ES2237752T3 - Regulacion del crecimiento de las plantas. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE AL CLONAMIENTO MOLECULAR Y EXPRESION DE UN GEN DE GUIBERRILINA (GA) 20-OXIDASA Y SU USO, POR EJEMPLO EN PLANTAS TRANSGENICAS. ASPECTOS DE LA INVENCION INCLUYEN DNA RECOMBINANTE QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO QUE EXHIBE UNA ACTIVIDAD 20-OXIDASA GA, UN POLIPEPTIDO RECOMBINANTE QUE EXHIBE UNA ACTIVIDAD 20-OXIDASA GA, Y PLANTAS TRANSGENICAS QUE EXPRESAN UN GEN 20-OXIDASA GA O SECUENCIAS 20-OXIDASA GA REVERSAS.

Description

Regulación del crecimiento de las plantas.

Esta invención se refiere a la regulación del crecimiento de las plantas y más en particular a la clonación molecular y expresión de un gen de giberelina-20-oxidasa y al uso del mismo, por ejemplo en plantas transgénicas.

Los compuestos químicos para el control del crecimiento de las plantas son productos comerciales desde hace muchos años. Muchos de tales compuestos actúan inhibiendo diversas etapas de la biosíntesis de las giberelinas (GA). Las GA constituyen un amplio grupo de productos diterpenoides naturales, algunos representantes de los cuales actúan en las plantas como hormonas, controlando muchos aspectos del desarrollo, incluido por ejemplo el alargamiento de los brotes. Entre los grupos de compuestos que inhiben la biosíntesis de las GA en las plantas superiores están los compuestos de amonio y fosfonio cuaternarios, los compuestos con un heterociclo que contiene nitrógeno y las acilciclohexanodionas. Sin embargo, el uso de tales compuestos químicos conlleva diversos problemas. Por ejemplo, es difícil aplicar los compuestos químicos a las plantas en cantidades adecuadas o seleccionar los órganos de las plantas sin que los compuestos químicos alcancen también otras plantas u organismos animales. Existe el riesgo de persistencia, que supone un obstáculo para el crecimiento de otros cultivos después de realizar el tratamiento de los cultivos deseados. Por consiguiente, un problema abordado por la presente invención consiste en evitar el uso de tales compuestos químicos. Este problema puede resolverse dentro de esta solicitud mediante la aportación de medios para el control del crecimiento de las plantas a nivel genético de dichas plantas.

Las últimas etapas de la vía de biosíntesis de las GA están catalizadas por dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato, diversas de ellas se han propuesto como enzimas reguladoras de la biosíntesis del compuesto C_{19} que es fisiológicamente importante y se llama GA_{1}. Por ejemplo, la actividad de la GA-20-oxidasa se prolonga durante muchos días en ciertas plantas sensibles al fotoperíodo y se regula en sentido decreciente como consecuencia de la acción de la GA_{1} en diversas especies.

Según la invención se proporciona una secuencia de DNA que codifica un polipéptido que presenta actividad de GA-20-oxidasa. Esta invención es el primer ejemplo de la clonación molecular de una dioxigenasa de GA:2-oxoglutarato. La enzima GA-20-oxidasa se conoce también como una 20-hidroxilasa o una C-20-oxidasa, ya que cataliza reacciones de oxidación en el átomo de carbono C-20 de la estructura de la GA. Es una dioxigenasa, porque se oxida simultáneamente el oxoglutarato.

Tal como se demuestra en los ejemplos, la secuencia de DNA de la presente invención codifica la GA-20-oxidasa capaz de actuar en uno o en varios de los sustratos siguientes: GA_{12}, GA_{53}, GA_{15} (lactona abierta o cerrada), GA_{44} (lactona abierta o cerrada), GA_{24}, GA_{19} y GA_{23}, entre otros.

La presente invención se refiere, pues, a una secuencia de DNA que codifica un polipéptido que despliega actividad de GA-20-oxidasa, dicho polipéptido que despliega actividad de GA-20-oxidasa es capaz de actuar en uno o varios de los sustratos siguientes: GA_{12}, GA_{53}, GA_{15} (lactona abierta o cerrada), GA_{44} (lactona abierta o cerrada), GA_{24}, GA_{19} y GA_{23}.

La secuencia de DNA de la invención puede codificar en principio una GA-20-oxidasa de cualquier planta, pero con preferencia de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas y con mayor preferencia de plantas dicotiledóneas. Una fuente especialmente idónea son las plantas de la familia cucurbitáceas, por ejemplo la Cucurbita maxima (= calabaza amarilla), de la cual las semillas inmaduras son una fuente adecuada. Otra fuente idónea es la formada por plantas de la familia crucíferas, por ejemplo la Arabidopsis thaliana (= oruga, berro de pared), cuyo material de brotes es una fuente conveniente.

Una forma preferida de ejecución de la invención es, por tanto, una secuencia de DNA que codifica una GA-20-oxidasa de plantas, con preferencia de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, con mayor preferencia de plantas dicotiledóneas y con preferencia especial de plantas de la familia cucurbitáceas y crucíferas, respectivamente, por ejemplo la C. maxima y la Arabidopsis thaliana, o una proteína que tenga una homología sustancial con las anteriores.

Tal como se emplea en la presente edición, la homología sustancial de secuencias significa que existe una relación estructural estrecha entre las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, las secuencias de DNA sustancialmente homólogas pueden ser homólogas en un 60%, con preferencia en un 80% y con preferencia especial homólogas en un 90% o en un 95% o más, y las secuencias de aminoácidos sustancialmente homólogas pueden ser homólogas con preferencia en un 35%, con mayor preferencia en un 50% y con preferencia especial en más del 50%. La homología incluye además una relación en la que están ausente una o varias subsecuencias de nucleótidos o de aminoácidos o bien en la que están interdispersadas subsecuencias con nucleótidos o aminoácidos adicionales.

El término "homología", utilizado en esta descripción, abarca no solamente la homología estructural, sino también la homología funcional.

La invención se refiere, pues, a una secuencia de DNA que codifica la GA-20-oxidasa de la Cucurbita maxima o de la Arabidopsis thaliana o una proteína que tenga por lo menos una homología del 35%, con preferencia por lo menos del 50% y con preferencia especial por lo menos superior al 50% con las anteriores.

La invención se refiere más específicamente a un DNA que tiene una secuencia que corresponde al marco abierto de lectura de la secuencia indicada en la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 5 o una secuencia equivalente a lo largo de la degeneración del código genético, incluidos los derivados capaces de hibridarse con la secuencia indicada en la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 5 y que todavía puede codificar a un polipéptido que tenga actividad de GA-20-oxidasa.

Una forma preferida de ejecución es, pues, un DNA indicado en la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 5 o que tenga una homología de secuencia con la secuencia indicada en la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 5.

La secuencia de DNA según esta invención es con preferencia un DNA recombinante que contiene una secuencia de DNA que codifica a un polipéptido recombinante que tenga actividad de GA-20-oxidasa.

En una forma de ejecución de la invención, el DNA recombinante tiene la forma de un clon cDNA.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar un constructo de gen quimérico que contiene una secuencia de DNA que codifica a un polipéptido que posee actividad de GA-20-oxidasa en asociación operativa con señales de expresión de plantas, incluidas las secuencias de promotor y de terminación capaces de provocar la expresión del gen en un polipéptido que tenga actividad de GA-20-oxidasa dentro de una planta, dichas secuencias de promotor son con preferencia las de un promotor inducible o de un promotor preferencia de tejido o de un promotor específico de tejido.

La invención se refiere además a un constructo de gen quimérico que contiene por lo menos una parte de una secuencia de nucleótido de GA-20-oxidasa inversa, en unión operativa con señales de expresión de las plantas, incluidas las secuencias de promotor y de terminación capaces de provocar que la secuencia inversa se exprese en un mRNA antisentido dentro de la planta.

Es también objeto de la invención proporcionar células hospedantes transformadas que contienen DNA recombinante que codifica un polipéptido provisto de actividad de GA-20-oxidasa en unión operativa con señales de expresión que incluyen secuencias de promotor y de terminación que permiten la expresión de dicho DNA en la célula hospedante.

Una forma preferida de ejecución de la invención es una planta transgénica, incluida la semilla y la progenie o propágulos de la misma, que consiste en un constructo genético quimérico integrado de forma preferentemente estable en su genoma, tal como se ha mencionado antes. Es preferida una planta monocotiledónea y una planta dicotiledónea, respectivamente, por ejemplo tabaco, tomate, algodón, girasol, maíz, trigo y Dactylis glomerata (= pasto ovillo).

Es preferida en especial una planta transgénica que sea una planta monocotiledónea, con preferencia una planta de maíz o una planta de trigo.

La invención se refiere además a un polipéptido recombinante de plantas que tengan actividad de GA-20-oxidasa, dicho polipéptido es capaz con preferencia de actuar en uno o varios de los sustratos siguientes: GA_{12}, GA_{53}, GA_{15} (lactona abierta o cerrada), GA_{44} (lactona abierta o cerrada), GA_{24}, GA_{19} y GA_{23}.

Una forma preferida de ejecución de la invención es, pues, un polipéptido recombinante que tenga actividad de GA-20-oxidasa y que sea de plantas, con preferencia de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, respectivamente, con mayor preferencia de plantas dicotiledóneas y con preferencia especial de plantas de la familia cucurbitáceas y crucíferas, respectivamente, por ejemplo Cucurbita maxima y Arabidopsis thaliana, o una proteína que tenga una homología sustancial con las anteriores.

La invención se refiere de modo más específica a un polipéptido recombinante que tenga una secuencia indicada en las SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 6 o una secuencia que sea sustancialmente homóloga con las anteriores.

La invención se refiere además a un método de obtención de una secuencia de DNA que codifique a una GA-20-oxidasa, que consiste en preparar una biblioteca de cDNA de un organismo fuente idóneo y en explorar dicha biblioteca mediante uno de los sistemas de exploración empleados convencionalmente.

La invención se refiere además a un método de obtención de un polipéptido recombinante que tenga actividad de GA-20-oxidasa, que posea una de las secuencias de DNA mencionadas anteriormente.

Otra forma de ejecución de la invención es un método de identificación de secuencias de DNA que consta de una región de DNA que codifica a un polipéptido provisto de actividad de GA-20-oxidasa, dicho método consiste en preparar un cDNA o una biblioteca genómica a partir de un organismo fuente idóneo y en explorar esta biblioteca mediante la hibridación empleando un DNA idóneo como sonda de hibridación.

La presente invención se refiere en primer lugar a una secuencia de DNA que codifica a un polipéptido provisto de actividad de GA-20-oxidasa.

Los ejemplos de secuencia de DNA según la invención son marcos abiertos de lectura de las secuencias indicadas en la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 5 o una secuencia equivalente a través de la degeneración del código genético. La secuencia de DNA según la invención puede ser, pues, una que codifique la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 6. Se da por supuesto que la invención incluye los derivados y mutantes de las secuencias indicadas en la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 5, en el supuesto de que tales derivados codifiquen péptidos esencialmente similares que tienen fundamentalmente la misma función que los péptidos codificados por el gen de la GA-20-oxidasa descrito en esta solicitud. Dichos derivados de la secuencia de DNA según la invención pueden ser variantes o mutantes de origen natural o, en especial, pueden ser variantes y mutantes creados artificialmente que pueden producirse de modo específico o inespecífico por métodos de mutación conocidos.

La mutación debe entenderse tanto en el sentido de deleción o inserción de una o varias bases como de sustitución de una o varias bases, o una combinación de ambas acciones. Tal es el caso en especial cuando dicha sustitución de bases va acompañada por una mutación silenciosa que no provoca una sustitución de aminoácidos y, por ello, no cambia la estructura química del producto de expresión.

Los genes estructurales según la invención que codifican la GA-20-oxidasa pueden constituir una secuencia codificante ininterrumpida o pueden incluir uno o varios intrones, unidos mediante las juntas de empalme apropiadas funcionales a las plantas, que pueden obtenerse de una fuente sintética o natural. El gen estructural según la invención que codifica a la GA-20-oxidasa puede obtenerse además exclusivamente de fuente de origen natural o de fuentes sintéticas. Puede obtenerse por ejemplo de una biblioteca genómica o de una biblioteca de cDNA o construirse en su totalidad por medios sintéticos.

Otra posibilidad consiste en la construcción de una secuencia de DNA híbrido y también de una DNA genómico y/o DNA sintético. En este caso, el cDNA puede originarse a partir del mismo gen que el DNA genómico, o bien el cDNA y el DNA genómico pueden originarse de fuentes genéticas diferentes. En cualquier caso, el DNA genómico y/o el cDNA pueden producirse en cada caso a título individual a partir del mismo gen o de genes diferentes.

Si el gen estructural contiene porciones de más de un gen, estos genes pueden originarse en uno mismo organismo, en diversos organismos que pertenecen a diferentes cepas o variedades de la misma especie o de diferentes especies del mismo género, o en organismos pertenecientes a más de un género de la misma unidad taxonómica o de una unidad taxonómica diferente.

En cualquiera caso, la secuencia de DNA se considera incluida dentro del alcance de la invención si la proteína codificada tiene una actividad de GA-20-oxidasa.

La invención proporciona además un método de obtención de un DNA recombinante que codifica una GA-20-oxidasa. El método puede incluir la obtención de una biblioteca de cDNA a partir de una fuente idónea y la exploración de esta biblioteca mediante un anticuerpo dirigido contra la GA-20-oxidasa o una parte de su secuencia de aminoácidos, o en explorar la biblioteca comprobando la actividad catalítica característica de la GA-20-oxidasa o por cualquier otro método idóneo ya conocido en la técnica. Pueden utilizarse técnicas estándar de la tecnología de DNA recombinante como parte del método, por ejemplo la hibridación empleando sondas de cDNA, la reacción en cadena de polimerasa empleando cebadores degenerados y el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción.

El método de obtención de un DNA recombinante que codifique la GA-20-oxidasa puede incluir la obtención de una biblioteca genómica o una biblioteca de genes de cDNA que puede producirse por métodos rutinarios habituales, muy conocidos por los expertos de este ámbito técnico. Los métodos básicos para producir una biblioteca genómica o una biblioteca genética de cDNA se describen con detalle por ejemplo en Maniatis y col. (1982), mientras que la información relativa a la transferencia y aplicación de estos métodos a los sistemas de plantas pueden encontrarse por ejemplo en la referencia Mohnen (1985) [Mohnen y col., EMBO J. 4, 1631-1635, 1985].

El DNA genómico y el cDNA pueden obtenerse de varias maneras. Por ejemplo, el DNA genómico puede extraerse mediante métodos conocidos a partir de células idóneas y después purificarse.

En una forma específica de ejecución de la presente invención, el material de partida empleado para la producción del cDNA es en general el mRNA, que puede aislarse de células o tejidos seleccionados, pero en especial de células o tejidos de semillas inmaduras de plantas cucurbitáceas, por ejemplo la Cucurbita maxima, que como se sabe son una fuente rica en enzimas biosintéticas GA. Otra fuente idónea de enzimas biosintéticas GA es el tejido de los brotes de las plantas de Arabidopsis thaliana. El mRNA aislado puede utilizarse después en la transcripción inversa como matriz para la producción del cDNA correspondiente.

Los métodos de aislamiento del poli(A^{+})RNA y de producción de cDNA ya son conocidos por los expertos en la materia y se describen con detalle en los ejemplos posteriores.

Las preparaciones de DNA extraído y purificado se descomponen a continuación en fragmentos para la siguiente clonación. El DNA genómico o el cDNA a clonar puede fragmentarse hasta un tamaño idóneo para la inserción en el vector de clonación mediante un corte mecánico o, con preferencia, por rotura o segmentación mediante enzimas de restricción idóneas. Los vectores de clonación adecuados que ya se están utilizando de forma rutinaria para la producción de bibliotecas genómicas y/o de genes de cDNA incluyen, por ejemplo, los vectores fagos, por ejemplo los fagos \lambda Charon, o vectores bacterianos, por ejemplo el plásmido pBR322 de la Escherichia coli. Otros vectores idóneos para la clonación son ya conocidos de los expertos en la materia y pueden obtenerse de proveedores comerciales, por ejemplo los contenidos en el kit de aislamiento de mRNA "Fast Track", suministrado por la empresa INVITROGEN o el kit de clonación \lambdagt11 de la empresa Amersham.

De las bibliotecas genéticas obtenidas de este modo pueden identificarse los clones idóneos, que contienen los genes deseados o partes de los mismos, mediante un programa de exploración, por ejemplo mediante sondas de oligonucleótidos idóneas (molécula sonda) y después aislarse. Para identificar los clones idóneos se dispone de diversos métodos, por ejemplo la hibridación diferencial de colonias y la hibridación en calva. Pueden utilizarse también métodos de detección inmunológica basados en la identificación de los productos específicos de traducción.

Se puede utilizar una molécula sonda, por ejemplo un fragmento de DNA que ya se ha aislado previamente del mismo gen o de un gel estructuralmente afín y que es capaz de hibridarse con la correspondiente sección de secuencia dentro del gen deseado que se quiere identificar.

En el supuesto de que sea conocida la secuencia de aminoácidos del gen a aislar o por lo menos partes de tal secuencia, se podrá escribir la correspondiente secuencia de DNA en base a tal información de secuencia. En base a tal información es posible, por tanto, dibujar las moléculas de los nucleótidos que pueden utilizarse como moléculas sonda para la identificación y el aislamiento de clones idóneos para la hibridación de dichas moléculas sonda con el DNA genómico o con el cDNA en uno de los métodos descritos antes.

Con el fin de facilitar la detección del gen deseado, la molécula sonda de DNA descrita antes puede marcarse con un grupo apropiado y fácilmente detectable. Dentro del alcance de esta invención se entiende por grupo detectable cualquier material que tenga una propiedad física o química especial que pueda identificarse con facilidad.

Dichos materiales se están utilizando ya en gran manera, sobre todo en el ámbito de los inmunoensayos y la mayoría de ellos pueden emplearse también en la presente solicitud. En este momento cabe mencionar en especial los grupos activos desde el punto de vista enzimático, por ejemplo las enzimas, los sustratos de enzimas, las coenzimas y los inhibidores de enzimas y también los agentes fluorescentes y luminiscentes, los cromóforos y los radioisótopos, por ejemplo el H^{3}, el S^{35}, el P^{32}, el I^{125} y el C^{14}. La fácil detectabilidad de estos marcadores se basa por un lado en sus propiedades físicas intrínsecas (p.ej. marcadores fluorescentes, cromóforos, radioisótopos) y por otro lado en sus propiedades de reacción y de fijación (p.ej. enzimas, sustratos, coenzimas, inhibidores).

Como molécula sonda es también idóneo un cDNA de hebra simple, derivado de un poli(A)^{+}RNA, que a su vez se aísla de un tejido o de una célula de los que se sabe que contienen niveles elevados de enzimas biosintéticas GA.

Por ejemplo, la secuencia de cDNA de la presente invención puede utilizarse para aislar secuencias de cDNA genómico o de otro tipo que codifican a la GA-20-oxidasa. Cuando se obtiene un cDNA parcial, el cDNA parcial puede utilizarse como sonda para explorar la biblioteca de cDNA con el fin de aislar un clon de cDNA de longitud completa. Se purifican los clones de hibridación, se mapean por restricción y se determina su secuencia. Un clon de longitud completa tendrá aproximadamente el tamaño de mensaje y tendrá además un marco abierto de lectura completo. Para aislar un clon genómico se emplea el cDNA de longitud completa como sonda para explorar una biblioteca genómica. Mediante el mapeo de restricción y la hibridación con el cDNA se identifica la región codificadora del clon genómico. La región en dirección al extremo 5' (upstream) de la región codificadora del clon es la región promotora.

Los métodos generales relativos a la hibridación se describen, por ejemplo, en Maniatis, T. y col. (1982) y en Haymes, B.T. y col. (1985) [Haymes, B.T. y col., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, editorial IRL Press, Oxford, Inglaterra, 1985].

Los clones dentro de las bibliotecas genéticas recién descritas, que son capaces de hibridación con una molécula sonda y que pueden identificarse mediante uno de los métodos de detección mencionados anteriormente, pueden analizarse después con el fin de determinar con detalle la extensión y la naturaleza de la secuencia codificadora.

Un método alternativo de clonación de genes se basa en la construcción de una biblioteca de genes, compuesta por vectores de expresión. En este método, de modo similar a los métodos ya descritos anteriormente, se aísla en primer lugar el DNA genómico, con preferencia el cDNA, de una célula o de un tejido capaz de expresarse en un producto genético deseado, en el caso que nos ocupa en una GA-20-oxidasa, y después empalmarse en un vector de expresión idóneo. Las bibliotecas genéticas así producidas pueden explorarse posteriormente empleando medidas apropiadas, con preferencia empleando anticuerpos, y seleccionarse aquellos clones que contengan como inserto el gen deseado o por lo menos una parte de dicho gen.

Como alternativa puede obtenerse el DNA total de la biblioteca de DNA, con preferencia de la biblioteca de cDNA, y utilizarse como molde para la reacción PCR con cebadores que representan porciones de baja degeneración de la secuencia de aminoácidos. Los cebadores empleados generarán con preferencia productos de PCR que representan una porción significativa de la secuencia de nucleótidos. Los productos de la PCR pueden ensayarse posteriormente para determinar si corresponden a una porción del gen de la GA-20-oxidasa empleando una sonda de oligonucleótido sintético correspondiente a una secuencia de fragmentos de aminoácidos situada en la región central o en interior de la proteína GA-20-oxidasa.

Los clones cDNA y los productos de la PCR obtenidos del modo descrito antes o los fragmentos de los mismos pueden utilizarse como sonda de hibridación en un proceso de identificación otras secuencias de DNA de un organismo de fuente homóloga o heteróloga que codifica un producto proteico que posee actividad de GA-20-oxidasa, por ejemplo una planta monocotiledónea. Una fuente adecuada podría ser el tejido de desarrollo de plantas de maíz o de trigo.

Pueden utilizarse también como marcadores RFLP para determinar, por ejemplo, la situación del gen de la GA-20-oxidasa o un rasgo o carácter íntimamente relacionado en el genoma de la planta o para propagar plantas de forma asistida con marcador [EP-A 306.139; WO 89/07647].

Utilizando los métodos descritos anteriormente se puede aislar un gen que codifique a la GA-20-oxidasa.

Para la caracterización ulterior se purifican las secuencias de DNA y se aíslan del modo descrito antes y se someten a un análisis de secuencia. El DNA aislado previamente se descompone en primer lugar en fragmentos mediante enzimas de restricción idóneas y después se clona en vectores de clonación adecuados, por ejemplo en los vectores M13 llamados mp 18 y mp 19. La secuenciación se lleva a cabo en la dirección de 5' a 3', utilizándose con preferencia el método de terminación de cadena de didesoxinucleótido propuesto por Sanger [Sanger y col., 1977] o el método propuesto por Maxam y Gilbert [Maxam y Gilbert, 1980] o una instrumentación de secuenciación de nucleótidos que se suministra como producto comercial [de la empresa Applied Biosystems, Foster City, California; y de DuPont, Wilmington, Delaware]. Con el fin de evitar errores de secuenciación, es ventajoso secuenciar las dos hebras de DNA en paralelo. El análisis de la secuencia de nucleótidos y de la secuencia correspondiente de aminoácidos se asiste con ventaja mediante un ordenador empleando los programas informáticos computerizados comercialmente disponibles (p.ej. programas GCG de la universidad de Wisconsin).

La región situada entre la región codificante y el extremo 5' (dirección upstream) del clon es la región del promotor. La región del promotor de la GA-20-oxidasa puede mapearse con mayor precisión mediante un análisis de deleción. Las deleciones de 5' en un promotor de GA-20-oxidasa se realizan introduciendo sitios de restricción por reacción PCR empleando cebadores oligonucleótidos con sitios de restricción en los extremos 5' y secuencias de promotor en los extremos 3'. Se digieren los productos de la PCR, se purifican y se clonan en vectores idóneos de clonación, por ejemplo en el pBI101 (Clontech). Los mutantes de deleción contienen la secuencia guía sin traducir, fusionada al sitio inicial de partida de la traducción del gen GUS. Las deleciones internas y de 3' del promotor de la GA-20-oxidasa se realizan por reacción PCR de una manera similar. Se fusionan los fragmentos de la PCR con un vector GUS que contenga el promotor mínimo CAMV 35S [de -46 a +1; Benfey y col., 1990]. Las plantas transgénicas se ensayan con el ensayo fluorimétrico e histoquímico de la GUS.

La región de promotor de la GA-20-oxidasa pueden utilizarse de modo conveniente dentro del alcance de la presente invención para obtener constructos de DNA recombinantes o quiméricos que contienen un gen estructural de la GA-20-oxidasa que puede ser de origen homólogo o heterólogo con respecto a la secuencia del promotor.

La presente invención se refiere también a secuencias de DNA recombinante que contienen en la dirección que va de 5' a 3' una región de promotor que puede obtenerse a partir de una secuencia de DNA genómico de GA-20-oxidasa, que está unida operativamente a una secuencia de DNA que codifica a la GA-20-oxidasa, que puede ser homóloga o heteróloga con respecto a la secuencia del promotor. Las secuencias de DNA recombinante producen la expresión de la GA-20-oxidasa homóloga o heteróloga asociada en un material vegetal transformado.

En principio, el DNA puede obtenerse también por síntesis química.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido recombinante provisto de actividad de GA-20-oxidasa. Este polipéptido o enzima es soluble y dependiente de 2-oxoglutarato. Es capaz de actuar por ejemplo sobre uno o varios de los sustratos siguientes: GA_{12}, GA_{53}, GA_{15} (lactona abierta o cerrada), GA_{44} (lactona abierta o cerrada), GA_{24}, GA_{19} y GA_{23}. La GA-20-oxidasa puede derivarse de plantas, con preferencia monocotiledóneas y dicotiledóneas, y con mayor preferencia de plantas dicotiledóneas. Una fuente especialmente apropiada de plantas es la familia de las cucurbitáceas, por ejemplo la Cucurbita maxima, las semillas inmaduras de la cual son una fuente conveniente. Otra fuente idónea son las plantas de la familia crucíferas, por ejemplo la Arabidopsis thaliana, el material de los brotes de la misma es una fuente conveniente.

En particular, la GA-20-oxidasa recombinante se deriva de la C. maxima o de la Arabidopsis thaliana, respectivamente, o es una proteína que tiene una homología sustancial con las anteriores (ver lo descrito anteriormente).

Una forma de ejecución de este último aspecto de la invención es una GA-20-oxidasa que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 6. La invención incluye además una proteína que tiene una homología sustancial (ya definida antes) con esta secuencia de aminoácidos y que tiene actividad de GA-20-oxidasa. Las proteínas modificadas derivadas de esta secuencia de aminoácidos por mutación, es decir adición, sustitución o deleción de uno o varios restos de aminoácidos, y que tienen actividad de GA-20-oxidasa se incluyen también dentro del alcance de la invención.

Una vez identificado y aislado el DNA que codifica un producto polipéptido que posee actividad de GA-20-oxidasa se puede obtener una proteína purificada por expresión transgénica de dicho DNA, es decir, por colocación de un DNA recombinante que incluye una secuencia de DNA que codifica a una proteína provista de actividad de GA-20-oxidasa en una bacteria, en una levadura, en una planta o en otro sistema idóneo de expresión celular.

Los hospedantes idóneos incluyen bacterias, por ejemplo la E. coli, y levaduras, incluida la cepa del Saccharomyces cerevisiae. Otros hospedantes idóneos del sistema de expresión incluyen las células de insectos desarrolladas en cultivos. Estas células de insectos pueden infectarse con un baculovirus que contengan una molécula de DNA recombinante según la invención.

Como alternativa, el baculovirus puede utilizarse para infectar las células de un insecto vivo y utilizarse las células del insecto como hospedante del sistema de expresión. El hospedante del sistema de expresión se deja producir seguidamente un sobrenadante de expresión. Esto permite la generación fácil de grandes cantidades de GA-20-oxidasa recombinante purificada por aislamiento de la enzima del sobrenadante de expresión.

Otro objeto de la presente invención son construcciones genéticas quiméricas que, además de la secuencia de DNA según la invención que codifica a la GA-20-oxidasa, contienen señales de expresión que incluyen secuencias tanto de promotor como de terminados y otras secuencias reguladoras de las regiones 3' y 5' sin traducir y que están unidades operativamente a la secuencia de DNA codificadora, de modo que se asegura la expresión del producto genético correspondiente en el organismo hospedante respectivo.

Dentro del alcance de la invención, las secuencias idóneas de control que se prefieren son aquellas que contienen el promotor y las secuencias reguladoras 5' y 3' sin traducir que son funcionales en las plantas. Estas secuencias pueden derivarse con independencia entre sí de cualquier fuente, por ejemplo de genes de virus, de plantas o de bacterias. Estos promotores o secuencias reguladoras pueden ser constitutivas por naturaleza o pueden regularse en sus modelos de expresión. Tal regulación puede ser temporal o espacial y puede incluir promotores regulados desde el punto de vista del desarrollo y promotores inducibles. Las proteínas pueden expresarse opcionalmente en la vacuola o en el ámbito extracelular empleando métodos bien conocidos de la técnica (EP 462.065).

En general se puede utilizar cualquier promotor y cualquier terminador capaz de realizar una inducción de la expresión de una secuencia de DNA codificador (gen estructural) como constituyente de la secuencia de gen quimérico según la invención. Las señales de expresión mencionadas pueden promover una expresión continua y estable del gen. Son especialmente apropiadas las señales de expresión originadas por genes de plantas o de virus de plantas. Son ejemplos de promotores y terminadores idóneos los genes del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) o las secuencias de DNA homólogas que todavía tienen las propiedades características de las señales de expresión mencionadas. Son también idóneas las señales de expresión bacterianas, en especial las señales de expresión de los genes de sintasa de nopalina (nos) o los genes de sintasa de opina (ocs) de los plásmidos Ti del Agrobacterium tumefaciens. Cabe mencionar también, por ejemplo, los promotores de ubiquitina, los promotores de actina, los promotores de histona y los promotores de tubulina. Otros promotores idóneos son los promotores de amilasa (promotor de a-amilasa) y un promotor inducible de ABA (ácido abscísico).

En otra forma de ejecución de la invención puede utilizarse una región de promotor obtenible a partir de una secuencia de DNA genómico de la GA-20-oxidasa, ya descrita anteriormente.

Dentro del alcance de esta invención se da preferencia a las señales de expresión 35S y 19S del genoma CaMV o de sus homólogos que pueden aislarse de dicho genoma empleando métodos de biología molecular, descritos por ejemplo en Maniatis y col. (1982) y pueden unirse a la secuencia de DNA codificador.

Son también preferidas las señales de expresión que contienen promotores preferenciales de tejidos o específicos de tejido. El término promotor preferencial de tejido se emplea para indicar que una señal de expresión dada promoverá un nivel más alto de transcripción de un DNA expresable asociado o de expresión del producto de dicha DNA indicado por cualquier ensayo convencional de RNA o de proteína, o que una secuencia dada de DNA pondrá de manifiesto algún efecto diferencial; es decir, que la transcripción de las secuencias de DNA asociadas o la expresión de un producto genético es mayor en algún tejido que en todos los tejidos restantes de la planta. Por ejemplo, el promotor preferencial de tejido puede dirigir una expresión más alta de un producto genético asociado en las hojas, en el tallo, en las raíces y/o en el polen que en la semilla. Un ejemplo de promotor preferencial de tejido, que puede utilizarse de forma idónea dentro del alcance de la presente invención, es un promotor preferido de médula aislado a partir de un gen TrpA de maíz.

El término promotor específico de tejido se emplea para indicar que una secuencia dada de DNA regulador promoverá la transcripción de una secuencia completa de DNA expresable asociado en uno o en varios tejidos de una planta, o en un tipo de tejido, al tiempo que no habrá fundamentalmente ninguna transcripción de la secuencia de DNA codificador asociado en todos los demás tejidos o tipos de tejidos de la planta. En la técnica se conocen numerosos promotores cuya expresión se sabe que varían de manera específica según los tejidos. Uno ejemplo de ello es la carboxilasa de piruvato de fosfoenol del maíz (PEPC), que es específica del tejido verde [Hudspeth, R.L. y Grula, J.W., 1989]. Otros promotores específicos de tejido verde incluyen a los promotores de proteína de fijación de clorofila a/b y los promotores de subunidad pequeña Rubisco. Cabe mencionar también por ejemplo los promotores específicos de polen, tales como los que pueden obtenerse a partir de genes de fosfato-cinasa dependiente del calcio [CDPK] de una planta.

Puede utilizarse también un promotor regulado desde el punto de vista del desarrollo. Obviamente, en la presente invención puede utilizarse cualquier promotor, que sea funcional en la planta hospedante deseada, para dirigir la expresión de un gen asociado.

En general, el gen estructural de GA-20-oxidasa puede unirse a la región del promotor ya sea en una orientación del mismo sentido, ya sea en una orientación antisentido.

A menudo es ventajoso incorporar una secuencia guía entre la secuencia del promotor y la secuencia de DNA codificador adyacente, la longitud de dicha secuencia guía se elige de tal manera que la distancia entre la secuencia del promotor y la secuencia del DNA según la invención sea la distancia óptima para la expresión del gen estructural asociado. Las secuencias guía idóneas incluyen secuencias guía de varias longitudes, aisladas a partir del gen 35S CaMV (Pierce y col, 1987). Las secuencias guía preferidas son aquellas que se aíslan a partir del gen 35S CaMV, que tienen una longitud de 50 a 130 nucleótidos. La identificación de otras secuencias guía ya es conocida en la técnica, ver Della-Cioppa y col., 1987; Schekman, 1985.

Otras secuencias de DNA regulador que pueden utilizarse para la construcción de genes quiméricos incluyen, por ejemplo, las secuencias que son capaces de regular la transcripción de una secuencia de DNA asociado a tejidos de plantas en el sentido de una inducción o represión.

Existen, por ejemplo, ciertos genes de plantas de los que se sabe que pueden inducirse con varios factores internos y externos, por ejemplo hormona de plantas, choque térmico, productos químicos, agentes patógenos, deficiencia de oxígeno, luz, estrés, etc.

Otro grupo de genes idóneos de las plantas abarca los genes regulados por la luz, en especial los genes codificados por núcleo de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bifosfato-carboxilasa (RUBISCO). Morelli y col. (1985) han puesto de manifiesto que la secuencia que flanquea a 5' en un gen RUBISCO del guisante es capaz de transferir la foto-inducibilidad a un gen informador (reporter), en el supuesto de que este último esté unido a una forma quimérica de dicha secuencia. Se ha podido extender también esta observación a otros genes foto-inducidos, por ejemplo la proteína de fijación de clorofila a/b.

Otro grupo de secuencias de DNA regulables abarca las secuencias regulables químicamente que están presentes por ejemplo en los genes de proteínas PR (relacionadas por patogénesis) del tabaco y que son inducibles por reguladores químicos, tales como los descritos en EP-A-332.104.

En una forma específica de la invención se emplea un promotor del gen PR1a de la Arabidopsis.

Las secuencias de DNA regulables mencionadas anteriormente a título de ejemplo pueden ser de origen tanto natural como sintético, o bien pueden contener una mezcla de secuencias de DNA natural y sintético.

Las secuencias de DNA recombinante de la presente invención pueden contener además una secuencia de señal, que está unida operativamente a la secuencia de DNA codificador. La secuencia de señal es la que produce el transporte especializado del péptido asociado dentro de la célula vegetal.

La secuencia de señal de la presente invención puede ser cualquier secuencia de DNA que sea capaz de dirigir el transporte de un polipéptido asociado hacia uno o varios compartimentos celulares. La secuencia de señal es con preferencia una secuencia que se traduce en un péptido de señal, que se separa del péptido una vez ha finalizado el paso del péptido. Las secuencias de señal son útiles para dirigir el producto polipéptido de la secuencia de DNA codificador a una ubicación deseada dentro de la célula, por ejemplo a los mitocondrios o al retículo endoplasmático, o de dirigir el transporte extracelular al exterior de la célula.

Cabe mencionar aquí, por ejemplo, los péptidos de señal en el extremo N, que intervienen en el transporte intracelular y que se hallan en el extremo N de las proteínas transportadas mediante un sistema endomembrana. Estas secuencias de señal aseguran que dichas proteínas pasen en primer lugar al retículo endoplasmático, en el que el péptido señal se escinde proteolíticamente de la proteína del precursor una vez esta ha realizado su función. En virtud de su función específica, este tipo de secuencia de péptido de señal se ha conservado en alto largo durante la evolución de todas las células vivas, con independencia de que sean bacterias, levaduras, hongos, animales o plantas.

Por otro lado, en el extremo C de las proteínas vacuolares se pueden encontrar secuencias que intervienen en dirigir la expresión de la parte codificadora asociada de la vacuola de la planta. Los ejemplos de las secuencias llamadas de dirección vacuolar (vacuolar targeting) se mencionan por ejemplo en el documento EP-A-462.065.

La molécula de DNA puede contener además secciones de secuencia que codifican a fragmentos de péptido, que en conjunto contribuyen a mejorar la competencia en la admisión en la vacuola, por ejemplo el fragmento de propéptido descubierto por Matsuoka, K. y Nakamura, K. en la extensión del extremo N de la esporamina [Matsuoka, K. y Nakamura, K. (1991)].

Otras secuencias de señal útiles para la presente invención son, por ejemplo, la secuencia de señal del gen relacionado por patogénesis (PR-1) del tabaco, que se describe en Cornellisen y col., 1986; la presecuencia de mitocondrio de levadura, Schmitz y col., 1989; la secuencia de señal de la proteína hierro-azufre Rieske de mitocondrio de plantas, Huang y col., 1991; los péptidos de direccionado de microcondrio y de cloroplasto, von Heijne y col., 1989.

La presente invención incluye además construcciones genéticas quiméricas que contienen, en unión operativa con un gen estructural que codifica la GA-20-oxidasa, otras secciones reguladores de la secuencia de DNA que permiten por ejemplo controlar específicamente la inducción o represión de la expresión genética.

Como modificación del aspecto anterior, la invención proporciona además un constructo genético quimérico que contiene por lo menos una parte de una secuencia de nucleótido de GA-20-oxidasa inversa, que tiene en su extremo 5' un promotor capaz de provocar que la secuencia inversa se exprese en el mRNA antisentido dentro de una planta y, opcionalmente, otras secuencias de DNA regulador, por ejemplo las mencionadas anteriormente.

Las diversas secciones de las secuencias de DNA quimérico según la invención pueden unirse entre sí mediante métodos ya conocidos de por sí para formar una secuencia completa de DNA codificador. Los métodos idóneos incluyen, por ejemplo, la recombinación "in vivo" de secuencias de DNA que tienen secciones homólogas y la unión "in vitro" de los fragmentos de restricción.

En los procesos "in vivo" y/o "in vitro" recién mencionados para el acoplamiento de diferentes secciones de dicha unidad funcional pueden intervenir vectores de clonación, por ejemplo los vectores de plásmido o de virus (bacteriófago) que tienen secuencias de replicación y de control que se originan en especies que son compatibles con las células hospedantes específicas.

El vector de clonación lleva en general un origen de replicación, en especial un origen de replicación que es capaz de funcionar en la E. coli, en el Agrobacterium o en ambos y, además, genes específicos que conducen a características de selección fenotípica en la célula hospedante transformada, en especial a resistencia a los antibióticos o a herbicidas concretos. Los vectores transformados pueden elegirse en base a estos marcadores fenotípicos después de la transformación realizada en la célula hospedante.

Estos vectores de clonación y la célula hospedante transformada con estos vectores pueden utilizarse en general para aumentar el número de copias de los constructos clonados con ellos. Con un mayor número de copias es posible aislar el vector que lleva la construcción genética quimérica y prepararlo por ejemplo para la inserción de secuencia genética quimérica en una célula de una planta.

Dentro del alcance de la presente invención son especialmente idóneos los vectores llamados "lanzaderas" (shuttle), que pueden replicar de forma estable no solo en uno sino por lo menos en dos organismos hospedantes diferentes, por ejemplo en la E. coli y en el Agrobacterium tumefaciens, en presencia de un marcador de selección idóneo.

Los marcadores fenotípicos seleccionables que pueden utilizarse dentro del alcance de esta invención incluyen por ejemplo la resistencia a la ampicilina, a la tetraciclina, a la higromicina, a la canamicina, al metotrexato, al G418 y a la neomicina, pero con esta lista, que se facilita a título meramente ilustrativo, no se pretende limitar el objeto de la invención.

Las células hospedantes idóneas dentro del alcance de esta invención son procariotas, incluidos los hospedantes bacterianos, por ejemplo el A. tumefaciens, la E. coli, la Salmonella typhimurium y la Serratia marcescens, y también las cianobacterias. Los hospedantes eucariotas, por ejemplo las levaduras, los hongos formadores de micelio y las células de plantas pueden utilizarse también dentro del alcance de esta invención.

El corte y empalme de la construcción genética quimérica según la invención en un vector idóneo de clonación se lleva a cabo aplicando métodos estándar, como son por ejemplo los descritos por Maniatis y col. (1982) y por Sambrook y col. (1989).

En otra etapa del proceso, el gene estructural clonado que codifica a la GA-20-oxidasa puede introducirse en uno de los cassettes empleados habitualmente para la transformación de plantas y transformarse en una célula de planta aplicando técnicas estándar y, opcionalmente, integrarse en el genoma de la planta.

La detección de la célula vegetal transformada puede llevarse a cabo empleando sistemas idóneos de selección.

Los sistemas de selección muy convenientes se aplican con preferencia en sistemas de expresión transitoria, que son los basados en un marcador en el que puede practicarse una muesca (scorable), por ejemplo genes reguladores o estructurales que controlan la biosíntesis de la antocianina, la GUS (\beta-glucuronidasa), la luciferasa, las opina-sintetasas, la taumatina, la \beta-galactosidasa, los epítopos sintéticos únicos empleados para la detección fácilmente mediante ensayo ELISA, las ficobiliproteínas y varias sustancias fluorigénicas.

En una forma específica de ejecución de la presente invención se utiliza un sistema de marcador basado en la "GUS", que contiene una secuencia de DNA que codifica a la enzima \beta-glucuronidasa unida operativamente a una o varias señales de expresión mencionadas anteriormente. Después de la expresión del gen de la GUS en la célula vegetal, la enzima \beta-glucuronidasa puede reaccionar con su sustrato específico, lo cual conduce a la aparición de manchas azules que pueden detectarse fácilmente en el tejido de la planta.

En otra forma de ejecución de la presente invención se utilizan secuencias de codificación de genes reguladores de antocianina, conocidos en la técnica como secuencias C1 y B-Peru (Goff y col., 1990). Dichas secuencias codificadoras, unidas operativamente con uno o varios promotores constitutivos, mencionados anteriormente, pueden utilizarse para aislar transformantes basándose en la pigmentación roja de las células transformadas con dichos genes. Por otro lado, el sistema de marcador basado en la "antocianina" implica una reacción de color rojo.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula hospedante transformada que consta de un DNA recombinante que codifica a un polipéptido provisto de actividad de GA-20-oxidasa unido operativamente a señales de expresión, incluidas las secuencias de promotor y de terminación, que permite la expresión de dicho DNA en la célula hospedante. Cuando la célula hospedante es una célula vegetal, entonces pueden obtenerse plantas transgénicas. La invención proporciona, pues, por primera vez una planta transgénica con una vía de biosíntesis alterada de la GA, en particular una planta que contiene y es capaz de expresar un gen recombinante de GA:2-oxoglutarato-dioxigenasa. Por lo tanto se proporciona una planta transgénica que contiene un DNA recombinante que codifica a un polipéptido provisto de actividad de GA-20-oxidasa unido operativamente a señales de expresión, incluidas las secuencias de promotor y de terminación, que permiten la expresión de dicho DNA en la planta.

Una modificación del aspecto anterior de la invención consiste en la transformación de una planta con un constructo que contiene una secuencia de nucleótido de GA-20-oxidasa inversa (la secuencia codificadora completa o una parte de la misma) para la transcripción del mRNA antisentido y después para la expresión reducida del gen de GA-20-oxidasa. En los documentos EP-A-240 208 (Calgene) y EP-A-458 367 (Calgene) se presentan ejemplos de la tecnología antisentido. La secuencia de nucleótido inverso puede asociarse con un promotor que sea específico de ciertos tejidos vegetales y/o con estímulos externos (p.ej. luz, frío, calor, compuestos químicos, etc.). Otros medios posibles de reducir la expresión son por ejemplo el uso de la tecnología de ribocimas, descrita en el documento EP-A-321 201 o en WO 89/05852. Dentro del alcance de la presente invención puede utilizarse también una combinación de tecnología antisentido y tecnología de ribocimas para regular la actividad de la GA-20-oxidasa.

También la superexpresión del gen de la GA-20-oxidasa en plantas puede producir niveles reducidos de giberelinas biológicamente activas en las plantas.

La invención incluye la progenie o los propágulos, incluida la semilla, de plantas transgénicas, ya definidos antes. La invención incluye además métodos de obtener plantas transgénicas.

El DNA recombinante según la invención, que contiene la secuencia de DNA que codifica a la GA-20-oxidasa, puede introducirse en la célula vegetal por múltiples vías que los expertos en la materia conocen perfectamente. Por ejemplo, los métodos de transformación de células vegetales incluyen la microinyección [Crossway y col. (1986); Neuhaus (1987)], la electroporación [Riggs y col. (1986)]; transformación mediada por el Agrobacterium [Hinchee y col. (1988)]; transferencia genética directa [Paszkowski y col. (1984)] y aceleración balística de partículas empleando por ejemplo dispositivos suministrados por Agracetus Inc., Madison, Wisconsin y DuPont Inc., Wilmington, Delaware [ver por ejemplo Sanford y col. patente US-4 945 050; y McCabe y col. (1988); ver además Wissinger y col. (1988); Sanford y col. (1987) (cebolla); Christou y col. (1988) (soja); McCabe y col. (1988) (soja); Datta y col. (1990) (arroz); Klein y col. (1988) (maíz); Klein y col. (1988) (maíz); Klein y col. (1989) (maíz); Fromm y col. (1990); Gordon-Kamm y col. (1990) (maíz)].

Un método posible de introducir material genético en las células vegetales consiste, por ejemplo, en poner las células vegetales en contacto con virus o con Agrobacterium que lleve el DNA que se pretende introducir. Esto puede lograrse infectando células vegetales sensibles o co-cultivando protoplastos derivados de células vegetales. Dentro del alcance de esta invención puede utilizarse el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) como vector para la inserción en una planta de la secuencia de DNA que codifica la GA-20-oxidasa según la invención.

Otro método de insertar la secuencia de DNA que codifica a la GA-20-oxidasa en una célula se basa en la infección de la célula vegetal con Agrobacterium tumefaciens y/o Agrobacterium rhizogenes, que se hayan transformado previamente con una construcción de dicho gen. A continuación se cultivan las células vegetales transgénicas en condiciones idóneas, que los expertos en la materia ya conocen, de modo que formen brotes y raíces y finalmente plantas completas.

Otro método viable de transformación de material vegetal consiste en la infección mixta empleando tanto Agrobacterium rhizogenes como Agrobacterium tumefaciens transformado, del modo descrito por Petit y col. (1986) para la transformación de zanahorias.

La secuencia de DNA que codifica a la GA-20-oxidasa según la invención puede transferir por tanto a células vegetales idóneas mediante, por ejemplo, el plásmido Ti del Agrobacterium tumefaciens o el plásmido Ri del Agrobacterium rhizogenes. El plásmido Ti o el plásmido Ri se transfiere a la planta en el curso de la infección con el Agrobacterium y se integra de manera estable al genoma de la planta.

Cualquier vector que contenga T-DNA puede transferirse a las células de las plantas y permita la selección de las células transformadas es idóneo para el uso dentro del alcance de esta invención, por ejemplo el vector "lanzadera" que contiene la secuencia de DNA que codifica a la GA-20-oxidasa según la invención, clonado dentro de la secuencia límite izquierdo (left border, LB) y la secuencia límite derecho (right border, RB) y que es capaz de una replicación estable en la E. coli y en el A. tumefaciens. Es preferido el sistema de vector llamado binario.

Aplicando técnicas de transformación desarrolladas recientemente es también posible en principio transformar especies vegetales "in vitro" que no son plantas hospedantes naturales del Agrobacterium. Por ejemplo, las plantas monocotiledóneas, en especial las especies cerealistas y diversos céspedes no son hospedantes naturales del Agrobacterium.

Cada vez se ve con mayor evidencia que las plantas monocotiledóneas pueden transformarse también empleando el Agrobacterium, de modo que empleando nuevas formulaciones experimentales ahora disponibles se pueden someter también a transformación especies de cereales y de céspedes [Grimsley, N.H. y col. (1987)].

Uno de los métodos preferidos para introducir el DNA en una célula vegetal mediante el Agrobacterium es la llamada transformación de disco de hoja empleando el Agrobacterium [Horsch y col. (1985)]. Se incuban discos de hoja estériles de una planta diana idónea con células de Agrobacterium que tengan una secuencia de DNA que codifique la GA-20-oxidasa según la invención y después se transfieren a un medio nutriente idóneo. Son idóneos en especial y por ello preferidos dentro del alcance de esta invención los medios LS que se han solidificado por adición de agar y enriquecido con uno o varios reguladores de crecimiento vegetal que se emplean habitualmente, en particular los elegidos entre el grupo de las auxinas, formado por el ácido a-naftilacético, el picloram, el ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético, el ácido 2,4-diclorofenoxiacético, el ácido indol-3-butírico, el ácido indol-3-láctico, el ácido indol-3-succínico, el ácido indol-3-acético y el ácido p-clorofenoxiacético y entre el grupo de las citoquininas, formado por la cinetina, la 6-benciladenina, la 2-isopenteniladenina y la zeatina. La concentración preferida de las auxinas y de las citoquininas se sitúa dentro del intervalo de 0,1 mg/l y 10 mg/l.

Después de una incubación de varios días, pero con preferencia después de una incubación de 2 a 3 días a una temperatura comprendida entre 20 y 40ºC, con preferencia entre 23 y 35ºC y con preferencia especial a 25ºC y en luz difusa, se trasladan los discos de hoja a un medio idóneo con el fin de inducir los brotes. Es preferido en especial para la selección de los transformantes un medio LS que no contenga auxina, pero que contenga en su lugar citoquinina y al que se añade una sustancia selectiva en función del gen marcador usado. Los cultivos se mantiene bajo la luz y se transfieren a un medio fresco a intervalos idóneos, pero con preferencia a intervalos de una semana. Se cortan los brotes verdes desarrollados y se prosigue su cultivo en un medio que induzca la formación de raíces a partir de los brotes. En el alcance de esta invención es preferido en particular un medio LS que no contenga auxina ni citoquinina, pero al que se ha añadido una sustancia selectiva para la selección de los transformantes.

Además de la transformación mediada por el Agrobacterium, es posible dentro del alcance de esta invención el uso de métodos de transformación directa para la inserción de construcciones genéticas de la invención en un material vegetal.

Los métodos viables para la transferencia directa de material genético a una célula vegetal comprenden por ejemplo el tratamiento de protoplastos aplicando procedimientos que modifican la membrana plasmática, por ejemplo el tratamiento con polietilenglicol, el tratamiento de choque térmico o la electroporación, o una combinación de tales procedimientos [Shillito y col. (1985)].

En la técnica de electroporación, se someten los protoplastos vegetales junto con los plásmidos que contienen la secuencia de DNA que codifica a la GA-20-oxidasa a pulsos eléctricos de alta intensidad de campo. Esto provoca un aumento reversible de la permeabilidad de las biomembranas y entonces permite la inserción de los plásmidos. Los protoplastos vegetales electroporados renuevan su pared celular, la dividen y forman el tejido del callo. La selección de las células vegetales transformadas puede realizarse mediante marcadores fenotípicos descritos anteriormente.

Otro método para la introducción directa de material genético en células de plantas, que se basa en procedimientos puramente químicos y permite una transformación muy rápida y eficaz, se describe en Negrutiu, I. y col. (1987).

También adecuada para la transformación de material vegetal es la transferencia genética directa empleando la co-transformación (Schocher, R.J. y col. (1986)).

La co-transformación es un método que se basa en la absorción e integración simultáneas de diversas moléculas de DNA (genes seleccionables y no seleccionables) en el genoma de una planta y que permite la detección de células que se han transformado con genes no seleccionables.

Otros medios de insertar material genético contenido en un vector directamente en una célula vegetal consisten en procedimientos puramente físicos, por ejemplo la microinyección empleando micropipetas finamente estiradas [Neuhaus y col. (1987)] o el bombardeo de las células con microproyectiles que están recubiertos con el DNA transformante ["bombardeo con microproyectiles" de Wang, Y.C. y col. (1988)] o que se aceleran a través de una solución que contiene DNA en dirección a las células a transformar por el impacto de presión, con lo cual se atomizan finamente con la solución adoptando la forma de neblina, como resultado del impacto de presión [EP-A-434 616].

El bombardeo con microproyectiles ha progresado como técnica de transformación eficaz de las células, incluidas las células de las plantas. Sanford y col. (1987) han publicado que el bombardeo con microproyectiles es eficaz para entregar ácido nucleico en el citoplasma de células vegetales del Allium cepa (cebolla). Christou y col. (1988) han descrito la transformación estable de callo de soja con un gen resistente a la canamicina mediante el bombardeo con microproyectiles. Christou y col. describen la penetración de aproximadamente el 0,1 al 5% de las células. Christou informa además de niveles observables de actividad de enzima NPTII y de la resistencia en los callos transformados hasta 400 mg/l de canamicina. McCabe y col. (1988) describen la transformación estable de la Glycine max (soja) empleando el bombardeo con microproyectiles. McCabe y col. describen también la recuperación de una planta R_{1} transformada a partir de una planta R_{0} quimérica.

La transformación de las plantas de maíz, incluidas las plantas de maíz selecto, mediante bombardeo con microproyectiles puede llevarse a cabo según el protocolo general descrito por ejemplo en el documento EP-A-478 502, esta descripción se incorpora a la presente como referencia.

La lista de los métodos de transformación posibles que se acaba de facilitar es puramente ilustrativa y no pretende ser exhaustiva ni pretende limitar el objeto de la invención.

La presente invención se refiere además a material vegetal transgénico, elegido entre el conjunto formado por los protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, óvulos, cigotos, etc. y en especial plantas enteras y con preferencia fenotípicamente normales que se hayan transformado mediante los procesos descritos antes y que contienen el DNA recombinante según la invención en forma expresable y a procesos para la producción de dicho material vegetal transgénico.

Dentro de la invención son preferidas las plantas monocotiledóneas, incluidas la semilla y la progenie o propágulos de la misma, pero en especial los monocotiledones de gramíneas, por ejemplo Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale y Setaria (= vallico o raigras, maíz, trigo, Triticale, sorgo, caña de azúcar, bromo o cebadilla, arroz, avena, cebada, centeno y mijo, respectivamente). Son preferidas en especial las plantas transgénicas de maíz, trigo y cebada y las semillas de las mismas.

La exploración de las células vegetales, tejidos y plantas en búsqueda de secuencias de DNA específicas puede realizarse mediante un análisis Southern (Southern, 1975). Los detalles de este procedimiento se describen en Maniatis y col. (1982). Esta exploración puede realizarse también con procedimientos de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los procedimientos de la PCR se describen con detalle en Mullis y col. (1987) y en Ehrlich, A. (1989).

La transformación de las células vegetales incluye la separación de las células transformadas de las que no se han transformado. Un método conveniente para tal separación o selección consiste en incorporar al material que se quiere insertar en la célula transformada un gen que sea un marcador de selección. Como resultado de ello, únicamente las células que se hayan transformado con éxito contendrán el gen marcador. El producto de traducción del gen marcador aportará entonces un rasgo fenotípico que permitirá efectuar la selección. Por lo general, el rasgo fenotípico es la capacidad de sobrevivir en presencia de algún agente químico, por ejemplo un antibiótico, p.ej. la canamicina, el G418, la paromomicina, etc., que se introduce en un medio de selección.

Algunos ejemplos de genes que confieren resistencia a los antibióticos incluyen entre otros los que codifican la neomicina-fosfotransferasa (resistencia a la canamicina) [Velten y col. (1984)], la higromicina-fosfotransferasa (resistencia a la higromicina) [van den Elzen y col. (1985)], el gen de la resistencia a la canamicina (NPT II) derivado del Tn5 [Bevan y col. (1983); McBride y col. (1990)], el gen PAT descrito por Thompson y col. (1987) y la cloranfenicol-acetiltransferasa.

Un ejemplo de gen utilizable en sentido primario como marcador explorable en un cultivo de tejido para la identificación de células vegetales que contienen vectores de ingeniería genética es un gen que codifica una enzima que produce un producto cromogénico. Un ejemplo es el gen que codifica la producción de la \beta-glucuronidasa (GUS). Esta enzima se utiliza en gran cantidad y su obtención y uso se describen en Jefferson (1987).

Una vez las células vegetales transformadas se han cultivado en un medio de selección, se seleccionan las células supervivientes para su ulterior estudio y manipulación. Los métodos y materiales de selección son conocidos de los expertos en la materia, permitiendo la elección de las células supervivientes con un alto grado de probabilidad de que las células escogidas se transformarán con éxito con el DNA exógeno.

Después de la transformación de las células vegetales o de las plantas empleando por ejemplo el plásmido Ti del Agrobacterium, las células vegetales o las plantas transformadas con el plásmido Ti de modo que se exprese la enzima pueden seleccionarse con un marcado fenotípico apropiado. Estos marcadores fenotípicos incluyen, pero no se limitan a la resistencia a los antibióticos. Otros marcadores fenotípicos son también conocidos en la técnica y pueden utilizarse en esta invención.

Los clones positivos se regeneran siguiendo procedimientos bien conocidos de la técnica. A continuación se evalúa la presencia de las propiedades deseadas en las plantas transformadas y/o la extensión en que se han expresado dichas propiedades deseadas. Una primera evaluación puede incluir por ejemplo el nivel de resistencia bacteriana/fúngica de las plantas transformadas, la heredabilidad estable de las propiedades deseadas, los ensayos de campo, etcétera.

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El proceso de producción de material vegetal transformado, incluidas las plantas completas, consiste, pues, fundamentalmente en lo siguiente:

en primer lugar aislar una secuencia de DNA que codifica a una proteína que posea actividad de GA-20-oxidasa a partir de una fuente idónea o bien sintetizarla por procesos conocidos;

unir operativamente dicha secuencia de DNA en una dirección de 5' a 3' a secuencias de expresión de una planta, ya definidas anteriormente;

transformar el constructo de la etapa (b) en un material vegetal mediante procesos ya conocidos y expresarlo en dicho material;

explorar el material vegetal tratado según la etapa (c) buscando la presencia de una secuencia de DNA que codifique a una proteína que despliegue actividad de GA-20-oxidasa; y opcionalmente

regenerar el material vegetal transformado con arreglo a la etapa (c) para obtener una planta entera y con preferencia fenotípicamente normal.

La presente invención se refiere además a plantas transgénicas y a la progenie sexual y/o asexual de las mismas, que se hayan transformado con una secuencia de DNA recombinante según la invención.

La expresión "progenie sexual o asexual de plantas transgénicas" incluye por definición acorde con la invención todos los mutantes y variantes que puedan obtenerse mediante los procesos conocidos, por ejemplo la fusión celular o la selección de mutantes y que todavía posean las propiedades características de la planta transformada inicial, junto con todos los productos de cruzamiento y de fusión del material vegetal transformado.

Otro objeto de la invención se refiere al material de proliferación de las plantas transgénicas. El material de proliferación de las plantas transgénicas se define según la invención como cualquier material vegetal que pueda propagarse sexualmente "in vivo" o "in vitro". Son especialmente preferidos dentro del alcance de la presente invención los protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, células de huevo, cigotos, junto con cualquier otro material de propagación obtenido a partir de plantas transgénicas.

Otro aspecto de la invención es la provisión de un anticuerpo cultivado contra por lo menos una parte de la secuencia de aminoácidos de la GA-20-oxidasa. Tal anticuerpo es útil para la exploración de la biblioteca de cDNA en vectores idóneos, derivados del RNA del tejido de la planta.

El gen de la GA-20-oxidasa según la invención es útil para la modificación de los procesos de crecimiento y desarrollo de plantas transgénicas. Por ejemplo, la expresión reducida con el RNA antisentido puede provocar una producción baja de GA y, de este modo, un menor crecimiento en alargamiento. La 20-oxidasa es una enzima reguladora y la producción de la GA puede ser especialmente sensible a su actividad. Se sabe que se regula con la duración del día en plantas de tipo roseta de día largo, por ejemplo las espinacas, en las que la mayor actividad de la 20-oxidasa en días largos produce la salida de brotes. Por ello puede ser especialmente beneficiosa la modificación de la expresión de este gen. Otros procesos regulados por la GA que son dianas potenciales de la manipulación son la germinación de la semilla, la iniciación de la floración y el desarrollo de las flores, la iniciación de los frutos y su crecimiento y la expresión sexual en algunas especies dioicas.

Por lo tanto, en un aspecto del uso de esta invención se utilizan secuencias inversas de nucleótidos de 20-oxidasa y promotores específicos de tejidos y/o estímulos (p.ej. luz, calor, frío, productos químicos, etc.) para la transformación de plantas de modo que se transcriba el mRNA antisentido, resultando de ello una expresión reducida del gen de la 20-oxidasa. Este método produce plantas con niveles reducidos de GA endógena y por consiguiente un hábito alterado de crecimiento y/u otros procesos de desarrollo.

Este método puede utilizarse para reducir el crecimiento vegetativo:

fortaleciendo la paja en cereales de grano pequeño y en el arroz;

previniendo el encamado;

previniendo el encamado de la colza oleaginosa y mejorando la estructura de su vaina;

mejorando la calidad de los plantones para el trasplante;

reduciendo el crecimiento del césped y hierbas de prados;

reduciendo el crecimiento de los brotes de frutales y árboles de adorno; produciendo plantas ornamentales de hábitos de crecimiento más compactos;

mejorando la tolerancia al frío, a la sequía y a la infección fúngica; y

mejorando los rendimientos por la desviación de asimilados de órganos vegetativos en reproductivos.

El método es, pues, útil para prevenir la salida de brotes y la floración en plantas de tipo roseta, p.ej. remolacha azucarera, lechuga, espinacas y nabos (Brassica). Es útil para prevenir los brotes, por ejemplo en tubérculos de patata. Es útil además para prevenir la germinación prematura de la semilla.

La invención es útil además para la transformación de plantas con constructos que contengan la secuencia de la 20-oxidasa y promotores específicos de tejidos y/o estímulos para conseguir una mayor expresión el gen de la GA-20-oxidasa. Este método aumentará los niveles de las GA biológicamente activas y modificará de este modo el desarrollo de las plantas, en los casos en los que la 20-oxidación es una etapa modificadora del rendimiento. El método puede utilizase para mejorar el inicio de la producción de frutos y el crecimiento: aumentando el tamaño de las bayas en uva sin semilla (aumentando también la longitud del raquis y produciendo un racimo menos compacto); aumentando la producción en cítricos, en especial en clementinas; retrasando la maduración de los cítricos; mejorando la producción en perales y disminuyendo el número de semillas; y para modificar la forma de la manzana y mejorar la textura de su monda.

El método puede utilizarse potencialmente para aumentar la extensión del tallo y la expansión de las hojas, por ejemplo para aumentar la longitud del tallo y el rendimiento en azúcar de la caña azucarera; la aumentar el rendimiento y la producción temprana del apio y del ruibarbo; para aumentar el rendimiento de la col, la lechuga, las espinacas, etc.; y para aumentar el rendimiento forrajero de las praderas. El método puede utilizarse para estimular la germinación de las semillas, por ejemplo para adelantar el malteado y aumentar el rendimiento en malta de los cereales (p.ej. cebada, trigo, avena). El método puede utilizarse además para producir una salida uniforme de brotes y para estimular la floración, por ejemplo en la producción de semillas de lechuga y otras especies de roseta o en avanzar la cosecha de alcachofas. El método puede utilizarse además para inducir la formación de flores en coníferas. Puede aplicarse también para superar el letargo de los tubérculos y para acelerar la emergencia de brotes en patatas, ñames, etc. El método puede aplicarse además para inducir flores estaminadas en especies ginoceas, por ejemplo la calabaza.

Las listas de secuencias y las figuras anexas pueden describirse del modo siguiente:

En la SEQ ID NO 1 se presenta una secuencia de nucleótido del clon pB11 del cDNA de GA-20-oxidasa que se puede obtener de la semilla de Cucurbita maxima.

En la SEQ ID NO 2 se presenta la secuencia de aminoácidos de la proteína GA-20-oxidasa correspondiente al clon pB11 de cDNA.

En la SEQ ID NO 3 se presenta la secuencia de nucleótido del clon pAt2301 del cDNA de la GA-20-oxidasa que puede obtenerse de la Arabidopsis thaliana.

En la SEQ ID NO 4 se presenta la secuencia de aminoácidos de la proteína GA-20-oxidasa correspondiente al clon pAt2301 de cDNA.

En la SEQ ID NO 5 se presenta la secuencia de nucleótido del clon pAt2353 del cDNA de la GA-20-oxidasa que puede obtenerse de la Arabidopsis thaliana.

En la SEQ ID NO 6 se presenta la secuencia de aminoácidos de la proteína GA-20-oxidasa correspondiente al clon pAt2353 de cDNA.

En la SEQ ID NO 7 se presenta la secuencia de aminoácidos de un péptido sintético que se ha producido sobre la base de la secuencia de aminoácidos de un péptido resultante de la digestión en tripsina de la GA_{12}-20-oxidasa purificada del endospermo de la C. maxima.

En las SEQ ID NO 8 y 9 se presentan las secuencias de aminoácidos de dos péptidos correspondientes a cebadores oligodesoxinucleótidos que se diseñan sobre la base de regiones de aminoácidos conservadas entre la 20-oxidasa de giberelina de cotiledón de Cucurbita maxima y dioxigenasas de otras plantas, incluida la proteína E8 relacionada con la maduración del tomate E8, la enzima de maduración en almacenaje con etileno del tomate, la hiosciamina-6-hidroxilasa del Hyoscyamus niger (beleno negro, dormidera), la flavanona-3-hidroxilasa de la cebada y el gen A2 del maíz.

En las SEQ ID NO 10 y 11 se presentan las secuencias de dos cebadores oligodesoxinucleótidos que se diseñan sobre la base de regiones de aminoácidos conservadas entre la 20-oxidasa de giberelina de cotilendón de Cucurbita maxima y dioxigenasas de otras plantas, incluida la proteína E8 relacionada con la maduración del tomate, la enzima de maduración del tomate almacenado con etileno, la hiosciamina-6-hidroxilasa del Hyoscyamus niger, la flavanona-3-hidroxilasa de la cebada y el gen A2 del maíz. Los cebadores hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' contienen sitios de rotura o segmentación de la endonucleasa de restricción para HindIII y EcoRI, respectivamente, en sus extremos 5'.

En las SEQ ID NO 12 y 13 se presentan las secuencias de nucleótido y de aminoácidos correspondientes de un inserto de clon pAt2204 de cDNA, cuya secuencia prevista de aminoácidos es idéntica en un 67% con la de la 20-oxidasa de giberelina de calabaza amarilla.

En las SEQ ID NO de 14 a 17 se presentan secuencias de nucleótido de cuatro oligonucleótidos, que se utilizan en combinación con los cebadores de secuenciación universal M13 en reacciones PCR.

La invención se ilustra también con los ejemplos siguientes. En los ejemplos se describen el aislamiento y la secuencia de nucleótido de un clon cDNA de GA_{12}-20-oxidasa elegida con un anticuerpo específico a partir de la biblioteca \lambdagt11 derivada de cotiledones de Cucurbita maxima (calabaza amarilla) inmadura. La identidad de los genes clonados se confirma con la expresión en Escherichia coli de una proteína recombinante funcional, que cataliza la oxidación en tres etapas de la GA_{12} a la GA_{25} y de la GA_{53} a la GA_{17} así como la formación de las GA de C_{19} en rendimientos bajos. Puede detectarse además la actividad de 20-oxidasa en calvas de bacteriófagos individuales.

La demostración de la actividad de la 20-oxidasa en calvas de bacteriófagos individuales sugiere que, en ausencia de un anticuerpo idóneo, podría efectuarse con éxito una exploración funcional de la biblioteca \lambdagt11 basada en la medición de la actividad catalítica de la enzima. Sería posible hacer el seguimiento de la actividad de la enzima a través de las subdivisiones de la biblioteca y después elegir las colonias lisogénicas individuales o calvas. Obviamente, puede detectarse un nivel bajo de actividad de la 20-oxidasa en lisógenos obtenidos con 3,6x10^{7} pfu a partir de la biblioteca amplificada.

Los ejemplos siguientes describen la obtención de constructos de DNA quimérico que contienen el cDNA de la GA-20-oxigenasa en orientación del mismo sentido y antisentido, que son idóneos para transformarse y expresarse en plantas. En los ejemplos se describe también la transformación de plantas con dichos constructos quiméricos elegidos entre el grupo formado por el tabaco, la zanahoria, el girasol, el tomate, el algodón, el Zea mays (maíz), la Dactylis glomerata (pasto ovillo) y el trigo.

En los ejemplos se describe además el aislamiento de tres clones cDNA adicionales [pAt2301; pAt2353; pYAP169] de la GA_{12}-20-oxidasa a partir de la biblioteca de \lambdagt11 derivados del tejido de brotes del mutante ga1 de la Arabidopsis thaliana. Las secuencias de nucleótido y de aminoácidos respectivamente de los clones pAt2301 y pAt2353 se definen en las SEQ ID NO de 1 a 6.

En los ejemplos se describe además la obtención de constructos de DNA quimérico que contienen los cDNA de la GA-20-oxidasa [AT2301; AT2353; YAP169] en orientación del mismo sentido y antisentido, que son idóneos para transformarse y expresarse en plantas de Arabidopsis thaliana y también la transformación de la Arabidopsis thaliana con dichos constructos quiméricos.

Ejemplo de referencia

Técnicas generales de DNA recombinante

Dado que muchas de las técnicas de DNA recombinante empleadas en esta invención son un tema de rutina para el experto en la materia, es mejor dar una breve descripción de las técnicas empleadas en general que describirla cada vez que se utilizan. Salvo cuando se indique expresamente lo contrario, todos los procedimientos se describen en la referencia de Maniatis y col. (1982).

A. Segmentación con endonucleasas de restricción

Una mezcla reaccionante contiene normalmente de 50 a 500 mg/ml de DNA en una solución tampón recomendada por el fabricante, New England Biolabs, Beverly, MA. Por cada mg de DNA se añaden de 2 a 5 unidades de endonucleasas y se incuba la mezcla reaccionante de una a tres horas a la temperatura recomendada por el fabricante. La reacción se termina calentando a 65ºC durante 10 minutos o por extracción con fenol y posterior precipitación del DNA con etanol. Esta técnica se describe también en las páginas de 104 a 106 de la referencia Maniatis y col. (1982).

B. Tratamiento de DNA con polimerasa para producir extremos romos (blunt ends)

Se añaden de 50 a 500 mg/ml de fragmentos de DNA a una mezcla reaccionante en el tampón recomendado por el fabricante, New England Biolabs. La mezcla reaccionante contiene los cuatro trifosfatos de desoxinucleótido en concentraciones de 0,2 mM. La reacción se lleva a cabo durante un período de 30 minutos a 15ºC y después se finaliza calentando a 65ºC durante 10 minutos. Para los fragmentos obtenidos por rotura con endonucleasas de restricción que producen extremos proyectados 5', por ejemplo EcoRI y BamHI, se utiliza el fragmento grande o fragmento de Klenow de la DNA-polimerasa. Para los fragmentos obtenidos mediante endonucleasas que producen extremos proyectados 3', por ejemplo PstI y SacI, se utiliza la DNA-polimerasa T4. El uso de estas enzimas se describe en las páginas de 113 a 121 de la referencia de Maniatis y col. (1982).

C. Electroforesis a través de gel de agarosa y purificación de los fragmentos de DNA de los geles

La electroforesis a través de gel de agarosa se efectúa en un aparato horizontal, descrito en las páginas de 150 a 163 de la referencia Maniatis y col. El tampón utilizado es el tampón tris-borato, descrito en ella. Se tiñen los fragmentos de DNA empleando 0,5 mg/ml de bromuro de etidio, que está presente en el gel del tampón del tanque durante la electroforesis o bien se añade después de la electroforesis. Si los fragmentos se separan del gel, se emplea una agarosa que gelifique a temperatura baja y se puede adquirir de la empresa Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Después de la electroforesis, se corta el fragmento deseado, se coloca en un tubo de ensayo de plástico, se calienta a 65ºC durante 15 minutos, se extrae tres veces con fenol y se precipita dos veces con etanol. Este procedimiento es ligeramente diferente al descrito por Maniatis y col. (1982) en la página 170.

Como alternativa, el DNA puede aislarse de la agarosa mediante el kit Geneclean (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, EE. UU.).

D. Adición de fragmentos de engarce sintético a extremos de DNA

Si se desea añadir un nuevo sitio de segmentación con endonucleasa al extremo de una molécula de DNA, la molécula se trata opcionalmente en primer lugar con la DNA-polimerasa con el fin de producir extremos romos, ya descritos en la sección anterior. Se añaden de 0,1 a 1,0 mg de este fragmento a unos 10 ng del DNA engarce fosforilado, suministrado por New England Biolabs, en un volumen de 20 a 30 ml con 2 ml de la DNA-ligasa T4 de New England Biolabs, y 1 mM de ATP en el tampón recomendado por el fabricante. Después de incubar a 15ºC durante una noche se finaliza la reacción calentando a 65ºC durante 10 minutos.

Se diluye la mezcla reaccionante hasta 100 ml con un tampón apropiado para la endonucleasa de restricción que rompe la secuencia del engarce sintético. Se añaden de 50 a 200 unidades de esta endonucleasa. Se incuba la mezcla de 2 a 6 horas a una temperatura adecuada, después se somete el fragmento a electroforesis a través de gel de agarosa y se purifica del modo descrito antes. El fragmento resultante tendrá entonces extremos que se producen por segmentación (rotura) con la endonucleasa de restricción. Estos extremos son normalmente cohesivos, de modo que el fragmento resultante puede unirse fácilmente a otros fragmentos que tengan los mismos extremos cohesivos.

E. Eliminación de los fosfatos del extremo 5' de los fragmentos de DNA

Durante las etapas de clonación de plásmido, el tratamiento del plásmido con fosfatasa reduce la recirculación del vector (debatida en la página 13 de la referencia Maniatis y col.). Después de la segmentación del DNA con la endonucleasa de restricción correcta, se añade una unidad de fosfatasa alcalina intestinal de ternera, suministrada por la empresa Boehringer-Mannheim, Mannheim. Se incuba el DNA a 37ºC durante una hora y después se extrae dos veces con fenol y se precipita con etanol.

F. Unión de los fragmentos de DNA

Si se tienen que engarzar entre sí fragmentos que tienen extremos cohesivos complementarios, se incuban 100 ng de cada fragmento en una mezcla de reacción de 20 a 40 ml que contenga 0,2 unidades de DNA-ligasa T4, suministrada por New England Biolabs, en un tampón recomendado por el fabricante. La incubación se lleva a cabo durante un período de 1 a 20 horas a 15ºC. Si se tienen que engarzar fragmentos de DNA que tienen extremos romos, se incuban del modo descrito antes, excepto que se tiene que aumentar la cantidad de DNA-ligasa T4 hasta 2-4 unidades.

G. Transformación del DNA en E. coli

La cepa HB101 de E. coli se utiliza en la mayoría de ensayos. El DNA se introduce en la E. coli empleando el método del cloruro cálcico, descrito en las páginas 250 y 251 de Maniatis y col. (1982).

H. Exploración de plásmidos de la E. coli

Después de la transformación se analizan las colonias resultantes de E. coli en búsqueda del plásmido deseado mediante un proceso rápido de aislamiento de plásmidos. En las páginas de 366 a 369 de la referencia Maniatis y col. (1982) se describen dos procesos habituales.

I. Aislamiento del DNA plásmido a gran escala

Los procesos para el aislamiento de plásmidos de E. coli a gran escala se describen en las páginas de 88 a 94 de la referencia Maniatis y col. (1982).

J. Clonación en vectores fago M13

En la descripción que sigue se da por supuesto que se emplea la forma replicativa de doble hebra de los derivados de fago M13 para los procesos habituales, por ejemplo segmentación con endonucleasa de restricción, engarce, etc.

A menos que se indique expresamente lo contrario, las enzimas pueden obtenerse de la empresa Boehringer Biolabs (BRL). Se utilizan con arreglo a las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario.

K. Análisis "Southern blot"

Se trata el DNA extraído en primer lugar con enzimas de restricción, después se somete a electroforesis a través de un gel de agarosa del 0,8% al 1%, se traslada a una membrana de nitrocelulosa [Southern, E.M. (1975)] y se hibridan con el DNA a detectar, que se ha sometido previamente a un desplazamiento de mella (nick-translation) (actividades específicas de DNA de 5 x 10^{8} a 10 x 10^{8} c.p.m./mg). Se lavan los filtros tres veces durante 1 hora cada vez con una solución de citrato sódico 0,03 M y cloruro sódico 0,3M a 65ºC. El DNA hibridado se hace visible por exposición (blackening) de una película de rayos X durante un período de 24 a 48 horas.

Ejemplo 1 Metabolismo de las GA[C^{14}] con productos de traducción "in vitro" de poli(A)^{+}RNA de Cucurbita maxima

Los cotiledones de endospermo y de desarrollo de la calabaza amarilla (C. maxima) son fuentes ricas en enzimas GA biosintéticas. Se aísla el poli(A)^{+}RNA de cotiledones inmaduros (1 g) de endospermo (10 g) de semilla de C. maxima con un índice de maduración del 50% empleando el kit de aislamiento de mRNA "Fast Track" (Invitrogen). El rendimiento en poli(A)^{+}RNA de los cotiledones (17,4 mg/g de peso fresco) es mucho mayor que el obtenido del endospermo (0,75 mg/g de peso fresco).

La traducción "in vitro" de mRNA de cotiledones (1 mg) o endospermo (0,5 mg) se realiza con lisados de reticulocito de conejo (Boehringer), aplicando condiciones estándar, excepto en que la leucina y la metionina tienen una concentración de 12,5 mM. En calidad de controles se incuban lisados de reticulocito con RNA de virus de mosaico de tabaco (1 mg) y el mRNA de cotiledón (1 mg) se incuba sin lisado. Después de una incubación a 30ºC durante 2 h se suplementan las mezclas (50 ml) con co-factores de dioxigenasa (2-oxoglutarato 4 mM, FeSO_{4} 0,5 mM, ascorbato 3 mM y la catalasa (1 mg/ml)) y se añade el sustrato de GA[C^{14}] (15.000 dpm; radiactividad específica: 180 Ci/mol) en 5 ml y se incuban durante 3 h más. Se extraen los productos y se separan por cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC) en fase inversa conectada en línea con un monitor de radiactividad.

Se constata que los productos después de la traducción del poli(A)^{+}RNA de ambos tejidos en lisados de reticulocito de conejo convierten la GA_{12}[C^{14}] en GA_{15}[C^{14}] después de la incubación con co-factores apropiados y análisis por HPLC. Esta actividad de 20-oxidasa es mayor en los productos de traducción derivados del mRNA de cotiledón. No se detecta actividad después de la incubación del lisado de reticulocito con el RNA del virus del mosaico del tabaco o del mRNA de cotiledón sin el sistema de traducción.

Ejemplo 2 Metabolismo de las GA[C^{14}] con calvas de bacteriófago recombinante

Se inmunoexplora una biblioteca de cDNA amplificada en \lambdagt11 derivada de poli(A)^{+}RNA de cotiledón con un anticuerpo dirigido contra un péptido sintético (ValPheGlyGlySerAspGluSerLys) que se produce sobre la base de la secuencia de aminoácidos de un péptido resultante de la digestión en tripsina de la GA_{12}-20-oxidasa de endospermo de C. maxima [ver SEQ ID NO 7].

Se construye una biblioteca de cDNA con cebadores oligo(dT) en \lambdagt11 (Amersham) empleando el mRNA de cotiledón. Se amplifica la biblioteca total (70.000 clones) obteniéndose 3,6x10^{8} unidades formadoras de calvas (pfu)/ml de las cuales el 69% son recombinantes. Se realiza una inmunoexploración de la biblioteca amplificada con 3.600 pfu en una placa de 90 mm y utilizando como sonda el anticuerpo del péptido de la 20-oxidasa (1 mg/ml) y un segundo anticuerpo de IgG anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina.

Se obtienen siete calvas positivas y estas, al igual que una calva negativa de control, se recubren de nuevo con 50 pfu/placa y se exploran de nuevo. Se ensayan nueve calvas positivas de una placa para analizar la actividad de GA_{12}-20-oxidasa incubando cartuchos de agar (5 ml) en tubos Eppendorf que contienen la GA_{12}[C^{14}] y co-factores indicados en el ejemplo 1 en 25 ml de tampón SM. Las incubaciones duran 6 h, el rellenado con co-factores se realizan cada 2 h. Los productos se recuperan por centrifugación (15.000 rpm durante 2 min) y se separan por cromatografía HPLC en fase inversa conectada en línea con un monitor de radiactividad.

Todas las calvas son activas, dando hasta un 60% de conversión del sustrato en GA_{15}[C^{14}]. De forma similar, dos calvas positivas elegidas de cada una de las placas restantes expresan también proteína funcional; en este caso, tomando cartuchos mayores (25 ml) de agar, el sustrato se convierte por completo principalmente en GA_{24}/GA_{25}. No se obtienen positivos después de recubrir de nuevo una calva negativa y explorar de nuevo con el anticuerpo y dos calvas de esta placa, elegidas al azar, no presentan actividad de GA_{12}-20-oxidasa.

Las calvas positivas, después de la purificación, convierten la GA_{12}[C^{14}] en GA_{15}, GA_{24} y GA_{25} radiomarcadas cuando los cartuchos de agar se incuban con el sustrato y co-factores. Las calvas negativas no presentan actividad enzimática. El tamaño de los insertos de los bacteriófagos positivos se determina aplicando una reacción en cadena de polimerasa con cebadores \lambdagt11, resultando ser todos ellos de 1,4 pares de kilobases (kbp).

Ejemplo 3 Metabolismo de las GA[C^{14}] con 20-oxidasa recombinante

Se examinan las propiedades catalíticas de la proteína recombinante empleando un lisógeno de un bacteriófago simple.

Se obtiene la GA-20-oxidasa recombinante a partir de lisógeno \lambdagt11 en Y1089 esencialmente del modo descrito por Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, editorial Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989, pero empleando un tampón de extracción de lisógeno que contiene Tris-HCl 200 mM, pH 7,0 y ditiotreitol 8 mM. Se examina la actividad de la proteína incubando lisados celulares con productos previos de síntesis de GA. La capacidad de la proteína de oxidar la GA_{12}[C^{14}] depende de forma absoluta de la adición del ácido 2-oxoglutárico y se reduce en un 73 y en un 90%, respectivamente cuando se omite el Fe^{2+} o el ácido ascórbico.

Se determina también la especificidad de sustrato de la proteína (tabla 1). Se incuban diferentes partes alícuotas de los lisados celulares con 100.000 dpm de GA_{12}[C^{14}] (A) o de GA_{53}[C^{14}] (B) y co-factores, del modo descrito en 1 en un volumen total de 250 ml a 30ºC durante 4 h, añadiendo co-factores frescos después de 2 h. En C se incuban los sustratos (200.000 dpm) con 250 ml del lisado con co-factores durante 6 h, rellenando con co-factores cada 2 h. Se extraen los productos y se analizan por cromatografía HPLC y recuento radiológico y se confirma su identidad por combinación de la cromatografía de gases y la espectrometría de masas (CG-EM). Las radiactividades específicas de los productos y sustratos son las mismas. Los resultados se presentan en la tabla 1.

TABLA 1 A. Incubaciones con GA_{12}[C^{14}]

1

B. Incubaciones con GA_{53}[C^{14}]

2

C. Incubaciones con las 20-oxo-GA[C^{14}]

3

* no resuelto por la HPLC

** según indica la CG-EM contiene solamente GA_{25}[C^{14}]

*** no se confirma la identidad de la GA[C^{14}] por CG-EM.

Cuando se incuba la proteína con concentraciones crecientes de GA_{12}[C^{14}] (tabla 1A) se produce una oxidación secuencial del grupo metilo C-20 a alcohol, aldehído y ácido carboxílico, obteniéndose como productos respectivamente la GA_{15}, GA_{24} y GA_{25} marcadas radiactivamente. Se obtienen también los correspondientes productos 13-hidroxi de GA (GA_{44}, GA_{19} y GA_{27}), aunque con una eficacia menor, cuando el lisado se incuba con la GA_{53}[C^{14}] (tabla 1B). La comparación de los sustratos aldehídicos GA_{24} (no hidroxilado), GA_{19} (monohidroxilado) y GA_{23} (dihidroxilado) pone de manifiesto que la eficacia de la oxidación en los ácidos tricarboxílicos correspondientes disminuye a medida que aumenta la polaridad del sustrato (tabla 1C). Además, los correspondientes productos GA de C_{19} (GA_{9}, GA_{20} y GA_{1}), que se forman por la pérdida del C-20 en forma de CO_{2}, se obtienen en un rendimiento bajo. Estos resultados indican que una enzima sola puede catalizar cada una de las etapas que suponen la oxidación del C-20 durante la biosíntesis de la GA, incluyendo además posiblemente la pérdida del C-20, a pesar de la confirmación tendrá que esperar estudios con la enzima correspondiente obtenida a partir de tejido vegetal, en el que la producción de GA-C_{19} constituya una vía predominante.

Ejemplo 4 Secuencia de nucleótido del clon cDNA de la GA-20-oxidasa y secuencia derivada de aminoácidos

Los análisis de restricción de insertos bacteriófago amplificado por PCR indican la presencia de un sitio EcoRI interno, pero no de sitios BamHI internos. El DNA bacteriófago se obtiene después de infectar la cepa Y1090 de E. coli (Amersham; 400 ml de cultivo) y se purifica empleando un kit de purificación de fagos lambda (Qiagen). Después de soltar el inserto con BamHI, este se subclona por inserción en el sitio BamHI del pUC18 y transformación de la cepa XL1blue de E. coli. Se aíslan los plásmidos de los transformantes (kit Plasmid Midi de Qiagen) y uno se secuencia en ambas hebras por el método de terminación de cadena del didesoxinucleótido.

El clon seleccionado se ha depositado como pB11 (E. coli) en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Centre, 1815 North University Street, Peoria, Il. 61604. El número de registro es el NRRL B-21096 y la fecha del depósito es el 21 de mayo de 1993.

La secuencia de nucleótido del clon seleccionado contiene un marco abierto de lectura de 1.158 nucleótidos que codifican a una proteína de Mr 43.321, que coincide en gran manera con el valor determinado para la enzima nativa.

La secuencia contiene regiones de homología con las de las dioxigenasas de la planta clonada previamente, incluida la 3-hidroxilasa, la hiosciamina-6-hidroxilasa, el E8, un gen relacionado con la maduración de función desconocida y la oxidasa del ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico, una enzima que interviene en la producción de la hormona etileno de la planta. Las secuencias conservadas incluyen tres motivos que contienen histidina, dos de los cuales se han propuesto como sitios de fijación de Fe en el centro activo de la enzima. Los aminoácidos que se conservan en otras dioxigenasas vegetales se indican en negrita.

La secuencia del péptido contra el que se dirige el anticuerpo para la exploración de la biblioteca de expresión está presente junto al extremo N y se subraya. Tiene una diferencia (P en lugar de V) que se ha constatado posteriormente que se debe a una impureza del péptido tríptico que se secuencia. Por lo tanto, todos los clones seleccionados cuando se emplea este anticuerpo serán aproximadamente de longitud completa y, tal como se ha demostrado, codificarán a proteínas funcionales.

Expresión heteróloga de la GA-20-oxidasa de calabaza amarilla en E. coli

Cuando el inserto de cDNA del pB11, que codifica a la GA-20-oxidasa de la calabaza amarilla, se expresa en la E. coli, la proteína producida cataliza la oxidación posterior del grupo metilo del C-20. Solamente el 1% de los productos son giberelinas C_{19} biológicamente activas, formadas por pérdida del C-20 en forma de CO_{2}; el 99% de los productos tienen un grupo ácido carboxílico en C-20 y no son biológicamente activos, ni pueden convertirse en giberelinas activas. La producción de esta enzima en las plantas debería, por tanto, desviar los productos intermedios de giberelina C_{20} de la biosíntesis de las GA (principalmente la GA_{12} y la GA_{53}) hacia las formas de ácido carboxílico, reduciendo de este modo los niveles de las GA activas.

Ejemplo 5 Construcción de un gen quimérico 35S-GA-20 (el cDNA de la GA20 clonado en el pCGN1761)

La GA20-oxidasa se expresa en forma de sentido y antisentido detrás del promotor constitutivo 35S. El cDNA que codifica al gen de la GA20-oxidasa se transfiere al vector pCGN1761 que lleva el promotor de doble 35S-CaMV y el terminador tml de la transcripción sobre un plásmido derivado del pUC. La construcción del pCGN1761 se describe en el ejemplo 23, en las páginas de 39 a 41 del documento EP-A-0 392 225, que se incorpora a la presente como referencia. El fragmento BamHI 1.4 que contiene el gen de la GA20-oxidasa se escinde del plásmido basado en el pUC descrito en el ejemplo 4 y se liga a un adaptador molecular fusionado de secuencia 5'-AATTCGAACCCCTTCG-3'/5'-GATCCGAAGGGGTTCG-3' (New England Biolabs, nº 1105 y nº 1106), convirtiendo de este modo los extremos BamHI en extremos EcoRI. El producto de ligación se purifica y se clona en el sitio EcoRI del pCGN1761 empleando técnicas estándar. Se recuperan las colonias que llevan el cDNA en orientaciones del mismo sentido y antisentido con respecto al promotor de doble 35S y se llaman pCGN1761-35S-GA20ox-A y pCGN1761-35S-GA20ox-B, respectivamente.

Ejemplo 6A

Transferencia de la fusión 35S-GA-20 de los pCGN1761-35S-GAox-A y pCGN1761-35S-GAox-B al vector binario pCIB2001

Se escinde el cassette de expresión 35S-GA20 de las construcciones pCGN1761-35S-GAox-A y pCGN1761-35S-GAox-B recién descritas cortando en primer lugar con el HindIII, volviendo romo el plásmido linealizado por incubación con la DNA-polimerasa T4 y después cortando con el HpaI para liberar el inserto 35S-GA20-tml. Este se clona en el sitio StuI del pCIB2001 generando vectores binarios que expresan el gen GA20ox en orientación del mismo sentido y antisentido detrás del promotor de doble 35S.

Ejemplo 6B

Transferencia de la fusión 35S-GA-20 de los pCGN1761-35S-GAox-A y pCGN1761-35S-GAox-B al vector de transferencia genética directa pCIB3064

Se escinde el cassette de expresión 35S-GA20 de las construcciones pCGN1761-35S-GAox-A y pCGN1761-35S-GAox-B descritas en el ejemplo 5 cortando en primer lugar con el HindIII, volviendo romo el plásmido linealizado por incubación con la DNA-polimerasa T4 y después cortando con el HpaI para liberar el inserto 35S-GA20-tml. Este fragmento se clona en el sitio HindIII (convertido en romo por incubación con la DNA-polimerasa T4) del pCIB3064 [Koziel y col. (1993)] generando vectores para la transferencia genética directa, utilizando la selección de genes PAT, expresando el gen GA20ox en orientación del mismo sentido y antisentido detrás del promotor de doble 35S.

Ejemplo 7 Construcción de un gen quimérico PR1-GA-20 (el cDNA de la GA20 clonado en el pCIB1004)

El cDNA que codifica al gen de la GA20-oxidasa se transfiere al vector pCIB1004 para colocarlo bajo el control del promotor de genes PR1a inducible químicamente. El pCIB1004 se segmenta con Ncol y la proyección (overhang) 3' se convierte en roma por incubación con la DNA-polimerasa T4. La construcción del pCIB1004 se describe en el ejemplo 21B de la página 36 del documento EP-A 0 332 104, que se incorpora a la presente como referencia. A continuación se ligan los engarces (linkers) no fosforilados BamHI (New England Biolabs nº 1003) a los extremos y la segmentación con el BamHI suelta un inserto que se descarta. Se escinde el gen que contiene GA20 de 1,4 kb de la construcción del ejemplo 4 por segmentación con BamHI y se liga al sitio BamHI del fragmento derivado de pCIB1004, fusionando de este modo el gen GA20 con el promotor PR1a en ambas orientaciones. Los plásmidos resultantes se llaman pCIB1004-PR1-GA20ox-A (orientación del mismo sentido) y pCIB1004-PR1-GA20ox-B (orientación antisentido).

Ejemplo 8A Transferencia de la fusión PRA1-GA20 de los pCGN1004-PR1-GAox-A y pCGN1004-PR1-GAox-B al vector binario pCIB2001

Se traslada el cassette de expresión PR-GA20 del constructo derivado de pCIB1004 por digestión parcial con KpnI, recuperación de un fragmento de tamaño 5,6 kb y ligación de este fragmento al sitio KnpI del pCIB2001. Esto genera vectores binarios que llevan el gen GA20ox para expresar detrás del promotor PR1a regulado químicamente en orientaciones del mismo sentido y antisentido.

Ejemplo 8B Transferencia de la fusión PRA1-GA20 de los pCGN1004-PR1-GAox-A y pCGN1004-PR1-GAox-B al vector de transferencia genética directa pCIB3064

Se traslada el cassette de expresión PR-GA20 del constructo derivado del pCIB1004 (ejemplo 7) por digestión parcial con KpnI, recuperación de un fragmento de tamaño 5,6 kb, incubación con DNA-polimerasa T4 para convertir los extremos en romos y ligación de este fragmento al sitio HindIII (convertido en romo por incubación con la DNA-polimerasa T4) de vectores que generan pCIB3064 para la transferencia genética directa, utilizando la selección de genes PAT, expresando el gen GA20ox en orientación del mismo sentido y antisentido detrás del promotor PR1a regulado químicamente.

Ejemplo 9 Construcción de un gen quimérico Pth-GA-20

Se emplea un promotor específico de médula (pith) de maíz para expresar el gen GA20 en orientación del mismo sentido y antisentido de manera específica de tejido. El pCGN1761 se segmenta (rompe) con XhoI y Sa1I y se trata con DNA-polimerasa T4 para convertir los extremos en romos. Se purifica a través de gel el mayor de los dos fragmentos resultantes. Se escinde del plásmido pCIB4433 (WO 93/07278) un fragmento BamHI que lleva un promotor específico de médula y se liga a un fragmento de 1,4 kb que lleva el gen GA20-oxidasa. El plásmido pCIB4433 se ha depositado en la Agricultural Research Culture Collection (NRRL) (1818 N. University St., IL 61604) en los términos del Tratado de Budapest con el número de depósito NRRL B-18999 con fecha 21 de setiembre de 1992. Después de la ligación se trata la mezcla con DNA-polimerasa T4 y se ligan los fragmentos romos resultantes al fragmento derivado del pCGN1761. Por mapeo de restricción y análisis de secuencia de los clones de E. coli obtenidos es posible identificar los clones orientados con el promotor Pth que conducen a la expresión del gen GA20 sentido en la región hacia el extremo 5' (upstream) del terminador de transcripción tml y los clones orientados con el promotor Pth que conducen a la expresión del gen GA20 en orientación antisentido, en la región hacia el extremo 5' (upstream) del terminador tml. Estos clones se denominan pCGN1761-Pth-GA20ox-A y pCGN1761-Pth-GA20ox-B, respectivamente.

Ejemplo 10A Transferencia de la fusión pepC-GA20 del pCGN1761-Pep-GA20ox-A y pCGN1761-Pep-GA20ox-B al vector binario pCIB2001

Es escinde el cassette Pth-GA20ox de los pCGN1761-Pth-GA20ox-A y pCGN1761-Pth-GA20ox-B empleando BgIII y HpaI y se clona en los sitios correspondientes del pCIB2001. Esto genera vectores binarios en los que el GA20ox está clonado en orientación del mismo sentido y antisentido bajo la regulación del promotor Pth, específico de la médula (pith).

Ejemplo 10B Transferencia de la fusión PepC-GA20 del pCGN1761-Pep-GA20ox-A y pCGN1761-Pep-GA20ox-B al vector de transferencia genética directa pCIB3064

Es escinde el cassette Pth-GA20ox de los pCGN1761-Pth-GA20ox-A y pCGN1761-Pth-GA20ox-B cortando en primer lugar con BgIII, convirtiendo en romo el plásmido linealizado por tratamiento con DNA-polimerasa T4 y después cortando con HpaI para liberar el inserto Pth-GA20ox. Este se clona en el sitio HindIII (convertido en romo por incubación con DNA-polimerasa T4) del pCIB3064, generando vectores para la transferencia genética directa, utilizando la selección de genes PAT, expresando el gen GA20ox en orientación sentido y antisentido bajo la regulación del promotor Pth, específico de la médula.

Ejemplo 11 Construcción del vector binario pCIB2001

En primer lugar se crea el TJS75 Kan por digestión del pTJS75 [Schmidhauser y col., J. Bacteriol. 164, 446-455,1985] con NarI para escindir el gen de tetraciclina y después se inserta un fragmento AccI del pUC4K [Messing y col., Gene 19, 259-268, 1982] que lleva un gen Npt I. Se obtiene el pCIB 200 por ligación de engarces XhoI al fragmento EcoRV del pCIB7 (que contiene los límites izquierdo y derecho del T-DNA, un gen quimérico nos/nptII seleccionable y el poliengarce pUC [Rohtstein y col., Gene 53, 153-161, 1987] y por clonación del fragmento digerido con XhoI en el TJS75 Kan digerido con salI. El pCIB2001 se obtiene por clonación de un nuevo poliengarce en el sitio de clonación múltiple del pCIB200 para lograr más sitios de enzima de restricción únicos.

Transformación de plantas

El DNA recombinante según la invención que contiene una secuencia de DNA que codifica a la GA20-oxidasa puede introducirse en una célula vegetal empleando un sistema de transformación de Agrobacterium bien conocido o mediante la entrega genética directa que consiste, por ejemplo, en la microinyección [Crossway y col. (1986); Neuhaus (1987)], la electroporación [Riggs y col. (1986)], la transferencia genética directa [Paszkowski y col. (1984)] o la aceleración balística de partículas empleando por ejemplo dispositivos suministrados por Agracetus Inc., Madison, Wisconsin y DuPont Inc., Wilmington, Delaware.

La detección de las células vegetales transformadas puede realizarse empleando sistemas de selección idóneos, bien conocidos en la técnica. Un gen marcador de selección idóneo puede estar presente en el vector de expresión de la planta durante la transformación de la misma o bien puede proporcionarse a través de uno de los plásmidos de selección aplicados convencionalmente, del modo descrito por Rothstein y col. (1987), que contiene un gen seleccionable de resistencia a la higromicina. Dicho plásmido puede introducirse en la célula vegetal junto con el DNA recombinante según la invención que contiene una secuencia de DNA que codifica a la GA20-oxidasa aplicando una co-transformación.

Ejemplo 12 Transformación de la Nicotiana tabacum mediada por el Agrobacterium tumefaciens

Se cortan explantes groseros de 5 a 10 mm de hojas jóvenes de 3 a 5 cm de longitud y de un tercio a un sexto del ápice de N. tabacum cv "Xanthi nc" y se cultivan en condiciones axénicas [Facciotti y Pilet, 1979] en medio MS sólido [Murashige y Skoog, 1962] que contiene un 0,7% de fitagar (Gibco-BRL), 1 mg/l de IAA, 0,15 mg/l de cinetina. Se extienden estos explantes sobre medio MS sólido que contiene un 0,6% de fitagar, 40 mg/l de sulfato de adenina, 2 mg/l de IAA y 2 mg/l de cinetina, sobre la superficie de dicho medio se coloca un filtro Whatman nº 1 y se incuba en la oscuridad a 24ºC durante 24 h. Se cultivan durante una noche las cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios descritos anteriormente en un medio LBMG a 30ºC en un agitador que gira a 180 rpm. Se impregnan los explantes en una suspensión bacteriana de 3,3 x 10^{8} células/ml durante 5 minutos aprox., se envasan en servilletas de papel esterilizadas y se extienden de nuevo sobre las mismas placas. Pasadas 48 horas se colocan los explantes en un medio de selección que contiene el mismo medio de placa que antes más 350 mg/l de cefotaxima y 100 mg/l de canamicina. Se coloca el tejido de control cultivado simultáneamente en el mismo medio, pero sin canamicina. Se trasladan los explantes a un medio fresco cada dos semanas. Se recolectan los brotes de 4 a 8 semanas después del cultivo simultáneo, se colocan en tubos de cultivo de 50 ml con 25 ml de medio MS sólido que contiene un 0,6 de fitagar, 1 mg/l de IBA, 350 mg/l de cefotaxima y 100 mg/l de canamicina. Se cultivan los tejidos de 24 a 28ºC, 12 horas de luz, 12 horas de oscuridad, intensidad lumínica de 6700 a 8400 lux. Los brotes echan raíces al cabo de 1-2 semanas y entonces se trasplantan a una mezcla de plantación en macetas de 4'' y se colocan en el "fitotrón de plantas transgénicas".

Ejemplo 13 Transformación de disco foliar de tabaco

Se cultivan cepas de Agrobacterium que contienen vectores binarios descritos anteriormente en medio de sales glutamato de pH ajustado a 5,6 durante un tiempo de 18 a 24 horas, dicho medio se suplementa con un 0,15% de manita, 50 mg/ml de canamicina, 50 mg/ml de espectinomicina y 1 mg/ml de estreptomicina antes de diluirlo a una densidad óptica OD_{600} de 0,2 en el mismo medio sin los antibióticos. Se cultivan las bacterias durante un tiempo de tres a cinco horas antes de diluir hasta una OD_{600} de 0,2 a 0,4 para la inoculación de discos de 5 a 7 mm, troquelados de hojas de N. tabacum cv xanthi que se han cultivado en condiciones asépticas en contenedores GA7, con arreglo a una modificación de los métodos de Horsch y col. (1985).

Se mantienen los discos foliares en sales mayor y menor de Murashige y Skoogs (MS) que contienen un 0,7% de agar, 1 mg/l de benciladenina y 1 mg/ml de NAA durante dos días antes de transferirlos a los mismos medios que contienen 50 mg/ml de canamicina, 100 mg/ml de carbenicilina y 100 mg/ml de mefoxina. Se escinden los brotes que se forman en los discos y se propagan hasta que se obtienen seis plántulas por subcultivo de las puntas de los brotes en medio MS que contiene 50 mg/ml de canamicina en contenedores GA7.

Se hace que las plántulas saquen raíces en medio que no contiene hormonas y 50 mg/ml de canamicina, se transfieren a suelo y se fortalecen en un fitotrón antes de transferirlas a un invernadero para el tratamiento de inducción con reguladores químicos. En el tiempo de floración se inducen las flores a la autopolinización. Se recogen las semillas después de la maduración.

Ejemplo 14 Producción de callos y plantas de tabaco transgénico

Para transformar el callo formado a partir de discos foliares se emplean cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios descritos anteriormente. Se mantiene el callo formado en medio de selección MSBN que contiene canamicina en un medio de crecimiento de callo que contiene sales mayor y menor de MS y Fe-EDTA (Gibco, nº 500-1117; 4,3 g/l), vitaminas MS, 100 mg/l de mio-inositol, 20 g/l de sucrosa, 2 mg/l de NAA y 0,3 mg/l de cinetina.

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El callo puede utilizarse para regenerar plantas transgénicas por transferencia de piezas de callo al medio MSBN y con arreglo a los métodos descritos.

Ejemplo 15 Transformación de zanahorias

Se cultivan del modo descrito en el ejemplo 13 las cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios descritos antes. Las bacterias, diluidas hasta una OD_{600} de 0,2 a 0,4, se utilizan seguidamente para la inoculación de discos cortados de zanahorias esterilizadas superficialmente.

Para esterilizar la superficie de zanahorias, estas se pelan y se sumergen durante 20 minutos en una solución de clorox al 10%. Se enjuagan las zanahorias con agua estéril, se cortan en rebanadas de 5 mm y se colocan por su cara basal sobre agar acuoso. A continuación se aplican de 20 a 50 ml de bacterias sobre la superficie superior de los discos. Pasados 7 días, se trasladan los discos a sales MS que contienen un 0,7% de agar, 3% de sucrosa, 0,1 mg/l de 2,4-D, 50 mg/ml de canamicina, 100 mg/ml de carbenicilina y 100 mg/ml de mefoxina. Se escinde el callo formado alrededor del disco cambial y se coloca en agar MS del 0,7% suplementado con un 3% de sucrosa, 0,1 mg/l de 2,4-D, 50 mg/ml de canamicina, 100 mg/ml de carbenicilina y 100 mg/ml de mefoxina. Después de que el callo haya crecido se corta en piezas pequeñas y se coloca al azar en cuatro placas del mismo medio.

Ejemplo 16 Transformación de girasol

Se cultivan del modo descrito cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios descritos anteriormente. Las bacterias, diluidas hasta una OD_{600} de 0,2 a 0,4, se utilizan después para la inoculación de tallos de plantas de girasol, preparados del modo siguiente:

Se sumergen semillas de girasol durante 10 min en captano del 10% y después 10 min en clorox del 10% y se enjuagan con agua esterilizada. Se quitan los recubrimientos de la semilla y se hacen germinar las semillas en agua que contiene un 0,7% de agar, en la oscuridad, durante tres días, después de lo cual se colocan en un incubador de laboratorio a 23ºC durante 12 horas seguidas. Se cultivan los plantones durante una semana antes de su decapitación e inoculación de las bacterias sobre la superficie de tallo cortada.

Pasada una semana se cortan los tallos inoculados y se colocan en sales MS que contienen un 0,7% de agar, un 3% de sucrosa, 2 mg/ml de NAA, 1 mg/ml de BAP, 100 mg/ml de carbenicilina, 100 mg/ml de mefoxina y 50 mg/ml de canamicina. Se traslada el callo a medio fresco cada dos semanas hasta que se obtenga una cantidad suficiente para 4 placas. La mitad del callo cultivado a partir de cepas virulentas de Agrobacterium se traslada a un medio sin hormonas que contiene 50 mg/ml de canamicina.

Ejemplo 17 Transformación del tomate

Se cultivan del modo descrito en el ejemplo 13 las cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios descritos antes. Las bacterias, diluidas hasta una OD_{600} de 0,2 a 0,4, se utilizan seguidamente para la inoculación de tallos de tomate preparados del modo siguiente.

Se sumergen las semillas de tomate durante 20 min en clorox del 10% y se enjuagan con agua esterilizada. Las semillas germinan en agua que contiene un 0,7% de agar en la oscuridad, durante tres días, después se colocan en un incubador de laboratorio a 23ºC durante 12 horas seguidas. Se cultivan las semillas durante una semana antes de la decapitación e inoculación de las bacterias sobre la superficie del tallo cortado.

Pasada una semana se cortan los tallos inoculados y se colocan en sales MS que contienen un 0,7% de agar, un 3% de sucrosa, 2 mg/ml de NAA, 1 mg/ml de BAP, 100 mg/ml de carbenicilina, 100 mg/ml de mefoxina y 50 mg/ml de canamicina. Se traslada el callo a medio fresco cada dos semanas hasta que se obtenga una cantidad suficiente para 4 placas.

Ejemplo 18 Transformación del algodón

Se cultivan del modo descrito las cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios descritos antes. Las bacterias, diluidas hasta una OD_{600} de 0,2 a 0,4, se utilizan seguidamente para la inoculación de cotiledones de algodón preparados del modo siguiente.

Se sumergen las semillas de algodón durante 20 min en clorox del 10% y se enjuagan con agua esterilizada. Las semillas germinan con agua que contiene un 0,7% de agar, en la oscuridad. Se cultivan las semillas durante una semana antes de la inoculación de las bacterias sobre la superficie del cotiledón. Se deja que los cotiledones inoculados formen un callo antes de cortarlos y colocarlos en sales MS que contienen un 0,7% de agar, 3% de sucrosa, 100 mg/ml de carbenicilina y 100 mg/ml de mefoxina. Se traslada el callo a medio fresco cada tres semanas hasta que se obtenga una cantidad suficiente para 4 placas. La mitad del callo cultivado a partir de cepas virulentas de Agrobacterium se traslada a un medio sin hormonas que contiene 50 mg/ml de canamicina.

Ejemplo 19 Obtención de un tipo especial de callo de Zea mays, Elite Inbred line Funk 2717

Se cultivan plantas de la variedad Inbred Line Funk 2717 de Zea mays hasta la floración en el invernadero y se autopolinizan. Se retiran de las plantas las espigas inmaduras que contienen embriones de aproximadamente 2-2,5 mm de longitud y se esterilizan durante 20 minutos en una solución de clorox al 10%. Se retiran asépticamente los embriones de los núcleos y se colocan en placas con el eje del embrión hacia abajo en medio OMS que contiene 0,1 mg/l de 2,4-D, un 6% de sucrosa y 25 mM de L-prolifina solidificada con un 0,24% de Gelrite® (medio de iniciación). Después de un cultivo de dos semanas a 27ºC y en la oscuridad se quita del embrión el callo desarrollado en el escutelo y se coloca en placas sobre medio B5 (Gamborg y col., 1968) que contiene 0,5 mg/l de 2,4-D y se solidifica con un 0,24% de Gelrite®. Se subcultiva el callo cada dos semanas a medio fresco. Después de un total de ocho semanas después de colocar los embriones en el medio de iniciación se identifica el tipo especial de callo por su morfología característica. Este callo se subcultiva después en el mismo medio. Pasado un período adicional de dos meses se traslada el callo y se subcultiva en serie en medio N6 que contiene 2 mg/l de 2,4-D y se solidifica con Gelrite®.

Ejemplo 20 Preparación de una suspensión de cultivo de Zea mays, Elite Inbred Funk 2717

Se subcultiva el callo recién descrito durante un total de seis meses, como mínimo. El tipo de callo elegido para el subcultivo es relativamente no mucilaginoso, granular y muy friable, de modo que se separa en agregados celulares individuales pequeños después de haberse colocado en medio líquido. No se retienen los cultivos que contienen agregados de células grandes y expandidas. Se colocan partes alícuotas de aproximadamente 500 mg del callo especial de Zea mays elite inbred funk 2717 en 30 ml de medio N6 que contiene 2 mg/l de 2,4-D en matraces Delong de 125 ml. Después de una semana de cultivo a 26ºC en la oscuridad en un agitador giratorio (130 rpm, 2,5 cm de recorrido) se sustituye el medio por medio fresco. Después de otra semana se subcultivan de nuevo las suspensiones de esta manera. Entonces se inspeccionan los cultivos y se retienen los que no presentan un número elevado de células expandidas. Se descartan los cultivos en suspensión que contienen agregados de células grandes y expandidas. El tejido preferido consiste en agregados celulares de división citoplasmática densa, que tienen una superficie característica más lisa que la del tipo usual de agregados celulares. Los cultivos que se retienen tienen por lo menos un 50% de células representadas en estos agregados pequeños. Esta es la morfología deseada. Estas suspensiones tienen además una velocidad alta de crecimiento, con un tiempo de doblado de menos de una semana. Los cultivos en suspensión se subcultivan cada semana transfiriendo 0,5 ml de PCV a 25 ml de medio fresco. Después de subcultivar de este modo durante un período de cuatro a seis semanas, los cultivos aumentan de dos a tres veces por cada semana de subcultivo. Se retienen para el subcultivo posterior los cultivos en los que más del 75% de las células presentan la morfología deseada. Se mantienen las líneas eligiendo siempre para el subcultivo el frasco cuyo contenido presenta la mejor morfología. Se practica en algunos casos una filtración periódica cada dos semanas a través de tamices de acero inoxidable de 630 mm de tamaño de poro para aumentar la dispersión de los cultivos, pero no es necesaria.

Ejemplo 21 Preparación de protoplastos de cultivos de Zea mays en suspensión

Se incuban de 1 a 1,5 ml de PCV de las células anteriores cultivadas en suspensión en un volumen de 10 a 15 ml de mezcla filtrada en condiciones estériles que contiene un 4% de celulasa RS con un 1% de Rhozyme en una solución de KMC (8,65 g/l de KCl, 16,47 g/l de MgCl_{2}.6H_{2}O y 12,5 g/l de CaCl_{2}.2H_{2}O, pH 5,6). La digestión se efectúa a 30ºC en una plataforma de agitación lenta durante un período de 3 a 4 horas. Se hace el seguimiento de la obtención de protoplastos liberados con un microscopio invertido. Los protoplastos liberados se recogen del modo siguiente.

Se filtra la preparación a través de un tamiz de ancho de malla 100 mm, después en un tamiz de malla 50 mm. Se lavan los protoplastos a través de tamices con un volumen de sal KCM igual al volumen original de la solución enzimática. Se colocan 10 ml de la preparación de protoplastos en cada uno de diversos tubos de plástico desechables de centrífuga y se coloca debajo una capa de 1,5 a 2 ml de una solución 0,6 M de sucrosa (tamponada a pH 5,6 con MES del 0,1% y KOH). Se centrifuga el tubo de 60 a 100 rpm durante 10 minutos y se recogen con pipeta los protoplastos que nadan en la interfase y se colocan en un tubo fresco. Se suspende de nuevo la preparación de protoplastos en 10 ml de una solución fresca de sal KMC y se centrifuga durante cinco minutos con una velocidad de 60 a 100 rpm. Se retira el líquido sobrenadante y se descarta y se suspenden de nuevo los protoplastos suavemente en la gota restante y después se añaden gradualmente 10 ml de una solución KMC de concentración 13/14. Se centrifuga de nuevo durante cinco minutos, se retira de nuevo el líquido sobrenadante y se suspenden los protoplastos de nuevo en una solución KMC de concentración 6/7. Se toma una parte alícuota para el recuento y se sedimentan de nuevo los protoplastos por centrifugación. Se suspenden de nuevo los protoplastos a razón de 10^{7} por ml en medio KM-8p o en manita 0,5 M que contenga MgCl_{2} 6 mM o en otro medio idóneo que pueda utilizarse en la transformación, tal como se describe en los ejemplos siguientes. Esta suspensión de protoplastos se utiliza para la transformación y se cultiva del modo descrito a continuación.

Ejemplo 22 Transformación de protoplastos de Zea mays por electroporación

A. Todas las etapas, salvo el choque térmico, se efectúan a temperatura ambiente (de 22 a 28ºC). Se resuspenden los protoplastos de la última etapa anterior en manita 0,5 M que contenga un 0,1% de MES y MgCl_{2} 6 mM. Se mide la resistencia de esta suspensión en una cámara de un Dialog Electroporator y se ajusta de 1 a 1,2 kL empleando una solución 300 mM de MgCl_{2}. Se someten los protoplastos a choque térmico sumergiendo el tubo que contiene la muestra en un baño de agua a 45ºC durante cinco minutos, después se enfría a temperatura ambiente sobre hielo, se añaden 4 mg de plásmido linealizado y 20 mg de DNA de soporte de timo bovino a partes alícuotas de 0,25 ml de esta suspensión. Se añaden a los protoplastos 0,125 ml de una solución de PEG del 24% (PM 8000) en manita 0,5 M que contenga MgCl_{2} 30 mM. Se mezcla bien esta mezcla, pero cuidadosamente, y se incuba durante 10 minutos. Se transfiere la muestra a la cámara del electroporador y se someten las muestras a pulsos tres veces a intervalos de 10 segundos, en voltajes iniciales de 1500, 1800, 2300 o 2800 Vcm^{-1} y un tiempo de disminución exponencial de 10 mseg.

Se cultivan los protoplastos del modo siguiente. Se extienden las muestras en cápsulas petri de 6 cm a temperatura ambiente. Pasados de 5 a 15 minutos se añaden 3 ml de medio KM-8p que contenga un 1,2% de agarosa SeaPlaque y 1 mg/l de 2,4-D. Se mezclan bien la agarosa y los protoplastos y se deja gelificar el medio.

B. Se repite el procedimiento con una o varias de las modificaciones siguientes.

La resistencia de la preparación de protoplastos se ajusta de 0,5 a 0,7 kL.

El PEG utilizado es PEG de PM 4000.

No se añade PEG, o bien se añade la mitad del volumen de PEG del 12%.

Se aplican los pulsos a intervalos de tres segundos.

Se extienden los protoplastos después de la electroporación en cápsulas colocadas sobre una placa enfriada a una temperatura de 16ºC.

Se colocan los protoplastos en tubos después de la etapa de la electroporación, se lavan con 10 ml de una solución KMC de concentración 6/7 o con una solución W5 (que contiene 380 mg/l de KCl, 18,375 g/l de CaCl_{2}.2H_{2}O, 9 g/l de NaCl; 9 g/l de glucosa, pH 6,0), después se recogen por centrifugación a 60 rpm durante 10 minutos, se suspenden de nuevo en 0,3 ml de medio KM y se extienden en placas del modo indicado en el apartado A.

No se añade el DNA del soporte del timo bovino.

Ejemplo 23 Transformación de protoplastos de Zea mays por tratamiento con PEG

A. Se resuspenden los protoplastos de la última etapa anterior en una solución 0,5 M de manita que contiene MgCl_{2} de 12 a 30 mM. Se efectúa un choque térmico a 45ºC durante cinco minutos, del modo descrito. Se distribuyen los protoplastos en partes alícuotas para la transformación en tubos de centrífuga, 0,3 ml de protoplastos suspendidos por tubo. Durante los 10 minutos siguientes se añade lo siguiente: DNA y solución de PEG (PM 6000, al 40% que contiene Ca(NO_{3})_{2} 0,1 M y manita 0,4 M; pH de 8 a 9 con KOH) para llegar a una concentración final de PEG del 20%. Se incuban las partes alícuotas durante 30 minutos con agitación suave ocasional y después se colocan los protoplastos en cápsulas petri (0,3 ml de la suspensión original de protoplastos por cápsula de 6 cm de diámetro) y se cultivan del modo descrito.

B. Se repite el procedimiento y se lavan los protoplastos después de 30 minutos de incubación en la solución PEG anterior, añadiendo 0,3 ml de solución de W5 cinco veces a intervalos de dos a tres minutos. Se centrifuga la suspensión de protoplastos, se retira el líquido sobrenadante y se cultivan los protoplastos del modo indicado.

C. Se repite lo anterior con la modificación de que la concentración final de PEG se sitúa entre el 13 y el 25%.

Ejemplo 24 Regeneración de callo de protoplastos

Se mantienen las placas que contienen los protoplastos en agarosa a 26ºC en la oscuridad. Pasados 14 días aparecen colonias a partir de los protoplastos. Se traslada la agarosa que contiene las colonias a la superficie de una cápsula petri de 9 cm de diámetro que contiene 30 ml de un medio N6 que contiene 2 mg/l de 2,4-D, solidificado con un 0,24% de Gelrite. Este medio se denomina 2N6. Se prosigue el cultivo del callo a 26ºC en la oscuridad y se subcultivan piezas de callo cada dos semanas en medio 2N6 sólido fresco.

Ejemplo 25 Selección de callo transformado de Zea mays

Se repite el procedimiento del ejemplo anterior con la modificación de que se añade un agente de selección apropiado al medio 2N6 con el fin de seleccionar las células transformadas.

Ejemplo 26 Regeneración de plantas de maíz

A. Se coloca callo en medio 2N6 para mantenimiento y en medio ON6 (que contiene medio N6 al que le falta el 2,4-D) y en medio N61 (que contiene medio N6 que contiene 0,25 mg/l de 2,4-D y 10 mg/l de cinetina) para iniciar la regeneración. Se cultiva el callo en medios ON6 y N61 en la luz (16 horas/día de luz de 840 a 8400 lux de lámparas fluorescentes blancas). Después de dos semanas se traslada el callo del medio N61 al medio ON6, dado que prolongar el tiempo en el medio N61 es perjudicial. Se subcultiva el callo cada dos semanas incluso si el callo se ha trasladado de nuevo a una formulación del mismo medio. Al cabo de un período de cuatro a ocho semanas aparecen las plántulas. Una vez las plántulas alcanzan por lo menos 2 cm de altura se trasladan a un medio ON6 en contenedores GA7. Se forman raíces en un período de dos a cuatro semanas y cuando las raíces tienen un aspecto bien formado, capaz de soportar el crecimiento, se trasladan las plántulas a un suelo en macetas de turba, a la sombra durante los primeros días (de cuatro a siete días). A menudo es útil invertir la copa de plástico transparente sobre los trasplantes durante dos o tres días para facilitar el fortalecimiento. Una vez se han consolidado las plantas, se tratan como plantas normales de maíz y se cultivan hasta la madurez en el invernadero. Con el fin de obtener progenie se autopolinizan las plantas o se cruzan con el tipo salvaje.

B. Se repite el ejemplo anterior con la modificación de que se añade un agente apropiado de selección al medio utilizado para mantener el callo.

Ejemplo 27 Producción de plantas de maíz transgénico Tejido

Se escinden embriones inmaduros de maíz, de longitud aprox. 1,5-2,5 mm, de una espiga del genotipo 6N615 14 ó 15 días después de la polinización. Se cultiva la planta madre en el invernadero. Antes de la escisión, se esteriliza la superficie de la espiga con clorox del 20% durante 20 minutos y se enjuaga 3 veces con agua esterilizada. Se colocan 36 embriones individuales por placa por el lado del escutelo en una superficie de 2 cm cuadrados, en un medio de iniciación de callo y después del autoclave se añaden el 2DG4 + 5 clorambeno (sales mayores N6, sales menores B5, hierro MS, 2% de sucrosa, con 5 mg/l de clorambeno, 20 mg/l de glucosa y 10 ml de adiciones G4, ver tabla 1).

TABLA 1 Adiciones G4

Ingrediente por litro de medio

caseína hidrolizada 0,5 g

prolina 1,38 g

ácido nicotínico 0,2 mg

piridoxina-HCl 0,2 mg

tiamina-HCl 0,5 mg

colina-HCl 0,1 mg

riboflavina 0,05 mg

biotina 0,1 mg

ácido fólico 0,05 mg

pantotenato Ca 0,1 mg

ácido p-aminobenzoico 0,05 mg

B12 0,136 g

Bombardeo

Se realiza el bombardeo del tejido empleando un dispositivo PDS-1000He de Biolistics. Se coloca el tejido en una bandeja de 8 cm debajo de la bandeja de la pantalla de paro. Se bombardea el tejido una vez con una solución de DNA/microsoporte de oro, 101, secada en el macrosoporte. La pantalla de paro que se utiliza está troquelada a mano empleando una pantalla de talla de acero inoxidable 10x10. Se emplean discos de rotura de un valor de 1550 psi. Después del bombardeo, los embriones se cultivan a 25ºC en la oscuridad.

Preparación del DNA para la entrega

El microsoporte se prepara esencialmente con arreglo a las instrucciones entregadas junto con el dispositivo de Biolistics.

Formación de callo

Se trasladan los embriones a un medio de iniciación de callo con 3 mg/l de PPT 1 día después del bombardeo. Se puntúan los embriones atendiendo a la iniciación del callo al cabo de 2 y 3 semanas del bombardeo. Todas las respuestas se trasladan al medio de mantenimiento del callo, medio 2DG4 + 0,5 2,4-D complementado con un agente apropiado de selección, que depende del gen marcador de selección usado. El medio de mantenimiento de callo son las sales mayores N6, sales menores B5, hierro MS, 2% de sucrosa, con 0,5 mg/l de 2,4-D, 20 mg/l de glucosa y 10 ml de adiciones G4 después de tratar en autoclave. Se subcultiva el callo embriogénico cada 2 semanas en medio fresco de mantenimiento, que contiene un agente apropiado de selección. Todos los callos se incuban a 25ºC y en la oscuridad.

La respuesta a la formación de callos de tipo I es del 18%. Cada embrión que produce callo se cultiva como un hecho individual que da lugar a una línea individual.

Regeneración

Después de 12 semanas de selección se retira el tejido del medio de mantenimiento de callo con un agente apropiado de selección y se coloca en el medio de regeneración y se incuba a 25ºC empleando un fotoperíodo de 16 horas de luz (50 E. m-2, s-1)/8 horas de oscuridad. El medio de regeneración es el 0,25MS3S5BA (0,25 mg/l de 2,4-D, 5 mg/l de BAP, sales MS, 3% de sucrosa) durante 2 semanas y posterior subcultivo en medio MS3S para la regeneración de las plantas. Pasadas de 4 a 10 semanas se retiran las plantas y se ponen en contenedores GA 7.

Ejemplo 28 Preparación de suspensiones embriogénicas del tejido de Dactylis glomerata L. (pasto ovillo)

A. Se inicia un callo embriogénico a partir de secciones basales de las hojas más jóvenes de plantas de pasto ovillo (Dactylis glomerata L.) cultivadas en invernadero, del modo descrito por Hanning y Conger (1982). Se esteriliza la superficie de las hojas por inmersión en una dilución 1:10 de una solución de clorox (hipoclorito sódico al 5,25%; The Clorox Company, Oakland, Ca.) durante unos 10 minutos y después se corta asépticamente en segmentos pequeños de 1 a 5 mm de longitud o de diámetro. Se colocan estos segmentos en placas sobre medio SH-30 estéril que contiene un 0,8% de agarosa como agente gelificante. El callo y/o las estructuras embriogénicas aparecen al cabo de 2 a 6 semanas después de la extensión en placas, efectuando el cultivo a 25ºC. Se mantiene el callo embriogénico por subcultivo en medio SH-30 fresco cada 2-4 semanas y por cultivo a 25ºC en la oscuridad.

B. Se inician los cultivos en suspensión embriogénica por colocación en placas de aproximadamente 0,5 g de peso fresco de callo embriogénico en 50 ml de medio líquido, descrito por Gray y Conger (1985) que contiene dicamba 45 mM y 4 g/litro de caseína hidrolizada. Se mantienen los cultivos en suspensión a 27ºC durante un fotoperíodo de 16 horas de luz (3300 lux) y 8 horas de oscuridad en un agitador giratorio que se mueve a una velocidad de 130 rpm en matraces Delong de 125 ml con una tapa metálica y parafina. Después de unas cuatro semanas se dejan sedimentar los terrones grandes durante 30 segundos y se retiran partes alícuotas de 10 ml del medio sobrenadante que contiene racimos de células pequeñas y se transfieren a 50 ml de medio fresco. Este proceso se repite cada 3-4 semanas empleando los cultivos mejor realizados, a juzgar por el tamaño más pequeño de terrón y la mejor calidad basada en la presencia de células citoplasmáticas pequeñas. Después de realizar 5-8 transferencias las suspensiones están esencialmente libres de células no embriogénicas y la mayoría de racimos de células embriogénicas son muy pequeños (de 150 a 2000 mm).

Ejemplo 29 Aislamiento y purificación de protoplastos de Dactylis glomerata L

Se preparan protoplastos de los anteriores cultivos embriogénicos en suspensión mediante filtración aséptica de las células a través de una unidad de filtro Nalgene de 0,2 mm y después adición de 0,5 g de peso fresco de células a cada uno de los 12,5 ml de mezcla de enzimas y protoplastos en una cápsula petri. La mezcla de enzimas contiene un 2% de celulosa RS, CaCl_{2}xH_{2}O 7 mM, NaH_{2}PO_{4}xH_{2}O 0,7 mM, MES 3 mM (pH 5,6), glucosa (550 mOs/kg de H_{2}O de pH 5,6) y se filtra en condiciones estériles. Se agita la mezcla en un agitador orbital a una velocidad de 50 rpm en luz dim. (<420 lux) durante 4-5 horas. A continuación se tamiza el material digerido a través de un tamiz de acero inoxidable (tamaño de malla: 100 mm) y se reparte en tubos de centrífuga de 12 ml que se centrifugan durante 5 minutos a una velocidad comprendida entre 60 y 100 rpm. A continuación se lava el sedimento que contiene los protoplastos tres veces con medio de cultivo de protoplastos KM-8p ajustado a 550 mOs/kg de H_{2}O con glucosa. En este momento puede incluirse una etapa de flotación para mayor purificación de los protoplastos. En este caso, los protoplastos lavados se depositan en capas de más de 10 ml de medio de cultivo KM-8p ajustado a 700 mOs/kg de H_{2}O con sucrosa. Después de una centrifugación de 10 minutos entre 60 y 100 rpm, se recogen los protoplastos que nadan en la interfase empleando para ello una pipeta fina. Finalmente se suspenden de nuevo los protoplastos en 1-2 ml de medio de cultivo KM-8p y se tamizan a través de una pantalla de acero inoxidable (tamaño de malla: 20 mm). Se recogen los protoplastos liberados y se lavan y se resuspenden en medio KM-8p para el cultivo o en un medio ajustado osmóticamente e idóneo para la transformación según los ejemplos anteriores.

Ejemplo 30 Cultivo de protoplastos y de callo de Dactylis glomerata L

A. Se colocan en placas los protoplastos purificados en una densidad de 5 x 10^{5} protoplastos por ml en medio de cultivo KM-8p que contiene un 1,3% de agarosa SeaPlaque (FMC Corp., Marine Colloids Division, Rockland, Maine, EE.UU.) y del 30 al 40% de medio acondicionado (obtenido a partir de cultivos embriogénicos en suspensión de Dactylis glomerata L. de 3 a 4 semanas de antigüedad por filtración del medio a través de un filtro Nalgene estéril de 0,2 mm, haciendo que el medio tenga 550 mOs/kg de H_{2}O por adición de glucosa y filtrando de nuevo en condiciones estériles). Después se colocan las placas en la oscuridad a una temperatura constante de 28ºC. Pasados de 10 a 14 días se corta la agarosa en cuñas y se coloca en un cultivo de esferillas (bead culture) descrito por Shillito y col. (1983) empleando 20 ml de un medio de cultivo en suspensión SH-45 con un 3% de sucrosa por cada 3 ml de cultivo original ocluido (incrustado) dentro de la agarosa. Se colocan las plantas en un agitador de plataforma y se agitan a una velocidad de 50 rpm en una luz de 670 lux. Se forman nuevos cultivos en suspensión cuando las colonias crecen en la agarosa y sueltan células que entran en el medio líquido. Se colocan las células cultivadas de la suspensión resultante en placas en un medio SH-30 solidificado con agar y se mantienen a 25ºC en la oscuridad hasta que se forma el callo.

B. Se cultivan los protoplastos del modo descrito antes, excepto que el medio que cultivo no contiene medio acondicionado.

Ejemplo 31 Transformación de protoplastos de Dactylis glomerata L. mediante electroporación

A. Inmediatamente después de la purificación de los protoplastos se realiza una electroporación con arreglo a Shillito y col. (1985) empleando plásmidos linealizados. Los protoplastos se suspenden de nuevo después del último lavado hasta una densidad en torno a 7 x 10^{6} protoplastos por ml en el tampón de electroporación (manita 0,4 M, MgCl_{2} 6 mM). Se colocan los protoplastos en partes alícuotas de 0,7 ml en tubos de plástico de 10 ml para centrífuga. A los tubos se les añaden DNA plásmido y DNA de timo bovino sometido a ultrasonidos (Sigma) para lograr concentraciones finales de 10 mg/ml y 50 mg/ml, respectivamente. A continuación se añaden 0,38 ml de solución de PEG (24% de PEG de PM 6000 en manita 0,4 M, MgCl_{2} 30 mM, 0,1% de MES (pH 5,6)] y se mezcla la solución suavemente. Se transfiere la suspensión de protoplasto a la cámara de un Dialog Electroporator y se aplican 10 pulsos de un voltaje inicial de 3250 Vcm^{-1} y una constante de disminución exponencial de 10 mseg a intervalos de 30 seg. Se saca la muestra de la cámara y se coloca en una cápsula petri de 10 cm de diámetro. Se añaden 10 ml de un medio KM-8p que contiene un 1,2% de agarosa SeaPlaque, se reparten los protoplastos por igual en el medio y se deja que la agarosa gelifique.

B. Se repite el procedimiento anterior, excepto que el voltaje inicial empleado es de 3500 Vcm^{-1}, 4000 Vcm^{-1}, 5000 Vcm^{-1}, 3000 Vcm^{-1} o 2500 Vcm^{-1}.

Ejemplo 32 Transformación de protoplastos de Dactylis glomerata L. por tratamiento con PEG

A. Se realiza una transferencia genética directa, mediada por el PEG, según el método de Negrutiu, I. y col. (1987). El DNA utilizado es el plásmido linealizado descrito.

Se suspenden los protoplastos después del último lavado en manita 0,5 M que contiene MgCl_{2} 15 mM en una densidad en torno a 2 x 10^{6} por ml. Se distribuye la suspensión de protoplastos en partes alícuotas de 1 ml en tubos de plástico de 10 ml para centrífuga. Se añade el DNA del modo descrito antes y después se añaden 0,5 ml de la solución de PEG (PEG del 40%, PM de 4000, en manita 0,4 M, Ca(NO_{3})_{2} 0,1 M, pH 7,0).

Se mezclan las soluciones suavemente y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente (24ºC) durante 30 minutos con agitación ocasional. Después se añaden 1,4 ml de la solución de lavado y se mezcla suavemente el contenido del tubo. La solución de lavado se compone de manita 87 mM, CaCl_{2} 115 mM, MgCl_{2} 27 mM, KCl 39 mM, Tris-HCl 7 mM y 1,7 g/l de mio-inositol, pH 9,0. Se añaden otras cuatro partes alícuotas de 1,4 ml a intervalos de 4 minutos, mezclando bien después de cada adición. Seguidamente se centrifuga el tubo a una velocidad de 60 rpm durante 10 minutos y se descarta el líquido sobrenadante. Se recogen los protoplastos sedimentados en 1 ml de medio de cultivo KM-8p y se colocan en cápsulas petri de 10 cm. Se añaden 10 ml de medio KM-8p que contiene un 1,2% de agarosa SeaPlaque. Se distribuyen los protoplastos por igual en todo el medio y se deja que gelifique la agarosa.

B. Se repite el procedimiento con una o varias de las modificaciones siguientes:

(1) Se ajusta el pH de la solución de lavado a 5,6 ó a 7,0.

(2) El PEG utilizado es un PEG de PM 6000, PEG de PM 2000 o PEG de PM 8000.

(3) El medio de lavado consta de NaCl 154 mM, CaCl_{2} 125 mM, KCl 5 mM, glucosa 5 mM, pH hasta 6,0 con KOH; o CaCl_{2} 0,2 M, 0,1% de MES, pH con KOH; o CaCl_{2} 0,2 M, Tris/HCl 7 mM, pH 9,0 con KOH.

Ejemplo 33 Transformación de protoplastos de Dactylis glomerata L. por electroporación o por tratamiento con PEG

La transformación se lleva a cabo del modo descrito anteriormente, excepto que los protoplastos se tratan a 45ºC durante 5 minutos antes de la distribución de las partes alícuotas en tubos para la transformación o después de la distribución de las partes alícuotas y antes de la adición del PEG.

Ejemplo 34 Selección de colonias transformadas

A. Se incuban las placas de cultivo (cápsulas petri) que contienen los protoplastos en la oscuridad en torno a 25ºC durante 10 días y después se cortan en 5 rebanadas iguales para "cultivos de esferillas" (Shillito y col. 1983). Cada una de cuatro rebanadas se coloca en 20 ml de medio de cultivo SH-45 que contiene 4 g/l de caseína hidrolizada y un agente de selección apropiado, en función del gen marcador para la selección empleado en la transformación de las plantas. Se coloca la quinta rebanada en 20 ml del mismo medio, pero sin agente de selección, actuando como control sin selección. Pasadas de 4 a 5 semanas se cortan de la agarosa las colonias de células derivadas de protoplastos supuestamente transformados en presencia del marcador de selección y se colocan en cápsulas petri de 19 mm con 2 ml de medio líquido SH-45 que contiene un agente de selección apropiado, se agita en un agitador orbital a 50 rpm. Pasadas otras 4-5 semanas, todas las colonias que se cultivan para formar nuevas suspensiones se transfieren a matraces Erlenmeyer de 125 ml y se cultivan de modo similar al cultivo en suspensión original, excepto que se incluye en el medio el agente de selección apropiado.

Se subcultivan las nuevas suspensiones cada 1-3 semanas empleando medio SH-45 que contiene 4 g/l de caseína hidrolizada y un agente de selección apropiado. Se extienden también en placas células de estas suspensiones sobre medio SH-30 solidificado que contiene un agente de selección apropiado y se incuban a 25ºC en la oscuridad. Los callos formados de las células cultivadas en placas se subcultivan cada dos semanas en medio fresco. Se supone que las células que crecen en presencia del marcador de selección son transformantes.

B. Se efectúa la sección del modo descrito, excepto que las colonias de células derivadas de protoplastos que crecen en presencia del medio que contiene el marcador de selección se colocan ahora en placas de agar del medio SH-30 que contiene el marcador de selección y se incuban a 25ºC en la oscuridad.

Ejemplo 35 Regeneración de plantas transformadas de Dactylis glomerata L

A. Se cultiva el callo de Dactylis glomerata L. (obtenida del modo descrito antes) derivado de protoplastos en el medio SH-30 solidificado y se subcultiva cada dos semanas. Todos los embriones formados se extraen y se extienden en un medio de germinación (SH-O) y se exponen a la luz (de 3800 a 4600 lux). La germinación de estos embriones tiene lugar en un período de 1 a 4 semanas y las plántulas resultantes se colocan en medio SH-O en la luz para formar el sistema radicular. Se trasladan al invernadero en el estadio de seis a doce hojas y se fortalecen gradualmente.

B. Se cultiva el callo (obtenido del modo descrito) derivado de protoplastos en medio SH-O solidificado con un 0,24% de Gelrite en la luz (de 3800 a 4600 lux) y se subcultiva cada dos semanas. Se colocan las plántulas resultantes en una mezcla 1:1 de medios SH-O y OMS solidificada con una combinación de 0,12% de Gelrite y 0,4% de agar en la luz para formar el sistema radicular. Se trasladan al invernadero en el estadio de seis a doce hojas y se fortalecen gradualmente.

C. Se obtienen plántulas pequeñas del modo descrito en los ejemplos 35A y 35B y se colocan en medio OMS solidificado con un 0,8% de agar en la luz para formar el sistema radicular. Se trasladan al invernadero en el estadio de seis a doce hojas y se fortalecen gradualmente.

D. Se colocan las plántulas obtenidas del modo descrito en el anterior ejemplo 35A en una mezcla 1:1 de medios SH-O y OMS solidificada con una combinación de un 0,12% de Gelrite y un 0,4% de agar en la luz para formar el sistema radicular. Se trasladan al invernadero en el estadio de seis a doce hojas y se fortalecen gradualmente.

Ejemplo 36 Producción de plantas de trigo transgénicas Mantenimiento del cultivo celular

Se mantienen cultivos de callos en un medio 1MS, del modo descrito por ejemplo en Murashige, T. y Skoog, F., 1962, Physiol. Plant 15, 473-497 (sales MS, vitaminas, hierro, 3% de sucrosa, 0,7% de agar, 1 mg/litro de 2,4-D). Los cultivos idóneos de callos comprenden entre otros los callos de tipo II (un tipo de callo friable y embriogénico), obtenido a partir de cultivos celulares "competentes en bombardeo" (shoot competent), descritos en W. Wang y H. Nguyen (1990, Plant Cell Reports 8, 639-642) después del subcultivo recurrente y la selección visual. Se subcultivan cada dos semanas y se mantienen a 26ºC en la oscuridad. Los cultivos en suspensión se mantienen en un medio líquido 1MS y se subcultivan dos veces por semana. Se mantienen en la oscuridad a 26ºC y se agitan con una velocidad de
\approx125 rpm.

Preparación de las células para el bombardeo

Se someten las células a un tratamiento de plasmólisis antes del bombardeo. Se mide el volumen de las células empaquetadas y se diluyen las células en medio líquido 1MS al que se ha añadido agente osmótico: sorbita 0,4 M para las células en suspensión y sorbita 0,6 M para las células de callo. Se diluyen las células de modo que el volumen celular empaquetado final sea de 1/20 ml para una suspensión fina y 1/10 ml para el callo. Se colocan las células diluidas en un frasco de 250 ml que contiene una varilla de agitación y se agitan por lo menos durante 30 minutos, hasta unas pocas horas. Para extender las células sobre las placas se retiran 2 ml del frasco y se pipetean en la parte alta de un frasco de vacío sobre el que se ha colocado un filtro GFA de 2,5 cm de Whatman. Se aplica el vacío hasta que las células se secan sobre el filtro, se colocan los filtros sobre cápsulas petri de 60x15 mm que contienen 5 ml de un medio de plasmólisis sólido para después del bombardeo: 1MS que contiene sorbita 0,2M para las células en suspensión o sorbita 0,4 M para las células de callo. Sobre cada cápsula se colocan dos filtros.

Preparación de las partículas

Se lavan las partículas de oro (1,0 micras; de Bio-Rad) por división en partes alícuotas en tubo de microcentrífuga, añadiendo \approx1 ml de etanol del 100%, tratando en vortex, se centrifuga, eliminando el líquido sobrenadante y repitiendo el proceso dos veces con agua esterilizada. Después del lavado final se elimina la mayor cantidad posible de agua y se añade una solución de polilisina (0,02% de polilisina + acetato amónico 15 mM) para sumergir por completo las partículas. Se tratan las partículas en vortex, se centrifuga y se elimina el líquido sobrenadante. Se secan las partículas durante una noche en una campana de flujo laminar o durante 30 minutos en una suave corriente de nitrógeno.

Para la preparación "completa" de las partículas se pesan 10 mg de partículas y se colocan en un tubo de microcentrífuga esterilizado que contiene una varilla agitadora. Se añaden 100 ml (1 mg/ml) de DNA (según la etapa I), se tratan en vortex, se añaden 10 ml de Na_{2}HPO_{4} 100 mM, se tratan en vortex, se añaden 10 ml de CaCl_{2} 100 mM, se tratan en vortex, se añaden 380 ml de etanol del 100%, se tratan en vortex. Se agita vigorosamente la suspensión sobre una placa de agitación al tiempo que se pipetean 3 ml en cada proyectil de plástico (flier). Se secan las partículas dentro de los proyectiles por lo menos durante 15 minutos antes de realizar el bombardeo.

Bombardeo de cultivos celulares

Se realiza el bombardeo de cultivos celulares empleando el dispositivo descrito en el documento EP-A-. ... Se invierte la cápsula petri que contiene los filtros de células sobre una plataforma en la parte alta de la plataforma, se centra sobre la abertura a través de la que se tienen que proyectar las partículas. Se coloca una pestaña transparente sobre la parte alta de la plataforma. Se coloca un microproyectil sobre el percutor de la culata y se cierra la culata. Se pulsa el botón "arm" (armar) para llenar el depósito con la cantidad apropiada de gas helio (normalmente 1800-1900 psi). Se conecta el vacío a la cámara hasta llegar a \approx27 mm. Se cierra la conexión al vacío y se pulsan los botones "arm" y "fire" (disparo). Se coloca el botón "arm" en la posición "paro". Por lo general, cada filtro se bombardea dos veces.

Cultivo y sección después del bombardeo

Después del bombardeo, las células se mantienen en la oscuridad durante una noche. Al día siguiente se quitan los filtros del medio de plasmólisis y se colocan en un medio 1MS. Se realiza la selección a los 7-10 días después del bombardeo para las células en suspensión y a los 14 días para las células de callo. Se arrancan las células de los filtros y se extienden sobre la superficie de placas que contienen medio 1MS más un agente apropiado de selección, en función del gen marcador de selección que se haya utilizado para la transformación de la planta. Se incuban las placas en la oscuridad durante varias semanas. Se transfieren las colonias resistentes que se forman después de unas pocas semanas a un medio IMS + agente de selección. Se trasladan las colonias que continúan proliferando durante 3-4 semanas a un medio de mantenimiento "0,5MS": sales MS, vitaminas, hierro, 3% de sucrosa, 0,7% de agar, 0,5 mg/litro de 2,4-D. Se subcultiva el tejido en este medio dos veces por semana hasta que las estructuras embriogénicas o el tejido parecen idóneos para la regeneración.

Regeneración

Se transfiere el tejido a un medio MS que contiene 3 mg/litro de BAP o bien 1 mg/litro de NAA + 5 mg/litro de GA y las placas se trasladan a la luz. Pasadas 2-4 semanas se traslada el tejido a un medio MS sin hormonas. Los brotes que se forman se colocan en cajas magenta que contienen medio MS sin hormonas o bien medio MS con 0,5 mg/litro de NAA. Cuando se ha producido un crecimiento suficiente de raíces y brotes, se transfieren las plántulas a un suelo y se colocan en el fitotrón.

Ejemplo 37 DNA de GA-20-oxidasa de la Arabidopsis thaliana (a) Aislamiento de DNA genómico de Arabidopsis thaliana

Se esteriliza la superficie de semillas de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta por tratamiento con una solución de hipoclorito sódico al 5% en Tween-20 del 0,01% (Sigma), se lavan dos veces con agua y se suspenden en agar del 0,15%. Se siembran las semillas en agar del 0,8% que contiene medio de Murashige y Skoog complementado con vitaminas B5 (Sigma) y un 5% de sucrosa en contenedores magenta estériles (Sigma). Se cultivan las plantas a 20ºC durante 4 semanas y se congela el material de los brotes en nitrógeno líquido y se almacena a -70ºC. Se aísla el DNA genómico esencialmente del modo descrito por Murray y Thompson (Murray, M.G. y Thompson, W.F. (1980)). Se muelen 10 g del tejido congelado para obtener una suspensión en un mortero enfriado con hielo con una pequeña cantidad de arena lavada con ácido. Se traslada el material homogeneizado a un tubo de polipropileno para centrífuga y se añade un volumen igual de CTAB del 2% (p/v) (bromuro de cetiltrimetilamonio, Sigma), NaCl 1,4 M, Tris-Cl 0,1 M, pH 8,0, EDTA 20 mM. Se agita suavemente, se incuba el tubo a 67ºC durante 20 min con agitación ocasional. Se retira el tubo del baño de agua y se le añaden 0,5 volúmenes de cloroformo, se mezcla suavemente y se deja a temperatura ambiente (20ºC) durante 20 min con inversión ocasional. Se centrifuga el tubo a 2000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente, se saca la fase superior y se introduce en un nuevo tubo y se descarta la fase inferior. A la fase superior se le añade 0,1 vol. de CTAB del 10% (p/v), NaCl 0,7 M y se repite la anterior extracción con cloroformo. Se decanta de nuevo la fase superior a un nuevo tubo y se le añaden 2 volúmenes de CTAB del 1% (p/v), Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM. Se mezcla suavemente y se deja en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora, después se centrifuga a 5000 rpm durante 5 min. Se disuelve el perdigón en CsCl al 50% (p/p) en tampón TE con bromuro de etidio hasta 0,5 mg/ml. Se trasvasa la solución a un tubo Quick-seal (Beckman) y se centrifuga en un rotor vertical (Beckman VTi90) a 80.000 rpm y 20ºC durante 16 horas. Se visualiza el DNA a la luz natural y se retira mediante una jeringuilla con aguja. Se elimina el bromuro de etidio por extracción, cuatro veces, con 5 volúmenes de butan-1-ol, previamente equilibrado con agua saturada de NaCl. Se diluye la solución por adición de 3 volúmenes de tampón TE (Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) y se precipita el DNA con 2 volúmenes de EtOH. Se forman perdigones con el DNA por centrifugación a 10.000 rpm a 0ºC durante 10 min, se lava con EtOH del 70%, se seca con vacío y se disuelve en tampón TE. Se determina la concentración de DNA por su absorbancia a 260 nm.

(b) Construcción de una biblioteca de cDNA

Se induce la germinación de semillas de Arabidopsis thaliana ga1 por incubación durante una noche en una solución 10 mM de GA_{3}, agitando a temperatura ambiente. Se lavan las semillas dos veces con agua, se suspenden en agar al 0,15% en agua y se siembran directamente sobre el compuesto de siembra. Se cultivan las plantas durante 5 semanas y se recolecta el tejido de los brotes directamente en nitrógeno líquido y se almacena a -70ºC. Se aísla el poliA^{+}RNA del modo descrito por Bartels y Thompson (1983). Se produce cDNA de doble hebra a partir de 5 mg de mRNA empleando un cebador oligo-dT con el kit cDNA Synthesis Plus (Amersham) y se añaden adaptadores EcoRi empleando un kit llamado \lambdagt11 Cloning Kit (Amersham). Se liga el cDNA a brazos \lambdaZapII desfoforilados, cortados con EcoRI (Stratagene) y se empaqueta con el Gigapack Gold (Stratagene). Se produce una biblioteca primaria de 320.000 recombinantes y la mitad de ella se amplifica por paso a través de E. coli XL1-Blue (Stratagene) del modo descrito por el fabricante.

(c) Colocación de la biblioteca de cDNA en placas para la exploración

Se inocula una parte alícuota de 50 ml de 2xYT (1,6% Bactotryptone, 1% extracto de levadura, 0,5% de NaCl) incluida maltosa del 0,2% y MgSO_{4} 10 mM con una colonia de E. coli XL1-Blue. Se cultiva a 30ºC durante una noche, se traslada a un tubo estéril para centrífuga y se centrifuga a 2000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. Se suspenden de nuevo las células en MgSO_{4} 10 mM. En tubos estériles de 15 ml se mezclan 500 ml de células de E. coli con 50.000 bacteriófagos recombinantes de la biblioteca amplificada y se incuban a temperatura ambiente durante 10 min y después a 37ºC durante 15 min. Se añaden 6,5 ml de agarosa fundida (0,75% en 2xYT/0,2% maltosa/MgSO_{4} 10 mM) a 48ºC y se vierte rápidamente el contenido del tubo sobre una placa precalentada de 10 cm x 10 cm de agar del 1,5% en 2xYT/0,2% maltosa/MgSO_{4} 10 mM. Se incuban las placas invertidas a 37ºC durante 6 horas y después se almacenan a 4ºC durante una noche. Se etiquetan los filtros de nitrocelulosa duplicados y se colocan sobre placas de agar durante 1 min cada uno. Se secan los filtros con aire y se tratan durante 5 min con cada uno de los siguientes: NaCl 1,5 M; NaOH 0,5 M (desnaturalización); NaCl 3M, Tris-Cl 1M, pH 6,5 (neutralización); NaCl 0,6 M, citrato trisódico 60 mM (fijación). Se secan de nuevo los filtros con aire sobre papel de filtro y se secan en estufa conectada al vacío, entre dos capas de papel de filtro, a 80ºC durante 2 horas.

(d) Preparación de la sonda marcada

Se marca el inserto del clon pAt2204, que consta de un fragmento de PCR del DNA genómico de la Arabidopsis, con P^{32} por extensión con cebador. Se desnaturalizan 2 mg de DNA plásmido en 20 mg de tampón TE por adición de 5 ml de NaOH 1 M, se incuba a temperatura ambiente durante 5 min y se neutraliza por desalado-precipitación a través de una columna de 0,5 ml de Sepharose CL-6B en TE, se centrifuga a 2.000 rpm durante 2,5 min. A 10 ml del DNA desnaturalizado se les añaden 2 ml de cebador universal de secuenciación (New England Biolabs) y 2 ml de Tris-Cl 100 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 50 mM. Se incuba la mezcla a 37ºC durante 15 min y se le añaden 4 ml de cDTP-P^{32} (10 mCi/ml; 3.000 Ci/mmol; Amersham), 1 ml de mezcla de dGAT (0,2 mM en cada caso de dGTP, dATP, DTTP), 1 ml de DNA-polimerasa de Klenow (1 u/ml; Gibco-BRL). Pasados 15 min a temperatura ambiente (20ºC) se añade 1 ml de dCTP 2 mM; pasados otros 5 min a temperatura ambiente se añaden 2,2 ml de tampón 10x HindIII (Gibco-BRL) y 10 unidades de HindIII y se incuba el tubo a 37ºC durante 45 min. Para terminar la reacción se añaden 8 ml de mezcla de carga de colorante formamida (Pharmacia) y se desnaturaliza el DNA calentando a 95ºC durante 2 min. Se cargan los productos en un hoyo de 1,5 cm sobre un gel de poliacrilamida de 1 mm de grosor, 20 cm x 20 cm (poliacrilamida del 6% (p/v) (acrilamida:metilenobisacrilamida = 39:1), 1 x TBE (Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 2,5 mM), urea 8M). Se gelifica con una potencia constante de 25 W durante 1 hora y se retira una placa de vidrio y se cubre el gel con una lámina adhesiva. Se identifica la posición de la banda marcada por autorradiografía frente a un X-OMAT LS de Kodak durante 5 min. Se escinde la banda marcada del gel y se coloca en una bolsa de diálisis de 1 cm de anchura, con 0,4 ml de tampón TE. Se sella por cada extremo con una pinza de diálisis y se coloca en un tanque horizontal de electroforesis que está lleno de tampón TBE. Se eluye el DNA marcado a 100 v durante 30 min y se recupera de la bolsa de diálisis en el tampón TE.

(e) Hibridación

Se humectan las hojas de filtro de nitrocelulosa obtenidas del modo descrito antes en agua y se prehibridan a 42ºC durante 2 horas en tampón de hibridación (formamida del 50%, NaPi 50 mM, pH 6,3, NaCl 0,75 M, citrato trisódico 75 mM, albúmina de suero bovino del 0,1% (p/v), Ficoll 400 al 0,1% (p/v), polivinilpirrolidona del 0,1% (p/v), dodecilsulfato sódico (SDS) del 0,1% (p/v), 100 mg/ml de DNA de timo bovino tratado con ultrasonidos). Se hierve la sonda durante 2 min, se mezcla con 25 ml de tampón de hibridación y se sella en una bolsa de politeno con los filtros prehibridados. Se efectúa la hibridación a 42ºC durante una noche y la sonda no fijada se elimina por lavado a temperatura ambiente durante 15 min con NaCl 0,3 M, citrato trisódico 30 mM, SDS del 0,1% (p/v) y a 60ºC durante 10 min con NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM, SDS del 0,1%. Se identifican las placas hibridadas positivamente por autorradiografía frente a una película X-OMAT AR de Kodak con pantallas de intensificación a -70ºC durante una noche.

Se aíslan las calvas positivas en forma pura por extensión de los positivos primarios sobre placas y los cartuchos de sonda con el inserto marcado de pAt2204 del modo descrito anteriormente. Los clones \lambdaZapII recombinantes puros se rescatan con el pBluescript (Stratagene) del modo descrito por el fabricante.

(f) Secuenciación del DNA

Se obtiene la secuencia de DNA de los insertos de los fragmentos de PCR clonados primariamente con el kit llamado T4 Polymerase Sequencing Kit (Pharmacia). Se secuencia el inserto del clon pAt2301 de longitud completa por construcción de un conjunto anidado de clones de inserción de transposón, empleando el kit llamado TN1000 Nested Set Kit (Gold Biotechnology, St. Louis, Mo.) y posterior secuenciación de los clones individuales con el kit T4 Polymerase Sequencing Kit (Pharmacia).

Ejemplo 38 Aislamiento y caracterización de clones de ADN pAt2301 y pAt2353 que codifican una giberelina-20-oxidasa a partir de la Arabidopsis thaliana (a) Amplificación por PCR y clonación de fragmentos internos de genes liberados con 20-oxidasa del DNA genómico de la Arabidopsis

Se diseñan cebadores oligonucleótidos degenerados, basados en regiones de aminoácidos conservadas entre la giberelina-20-oxidasa de cotiledones de Cucurbita maxima y otras dioxigenasas vegetales, incluida la proteína relacionada de maduración del tomate E8, la enzima de maduración en almacenaje con etileno del tomate, la hiosciamina-6-hidroxilasa del Hyoscyamus niger, la flavanona-3-hidroxilasa de la cebada y el gen A2 del maíz. Los cebadores en dirección al extremo 5' de la cadena (upstream) y al extremo 3' de la cadena (downstream) contienen sitios de rotura con endonucleasas de restricción para la HindIII y la EcoRI, respectivamente, en sus extremos 5'.

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Las reacciones PCR contienen 50 ng de DNA genómico de la cepa Arabidopsis thaliana Landsberg erecta (Redei, G.P. (1962)), 2,5 \mug de cada cebador degenerado, 25 \muM de cada dNTP y 1 unidad de AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus) en un volumen total de 25 \mul de tampón AmpliTaq que contiene MgCl_{2} 1,5 mM y se cubre con una capa superior de 25 \mul de aceite mineral. Se incuban las mezclas reaccionantes a 94ºC durante 5 min y después se someten a 40 ciclos de 94ºC 1 min, 35ºC 2 min, 72ºC 3 min. La etapa de los 72ºC se incrementa en 5 segundos cada ciclo. A continuación se incuban las mezclas reaccionantes a 72ºC durante 10 minutos.

Se separan los productos de la amplificación PCR por electroforesis a través de un gel de agarosa al 1,5% en tampón tris-borato-EDTA (Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 2,5 mM). Se identifica una banda débil de aprox. 190 bp y se eluye del gel con 100 \mul de tampón TE (Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM); 1 \mul del mismo se utiliza como sustrato para una reacción PCR en las condiciones descritas anteriormente. Se vuelven a separar los productos por electroforesis a través de gel de agarosa y se purifica la banda amplificada de 190 bp de la agarosa. Se digiere con EcoRi y con HindIII y se liga una décima parte de los productos a 100 ng de pUC19 (Pharmacia), previamente digerido con EcoRi y con HindIII y se desfosforila. Se introducen los productos de la reacción de ligación en la cepa XL1-Blue de E. coli (Stratagene) por transformación y se cultivan en placas de agar 2xYT que contienen 100 \mug/ml de ampicilina. Se aísla el DNA plásmido de las colonias individuales y se secuencia por el método de la terminación de cadena de didesoxinucleótido.

Uno de estos clones, el pAt2204, contiene un inserto cuya secuencia de aminoácidos prevista es idéntica en un 67% con la de la giberelina-20-oxidasa de la calabaza amarilla:

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(b) Aislamiento de clones cDNA de longitud completa correspondientes al clon pAt2204 después de la PCR

Se marca el inserto de pAt2204 con dCTP-P^{32} y se utiliza como sonda en cartuchos de filtro de nitrocelulosa de una biblioteca de cDNA de longitud completa, construida en \lambdaZapII (Stragene) a partir del poli-A^{4}RNA aislado de material de brotes del mutante ga1 deficiente en giberelina de la Arabidopsis thaliana (Koornneff, M. y van der Veen, J.H. (1980)). Se efectúa la hibridación a 42ºC durante una noche en formamida del 50%, fosfato sódico 50 mM, pH 6,3, NaCl 0,75 M, citrato sódico 75 mM, 0,1% de albúmina de suero bovino, 0,1% de Ficoll 400, 0,1% de polivinilpirrolidona 360, 0,1% de dodecilsulfato sódico y 100 \mug/ml de DNA de testículo de salmón. Se lavan los filtros a 42ºC durante 10 min con NaCl 15 mM, citrato sódico 1,5 mM. Se identifican las placas de hibridación por autorradiografía y se purifican por rondas sucesivas de hibridación. Se convierten los clones positivos en clones pBluescript por rescate de plásmido y se caracterizan por digestión en EcoRi y secuenciación de DNA. Para los estudios de expresión heteróloga se eligen el clon pAt2353 y el clon pAt2301 que contiene un inserto de 1,3 kbp.

(c) Expresión del clon pAt2301 de cDNA en E. coli

Se escinde con EcoRi el inserto de 1,3 kbp del pAt2301, se purifica con electroforesis a través de gel de agarosa y se liga al vector de expresión pTrcHisA (Invitrogen), cortado previamente con EcoRI y desfosforilado. Se introducen los productos de ligación en la cepa TOP10 de E. coli (Invitrogen) por transformación y se seleccionan por cultivo en agar 2xYT con 100 \mug/ml de ampicilina. Se aísla el plásmido de DNA de un gran número de los clones resultantes y se determina la orientación del inserto de cDNA por digestión con HindIII. El clon pAt2328 contiene un inserto de cDNA en orientación sentido y se utiliza para inocular 50 ml de 2xYT que contiene 100 \mug/ml de carbenicilina. Pasadas 2 horas de cultivo con agitación a 37ºC se añade el IPTG (isopropil-b-D-tiogalactopiranósido) hasta 1 mM y se cultivan durante 5 horas más. Se recolectan las células por centrifugación y se suspenden en 4 ml de Tris-Cl 100 mM, pH 7,5, DTT 4 mM, y se someten a ultrasonidos sobre hielo durante un total de 90 segundos. A continuación se congelan las muestras en nitrógeno líquido, se descongelan manualmente y se elimina el material insoluble por centrifugación a 15.000 rpm durante 5 min. Se almacena el líquido sobrenadante resultante a -80ºC y después se emplea en el ensayo enzimático.

Se incuba el sobrenadante (90 \mul) a 30ºC durante 5 horas con GA_{12}[C^{14}] (10.000 dpm) y co-factores de dioxigenasa igual que en el ejemplo 1, en un volumen total de 100 \mul. Se separan los productos por HPLC, observándose la producción de la GA_{15}[C^{14}], cuya identidad se confirma por cromatografía de gases combinada con espectrometría de masas (CG-EM).

Ejemplo 39 Aislamiento del clon YAP169 de cDNA, que codifica a la giberelina-20-oxidasa, a partir de la Arabidopsis thaliana

Se utiliza el programa TBLASTIN de la DBEST (database of expressed sequence tags) del NIH (BLAST@NCBI.NLM.NIH.GOV) para la secuencia completa de aminoácidos del clon At2301 del cDNA de la Arabidopsis para buscar las secuencias afines. El programa de búsqueda traduce las secuencias de DNA de la base de datos en secuencias de aminoácidos de ambas orientaciones y los tres marcos de lectura. La base de datos DBEST contiene secuencias parciales de los cDNA obtenidos al azar como parte del programa de secuenciación sistemática del cDNA de la Arabidopsis. Höfte y col. (1993) han publicado el método para obtener las secuencias de la Arabidopsis.

Utilizando el programa TBLASTIN se puede identificar un clon adicional (YAP159) que, debido a su homología de secuencia con el clon pAt2301, es capaz de codificar una dioxigenasa. Expresando el cDNA en E. coli del modo descrito antes se confirma que la proteína expresada tiene actividad de 20-oxidasa. M. Delseny, de la universidad de Perpiñán, Francia, ha facilitado amablemente el clon YAP169.

Ejemplo 40 Transformación de la Arabidopsis thaliana (a) Construcción de un vector PR1-tml

Construcción de un vector en el que se sustituye el promotor de doble CaMV 35S por un promotor inducible químicamente a partir del gen PR1a de la Arabidopsis. Se usa el oligonucleótido 5'-GAGAATTCTAAGTTGATAATGGTTATTG-3' combinado con el cebador de secuenciación universal M13 para la PCR, empleando como sustrato un plásmido pATPR1-P. El producto de esta reacción, un fragmento de 4,2 kbp que lleva el promotor PR1, se digiere con EcoRi y HindIII. Se digiere el plásmido pCGN1761 con EcoRI y HindIII para quitar el promotor de doble 35S y se liga el fragmento de vector de 5 kbp con el fragmento de promotor PR1. Los productos de ligación se introducen en la E. coli por transformación y se identifica una colonia que tiene el promotor PR1. Este plásmido se llama pPR1-tml.

(b) Construcción de genes quiméricos de 35S-20-oxidasa (Arabidopsis) (cada uno los tres cDNA de 20-oxidasa de Arabidopsis se clona en el pCGN1761)

Cada uno de los tres cDNA de GA-20-oxidasa (At2301, At2353 e YAP169) se expresa en orientación del mismo sentido y antisentido detrás del promotor constitutivo CaMV 35S por amplificación PCR de cada uno de los marcos de lectura abiertos y transferencia al vector pCGN1761. Se sintetiza un oligonucleótido correspondiente al codón de iniciación de la traducción y las 12-13 bases sucesivas de la hebra de codificación de cada cDNA e incorporando un sitio EcoRI en los extremos 5'; para el pAt2301, el oligonucleótido es el 5'-GAGAATTCAAAATGGCCGTAAGTTTCG-3'; para el pAt2353, el oligonucleótido es el 5'-GAGAATTCAGAAATGGCGATACTATGC-3'; para el YAP169, el oligonucleótido es el 5'-GAGAATTCAAAAATGGCAACGGAATGC-3'. Se utiliza cada uno de estos oligonucleótidos combinado con el cebador de secuenciación universal M13 para las reacciones PCR, empleando un sustrato plásmido adecuado (pAt2301, pAt2353 e YAP169, respectivamente). Los productos de la PCR de cada reacción se digieren con EcoRI y se clonan en el sitio EcoRi del pCGN1761 aplicando técnicas estándar. Se recuperan las colonias que llevan cada uno de los tres insertos de cDNA en orientaciones del mismo sentido y antisentido con respecto al promotor 35S y se denominan pCGN1761-35S-At2301-sentido, pCGN1761-35S-At2301-antisentido, pCGN1761-35S-At2353-sentido, pCGN1761-35S-At2353-antisentido, pCGN1761-35S-YAP169-sentido, pCGN1761-35S-YAP169-antisentido, respectivamente.

(c) Construcción de genes quiméricos de Pr1-20-oxidasa (Arabidopsis) (cada uno los tres cDNA de 20-oxidasa de Arabidopsis se clona en el pPR1-tml)

Los productos de PCR digeridos con EcoRI, derivados de los pAt2301, pAt2353 e YAP169, descritos antes, se clonan en el sitio EcoRI del pPR1-tml para obtener cada uno de los cDNA de GA-20-oxidasa de Arabidopsis en orientación del mismo sentido y antisentido con respecto al promotor PR1 inducible químicamente. Los constructos se llaman pPR1-At2301-sentido, pPR1-At2301-antisentido, pPR1-At2353-sentido, pPR1-At2353-sentido, pPR1-YAP169-sentido y pPR1-YAP169-antisentido.

(d) Transferencia de las fusiones de 35S-20-oxidasa (Arabidopsis) del pCGN1761-35S-At2301-sentido, pCGN1761-35S-At2301-antisentido, pCGN1761-35S-At2353-sentido, pCGN1761-35S-At2353-antisentido, pCGN1761-35S-YAP169-sentido y pCGN1761-35S-YAP169-antisentido al vector binario pCIB200

Se escinden cassettes de expresión de 35S-20-oxidasa de los constructos pCGN1761-35S-At2301-sentido, pCGN1761-35S-At2301-antisentido, pCGN1761-35S-At2353-sentido, pCGN1761-35S-At2353-antisentido, pCGN1761-35S-YAP169-sentido y pCGN1761-35S-YAP169-antisentido por digestión total o parcial con XbaI. Cada uno de estos cassettes se clona en el sitio XbaI del pCIB200 (ver ejemplo 11), generando vectores binarios capaces de expresar los insertos de cDNA del pAt2301, pAt2353 e YAP169 en orientación del mismo sentido y antisentido detrás del promotor de doble 35S.

(e) Transferencia de las fusiones de PR1-20-oxidasa (Arabidopsis) del pPR1-At2301-sentido, pPR1-At2301-antisentido, pPR1-At2353-sentido, pPR1-At2353-antisentido, pPR1-YAP169-sentido y pPR1-YAP169-antisentido al vector binario pCIB200

Se escinden cassettes de expresión de PR1-20-oxidasa de los constructos pPR1-At2301-sentido, pPR1-At2301-antisentido, pPR1-At2353-sentido, pPR1-At2353-antisentido, pPR1-YAP169-sentido y pPR1-YAP169-antisentido por digestión total o parcial con XbaI. Cada uno de estos cassettes se clona en el sitio XbaI del pCIB200, generando vectores binarios capaces de expresar los insertos de cDNA del pAt2301, pAt2353 e YAP169 en orientación del mismo sentido y antisentido detrás del promotor PR1 inducible químicamente.

(f) Transformación de la Arabidopsis thaliana

Se introducen los constructos anteriores en la Arabidopsis thaliana por transformación mediada por el Agrobacterium tumefaciens, del modo descrito en los ejemplos 12 y 13.

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Sanford et al, US Patent 4,945,050

Sanford et al, Particulate Science and Technology 5:27-37 (1987)

Sanger, Proc Nat Acad Sci USA 74: 5463-5467 (1977)

Schekman, TIBS, 188, 1985

Schmidhauser et al, J Bacteriol 164: 446-455, 1985

Schmitz et al, Plant Cell, 1: 783-791,1989

Schocher RJ et al, Bio/Technology, 4: 1093-1096 (1986)

Shillito et al, Bio Technology, 3: 1099-1103 (1985)

Southern, J. Mol. Biol. 98: 503 (1975)

Thompson et al, EMBO J 6: 2519-2523 (1987)

Velten et al, EMBO J. 3: 2723-2730 (1984)

Wang and Nguyen, Plant Cell Reports 8: 639-642, 1990

Wang Y-C et al, Plant Mol. Biol. 11: 433-439 (1988)

Weissing et al, Annual Rev. Genet. 22: 421-477 (1988)

Bibliografía técnica de patentes

EP-A 0 267 159	WO 89/07647
EP-A 0 306 139	US-P 4,945,050
EP-A 0 332 104
EP-A 0 434 616
EP-A 0 462 065
EP-A 0 478 502

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Long Ashton Research Station

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: ninguna

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Long Ashton, Bristol

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Reino Unido

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): BS18 9AF

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: (0275) 392181

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: (0275) 394007

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Regulación del crecimiento

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

vegetal

\hfill

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEÍBLE CON ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SITEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1,0, versión #1.25 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.800000\baselineskip

NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9311147.4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1395 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA para mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Cucurbita maxima

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: clon pB11

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}

5

6

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 386 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Cucurbita maxima

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: proteína para el clon pB11

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1259 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA para mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: clon pAt2301

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 377 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: para el clon pAt2301

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1490 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA para mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: clon pAt2353

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 378 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: para el clon pAt2353

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Cucurbita maxima

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO DE TEJIDO: endospermo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Phe Gly Gly Ser Asp Glu Ser Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: para el cebador 1 (ejemplo 38)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Tyr Tyr Pro Thr Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: para el cebador 2 (ejemplo 38)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Val Ile Asn Ile Gly Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: cebador 1 (ejemplo 38)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAAGCTTAA YTAYTAYCCN ACNTG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: cebador 2 (ejemplo 38)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AARCANTADT TRTADCCNCT TAAGCG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 174 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: pAt2204

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 58 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: para el clon pAt2204

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: oligo (ejemplo 39a)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAATTCTA AGTTGATAAT GGTTATTG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: oligo 1 (ejemplo 39b)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAATTCAA AATGGCCGTA AGTTTC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 16

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: oligo 2 (ejemplo 39b)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAATTCAG AAATGGCGAT ACTATGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

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(iii)

HIPOTÉTICA: no

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(iii)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: oligo 3 (ejemplo 39b)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAATTCAA AAATGGCAAC GGAATGC

\hfill

27

Claims (45)

1. Una molécula de DNA que codifica a un polipéptido que es homólogo en más del 50% con la SEQ ID NO 2 y posee actividad de GA-20-oxidasa.

2. Una molécula de DNA según la reivindicación 1, en la que el polipéptido que posee actividad de GA-20-oxidasa es capaz de actuar sobre uno o varios de los sustratos siguientes: GA_{12}, GA_{53}, GA_{15} (lactona abierta o cerrada), GA_{44} (lactona abierta o cerrada), GA_{24}, GA_{19} y GA_{23}.

3. Una molécula de DNA según la reivindicación 1 ó 2, que está en la forma de un clon de cDNA.

4. Una molécula de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, que codifica una GA-20-oxidasa de plantas, con preferencia de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, con mayor preferencia de plantas dicotiledóneas y con preferencia especial de plantas de la familia de las cucurbitáceas y de las crucíferas, respectivamente.

5. Una molécula de DNA según la reivindicación 4, que codifica una GA-20-oxidasa de la Cucurbita maxima.

6. Una molécula de DNA según la reivindicación 4, que codifica una GA-20-oxidasa de la Arabidopsis thaliana.

7. Una molécula de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, que contiene una secuencia que corresponde a un marco abierto de lectura de la secuencia indicada en la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 5, o una secuencia equivalente por degeneración del código genético, incluidos los derivados capaces de hibridarse con la secuencia indicada en la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 5 y que todavía codifica a un polipéptido que posee actividad de GA-20-oxidasa.

8. Una molécula de DNA que tiene una homología de secuencia de por lo menos el 60% con la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 1.

9. Una molécula de DNA que tiene una homología de secuencia de por lo menos el 60% con la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 3.

10. Una molécula de DNA que tiene una homología de secuencia de por lo menos el 60% con la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 5.

11. Un método de obtención de un DNA según la reivindicación 1 que codifica a un polipéptido que posee actividad de GA-20-oxidasa, que consiste en preparar una biblioteca de cDNA a partir de un organismo fuente idóneo y explorar esta biblioteca mediante uno de los sistemas de exploración aplicados de forma convencional.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que la exploración se efectúa mediante un anticuerpo contra la GA-20-oxidasa o una parte de su secuencia de aminoácidos o por ensayo de las características de la actividad catalítica de la GA-20-oxidasa.

13. Un polipéptido producido por métodos recombinantes por expresión de una secuencia de DNA reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 en un organismo hospedante idóneo y que tiene una secuencia de aminoácidos que es homóloga en más del 50% con la SEQ ID NO 2 y posee actividad de GA-20-oxidasa.

14. Un polipéptido según la reivindicación 13, que es capaz de actuar sobre uno o varios de los sustratos siguientes: GA_{12}, GA_{53}, GA_{15} (lactona abierta o cerrada), GA_{44} (lactona abierta o cerrada), GA_{24}, GA_{19} y GA_{23}.

15. Una GA-20-oxidasa según la reivindicación 13 ó 14 que procede de plantas, con preferencia de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, con mayor preferencia de plantas dicotiledóneas y con preferencia especial de plantas de la familia de las cucurbitáceas y de las crucíferas, respectivamente.

16. Una GA-20-oxidasa según la reivindicación 15, que es de la Cucurbita maxima.

17. Una GA-20-oxidasa según la reivindicación 15, que es de la Arabidopsis thaliana.

18. Una GA-20-oxidasa según una cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 17 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 6.

19. Un método de obtención de un polipéptido según la reivindicación 13, que consiste en expresar una secuencia de DNA reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 en un organismo hospedante idóneo.

20. Un método según la reivindicación 19, en el que dicha expresión se efectúa en una célula hospedante transformada.

21. Una célula hospedante transformada que contiene un DNA según la reivindicación 1 en unión operativa con señales de expresión que incluyen secuencias de promotor y de terminación que permiten la expresión de dicho DNA en la célula hospedante.

22. Un constructo genético quimérico que contiene un DNA según la reivindicación 1 en unión operativa con señales de expresión de la planta que incluyen secuencias de promotor y de terminación capaces de provocar la expresión del gen en un polipéptido que posee actividad de GA-20-oxidasa dentro de una planta.

23. Un constructo genético quimérico que contiene un DNA según la reivindicación 1 o una parte del mismo en orientación inversa y en unión operativa con señales de expresión de la planta, incluidas las secuencias de promotor y de terminación capaces de provocar la expresión de la secuencia inversa en mRNA antisentido dentro de una planta.

24. Un constructo genético quimérico según la reivindicación 22 ó 23, en el que el promotor es un promotor inducible.

25. Un constructo genético quimérico según la reivindicación 22 ó 23, en el que el promotor es un promotor preferencial de tejido o un promotor específico de tejido.

26. Un constructo genético quimérico según la reivindicación 25, en el que el promotor preferencial de tejido o promotor específico de tejido es un promotor específico de médula.

27. Un constructo genético quimérico según la reivindicación 22 ó 23, que consiste en la adición a las secuencias de promotor y de terminación de otras secuencias reguladoras de la región no traducida 5' y 3'.

28. Un constructo genético quimérico según la reivindicación 27, en el que la secuencia reguladora adicional es una secuencia capaz de regular la transcripción de una secuencia de DNA asociada en tejidos vegetales en el sentido de inducción o de represión.

29. Un constructo genético quimérico según la reivindicación 28, en el que la secuencia reguladora es inducible por un compuesto químico.

30. Un constructo genético quimérico según la reivindicación 29, en el que la secuencia reguladora se obtiene a partir de un gen de proteína PR (relacionada por patogénesis).

31. Un vector que contiene un constructo genético quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones de 22 a 30.

32. Una célula hospedante transformada con un constructo genético quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones de 22 a 30.

33. Una célula hospedante según la reivindicación 32, que es de origen bacteriano o vegetal.

34. Una célula vegetal o una planta transgénica que incluye su semilla, que contiene una secuencia de DNA integrada de modo estable en su genoma, según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10.

35. Una planta transgénica, incluida su semilla, que contiene una secuencia de DNA según la reivindicación 1 en unión operativa con señales de expresión de la planta, incluidas las secuencias de promotor y de terminación, que permiten la expresión de dicho DNA en la planta.

36. Una planta transgénica, incluida su semilla, que contiene un DNA según la reivindicación 1 o una parte del mismo en orientación inversa y en unión operativa con señales de expresión de la planta, incluidas las secuencias de promotor y de terminación, que permiten la transcripción de dicha secuencia o secuencia parcial para formar un mRNA antisentido.

37. Una célula o planta transgénica, incluida su semilla, que se transforma con un constructo genético quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones de 22 a 30.

38. Una planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones de 34 a 37, seleccionada entre el grupo formado por el tabaco, la zanahoria, el girasol, el tomate, el algodón, el Zea mays (maíz), la Dactylis glomerata (pasto ovillo) y el trigo.

39. Una planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones de 34 a 37, que es una planta monocotiledónea, con preferencia una monocotiledónea gramínea.

40. Una planta transgénica según la reivindicación 39, que es una monocotiledónea gramínea elegida entre el grupo formado por el Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale y Setaria (= vallico o raigras, maíz, trigo, Triticale, sorgo, caña de azúcar, bromo o cebadilla, arroz, avena, cebada, centeno y mijo, respectivamente).

41. Una planta transgénica según la reivindicación 40, que es una planta de maíz.

42. Una planta transgénica según la reivindicación 40, que es una planta de trigo.

43. Progenie y propágulos, incluida la semilla, de una planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones de 34 a 42.

44. Un método de identificación de secuencias de DNA que contiene una región de DNA que codifica un polipéptido que posee actividad de GA-20-oxidasa, dicho método consiste en preparar un cDNA o una biblioteca genómica a partir de un organismo fuente idóneo y explorar esta biblioteca mediante la hibridación empleando como sonda de hibridación un DNA recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones de 7 a 10.

45. Una secuencia de DNA que contiene una región de DNA que codifica a un polipéptido que posee actividad de GA-20-oxidasa, que puede obtenerse por un método según la reivindicación 44.