta ahora, en estudios con factores para suprimir la invasión y la metástasis de las células cancerosas, la diana fue, principalmente, la proteasa de la matriz derivada de las células cancerosas, pero todavía no se ha desvelado la sustancia eficaz para el bloqueo de la invasión y la metástasis de las células cancerosas.

En contraste con ello, el objeto de la invención es bloquear la señal de inducción de la invasión y la metástasis de las células cancerosas en el lado distal y es una característica principal que se basa en una estrategia completamente nueva, y ésta es una invención pionera.

El agente anticanceroso de la invención contiene la proteína (fragmento \alpha) con las propiedades psicoquímicas y actividades fisiológicas mencionadas anteriormente y un ingrediente activo, y esta proteína se puede obtener, por ejemplo, mediante un procedimiento de descomponer enzimáticamente el HGF, un procedimiento de preparación mediante técnicas de ingeniería genética y un procedimiento de preparación química.

En cuanto al HGF usado en el procedimiento de descomposición enzimática, se puede usar HGF preparado mediante varios procedimientos. Se conocen muchos procedimientos para preparar HGF y, por ejemplo, el HGF se puede obtener mediante extracción y purificación de órganos tales como el hígado, el bazo, el pulmón, la médula ósea, el cerebro, los riñones y la placenta, células sanguíneas tales como plaquetas y leucocitos, plasma y suero de mamíferos tales como ratas, vacas, caballos y ovejas (FEBS Letters, 224, 312, 1987; Proc. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989).

Asimismo, es posible obtener HGF mediante cultivo de células de cultivo primarias o de líneas celulares productoras de HGF, seguido por la separación y la purificación del producto del cultivo (por ejemplo, del sobrenadante del cultivo, células cultivadas). Además, se puede obtener HGF mediante el procedimiento de ingeniería genética, que comprende la recombinación del gen que codifica HGF con el vector adecuado, su inserción en una célula huésped adecuada para dar un transformante y la separación del HGF recombinante deseado del sobrenadante del cultivo del transformante (por ejemplo, Nature, 342, 440, 1989, "Kokai" de solicitud de patente japonesa números 111383/1993 y 255096/1991, Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989).

No hay una limitación específica de la célula huésped y se pueden usar varias células huésped usadas convencionalmente en los procedimientos de ingeniería genética, que son, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, levaduras, hongos filamentosos y células vegetales o animales.

Más específicamente, el procedimiento de extracción y purificación de HGF de tejidos hepáticos es, por ejemplo, administrar a una rata por vía intraperitoneal tetracloruro de carbono, extraer el hígado de la rata con hepatitis, molerlo y purificarlo mediante la técnica habitual de purificación de proteínas tal como una cromatografía en columna en gel usando S-Sefarosa y heparina sefarosa, o HPLC.

Además, mediante el procedimiento de ingeniería genética se transforman células animales, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de ratón C127, células de mono COS, células Sf (Spodoptera frugiperda) y similares, con el gen que codifica la secuencia de aminoácidos de HGF y se puede obtener el HGF del sobrenadante del cultivo de los transformantes. A propósito se puede usar HGF derivado de seres humanos o de mamíferos, aunque se prefiere el HGD derivado de seres humanos y es más preferible el HGF recombinante humano ("Kokai" de solicitud de patente japonesa número 111383/1993).

En cuanto al HGF obtenido de este modo, tan sustancialmente eficaces como el HGF, hay posibilidades de que una parte de la secuencia de aminoácidos se delecione o sustituya con otro u otros aminoácidos, que otra secuencia de aminoácidos se inserte parcialmente, que 1, 2 o más aminoácidos se unan a los extremos C o N o que los azúcares se delecionen o sustituyan.

La descomposición enzimática del HGF se lleva a cabo mediante, por ejemplo, digestión del HGF con enzimas tales como elastasa. A continuación, el producto de la digestión se purifica mediante un procedimiento convencional de purificación de proteínas tal como cromatografía líquida de alto rendimiento, y se aísla un HGF de bajo peso molecular compuesto por un fragmento de 55-69 kDa con la cadena \alpha, de forma que se obtiene la proteína (fragmento \alpha) con las propiedades físicoquímicas y las actividades fisiológicas mencionadas anteriormente.

El fragmento \alpha de la invención no sólo se limita a los obtenidos mediante los procedimientos anteriores, sino que se puede preparar químicamente según el procedimiento convencional de síntesis peptídica. Asimismo, el fragmento \alpha se puede obtener mediante el procedimiento de ingeniería genética mencionada anteriormente usando genes codificadores de la secuencia de aminoácidos del fragmento \alpha.

Como se muestra en los siguientes ejemplos, se ha descrito que el fragmento \alpha tiene la actividad antagonista del receptor c-Met/HGF para bloquear la actividad mitogénica y motogénica del HGF y suprimir la invasión de las células cancerosas. Por tanto, el agente de la invención principalmente compuesto por fragmento \alpha es útil como agente anticanceroso para seres humanos y mamíferos (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, monos, perros, gatos), en especial como supresores de la invasión y supresores de la metástasis de las células cancerosas.

Otras formas de realización de la presente invención se refieren al uso del fragmento \alpha como se ha definido antes en la presente memoria descriptiva como un agente anticanceroso.

El agente anticanceroso de la invención se prepara en varias formas de dosificación (por ejemplo, líquida, sólida, cápsula), y generalmente se prepara como una inyección del ingrediente activo del fragmento \alpha sólo, o junto con un vehículo convencional, o como una preparación oral junto con un vehículo convencional. La inyección se puede preparar mediante un procedimiento convencional, por ejemplo, el fragmento \alpha se disuelve en un disolvente adecuado (por ejemplo, agua esterilizada, solución tampón, suero salino fisiológico), se filtra para su esterilización y se introduce en un recipiente aséptico. Normalmente, el contenido del fragmento \alpha en la inyección se ajusta a 0,0002 a 0,2 (p/v%) o, preferentemente, a 0,001 a 0,1 (p/v %). Como la preparación oral, se prepara en, por ejemplo, comprimidos, gránulos, gránulos finos, polvos, cápsulas blandas o duras, líquido, emulsión, suspensión, jarabe, y tales formas de dosificación se pueden preparar mediante procedimientos convencionales de fabricación. El contenido del fragmento \alpha en la preparación puede ajustarse de forma adecuada según la forma de dosificación y las enfermedades a las que se aplica.

Preferentemente, en la fabricación farmacéutica se puede añadir un agente estabilizante y entre los ejemplos de tales agentes estabilizantes se pueden incluir, entre otros, albúmina, globulina, gelatina, manitol, glucosa, dextrano y etilenglicol. La preparación de la invención también puede contener otros aditivos necesarios para la fabricación, tales como excipientes, auxiliares de la disolución, antioxidantes, agentes analgésicos y agentes isotónicos. En la preparación líquida se prefiere su almacenamiento en condiciones de congelación o tras la eliminación de agua mediante un procedimiento, tal como secado por congelación. La preparación secada por congelación se usa disolviéndola de nuevo mediante la adición de agua destilada antes de usar para su inyección.

La preparación de la invención se debe administrar a través de una vía adecuada según la forma de dosificación. Por ejemplo, la inyección se puede administrar por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea e intramuscular. La dosis se ajusta de forma adecuada en función del síntoma, el agente o el peso corporal del paciente y normalmente se usan de 0,01 mg a 100 mg del fragmento \alpha, que se administran una vez al día o se divide en varias porciones.

Aplicabilidad industrial

En la invención, el ingrediente activo del fragmento \alpha posee un efecto específico para la supresión de la invasión o la metástasis de las células cancerosas tales como en el cáncer de vesícula biliar, el cáncer de pulmón y otros, que son altamente metastásicos y tienen como resultado una letalidad elevada. Por tanto, el agente anticanceroso de la invención puede usarse en el tratamiento y la prevención del cáncer y es extremadamente útil desde el punto de vista clínico.

Ejemplos

La invención se describe de forma más específica a continuación haciendo referencia a los Ejemplos y los Ejemplos de prueba.

Ejemplo 1 Aislamiento y purificación del fragmento \alpha del HGF

Se produjo la digestión de 900 mg de HGF recombinante con elastasa durante 1 hora y se purificó mediante HPLC de fase inversa (C4). Su cromatograma se muestra en la Fig. 1. Como se muestra en la Fig. 1 se obtuvieron cuatro picos y se identificó que el primer pico era el fragmento \alpha, el segundo pico era HGF sin digerir y el tercer y el cuarto pico eran \beta-1 y \beta-2 respectivamente. Después se eliminó el disolvente mediante un sistema de secado por congelación y se recogió cada una de las fracciones y se volvieron a suspender en agua destilada. Mediante SDS-PAGE se encontró que las sustancias obtenidas eran fragmentos \alpha y \beta (véase Fig. 2). Como resultado de la determinación de proteínas se obtuvieron 178 mg de fragmento \alpha.

Ejemplo 2 Análisis de la acción como motógeno usando células MDKC

Las células MDKC se prepararon en 2 x 104 células/ml en medio ce cultivo DMEM con 10% de FBS y se sembraron en placas de 48 pocillos a 250 ml/pocillo. Al añadir fragmento \alpha solo en un intervalo de 10 ng/ml a 10 mg/ml y cultivarlo durante 24 horas se observó la superficie mediante microscopio de contraste de fases. Los resultados se muestran en la Fig. 3. Como se muestra en la fig. 3, en el fragmento \alpha no se reconoció acción de dispersión. A continuación, mediante la adición simultánea de 2 ng/ml de HGF se estudió el efecto inhibidor del HGF. Los resultados se muestran en la Fig. 4 (en la fotografía, la indicación "\alpha" indica la concentración del fragmento \alpha (aumento), en lo sucesivo igual). Como se muestra en la Fig. 4, cuando la concentración superó las 1000 veces, se observó la inhibición de la dispersión de un modo dependiente de la dosis. Por tanto, se sugirió firmemente que el fragmento \alpha era un antagonista del HGF.

Ejemplo 3 Análisis de la acción como mitógeno usando células hepáticas de rata

Se cultivaron células hepáticas de rata en placas de 38 pocillos de forma que ocupen un área de aproximadamente el 50% y se añadieron HGF, EGF y fragmento \alpha y se cultivaron durante 22 horas. Se marcaron con ^{125}I-BrdU (0,15 mCi/pocillo) durante 4 horas y se midió con un contador de centelleo. Los resultados se muestran en la Fig. 5. En un intervalo de 10^{2} ng/ml a 10^{4} ng/ml de fragmento \alpha no se reconoció la acción de estimulación de síntesis de ADN. Cuando se añadieron simultáneamente 5 ng/ml de HGF se descubrió que la actividad mitogénica del HGF se suprimía de forma dependiente de la dosis (véase la fig. 5c). Por tanto se probó que el fragmento \alpha era un antagonista de la actividad mitogénica y motogénica del HGF.

Ejemplo 4 Acción del fragmento \alpha sobre la invasión de células cancerosas inducida por el HGF

En el modelo de invasión de película basal con una cámara de invasión cuantitativa Matrigen (24 pocillos) se estudió el efecto del fragmento \alpha sobre la acción inductora de la invasión de las células cancerosas por parte del HGF. Ajustando las células GB-d1 a 1,5 x 10^{4} células/200 ml/pocillo, se sembraron las células en la cámara superior. En 500 ml de medio de cultivo de la cámara inferior se añadieron 2 ng/ml de HGF y fragmento \alpha y se cultivaron durante 24 horas, y se marcaron con H y E después de fijar. Microscópicamente se observaron 10 campos arbitrarios (8,4 mm^{2}) y la capacidad de invasión se evaluó mediante el número de células que invaden la superficie inferior del filtro. Como resultado, el HGF estimuló la invasión de las células GB-d1 de un modo dependiente de la dosis (véase la Fig. 6). Se estudió la acción del fragmento \alpha en 3 ng/ml de HGF y el fragmento \alpha inhibió la acción del HGD de forma dependiente de la dosis, es decir, 130 veces, 400 veces, 4000 veces, 13000 veces de 3 ng/ml de HGF (véase la Fig. 7). Los resultados de la Fig. 6 y la Fig. 7 se expresan gráficamente en la Fig. 8.

De estos resultados se sabe que el fragmento \alpha es eficaz en la supresión de la invasión de las células cancerosas inducida por el HGF.

Preparación del ejemplo 1

Asépticamente se preparó una solución con 1 mg de fragmento \alpha, 1 g de manitol y 10 mg de polisorbato 80 en 100 ml de suero salino fisiológico, y se vertió en viales de 1 ml, se secó por congelación y se selló, y se obtuvieron preparaciones secadas por congelación(liofilizadas).

Preparación del ejemplo 2

Asépticamente se preparó una solución acuosa con 1 mg de fragmento \alpha y 100 mg de seroalbúmina humana en 100 ml de tampón fosfato 0,02M (que contiene NaCl 0,15M y polisorbato 80 0,01%, pH 7,4), y se vertió en viales de 1 ml, se secó por congelación y se selló, y se obtuvieron preparaciones secadas por congelación(liofilizadas).

Preparación del ejemplo 3

Asépticamente se preparó una solución con 1 mg de fragmento \alpha, 2 g de sorbitol, 2 g de glicina y 10 mg de polisorbato 80 en 100 ml de agua destilada para inyección, y se vertió en viales de 1 ml, se secó por congelación y se selló, y se obtuvieron preparaciones secadas por congelación (liofilizadas).

Claims

1. Un agente anticanceroso que contiene una proteína con las siguientes propiedades psicoquímicas y actividades fisiológicas como un ingrediente activo:

a.: compuesto por la cadena \alpha del HGF, que se puede obtener mediante la digestión del HGF con elastasa;

b.: con un peso molecular de 55-69 kDa; y

c.: con actividad antagonista del receptor c-Met/HGF.

2. El agente anticanceroso de la reivindicación 1, en el que el HGF se fabrica mediante procedimiento de recombinación génica.

3. El agente anticanceroso de la reivindicación 2, en el que la células huésped del procedimiento de recombinación génica es cualquiera de Escherichia coli, Bacillus subtilis, levaduras, hongos filamentosos y células vegetales o animales.

4. Uso de una proteína como se ha definido en la reivindicación 1 para la fabricación de un agente anticanceroso.

5. El uso de la proteína de la reivindicación 4, en el que el HGF se fabrica mediante el procedimiento de recombinación génica.