ES2235363T3 - Proteina relacionada con la proteasa. - Google Patents

Proteina relacionada con la proteasa.

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ES2235363T3
ES2235363T3 ES98945221T ES98945221T ES2235363T3 ES 2235363 T3 ES2235363 T3 ES 2235363T3 ES 98945221 T ES98945221 T ES 98945221T ES 98945221 T ES98945221 T ES 98945221T ES 2235363 T3 ES2235363 T3 ES 2235363T3
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Abstract

Proteína relacionada con la proteasa, comprendiendo la proteína la secuencia de aminoácidos de la figura 1. Otro contenido de la presente invención se refiere a un anticuerpo dirigido contra una proteína y proteína de fusión anteriores, respectivamente. Tal anticuerpo puede prepararse mediante procedimientos convencionales. Puede ser policlonal y monoclonal, respectivamente. Para su preparación, es favorable inmunizar animales, particularmente conejos o pollos para un anticuerpo policlonal y ratones para un anticuerpo monoclonal, con una proteína (de fusión) anterior o fragmentos de la misma. Además, pueden realizarse inmunizaciones de recuerdo de los animales con la misma proteína (de fusión) o fragmentos de la misma. El anticuerpo policlonal puede obtenerse entonces del suero y la yema de huevo de los animales, respectivamente. Para el anticuerpo monoclonal, se fusionan células de bazo de los animales con células de mieloma. La presente invención permite investigar la queratinización delpelo. Puede detectarse (PVP) en las células, particularmente en las células cutáneas, por medio de un anticuerpo según la invención. Puede establecerse una relación entre (PVP) y la queratinización del pelo. Además, es posible detectar por medio de una (PVP) según la invención un autoanticuerpo dirigido contra esta proteína. Ambas detecciones pueden realizarse mediante procedimientos convencionales, particularmente un Western blot (inmunotransferencia), un ELISA, una inmunoprecipitación o mediante inmunofluorescencia. Además, la expresión del gen que codifica para (PVP) puede detectarse mediante un ácido nucleico según la invención, particularmente un ADN y cebadores derivados del mismo. Esta detección puede llevarse a cabo según lo habitual, particularmente en una Southern blot.

Description

Proteína relacionada con la proteasa.
La presente invención se refiere a una proteína relacionada con la proteasa, a un ADN que codifica para la misma y a un procedimiento para la preparación de la misma. Además, esta invención se refiere al uso del ADN y la proteína, así como de anticuerpos dirigidos contra la proteína.
Una anomalía del pelo se debe frecuentemente a una afectación de la queratinización del pelo. A partir de investigaciones realizadas con ratones sin pelo ("nude") se sabe que el producto génico de un gen denominado como whn es importante para la queratinización del pelo. Este producto génico es un factor de transcripción. Sin embargo, no se conocen sus genes diana. Debido a eso, no es posible interferir en la queratinización del pelo. Sin embargo, esto sería deseable, particularmente si está afectada la queratinización del pelo.
Por tanto, es el objeto de la presente invención proporcionar un producto mediante el cual pueda investigarse la queratinización del pelo y opcionalmente regularse.
Según la invención, esto se consigue mediante los contenidos definidos en las reivindicaciones.
Por tanto, el contenido de la presente invención está representado por una proteína relacionada con la proteasa, comprendiendo la proteína la secuencia de aminoácidos de la figura 1 o una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la misma en uno o más aminoácidos.
La presente invención se basa en el hallazgo del solicitante de que el producto génico del gen whn es responsable de regular la expresión de al menos tres genes. Dos de estos genes codifican para las queratinas conocidas Ha3 (véase Winter, H. et al., Exp. Cell Res. 212 (1994), 190-200) y CK15 (véase Nozaki, M. et al., Gene 138 (1994), 197-200), respectivamente.
El tercer gen codifica para una proteína que tiene homologías con respecto a una proteasa de la familia de las calicreínas, opcionalmente una actividad proteasa, pero que se diferencia de una proteasa conocida de la familia de las calicreínas en el nivel de ADN por hibridación en condiciones normales. Tal proteína tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 1 o una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la misma en uno o más aminoácidos.
Kunvoka et al., Int. Immunol. 8(6) (1996), 961-966, Nozaki et al., Gene 138 (1994), 197-200 y Winter, et al., Exp. Cell Res. 212 (1994), 190-200, se ocupan del gen whn y sus efectos, el gen / proteína Ck15 y los genes / proteínas Ha3 y Ha2, respectivamente. Sin embargo, estos documentos no sugieren, ni mucho menos describen y caracterizan la proteína relacionada con la proteasa específica de la presente invención.
Además, el solicitante ha encontrado que cuando el producto génico del gen whn carece de los genes Ha3 y CK15 se subexpresa, mientras que el gen de la proteína anterior se sobreexpresa.
La proteína anterior se denomina "proteína relacionada con la proteasa" (PVP) en la presente invención.
Otro contenido de la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica para una (PVP). Éste puede ser un ARN o un ADN. Este último puede ser un ADN genómico o un ADNc, por ejemplo. Dicho ADN comprende lo siguiente:
(a)
el ADN de la figura 1,
o
(b)
un ADN relacionado con el ADN de (a) a través del código genético degenerado.
Se depositó una sección del ADN de la figura 1 en la DMSZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección alemana tipo de microorganismos y cultivos celulares]) como pRDA2-1a bajo el DSM 11522, el 23 de abril de 1997.
A continuación, se describe un ADN según la invención en la forma de un ADNc. Representa un ejemplo para cada ADN que cae bajo la presente invención.
Para la producción de un ADNc según la invención, es favorable aislar ARNm de células cutáneas de ratones whn (+/+) y nu/nu(whn(-/-), respectivamente, para transcribir el ARNm en ADNc y someter el ADNc a un método de "análisis de las diferencias representacionales" (RDA) (véase, Hubank, M. y Schatz, D., Nucleic Acids Research 22 (1994), 5640-5648) de modo que se identifique el ADNc que se subexpresa y sobreexpresa, respectivamente, en ratones nu/nu comparado con ratones whn(+/+). En particular, el último ADNc representa un ADNc según la invención.
Un ADNc según la invención puede estar presente en un vector y vector de expresión, respectivamente. Una persona experta en la técnica está familiarizada con ejemplos de los mismos. En el caso de un vector de expresión para E. coli, éstos son, por ejemplo, pGEMEX, derivados de pUC, pGEX-2T, pET3b y pQE-8. Para la expresión en levaduras, han de mencionarse pY100 e Ycpad1 como ejemplos, mientras que para la expresión en células animales, por ejemplo han de indicarse pKCR, pEFBOS, cDM8 y pCEV4. Para la expresión en células de insectos, es especialmente adecuado el vector de expresión de baculovirus pAcSGHisNT-A.
La persona experta en la técnica está familiarizada con las células adecuadas para expresar un ADNc según la invención, que está presente en un vector de expresión. Ejemplos de tales células comprenden las cepas de E. coli HB101, DHI, x1776, JM101, JM109, BL21 y SG 13009, la cepa de levaduras Saccharomyces cerevisiae y las células animales Ltk, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero y HeLa, así como las células de insecto sf9.
La persona experta en la técnica conoce de qué manera ha de insertarse un ADNc según la invención en un vector de expresión. También está familiarizado con el hecho de que este ADN puede insertarse en relación con un ADN que codifica para otra proteína y péptido, respectivamente, de modo que el ADNc según la invención puede expresarse en la forma de una proteína de fusión.
Además, la persona experta en la técnica está familiarizada con las condiciones de cultivo de células transformadas y células transfectadas, respectivamente. También conoce procedimientos que sirven para aislar y purificar la proteína expresada por el ADNc según la invención. Por tanto, tal proteína que también puede ser una proteína de fusión representa también un contenido de la presente invención.
Otro contenido de la presente invención se refiere a un anticuerpo dirigido contra una proteína y proteína de fusión anteriores, respectivamente. Tal anticuerpo puede prepararse mediante procedimientos convencionales. Puede ser policlonal y monoclonal, respectivamente. Para su preparación, es favorable inmunizar animales, particularmente conejos o pollos para un anticuerpo policlonal y ratones para un anticuerpo monoclonal, con una proteína (de fusión) anterior o fragmentos de la misma. Además, pueden realizarse inmunizaciones de recuerdo de los animales con la misma proteína (de fusión) o fragmentos de la misma. El anticuerpo policlonal puede obtenerse entonces del suero y la yema de huevo de los animales, respectivamente. Para el anticuerpo monoclonal, se fusionan células de bazo de los animales con células de mieloma.
La presente invención permite investigar la queratinización del pelo. Puede detectarse (PVP) en las células, particularmente en las células cutáneas, por medio de un anticuerpo según la invención. Puede establecerse una relación entre (PVP) y la queratinización del pelo. Además, es posible detectar por medio de una (PVP) según la invención un autoanticuerpo dirigido contra esta proteína. Ambas detecciones pueden realizarse mediante procedimientos convencionales, particularmente un Western blot (inmunotransferencia), un ELISA, una inmunoprecipitación o mediante inmunofluorescencia. Además, la expresión del gen que codifica para (PVP) puede detectarse mediante un ácido nucleico según la invención, particularmente un ADN y cebadores derivados del mismo. Esta detección puede llevarse a cabo según lo habitual, particularmente en una Southern blot.
Además, la presente invención es apropiada para interferir de manera regulada en la queratinización del pelo. Esta regulación puede ser positiva o negativa. Se entiende que una regulación positiva significa una mediante la cual puede combatirse una afectación de la queratinización del pelo. Una regulación negativa existiría si se redujese una queratinización normal o fuerte del pelo.
Para una regulación positiva de la queratinización del pelo, es lógico utilizar (PVP) en la forma de una sustancia que la inhiba. Esta sustancia puede ser un anticuerpo según la invención. Además, puede ser un oligonucleótido antisentido que sea apropiado para la inhibición de la expresión del gen que codifica para (PVP).
Para una regulación negativa de la queratinización del pelo, es lógico utilizar (PVP) como tal o en la forma de un ácido nucleico que la exprese.
Por tanto, la presente invención representa una contribución importante a la comprensión de la queratinización del pelo y una posible interferencia reguladora.
Breve descripción del dibujo
La figura 1 muestra la secuencia de bases de un ADNc según la invención, así como la secuencia de aminoácidos, derivada de la misma, de una (PVP) según la invención.
La presente invención se explica mediante los ejemplos de a continuación.
Ejemplo 1 Preparación de un ADNc según la invención
Se preparó un ADNc según la invención según el método de "análisis de las diferencias representacionales" (RDA). Este método comprende el aislamiento de ARNm de células cutáneas de ratones whn(+/+) y ratones nu/nu, respectivamente, la transcripción del ARNm en ADNc y la diferenciación del ADNc, de modo que se identifique lo que se subexpresa y se sobreexpresa, respectivamente, en los ratones nu/nu. En particular, este último representa un ADNc según la invención.
A) Secuencia de los adaptadores oligonucleotídicos
Se requirieron los siguientes pares de adaptadores oligonucleotídicos para el RDA:
\vskip1.000000\baselineskip
1
B) Preparación de poli A-ARNm a partir de los tejidos que se van a comparar entre sí
Se obtuvo inicialmente ARN de la piel de ratones whn(+/+) y ratones nu/nu, respectivamente, según el método de "extracción de ARN en una sola etapa" (Chomczynski y Sacchi, 1987). Posteriormente, se aislaron las fracciones de poli A-ARNm de las dos poblaciones de ARN por medio de Dynabeads oligo(dT) (perlas magnéticas) según el correspondiente protocolo de la compañía Dynal.
C) Síntesis de ADNc bicatenario
Se utilizó el "kit de síntesis de ADNc ribo clone" de la compañía de Promega para la síntesis de ADNc whn(+/+) y ADNc nu/nu bicatenarios, respectivamente. Se utilizaron 4 \mug de poli A-ARNm de cada uno para obtener aproximadamente 2 \mug de ADNc.
D) Análisis de las diferencias 1. Digesto de restricción de los ADNc bicatenarios
a)
Se digirieron aproximadamente 2 \mug de cada ADNc en un lote de reacción de 100 \mul mediante la endonucleasa de restricción DpnII a 37ºC durante 2 horas.
b)
Las disoluciones de reacción se extrajeron entonces dos veces con una mezcla (1:1) de fenol/cloroformo y una vez con cloroformo al 100%.
c)
El ADN incluido en las fases acuosas de los dos lotes de reacción se mezcló con 2 \mug de glucógeno, 50 \mul de acetato de amonio 10 M y 650 \mul de etanol al 100%, cada uno, y se precipitaron en hielo durante 20 minutos.
Tras 14 minutos de centrifugación a 4ºC y con 14000 rpm, se desechó el sobrenadante y el sedimento de ADN se lavó con etanol al 70%. Tras otra centrifugación y eliminación de la fase alcohólica, el ADN seco se resuspendió en 20 \mul de tampón TE.
2. Ligación de los ADNc al par de adaptadores oligonucleotídicos R-BgI
a)
Se utilizó un recipiente de reacción para combinar lo siguiente:
\hskip10mm 20 \mul de ADNc cortado (lote de reacción total del punto D)1c)
\hskip10mm 8 \mug de R-BgI-24
\hskip10mm 4 \mug de R-BgI-12
\hskip10mm 6 \mul de tampón 10 x ligasa
\hskip10mm \underline{x \ \mu l \ de \ agua}
\hskip10mm 57 \mul de volumen final
b)
El lote de reacción se calentó en un termociclador (termociclador con efecto Peltier PTC-200, MJ Research) a 50ºC, se mantuvo a esta temperatura durante 1 minuto y luego se enfrió de nuevo hasta 10ºC en el transcurso de una hora (velocidad de la rampa: 0,1ºC/9 segundos).
c)
Tras añadir 3 \mul de ADN ligasa de T4 (1 U/\mul), la mezcla se incubó a 16ºC durante la noche.
3. Síntesis de "representaciones" de las poblaciones de ADNc que se van a comparar entre sí
a)
Para generar lo que se denomina "representaciones" de los ADNc ligados, se complementó inicialmente el volumen de los lotes de ligación del punto 2c) con la adición de 140 \mul de agua a cada uno para dar 200 \mul.
Luego, se prepararon 30 reacciones de 200 \mul cada una, a partir de esta disolución diluida, por población de ADNc (piel de whn(+/+) y piel de nu/nu, respectivamente).
Se añadieron sucesivamente los siguientes reactivos a tal lote:
\hskip10mm 143 \mul de agua
\hskip10mm 20 \mul de tampón 10 x PCR
\hskip10mm 20 \mul de dNTP 2 mM
\hskip10mm 10 \mul de cloruro de Mg 25 mM
\hskip10mm 2 \mul de R-BgI-24 (1 \mug/\mul)
\hskip10mm 4 \mul de lote de ligación diluido
b)
PCR
3 minutos: 72ºC
adición de 1 \mul de Taq-ADN polimerasa (5 U/\mul)
\hskip10mm 20 veces: 5 minutos: 95ºC
\hskip10mm 3 minutos: 72ºC
finalmente: enfriamiento hasta 4ºC.
c)
Para preparar las disoluciones de reacción, se combinaron 4 lotes de reacción de cada una en un recipiente.
\vskip1.000000\baselineskip
2
Lavado del sedimento de ADN con etanol al 70% y resuspensión en tal cantidad de agua que dé como resultado una concentración de 0,5 \mug/\mul.
4. Digesto de restricción de las "representaciones"
a)
Para eliminar los adaptadores oligonucleotídicos R-BgI, se sometieron 300 \mug de cada representación (piel de whn(+/+) y piel de nu/nu, respectivamente) a un digesto de restricción. Tras la adición de los reactivos de más adelante, se llevó a cabo una incubación a 37ºC durante 4 horas:
\hskip10mm 600 \mul de la representación de ADNc (0,5 \mug/\mul)
\hskip10mm 140 \mul de tampón 10 x DpnII
\hskip10mm 100 \mul de DpnII (10 U/\mul)
\hskip10mm 560 \mul de agua
b)
El lote de digesto de restricción se distribuyó en dos recipientes antes de su preparación.
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
Lavado del sedimento de ADN con etanol al 70% y resuspensión en tal cantidad de agua que dé como resultado una concentración de 0,5 \mug/\mul.
La representación de ADNc de piel de whn(+/+) digerido con DpnII resultante representaba la población de ADN "driver" (de la muestra control) que se va a utilizar en la hibridación sustractiva.
5. Síntesis de la población de ADN "tester" (de la muestra de prueba)
a)
Se separaron 20 \mug de la representación de ADNc de piel de nu/nu digerido con DpnII (= ADN "tester") electroforéticamente en un gel TAE (Tris-acetato-EDTA):
\hskip10mm 40 \mul de ADN "tester" (0,5 \mug/\mul)
\hskip10mm 50 \mul de tampón TE
\hskip10mm 10 \mul de tampón de carga 10 x
se aplicaron a un gel de agarosa al 1,2% en TAE. Se aplicó una tensión al gel hasta que el componente de azul de bromofenol del tampón de carga hubo migrado aproximadamente 2 cm.
b)
Posteriormente, se cortaron del gel las bandas que contenían la representación de ADN y se eluyeron por medio del "kit de extracción de ADN en gel de agarosa" de la compañía Boehringer Mannheim.
Los extractos de ADN se purificaron, de modo que se obtuvo un total de 60 \mul disolución. La concentración de esta disolución se evaluó mediante la electroforesis de 5 \mul en un gel de agarosa al 1%.
c)
Finalmente, se ligó el ADN "tester" con el par de oligonucleótidos J:
\hskip10mm 2 \mug de eluato de ADN "tester"
\hskip10mm 6 \mul de tampón 10 x ligasa
\hskip10mm 4 \mul de J-BgI-24 (2 \mug/\mul)
\hskip10mm 4 \mul de J-BgI-12 (1 \mug/\mul)
\hskip10mm \underline{x \ \mu l \ de \ agua}
\hskip10mm 57 \mul de volumen final
d)
Transferencia del lote de reacción al interior del termociclador:
1 minuto: 50ºC
enfriamiento hasta 10ºC en un plazo de 1 hora (velocidad de la rampa: 0,1ºC/9 segundos).
e)
Tras añadir 3 \mul de ADN ligasa de T4 (1 U/\mul), incubación a 16ºC durante la noche.
f)
Ajuste de la concentración del ADN "tester" hasta aproximadamente 10 ng/\mul mediante la adición de 120 \mul de agua.
6. Hibridación sustractiva
a)
Se combinaron 80 \mul de ADN "driver" (40 \mug) de la etapa 4. y 40 \mul (0,4 \mug) de ADN "tester" diluido de la etapa 5., ligados con los oligonucleótidos J en un recipiente de reacción y se extrajeron 2 veces con fenol/cloroformo (1:1) y una vez con cloroformo al 100%.
b)
Precipitación por adición de 30 \mul de acetato de amonio 10 M, 380 \mul de etanol al 100%; -70ºC durante 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
c)
El ADN se resuspendió en 4 \mul de tampón EE x3 (EPPS 30 mM, pH 8,0, a 20ºC (compañía Sigma); EDTA 3 mM), acompañado por adición y extracción mediante pipeteo durante aproximadamente 2 minutos, luego calentando hasta 37ºC durante 5 minutos, corta "agitación en vórtex" y finalmente combinando la disolución de nuevo en el fondo del recipiente mediante centrifugación. La disolución se cubrió finalmente con una fase que consistía en 35 \mul de aceite mineral.
d)
Transferencia del lote de reacción al interior del termociclador:
5 minutos: 98ºC,
enfriamiento hasta 67ºC y adición inmediata de 1 \mul de NaCl 5 M al ADN,
20 horas de incubación a 67ºC.
7. Síntesis del primer producto con diferencias
a)
Tras eliminar el aceite mineral de la manera más completa posible, el ADN se diluyó gradualmente:
1.
adición de 8 \mul de TE (+ 5 \mug/\mul de ARN de levaduras)
2.
adición de 25 \mul de TE, posteriormente mezclado meticuloso
3.
adición de 362 \mul de TE, vórtex.
b)
Se prepararon 4 PCR para cada hibridación sustractiva. Por reacción:
\hskip10mm 127 \mul de agua
\hskip10mm 20 \mul de tampón 10 x
\hskip10mm 20 \mul de dNTP 2 mM
\hskip10mm 5 \mul de cloruro de Mg 25 mM
\hskip10mm 20 \mul de disolución de hibridación diluida (de la etapa 7a)) 
\newpage
c)
Programa de PCR:
3 minutos: 72ºC
adición de 1 \mul de Taq-ADN polimerasa (5 U/\mul)
5 minutos: 72ºC
adición de 2 \mul de cebador J-BgI-24 (1 \mug/\mul)
\hskip10mm 10 veces: 1 minuto: 95ºC
\hskip10mm 3 minutos: 70ºC
finalmente: 10 minutos: 72ºC, luego enfriamiento hasta temperatura ambiente.
d)
Se combinaron los 4 lotes de reacción en un recipiente de 1,5 ml.
extracción: 2 veces con fenol/cloroformo (1:1), 1 vez con cloroformo al 100%.
Tras la adición de 2 \mug de vehículo de glucógeno:
Precipitación con 75 \mul de acetato de Na 3 M (pH 5,3),
800 \mul de 2-propanol, 20 minutos en hielo.
Centrifugación: 14 minutos, 14000 rpm, 4ºC.
Lavado del sedimento de ADN con etanol al 70%.
Tras secado del ADN, resuspensión en 40 \mul de agua.
e)
Se sometieron 20 \mul del ADN resuspendido procedente de d) a un "digesto de nucleasa Mung Bean" (MBN):
\hskip10mm 20 \mul de agua
\hskip10mm 4 \mul de tampón 10 x nucleasa Mung Bean (compañía NEB)
\hskip10mm 14 \mul de agua
\hskip10mm 2 \mul de nucleasa Mung Bean (10 U/\mul; compañía NEB)
\hskip10mm 5 minutos, 30ºC.
La reacción se detuvo mediante la adición de 160 \mul de Tris-HCl 50 mM (pH 8,9) y 5 minutos de incubación a 98ºC. Posteriormente, el recipiente se puso en hielo hasta la siguiente etapa.
f)
Durante la incubación con MBN, se prepararon 4 PCR adicionales (en hielo):
\hskip10mm 127 \mul de agua
\hskip10mm 20 \mul de dNTP 2 mM
\hskip10mm 10 \mul de cloruro de Mg 25 mM
\hskip10mm 2 \mul de J-BgI-24 (1 \mug/\mul)
\hskip10mm 20 \mul de ADN digerido con MBN.
g)
Programa de PCR:
1 minuto: 95ºC
permitiendo enfriar hasta 80ºC, adición de 1 \mul de Taq-ADN polimerasa (5 U/\mul),
\hskip10mm 18 veces: 1 minuto: 95ºC
\hskip10mm 3 minutos: 70ºC,
finalmente: 10 minutos: 72ºC; permitiendo enfriar hasta 4ºC.
h)
Se combinaron los 4 lotes de PCR en un recipiente.
Extracción: 2 veces con fenol/cloroformo (1:1), 1 vez con cloroformo al 100%.
Precipitación: 75 \mul de acetato de Na 3 M (pH 5,3), 800 \mul de 2- propanol, 20 minutos en hielo.
Centrifugación: 14 minutos, 14000 rpm, 4ºC.
lavado del sedimento de ADN con etanol al 70%. Resuspensión del ADN en 100 \mul de agua (concentración resultante: 0,5 \mug/\mul); la disolución obtenida de esta manera representaba el primer producto con diferencias.
8. Intercambio de los adaptadores oligonucleotídicos del producto con diferencias
a)
Eliminación de los adaptadores oligonucleotídicos mediante el digesto de restricción con DpnII:
\hskip10mm 40 \mul del producto con diferencias 1 (0,5 \mug/\mul)
\hskip10mm 30 \mul de tampón 10 x DpnII
\hskip10mm 15 \mul de DpnII (10 U/\mul)
\hskip10mm 215 \mul de agua
\hskip10mm 37ºC durante 2 horas.
b)
Preparación del lote de reacción:
Extracción: 2 veces con fenol/cloroformo (1:1), 1 vez con cloroformo al 100%.
Precipitación: 33 \mul de acetato de Na 3 M (pH 5,3), 800 \mul de etanol al 100%, 20 minutos, -20ºC.
Centrifugación: 14 minutos, 14000 rpm, 4ºC.
Lavado del sedimento con etanol al 70% y resuspensión en 40 \mul de agua.
c)
Ligación del producto con diferencias al par de adaptadores oligonucleotídicos N-BgI
Se diluyó 1 \mul de la disolución de ADN preparada procedente de la etapa b) en 9 \mul de agua para dar una concentración de 50 ng/\mul; se utilizaron 4 \mul de esta disolución en la siguiente reacción:
\hskip10mm 4 \mul del producto con diferencias 1 digerido con DpnII (200 ng)
\hskip10mm 6 \mul de tampón 10 x ligasa
\hskip10mm 2,5 \mul de N-BgI-24 (3,5 \mug/\mul)
\hskip10mm 2 \mul de N-BgI-12 (2 \mug/\mul)
\hskip10mm 42,5 \mul de agua
d)
Tras la transferencia del lote de reacción al interior del termociclador:
1 minuto: 50ºC
permitiendo enfriar hasta 10ºC en un plazo de una hora (velocidad de la rampa: 0,1ºC/9 segundos)
e)
Tras añadir 3 \mul de ADN ligasa de T4 (1 \mug/\mul), incubación a 16ºC durante la noche.
9. Síntesis del 2º producto con diferencias
Se diluyó el lote de ligación procedente de la etapa 8e) añadiendo 100 \mul de agua hasta una concentración de 1,25 ng/\mul. Se mezclaron 40 \mul de esta dilución (50 ng) con 80 \mul de ADN "driver" (véase el punto 4.) y se trataron de nuevo según las etapas 6. a 8. Cuando se cambiaron los adaptadores oligonucleotídicos (etapa 8.), se ligaron los oligonucleótidos J-BgI, en este caso, al producto con diferencias 2 recién formado.
10. Síntesis del 3^{er} producto con diferencias
Se redujo la concentración del producto con diferencias 2 ligado con los oligonucleótidos J-BgI hasta una concentración de 1 ng/\mul. Se diluyeron de nuevo 10 \mul de esta disolución con 990 \mul de agua (+ 30 \mug de ARN de levaduras), de modo que la concentración fue entonces de 10 pg/\mul. Se llevó a cabo la hibridación sustractiva con 100 pg (10 \mul) del producto con diferencias 2 ligado a J y 40 \mug (80 \mul) de ADN "driver" procedente de la etapa 4. Como para el resto, el procedimiento se llevó a cabo como en el caso del 1^{er} y 2º productos con diferencias según las etapas 6. a 8. La PCR según la reacción con MBN (punto 7.g) produjo una excepción, aquí se llevaron a cabo 18 ciclos en lugar de 22.
11. Clonación del 3^{er} producto con diferencias
Se sometió inicialmente el 3^{er} producto con diferencias a un digesto de restricción con DpnII, de modo que se eliminaran los adaptadores oligonucleotídicos. Luego, se aplicó el producto de reacción a un gel TAE y se separó electroforéticamente. Se cortaron del gel las bandas de ADN separadas, se eluyó el ADN y se clonó en un vector cortado con BamHI (pBS Not).
12. Caracterización de los productos con diferencias
Con el fin de confirmar que los fragmentos de ADN clonados no eran artefactos del método sino secuencias que estaban incluidas realmente en las representaciones de ADN investigadas, se llevaron a cabo análisis Southern en los que se hibridaron las representaciones de ADNc investigadas con los productos de clonación marcados radiactivamente.
Posteriormente, aquellos fragmentos de ADN que probaron ser productos con diferencias "reales" en el análisis Southern, se investigaron por medio de hibridaciones Northern: se sometieron a inmunotransferencia los ARN procedentes de los tejidos investigados (ADNc de piel de whn(+/+) y ADNc de piel de nu/nu) y se hibridaron con los productos de clonación marcados radiactivamente. Mediante esto, se confirmó la expresión diferencial de estas secuencias en los tejidos investigados. Un análisis de las secuencias produjo el ADNc de la figura 1 según la invención.
Ejemplo 2 Preparación y purificación de una (PVP) según la invención
Para la preparación de una (PVP) según la invención, se escinde el vector pBSNot-PVP del ejemplo 1 mediante BamHI, se aísla el ADN que codifica para (PVP) y se inserta en el vector de expresión pQE-8 (compañía Quiagen) escindido por BamHI. Se obtiene el plásmido de expresión pQ/PVP. Tal plásmido codifica para una proteína de fusión que comprende 6 residuos de histidina (componente del extremo N-terminal) y la (PVP) de la figura 1 según la invención (componente del extremo C-terminal). pQ/PVP se utiliza para transformar SG 13009 de E. coli (véase, Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273). Las bacterias se cultivaron en un caldo LB con ampicilina 100 \mug/ml y kanamicina 25 \mug/ml y se inducen con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 60 \muM durante 4 horas. La adición de clorhidrato de guanidina 6 M sirve para conseguir la lisis de las bacterias, posteriormente se lleva a cabo una cromatografía (resina de Ni-NTA) con el lisado en presencia de urea 8 M, lo que corresponde a las instrucciones del fabricante (compañía Quiagen) del material para cromatografía. La proteína de fusión unida se eluye en un tampón que tiene pH 3,5. Tras su neutralización, la proteína de fusión se somete a una electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 18% y se tiñe con azul de Coomassie (véase Thomas, J. O. y Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
De esta manera, puede prepararse una proteína (de fusión) según la invención, en una forma sumamente pura.
Ejemplo 3 Preparación y detección de un anticuerpo según la invención
Se somete una proteína de fusión del ejemplo 1 según la invención a una electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 18%. Tras la tinción del gel utilizando acetato de sodio 4 M, se corta del gel una banda larga de aproximadamente 25 kD y se incuba en disolución de sal común tamponada con fosfato. Las piezas de gel se sedimentan antes de que se determine la concentración de proteína del sobrenadante mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, lo que va seguido por tinción con azul de Coomassie. Se inmunizan animales con la proteína de fusión purificada del gel, tal como sigue:
Protocolo de inmunización para anticuerpos policlonales en conejos
Se utilizan 35 \mug de la proteína de fusión purificada del gel, por inmunización, en 0,7 ml de PBS y 0,7 ml de adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund, respectivamente.
6
Se prueba el suero del conejo en una inmunotransferencia. Para este fin, se somete una proteína de fusión del ejemplo 1 según la invención a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se transfiere a un filtro de nitrocelulosa (véase Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10 (1984), 203-209). El análisis de Western blot se lleva a cabo tal como se describe en Bock, C. T. et al., Virus Genes 8 (1994), 215-229). Para este fin, se incuba el filtro de nitrocelulosa con un primer anticuerpo a 37ºC durante 1 hora. Este anticuerpo está en el suero del conejo (1:10000 en PBS). Tras varias etapas de lavado utilizando PBS, el filtro de nitrocelulosa se incuba con un segundo anticuerpo. Este anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de cabra anti-IgG de conejo acoplado con fosfatasa alcalina (compañía Dianova) (1:5000) en PBS. Una incubación de 30 minutos a 37ºC va seguida por varias etapas de lavado utilizando PBS y luego por la reacción de detección de la fosfatasa alcalina utilizando disolución reveladora (fosfato de 5'-bromo-4-cloro-3-indolilo 36 \muM, azul de nitrotetrazolio 400 \muM, Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM) a temperatura ambiente, hasta que las bandas son visibles.
De esta manera, pueden prepararse los anticuerpos monoclonales según la invención.
Protocolo de inmunización para anticuerpos policlonales en pollos
Se utilizaron 40 \mug de proteína de fusión purificada del gel, por inmunización, en 0,8 ml de PBS y 0,8 ml de adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund, respectivamente.
7
Los anticuerpos se extraen de la yema de huevo y se prueban en un Western blot. Los anticuerpos policlonales según la invención se detectan de esta manera.
Protocolo de inmunización para anticuerpos monoclonales de ratón
Se utilizaron 12 \mug de proteína de fusión purificada del gel, por inmunización, en 0,25 ml de PBS y 0,25 de adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund, respectivamente. La proteína de fusión se disolvió en 0,5 ml (sin adyuvante) en la 4ª inmunización.
8
Se prueban los sobrenadantes de los hibridomas en un Western blot. Los anticuerpos monoclonales según la invención se detectan de esta manera.

Claims (10)

1. Proteína relacionada con la proteasa, comprendiendo la proteína la secuencia de aminoácidos de la figura 1.
2. ADN que codifica para una proteína según la reivindicación 1, en el que el ADN comprende:
(a)
el ADN de la figura 1; o
(b)
un ADN relacionado con el ADN de (a) a través del código genético degenerado.
3. Plásmido de expresión que comprende el ADN según la reivindicación 2.
4. Transformante que contiene el plásmido de expresión según la reivindicación 3.
5. Procedimiento para la preparación de la proteína según la reivindicación 1, que comprende el cultivo del transformante según la reivindicación 4 en condiciones adecuadas.
6. Anticuerpos dirigidos contra la proteína según la reivindicación 1.
7. Uso de la proteína según la reivindicación 1, el ADN según la reivindicación 2 o el anticuerpo según la reivindicación 6, para la preparación de una composición de diagnóstico para detectar la queratinización del pelo.
8. Uso de la proteína según la reivindicación 1, para la preparación de una preparación farmacéutica para la regulación negativa de la queratinización del pelo.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que la proteína está presente como tal o en la forma de un ácido nucleico que la expresa.
10. Uso de una sustancia que inhibe la proteína según la reivindicación 1, para la preparación de una composición farmacéutica para la regulación positiva de la queratinización del pelo, en el que dicha sustancia es un anticuerpo según la reivindicación 6 y/o un oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión del ácido nucleico que codifica para la proteína.
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