ES2237159T3 - Sistema de transformacion en el campo de los hongos micoticos filamentosos en chrysosporium. - Google Patents
Sistema de transformacion en el campo de los hongos micoticos filamentosos en chrysosporium.Info
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Abstract
Cepa de Chrysosporium recombinante obtenida por métodos de transformación, dicha cepa comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés, dicha secuencia de ácido nucleico estando operativamente unida a una región reguladora de la expresión y opcionalmente a una secuencia señal de secreción, dicha cepa recombinante expresando dicho polipéptido de interés en un nivel más alto que la cepa no recombinante correspondiente en las mismas condiciones, y dicha secuencia de ácido nucleico siendo introducida de forma estable en dicha cepa de Chrysosporium mediante dichos métodos de transformación.
Description
Sistema de transformación en el campo de los
hongos micóticos filamentosos en Chrysosporium.
La invención en objeto pertenece a un nuevo
sistema de transformación en el campo de los huéspedes micóticos
filamentosos para la expresión y secreción de proteínas o
polipéptidos heterólogos. La invención también contempla un proceso
para producir grandes cantidades de polipéptidos de una manera
económica. El sistema comprende una cepa micótica transformada o
transfectada del género Chrysosporium, más particularmente
de Chrisosporium lucknowense y mutantes o derivados del
mismo. También se contemplan transformantes que contienen secuencias
de codificación de Chrysosporium. Se dan a conocer nuevas
cepas mutantes de Chrysosporium así como enzimas nuevas
derivadas de las mismas.
Diversos huéspedes para la expresión génica y
métodos de transformación han sido revelados en la técnica
precedente. A menudo se mencionan bacterias como p. ej.
Escherichia coli. No obstante, E. coli es un
microorganismo incapaz de secretar varias proteínas o polipéptidos,
y como tal, no es deseable como célula huésped para la producción
de proteínas o polipéptidos en el nivel industrial. Una desventaja
adicional de E. coli, que es válida también para las
bacterias en general, es que las procariotas no pueden proporcionar
las modificaciones adicionales necesarias para que se puedan
producir numerosas proteínas eucarióticas o polipéptidos en una
forma activa. La glicosilación de proteínas y el pliegue adecuado
de proteínas son ejemplos de procesos necesarios para asegurar la
producción de una proteína o polipéptido activo. Para asegurar estos
procesos se pueden usar en ocasiones células mamíferas; no
obstante, la desventaja de dichas células es que éstas son a menudo
difíciles de mantener y requieren medios caros. Tales sistemas de
transformación, en consecuencia, no son prácticos para la producción
de proteínas o polipéptidos en un nivel industrial. Pueden tener un
coste eficaz para compuestos farmacéuticos muy caros que requieren
cantidades relativamente bajas, pero ciertamente no para enzimas
industriales.
Varios sistemas de expresión micóticos han sido
desarrollados p. ej. Aspergillus niger, Aspergillus awamori,
Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei. Se han sugerido
otros, pero por varios motivos no han sido ampliamente aceptados ni
se ha extendido su uso. En términos generales, el huésped ideal
debe cumplir un gran número de criterios:
- -
- el huésped ideal debe ser fermentado fácilmente usando un medio económico,
- -
- el huésped ideal debería usar el medio de forma eficiente,
- -
- el huésped ideal debe producir el polipéptido o proteína con un rendimiento elevado, es decir, debe exhibir una alta proporción de la proteína respecto a la biomasa,
- -
- el huésped ideal debería ser capaz de secretar de forma eficaz la proteína o el polipéptido,
- -
- el huésped ideal debe permitir con facilidad el aislamiento y la purificación de la proteína o el polipéptido deseado.
- -
- el huésped ideal debe procesar la proteína o polipéptido deseado de tal manera que sea producido en una forma activa y que no requiera fases adicionales de activación o modificación,
- -
- el huésped ideal debería ser fácilmente transformado,
- -
- el huésped ideal debería permitir el uso de una amplia gama de elementos reguladores de la expresión, asegurando así facilidad de aplicación y versatilidad,
- -
- el huésped ideal debería permitir el uso de marcadores fácilmente seleccionables que sean económicos de usar,
- -
- el huésped ideal debería producir transformantes estables,
- -
- el huésped ideal debería permitir el cultivo en condiciones no perjudiciales para la proteína o polipéptido expresado p. ej. viscosidad baja, poca cizalla.
Sistemas micóticos que todavía no han alcanzado
un uso difundido están descritos p. ej. en la patente US 5,578,463
por Berka et al. donde se sugieren Neurospora, Podospora,
Endothia, Mucor, Cochoibolus y Pyricularia junto con
Aspergillus y Trichoderma. No obstante sólo se
proporcionan ejemplos de transformación y expresión para
Aspergillus y Trichoderma y no se dan detalles para
ninguno de los otros huéspedes sugeridos.
WO 96/02563 y las patentes US 5,602,004,
5,604,129 y 5,695,985 de Novo Nordisk describen los inconvenientes
de los sistemas de Aspergillus y Trichoderma y
sugieren condiciones de cultivo para otros hongos que pueden ser
más adecuados para la producción de proteínas a gran escala. Los
únicos ejemplos proporcionados para cualquier cultivo transformado
son los de las cepas de Myceliophthora thermophila,
Acremonium alabamense, Thielavia terrestris y
Sporotrichum cellulophilum. Se ha dado a conocer que la
cepa de Sporotrichum puede lisar y producir un pigmento verde
en unas condiciones de fermentación que no conducen a tales
resultados para las otras cepas. Un mutante no esporulante de
Tielavia terrestris se describe como el organismo de
elección en virtud de su morfología. No obstante, también se indica
que la eficiencia para los protoplastos de Thielavia y
Acremonium (la cepa de Acremonium usada siendo el
estado imperfecto de la cepa de Thielavia usada) es baja y
que la higromicina no fue útil como marcador de selección. Se
sugieren otras muchas como potencialmente útiles en virtud de su
morfología pero no se ha descrito la transformación de las mismas.
Las cepas sugeridas son Corynascus, Thermoascus, Chaetomium,
Ctenomyces, Scytalidium y Talaromices. Los huéspedes
transformados mencionados sólo producen niveles bajos de la
xilanasa Humicola introducida, siendo Thielavia la
que produce la cantidad más pequeña; no obstante, la información es
ambigua y se podría inferir en realidad que la Thielavia fue
la mejor forma de realización. La nomeclatura de esta referencia
está basada en los Nombres ATCC de "Hongos Industriales" de
1994. Por lo tanto es evidente que no se logró un alto grado de
expresión heteróloga y, de hecho, no se pudo derivar una correlación
positiva entre la morfología postulada y el grado de expresión. Si
se pudiese extraer una correlación, sería probablemente negativa.
Según la clasificación de Hongos de 1996 ATCC, Sporotrichum
thermophilum ATCC 20493 es una cepa de Myceliophthora
thermophila. Actualmente, la cepa se sigue identificando como
Myceliophthora thermophila. La imprevisibilidad de la
técnica resulta evidente tras estas última descripciones.
También Allison et al. (Curr. Genetics
21:225-229, 1992) han descrito la transformación de
Humicola grisea var. thermoidea usando el método de
acetato de litio y una secuencia de codificación enzimática de
Humicola, pero no se ha informado de la expresión de ninguna
proteína heteróloga a partir de una cepa de este tipo.
En 1997 una patente publicada a nombre de Hawaii
Biotechnology Group sobre Neurospora transformada para la
expresión de péptidos mamíferos como quimosina. La transformación
de Neurospora crassa auxotrófica tuvo lugar con
esferoplastos. Se introdujeron regiones reguladoras
transcripcionales endógenas y se llevó a cabo la cotransformación.
No se hace ninguna mención relativa a otros huéspedes y otros
protocolos de transformación. No hay nada evidente en la
descripción en lo que se refiere al grado de expresión. Es dudoso
que el grado de expresión sea alto, ya que las inmunotécnicas (que
son útiles para la detección de cantidades pequeñas de proteínas)
son las únicas técnicas utilizadas para ilustrar la presencia de la
proteína. No se describe un aislamiento real de la proteína.
WO 97/26330 de Novo Nordisk sugiere un método
para obtener mutantes de células madre micóticas filamentosas que
tienen una propiedad mejorada para la producción de polipéptidos
heterólogos. El método comprende en primer lugar el descubrimiento
de una morfología alterada específica, seguido de una evaluación
sobre si un transformante produce más polipéptidos heterólogos que
el precursor. El método está ilustrado sólo para cepas de
Fusarium A3/5 y Aspergillus oryzae. Se sugiere que el
método es aplicable para Aspergillus, Trichoderma, Thielavia,
Fusarium, Neurospora, Acremonium, Toliplocadium, Humicola,
Scytalidium, Myceliophthora o Mucor. Como se ha indicado
arriba, la imprevisibilidad de la técnica y también la
imprevisibilidad del método de la solicitud citada no proporciona
una enseñanza generalmente aplicable con una expectativa razonable
de éxito.
Ahora describimos un sistema de expresión
micótico alternativo con la simplicidad de uso del anteriormente
mencionado para Aspergilli y Trichoderma, el cual
cumple con los requisitos anteriores. El nuevo sistema no ha sido
enseñado o sugerido en la técnica precedente. El nuevo sistema según
la invención proporciona las ventajas adicionales de que los
índices de transformación son superiores a los del sistema de
Trichoderma reesei habitualmente utilizado. Además, las
condiciones de cultivo ofrecen la ventaja adicional de ser
ventajosas para el polipéptido expresado. Cuando se hace referencia
en esta especificación y en las reivindicaciones anexas a
"polipéptidos" o "polipéptidos de interés" como productos
del sistema de expresión de la invención, este término también
comprende proteínas, es decir polipéptidos que tienen una función
particular y/o una estructura secundaria y/o terciaria.
El pH del medio de cultivo puede ser neutro o
alcalino, por lo que la proteína o polipéptido producido ya no es
sometido a un pH ácido agresivo y potencialmente desactivador.
También es posible un cultivo con un pH ácido, por ejemplo pH 4,
para aquellos casos en los que la proteína o polipéptido se adapta
mejor a un medio ácido. Un cultivo adecuado puede realizarse con un
pH entre 4.0-10.0. Es preferible, no obstante, un pH
neutro o alcalino, ya que la cepa huésped exhibe un mejor
crecimiento con este pH, p. ej. entre 6 y 9. El crecimiento a
temperatura alcalina que puede ser a partir de pH 8 y puede incluso
llegar a 10 es también una buena alternativa para algunos casos.
También la temperatura de cultivo de tales cepas huéspedes es
ventajosa para la estabilidad de algunos tipos de los polipéptidos
producidos. La temperatura de cultivo es idóneamente una temperatura
de 25-43ºC. Una temperatura en la gama de 40ºC
hasta 23ºC o 30ºC es también ventajosamente aplicada.
Evidentemente, estas condiciones son particularmente interesantes
para la producción de polipéptidos mamíferos. La temperatura
seleccionada dependerá de la eficacia de coste del cultivo y la
sensibilidad del polipéptido o cepa de cultivo. Las condiciones
serán determinadas por el experto en la materia sin una carga
excesiva para cada caso, como es habitual en la técnica.
También se ha constatado que la proporción de la
biomasa respecto a la viscosidad y la cantidad de proteína
producida es exageradamente favorable para el huésped según la
invención. Se han realizado comparaciones con Trichoderma
longibrachiatum (anteriormente conocida también como
Trichoderma reesei,) y con Aspergillus Niger.
Trichoderma longibrachiatum dio 2.5-5 g/l de
biomasa, Aspergillus niger dio 5-10 g/l de
biomasa y el huésped según la invención dio 0.5-1
g/l de biomasa con sus respectivas condiciones optimizadas. Por lo
tanto, se presenta una mejora de 5 a 10 veces mayor que en las cepas
comercialmente usadas. Estas cepas comerciales son cepas que son
consideradas en sí mismas en la técnica como grandes productoras de
proteínas y que han sido usadas con éxito para la producción
comercial de proteínas. Han sido cultivadas en sus condiciones
óptimas, desarrolladas y creadas de forma viable en fermentos
comerciales a gran escala. Estas mismas cepas han sido usadas para
ilustrar la enorme mejora en los valores de viscosidad para los
cultivos del huésped según la invención. Al final del proceso de
fermentación Trichoderma longibrachiatum dio un valor de
200-600 cP (Centipoise), Aspergillus Niger
dio un valor de 1500-2000 cP y el huésped según la
invención dio un valor inferior a 10 cP. Por lo tanto esto
proporciona al menos una mejora de 20 a 200 veces mejor que los
valores de viscosidad de las cepas comercialmente usadas. Otro
aspecto bastante sorprendente es el hecho de que los niveles de
proteínas determinados para las células huéspedes según la
invención fueron muy superiores que para las cepas comerciales de
Aspergilli y Trichoderma reesei, incluso con los
niveles de biomasa y viscosidad sorprendentemente bajos
anteriormente mencionados. En resumen, se presenta aquí un sistema
de transformación y un sistema de expresión mejorado, fácil de usar
y versátil con unas condiciones de cultivo mejoradas. Las cepas
según la invención producen niveles de proteínas sorprendentemente
más altos con estas condiciones mejoradas y además lo consiguen en
un tiempo inferior de fermentación.
La invención en objeto está dirigida a cepas de
Chrysosporium recombinantes obtenidas por métodos de
transformación, dicha cepa comprendiendo una secuencia de ácida
nucleico introducida de forma estable que codifica una proteína o
un polipéptido heterólogo, dicha secuencia de ácido nucleico
estando operativamente unida a una región reguladora de la expresión
y opcionalmente una secuencia de codificación de la señal de
secreción y/o una secuencia de codificación de la proteína
transportadora. Preferiblemente, una cepa recombinante según la
invención segrega el polipéptido de interés. Esto evitará la
necesidad de ruptura de la célula con el objetivo de aislar el
polipéptido de interés y también minimiza el riesgo de degradación
del producto expresado por el resto de componentes de la célula
huésped.
Chrysosporium puede ser definida
morfológicamente de forma consistente con la descripción de Barnett
y Hunter 1972, Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 3ª Edición de
Burgess Publishing Company. Se conocen otras fuentes que
proporcionan detalles en lo que se refiere a la clasificación de
hongos del género Chrysosporium p. ej. la clasificación de
Sutton (Van Oorschot, C.A.N. (1980) "A revision of
Chrysosporium and allied genera" en Studies in Mycology
No. 20 de CBS en Baarn, The Netherlands, p1-36). CBS
es uno de las institutos depositarios del Tratado de Budapest. Según
estas indicaciones el género Chrisosporium entra dentro de
la familia Moniliaceae que pertenece al orden
Hyphomycetales. Los criterios que pueden ser usados son los
siguientes:
Los conidios son producidos directamente en el
micelio, en células esporogénicas separadas o en conidioforas
diferentes.
Tanto los conidios como las conidioforas (si las
hay) son hialinas o de color brillante; las conidioforas son
individuales o bien están en agrupaciones libres.
Las colonias normalmente se esparcen, son de
color blanco, a veces de color crema, marrón pálido o amarillo, con
aspecto de fieltro y/o en polvo. Las hifas son principalmente
hialinas y de pared lisa, con ramificación irregular, más o menos
ortotópica. Las hifas fértiles exhiben poca o ninguna
diferenciación. Los conidios son terminales y laterales, tálicos,
distribuidos por todos las hifas, sésiles o en protuberancias
cortas o ramas laterales, subhialinos o amarillo pálido, de pared
gruesa o delgada, subglobosos, claviformes, piriformes,
orobovoides, unicelulares, raramente bicelulares, truncados. A
veces están presentes conidios intercalados, son solitarios,
ocasionalmente concatenados, subhialinos o amarillo pálido, más
anchos que las hifas de soporte, normalmente unicelulares,
truncados en ambas extremidades. Ocasionalmente están presentes
clamidosporas.
Otra fuente que proporciona información sobre la
nomeclatura micótica es ATCC (US). Su sitio web es
http://www.atcc.org. CBS también tiene un sitio web (http//www.cbs.knaw.nl) que proporciona información relevante. VKM en Moscú es también una fuente fiable de información; la dirección de correo electrónico de VKM es http://www.bdt.org.br.bdt.msdn.vkm/general. Otra fuente es http//NT.ars-grin.gov/fungaldatabases. Todas estas instituciones pueden proporcionar conocimientos relativos a las características distintas de Chrisosporium.
http://www.atcc.org. CBS también tiene un sitio web (http//www.cbs.knaw.nl) que proporciona información relevante. VKM en Moscú es también una fuente fiable de información; la dirección de correo electrónico de VKM es http://www.bdt.org.br.bdt.msdn.vkm/general. Otra fuente es http//NT.ars-grin.gov/fungaldatabases. Todas estas instituciones pueden proporcionar conocimientos relativos a las características distintas de Chrisosporium.
Las cepas definidas como pertenecientes a
Myceliophthora thermophila no son consideradas como cepas de
Chrysosporium según la definición de la invención. En el
pasado ha habido confusión considerable sobre la nomeclatura de
algunas cepas de Myceliophthora. Preferiblemente las
Chrisosporium según la invención son aquellas que son
claramente distinguibles como tal y no pueden confundirse con
Myceliophthora, Sporotrichum o Phanerochaete
chrysosporium.
Las siguientes cepas se definen como
Chrysosporium, aunque la definición de Chrysosporium
no se limita a estas cepas: C. botryoides, C. carmichaelii, C.
crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, C. farinicola, C.
fastidium, C. filiforme, C. georgiae, C. globiferum, C. globiferum
var. articulatum, C. globiferum var. niveum, C. hirundo, C.
hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C.
kreiselii, C. kuzurovianum, C. lignorum, C. lobatum, C.
lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. medium, C. medium var.
spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium var. roseum,
C. minor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var. crescens, C.
pilosum, C. pseudomerdarium, C. pyriformis, C. queenslandicum, C.
sigleri, C. sulfureum, C. synchronum, C. tropicum, C. undulatum, C.
vallenarense, C. vespertilium, C. zonatum.
C. lucknowense constituye una de las
especies de Chrysosporium que ha suscitado un interés
particular, ya que ha proporcionado un gran productor natural de
proteínas de celulasa (WO 98/15633 y relacionadas con US
5,811,381). Las características de esta Chrysosporium
lucknowense son:
Las colonias alcanzan 55 mm de diámetro en agar
de glucosa Sabouraud en 14 días, son de color crema, de aspecto de
fieltro y esponjosas; densas y con 3-5 mm de
altura; los márgenes son definidos, regulares y franjeados; el
reverso es amarillo pálido a color crema. Las hifas son hialinas,
de pared lisa y delgada, algo ramificadas. Las hifas aéreas son la
mayoría fértiles y muy septadas, aproximadamente de
1-3.5 mm de ancho. Las hifas sumergidas no son
fértiles, aproximadamente de 1-4.5 mm de ancho, a
menudo las hifas más delgadas estando deformadas. Los conidios son
terminales y laterales, la mayoría son sésiles o en protuberancias
cortas frecuentemente cónicas o en ramas laterales cortas. Los
conidios son solitarios pero están muy próximos unos de otros,
formándose de 1-4 conidios en una célula hifal,
subhialinos, de pared bastante delgada y lisa, principalmente
subglobosos, también orobovoides claviformes, unicelulares, de 2.5 x
11 x 1.5-6 mm, con cicatrices basales anchas
(1-2 mm). No hay conidios intercalados. No hay
clamidosporas. ATCC 44006, CBS 251.72, CBS 143.77 y CBS 272.77 son
ejemplos de cepas de Chrysosporium lucknowense y otros
ejemplos se dan en WO 98/15633 y US 5,81 1,381.
Otra cepa fue aislada de estas especies con una
capacidad de producción incluso más alta para celulasas. Esta cepa
se llama C1 por sus indicación interna y fue depositada en la
Depositaría Internacional "All Russian Collection" de
micro-organismos de la Academia Rusa de Ciencias,
Bakrushina Street 8, Moscow, Russia 113184 en Agosto 29, 1996, como
un depósito según el Tratado de Budapest y se le asignó el Número
de acceso VKM F-3500D. Se denomina Chrysosporium
lucknowense Garg 27K. Las características de la cepa C1 son las
siguientes:
Las colonias alcanzan un tamaño de
aproximadamente hasta 55-66 mm de diámetro en agar
de patata-dextrosa en aproximadamente 7 días; son
de color crema claro, con aspecto de fieltro, de 2-3
mm de altura en el centro, los márgenes son definidos, regulares,
franjeados; el reverso pálido, de color crema. Las hifas son
hialinas, de pared fina y lisa, poco ramificadas. Las hifas aéreas
son fértiles, septadas, de 2-3 mm de ancho. Las
hifas sumergidas no son fértiles. Los conidios son terminales y
laterales; sésiles o en ramas laterales cortas; ausentes;
solitarios, pero muy próximos unos de otros, hialinos, de pared
fina y lisa, subglobosos, claviformes o obovoides, unicelulares, de
4-10 mm. No hay clamidosporas. No hay conidios
intercalados.
El método de aislamiento de la cepa C1 está
descrito en WO 98/15633 y US 5,811,381. Las cepas que exponen esta
morfología están incluidas dentro de la definición de
Chrysosporium según la invención. También se incluyen
dentro de la definición de Chrysosporium las cepas derivadas
de precursores de Chrysosporium, incluidas aquellas que han
mutado de alguna manera de forma natural o por mutagénesis
inducida. En particular la invención comprende los mutantes de
Chrysosporium obtenidos por mutagénesis inducida,
especialmente por una combinación de irradiación y mutagénesis
química.
Por ejemplo, la cepa C1 fue mutagenizada
sometiéndola a luz ultravioleta para generar la cepa
UV13-6. Esta cepa fue posteriormente mutada
adicionalmente con
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
para generar la cepa NG7C-19. Esta última cepa a su
vez fue sometida a mutación por luz ultravioleta dando como
resultado la cepa UV18-25. Durante este proceso de
mutación las características morfológicas han variado de alguna
manera en el cultivo en líquido o en placas, así como bajo el
microscopio. Con cada mutagénesis sucesiva los cultivos mostraron
una apariencia cada vez menos esponjosa y con aspecto de fieltro en
las placas, lo cual se ha descrito como una característica de
Chrysosporium, hasta que las colonias lograron una
apariencia plana y mate. Un pigmento marrón observado en la cepa de
tipo salvaje en algunos medios fue también menos predominante en
las cepas mutantes. En el cultivo líquido, el mutante
UV18-25 fue evidentemente menos viscoso que la cepa
de tipo salvaje C1 y los mutantes UV13-6 y NG7C 19.
A pesar de que todas las cepas mantuvieron en general las
características microscópicas de Chrysosporium, los micelios
se volvieron más estrechos con cada mutación sucesiva y en
UV18-25 se pudo observar una fragmentación clara de
los micelios. Es posible que esta fragmentación micelial sea la
causa de la viscosidad reducida asociada a los cultivos de
UV18-25. La capacidad de esporular de las cepas
disminuyó con cada fase mutagénica. Esto ilustra que para que una
cepa pertenezca al género Chrysosporium puede haber alguna
derivación de la definición morfológica anterior. En cada fase de
mutación se incrementó además la producción de celulasa y proteínas
extracelulares, mientras que las diferentes mutaciones ocasionaron
una reducción de la expresión de proteasa. Los criterios mediante
los cuales se puede determinar la taxonomía micótica están
disponibles por CBS, VKMF y ATCC, por ejemplo.
En particular, se ha observado que la forma
anamorfa de Chrysosporium es adecuada para la aplicación de
producción según la invención. El metabolismo anamorfo la hace
extremadamente adecuada para un alto grado de expresión. El
teleomorfo también debería ser adecuado ya que el carácter genético
de anamorfo y teleomorfo es idéntico. La diferencia entre anamorfo
y teleomorfo es que uno es el estado asexual y el otro es el estado
sexual. Los dos estados exhiben una morfología diferente en ciertas
condiciones.
Es preferible usar cepas de Chrysosporium
no tóxicas, de las cuales se conocen varias en la técnica, ya que
esto reduce riesgos medioambientales durante la producción a gran
escala y simplifica los procedimientos de producción gracias a la
reducción concomitante de los costes.
Una región reguladora de la expresión es una
secuencia de ADN reconocida por la cepa de Chrysosporium
huésped para la expresión. Comprende una secuencia promotora
operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica
el polipéptido que va a ser expresado. El promotor está unido de
tal manera, que la posición respecto al codón de inicio de la
secuencia que va a ser expresada permite la expresión. La secuencia
promotora puede ser constitutiva o inducible. Cualquier secuencia
reguladora de la expresión o combinación de la misma capaz de
permitir la expresión de un polipéptido a partir de una cepa de
Chrysosporium puede ser considerada. La secuencia reguladora
de la expresión es idóneamente una región reguladora de la
expresión micótica, p. ej. una región reguladora de ascomiceto.
Idóneamente la región reguladora de la expresión micótica es una
región reguladora de cualquiera de los siguientes géneros de hongos:
Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Hansenula, Mucor,
Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium,
Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces o formas sexuales
alternativas de los mismos como Emericella, Hypocrea p. ej.
el promotor de celobiohidrolasa de Trichoderma, el promotor
de glucoamilasa de Aspergillus, el promotor de
gliceraldehído fosfato dehidrogenasa de Aspergillus, el
promotor de alcohol dehidrogenasa A y alcohol dehidrogenasa R de
Aspergillus, el promotor de amilasa TAKA de
Aspergillus, los promotores de fosfoglicerato y de control
de la vía de cruce de Neurospora, el promotor de proteinasa
aspártica de Rhizomucor miehei, el promotor de lipasa de
Rhizomucor miehei y el promotor de
beta-galactosidasa de Penicillium canescens.
Una secuencia reguladora de la expresión del mismo género que la
cepa huésped es extremadamente adecuada, ya que es más probable que
esté específicamente adaptada al huésped específico. Por lo tanto,
preferiblemente la secuencia reguladora de la expresión es un de
una cepa de Chrysosporium.
Hemos descubierto cepas particulares de
Chrysosporium para expresar proteínas en cantidades
extremadamente grandes, y las secuencias reguladoras de la
expresión natural de estas cepas son particularmente interesantes.
Estas cepas son internamente designadas como cepa de
Chrysosporium C1, cepa UV13-6, cepa
NG7C-19 y cepa UV18-25. Han sido
depositadas de acuerdo con el Tratado de Budapest en el instituto
depositario de "All Russian Collection" (VKM) en Moscú. La
cepa de tipo salvaje C1 fue depositada de acuerdo con el Tratado de
Budapest con el número VKM F-3500 D, fecha de
depósito 29-08-1996, el mutante de
C1 UV13-6 fue depositado con el número VKM
F-3632 D y fecha de depósito
02-09-1998, el mutante de C1
NG7c-19 fue depositado con el número VKM
F-3633 D y fecha de depósito
02-09-1998 y el mutante de C1
UV18-25 fue depositado con el número VKM
F-3631 D y fecha de depósito
02-09-1998.
Preferiblemente, se aplica una región reguladora
de la expresión que permite una gran expresión en el huésped
seleccionado. También puede tratarse de una región reguladora de
una expresión elevada derivada de un huésped heterólogo, como los
que se conocen bien en la técnica. Ejemplos específicos de
proteínas conocidas por ser expresadas en cantidades grandes y por
lo tanto por proporcionar secuencias reguladoras de expresión
adecuadas para la invención son, sin limitarse a éstas,
hidrofobina, proteasa, amilasa, xilanasa, pectinasa, esterasa,
beta-galactosidasa, celulasa (p. ej. endoglucanasa,
celobiohidrolasa) y poligalacturonasa. La elevada producción ha
sido constatada tanto en estado sólido como en condiciones de
fermentación sumergida. Los ensayos para la evaluación de la
presencia o producción de tales proteínas son muy conocidos en la
técnica. Los catálogos de Sigma y Megazime, por ejemplo,
proporcionan numerosos ejemplos. Megazime está ubicada en Bray
Business Park, Bray, County Wicklow, en Irlanda. Sigma Aldrich
tiene muchas filiales en todo el mundo p. ej. USA P.O. Box 14508 St.
Louis Missouri. En cuanto a la celulasa se hace referencia a
ensayos comercialmente disponibles, como los ensayos CMCasa, ensayos
endoviscométricos, ensayos de Avicelase, ensayos de
beta-glucanasa, ensayos RBBCMCasa, ensayos
Cellazyme C. Otras alternativas son muy conocidas por los expertos
en la técnica y pueden encontrarse en la bibliografía general
referida al tema, y esta información se considera incorporada en la
presente como referencia. Por ejemplo, se hace referencia a
"Methods in Enzymology" Volumen 1, 1955 hasta los vol.
297-299, 1998. Se aplica adecuadamente una
secuencia promotora de Chrysosporium para asegurar un buen
reconocimiento de la misma por el huésped.
Hemos descubierto que las secuencias reguladoras
de la expresión heterólogas funcionan con la misma eficiencia en
Chrisosporium que las secuencias de Chrysosporium
nativas. Esto permite usar construcciones y vectores bien conocidos
para la transformación de Chrysosporium y ofrece numerosas
otras posibilidades para construir vectores que permitan buenos
índices de expresión en este nuevo huésped de expresión y de
secreción. Por ejemplo, las técnicas de transformación estándar de
Aspergillus pueden ser usadas como se describe por ejemplo
en Christiansen et al. en Bio/Technol.
6:1419-1422 (1988). Otros documentos que
proporcionan detalles sobre vectores de transformación de
Aspergillus, p. ej. las patentes US 4,816,405, 5,198,345, 5,
503,991, 5,364,770 y 5,578,463,
EP-B-215.594 (también para
Trichoderma) y su contenido están incorporadas como
referencia. Puesto que se han constatado índices extremadamente
altos de expresión de celulasa para las cepas de
Chrysosporium, las regiones de regulación de la expresión de
tales proteínas son particularmente preferidas. Como ejemplos
específicos hacemos referencia a las cepas de Chrysosporium
depositadas previamente mencionadas.
Una construcción de ácido nucleico que comprende
una región reguladora de la expresión de ácido nucleico de
Chrisosporium, preferiblemente de Chrysosporium
lucknowense o un derivado, constituye una forma de realización
separada de la invención, al igual que la cepa mutante de
Chrysosporium que la comprende operativamente unida al
polipéptido que va a ser expresado. Idóneamente una construcción de
ácido nucleico de este tipo será una región reguladora de la
expresión de Chrysosporium unida a la expresión de celulasa
o de xilanasa, preferiblemente a la expresión de celobiohidrolasa,
más específicamente a la expresión de una celobiohidrolasa de 55
kDa. Las secuencias promotoras de Chrisosporium de una
endoglucanasa de 25 kDa (C1-EG5) y una endoglucanasa
de 43 kDa (C1-EG6), cuyos pesos moleculares son
determinados según SDS PAGE (los pesos moleculares según los datos
de la secuencia de aminoácidos siendo 21.9 kDa y 39.5 kDa), se dan
a modo de ejemplo. Así, las secuencias promotoras de
Chrysosporium de hidrofobina, proteasa, amilasa, xilanasa,
esterasa, pectinasa, beta galactosidasa, celulasa (p. ej.
endoglucanasa, celobiohidrolasa) y poligalacturonasa se consideran
que también entran dentro del campo de la invención. Cualquiera de
los promotores o regiones reguladoras de expresión de las enzimas
descritas en la tabla A o B pueden ser empleadas adecuadamente. La
secuencia de ácido nucleico según la invención puede ser obtenida
de forma adecuada de una cepa de Chrysosporium según la
invención, dicha cepa está definida en otra parte de la descripción.
Las maneras para determinar las secuencias promotoras son numerosas
y muy conocidas en la técnica. Experimentos de eliminación de la
nucleasa de la región anterior al codón ATG en el principio del gen
pertinente proporcionarán dicha secuencia. También por ejemplo un
análisis de las secuencias de consenso puede conducir al
descubrimiento de un gen de interés. Mediante el uso de técnicas de
hibridación y de amplificación, un experto en la técnica podrá
llegar fácilmente a las secuencias promotoras correspondientes.
Las secuencias promotoras de endoglucanasas C1
fueron identificadas de esta forma, mediante la clonación de los
genes correspondientes, y se dan en SEC ID Nº 2 (EG5) y 1 (EG6),
respectivamente. Otros promotores preferidos según la invención son
el promotor de celobiohidrolasa de 55 kDa (CBH1) y los promotores
de xilanasa de 30 kDa (Xy1F), ya que las enzimas son expresadas en
un nivel elevado por sus promotores. Las secuencias promotoras
correspondientes pueden ser identificadas de una manera directa
mediante clonación, como se describe abajo para los promotores de
endoglucanasa, usando la información de la secuencia parcial dada
en SEC ID Nº 4 (para CBH1) y SEC ID Nº 5 (para Xy1F),
respectivamente. Los promotores de las enzimas que degradan
carbohidratos de Chrysosporium, especialmente los promotores
C1, pueden ventajosamente ser usados para la expresión de
polipéptidos deseados en un organismo huésped, especialmente un
organismo huésped micótico u otro microbiano. Las secuencias
promotoras que tienen al menos un 60%, preferiblemente al menos un
70%, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de la
secuencia de nucleótidos con la secuencia dada en SEC ID nº 1 y 2,
o con las secuencias encontradas para otros genes de
Chrysosporium, forman parte de la presente invención.
En cuanto a las formas de realización
particulares de la cepa recombinante y la secuencia de ácido
nucleico según la invención, se hace referencia a los ejemplos.
También se hace referencia a las cepas recombinantes de la técnica
precedente que describen secuencias promotoras de elevada
expresión, en particular aquellas que proporcionan una elevada
expresión micótica p. ej. como las que se describen para
Aspergillus y Trichoderma. La técnica precedente
proporciona varias regiones reguladoras de la expresión para su uso
en Aspergillus p. ej. US 5,252,726 de Novo y US 5,705,358 de
Unilever. El contenido de esta técnica precedente está incorporado
en la presente como referencia.
El gen de hidrofobina es un gen micótico que se
expresa en gran cantidad. Por lo tanto se sugiere que la secuencia
promotora de un gen de hidrofobina, preferiblemente de
Chrysosporium, puede ser idóneamente aplicada como secuencia
reguladora de la expresión en una forma de realización adecuada de
la invención. Las secuencias de genes de Trichoderma
harzianum y Trichoderma reesei para hidrofobina han sido
descritas por ejemplo en la técnica precedente, así como una
secuencia de genes para Aspergillus fumigatus y
Aspergillus nidulans y la información relevante de la
secuencia está incorporada en la presente como referencia (Munoz
et al, Curr. Genet. 1997,
32(3):225-230; Nakari-Setala
T. et al, Eur. J. Biochem. 1996 15:235
(1-2):248-255, M. Parta et
al., Infect. Immun. 1994 62 (10): 4389-4395 y
Stringer M.A. et al. Mol. Microbiol. 1995
16(1):33-44). Con el uso de esta
información de secuencia un experto en la técnica puede obtener las
secuencias reguladoras de la expresión de genes de
Chrisosporium de hidrofobina sin una excesiva
experimentación, siguiendo las técnicas estándares que se han
sugerido antes. Una cepa de Chrysosporium recombinante según
la invención puede comprender una región que regula la hidrofobina
operativamente unida a la secuencia que codifica el polipéptido de
interés.
Una secuencia reguladora de la expresión puede
también comprender además un intensificador o un silenciador. Estos
son también muy conocidos en la técnica precedente y están
normalmente localizados a cierta distancia del promotor. Las
secuencias reguladoras de la expresión también pueden comprender
promotores con sitios de unión activador y sitios de unión
represor. En algunos casos estos sitios pueden también ser
modificados para eliminar este tipo de regulación. Se han descrito
promotores micóticos filamentosos en los que están presentes sitios
creA. Tales sitios creA pueden ser mutados para asegurar que se
elimina la represión de la glucosa que normalmente es ocasionada
por la presencia de los sitios no mutados. WO 94/13820 de
Gist-Brocades ilustra este principio. El uso de un
promotor de este tipo permite la producción del polipéptido
codificado por la secuencia de ácido nucleico regulada por el
promotor en presencia de glucosa. El mismo principio es también
evidente en WO 97/09438. Estos promotores pueden ser usados con o
sin sus sitios creA. Los mutantes en los que los sitios creA han
sido mutados pueden ser usados como secuencias reguladoras de la
expresión en una cepa recombinante según la invención y la
secuencia de ácido nucleico que regula puede entonces ser expresada
en presencia de glucosa. Tales promotores de Chrysosporium
aseguran la derrepresión de una manera análoga a la ilustrada en WO
97/09438. La identidad de los sitios creA es conocida en la técnica
precedente. De forma alternativa, es posible aplicar un promotor
con sitios de unión CreA que no han sido mutados en una cepa
huésped con una mutación en otro lugar en el sistema de represión p.
ej. en el propio gen creA, de modo que la cepa puede,
independientemente de la presencia de sitios de unión creA,
producir la proteína o polipéptido en presencia de glucosa.
Las secuencias de terminación son también
secuencias reguladoras de la expresión y éstas están operativamente
unidas al 3' terminal de la secuencia que va a ser expresada.
Cualquier terminador micótico puede ser funcional en la cepa de
Chrysosporium huésped según la invención. Algunos ejemplos
son el terminador trpC de A. nidulans (1), el terminador
alfa-glucosidasa de A. Niger (2), el
terminador glucoamilasa de A. Niger (3), el terminador
carboxil proteasa de Mucor miehei (US 5,578,463) y el
terminador celobiohidrolasa de Trichoderma reesei.
Naturalmente las secuencias de terminación de Chrysosporium
funcionan en Chrysosporium y son adecuadas p. ej. el
terminador EG6.
Una cepa recombinante de Chrysosporium
adecuada según la invención tiene la secuencia de ácido nucleico
que va a ser expresada operativamente unida a una secuencia que
codifica la secuencia de aminoácidos definida como secuencia señal.
Una secuencia señal es una secuencia de aminoácidos que, cuando
está operativamente unida a la secuencia de aminoácidos del
polipéptido expresado, permite la secreción del mismo a partir del
hongo huésped. Una secuencia señal de este tipo puede estar
normalmente asociada con el polipéptido heterólogo o puede ser
nativa del huésped. También puede ser extraña tanto del huésped
como del polipéptido. La secuencia de ácido nucleico que codifica
la secuencia señal debe estar posicionada en marco para permitir la
traducción de la secuencia señal y el polipéptido heterólogo.
Cualquier secuencia señal capaz de permitir la secreción de un
polipéptido a partir de una cepa de Chrysosporium puede ser
considerada. Una secuencia señal de este tipo es idóneamente una
secuencia señal micótica, preferiblemente una secuencia señal de
ascomiceto.
Ejemplos adecuados de secuencias señal pueden ser
derivados de las levaduras en general o de cualquiera de los
siguientes géneros específicos de hongos: Aspergillus,
Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neurospora, Rhizomucor,
Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium,
Saccharomyces, Talaromyces o formas sexuales alternativas de
los mismos como Emericella, Hypocrea. Las secuencias señal
que son particularmente útiles están a menudo asociadas en su forma
nativa con las siguientes proteínas: una celobiohidrolasa, una
endoglucanasa, una beta-galactosidasa, una
xilanasa, una pectinasa, una esterasa, una hidrofobina, una
proteasa o una amilasa. Algunos ejemplos incluyen amilasa o
glucoamilasa de Aspergillus o Humicola (4), amilasa
TAKA de Aspergillus oryzae, alfa-amilasa de
Aspergillus Niger, carboxil peptidasa de Mucor (US
5,578,463), una lipasa o proteinasa de Rhizomucor miehei,
celobiohidrolasa de Trichoderma (5),
beta-galactosidasa de Penicillium canescens y
el factor de acoplamiento alfa de Sacaromices.
De forma alternativa, la secuencia señal puede
ser de un gen de amilasa o de subtilisina de una cepa de
Bacillus. Una secuencia señal del mismo género que la cepa
huésped es extremadamente adecuada, ya que es más posible que esté
específicamente adaptada al huésped específico, por lo tanto
preferiblemente la secuencia señal es una secuencia señal de
Chrysosporium. Hemos descubierto cepas particulares de
Chrysosporium para excretar proteínas en cantidades
extremadamente grandes y naturalmente las secuencias señal de estas
cepas son particularmente interesantes. Estas cepas son
internamente designadas como cepa de Chrysosporium C1, cepa
UV13-6, cepa NG7C-19 y cepa
UV18-25. Han sido depositadas de acuerdo con el
Tratado de Budapest, tal y como se describe en otra parte de esta
descripción. Las secuencias señal de hongos filamentosos, levaduras
y bacterias son útiles. Las secuencias señal de origen no micótico
son también consideradas útiles, particularmente las bacterianas,
vegetales y mamíferas.
Una cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las formas de realización de la invención puede
además comprender un marcador seleccionable. Dicho marcador
seleccionable permitirá una selección fácil de las células
transformadas o transfectadas. Un marcador seleccionable a menudo
codifica un producto génico que proporciona un tipo específico de
resistencia extraña a la cepa no transformada. Puede tratarse de una
resistencia a metales pesados, antibióticos y biocidas en general.
Prototrofia es también un marcador seleccionable útil de la
variedad no antibiótica. Los marcadores seleccionables no
antibióticos pueden ser los preferidos en caso de que la proteína o
polipéptido de interés vaya a ser usado en alimentos o fármacos,
con el objetivo de obtener la homologación de dicho producto de
forma más rápida o menos complicada. Muy a menudo la indicación GRAS
se usa para este tipo de marcadores. Varios de estos marcadores
están disponibles para los expertos en la técnica. La agencia FDA
p. ej. proporciona una lista de los mismos. Los marcadores
seleccionables usados más frecuentemente son aquellos que se pueden
seleccionar del grupo de los que confieren resistencia a un
medicamento o mejoran un defecto nutritivo p. ej del grupo que
comprende amdS (acetamidasa), hph (higromicina fosfotransferasa),
pyrG
(orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa),
trpC (antranilato sintasa), argB
(ornitina-carbamoiltransferasa), sC (sulfato
adeniltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa),
resistencia al glufosinato, niaD
(nitrato-reductasa), un gen de resistencia a la
bleomicina, más específicamente Sh ble, resistencia a la
sulfonilurea p. ej. mutación de acetolactato sintasa ilv1. La
selección puede también realizarse en virtud de la cotransformación
en caso de que el marcador seleccionable esté sobre un vector
separado o de que el marcador seleccionable esté sobre el mismo
fragmento de ácido nucleico que la secuencia de codificación del
polipéptido para el polipéptido de interés.
Tal y como se utiliza en este caso, el término
polipéptido heterólogo es una proteína o polipéptido no expresado
de forma normal y segregado por la cepa huésped de
Chrysosporium usada para la expresión según la invención. El
polipéptido puede ser de origen vegetal o animal (vertebrado o
invertebrado) p. ej. de mamífero, pez, insecto, o tener como origen
un microorganismo, con la condición de que no se produzca en la cepa
huésped. Como mamífero se incluye al ser humano. Como
microorganismos se incluyen virus, bacterias, arqueobacterias y
hongos, es decir hongos filamentosos y levaduras. Bergey's
Manual for Bacterial Determinology proporciona listas adecuadas
de bacterias y arqueobacterias. Con fines farmacéuticos se
preferirán a menudo proteínas humanas, por lo que un huésped
recombinante según la invención que constituya una forma de
realización preferida será un huésped en el que el polipéptido sea
de origen humano. Con fines como la producción de alimentos,
idóneamente el polipéptido heterólogo será de origen animal,
vegetal o de algas. Estas formas de realización también son
consideradas, en consecuencia, ejemplos adecuados de la invención.
Formas de realización alternativas que también son útiles incluyen
un polipéptido heterólogo de cualquier origen bacteriano, de
levadura, vírico, arqueobacteriano y micótico. El origen micótico es
el más preferido.
Una forma de realización adecuada de la invención
comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga con uso de
codones adaptados. Dicha secuencia codifica la secuencia de
aminoácidos nativa del huésped del cual se ha derivado, pero tiene
una secuencia de ácido nucleico diferente, es decir, una secuencia
de ácido nucleico en la que determinados codones han sido
reemplazados por otros codones que codifican el mismo aminoácido
pero que son utilizados más fácilmente por la cepa huésped empleada
para la expresión. Esto puede llevar a una mejor expresión de la
secuencia de ácido nucleico heteróloga. Se trata de una práctica
habitual para un experto en la técnica. Este uso de codones
adaptados puede llevarse a cabo basándose en el uso de un codón
micótico conocido respecto al uso de un codón no micótico. Puede
también estar adaptado más específicamente incluso al uso de un
codón del propio Chrysosporium. Las similitudes son tales que
el uso de codones como los observados en Trichoderma,
Humicola y Aspergillus debería permitir el intercambio
de secuencias de tales organismos sin el uso de codones adaptados.
Los detalles en lo que se refiere el uso de codones de estos hongos
están disponibles para los expertos en la técnica y están
incorporados aquí como referencia.
La invención no se limita a las cepas
recombinantes anteriormente mencionadas de Chrysosporium,
sino que también se extiende a una cepa recombinante de
Chrysosporium que comprende una secuencia de ácido nucleico
que codifica una proteína homóloga para una cepa de
Chrysosporium, dicha secuencia de ácido nucleico estando
operativamente unida a una región reguladora de la expresión y
dicha cepa recombinante expresando más cantidad de dicha proteína
que la cepa correspondiente no recombinante en las mismas
condiciones. En el caso del polipéptido homólogo de interés
preferiblemente se trata de una enzima neutra o alcalina, como una
hidrolasa, una proteasa o una enzima que degrada carbohidratos, como
ya se ha descrito en otra parte. El polipéptido puede también ser
ácido. Preferiblemente la cepa recombinante expresará el
polipéptido en cantidades superiores a la cepa no recombinante.
Todas las observaciones mencionadas respecto al polipéptido
heterólogo son también válidas (mutatis mutandis) para el
polipéptido homólogo de celulasa.
En consecuencia, la invención también comprende
cepas de Chrysosporium creadas por ingeniería genética,
donde la secuencia que debe ser introducida puede tener como origen
Chrysosporium. Dicha cepa puede, no obstante, distinguirse
de las cepas producidas de forma nativa, por ejemplo, en virtud de
las secuencias heterólogas que están presentes en la secuencia de
ácido nucleico usada para transformar o transfectar el
Chrysosporium, en virtud del hecho de que están presentes
múltiples copias de la secuencia que codifica el polipéptido de
interés o en virtud del hecho de que éstas están expresadas en una
cantidad que supera las de la cepa no creada por ingeniería genética
en condiciones idénticas o en virtud del hecho de que la expresión
se produce en condiciones normalmente de no expresión. Este último
puede ser el caso si un promotor inducible regula la secuencia de
interés contrariamente a la situación no recombinante o si otro
factor induce la expresión, es el caso de la cepa no creada por
ingeniería genética. La invención tal y como se define en las formas
de realización precedentes no está destinada a incluir las cepas de
Chrysosporium de origen natural. La invención está dirigida
a las cepas derivadas a través de métodos de transformación.
Todas las cepas recombinantes de la invención
pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína heteróloga seleccionada de enzimas que degradan los
carbohidratos (celulasas, xilanasas, mananasas, manosidasas,
pectinasas, amilasas, p. ej. glucoamilasas,
\alpha-amilasas, alfa y
beta-galactosidasas, y \alpha- y
\beta-glucosidasas,
\beta-glucanasas, quitinasas, quitanasas),
proteasas (endoproteasas, amino-proteasas, amino- y
carboxi-peptidasas), otras hidrolasas (lipasas,
esterasas, fitasas), oxidorreductasas (catalasas,
glucosa-oxidasas) y transferasas
(transglicosilasas, transglutaminasas, isomerasas e invertasas).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
| * pesos moleculares (por MALDI) | |
| Nota: | * el resto de pesos moleculares por SDS PAGE |
| * las enzimas fueron tomadas con las mismas cantidades de proteínas | |
| * xyl = xilanasa | |
| * endo = endoglucanasa | |
| * gal = galactosidasa | |
| * gluc = glucosidasa | |
| * CBN = celbiohidrolasa | |
| PGU = poligalacturonasa |
Los productos más interesantes que pueden ser
producidos según la invención son celulasas, xilanasas, pectinasas,
lipasas y proteasas; las celulasas y xilanasas disociando enlaces
beta-1,4, y las celulasas comprendiendo
endoglucanasas, celobiohidrolasas y
beta-glucosidasas. Estas proteínas son
extremadamente útiles en varios procesos industriales conocidos en
la técnica. Específicamente para las celulasas se hace referencia p.
ej. a WO 98/15633 donde se describe el uso de celobiohidrolasas y
endoglucanasas. El contenido de dicha solicitud está incorporado en
la presente como referencia. También se alude a las Tablas A y B
que proporcionan detalles adicionales de las proteínas de
Chrysosporium interesantes.
Se ha descubierto, según la invención, que los
mutantes de Chrysosporium pueden ser hechos para tener una
expresión reducida de proteasa, haciéndolos así incluso más
adecuados para la producción de productos proteínicos,
especialmente si el producto proteínico es sensible a la actividad
proteasa. En consecuencia, la invención también abarca una cepa de
Chrysosporium mutante que produce menos proteasa que una cepa
de Chrysosporium no mutante, por ejemplo menos que una cepa
C. lucknowense C1 (VKM F-3500 D). En
particular, la actividad proteasa de tales cepas es inferior a la
mitad, más en particular inferior a un 30% de la cantidad producida
por la cepa C1. La reducción de la actividad proteasa puede ser
medida por métodos conocidos, como la medición del halo formado en
placas de leche desnatada o por degradación BSA.
Una forma de realización de la invención que es
particularmente interesante es un Chrysosporium recombinante
según la invención, en el que la secuencia de ácido nucleico que
codifica el polipéptido de interés codifica un polipéptido que es
inactivado o es inestable en un pH ácido, es decir un pH inferior a
6, incluso inferior a pH 5,5, más idóneamente incluso inferior a pH
5 e incluso tan bajo como o inferior a un pH 4. Esta es una forma
de realización particularmente interesante, ya que los sistemas de
expresión micóticos generalmente descritos no son cultivados en
condiciones neutras a alcalinas, sino que son cultivados en pH
ácido. En consecuencia, el sistema según la invención proporciona
un sistema de expresión micótico seguro para proteínas o
polipéptidos que son susceptibles de ser inactivados o inestables en
un pH ácido.
Bastante específicamente, una cepa recombinante
tal y como se define en cualquiera de las formas de realización
según la invención, en la que la secuencia de ácido nucleico que
codifica el polipéptido de interés codifica una proteína o
polipéptido que expone actividad y/o estabilidad óptima en un pH
superior a 5, preferiblemente en un pH entre neutro o alcalino (es
decir superior a 7) y/o en un pH superior a 6, se considera una
forma de realización preferida de la invención. Más de un 50%, más
de un 70% e incluso más de un 90% de las actividades óptimas con
tales valores de pH se indican como formas de realización
particularmente útiles. Un polipéptido expresado en unas
condiciones de cultivo no necesariamente tienen que ser activo en
las condiciones de cultivo, de hecho puede ser ventajoso que sea
cultivado en condiciones en las cuales es inactivo, ya que su forma
activa podrían ser perjudicial para el huésped. Este es el caso de
las proteasas, por ejemplo. No obstante, lo que sí es necesario es
que la proteína o polipéptido sean estables en las condiciones de
cultivo. La estabilidad puede ser termoestabilidad. También puede
tratarse de estabilidad contra composiciones o productos químicos
específicos, como los que están presentes por ejemplo en
composiciones o procesos de producción o aplicaciones del
polipéptido o proteína de interés. LAS en composiciones detergentes
que comprenden celulasas o lipasas, etc. es un ejemplo de un
producto químico a menudo perjudicial para las proteínas. Los
períodos de uso en las aplicaciones pueden variar desde una
exposición corta a una larga, por lo que la estabilidad puede darse
durante un periodo de tiempo variable según la aplicación. El
experto en la materia podrá determinar las condiciones correctas en
cada caso. Se pueden usar varios ensayos comercialmente disponibles
para determinar las actividades óptimas de varios productos
enzimáticos. Los catálogos de Sigma y Megazime por ejemplo muestran
esto. Ejemplos específicos de pruebas se mencionan en otra parte de
la descripción. Los fabricantes proporcionan orientaciones
dependiendo de la aplica-
ción.
ción.
Hemos descubierto sorprendentemente que una cepa
de Chrysosporium que puede ser idóneamente usada para
transformar o transfectar la secuencia de interés que va a ser
expresada es una cepa que exhibe una biomasa relativamente baja.
Hemos descubierto que las cepas de Chrysosporium que tienen
una biomasa entre dos y cinco veces inferior que las de
Trichoderma reesei cuando se cultivan con una viscosidad de
200-600 cP al final de la fermentación, y exhiben
una biomasa entre 10 y 20 veces inferior que las de Aspergillus
Niger cuando se cultivan con una viscosidad de
1500-2000 cP en condiciones correspondientes, es
decir, sus respectivas condiciones de cultivo óptimas pueden
proporcionar un nivel alto de expresión. Este nivel de expresión
supera con mucho al de las dos cepas comerciales de referencia con
una biomasa muy inferior y una viscosidad muy inferior. Esto
significa que el rendimiento de la expresión de dichas cepas de
Chrysosporium será considerablemente superior al de
Aspergillus Niger y Trichoderma reesei. Dicha cepa
de Chrysosporium transformada o transfectada constituye una
forma de realización adecuada de la invención.
Se observó una biomasa de 0,5-1,0
g/l para la cepa de Chrysosporium
C1(18-25) en contraposición a
2,5-5,0 g/l para Trichoderma reesei y
5-10 g/l para Aspergillus Niger en las
condiciones descritas anteriormente. En los ejemplos hemos
proporcionado detalles de este proceso.
En una forma de realización adecuada, una cepa de
Chrysosporium recombinante según la invención produce
proteínas o polipéptidos en al menos la cantidad equivalente a la
producción en moles por litro de celulasa por la cepa
UV13-6 o C-19, y más preferiblemente
al menos equivalente o superior a la de la cepa
UV18-25 en condiciones idénticas o
correspondientes, es decir, sus condiciones de cultivo óptimas
respectivas.
De forma inesperada hemos descubierto también que
los índices de expresión y secreción son increíblemente altos
cuando se usa una cepa de Chrysosporium que exhibe la
morfología micelial de la cepa UV18-25, es decir
micelios cortos fragmentados. Por lo tanto, una cepa recombinante
según la invención preferiblemente exhibe esta morfología. La
invención no obstante también comprende cepas de
Chrysosporium no recombinantes o cepas creadas de otra forma
por ingeniería genética que exhiben esta característica nueva e
inventiva. También se incluye en la invención una cepa de
Chrysosporium recombinante en cualquiera de las formas de
realización descritas según la invención, que además exhibe una
menor esporulación en comparación con C1, preferiblemente inferior
a la de la cepa UV13-6, preferiblemente inferior a
la de NG7C-19, preferiblemente inferior a la de
UV18-25 en condiciones de fermentación equivalentes.
La invención también comprende una cepa de Chrysosporium
recombinante en cualquiera de las formas de realización descritas
según la invención, que además exhibe al menos la proporción de
cantidad de producción de proteínas respecto a la biomasa en
comparación con C1, preferiblemente en comparación con la de
cualquiera de las cepas UV13-6,
NG7C-19 y UV18-25 en condiciones de
fermentación equivalentes. La invención no obstante también
comprende cepas de Chrisosporium no recombinantes o cepas
creadas de cualquier otra forma por ingeniería genética que exhiben
esta característica nueva e inventiva como tal o en combinación con
cualquiera de las otras formas de realización.
Otra forma de realización atractiva de la
invención también comprende una cepa de Chrysosporium
recombinante que exhibe una viscosidad inferior a la de la cepa
NG7C-19, preferiblemente inferior a la de
UV18-25 en condiciones de fermentación idénticas o
correspondientes. La invención no obstante también comprende cepas
de Chrysosporium no recombinantes o cepas creadas de
cualquier otra forma por ingeniería genética que exhiben esta
característica nueva e inventiva como a tal o en combinación con
cualquiera de las otras formas de realización. Hemos determinado que
la viscosidad de un cultivo de UV18-25 es inferior
a 10 cP en contraposición a la de Trichoderma reesei que es
del orden de 200-600 cP, siendo la de
Aspergillus Niger del orden de 1500-2000 cP
en sus respectivas condiciones de cultivo óptimas al final de la
fermentación. El procedimiento usado para este tipo de
determinación se proporciona en los ejemplos.
La viscosidad puede ser evaluada en muchos casos
por control visual. La fluidez de la sustancia puede variar hasta
tal punto que puede ser casi sólida, como una salsa o líquida. La
viscosidad puede también ser evaluada fácilmente por viscometría
rotacional de Brookfield, usando tubos de viscosidad cinemática, un
viscosímetro por caída de bola o un viscosímetro de tipo taza. Los
rendimientos de un cultivo con una viscosidad tan baja son
superiores a los de los cultivos comerciales conocidos con una
viscosidad superior por unidad de tiempo y por célula.
El procesamiento de tales cultivos de viscosidad
baja según la invención es ventajoso, en particular cuando los
cultivos son ampliados a escala. Las cepas de Chrysosporium
en cuestión con una viscosidad baja tienen un buen rendimiento en
cultivos de hasta 150,000 litros. En consecuencia, cualquier tamaño
de cultivo de hasta 150,000 litros constituye una forma de
realización útil de la invención. Cualquier otro tamaño
convencional de fermentación debería dar un buen resultado con las
cepas según la invención. El razonamiento que subyace en este hecho
es que pueden surgir problemas en una producción a gran escala, con
la formación de agregados que tienen micelios que son demasiado
densos y/o están distribuidos de una manera desigual. En
consecuencia, los medios no pueden ser eficazmente utilizados
durante el cultivo, lo que lleva a un proceso de producción
ineficiente en particular en fermentaciones a gran escala, i.e. por
encima de los 150,000 litros. La aireación y la mezcla se vuelven
problemáticas y causan una deficiencia de oxígeno y nutrientes y,
en consecuencia, una reducción de la concentración de la biomasa
productiva y una reducción de la producción de polipéptidos durante
el cultivo, y/o pueden ocasionar periodos de fermentación más
largos. Además, una alta viscosidad y una alta cizalla no son
deseables en los procesos de fermentación comerciales, y en los
procesos comerciales actuales son los factores que limitan la
producción. Todos estos aspectos negativos pueden ser superados por
el huésped de Chrysosporium según la invención, el cual
muestra características mucho mejores que Trichoderma reesei,
Aspergillus Niger y Aspergillus oryzae, que son
comercialmente usados en este aspecto, es decir exhibe mejores
niveles de producción de proteínas y mejores propiedades de
viscosidad y cantidades de biomasa.
Una cepa de Chrysosporium seleccionada de
C1, UV13-6, NG7C-19 y
UV18-25 ilustra varios aspectos de la invención
increíblemente bien. La invención, no obstante, también comprende
cepas recombinantes de Chrysosporium derivadas de las cuatro
cepas depositadas que también exhiben cualquiera de las
características nuevas e inventivas como tales o combinadas. Los
datos de depósito de estas cepas han sido presentados en otra parte
de la descripción. La invención también comprende cepas
recombinantes de Chrysosporium derivadas de las cuatro cepas
depositadas, que también exhiben cualquiera de las características
nuevas e inventivas como tales o combinadas. Una cepa de
Chrysosporium según la invención también comprende una cepa
que exhibe, en las condiciones de cultivo correspondientes, una
biomasa al menos dos veces inferior a la de Trichoderma
reesei, idóneamente incluso hasta más de 5 veces inferior a la
de Trichoderma reesei, específicamente a la de una
Trichoderma reesei que exhibe una viscosidad de
200-600 cP como se describe en las condiciones de
los ejemplos. Una cepa de Chrysosporium según la invención
también comprende una cepa que produce el polipéptido en al menos
la cantidad en moles por litro de celulasa por la cepa C1,
UV13-6, NG7C-19 o
UV18-25 en condiciones idénticas o
correspondientes.
Las cepas de Chrysosporium según la
invención son más preferidas si éstas muestran condiciones de
crecimiento óptimas con un pH neutro o alcalino y temperaturas de
25-43ºC. Es preferible un pH neutro e incluso
alcalino. Tales condiciones de producción son ventajosas para varios
polipéptidos y proteínas, en particular aquellas susceptibles de
atacar en un pH ácido o aquellas que son inactivas o inestables a
temperaturas bajas. No obstante, en una forma de realización de la
invención también se incluyen cepas de Chrysosporium que
pueden ser cultivadas en un pH ácido, lo cual puede resultar útil
para ciertas proteínas y polipéptidos. Un pH ácido adecuado se
sitúa a partir de 7.0. Se puede considerar un pH ácido inferior a
6.5, ya que proporciona una buena forma de realización de la
invención. Un pH entre 5,0-7,0 es también una forma
de realización adecuada. Un pH neutro puede ser de 7.0 o alrededor
de 7, p. ej. 6.5-7.5. Como se ha indicado en otra
parte, el pH de interés óptimo depende de varios factores que
serán evidentes para el experto en la técnica. Se puede usar
idóneamente un pH alcalino superior a 7.5, idóneamente entre
7.5-9.0.
Al comparar los datos de las cepas según la
invención con otras cepas que quizás tienen otras condiciones
óptimas (p. ej. Aspergillus y Trichoderma) en cuanto
a la medición de la viscosidad, la determinación de la biomasa o
la producción de proteínas, deberían realizarse las comparaciones
empleando las condiciones óptimas pertinentes para cada cepa en
cuestión. Esto será obvio para el experto en la técnica.
Una cepa de Chrysosporium según cualquiera
de las formas de realización de la invención mencionadas arriba,
dicha cepa exhibiendo además una producción de una o más de las
enzimas micóticas seleccionadas entre las enzimas que degradan
carbohidratos, proteasas, otras hidrolasas, oxidorreductasa, y
transferasas anteriormente mencionadas, se considera una forma de
realización particularmente útil de la invención. Los productos más
interesantes son específicamente celulasas, xilanasas, pectinasas,
lipasas y proteasas. No obstante, también es útil como forma de
realización de la invención, una cepa de Chrysosporium que
exhibe una producción de una o más enzimas micóticas que exhiben
una estabilidad y/o actividad óptima neutra o alcalina,
preferiblemente una estabilidad y/o actividad óptima alcalina, dicha
enzima siendo seleccionada entre las enzimas que degradan
carbohidratos, hidrolasas y proteasas, preferiblemente hidrolasas y
enzimas que degradan carbohidratos. En el caso de
Chrysosporium no recombinante, tales enzimas idóneamente no
son celulasas, tal y como se describe en WO 98/15633. Enzimas
particularmente interesantes son xilanasas, proteasas, esterasas,
alfa galactosidasas, beta-galactosidasas,
beta-glucanasas y pectinasas. Las enzimas no se
limitan a las que se acaban de mencionar. Las observaciones sobre
estabilidad y actividad dadas en otra parte de la descripción
también son válidas aquí.
La invención también comprende un método para
producir un polipéptido de interés, dicho método comprendiendo el
cultivo de una cepa de Chrysosporium, en cualquiera de las
formas de realización según la invención, en condiciones que
permiten la expresión y preferiblemente secreción del polipéptido y
recuperación del polipéptido de interés posteriormente
producido.
Cuando se menciona proteína o polipéptido, se
pretende incluir las variantes y mutantes p. ej. mutantes por
sustitución, inserción o supresión de proteínas de origen natural
que exhiben la actividad del no mutante. Esto mismo se aplica con
respecto a las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes.
Procesos como la transposición de genes, ingeniería de proteínas,
mutagénesis dirigida, evolución dirigida y mutagénesis aleatoria,
son procesos a través de los cuales se pueden obtener tales
polipéptidos, variantes o mutantes. US 5,223,409, US 5,780,279 y US
5,770,356 proporcionan enseñanzas sobre evolución dirigida. Mediante
el uso de este proceso, una biblioteca de secuencias genéticas
mutadas de forma aleatoria, creada por ejemplo mediante
transposición de genes por PCR con tendencia a error, es producida
en cualquier tipo de célula. Cada gen tiene una región de secreción
y una región de inmovilización anexas, de manera que la proteína
resultante es segregada y se mantiene fijada a la superficie del
huésped. Posteriormente, se crean unas condiciones que requieren la
actividad biológica del polipéptido particular. Esto ocurre durante
varios ciclos, que en última instancia conducen a un gen final con
las características deseadas. En otras palabras, un proceso de
evolución dirigida acelerado. US 5,763,192 también describe un
proceso para obtener ADN, ARN, péptidos, polipéptidos o proteínas
mediante el acoplamiento del polinucleótido sintético
estocásticamente a secuencias generadas, la introducción de las
mismas en un huésped, seguido de la selección de la célula huésped
con la característica predeterminada correspondiente.
Pueden utilizarse las técnicas estándares de
clonación y de aislamiento de proteínas y polipéptidos para
alcanzar la información de secuencia necesaria. Se pueden emplear
partes de secuencias conocidas como sondas para aislar otras
homólogas en otros géneros y cepas. La secuencia de ácido nucleico
que codifica una actividad enzimática particular puede utilizarse
para seleccionar una biblioteca de Chrysosporium, por
ejemplo. Un experto en la técnica determinará qué condiciones de
hibridación son las apropiadas. Los métodos convencionales para la
construcción de bibliotecas por hibridación de ácido nucleico y las
técnicas de clonación están descritas en Sambrook et al
(Eeds) (1989) en "Molecular Cloning. A Laboratory Manual"
Cold Spring Harbor, Press Plainview, New York, y Ausubel et
al (Eds) "Current Protocols in Molecular Biology" (1987)
John Wiley and Sons, New York. La información relevante puede
también derivarse de manuales y patentes posteriores, así como de
varios equipos comercialmente disponibles en la técnica.
En una forma de realización de alternativa, dicho
método comprende el cultivo de una cepa según la invención en
condiciones que permiten la expresión y preferiblemente secreción
de la proteína o polipéptido o precursor del mismo, y recuperación
del polipéptido posteriormente producido, y opcionalmente
sometiendo el precursor a fases adicionales de aislamiento y
purificación para obtener el polipéptido de interés. Dicho método
puede idóneamente comprender una fase de disociación del precursor
en el polipéptido o precursor de interés. La fase de disociación
puede ser disociación con una proteasa de tipo
Kex-2, cualquier proteasa o Kex-2
pareada con un aminoácido básico, por ejemplo cuando un sitio de
disociación de la proteasa se enlaza con una proteína
transportadora bien segregada y el polipéptido de interés. Un
experto en la técnica podrá encontrar rápidamente secuencias de
proteasa de tipo Kex-2, ya que los detalles de las
secuencia de consenso para las mismas están disponibles y ya se han
descrito varias alternativas, p. ej. furina.
Adecuadamente, en un método para la producción
del polipéptido según cualquiera de las formas de realización de la
invención, el cultivo se realiza con un pH superior a 5,
preferiblemente 5-10, más preferiblemente
6-9. Idóneamente, en dicho método el cultivo se
realiza a una temperatura entre 25-43ºC,
preferiblemente 30-40ºC. La cepa de
Chrysosporium usada en el método según la invención es muy
adecuadamente una cepa de Chrysosporium recombinante según
cualquiera de las formas de realización descritas. El método según
la invención, en este caso, puede además ser precedido por la fase
de producción de una cepa de Chrysosporium recombinante según
la invención. La selección de las condiciones apropiadas dependerán
de la naturaleza del polipéptido que se quiere expresar y dicha
selección entra dentro de las competencias de la actividad normal
de un experto en la técnica.
El método de producción de una cepa de
Chrysosporium recombinante según la invención forma también
parte de la invención en objeto. El método comprende la
introducción estable de una secuencia de ácido nucleico que
codifica un polipéptido heterólogo u homólogo en una cepa de
Chrysosporium, dicha secuencia de ácido nucleico estando
operativamente unida a una región reguladora de la expresión, dicha
introducción se realiza de una forma conocida per se para la
transformación de hongos filamentosos. Como se ha indicado antes,
hay numerosas referencias sobre esto disponibles y se ha citado una
pequeña selección. La información que se proporciona es suficiente
para permitir que el experto en la materia pueda llevar a cabo el
método sin una carga excesiva. El método comprende la introducción
de una secuencia de ácido nucleico que comprende cualquiera de los
elementos de ácido nucleico descritos en las distintas formas de
realización de Chrysosporium recombinante según la
invención, como tales o en combinación.
A modo de ejemplo, la introducción puede
realizarse usando el método de transformación de protoplastos. El
método está descrito en los ejemplos. Se conocen métodos
alternativos de transformación de protoplastos o esferoplastos, y
pueden ser usados tal y como ha sido descrito en la técnica
precedente para otros hongos filamentosos. Detalles de tales métodos
pueden encontrarse en muchas de los referencias citadas. Un método
según la invención comprende idóneamente el uso de una cepa no
recombinante de Chrysosporium según la invención como
material de partida para la introducción de la secuencia que
codifica el polipéptido de interés deseado.
La invención en objeto también comprende un
método para producir una enzima de Chrysosporium, dicho
método comprendiendo el cultivo de una cepa de Chrysosporium
según cualquiera de las formas de realización de la invención del
modo descrito anteriormente, en un medio de cultivo con un pH
superior a 5, preferiblemente 5-10, más
preferiblemente 6-9, idóneamente
6-7.5, 7.5-9, como ejemplos de gamas
de pH neutro y alcalino.
La invención en objeto también comprende dicho
método usando un medio de cultivo a una temperatura entre
25-43ºC, preferiblemente 30-40ºC.
La combinación del pH y la temperatura preferidas es una forma de
realización especialmente preferida del método para producir la
enzima de Chrysosporium según la invención.
De forma más general, la invención además
comprende un método para producir enzimas que exponen una actividad
y/o estabilidad óptima neutra o alcalina, preferiblemente una
actividad y/o estabilidad óptima alcalina. Las gamas preferidas en
cuanto al pH y la actividad óptima, así como los ensayos mediante
los cuales determinarlas, han sido proporcionados en otra parte de
la descripción. La enzima debería ser seleccionada entre enzimas
que degradan carbohidratos, proteasas, otras hidrolasas,
oxidorreductasas, y transferasas, del modo descrito anteriormente,
dicho método comprendiendo el cultivo de una célula huésped
transformada o transfectada con la secuencia de ácido nucleico que
codifica la enzima correspondiente. Idóneamente, dicha enzima será
una enzima de Chrysosporium. Un método adecuado de este tipo
comprende la producción específicamente de celulasa, xilanasa,
pectinasa, lipasa y proteasa, donde la celulasa y la xilanasa
disocian enlaces \beta-1,4 y la celulasa
comprende endoglucanasa, celobiohidrolasa y
\beta-glucosidasa. El método según la invención
puede comprender el cultivo de cualquier huésped de
Chrysosporium según la invención que comprenda el ácido
nucleico que codifica dichas enzimas. Idóneamente, la producción de
huéspedes de Chrysosporium no recombinantes según la
invención está destinada a la producción de enzimas, hidrolasas y
proteasas que degradan carbohidratos. En este caso, la enzima
idóneamente no es una celulasa. Ejemplos de productos adecuados
para ser producidos se dan en las Tablas A y B. Los métodos de
aislamiento son análogos a los descritos en WO 98/15633 y están
incorporados aquí como referencia.
Las enzimas producidas por cepas de
Chrysosporium según la invención están también incluidas en
la invención. También se incluyen enzimas de origen
Chrysosporium que pueden ser aisladas de cepas de
Chrysosporium no recombinantes según la invención. Muestran
las características de estabilidad y actividad mencionadas.
Idóneamente, son estables en presencia de LAS. En particular se
reivindican las proteasas con pl 4-9.5, proteasas
con un PM de 25-95 kD, xilanasas con pl entre 4.0 y
9.5, xilanasas con PM entre 25 y 65 kD, endoglucanasas con un pl
entre 3.5 y 6.5, endoglucanasas con PM de 25-55
kDa, \beta-glucosidasas,
\alpha,\beta-galactosidases con un pl de 4 4.5,
\beta-glucosidasas,
\alpha,\beta-galactosidases con un PM de
45-50 kDa, celobiohidrolasas de pl
4-5, celobiohidrolasas de PM 45-60
kDa, p. ej. un PM de 55 kD y pl 4.4, poligalacturonasas, con un pl
de 4.0-5.0 poligalacturonasa de
60-70 kDa, p. ej. 65 kDa, esterasas con un pl
4-5, y esterasas con un PM de
95-105 kDa, con las características de estabilidad y
actividad anteriormente mencionadas. Los pesos moleculares (PM) son
determinados por SDS-PAGE. La enzima no
recombinante, es decir que se produce de forma nativa, no es la
celulasa descrita en WO 98/15633. Una enzima como la descrita en WO
98/15633 queda excluida. Las enzimas según la invención están
representadas por las enzimas de la Tabla B. Enzimas con
combinaciones de los valores de pl y pesos moleculares
anteriormente mencionados están también incluidas.
La invención también se refiere a la
(sobre)producción de productos no proteínicos por las cepas
mutantes (recombinantes) de la invención. Tales productos no
proteínicos incluyen metabolitos primarios, como ácidos orgánicos,
aminoácidos, y secundarios como antibióticos, p. ej. penicilinas y
cefalosporinas. Estos productos son el resultado de combinaciones de
vías bioquímicas, que incluyen diferentes genes micóticos de
interés. Los metabolitos micóticos primarios y secundarios y los
procedimientos para producir estos metabolitos en organismos
micóticos se conocen muy bien en la técnica. Ejemplos de la
producción de metabolitos primarios están descritos en Mattey M.,
The Production of Organic Acids, Current Reviews in
Biotechnology, 12, 87-132 (1992). Ejemplos de la
producción de metabolitos secundarios están descritos en Penalva
et al. The Optimization of Penicillin Biosynthesis in
Fungi, Trends in Biotechnology 16, 483-489
(1998).
Las siguientes gamas de datos de parámetros
operativos han sido determinadas para fermentaciones micóticas
usando tres organismos micóticos diferentes. Los tres organismos
micóticos comparados son: Trichoderma longibrachiatum
(anteriormente T. reesei), Aspergillus Niger y
Chrysosporium lucknowense (UV18-25).
La viscosidad es determinada en un viscosímetro
Brookfield LVF usando el adaptador de muestra pequeño y el husillo
número 31.
Se enciende la bomba de circulación de agua 5
minutos antes de usar el viscosímetro para equilibrar la cámara de
agua. La temperatura del baño debería ser de 30ºC.
Se obtiene una muestra reciente del caldo de
fermentación y se depositan 10 ml del caldo en el husillo de muestra
pequeño. Se selecciona la velocidad del husillo para que dé una
lectura en la gama de 10-80. Se esperan cuatro (4)
minutos y se toma la lectura de la escala del viscosímetro. Se
multiplicar la lectura por el factor dado abajo para obtener la
viscosidad en centipoise (cP).
| Velocidad del husillo | Factor de multiplicación | |
| 6 | 50 | |
| 12 | 25 | |
| 30 | 10 | |
| 60 | 5 |
Las siguientes gamas de viscosidad han sido
determinadas usando el procedimiento anterior para fermentaciones,
usando el organismo micótico específico usando el procedimiento
anterior:
| Viscosidad en cP | |
| T. longibrachiatum | 200-600 |
| A. Níger | 1,500-2,000 |
| C. lucknowense (UV18-25) | LT 10 |
La biomasa se determina mediante el procedimiento
siguiente: Previamente se pesan 5.5 cm de papel de filtro (Whatman
54) en un peso de aluminio. Se filtran 5.0 ml del caldo entero a
través del papel de 5.5 cm en un embudo Buchner, se lava la torta
del filtro con 10 ml agua desionizada, se coloca la torta lavada y
el filtro en una balanza y se seca durante toda la noche a 60ºC.
Se finaliza el secado a 100ºC durante 1 hora, luego se coloca en un
desecador para enfriarla. Se mide el peso de material seco. La
biomasa total (g/l) es igual a la diferencia entre el peso inicial
y el final multiplicado por 200. Las siguientes gamas de biomasa
han sido determinadas para las fermentaciones que usan el organismo
micótico específico usando el procedimiento anterior:
| Biomasa en g/l | |
| T. longibrachiatum | 2.5-5 |
| A. Níger | 5-10 |
| C. lucknowense (UV18-25) | 0.5-1 |
Los niveles proteínicos fueron determinados
usando el procedimiento de ensayo BioRad de Sigma Company. Los
niveles proteínicos fueron máximos para Chrysosporium. Los
datos presentados arriba representan valores determinados 48 horas
tras el inicio del proceso de fermentación y hasta el final de la
fermentación; todos los valores de Aspergilli y
Trichoderma son para organismos micóticos comercialmente
relevantes y reflejan datos comerciales reales.
Una cepa micótica como C. lucknowense
(UV18-25) tiene la ventaja de que la viscosidad
baja permite el uso de una potencia y/o cizalla inferior en la
fermentación para alcanzar las demandas de oxígeno, para aquellos
casos en los que el esfuerzo de cizalla en el producto puede ser
perjudicial para la productividad debido al daño físico de la
molécula del producto. La producción de biomasa inferior con una
alta producción de proteínas indica un organismo más eficaz en la
conversión de los medios de fermentación en producto. En
consecuencia, el Chrysosporium proporciona mejores datos de
biomasa y viscosidad al tiempo que también proporciona al menos
tantas proteínas, y de hecho muchas más proteínas, que los dos
sistemas comercialmente usados, con lo cual obviamente es mejor que
las cepas normalmente depositadas de Aspergillus o
Trichoderma reesei en las colecciones públicas
generales.
La alta producción de proteínas con una
concentración de biomasa baja producida por C. lucknowense
(UV 18-25) permitiría un desarrollo de las
condiciones de fermentación con mayores múltiplos de incremento de
la biomasa, si el aumento de la biomasa diese como resultado una
mayor productividad para el producto deseado antes de alcanzar las
condiciones de fermentación límites. Los elevados niveles de
biomasa y viscosidad presentes producidos por los organismos T.
longibrachiatum y A. Niger restringen el aumento de la
biomasa, ya que los presentes niveles de biomasa y viscosidad casi
limitan con las condiciones prácticas de fermentación.
Dos cepas no transformadas de
Chrysosporium C1 y una cepa de referencia de Trichoderma
reesei fueron evaluadas en dos medios (Gs pH 6,8 y agar
Pridham, PA, pH 6,8). Con el fin de evaluar el nivel de resistencia
antibiótica, se recogieron esporas de placas con PDA de 7 días. Unas
placas selectivas fueron incubadas a 32ºC y evaluadas después de
2,4 y 5 días. El resultado fue que las cepas C-1,
NG7C-19 y UV18-25, tienen claramente
un nivel de resistencia basal bajo tanto para fleomicina como para
higromicina. Este nivel es comparable con el de una cepa de T.
reesei de referencia usada de forma habitual en el laboratorio.
En consecuencia, existen indicios claros de que estos dos
marcadores seleccionables micóticos estándar pueden ser usados bien
en cepas de Chrysosporium. No deberían esperarse problemas
con otros marcadores seleccionables micóticos estándares.
La selección de cepas de Chrysosporium
Sh-ble (resistencia a la fleomicina) transformadas
se realizó de forma satisfactoria en 50 \mug/ml. Este fue
también el nivel de selección usado para T. Reesei, lo que
muestra que la selección diferencial puede ser fácilmente
conseguida en Chrysosporium. Las mismas observaciones son
válidas para cepas transformadas con resistencia a la higromicina
en un nivel de 150 \mug/ml.
La técnica de transformación de protoplastos fue
usada en Chrysosporium basándose en la tecnología de
transformación micótica más generalmente aplicada. Todas las
esporas de una placa con 90 mm de PDA fueron recuperadas en 8 ml de
IC1 y transferidas a un frasco de agitación con 50 ml del medio IC1
para su incubación durante 15 horas a 35ºC y 200 rpm. Después, el
cultivo fue centrifugado, el granulado fue lavado en MnP, llevado
de nueva a una solución con 10 ml de MnP y 10 mg/ml de Caylase
C_{3} e incubado durante 30 minutos a 35ºC con agitación (150
rpm).
La solución fue filtrada y el filtrado fue
sometido a un centrifugado durante 10 minutos a 3500 rpm. El
granulado fue lavado con 10 ml de MnPCa^{2+}. Este fue
centrifugado durante 10 minutos a 25ºC. Luego se añadieron 50
microlitros de MPC frío. La mezcla fue mantenida en hielo durante 30
minutos, tras lo cual se añadieron 2,5 ml de PMC. Después de 15
minutos a temperatura ambiente se mezclaron 500 microlitros de los
protoplastos tratados en 3 ml de MnR Soft e inmediatamente se
depositaron en una palca de MnR que contenía fleomicina o
higromicina como agente de selección. Tras la incubación durante
cinco días a 30ºC, los transformantes fueron analizados (los clones
son visibles después de 48 horas). La eficiencia de la
transformación fue determinada usando 10 microgramos del plásmido
pAN8-1^{19} de referencia. Los resultados se
presentan en la tabla siguiente D.
Los resultados muestran que la viabilidad de los
transformantes de Chrysosporium es superior a los de
Trichoderma. La transformabilidad de las cepas es
comparable y, así, el número de transformantes obtenidos en un
experimento es 4 veces mayor para Chrysosporium que para
T. reesei. Así el sistema de transformación de
Chrisosporium no sólo iguala al sistema de T. reesei
usado de forma habitual, sino que incluso lo mejora. Esta mejora
puede probarse especialmente útil para vectores que son menos
eficaces en la transformación que pAN8-1. Ejemplos
de estos vectores de transformación menos eficaces son los vectores
que transportan proteínas para la producción de proteínas no
micóticas, los cuales generalmente producen 10 veces menos
transformantes.
Otros vectores de transformación y de expresión
fueron construidos con secuencias de codificación de proteínas de
Chrysosporium homólogas y también con secuencias de
codificación de proteínas heterólogas para el uso en experimentos
de transformación con Chrysosporium. Los mapas de vectores
se proporcionan en las figuras 6-11.
La proteína homóloga que va a ser expresada fue
seleccionada del grupo de celulasas producidas por
Chrysosporium y consistió en endoglucanasa 6, que pertenece
a la familia 6 (PM 43 kDa), y la proteína heteróloga fue la
endoglucanasa 3, que pertenece a familia 12 (PM 25 kDa) de
Penicillium.
pF6g comprende un fragmento promotor de
endoglucanasa 6 de Chrysosporium unido a la secuencia señal
de la endoglucanasa 6 en marco con el marco de lectura abierto de
la endoglucanasa 6, seguido de la secuencia de terminación de
endoglucanasa 6. La selección de transformantes se realiza usando
una cotransformación con un vector seleccionable.
pUT1150 comprende un promotor celobiohidrolasa de
Trichoderma reesei unido a una secuencia señal de
endoglucanasa 6 en marco con el marco de lectura abierto de
endoglucanasa 6, seguido de la secuencia de terminación de
celobiohidrolasa de T. reesei. Además, este vector
transporta un segundo cassette de expresión con un marcador de
selección, es decir, el gen de resistencia a la fleomicina (gen
Sh-ble).
pUT1152 comprende un promotor de
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
A de Aspergillus nidulans unido a la secuencia señal de
endoglucanasa 6 en marco con el marco de lectura abierto de la
endoglucanasa 6, seguido de la secuencia de terminación de
antranilato sintasa (trpC) de A. nidulans. Además este
vector transporta un segundo cassette de expresión con un marcador
de selección, es decir el gen de resistencia a la fleomicina (gen
Sh-ble).
pUT1155 comprende un promotor de
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
A de A. nidulans unido a la secuencia señal de
celobiohidrolasa de Trichoderma reesei en marco con la
proteína transportadora Sh-ble que a su vez está
unida en marco con el marco de lectura abierto de la endoglucanasa
6, seguido de la secuencia de terminación trpC de A.
nidulans. Este vector utiliza la tecnología de la proteína
transportadora fusionada a la proteína de interés, la cual se conoce
por mejorar en gran medida la secreción de la proteína de
interés.
pUT1160 comprende un promotor de
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
A de Aspergillus nidulans unido a una secuencia señal de
celobiohidrolasa de Trichoderma reesei en marco con la
proteína transportadora Sh-ble, que a su vez está
unida en marco con el marco de lectura abiertoendo de la glucanasa
3 de Penicillium, seguido de la secuencia de terminación de
trpC de A. nidulans.
pUT1162 comprende un promotor de celobiohidrolasa
de Trichoderma reesei unido a la secuencia señal de la
endoglucanasa 3 en marco con el marco de lectura abierto de la
endoglucanasa 3 de Penicillium, seguido de la secuencia de
terminación de celobiohidrolasa de T. reesei. Además este
vector transporta un segundo cassette de expresión con un marcador
de selección, es decir el gen de resistencia a la fleomicina (gen
Sh-ble).
La tabla E muestra los resultados de la
transformación tanto de Chrysosporium
UV18-25 como de Tolipocladium geodes. El
protocolo de transformación usado está descrito en la sección
relativa a la transformación heteróloga.
Las cepas C1 (NG7C-19 y/o
UV18-25) fueron evaluadas según su capacidad para
segregar diversas proteínas heterólogas: una proteína bacteriana
(proteína con resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus
hindustanus, Sh ble), una proteína micótica (xilanasa II de
Trichoderma reesei, XYN2) y una proteína humana (el
lisozima humano, HLZ). Los detalles del proceso son los
siguientes:
Las cepas C1, NG7C-19 y
UV18-25, fueron transformadas con el plásmido
pUT720^{1}. Este vector presenta el cassette de expresión micótico
siguiente:
- -
- el promotor de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Aspergillus nidulans (gpdA)^{2}
- -
- una secuencia señal de celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei (cbh1) sintética^{1,3}
- -
- el gen de resistencia a la fleomicina Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus^{4}
- -
- el terminador de triptófano-sintasa (trpC) de Aspergillus nidulans^{5}
El vector también transporta el gen
beta-lactamasa (bla) y el origen de
replicación de E. coli del plásmido pUC18^{6}. El mapa del
plásmido detallado se proporciona en la figura 2. Los protoplastos
C1 fueron transformados según Durand et al.^{7} adaptado a
C1 (las composiciones de los medios & las soluciones se dan en
otra parte): se recogieron todas las esporas de una cepa C1 no
transformada de una placa de 90 mm de PDA en 8 ml de IC1 y fueron
transferidas a un frasco de agitación con 50 ml del medio IC1 para
su incubación durante 15 horas a 35ºC y 150 rpm. A continuación, el
cultivo fue centrifugado, el granulado lavado en MnP, redisuelto en
10 ml de MnP + 10 mg/ml de Caylase C_{3}, e incubado durante 30
minutos a 35ºC con agitación (150 rpm). La solución fue filtrada y
el filtrado fue centrifugado durante 10 minutos a 3500 rpm. El
granulado fue lavado con 10 ml de MnPCa^{2+}. Este fue
centrifugado durante 10 min a 3500 rpm y el granulado fue recogido
sobre 1 ml de MnPCa^{2+}. Se añadieron 10 \mug de ADN pUT720 a
200 \mul de solución de protoplastos y se incubó durante 10 min a
temperatura ambiente (\sim20ºC). Luego, se añadieron 50 \mul de
MPC frío. La mezcla fue mantenida en hielo durante 30 min. tras lo
cual se añadieron 2.5 ml de PMC. Después de 15 min. a temperatura
ambiente, se mezclaron 500 \mul de los protoplastos tratados con 3
ml de MnR Soft e inmediatamente se depositaron sobre una placa de
MnR que contenía fleomicina (50 \mug/ml a pH6.5) como agente de
selección. Después de 5 días
de incubación a 30ºC, los transformantes fueron analizados (los clones empezaron a ser visible después de 48 horas).
de incubación a 30ºC, los transformantes fueron analizados (los clones empezaron a ser visible después de 48 horas).
La producción de Sh ble de transformantes de C1
(clones resistentes a la fleomicina) fue analizada como sigue: los
transformantes primarios fueron recogidos con un palillo en placas
de GS+fleomicina (5 \mug/ml) y se dejaron crecer durante 5 días a
32ºC para verificar la resistencia. Cada clon resistente verificado
fue subclonado sobre placas de GS. Dos subclones por transformante
fueron utilizados para inocular placas de PDA con el objetivo de
obtener esporas para la iniciación del cultivo líquido. Los cultivos
líquidos en IC1 se dejaron crecer durante 5 días a 27ºC (agitación
200 rpm). Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g, 10 min)
y se recogieron 500 \mul del sobrenadante. A partir de estas
muestras, las proteínas fueron precipitadas con ATC y resuspendidas
en un tampón Western Sample para 4 mg/ml de las proteínas totales
(Método Lowry^{8}). Se cargaron 10 \mul (aproximadamente 40
\mug de las proteínas totales) sobre un gel de acrilamida/SDS al
12% y se dejó evolucionar (sistema BioRad, Mini
Trans-Blot). La transferencia Western fue
desarrollada según las instrucciones de BioRad (membrana Schleicher
& Schull de 0.2 \mum) utilizando un antisuero de conejo
anti-Sh ble (Cayla Cat. Ref.
#ANTI-0010) como anticuerpo primario. Los resultados
se muestran en la figura 1 y en la Tabla F:
Estos datos muestran que:
- 1)
- Las señales de transcripción/traducción heterólogas de pUT720 son funcionales en Chrysosporium.
- 2)
- La secuencia señal heteróloga de pUT720 es funcional en Chrysosporium.
- 3)
- Chrysosporium puede ser usado como huésped para la secreción de una proteína bacteriana heteróloga.
Las cepas C1, NG7C-19 y
UV18-25, fueron transformadas con el plásmido
pUT97OG^{9}. Este vector presenta el cassette de expresión
micótico siguiente:
- -
- el promotor de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Aspergillus nidulans (gpdA)^{2}
- -
- una secuencia señal sintética de celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei (cbh1)^{1,3}
- -
- el gen de resistencia a la fleomicina Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus usado como proteína transpor-tadora^{4}
- -
- dominio de la región bisagra de glucoamilasa de Aspergillus Niger (glaA2) clonado del plásmido pAN56-2^{11,12}
- -
- un péptido de enlace (LGERK) que representa un sitio de disociación de proteasa tipo KEX2^{1}
- -
- un gen sintético de lisozima humano (hlz)^{10}
- -
- un terminador de triptófano-sintasa (trpC) de Aspergillus nidulans^{5}
El vector también transporta el gen
beta-lactamasa (bla) y el origen de
replicación de E. coli del plásmido pUC18^{6}. El mapa del
plásmido detallado se proporciona en la figura 3. Los protoplastos
C1 fueron transformados con el plásmido pUT970G siguiendo el mismo
procedimiento ya descrito en el ejemplo 1. La proteína de fusión (Sh
ble::bisagra GAM: HLZ) es funcional con respecto a la resistencia a
la fleomicina, lo que permite una selección fácil de los
transformantes de C1. Además, el nivel de resistencia a la
fleomicina se corresponde en términos generales con el nivel de
expresión hlz.
La producción de HLZ de los transformantes de C1
(clones resistentes a la fleomicina) fue analizada mediante el
siguiente ensayo de la actividad lisozima: los transformantes
primarios fueron recogidos con un palillo sobre placas de
GS+fleomicina (5 \mug/ml) (verificación de la resistencia) y
también sobre placas LYSO (detección de la actividad HLZ mediante
visualización de la zona de aclarado^{1,10}). Las placas se
dejaron crecer durante 5 días a 32ºC. Cada clon verificado fue
subclonado sobre placas LYSO. Dos subclones por transformante
fueron utilizados para inocular placas PDA con el objetivo de
obtener esporas para la iniciación del cultivo líquido. Los cultivos
líquidos en IC1 se dejaron crecer durante 5 días a 27ºC (agitación
180 rpm). Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g, 10
min). A partir de estas muestras, la actividad lisozima fue medida
según Mörski et al.^{13}.
Estos datos muestran que:
- 1)
- Se confirman los puntos 1 & 2 del Ejemplo 1.
- 2)
- Sh ble es funcional en Chrysosporium como marcador de resistencia.
- 3)
- Sh ble es funcional en Chrysosporium como proteína transportadora.
- 4)
- El sitio de disociación de la proteasa tipo KEX2 es funcional en Chrysosporium (de lo contrario HLZ no sería activa).
- 5)
- Chrysosporium puede ser usado como huésped para la secreción de una proteína mamífera heteróloga.
La cepa de C1, UV18-25, fue
transformada por los plásmidos pUT1064 y pUT1065. pUT1064 presenta
los dos cassettes de expresión micóticos siguientes:
El primer cassette permite la selección de
transformantes resistentes a la fleomicina:
- -
- El promotor del gen de control del cruce de Neurospora crassa 1 (cpc-I)^{14}
- -
- El gen de resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus Sh ble^{4}
- -
- El terminador de triptófano-sintasa (trpC) de Aspergillus nidulans^{5}
El segundo cassette es el cassette de producción
de xilanasa:
- -
- El promotor TR2 cbh1 de la cepa T. reesei^{15}
- -
- El gen TR2 xyn2 (incluyendo su secuencia señal) de la cepa T. reesei^{16}
- -
- El terminador TR2 cbh1 de la cepa T. reesei^{15}
El vector también transporta un origen de
replicación de E. coli del plásmido pUC19^{6}. El mapa del
plásmido detallado se proporciona en la figura 4.
pUT1065 presenta el cassette de expresión
micótico siguiente:
- -
- el promotor de gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (gpdA) de A. nidulans^{2}
- -
- una secuencia señal sintética de celobiohidrolasa 1 (cbh1) de T. reesei^{1,3}
- -
- el gen de resistencia a la fleomicina Sh ble de S. hindustanus^{4} usado como proteína transportadora^{10}
- -
- un péptido de enlace (SGERK) que representa un sitio de disociación de proteasa de tipo KEX2^{1}
- -
- el gen TR2 xyn2 (sin secuencia señal) de la cepa T. reesei^{16}
- -
- el terminador de triptófano-sintasa (trpC) de A. nidulans^{5}
El vector también transporta el gen
beta-lactamasa (bla) y un origen de
replicación de E. coli del plásmido pUC18^{6}. El mapa del
plásmido detallado se proporciona en la figura 5. Los protoplastos
de C1 fueron transformados con el plásmido pUT1064 o pUT1065
siguiendo el mismo procedimiento ya descrito en el ejemplo 1. La
proteína de fusión en el plásmido pUT1065 (Sh ble::XYN2) es
funcional con respecto a la resistencia a la fleomicina, por lo que
permite la selección fácil de los transformantes de C1. Además, el
nivel de resistencia a la fleomicina se corresponde en términos
generales con el nivel de expresión xyn2. En el pUT1064,
xyn2 fue clonado con su propia secuencia señal.
La producción de xilanasa de los transformantes
C1 (clones resistentes a la fleomicina) fue analizada mediante el
ensayo de la actividad xilanasa como sigue: los transformantes
primarios fueron recogidos con un palillo sobre unas placas de
GS+fleomicina (5 \mug/ml) (verificación de la resistencia) y
también sobre placas de xilano (detección de la actividad xilanasa
mediante visualización de la zona de aclarado^{17}). Las placas se
dejaron crecer durante 5 días a 32ºC. Cada clon verificado fue
subclonado sobre placas de xilano. Dos subclones por transformante
fueron utilizados para inocular placas de PDA con el objetivo de
obtener esporas para la iniciación del cultivo líquido. Los
cultivos líquidos en IC1+ 5 g/l Kftalato se dejaron crecer 5 días a
27ºC (agitación 180 rpm). Luego, los cultivos fueron centrifugados
(5000 g, 10 min). A partir de estas muestras, la actividad xilanasa
fue medida por la técnica DNS según Miller et al.^{18}
Estos datos muestran que:
- 1)
- Se confirman los puntos 1 a 4 del ejemplo 2.
- 2)
- C1 puede ser usada como huésped para la secreción de una proteína micótica heteróloga.
[4] También se ilustran datos de la expresión de
UV18-25 transformado, y en la tabla 1 se muestran
los resultados para los plásmidos con los cuales se efectuó la
transformación. La tabla muestra unos buenos niveles de expresión
para endoglucanasa y celobiohidrolasa usando secuencias de
regulación de la expresión y secuencias señal heterólogas, pero
también con secuencias de regulación de la expresión y secuencias
de señal homólogas. Los detalles de los diferentes plásmidos pueden
sacarse en otra parte en la descripción y en las figuras. La
producción se realiza con un pH alcalino a una temperatura de
35ºC.
| Condiciones de cultivo (frasco de agitación): 88h, 35ºC, 230 rpm |
| *todas las cifras anteriores son en % respecto a la cepa madre UV18-25 |
| Base Mandels: | Medio MnP: | |
| KH_{2} PO_{4} 2.0 g/l | Base Mandels con | |
| (NH_{4})_{2} SO_{4} | 1.4 g/l | Peptona 1 g/l |
| MgSO_{4}.7H_{2}O | 0.3 g/l | MES 2 g/l |
| CaCl_{2} | 0.3 g/l | Sacarosa 100 g/l |
| Oligoelementos | 1.0 ml/l | Ajustar pH a 5 |
| MnR | MnP CA^{2+}: | |
| MnP+sacarosa | 130 g/l | Medio MnP + |
| Extracto de levadura | 2.5 g/l | CaCl_{2}2H_{2}O 50 mM |
| Glucosa | 2.5 g/l | Ajustar pH a 6.5 |
| Agar | 15 g/l | |
| MnR Soft: | MnR con sólo 7.5 g/l de agar | |
| MPC: | ||
| CaCl_{2} | 50 mM | pH 5.8 |
| MOPS | 10 mM | |
| PEG | 40% |
| GS: | ||
| Glucosa | 10 g/l | |
| Biosoyase | 5 g/l | [Merieux] |
| Agar | 15 g/l | pH debería ser 6.8 |
| PDA: | ||
| Agar de dextrosa de patata | 39 g/l | [Difco] |
| el pH debería ser 5.5 | ||
| MPG: | ||
| Base Mandels con | ||
| K.ftalato | 5 g/l | |
| Glucosa | 30 g/l | |
| Extracto de levadura | 5 g/l |
Los medios de regeneración (MnR) completados con
50 \mug/ml de fleomicina o 100-150 \mug/ml de
higromicina se utilizan para seleccionar los transformantes. El
medio GS, completado con 5 \mug/ml de fleomicina se utiliza para
confirmar la resistencia antibiótica.
PDA es un medio completo para un crecimiento
rápido y una buena esporulación. Los medios líquidos son inoculados
con 1/20 de suspensión de esporas (todas las esporas de una placa
con 90 mm de PDA en 5 ml de Tween 0.1%). Dichos cultivos se dejaron
crecer a 27ºC en frascos de agitación (200 rpm).
Se describe el proceso para obtener varias
proteínas ya que se dan diversas características de las proteínas.
Las tablas A, B y J proporcionan detalles del esquema de
purificación y las actividades. El aislamiento se realiza a partir
del cultivo de Chrysosporium filtrado usando cromatografía de
intercambio iónico DEAE-Toyopearl, análogamente al
método descrito en WO 98/15633, que está incorporado aquí como
referencia. La fracción no enlazada (F 60-31 CF)
obtenida por esta cromatografía fue purificada utilizando
cromatografía de intercambio iónico Macro Prep Q después de
equilibrar el pH a 7,6. La fracción no enlazada (NBNB) fue agrupada
y las proteínas enlazadas fueron eluídas en un gradiente de naCl
0-1 M. La fracción NBNB proporcionó bandas de
proteínas principales de 19, 30, 35 y 46 kD y una secundaria de 51
kD. En el gradiente de naCl 0-1 M, los niveles
máximos de proteínas fueron eluídos de varias fracciones.
39-41 incluyó proteínas de 28, 36 y 60 kD,
44-48 incluyó 28, 45 y 66 kD como bandas de
proteínas principales con proteínas de 33, 36, 55, 60 y 67 kD, la
fracción 49-51 dio proteínas de 30, 36, 56 y 68 kD y
la fracción 52-59 incluyó proteínas principales de
33 y 55 kD y proteínas secundarias de 28 y 36 kD. La fracción NBNB
agrupada fue purificada de nuevo por cromatografía hidrofóbica en
Phenyl Superose. La fracción NBNB fue equilibrada con un tampón de
fosfato 0,03M Na, pH 7,0, que contenía (NH_{4})_{2}
SO_{4} 1,2 M y aplicada a una columna. Las proteínas adsorbidas
fueron eluídas en un gradiente de (NH_{4})_{2} SO_{4}
1,2-0,6 M. De esta manera, se obtuvo una xilanasa
homogénea con un PM 30 y 51 kD y pl 9.1 y 8.7, respectivamente, así
como una proteasa de 30 kD con
pl 8,9.
pl 8,9.
Las xilanasas no tuvieron actividad MUF celobiasa
y por lo tanto son xilanasas reales. La xilanasa alcalina de 30 kD
(pl 9.1) tuvo una alta actividad dentro de un margen muy amplio de
pH de 5-8 manteniendo un 65% de su actividad máxima
con un pH 9-10; es un elemento de la familia de
xilanasas F; su nucleótido parcial y sus secuencias de aminoácidos
están ilustradas en SEC ID Nº 5. La secuencia de aminoácidos
parcial ilustrada se corresponde aproximadamente con los
aminoácidos 50-170 del terminal N de la proteína
madura. Las xilanasas según la invención tienen al menos un 60%,
preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%
de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos parcial
de SEC ID Nº 5. El promotor de xilanasa correspondiente, que
constituye una forma de realización preferida de la invención,
puede ser identificado usando la secuencia de nucleótidos parcial
de SEC ID Nº 5. La xilanasa de 51 kD (pl 8,7) tuvo una actividad
máxima con un pH 6, mantuvo al menos un 70% de su actividad con un
pH 7,5 y mantuvo al menos un 50% de su actividad con un pH 8,0. No
fue muy estable con sólo un 15% de actividad con un pH 5,5 y un 4%
con un pH 7,5. La constante de Michaelis hacia xilano de abedul fue
de 4,2 g/l para la xilanasa de 30kD y 3,4 g/l para la xilanasa de
51 kD. La temperatura óptima fue alta, de 70ºC para ambas
xilanasas.
La actividad de la proteasa de 30 kD, medida
respecto a las proteínas de la fracción NBNB, resultaron ser igual
a 0,4 x 10^{-3} unidades/ml a 50ºC y con un pH 7, 90 kD. La
fracción exhibió actividad hacia la caseína teñida de 0,4 unidades
arbitrarias/mg (pH 7). La adición de urea como agente caotrópico
ocasionó un aumento de la actividad proteasa 2-3
veces superior. El efecto de la proteasa en la actividad xilanasa
fue significativo. Sólo un 30% de la actividad xilanasa se mantuvo
con un pH 10,3 y a 50ºC después de 30 minutos de incubación. Con un
pH 8, se mantuvo el 95% de la actividad xilanasa. La adición de LAS
ocasionó una reducción espectacular de la actividad xilanasa con un
pH 8 y 10,3, con sólo un 50% de actividad xilanasa después de 10
minutos de incubación con o sin inhibidor de proteasa PMSF. La
proteasa de 30 kD fue alcalina con un pH óptimo de pH
10-11. La actividad es inhibida por fluoruro de
fenilmetilsulfonilo (PMSF) y no por ácido iodoacético, pepstatina A
y EDTA, lo que la caracteriza como una proteasa de tipo serina. La
proteasa no es activa hacia las proteínas de C1 con un pH neutro y a
50ºC sin agentes caotrópicos. El aumento del pH y la adición de
agentes caotrópicos como LAS, SDS y urea aumentan
significativamente la
proteólisis.
proteólisis.
La fracción 39-41 fue purificada
por cromatografía hidrofóbica en Phenol Superose. Las fracciones
fueron equilibradas con un tampón de fosfato Na 0,03M, pH 7,2 que
contenía (NH_{4})_{2} SO_{4} .1,5 M, y aplicadas sobre
una columna. Las proteínas adsorbidas fueron eluídas en un
gradiente de (NH_{4})_{2} SO_{4}
1,5-0 M. De esta manera se obtuvo la xilanasa
homogénea con un PM 60 kD y pl 4,7. Esta xilanasa tuvo actividades
hacia xilano, MUF-celobiósido,
MUF-xilósido y MUF-lactósido. Esta
xilanasa probablemente pertenece a la familia 10 (familia F). Esta
xilanasa fue estable con un pH de 5 a 8 durante 24 horas y mantuvo
más del 80% de actividad a 50ºC. Mantuvo un 70% de actividad con un
pH 5-7 a 60ºC. Mantuvo un 80% de actividad durante 5
horas, y un 35% durante 24 horas, a 50ºC y con un pH 9. Con un pH
10 mantuvo un 60% de actividad a 50ºC y tras 0,5 horas de
incubación. Después de 5 horas de incubación con un pH 8 y a 60ºC
se observó que la actividad decrecía un 45% hasta 0 después de 24
horas. Tuvo un pH óptimo dentro del margen de pH de
6-7 y mantuvo un 70% de actividad con un pH 9 y un
50% de su actividad con un pH 9,5. La constante de Michaelis hacia
xilano de abedul fue de 0,5 g/l. La temperatura óptima fue alta, e
igual a
80ºC.
80ºC.
La fracción 44-48 fue luego
purificada mediante cromatoenfoque en Mono P. A, se usó un
gradiente de pH de 7,63-5,96 para la elución de las
proteínas. Como resultado, la endoglucanasa de 45 kD fue aislada con
un pl 6. La endo de 45 kD tuvo una actividad máxima hacia CMC con
un pH 5 y hacia RBB-CMC con un pH
5-7. La endo de 45 kD mantuvo un 70% de su actividad
máxima hacia CMC con un pH 6,5 y mantuvo un 70% de su actividad
máxima hacia RBB-CMC con un pH 7,0; mantuvo un 50%
de su actividad máxima hacia CMC con un pH 7 y mantuvo un 50% de su
actividad máxima hacia RBB-CMC con un pH 8. La
constante de Michaelis hacia CMC fue de 4,8 g/l. La temperatura
óptima fue alta, e igual a 80ºC. Otras proteínas 28, 33, 36, 55, 60
y 66 kD fueron eluídas mezcladas
juntas.
juntas.
La fracción 52-58 fue purificada
por cromatoenfoque en Mono P también con un gradiente de pH
7,6-4,5. Se obtuvo una endoglucanasa individual de
55 kD con pl 4,9. La endo 55 kD fue neutra. Tuvo un pH óptimo de
4,5-6 y mantuvo 70% de su actividad con un pH 7,0
tanto para CMC como para RBB-CMC y mantuvo un 50% de
su actividad con un pH 8 tanto para CMC como para
RBB-CMC. La constante de Michaelis hacia CMC fue de
1 g/l. La temperatura óptima fue alta, e igual a 80ºC. Varias
fracciones también retuvieron proteínas con PM de 28,33 y 36
kD.
Se aislaron proteínas de 45, 48 y 100 kD de la
fracción enlazada DEAE Toiopearl de F 60-8 UF conc.
del cultivo de Chrysosporium de las fracciones
50-53 usando cromatografía Macro Prep Q.
La fracción 50-53 fue equilibrada
con un tampón de Imidazol HCl 0.03 M, pH 5.75, y fue aplicada sobre
una columna, las proteínas adsorbidas fueron eluidas en un
gradiente de naCl 0,1-0,25 M durante 4 h. Como
resultado se aislaron proteínas de 45 kD (pl 4.2), 48 kD (pl 4.4) y
100 kD (pl 4.5) en estado homogéneo (figura 17).
La de 45 kD es supuestamente un alfa
beta-galactosidasa en virtud de su actividad hacia
p-nitrofenilo alfa-galactosida y
p-nitrofenilo beta-galactosida. El
pH óptimo fue de 4,5, mantuvo un 70% de actividad con un pH 5,7 y
mantuvo un 50% de su actividad con un pH 6,8. La temperatura óptima
fue de 60ºC (figura 18).
La proteína de 48 kD fue una celobiohidrolasa con
una alta actividad hacia p-nitrofenilo
beta-glucósido y también actividades hacia MUF
cellobioside, MUF lactósido y butirato de
p-nitrofenilo. La proteína de 48 kD tiene un pH
óptimo de 5 hacia CMC y de 5-6 hacia
RBB-CMC (figura 19).
La proteína de 100 kD con pl 4,5 tuvo actividad
sólo hacia butirato de p-nitrofenilo. Es
probablemente una esterasa, pero no una feruloil esterasa, ya que
no tiene actividad contra éster metílico del ácido ferúlico. Tiene
un pH neutro/alcalino óptimo (pH 8-9) y una
temperatura óptima de 55-60ºC (figura 20, 21).
La proteasa de 90 kD con pl 4,2 fue aislada de la
fracción enlazada, y la actividad medida hacia las proteínas de la
fracción NBNB resultaron ser iguales a 12 x 10^{-3} unidades/ml a
50ºC y con un pH 7, 90 kD. La fracción exhibió una actividad hacia
caseína teñida de 0,01 unidades arbitrarias/mg (pH 7). La adición
de urea como agente caotrópico ocasionó un aumento de
2-3 veces de la actividad proteasa, al igual que lo
hizo la adición de LAS tanto con pH 7 como pH 9 (50ºC). La proteasa
de 90 kD fue neutra con un pH óptimo de pH 8. La actividad es
inhibida por fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y no por ácido
iodoacético, pepstatina A y EDTA, lo que la caracteriza como una
proteasa de tipo serina.
También se aisló de la fracción enlazada una
endoglucanasa de 43 kD con pl 4.2 (fracción 33-37)
y una endoglucanasa de 25 kD con pl 4.1 (fracción
39-43), una celobiohidrolasa de 55 kD con pl 4.9
(fracción 39-43) y una poligalacturanasa de 65 kD
con pl 4.4 (fracción 39-43). Las endoglucanasas no
tuvieron actividad hacia avicel o MUF cellobioside y tuvieron una
alta actividad hacia MC, RBB-CMC, CMC41,
beta-glucano y endoglucanasa. La endo de 25 kD no
produjo glucosa de CMC y la endo de 43 kD sí lo hizo. No se formó
glucosa a partir de avicel. El pH óptimo para la proteína de 43 kD
fue de 4,5, manteniendo un 70% de actividad máxima con un pH 7.2 y
un 50% con un pH 8. La endo de 43 kD mantuvo un 70% de actividad
con un pH 5 y 6 durante 25 horas de incubación. Sólo mantuvo un 10%
con un pH 7 durante este periodo de incubación. La endo de 25 kD
tuvo un pH óptimo de actividad en pH 5 hacia CMC y un pH óptimo
amplio de actividad hacia RBB-CMC, manteniendo un
70% de la actividad máxima con un pH 9 y un 50% de la actividad
máxima con un pH 10. Tuvo un 100% de actividad con un pH 5 y 6 y un
80% con un pH 7, 8, 8.6 y 9.6 durante 120 horas de incubación. La
endo de 25 kD tuvo una temperatura óptima de actividad a 70ºC. La
endo de 43 kD tuvo una temperatura óptima de actividad a 60ºC. La
constante de Michaelis hacia CMC fue de 62 y 12,7 g/l para endo 25 y
43 kD respectivamente. La poligalacturonasa es una pectinasa. La
constante de Michaelis hacia PGA
fue de 3.8 g/l. El pH óptimo de la actividad PGU está dentro de la gama de pH 5-7 y la T óptima dentro de
50-65ºC.
fue de 3.8 g/l. El pH óptimo de la actividad PGU está dentro de la gama de pH 5-7 y la T óptima dentro de
50-65ºC.
Los genes que codifican proteínas de C.
lucknowense fueron obtenidos usando PCR y caracterizados por un
análisis de secuencias. Los genes completos correspondientes fueron
obtenidos mediante selección (parcial) de bibliotecas de genes
usando los fragmentos de PCR aislados. El gen completo de la
endoglucanasa 43 kD (EG6, familia 6) de la cepa C1 fue clonado,
secuenciado y analizado (incluyendo la región del promotor 2.5 kb y
la región del terminador 0.5 kb). Su nucleótido y secuencias de
aminoácidos están ilustradas en SEC ID Nº 1. El peso molecular
previsto para la proteína madura es de 39,427 Da y el pl previsto
es de 4.53, valores los cuales se corresponden bien con los valores
medidos. El análisis del alineamiento de las proteínas con otras
glicosil hidrolasas de la familia 6.2 muestra que
C1-EG6 no incluye un dominio de enlace de celulosa
(CBD). El análisis de homología usando el SwissProt Software de
SAMBA (algoritmo Smith & Waterman, penalización GAP 12/2,
alineamiento 10, matriz Blosum62) muestra que
C1-EG6 tiene un 51.6% de identidad con Fusarium
oxysporum EG-B (más de 376 aminoácidos), un
51.0% de identidad con Agaricus bisporus CBH3 (más de 353
aminoácidos), y un 50.7% de identidad con Trichoderma reesei
CBH2 (más de 367 aminoácidos). La secuencia señal putativa se
desarrolla como Met 1 a Arg 28. El promotor contiene diferentes
sitios de enlace creA potenciales, por lo que es muy posible que
este promotor esté sujeto a represión de glucosa en una cepa
micótica con la regulación creA en funcio-
namiento.
namiento.
De forma similar, se clonó, secuenció y analizó
el gen completo de la endoglucanasa de 25 kD (EG5, familia 45) de
la cepa C1 (incluyendo la región promotora 33 kb y la región
terminadora 0.7 kb). El nucleótido y las secuencias de aminoácidos
están ilustradas en la SEC ID Nº 2. El peso molecular previsto de
la proteína madura es de 21,858 Da y el pl previsto es 4.66,
valores que se corresponden bien con los valores medidos. Esta es la
endoglucanasa micótica más pequeña conocida hasta la fecha. El
análisis del alineamiento de las proteínas con otras glicosil
hidrolasas de la familia 45 muestra que C1-EG5 no
incluye un dominio de enlace de celulosa (CBD), ni un dominio de
cohesión/anclaje. El análisis de homología usando un software
NCBI-BLASTP2 (penalización GAP 11/1, alineamiento
10, matriz Blosum62) muestra que la proteína homóloga más próxima a
C1-EG5 es Fusarium oxysporum
EG-K con un 63% de identidad. La secuencia señal
putativa se desarrolla como Met 1 a Ala 18. El promotor contiene
muchos sitios de unión creA potenciales, por lo que es muy posible
que este promotor esté sujeto a represión de glucosa en una cepa
micótica con la regulación creA en funcionamiento.
Además, se encontró otra endoglucanasa por PCR
basándose en el análisis de homología de celulasas de la familia
12. El nucleótido parcial y la secuencia de aminoácidos de esta
otra endoglucanasa (EG3, familia 12) se da en la SEC ID Nº 3.
La proteína de 55kD fue una celobiohidrolasa
(denominada aquí como CBH1) con actividad contra
MUF-celobiósido, MUF lactósido, FP y avicel, también
contra p-nitrofenilo
\beta-glucósido, celobiosa y
p-nitrofenilo lactósido. Su actividad hacia MUF
celobiósido es inhibida por celobiosa. La constante de inhibición
fue determinada en 0,4 mM. La constante de Michaelis hacia MUF MUF
celobiósido fue de 0,14 mM, hacia MUF lactósido fue de 4 mM y hacia
CMC fue de 3,6 g/l. El pH óptimo es más bien amplio de 4,5 a 7. Se
mantuvo un 50% de la actividad máxima hacia CMC y un 80% de la
actividad hacia RBB-CMC con un pH 8. Se mantuvo un
70-80% de la actividad con un pH 5-8
durante 25 horas de incubación. La temperatura óptima es de
60-70ºC. La CBH1 es probablemente un elemento de la
familia 7 de las celobiohidrolasas; su nucleótido parcial y
secuencias de aminoácidos están ilustradas en SEC ID Nº 4. La
secuencia de aminoácidos parcial ilustrada se corresponde
aproximadamente con los aminoácidos 300-450 del
terminal N de la proteína madura. Una celobiohidrolasa según la
invención tiene al menos un 64%, preferiblemente al menos un 70%,
más preferiblemente al menos un 80% de identidad de secuencia con
la secuencia de aminoácidos parcial de la SEC ID Nº 4. El promotor
CBH correspondiente, que es una forma de realización preferida de
la invención, puede ser identificado usando la secuencia de
nucleótidos parcial SEC ID Nº 4. Un efecto sinérgico fue observado
entre endo 25 kD y CBH 55 kD durante la hidrólisis de avicel. El
coeficiente de sinergia fue máximo con la proporción 80:20 de endo
25 kD respecto a CBH 55 kD. El K_{Syn} máximo fue 1,3.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
El nivel de expresión de los cinco genes
principales de Chrysosporium fue estudiado mediante el
análisis Northern. Varias cepas de C. lucknowense fueron
desarrolladas en un medio rico que contenía pharmedia con
celulosa y lactosa (medio 1) o un medio rico que contenía
pharmedia y glucosa (medio 2) a 33ºC. Después de 48 h, se
recogió el micelio y el ARN fue aislado. El ARN fue hibridado con 5
sondas diferentes: EG5, EG6, EG3, XylF y CBH. Después de la
exposición, las manchas Northern fueron eliminadas e hibridadas de
nuevo con una sonda para L3 ribosomal como un control para la
cantidad de ARNm en la mancha. Muchas cepas mostraron una respuesta
altísima para CBH y una alta respuesta para XylF en el medio 1; en
el medio 2, la mitad de las cepas mostraron una alta respuesta para
todos los genes, y la otra mitad mostró una respuesta baja. El
orden de la fuerza de expresión se ha deducida a partir de estos
datos: CBH > XylF > EG5 > EG3 > EG6.
Las tablas A, B y J ilustran los detalles
anteriores.
\newpage
Figura 1 es una transferencia Western como se
describe en los Ejemplos
Figura 2 es un mapa pUT720
Figura 3 es un mapa pUT970G
Figura 4 es un mapa pUT1064
Figura 5 es un mapa pUT1065
Figura 6 es un mapa pF6g
Figura 7 es un mapa pUT1150
Figura 8 es un mapa pUT1152
Figura 9 es un mapa pUT1155
Figura 10 es un mapa pUT1160
Figura 11 es un mapa pUT1162
Figura 12: Cromatografía de intercambio iónico en
Macro Prep Q de la fracción NB después de
DEAE-Toyopearl de la muestra
F-60-31 CF.
Figura 13: Dependencia al pH de la actividad
enzimática de las fracciones NB de la muestra
F-60-31 CF.
Figura 14: Estabilidad de las enzimas de la
facción NB de la muestra F-60-31 CF
con un pH 5.5 y 7.5 (60ºC).
Figura 15: Estabilidad del pH a 60ºC y a 50ºC de
Xyl 60 kD (pl 4.7) de la fracción NB de la muestra
F-60-31.
Figura 16: Dependencia a la temperatura de las
enzimas de la fracción NB de la muestra
F-60-31.
Figura 17: Cromatografía de intercambio iónico en
Macro Prep Q de las fracciones enlazadas 50-53
después de DEAE-Toyopearl de la muestra
F-60-8.
Figura 18: Dependencia al pH y a la temperatura
de la actividad \alpha-galactosidasa de
F-60-43, UF - conc.
Figura 19: Dependencia al pH de la actividad de
CBH 48 kD (pl 4.4) de las fracciones enlazadas de
F-60-8, UF-conc.
Figura 20: Dependencia a la temperatura de la
actividad hacia p-nitrofenilo butirato de
F-60-8, UF - conc.
Figura 21: Dependencia al pH de la actividad
hacia p-nitrofenilo butirato de
F-60-8, UF - conc.
Figura 22: recorrido del pH respecto a la
actividad de las proteasas 30kD (pl 8.9) y 90 kD (pl 4.2) hacia las
proteínas C1 (50ºC, 30 min. incubación).
Figura 23: Efecto de la proteasa 30 kD (pi 8.9)
"alcalina" en la actividad xilanasa de la fracción NBNB (Macro
Prep Q) de F 60 31 CF a 50º.
Figura 24: Efecto de la proteasa 90 kD (pl 4.2)
"neutra" en la actividad CMCasa de las proteínas en la fracción
enlazada #44-45 (DEAE-Toyopearl) de
la muestra F 60-8 UV- conc. a 50ºC.
Figura 25: Hidrólisis completa del ácido
poligalacturónico por la poligalacturonasa 65 kD (pl 4.4): 50ºC, pH
4.5; concentración pf PGA=5 g/l, concentración de proteínas = 0.1
g/l.
Figura 26: Dependencia al pH y a la temperatura
de la actividad poligalacturonasa de
F-60-43,
UF-conc.
Figura 27: Inhibición de la actividad hacia
MUF-celobiósido por celobiosa para CBH 55 kD (pl
4.4): pH 4.5, 40ºC.
Figura 28: Efecto sinérgico entre endo 25 kD (pl
4.1) y CBH 55 kD (pl 4.4) hacia avicel (40ºC, pH 5, 25
minutos).
Figura 29: Hidrólisis completa de CMC (A) y
avicel (B) por las enzimas aisladas de las fracciones enlazadas de
la muestra F-60-8, UF conc. (50ºC,
pH 5): concentración de CMC y avicel - 5 g/l, concentración de endo
25 kD = 0.01 g/l, concentración de endo 43 kD = 0.02 g/l; endo
1-25 kD (pl 4.1), endo 2-43 kD (pl
4.2).
Figura 30: Hidrólisis completa de CMC (1) y
avicel (2) por CBH 55 kD (pl 4.4) sin (a) y con (b)
glucono-\delta-lactona (50ºC, pH
4.5): concentración de CMC y avicel = 5 g/l, concentración de
proteína = 0.1 g/l, concentración de
glucono-\delta-lactona = 5
g/l.
Figura 31: Dependencia al pH de las actividades
CMCasa y RBB-CMCasa de las enzimas aisladas de la
muestra F-60-8 UF- conc. Endo
1-25 kD (pl 4.1), endo 2-43 kD (pl
4.2).
Figura 32: Dependencia al pH de las actividades
CMCasa y RBB-CMCasa de CBH 55 kD (pl 4.4).
Figura 33: Dependencia a la temperatura de la
actividad CMCasa (pH 4.5) de las enzimas aisladas de fracciones
enlazadas de la muestra F-60-8
UF-conc. CBH 1-55 kD (pl 4.4), endo
2-25 kD (pl 4.1), endo 3-43 kD (pl
4.2).
Figura 34: Estabilidad del pH (50ºC) de las
enzimas aisladas de fracciones enlazadas de la muestra
F-60-8 UF- conc. CBH
1-55 kD (pl 4.4), endo 2-25 kD (pl
4.1), endo 3-43 kD (pl 4.2).
Figura 35: Adsorción de las enzimas aisladas de
fracciones enlazadas de la muestra
F-60-8 UF- conc.
(El contenido de las cuales está
incorporado en la
presente)
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Secuencias de Chrysosporium
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID
Nº1:
\vskip1.000000\baselineskip
C1-EG6 "43kD"
(Familia 6) fue obtenida por PCR basándose en la secuenciación de
la proteína "Endo 43kD" y análisis de homología de las
celulasas de la familia
6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº
2:
\vskip1.000000\baselineskip
Gen C1-EG5
"25kD" (Familia 45) obtenido por PCR basándose en la
secuenciación de la proteína "Endo 25kD" y en el análisis de
homología de la familia
45.
SEC ID Nº
3:
\vskip1.000000\baselineskip
Fragmento del gen
C1-EG3 (Familia 12) obtenido por PCR basándose en el
análisis de homología de celulasas de la familia
12.
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº
4:
\vskip1.000000\baselineskip
Celobiohidrolasa de
Chrysosporium
CBH1
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID
Nº5:
\vskip1.000000\baselineskip
Xilanasa de Chrysosporium F
Claims (28)
1. Cepa de Chrysosporium recombinante
obtenida por métodos de transformación, dicha cepa comprendiendo
una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de
interés, dicha secuencia de ácido nucleico estando operativamente
unida a una región reguladora de la expresión y opcionalmente a una
secuencia señal de secreción, dicha cepa recombinante expresando
dicho polipéptido de interés en un nivel más alto que la cepa no
recombinante correspondiente en las mismas condiciones, y dicha
secuencia de ácido nucleico siendo introducida de forma estable en
dicha cepa de Chrysosporium mediante dichos métodos de
transformación.
2. Cepa de Chrysosporium recombinante
según la reivindicación 1, dicha cepa recombinante siendo obtenida
por métodos de transformación que comprenden la introducción
estable de al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga
seleccionada de secuencias de ácido nucleico heterólogas que
codifican polipéptidos, secuencias señal heterólogas y secuencias
de regulación de la expresión heterólogas.
3. Cepa de Chrysosporium recombinante
según la reivindicación 2, donde dicho polipéptido de interés es un
polipéptido heterólogo de origen vegetal, animal (incluyendo
humano), algal, bacteriano, arqueobacteriano, viral o micótico.
4. Cepa de Chrysosporium recombinante
según la reivindicación 1 o 2, donde dicho polipéptido de interés
es un polipéptido homólogo que es expresado en un nivel más alto
que en la cepa no recombinante correspondiente en las mismas
condiciones.
5. Cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde
dicho polipéptido de interés está seleccionado de enzimas que
degradan carbohidratos, proteasas, lipasas, esterasas, otras
hidrolasas, oxidorreductasas y transferasas.
6. Cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde
dicho polipéptido de interés está seleccionado de enzimas micóticas
que permiten la (sobre)producción de metabolitos primarios,
ácidos orgánicos, metabolitos secundarios, y antibióticos.
7. Cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde
dicho polipéptido de interés exhibe una actividad y/o estabilidad
óptima con un pH por encima de 6, y/o mantiene más de un 50% de su
actividad y/o estabilidad con un pH superior a 6.
8. Cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que
comprende una secuencia señal heteróloga u homóloga.
9. Cepa de Chrysosporium recombinante
según la reivindicación 8, que comprende una secuencia señal
micótica, p. ej. de ascomiceto.
10. Cepa de Chrysosporium recombinante
según la reivindicación 9, donde la secuencia señal micótica es una
secuencia señal de celulasa, \beta-galactosidasa,
xilanasa, pectinasa, esterasa, proteasa, amilasa, poligalacturonasa
o hidrofobina.
11. Cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además
comprende un marcador seleccionable, por ejemplo un marcador que
confiere resistencia a un medicamento o alivia un defecto
nutriticional.
12. Cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende
una región reguladora de la expresión heteróloga u homóloga,
preferiblemente una secuencia de regulación de la expresión
micótica.
13. Cepa de Chrysosporium recombinante
según la reivindicación 12, donde la región reguladora de la
expresión comprende un promotor inducible o constitutivo.
14. Cepa de Chrysosporium recombinante
según la reivindicación 12 o 13, donde la región reguladora de la
expresión comprende un promotor micótico de celobiohidrolasa,
gluco-amilasa, gliceraldehído fosfato
dehidrogenasa, alcohol dehidrogenasa A, alcohol dehidrogenasa R,
fosfoglicerato, proteinasa aspártica, lipasa,
beta-galactosidasa, hidrofobina, proteasa, amilasa,
xilanasa, pectinasa, esterasa, endoglucanasa o
poligalacturonasa.
15. Cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha
cepa recombinante es obtenida por transformación de una cepa
mutante, dicha cepa mutante siendo obtenida mediante fases de
mutagénesis, que incluyen al menos una fase de irradiación UV y
mutagénesis química, preferiblemente comprende una primera fase de
irradiación UV, una fase de tratamiento con
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
y una segunda fase de irradiación UV.
\newpage
16. Cepa de Chrysosporium recombinante
según la reivindicación 15, donde dicha cepa mutante se deriva de
Chrysosporium lucknowense, especialmente de la cepa C.
lucknowense C1 (VKM F-3500 D).
17. Cepa de Chrysosporium recombinante
según la reivindicación 15 o 16, donde dicho mutante corresponde o
es derivado de una de las cepas mutantes UV13-6
(VKM F-3632 D), NG7C-19 (VKM
F-3633 D), y UV18-25 (VKM
F-3631 D).
18. Cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones 15-17,
dicha cepa exhibiendo una biomasa inferior a la mitad de la de
Trichoderma reesei, dicho cultivo de Trichoderma
exhibiendo una viscosidad de 200-600 cP al ser
cultivado en condiciones equivalentes.
19. Cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones 15-18,
dicha cepa produciendo al menos la misma cantidad de celulasa en
moles por litro que la producida por cualquiera de las cepas
mutantes C1 (VKM F-3500 D), UV13-6
(VKM F- 3632 D), NG7C-19 (VKM
F-3633 D), y UV18-25 (VKM
F-3631 D).
20. Cepa de Chrysosporium recombinante
según cualquiera de las reivindicaciones 15-19,
dicha cepa produciendo al menos la misma cantidad de proteasa que
la producida por la cepa de Chrysosporium lucknowense C1
(VKM F-3500 d), preferiblemente menos de la mitad de
la cantidad producida por dicha cepa C1.
21. Cepa recombinante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la región reguladora de la
expresión se deriva de una cepa de Chrysosporium.
22. Cepa recombinante según la reivindicación 21,
donde dicha región reguladora de la expresión se deriva de una cepa
de Chrysosporium mutante obtenida por mutagénesis in
vitro, y comprende una secuencia promotora asociada a la
expresión de celulasa o a la expresión de xilanasa, preferiblemente
una secuencia promotora de celobiohidrolasa (CBH1).
23. Método para producir un polipéptido de
interés, dicho método comprendiendo el cultivo de una cepa de
Chrysosporium recombinante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en condiciones que permiten la
expresión y preferiblemente la secreción de la proteína o
polipéptido, y la recuperación del polipéptido de interés
posteriormente producido.
24. Método según la reivindicación 23, que además
comprende una fase de disociación de un precursor de dicho
polipéptido en el polipéptido o precursor de interés,
preferiblemente una disociación con una proteasa de tipo
Kex-2, cualquier proteasa pareada con un aminoácido
básico, o Kex-2.
25. Método según la reivindicación 23 o 24, donde
el cultivo se realiza con un pH en la gama 6-9, y/o
a una temperatura entre 25 y 43ºC.
26. Método para producir una cepa de
Chrysosporium recombinante según cualquiera de las
reivindicaciones 1-22, que comprende la introducción
estable de una secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido homólogo u heterólogo en una cepa de
Chrysosporium, dicha secuencia de ácido nucleico estando
operativamente unida a una región reguladora de la expresión, dicha
introducción siendo realizada de una forma conocida per se
para la transformación de hongos filamentosos.
27. Método según la reivindicación 26, donde el
método de transformación es el método de transformación de los
protoplastos.
28. Cepa recombinante según la reivindicación 4,
donde dicho polipéptido de interés es una xilanasa de
Chrysosporium de la familia F de las xilanasas, con un pl de
9,1, un PM de aproximadamente 30 kD según SDS PAGE, y que tiene al
menos un 75% de identidad de los aminoácidos, en un extensión de 120
aminoácidos, con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID
Nº 5.
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