ES2240072T3 - Procedimiento microbiano para la preparacion de pravastatina. - Google Patents
Procedimiento microbiano para la preparacion de pravastatina.Info
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Abstract
Procedimiento microbiano para la preparación del compuesto de **fórmula** a partir de un compuesto substrato, en la que R representa un metal alcalino o un ión amónico, que comprende las etapas siguientes: a) cultivar una cepa de la especie del hongo filamentoso Mortierella maculata capaz de 6â-hidroxilar un compuesto en un medio nutricio que contiene fuentes de nitrógeno y carbono asimilables y sales minerales, b) suministrar el substrato objeto de transformación al cultivo desarrollado de Mortierella maculata, c) fermentar el substrato hasta finalizar la bioconversión, d) separar el compuesto del caldo de cultivo, y e) aislar el compuesto.
Description
Procedimiento microbiano para la preparación de
pravastatina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de pravastatina, y particularmente
a un procedimiento microbiano para la producción de pravastatina a
escala industrial.
El factor de riesgo más alto de la
ateroesclerosis y especialmente, de la oclusión coronaria, es el
alto nivel de colesterol en el plasma. En las dos últimas décadas se
ha examinado ampliamente la
3-hidroxi-3-metilglutaril
coenzima A reductasa (EC.1.1.1.34) como la enzima clave que limita
la tasa de biosíntesis del colesterol. La pravastatina, un compuesto
de la fórmula I,
y otros compuestos relacionados
(compactina, mevinolina, sinvastatina) son los inhibidores
competitivos de la enzima HMG-CoA reductasa [A. Endo
et al., J. Antibiot. 29, 1346-1348 (1976); A.
Endo et al., FEBS Lett. 72, 323-326 (1976);
C.H. Kuo et al., J. Org. Chem. 48, 1991
(1983)].
La pravastatina se aisló en primer lugar por M.
Tanaka et al (resultados no publicados) de la orina de un
perro durante el examen del metabolismo de la compactina (Arai, M.
et al., Sankyo Kenkyusyo Nenpo, 40, 1-38,
1988). La pravastatina es habitualmente un agente que disminuye el
colesterol con el mecanismo de acción más ventajoso. Su carácter más
importante es la selectividad tisular, es decir, que inhibe la
síntesis del colesterol en dos sitios principales de la
colesterogénesis, tales como el hígado y el intestino delgado,
mientras que en otros órganos no se detecta fácilmente el efecto
limitante de la enzima intracelular. Al mismo tiempo, el efecto
limitante de la mevinolina y de la sinvastatina sobre la biosíntesis
del colesterol es significativo en la mayoría de los órganos (T.
Koga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1045,
115-120, 1990).
La pravastatina difiere esencialmente en la
estructura química de la mevinolina y de la sinvastatina, que tienen
un carácter más lipofílico. En el caso de estos últimos compuestos,
el sustituyente que se conecta al átomo de carbono
C-1 de la estructura hexahidronaftalénica acaba en
un anillo lactónico de 6 elementos, mientras que en el caso de la
pravastatina, en vez del anillo de lactona, se encuentra la forma de
la sal sódica dihidroxiácida abierta, biológicamente activa. Otra
diferencia estructural importante es que en vez del grupo metilo de
la mevinolina y de la sinvastatina en la posición
C-6 del anillo hexahidronaftalénico, en la
pravastatina puede encontrarse un grupo hidroxilo, que da lugar a un
aumento ulterior en el carácter hidrofílico.
Como resultado de las diferencias estructurales
mencionadas anteriormente, la pravastatina es capaz de penetrar sólo
mínimamente a través de la membrana lipofílica de las células
periféricas (A.T.M., Serajuddin et al., J. Pharm. Sci. 80,
830-834, 1991).
La producción industrial de pravastatina puede
obtenerse mediante dos procedimientos de fermentación. En la primera
etapa microbiológica, se prepara la compactina, y entonces, durante
una segunda fermentación, la sal sódica de la compactina ácida como
substrato es convertida a pravastatina mediante hidroxilación
microbiana en la posición 6\beta.
Según las patentes publicadas, la hidroxilación
microbiana de la compactina puede realizarse en diversos grados con
especies fúngicas que pertenecen a distintos géneros, y con
bacterias filamentosas que pertenecen al género Nocardia, con
los géneros Actinomadura y Streptomyces(memoria de
patente belga nº 895090, memoria de patente japonesa nº 5.810.572,
patentes US nº 4.537.859 y nº 4.346.227, y la solicitud de la
patente europea publicada nº 0605230). La bioconversión del
substrato de compactina se publicó a una concentración de 500
\mug/ml utilizando hongos filamentosos tales como Mucor
hiemalis, Syncephalastrum nigricans, Cunninghamella
echinulata y en 2000 a 4000 \mug/ml con cepas de Nocardia,
Actinomadura y Streptomyces pertenecientes a los
procariotas.
Un problema general que se ha experimentado en
los casos de preparación de la pravastatina con hongos filamentosos
es que, debido al efecto antifúngico de la compactina, los
microorganismos no pueden tolerar el substrato de compactina que se
suministra al cultivo, incluso a concentraciones bajas (Serizawa
et al., J. Antibiotics, 36, 887-891, 1983).
La toxicidad celular de este substrato también se observó en la
hidroxilación con Streptomyces carbophilus, estudiada
ampliamente por los investigadores japoneses (M. Hosobuchi et
al., Biotechnology and Bioengineering, 42,
815-820, 1993).
Los autores japoneses trataron de mejorar la
capacidad hidroxilante de la cepa de Streptomyces carbophilus
con técnicas de ADN recombinante. Para la hidroxilación de la
compactina, es necesario un sistema citocromo P-450
monooxigenasa (Matsuoka et al., Eur. J. Biochem. 184,
707-713, 1989). Sin embargo, según los autores, en
el transporte electrónico del sistema citocromo
P-450 monooxigenasa bacteriano no actúa una, sino
varias proteínas que complican la aplicación de las técnicas de ADN.
El desarrollo de un procedimiento microbiológico de hidroxilación
para la preparación de pravastatina, de un coste adecuado,
constituye una tarea extremadamente dificultosa y compleja.
El objetivo de la presente invención es elaborar
un nuevo procedimiento microbiano para la preparación de
pravastatina a escala industrial a partir de la compactina, que
producirá pravastatina en unas condiciones más ventajosas que las
conocidas anteriormente. Durante el trabajo de investigación, se
intentó encontrar ante todo una cepa de microorganismo con una
enzima hidroxilasa que pudiera adaptarse para la transformación
microbiana de compactina a pravastatina a alta concentración.
La presente invención se refiere a un
procedimiento microbiano para la preparación del compuesto de
fórmula (I)
a partir de un compuesto substrato
de fórmula
(II),
en la que R representa un metal
alcalino o un ión amónico, que comprende las etapas siguientes: (a)
cultivar una cepa de la especie del hongo filamentoso Mortierella
maculata capaz de 6\beta-hidroxilar un
compuesto de fórmula (II) en un medio nutricio que contiene fuentes
de nitrógeno y carbono asimilables y sales minerales, (b)
suministrar el substrato objeto de transformación al cultivo
desarrollado de Mortierella maculata, (c) fermentar el
substrato hasta que finalice la bioconversión, (d) separar el
compuesto de fórmula (I) del caldo de cultivo, y (e) aislar el
compuesto de fórmula
(I).
La presente invención se refiere además a un
cultivo biológicamente puro de la cepa E-97 n. sp.
de Mortierella maculata depositada en la National Collection
of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría,
con el número de registro NCAIM(P)F 001266, y un
cultivo biológicamente puro de su mutante, la cepa
E-97/15/13 n. sp. de Mortierella maculata
depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial
Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro
NCAIM(P)F 001267.
La Figura 1 es una muestra de las características
físicas de Mortierella maculata n. sp.
E-97.
Durante el programa de rastreo, que comprendió
aproximadamente 5.500 cepas procarióticas y eucarióticas, se
seleccionaron 23 microorganismos, que eran capaces de hidroxilar la
compactina en oposición. De entre estas cepas, una forma de hongo
filamentoso se mostró más apropiada para producir pravastatina,
debido a su mayor resistencia con respecto a la compactina, cuando
se comparó con las cepas conocidas de las patentes ya publicadas.
Según la investigación taxonómica, esta cepa demostró constituir una
nueva representante de las especies pertenecientes al género
Mortierella (Mortierella maculata n. sp). A partir de
las formas de hongo seleccionadas se aisló, por un lado, una nueva
cepa aplicando procedimientos de selección por mutación y por el
otro, induciendo a la enzima hidroxilasa de la cepa, la cual fue
capaz de hidroxilar el substrato de compactina a pravastatina a una
concentración mayor que la publicada hasta la fecha. Como agentes
mutagénicos, se aplicaron agentes físicos y químicos (irradiación
UV, metil metano sulfonato,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina).
Después de los tratamientos mutagénicos para preparar células
haploides, la suspensión de esporas se extendió sobre placas de agar
que contenían benomil, inoculándose entonces las colonias que se
habían desarrollado sobre placas que contenían 100 \mug/ml de
8-de-(2-metil-butiril)-compactina
o placas de agar que contenían compactina, para inducir la enzima
hidroxilasa. Aplicando estos procedimientos, a partir de la nueva
cepa se preparó una cepa mutante que es capaz de convertir la
compactina a pravastatina en un grado significativamente superior
que el de la cepa parental.
Durante los experimentos de optimización se
determinaron la composición del inóculo más beneficioso, y el medio
de bioconversión más ventajoso para la hidroxilación de la
compactina, así como el procedimiento óptimo para el suministro
repetido de la compactina a una alta concentración.
Consecuentemente, la presente invención se basa
en el reconocimiento de que las cepas designadas
E-97 y E-97/15/13 del hongo aislado
denominado Mortierella maculata, que fueron depositadas con
los números de registro NCAIM(P)F 001266 y
NCAIM(P)F 001267 respectivamente, en la National
Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (Department
of Microbiology and Biotechnology, University of Horticulture and
the Food Industry, Budapest) bajo condiciones apropiadas de
fermentación, son capaces de fabricar con un alto rendimiento la
pravastatina, mientras que los compuestos relacionados no deseados
tales como las formas ácidas de
6\alpha-hidroxi-compactina,
2\alpha-hidroxi-compactina,
8-de-(2-metil-butiril)-compactina,
3\alpha,5\beta-dihidroxi-5,6-dihidro-isocompactina,
8\alpha-\beta-hidroxi-compactina
y los derivados hidroxilados en las posiciones 2 y 3 de la cadena
lateral 2-metil-butiril de la
compactina, se obtienen sólo en cantidades pequeñas o significativas
durante la bioconversión. Así, estas cepas son especialmente
apropiadas para fabricar la pravastatina a escala industrial.
Teniendo en cuenta que la producción con un bajo
coste del ingrediente activo a escala industrial es función de la
concentración del substrato de compactina, es importante tener una
cepa que sea capaz de tolerar concentraciones altas de compactina y
pravastatina. En consecuencia, otra parte importante de la invención
es el reconocimiento de que la capacidad de hidroxilación del hongo
original aislado puede mejorarse aplicando los procedimientos de
selección mediante mutación e inducción enzimática y, además, de que
mediante el desarrollo de un procedimiento apropiado de suministro
del substrato, la hidroxilación de grandes cantidades de compactina
a pravastatina pueda realizarse en un procedimiento único. En
conclusión, la nueva cepa mutante denominada como Mortierella
maculata n. sp. E-97/15/13 es especialmente
apropiada para la producción de la pravastatina.
Las características taxonómicas de las nuevas
especies fúngicas aisladas, comparándolas con los atributos
diagnósticos más importantes de las especies conocidas de
Mortierella, se describen a continuación.
En medio de agar-extracto de
malta-caseína-almidón, el micelio
aéreo se desarrolla bien (una capa de más de 10 \mum de grueso
sobre el micelio substrato). Al principio aparece como una red
blanca de hifas estrechamente entrelazadas, en las que las últimas
manchas esporulantes amarillentas de algunos mm de diámetro aparecen
de forma dispersa (la nueva denominación "maculatus" se
refiere a lo anterior: manchadas). Esta coloración amarillenta puede
a veces ocupar las superficies continuas más grandes de la red
aérea. El color del micelio del substrato se presenta sobre medio de
agar Czapek, Czapek sangre, tirosina,
caseína-almidón, extracto de malta, etc., decolorado
en su mayor parte o ligeramente amarillento. El color de la red del
micelio del substrato es ligeramente rojizo sobre el medio extracto
de levadura-glucosa-peptona. Sobre
los medios que se han listado anteriormente, no tuvo lugar la
producción de pigmentos solubles y difusibles, o sólo raramente se
produjo una coloración amarillenta. Las colonias de la cepa
E-97, debido a su producción de aceite volátil, y de
modo similar, otras muchas especies de Mortierella, (excepto
las especies de la sección Isabellina), pueden producir una
exudación de un aroma intenso muy
característico.
característico.
Los esporangióforos, designados con los números
de referencia 1 a 7 en la Figura 1, se desarrollan localmente en
grandes cantidades, frecuentemente, sobre las hifas aéreas (pero
menos en las del substrato) a distancias uno de otro muy diferentes.
No presentan ramificaciones, sino que son en su mayoría curvados o
rectos. Su longitud está generalmente entre 60 y 80 \mum. El punto
de arranque en una abrumadora mayoría de los casos está constituido
por un diámetro fuertemente engrosado y más o menos corto de las
hifas de la red aérea, a partir del cual están separados por septos.
Los mismos esporangióforos pueden estar asimismo hinchados (a veces
muy hinchados), tal como se muestra en el número de referencia 6,
pero en la dirección del esporangio se estrechan gradualmente, desde
5,0 y 9,0 \mum a 1,0 y 2,0 \mum. Constituye un importante
carácter taxonómico que los esporangióforos, por debajo, nunca se
ensanchan (véase el número de referencia (8)).
Los esporangios son esféricos; en algunos casos,
esferas ligeramente aplanadas. Su diámetro está aproximadamente
entre 6,0 y 17,0 \mum, relativamente pequeño comparado con el
tamaño de los esporangios de otras especies de Mortierella.
Los esporangios pueden contener muchas esporas, pero también existen
esporangios que sólo contienen una. Las esporas (9) son cilíndricas
o menos ovales. Su tamaño está entre 3,0 a 5,0 x 1,5 a 2,0 \mum.
En el interior de las esporas individuales, pueden encontrarse una o
dos pequeñas gotas oleosas esféricas oscuras (10). Debido a la muy
fácil desintegración de la pared del esporangio, en los entornos
húmedos, las esporas se dividirán fácilmente. Después de la
desintegración del esporangio, a veces en el extremo de los
esporangióforos, pueden observarse un fino "collar" tipo horca
y una columela rudimentaria muy corta (y que no es típica). Las
yemas (15) a (28) que son esféricas o cilíndricas pueden encontrarse
en la mayoría de los distintos medios diagnósticos. Habitualmente,
el tamaño está entre 10 y 25 \mum. En los cultivos, pueden
encontrarse cadenas de yemas esféricas (13), células en ciernes,
yemas intercaladas (15) a (23), asociaciones de hifas de crecimiento
particular espiral de una de ellas aproximadamente otras (11),
estructuras de tipo anastomótico y células gigantes. En el micelio
aéreo, pueden apreciarse también redes de hifas voluminosas muy
densas (50 a 250 pm de diámetro) (14) sin la presencia de cigotos
detectables.
Los cultivos de la cepa E-97
pueden reducir nitratos a nitritos, no hidrolizan el almidón, la
esculina, la arginina o la gelatina, pero hidrolizan los
polisorbatos Tween y no descomponen los hidrocarburos parafínicos.
Los cultivos de la cepa E-97 tienen actividad
ureasa, muestran un buen desarrollo entre pH 7,0 y 9,0 y toleran un
NaCl máximo del 2%. Los efectos de la xantina, hipoxantina,
lecitina, tirosina y adenina, son negativos. Se ha detectado una
intensa producción de ácido de los cultivos a partir de la glucosa,
fructosa, glicerina y galactosa, pero muy débil o inexistente a
partir de xilosa, arabinosa, rafinosa, sorbitol, inositol, inulina,
etc. Se detectó un débil crecimiento con piruvato y acetato, pero no
se pudo encontrar con benzoato, salicilato, citrato, lactato,
succinato, tartrato y malonato. Se observó un buen crecimiento con
glucosa y fructuosa como únicas fuentes de carbono en el medio. Los
ensayos de utilización con xilosa, arabinosa, ramnosa, sacarosa,
rafinosa, manitol e inositol, mostraron ser negativos. Los cultivos
no descomponen la celulosa.
Situación sistemática: La cepa
E-97 pertenece a la familia Mortiereláceas y es un
miembro típico del género Mortierella: Los esporangios
contienen generalmente muchas esporas, la columella está
extremadamente reducida, las yemas están frecuentemente presentes,
no se ha detectado la presencia de cigotos y las colonias exudan un
aroma fuerte muy característico. En el género Mortierella, la
cepa E-97 representa típicamente la "Sección
Alpina". Ésta puede caracterizarse por esporangióforos muy cortos
que no se ramifican (longitud máxima hasta 200 \mum), y
esporangios diminutos (Zycha, H. y Siepmann, R, Mucorales. Eine
Beschreibung aller Gattungen und Arten dieser Pilzgruppe.
D-3301 Lehre, Verl. von J.Cramer. 1969). Entre los
miembros de la sección Alpina, la cepa E-97 muestra
la mayor similitud con las especies M. thaxteri Björling 1936
y M. renispora Dixon-Stewart 1932. Sin
embargo, los datos en la Tabla 1 muestran claramente las diferencias
en las propiedades diagnósticas de la cepa E-97 de
estas dos especies. De acuerdo con esto, como nueva especie,
presentamos la cepa en la presente memoria con el nombre de
Mortierella maculata nov. spec. E-97.
En el procedimiento para la preparación de la
pravastatina según la presente invención, se utiliza preferentemente
el cultivo de la cepa fúngica denominada Mortierella maculata
n. sp. E-97 o de su forma mutante, denominada
E-97/15/13. La cepa seleccionada presenta
importantes ventajas, debido a su rápido crecimiento. Como fuente de
carbono, utiliza fácilmente glucosa, glicerina, fructosa o
galactosa. Como fuente de nitrógeno puede utilizar extracto de
levadura, peptona, caseína, extracto de carne, harina de soja, licor
de maíz, nitrato sódico, o sulfato amónico.
En el medio de cultivo utilizado para la
producción de pravastatina, además de las fuentes anteriormente
mencionadas de carbono y nitrógeno, pueden encontrarse sales
minerales, por ejemplo, fosfato dihidrógeno potásico, cloruro
magnésico, sulfato magnésico, elementos traza (sales ferrosas, de
manganeso), aminoácidos y agentes antiespuma.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, la suspensión de esporas que se ha preparado a
partir del cultivo de agar inclinado en un tubo de ensayo de la
Mortierella maculata n. sp. denominada cepa
E-97 o de su mutante [NCAIM(P)F
001267] denominado E-97/15/13, se siembra en un
medio de inoculación; entonces, el 10% del cultivo de inoculación,
que se cultiva durante 3 días entre 25 y 30ºC aproximadamente,
preferentemente entre 24 y 28ºC, y muy preferentemente a 28ºC
aproximadamente, se transfiere al medio de bioconversión. Entonces,
se incuba durante 4 días a una temperatura de entre 25ºC y 28ºC
aproximadamente preferentemente a aproximadamente 28ºC,
suministrándose entonces la glucosa y la sal sódica del ácido de
compactina al cultivo. Dependiendo de la concentración del substrato
de compactina que se ha suministrado, el cultivo se continua entre 2
y 12 días más bajo condiciones aeróbicas, mientras que el pH se
mantiene entre 5,5 y 7,5, preferentemente a 7,0. La bioconversión se
realiza bajo condiciones de aireación y de agitación, y si la
velocidad del flujo aéreo es de 0,2 vvm, la de rotación del agitador
es de 400/min.
Durante la fermentación, se hizo el seguimiento
de la bioconversión del substrato de compactina mediante un
procedimiento de cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Según
este procedimiento, la muestra del caldo de cultivo se diluye dos
veces con metanol y se centrifuga, y el sobrenadante se utiliza para
el análisis HPLC bajo los siguientes parámetros: Equipo analítico
Waters de HPLC; columna: Nucleosil C_{18} 10 \mum; longitud de
onda detectora: 238 nm; volumen de inyección: 20 \mul, velocidad
de flujo: 1 ml/min; se utiliza gradiente de elución, con los
eluyentes: A= solución acuosa al 0,05% de ácido fosfórico, B =
acetonitrilo.
| Tiempo (min) | Eluyente A (%) | Eluyente B (%) |
| 0 | 70 | 30 |
| 20 | 0 | 100 |
| 25 | 0 | 100 |
| 25,1 | 70 | 30 |
| 35 | 70 | 30 |
Tiempos aproximados de retención:
pravastatina, de 8,6 a 9,0 min; ácido de compactina de 11,6 a 12,0
min; pravastatina lactona de 15,0 a 15,5 min, compactina de 16,5 a
17,0 min.
Para la producción de pravastatina, la solución
acuosa de la sal sódica del ácido de compactina se añade en la hora
96ª del cultivo. Para este procedimiento, el substrato se prepara en
forma sólida de la manera siguiente. La compactina lactona es
hidrolizada en una solución de hidróxido sódico 0,2 M durante 2
horas a 40ºC, ajustándose entonces el pH de la reacción a 7,5
mediante ácido clorhídrico y la solución neutralizada se dispuso en
forma de capa sobre una columna adsorbente Diaion
HP-20; el cloruro sódico formado durante la
neutralización se eliminó mediante lavado acuoso de la columna, y
entonces, la sal sódica del ácido de compactina se eluyó a partir de
la columna mediante acetona acuosa al 50%. A continuación, el eluado
se destiló al vacío y el residuo acuoso se liofilizó. Después de la
neutralización, la solución acuosa del hidrolizado alcalino de la
compactina puede utilizarse directamente, asimismo, como substrato.
En este caso, el contenido de la sal sódica del ácido de compactina
del hidrolizado se mide mediante HPLC, y la solución se mantiene a
-20ºC hasta que vaya a aplicarse.
Cuanto más alto fue el pH del caldo de cultivo
alcanzado en el cuarto día de la fermentación, más ventajosa fue la
hidroxilación del substrato de compactina. Se dejó que el suministro
del substrato de compactina se iniciara cuando el pH del caldo de
cultivo sobrepasara 6,3. Como mucho, en el 4º día de la fermentación
de la solución acuosa filtrada estéril del ácido de compactina, se
añadió tanta sal sódica de ácido de compactina como se necesitó,
hasta obtener una concentración de 500 \mug/ml. Asimismo, también
se añadió al cultivo glucosa, a partir de una solución de ésta al
50%, esterilizada a 121ºC durante 25 minutos, de la siguiente forma:
si el pH del caldo de cultivo era superior al valor de 6,7, se
añadió glucosa al 1%, en relación con el volumen del caldo de
cultivo, mientras que si el pH estaba entre 6,3 y 6,7, la cantidad
suministrada de glucosa fue del 0,5%. La sal sódica del ácido de
compactina se consumió a partir del caldo de cultivo después de 24
horas, analizándose su transformación mediante la HPLC. En este
caso, por cada ml del caldo de cultivo, se añadieron otros 500
\mug de compactina. Además del substrato de compactina, se
suministró asimismo glucosa, tal como se ha descrito anteriormente.
La morfología del cultivo a las 120 horas se caracteriza por el
pequeño crecimiento del sedimento (diámetro del sedimento, entre 0,5
y 3,0 mm). Después de 24 horas, la segunda dosis del substrato
también se consumió a partir del caldo de cultivo, por lo que otra
parte de la sal sódica del ácido de compactina que produce una
concentración de 500 \mug/ml en todo el caldo de cultivo, se
añadió paralelamente al suministro de glucosa dependiente del valor
del pH del caldo de cultivo. A partir del cuarto día y hasta los
días 17º a 18º de la fermentación, los suministros de substrato y de
la glucosa se repitieron diariamente de la forma descrita
anteriormente.
Para la recuperación del producto a partir del
caldo de cultivo, es ventajoso considerar el hecho de que durante la
bioconversión la pravastatina se constituye en su forma ácida, por
lo que puede aislarse a partir del filtrado del caldo de cultivo
mediante su adsorción sobre una columna de resina de intercambio
aniónico. Para el aislamiento del producto, es ventajoso utilizar
una resina de intercambio aniónico fuertemente básica que es un
polímero de poliestireno-divinilbenceno que
vehiculiza grupos activos de amonio cuaternario. El producto puede
adsorberse directamente a partir del filtrado del cultivo, mezclando
con éste la resina de intercambio aniónico que se encuentra en forma
hidroxílica. El producto que se adsorbe en la resina de intercambio
iónico puede eluirse a partir de la columna mediante ácido acético o
una mezcla agua-acetona que contiene cloruro sódico,
preferentemente una mezcla de agua-acetona (1:1) que
contiene cloruro sódico al 1%. Las fracciones que contienen la
pravastatina se combinan y la acetona que se encuentra en el eluado
se destila al vacío. El pH del concentrado se ajusta del orden de
3,5 a 4,0 con ácido sulfúrico al 15% y la solución acuosa se extrae
con acetato de etilo. El extracto de acetato de etilo se lava con
agua y se seca con sulfato sódico anhidro, Entonces, a partir de la
pravastatina, se prepara el derivado lactónico. El cierre del anillo
de lactona se realiza en solución de acetato de etilo seco a
temperatura ambiente, bajo agitación continua induciendo la
formación de lactona con la presencia, en cantidades catalíticas,
del ácido trifluoroacético. El procedimiento de transformación se
comprueba mediante análisis de cromatografía en capa fina (TLC).
Después de finalizar la formación de la lactona, la solución de
acetato de etilo se lava primero con solución acuosa al 5% de
carbonato de hidrógeno sódico y a continuación con agua, secándose
entonces con sulfato sódico anhidro y evaporándose al vacío. El
residuo de la evaporación se trata en solución de acetona con
carbón, se evapora otra vez y se vuelve a cristalizar a partir de un
alcohol alifático que contiene un átomo de carbono 1 a 4,
preferentemente a partir de etanol. El residuo de evaporación del
licor madre de recristalización se purifica mediante cromatografía
en columna de gel de sílice, aplicando la mezcla de acetato de
etilo-n-hexano aumentando
gradualmente el contenido del acetato de etilo como eluyente.
A partir de la pravastatina lactona obtenida
después de recristalización y de purificación cromatográfica, se
prepara la pravastatina mediante hidrólisis a temperatura ambiente
en acetona, con una cantidad equivalente de hidróxido sódico. Cuando
la formación de la sal sódica de pravastatina se completa, la mezcla
reactiva se diluye con agua y se neutraliza, destilándose al vacío
el contenido en acetona. La pravastatina se adsorbe a partir del
residuo acuoso obtenido en una columna que contiene resina Diaion
HP-20, se lava con agua desionizada y se eluye a
partir de la columna con una mezcla de acetona-agua
desionizada. Entonces, las fracciones que contienen pravastatina se
combinan, el contenido de acetona se destila y después de
liofilización del residuo acuoso, puede obtenerse la pravastatina
con una gran pureza, pudiéndose recristalizar a partir de una mezcla
de acetato de etilo-etanol.
Durante el procedimiento, la cantidad total de
pravastatina puede ser adsorbida. Durante el cierre de la lactona de
la pravastatina, pueden formarse asimismo la
3\alpha-hidroxi-iso-compactina
y otros productos de desecho. Aunque estas últimas reacciones
disminuyen el rendimiento del aislamiento, aquéllos compuestos
pueden separarse mediante el procedimiento de purificación
anteriormente mencionado y, en consecuencia, la pravastatina puede
prepararse de esta forma de una calidad farmacéuticamente
aceptable.
Después de finalizar la bioconversión, la
pravastatina puede extraerse a partir del caldo de cultivo o del
filtrado obtenido después de la separación de las células fúngicas
filamentosas. Las células fúngicas filamentosas pueden eliminarse
mediante filtración o centrifugación; sin embargo, es ventajoso,
especialmente a escala industrial, realizar una extracción del caldo
de cultivo en su totalidad. Antes de la extracción, el pH del caldo
de cultivo de la fermentación o del filtrado de éste, se ajusta a un
valor de entre 3,5 y 3,7 con un ácido mineral, preferentemente con
ácido sulfúrico diluido. La extracción se realiza con un éster del
ácido acético y un alcohol alifático que contiene 24 átomos de
carbono, preferentemente con acetato de etilo o acetato isobutílico.
Las etapas de extracción deberán realizarse, y muy rápidamente para
evitar la formación del derivado de lactona a partir de la
pravastatina, a un pH ácido.
A partir del extracto del disolvente orgánico, la
pravastatina en forma ácida puede transferirse como sal sódica a a
la fase acuosa. Por ejemplo, a partir de un extracto de acetato de
etilo, la pravastatina puede extraerse en una proporción volumétrica
de 1/10 y de 1/20 del carbonato de hidrógeno sódico al 5%, o de agua
ligeramente alcalina (pH entre 7,5 y 8,0). Se descubrió que la
pravastatina puede recuperarse en forma pura a partir del extracto
acuoso alcalino obtenido anteriormente mediante cromatografía en
columna, aplicando una resina no iónica de adsorción. Un
procedimiento ventajoso es eliminar en primer lugar el disolvente
disuelto en la fase acuosa mediante destilación al vacío a partir
del extracto acuoso alcalino, y entonces cargar éste en una columna
Diaion HP-20.
Adsorbiéndose la sal sódica de la pravastatina en
la columna se purifica por elución, aumentando gradualmente el
contenido de acetona de las soluciones acuosas, combinándose y
concentrándose al vacío, entonces, las fracciones principales que
contienen pravastatina. El concentrado acuoso es purificado
posteriormente mediante cromatografía en otra columna Diaion
HP-20, obteniendo un eluado que contiene
pravastatina pura, a partir del cual, después de clarificación con
carbón y liofilización, puede obtenerse la pravastatina de una
calidad farmacéuticamente aceptable.
Este procedimiento de aislamiento está
constituido por menos etapas que el anterior, ya que la formación de
la lactona de la pravastatina y su hidrólisis no están implicadas en
el procedimiento. Durante el aislamiento, la pravastatina se expone
a condiciones ácidas durante sólo un tiempo limitado, bajo las
cuales es menos estable que en las soluciones alcalinas o neutras, y
en consecuencia, durante este procedimiento de aislamiento no se
forman prácticamente artefactos.
Además, se descubrió que la cromatografía sobre
el gel de Dextrano LH-20 de Sephadex (derivado
hidroxipropilado) se utiliza ventajosamente para purificar la
pravastatina. Aplicando este procedimiento puede producirse
pravastatina que sobrepase la pureza del 99,5% (medida mediante
HPLC).
Durante los experimentos de la presente
invención, se reconoció que a partir del extracto del disolvente
orgánico, preferentemente del extracto de acetato de etilo o del
acetato de isobutilo del caldo de cultivo, o del nitrato del caldo
de cultivo del hongo filamentoso de las cepas bacterianas
filamentosas, entre ellas la de Mortierella maculata n. sp.
capaz de hidroxilar en posición 6\beta un compuesto de fórmula
general (II), la pravastatina puede precipitarse, con aminas
secundarias, como una sal cristalina. Además, se constató que para
la formación de la sal, son apropiadas varias aminas secundarias que
contenían sustituyentes alquilo, cicloalquilo-, aralquilo-, o
arilo-. De entre ellas se seleccionaron oportunamente aminas
secundarias no tóxicas, por ejemplo, dioctilamina,
diciclohexilamina, dibencilamina. El aislamiento de las sales
orgánicas intermediarias de las aminas secundarias, por ejemplo, de
la sal de la dibencilamina, se llevó a cabo añadiendo dibencilamina
en una cantidad equivalente a 1,5, relacionada con el contenido de
pravastatina del extracto, concentrándose entonces éste mediante
destilación al vacío al 5% de su volumen original, añadiéndose
entonces otra cantidad de dibencilamina al concentrado en una
proporción equivalente de 0,2. La sal cristalina de dibencilamina
precipita a partir del concentrado. El producto en bruto cristalino
se filtra y se seca al vacío. Entonces, se clarifica con carbón y se
vuelve a cristalizar en acetona.
En el procedimiento que se menciona
anteriormente, en el que están implicadas la extracción del
disolvente orgánico y la reextracción a pH alcalino, el
procedimiento de aislamiento que se basa en la formación de las
sales de las aminas secundarias puede utilizarse asimismo para
reemplazar la purificación con la columna cromatográfica. En este
caso, es ventajoso precipitar la sal de dibencilamina de la
pravastatina a partir del extracto de acetato isobutílico obtenido
después de la acidificación del extracto acuoso alcalino.
Las sales orgánicas de las aminas secundarias
pueden transformarse en pravastatina mediante hidróxido sódico o con
un alcóxido sódico, preferentemente etóxido sódico.
La transformación se detalla en el caso de la sal
de dibencilamina de la pravastatina. La sal de dibencilamina que se
ha vuelto a cristalizar, se suspende en una mezcla de agua y acetato
de isobutilo, añadiéndose entonces una cantidad equivalente de
hidróxido sódico en solución acuosa a la suspensión, manteniendo el
pH entre 8,0 y 8,5 mediante agitación. Después de la desaparición de
la suspensión, las fases se separan y la solución acuosa que
contiene pravastatina se lava dos veces con acetato de isobutilo. La
solución acuosa se clarifica con carbono activado y se liofiliza,
produciendo pravastatina de una calidad farmacéuticamente
aceptable.
Un procedimiento preferido para transformar la
sal de dibencilamina de la pravastatina en pravastatina es suspender
la sal de dibencilamina recristalizada en etanol, añadir entonces
bajo agitación a la suspensión la cantidad equivalente o un pequeño
exceso de etóxido sódico, concentrar entonces la mezcla reactiva al
vacío y añadir acetona: la pravastatina se precipita en forma
cristalina a partir del concentrado.
Otro procedimiento preferido para transformar la
sal de dibencilamina de la pravastatina en pravastatina es suspender
la sal de dibencilamina recristalizada en una mezcla de etanol-
acetato de etilo, añadir una cantidad equivalente o un pequeño
exceso de hidróxido sódico en etanol a la solución, y la
pravastatina se precipita.
El aislamiento de la pravastatina a través de una
sal amínica secundaria intermediaria constituye un procedimiento más
sencillo que cualquiera de los procedimientos de aislamiento
anteriormente conocidos. Durante el procedimiento, no se forman
artefactos, y la separación de la pravastatina de los productos de
desecho de la bioconversión y de los diversos productos metabólicos
sintetizados por el microorganismo hidroxilante puede resolverse sin
aplicar ningún procedimiento cromatográfico.
Las estructuras de la pravastatina, pravastatina
lactona y de las sales de las aminas secundarias aisladas de la
pravastatina, se han verificado mediante UV, IR,
^{1}H-RMN, ^{13}C-RMN y
procedimientos de espectroscopía de masas.
La invención se describirá y entenderá más
claramente haciendo referencia a los ejemplos que se expresan a
continuación, que se presentan a título de ilustración y no
limitativo del alcance de la invención.
Se preparó una suspensión de esporas con 5 ml de
una solución de cloruro sódico al 0,9% obtenida a partir de un
cultivo inclinado en un tubo de ensayo, de agar con extracto de
levadura-extracto de malta con una duración de entre
7 y 10 días, de una cepa de Mortierella maculata nov. spec.
E-97 [NCAIM(P)F 001266], capaz de
6\beta-hidroxilar la compactina, utilizándose la
suspensión para inocular 100 ml de medio PI de inoculación
esterilizado en un matraz Erlenmeyer de 500 ml.
| glucosa | 50 g |
| harina de soja | 20 g |
| en 1000 ml de agua corriente |
Antes de la esterilización, el pH del medio se
ajustó a 7,0, esterilizándose éste entonces a 121ºC durante 25
minutos. El cultivo se agitó mediante un agitador rotatorio (250
rpm, 2,5 cm de amplitud) durante 3 días a 28ºC, transfiriéndose
entonces 10 ml del cultivo obtenido a 100-100 ml de
medio de bioconversión MU/4 esterilizado en un matraz Erlenmeyer de
500 ml durante 25 minutos a 121ºC.
| glucosa | 40 g |
| harina de soja | 20 g |
| caseína-peptona | 1g |
| asparagina | 2 g |
| fosfato dihidrógeno potásico | 0,5 g |
| en 1000 ml de agua corriente |
Antes de la esterilización, el pH del medio se
ajustó a 7,0, esterilizándose éste entonces a 121ºC durante 25
minutos.
Los matraces se agitaron en un agitador rotatorio
(250 rpm, 2,5 cm de amplitud) durante 4 días a 25ºC, añadiéndose
entonces a los cultivos 50-50 mg de substrato de
compactina (sal sódica del ácido de compactina) en forma acuosa
filtrada estéril, continuándose entonces el cultivo. De modo
similar, en el 5º día, otros 50-50 mg de la sal
sódica del ácido de compactina se añadieron a los cultivos de
hongos, y se continuó la fermentación durante otras 24 horas. El
contenido en pravastatina del caldo de cultivo se determinó mediante
HPLC. La fermentación se continuó durante 168 horas. Al final de la
bioconversión, la concentración promedio de la pravastatina del
caldo de fermentación fue de 620 \mug/ml.
En un fermentador a escala de laboratorio con un
volumen de trabajo de 5 litros, se preparó un medio de cultivo MU/S
de bioconversión, y los componentes del medio de cultivo que se
añadieron correspondían a un volumen de 5 litros, pero se cargó sólo
hasta 4,5 litros, esterilizándose entonces durante 45 minutos a
121ºC y sembrándose con 500 ml del cultivo de inoculación, preparado
según el Ejemplo 1.
| glucosa | 20 g |
| glicerina | 20 g |
| harina de soja | 20 g |
| peptona | 5 g |
| fosfato dihidrógeno de potasio | 0,5 g |
| polipropilenglicol 2000 | 1 g |
| en 1000 ml de agua corriente |
Antes de la esterilización, el pH del medio se
ajustó a un valor de 7,0.
La fermentación se realizó a 28ºC, con una
velocidad de agitación de 400 rpm y con un grado de aireación de 60
litros/hora durante 4 días a partir de la dirección del fondo. En el
2º día después de la transferencia, el cultivo empezó a producir
espuma intensamente, que disminuyó añadiendo más polipropilenglicol
2000. Al comienzo de la fermentación (16 a 20 horas) el pH disminuyó
desde el valor inicial de 6,5 a entre 5,0 y 5,5, y entonces, desde
el 3^{er} día empezó a aumentar y alcanzó entre 6,3 y 7,5 en el
cuarto día. Se permitió que el suministro del substrato de
compactina empezara si el pH del caldo de cultivo era superior a
6,3. En el 4º día de la fermentación, se añadieron 2,5 g de
substrato de compactina en solución acuosa filtrada estéril. Se
añadió al cultivo glucosa entre el 0,5 y el 1,0%, calculada para el
volumen del caldo de cultivo dependiendo del pH, en forma de una
solución al 50% esterilizada a 121ºC durante 25 minutos
paralelamente al suministro del substrato. Después de 24 horas, el
substrato de compactina se consumió a partir del cultivo,
detectándose mediante HPLC a partir de las muestras tomadas del
fermentador. En este caso otros 2,5 g de substrato de compactina y
glucosa se añadieron tal como se ha descrito anteriormente, y la
bioconversión se continuó durante otras 24 horas, cuando el
substrato se convirtió a pravastatina.
Después de finalizar la fermentación, 5,1 litros
del caldo de cultivo que contenían 630 \mug/ml de pravastatina se
filtraron sobre un paño de filtro. Se añadieron dos litros de agua
al micelio separado, agitándose entonces la suspensión del micelio
durante una hora y filtrándose. Estos dos filtrados se combinaron y
se hicieron pasar con una velocidad de flujo de 500 ml/hora a través
de una columna Dowex Al 400 (OH) que contenía 138 g
(250 ml) de resina (diámetro de columna 3,4 cm), altura del lecho de
resina de 28 cm), lavándose entonces este lecho de la resina con 300
ml de agua desionizada. A continuación, se realizó la elución a
partir de la resina mediante una mezcla de 1 litro de
acetona-agua (1:1) que contenía 10 g de cloruro
sódico. El volumen de las fracciones fue de 100 ml cada una. El
eluado se analizó mediante el siguiente procedimiento cromatográfico
en capa fina (procedimiento TLC): adsorbente: lámina flexible de
aluminio Kieselgel 60 F _{254} DC (Merck); disolvente de revelado:
mezcla de acetona-benceno-ácido acético (50:50:3);
detección: con el reactivo ácido fosfomolíbdico. El valor de R_{f}
de la pravastatina es de 0,5. Las fracciones que contenían el
producto se combinaron y la acetona se destiló al vacío. El pH del
concentrado de 400 ml se ajustó a entre 3,5 y 4,0 mediante ácido
sulfúrico al 15%, extrayéndose entonces tres veces con 150 ml de
acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo se combinaron y
secaron con sulfato sódico anhidro. A continuación, se preparó la
pravastatina lactona a partir de la pravastatina ácida, añadiendo a
temperatura ambiente, bajo agitación continua, ácido
trifluoroacético en cantidades catalíticas. La formación de
pravastatina lactona se controló mediante TLC (el valor R_{f} de
la pravastatina lactona en el sistema TLC anterior es de 0,7).
Después de completarse la formación de la lactona, el acetato de
etilo se lavó con 2 x 50 ml de solución acuosa al 5% de carbonato de
hidrógeno sódico, lavándose entonces con 50 ml de agua, secándose
con sulfato sódico anhidro y evaporándose al vacío. El residuo de
evaporación obtenido en una cantidad de 3 g, se disolvió en 100 ml
de acetona y se clarificó con 0,3 g de carbón. Entonces se filtró el
carbón y la acetona se evaporó al vacío. El producto en bruto
obtenido se cristalizó a partir de 20 ml de etanol. La pravastatina
lactona cristalina precipitada se filtró y se lavó sobre el filtro
con 30 ml de n-hexano, secándose a temperatura
ambiente al vacío. De esta forma, se obtuvieron 1,5 g de
pravastatina cromatográficamente pura. Temperatura de ebullición,
140-142ºC [\alpha]^{D}= +194º (c= 0,5,
metanol). El licor madre de la cristalización se evaporó al vacío,
obteniéndose un residuo de evaporación de 1,2 g, el cual se
cromatografió en una columna que contenía 24 g de adsorbente
Kieselgel 60 (diámetro de la columna: 1,6 cm, altura del lecho: 20
cm). El producto en bruto disuelto en 5 ml de benceno, se depositó
en la columna. Para la elución se utilizaron mezclas de acetato de
etilo-n-hexano en las que el
contenido en acetato de etilo aumentaba gradualmente. La
pravastatina lactona puede eluirse a partir de la columna con la
mezcla de acetato de etilo al 60% n-hexano al 40%.
Las fracciones se controlaron mediante TLC utilizando la mezcla de
acetato de etilo-n-hexano (9:1) como
disolvente de revelado. Las fracciones que contenían
pravastatina-lactona se combinaron y evaporaron al
vacío. Según este procedimiento, se obtuvieron 0,3 g de producto
puro, siendo su calidad, idéntica a la de la pravastatina lactona
obtenida por cristalización.
Los dos lotes de pravastatina lactona se
combinaron y se preparó la sal sódica según el procedimiento
siguiente: 1,8 g de pravastatina lactona se disolvieron en 20 ml de
acetona, y con agitación, se añadieron 4,5 ml de hidróxido sódico 1M
acuoso, agitándose entonces la solución durante una media hora a
temperatura ambiente. Cuando la formación de la sal finalizó, 20 ml
de agua se añadieron a la mezcla y la solución fue neutralizada,
evaporándose entonces la acetona al vacío. El concentrado acuoso fue
cromatografiado en una columna rellena con 150 ml de resina Diaion
HP 20 (diámetro de la columna: 2,6 cm, altura del lecho: 30 cm).
Como agentes eluyentes se utilizaron mezclas de
acetona-agua desionizada, en las que la
concentración de acetona aumentó en etapas del 5%. La pravastatina
puede eluirse a partir de la columna mediante una mezcla de agua
desionizada-acetona que contiene acetona al 15%. Las
fracciones se analizaron mediante TLC. Las fracciones que contenían
el producto se combinaron y la acetona se evaporó al vacío. Se
obtuvieron 1,3 g de pravastatina mediante liofilización del residuo
acuoso. El producto cromatográficamente puro se cristalizó a partir
de una mezcla de etanol y acetato de etilo.
Temperatura de fusión: 170-173ºC
(descomposición)
[\alpha]^{D} _{20}= +156º, (c= 0,5,
en agua).
Espectro de absorción del ultravioleta (20
\mug/ml, en metanol): \lambda_{max} = 231, 237, 245 nm (log
\varepsilon-4,263; 4,311; 4,136)
Espectro de absorción infrarrojo (KBr): \nuOH
3415, \nuCH 2965, \nuC=O 1730, \nuCOO^{-} 1575 cm^{-1}
Espectro ^{1}H-RMN (D_{2}O,
\delta, ppm): 0,86, d, 3H (2-CH_{3}); 5,92, dd,
J=10,0 y 5,4 Hz, 1H (3-H); 5,99, d, J=10,0 Hz, 1H
(4-H); 5,52, br 1H (5-H); 4,24, m,
1H (6-H); 5,34, br, 1H (8-H); 4,06,
m, 1H (\beta-H), 3,65, m, 1H
(\delta-H); 1,05, d, 3H
(2'-CH_{3}); 0,82, t, 3H
(4'-H_{3}).
Espectro ^{13}C-RMN (D_{2}O,
\delta, ppm): 15,3, q (2-CH_{3}); 139,5, d,
(C-3); 129,5, d, (C-4); 138,1, s,
(C-4a), 127,7, d, (C-5); 66,6 d
(C-6); 70,1, d (C-8); 182,6, s,
(COO^{-}); 72,6, d (C-\beta); 73,0 d
(C-\delta); 182,0, s (C-1'); 18,8,
q (2'-CH_{3}); 13,7, q (C-4').
Espectro de masas FAB positivo (iones
característicos):
[M + Na]^{-} 469; [M + H]^{+}
447.
Espectro de masas FAB negativo (iones
característicos):
[M-H]^{-} 445,
[M-Na]^{+} 423, m/z 101 [ácido
2-metil-butírico-H]^{-}
En un fermentador a escala de laboratorio con un
volumen de trabajo de 5 litros, se preparó un medio de cultivo MU/4
de bioconversión según se describe en el Ejemplo 1, y aunque se
cargó hasta 4,5 litros, la composición del medio de cultivo se
calculó hasta 5 litros, esterilizándose entonces durante 45 minutos
a 121ºC y sembrándose con 500 ml del cultivo de inoculación,
preparado según el Ejemplo 1. La fermentación se realizó a 25ºC,
aplicando una velocidad de agitación de 300 rpm y con una tasa de
aireación de 50 litros/hora durante 4 días. Después de suministrar 5
g de substrato de compactina al cultivo, se realizó la bioconversión
según el Ejemplo 2.
Después de finalizar la bioconversión, el caldo
de 4,9 litros, que contenía 660 \mug/ml de pravastatina, se filtró
y el micelio separado se lavó suspendiéndolo en 2x1 litros de agua
desionizada. El pH del filtrado combinado de 5,6 litros del caldo de
cultivo se ajustó mediante el ácido sulfúrico al 20% a entre 3,5 y
3,7, agitándose entonces el filtrado ácido con 2750 ml de acetato de
etilo durante 30 minutos. A continuación, las fases se separaron. La
fase acuosa se extrajo otra vez con 2x1375 ml de acetato de etilo.
470 ml de agua desionizada se añadieron al extracto combinado de
4740 ml de acetato de etilo, ajustándose entonces el pH de la mezcla
acuosa de acetato de etilo a entre 7,5 y 8,0 mediante hidróxido
sódico 1M. Después de 20 minutos de agitación, las fases se
separaron, extrayéndose entonces el extracto de acetato de etilo con
2x235 ml de agua desionizada, tal como se ha descrito anteriormente.
Entonces la solución acuosa combinada débilmente alcalina de un
volumen de 1080 ml, se concentró al vacío hasta un volumen de 280
ml. La solución acuosa concentrada se depositó en una columna
cromatográfica (proporción de la altura al diámetro = 6,5) rellena
con 280 ml de resina no iónica Diaion HP-20
(Mitsubishi, Co., Japón). La adsorción en la columna se realizó a
una velocidad de flujo de 250 a 300 ml/hora, lavándose entonces la
columna con 840 ml de agua desionizada. A continuación, la columna
se eluyó en el orden siguiente, con 800, 1000, 500 y 500 ml de agua,
que contenían respectivamente 5%, 10%, 15% y 20% de acetona. Durante
la elución se recuperaron fracciones de 50 ml, que se analizaron
mediante el procedimiento TLC que se ha procurado en el Ejemplo 2.
Las fracciones que contenían pravastatina como componente principal,
se combinaron y la solución obtenida se concentró al vacío hasta un
volumen de 260 ml. La solución acuosa concentrada se cromatografió
en una columna que contenía resina Diaion HP-20 en
un volumen de 260 ml. Después de la adsorción de la pravastatina, la
columna se lavó con 790 ml de agua desionizada, eluyéndose entonces
con soluciones acuosas de acetona en porciones de
260-260 ml aumentando gradualmente el contenido en
acetona de la siguiente manera: 2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 12,5, 15,0 y
20,0%. Durante la cromatografía en columna se recuperaron fracciones
de 25 ml, y el contenido en pravastatina de las fracciones se
analizó tal como se indicó anteriormente. Las fracciones que
contenían pravastatina como único componente mediante la TLC, se
combinaron y evaporaron al vacío. A continuación, se añadieron 0,3 g
de carbón a la solución acuosa concentrada (aproximadamente 30 ml) y
la pravastatina se clarificó a temperatura ambiente durante 30
minutos. Entonces, el carbón se eliminó mediante filtración a partir
de la solución y el filtrado se liofilizó. De esta forma se
obtuvieron
1,62 g de pravastatina en forma liofilizada.
1,62 g de pravastatina en forma liofilizada.
A partir del cultivo inclinado en un tubo de
ensayo de la cepa de Mortierella maculata nov. spec.
E-97 [NCAIM(P)F 001266] cultivada
entre 10 y 12 días, se preparó una suspensión de esporas con 5 ml de
solución estéril de cloruro sódico al 0,9%, utilizándose esta
suspensión para inocular 500 ml de medio inóculo VHIG,
esterilizándose en un matraz Erlenmeyer de 3000 ml.
| glucosa | 30 g |
| extracto de carne | 8 g |
| extracto de levadura | 1 g |
| Tween-80 (polioxietileno (20) sorbitan monooleato) | 0,5 g |
| en 1000 ml de agua corriente |
Antes de la esterilización, el pH del medio se
ajustó a 7,0 y dicha esterilización se realizó a 121ºC durante 25
minutos. El cultivo se realizó durante 3 días en un agitador
rotatorio (250 rpm, amplitud 2,5 cm), utilizándose entonces el
cultivo obtenido del inóculo para inocular un fermentador a escala
de laboratorio que contenía medio de cultivo de bioconversión PK en
un volumen de trabajo de 5 litros.
| glucosa | 40 g |
| peptona | 5 g |
| harina de soja | 20 g |
| K_{2}HPO_{4} | 2 g |
| KH_{2}PO_{4} | 1 g |
| NaNO_{3} | 2 g |
| KCl | 0,5 g |
| en 1000 ml de agua corriente. |
Antes de la esterilización, el pH del medio se
ajustó a 7,0. Después de la inoculación, el cultivo, el suministro
del substrato y la bioconversión se realizaron según el Ejemplo 2,
aislándose entonces la pravastatina del caldo en el cual su
concentración fue de 650 \mug/ml al final de la fermentación.
Finalizando la fermentación, el pH de los 4,9
litros del caldo que contenía 650 \mug/ml de pravastatina, se
ajustó bajo agitación continua con hidróxido sódico 2M a un pH entre
9,5 y 10,0, ajustándose entonces después de una hora de agitación a
pH entre 3,5 y 3,7 con ácido sulfúrico al 20%. A continuación, la
solución ácida se extrajo con 2,45 litros de acetato de etilo. Las
fases se separaron, y mediante centrifugación se preparó un extracto
limpio a partir de la fase orgánica emulsificada. El caldo se
extrajo otra vez con 2 x 1,22 litros de acetato de etilo mediante el
procedimiento que se ha proporcionado anteriormente. Los extractos
de acetato de etilo se combinaron y se añadieron 0,4 litros de agua
desionizada, ajustándose entonces el pH de la mezcla a entre 8,0 y
8,5 con hidróxido sódico 1M. Las fases se separaron, y la fase de
acetato de etilo se extrajo con 2 x 0,2 litros de agua desionizada
de pH entre 8,0 y 8,5 como se ha explicado anteriormente. El pH de
la pravastatina combinada que contenía una solución acuosa alcalina
débil se ajustó bajo agitación con una solución de ácido sulfúrico
al 20% con un pH de entre 3,5 y 3,7. La solución ácida obtenida se
extrajo con 4 x 0,2 litros de acetato de etilo. Los extractos
combinados de acetato de etilo se lavaron con 2 x 0,2 litros de agua
desionizada, añadiéndose entonces a la solución de acetato de etilo
dibencilamina en un porcentaje de 150 moles -calculados para el
contenido de pravastatina medido mediante HPLC-. La solución de
acetato de etilo se concentró al vacío hasta un volumen de 0,2
litros. Posteriormente, se añadió dibencilamina en un porcentaje de
20 moles al concentrado obtenido, y la solución que precipitó se
mantuvo durante la noche a entre 0 y 5ºC. La sal de dibencilamina de
pravastatina que había precipitado, se filtró, lavándose el
precipitado sobre el filtro con acetato de etilo enfriado y entonces
dos veces con n-hexano, y secándolo finalmente al
vacío entre 40 y 50ºC. El producto en bruto obtenido (3,9 g) se
disolvió en 100 ml de metanol a temperatura ambiente, clarificándose
entonces la solución mediante 0,45 g de carbón. A continuación, el
filtrado de alcohol metilo se concentró al vacío. El residuo
evaporado se disolvió en 120 ml de acetona a una temperatura externa
de entre 62 y 66ºC, enfriándose entonces la solución a temperatura
ambiente. A continuación, se continuó la recristalización por la
noche a entre 0 y 5ºC. Los cristales que precipitaron se filtraron,
lavándose entonces éstos sobre el filtro dos veces con acetona fría
y dos veces con n-hexano. La sal de dibencilamina
recristalizada de pravastatina se suspendió en la mezcla de 160 ml
de acetato de isobutilo y de 80 ml de agua desionizada. A
continuación, se añadió a la suspensión, bajo agitación, hidróxido
sódico en una cantidad equivalente. Después de la desaparición de la
suspensión, las fases se separaron y la solución acuosa que contenía
la pravastatina se lavó con 2 x 30 ml de acetato de isobutilo. La
solución acuosa obtenida se clarificó con carbón. Entonces, el
filtrado acuoso se concentró hasta un volumen de 20 ml
aproximadamente. La solución acuosa obtenida se cargó en una columna
cromatográfica (altura: diámetro=22) rellena con 0,4 litros de gel
LH-20 en Sephadex (proveedor: Pharmacia, Suecia).
Durante la cromatografía, se utilizó el agua desionizada como el
eluyente, y se recuperaron fracciones de 20 ml. Las fracciones se
analizaron mediante TLC, y asimismo, entonces, las que contenían
pravastatina, mediante HPLC utilizando los procedimientos descritos
anteriormente. Las fracciones que contenían pravastatina pura se
combinaron y liofilizaron. De esta forma, se obtuvieron 1,75 g de
pravastatina, cuya pureza es mayor que el 99,5% mediante
HPLC.
HPLC.
A partir del cultivo inclinado en un tubo de
ensayo de la cepa de Mortierella maculata n. spec.
E-97 [NCAIM(P)F 001266] cultivada
entre 10 y 12 días, se preparó una suspensión de esporas con 5 ml de
solución estéril de cloruro sódico al 0,9%, y entonces 500 ml del
medio de inoculación se inocularon con ella tal como se describe en
el Ejemplo 4. En un fermentador a escala de laboratorio con un
volumen de trabajo de 5 litros, el medio de cultivo PC/4 de
bioconversión es esterilizado durante 45 minutos a 121ºC y es
inoculado, entonces, con el cultivo de
siembra.
siembra.
| Extracto de malta | 5,0% |
| Harina de soja | 1,0% |
| Peptona | 1,0% |
| Licor de maíz | 1,0% |
| MgSO_{4} x 7H_{2}O | 0,1% |
| en 1000 ml de agua corriente |
Antes de la esterilización, el pH del medio se
ajustó a 7,0. Después de la inoculación, el cultivo y el suministro
del substrato se realizaron según el Ejemplo 2, y entonces, se
obtuvieron 5,1 litros de caldo con una concentración de 610
\mug/ml de pravastatina.
A partir del caldo se produjeron mediante el
procedimiento que se da a conocer en el Ejemplo 4, 3,7 g del
producto en bruto de la sal de dibencilamina de pravastatina, a
partir del cual se obtuvieron 2,9 g de la sal de dibencilamina de
pravastatina, después de recristalización. La sal de dibencilamina
pravastatina recristalizada se suspendió en 45 ml de etanol,
añadiéndose entonces bajo agitación hidróxido sódico en un
porcentaje de 110 moles, suministrando una solución de hidróxido
sódico etanólica 1 M. La agitación de la solución continuó durante
media hora, añadiéndose entonces a ella 0,3 g de carbón y agitando
durante otra media hora. La solución se filtró entonces, y el
filtrado se concentró hasta 15 ml. Entonces, se añadieron 60 ml de
acetona al concentrado a una temperatura de entre 56 y 60ºC. La
solución obtenida se enfrió a temperatura ambiente, manteniéndola
entonces durante la noche a +5ºC. A continuación, se filtró el
precipitado, lavándose entonces con 2 x 20 ml de acetona, 2 x 20 ml
de acetato de etilo y 2 x 20 ml de n-hexano,
secándose finalmente al vacío. Los 1,7 g resultantes de pravastatina
se disolvieron en etanol, se clarificaron con carbono y se
cristalizaron a partir de una mezcla de acetato de
etilo-etanol. De esta forma, se obtuvieron 1,54 g de
pravastatina que fueron idénticos con el producto del Ejemplo 2.
Tal como se describe en el Ejemplo 4, a partir
del cultivo inclinado en un tubo de ensayo de la cepa de
Mortierella maculata n. spec. E-97
[NCAIM(P)F 001266] cultivada entre 7 y 10 días, un
medio MI de inoculación de 500 ml esterilizado en un matraz
Erlenmeyer de 3000 ml, se inoculó e incubó a 28ºC durante 3 días en
un agitador rotatorio.
| glucosa | 40 g |
| caseína | 5 g |
| KCl | 0,5 g |
| NaNO_{3} | 3 g |
| KH_{2}PO_{4} | 2 g |
| MgSO_{4} x 7H_{2}O | 0,5 g |
| FeSO_{4} x 7H_{2}O | 0,01 g |
| en 1000 ml de agua corriente |
Antes de la esterilización, el pH del medio se
ajustó a 6,0 y dicha esterilización se llevó a cabo a 121ºC durante
35 minutos. El cultivo de siembra obtenido se inoculó en un medio
P12 de bioconversión de 5 litros, esterilizado en un
fermentador.
| glucosa | 10 g |
| extracto de malta | 50 g |
| extracto de levadura | 5 g |
| licor de maíz | 5 g |
| MgSO_{4} x 7H_{2}O | 1 g |
| Tween -80 | 0,5 g |
| en 1000 ml de agua corriente |
Antes de la esterilización, el pH del medio se
ajustó a 7,0 y dicha esterilización se realizó a 121ºC durante 45
minutos. La fermentación, el suministro del substrato y la
bioconversión se realizaron según el Ejemplo 2. Después de finalizar
la bioconversión, la pravastatina formada en una concentración de
620 \mug/ml, se aisló del modo siguiente:
El pH de 5,15 litros del caldo de cultivo que
contenían 620 \mug/ml de pravastatina se ajustó con hidróxido
sódico 2M a un valor de 9,5, agitándose entonces a temperatura
ambiente durante 1 hora. El caldo se filtró y el micelio se lavó con
una suspensión en 1 x 2 litros y entonces en 1 x 0,5 litros de agua.
Los filtrados se combinaron y el pH de la solución acuosa se ajustó
con ácido sulfúrico al 20% al valor 3,7, extrayéndose con 2,5 litros
entonces con 1,5 litros de acetato de etilo. Los extractos de
acetato de etilo se combinaron, se lavaron con 2 x 0,5 litros de
agua, añadiéndose 1,95 g de diciclohexilamina. El extracto de
acetato de etilo se concentró a 40ºC a 200 ml bajo presión reducida,
y se añadieron otra vez al concentrado 0,195 g de diciclohexilamina,
el cual se agitó entonces a 15ºC durante 6 horas. El material
cristalino se precipitó, se lavó con 20 ml y con 15 ml de acetato de
etilo y se secó a 40ºC. De esta forma se obtuvieron 3,51 g del
producto en bruto. Después de la recristalización del producto en
bruto en una mezcla acetona-etanol, se obtuvieron
3,05 g de la sal de diciclohexilamina de la pravastatina
(temperatura de fusión: entre 162 y 168ºC), que se convirtió a
pravastatina según el Ejemplo 5.
La fermentación, suministro del substrato y
bioconversión se realizaron con la cepa de Mortierella
maculata n. spec. E-97 [NCAIM(P)F
001266], tal como se describe en el Ejemplo 2. La pravastatina
obtenida como resultado de la bioconversión se aisló del caldo de la
forma siguiente:
5 litros del caldo de cultivo que contenían 630
\mug/ml de pravastatina se filtraron sobre un paño de filtro. El
micelio del hongo se agitó en 2 litros de solución de hidróxido
sódico 0,1 M durante una hora, filtrándose. Estos dos filtrados se
combinaron y el pH se ajustó con ácido sulfúrico al 15% a un valor
de entre 3,5 y 4,0. A continuación, la solución se extrajo con 2 x
1,8 litros de acetato de etilo. Las fases de acetato de etilo
combinadas se lavaron con 800 ml de agua. Entonces, se añadieron 400
ml de agua desionizada y el pH de la mezcla se ajustó mediante
hidróxido sódico 1M a un valor de entre 8,0 y 8,5. La mezcla se
agitó durante 15 minutos, separándose entonces las fases. Se
añadieron 300 ml de agua a la fase de acetato de etilo y el pH se
ajustó entre 8,0 y 8,5. Después de agitar durante 15 minutos, las
fases se separaron. Se añadieron otra vez 300 ml de agua a la fase
de acetato de etilo y el pH se ajustó entre 8,0 y 9,5, Entonces, la
mezcla se agitó durante 15 minutos. Las dos fases se separaron otra
vez. Todas las fases acuosas se combinaron y el pH se ajustó con
ácido sulfúrico al 15% a un valor de entre 3,5 y 4,0, extrayéndolas
entonces con 3 x 300 ml de acetato de etilo. Los extractos
combinados de acetato de etilo se lavaron con 150 ml de agua, se
sacaron con sulfato sódico anhidro y se filtraron. Entonces, se
añadió al extracto de acetato de etilo dioctilamina en un porcentaje
de 150 moles-calculado para el contenido de
pravastatina. El acetato de etilo se evaporó hasta 1/10 del volumen
aproximadamente y se añadió la acetona hasta precipitación. La
mezcla se mantuvo a +5ºC durante la noche. El precipitado se filtró
en un filtro G-4, se lavó con 20 ml de acetona y
entonces con 20 ml de n-hexano y se secó al vacío a
temperatura ambiente. Los 3,3 g obtenidos de la sal de dioctilamina
en bruto de la pravastatina se volvieron a cristalizar a partir de
20 ml de acetona, dando lugar a 2,7 g puros de la sal dioctilamina
de la pravastatina. Temperatura de fusión:
143-146ºC. La sal de dioctilamina de la pravastatina
se convirtió a pravastatina con el procedimiento dado a conocer en
el Ejemplo 5.
Mediante el desarrollo de la capacidad de
hidroxilación de la cepa Mortierella maculata n. spec.
E-97, aislada del entorno natural, que es capaz de
6\beta-hidroxilar la compactina, en los
experimentos que se consideran detalladamente a continuación, de
selección mutacional y de inducción enzimática; Se obtuvo la cepa
mutante Mortierella maculata n. sp.
E-97/15/13 [NCAIM(P)F 001267].
La cepa de Mortierella maculata n. sp.
E-97 [NCAIM(P)F 001266] aislada en la
presente invención, se cultivó en un medio inclinado de MS agar a
28ºC durante 7 días.
| glucosa | 4 g |
| extracto de malta | 10 g |
| extracto de levadura | 4 g |
| agar | 20 g |
| en 1000 ml de agua corriente |
Las esporas se lavaron lejos de los cultivos
inclinados con 5 ml de cloruro sódico al 0,9%, transfiriendo
después, entonces, la suspensión de las esporas a una placa estéril
de Petri donde se irradiaron con luz ultravioleta durante 1 minuto.
A continuación, se añadió
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
a la suspensión de esporas a la concentración final de 2000
\mug/ml. Entonces, la suspensión se transfirió a un matraz
Erlenmeyer de 100 ml, agitándose a una temperatura de 28ºC a una
velocidad de 150 rpm durante 20 minutos. A continuación, las esporas
se sedimentaron mediante centrifugación, a una velocidad de 4000 rpm
durante 10 minutos, y se suspendió entonces en una solución estéril
de cloruro sódico al 0,9%. La suspensión se esparció sobre una placa
de MUVB agar que contenía 10 \mug/ml de benomil y sangre
desfibrinada al 1%.
| glucosa | 40 g |
| asparagina | 2 g |
| peptona | 2,5 g |
| fosfato dihidrógeno potásico | 0,5 g |
| agar | 20 g |
en 990 ml de agua destilada; después de
esterilización, el medio se completó con 10 ml de sangre bovina y 10
mg de benomil.
Las placas de agar se incubaron a 28ºC durante 7
días, transfiriéndose entonces las colonias que se desarrollaban,
mediante selección al azar, a tubos de ensayo que contenían el medio
PS de agar.
| glucosa | 40 g |
| peptona micológica | 10 g |
| agar | 15 g |
| en 1000 ml de agua destilada. |
Antes de la esterilización, el pH del medio se
ajustó a un valor de entre 5,6 y 5,7. La esterilización se llevó a
cabo a 121ºC durante 20 minutos.
Los cultivos inclinados se incubaron a 28ºC
durante 12 días, y su producción de pravastatina se ensayó en
experimentos de matraces de agitación, tal como se describe en el
Ejemplo 1. Mediante este procedimiento se seleccionó la cepa mutante
Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13, que
produjo pravastatina que sobrepasó una tasa de conversión del 60% a
partir del substrato que se había aplicado de la sal sódica del
ácido de compactina, alcanzando una concentración de 1000
\mug/ml.
La enzima hidroxilasa de la cepa de
Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13 fue
inducida por el cultivo sobre el medio MU-VB agar
que contenía 100 \mug/ml
8-de-(2-metil-butiril)
compactina y/o compactina. Después de la selección al azar de las
colonias que se estaban desarrollando, se transfirieron a cultivos
inclinados MU-VB que contenían inductores. La
producción de pravastatina de los cultivos inclinados que se
desarrollaban, fue analizada mediante el procedimiento que se
explica en el Ejemplo 1, con la diferencia de que el suministro del
substrato compactina en la cantidad de 500 \mug/ml se llevó a cabo
a partir del 4º día de la fermentación para otros 11 días, y el
substrato de la compactina sódica se añadió gradualmente durante los
12 días convertido completamente a pravastatina. Al finalizar la
bioconversión llevada a cabo en 50 cultivos en matraces de agitación
a partir de 30 g de substrato de compactina sódica, la formación de
18,5 g de pravastatina se midió mediante HPLC. La recuperación de la
pravastatina a partir de los caldos combinados de la fermentación,
se llevó a cabo según el procedimiento que se explica a
continuación.
Después de finalizar la fermentación, el pH de
los 5,5 litros del caldo con una concentración de pravastatina de
3360 \mug/ml, se ajustó con una solución de ácido sulfúrico al 20%
a entre 3,5 y 3,7. A continuación, la solución ácida se extrajo
mediante 2,75 litros de acetato de etilo. Las fases se separaron, y
se preparó un extracto limpio mediante centrifugación a partir de la
fase orgánica emulsificada. El caldo de cultivo se extrajo dos veces
más con 1,37 litros de acetato de etilo, tal como se ha descrito
anteriormente. Los extractos combinados de acetato de etilo se
lavaron con 2 x 1,15 litros de agua desionizada, añadiéndose
entonces, a la solución de acetato de etilo, dibencilamina en un
porcentaje de 150 moles -calculado para el contenido en pravastatina
medido mediante HPLC-. La solución de acetato de etilo se concentró
al vacío hasta un volumen de 0,23 litros aproximadamente.
Posteriormente se añadieron al concentrado dibencilamina en un
porcentaje de 20 moles, y la solución del precipitado se mantuvo
durante la noche entre 0 y 5ºC. El precipitado de la sal ácida de
dibencilamina de la pravastatina se filtró, lavándose entonces el
precipitado suspendiéndolo en acetato de etilo enfriado y a
continuación, dos veces en n-hexano, secándolo
finalmente de 40 a 50º al vacío. El producto en bruto obtenido (22,4
g)se disolvió en 0,67 litros de acetona a una temperatura de
62 a 66ºC, clarificándose la solución con 2,2 g de carbón. Después
de la clarificación, el filtrado de acetona se concentró al vacío
hasta un volumen de 0,56 litros. Los cristales que precipitaron del
concentrado se disolvieron otra vez a la temperatura anterior,
enfriándose entonces la solución a temperatura ambiente. A
continuación, se continuó la recristalización por la noche entre 0 y
5ºC. Los cristales que precipitaron se filtraron, y se lavaron por
suspensión dos veces en acetona enfriada y dos veces en
n-hexano. La sal de dibencilamina ácida
recristalizada de la pravastatina se secó al vacío a una temperatura
de 40 a 50ºC. La sal de dibencilamina ácida obtenida de la
pravastatina (14,8 g) se disolvió a 40-44ºC en 740
ml de una mezcla de acetato de etilo-etanol (9:1),
añadiéndose entonces a la solución hidróxido sódico en un porcentaje
de 110 moles, en forma de una solución etanólica 1 M. La agitación
de la solución precipitada obtenida continuó durante media hora a
temperatura ambiente, alcanzándose entonces una precipitación
completa como resultado de aplicar frío provocado por el hielo
durante entre 1 y 1,5 horas. A continuación, el precipitado se
filtró y se lavó con 2 x 150 ml de acetato de etilo enfriado y de 2
x 150 ml de n-hexano,secándose finalmente al vacío a
40 a 50ºC. La pravastatina obtenida se disolvió en etanol, se
clarificó con 1,0 g de carbón, se cristalizó entonces a partir de
una mezcla de acetato de etilo-etanol. De esta
forma, se obtuvieron 9,4 g de pravastatina, con constantes físicas
que correspondían a los datos dados en el Ejemplo 2.
Claims (33)
1. Procedimiento microbiano para la preparación
del compuesto de fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
a partir de un compuesto substrato de fórmula
(II),
en la que R representa un metal
alcalino o un ión amónico, que comprende las etapas
siguientes:
- a)
- cultivar una cepa de la especie del hongo filamentoso Mortierella maculata capaz de 6\beta-hidroxilar un compuesto de fórmula (II) en un medio nutricio que contiene fuentes de nitrógeno y carbono asimilables y sales minerales,
- b)
- suministrar el substrato objeto de transformación al cultivo desarrollado de Mortierella maculata,
- c)
- fermentar el substrato hasta finalizar la bioconversión,
- d)
- separar el compuesto de fórmula (I) del caldo de cultivo, y
- e)
- aislar el compuesto de fórmula (I).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicho medio es un caldo de cultivo nutricio.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que dicha etapa de separar el compuesto de fórmula (I) del caldo de
cultivo se realiza por adsorción en una resina de intercambio iónico
aniónico.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que dicha etapa de separar el compuesto de fórmula (I) del caldo de
cultivo se realiza mediante extracción con un disolvente orgánico no
miscible en agua, seguido por la preparación de su derivado
lactónico o de su sal amínica secundaria como intermediario.
5. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que dicha etapa de separar el compuesto de fórmula (I) del caldo de
cultivo se realiza mediante purificación del extracto acuoso
alcalino obtenido del extracto del disolvente orgánico del caldo de
fermentación con cromatografía en una resina adsorbente no
iónica.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la cepa de Mortierella maculata es la cepa
E-97 n. sp. de Mortierella maculata
depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial
Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro
NCAIM(P)F 001266.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la cepa de Mortierella maculata es la cepa
E-97/15/13 n. sp. de Mortierella maculata
depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial
Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro
NCAIM(P)F 001267.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la enzima hidroxilasa de la cepa utilizada para la
transformación es inducida por la
8-de(2-metil-butiril)compactina
o la compactina.
9. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que un compuesto de fórmula (II) como substrato, se añade al cultivo
paralelamente a la etapa de suministro, y en el que la etapa de
suministro depende del pH del cultivo y su cantidad está relacionada
con el volumen del caldo entre el 0,5 y el 1,0%.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa de fermentación se realiza en un medio que contiene
una fuente de carbono seleccionada de entre el grupo formado por
glucosa, fructosa y glicerina.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa de fermentación se realiza en un medio que contiene
una fuente de nitrógeno seleccionada de entre el grupo formado por
harina de soja, peptona, caseína, extracto de levadura y extracto de
carne.
12. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el compuesto de fórmula (I) formado durante la bioconversión,
se separa del caldo de cultivo por adsorción a partir del filtrado
del caldo de cultivo y del agua de lavado del micelio en una resina
de intercambio aniónico, eluyendo el compuesto de fórmula (I) a
partir de la resina, transformando completamente el compuesto de
fórmula (I) en su forma lactónica, aislando el derivado lactónico,
hidrolizando el derivado lactónico mediante hidróxido sódico, y
desalando el compuesto de fórmula (I) sobre una resina de adsorción
no iónica.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que dicha resina de intercambio aniónico que presenta grupos
activos de amonio cuaternario que contienen una estructura
poliestireno-divinilbencénica, se utiliza para la
separación del compuesto de fórmula (I) a partir del filtrado del
caldo de cultivo.
14. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el compuesto de fórmula (I) formado durante la bioconversión
se extrae en forma ácida a partir del caldo de cultivo, habiendo el
caldo sido acidificado a un pH de entre 3,5 y 3,7, o a partir del
filtrado del caldo, mediante un disolvente orgánico no miscible en
agua.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que dicho disolvente orgánico no miscible en agua es acetato de
etilo.
16. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que dicho disolvente orgánico no miscible en agua es acetato de
isobutilo.
17. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicho compuesto de fórmula (I) se extrae en forma de sal
sódica a partir del disolvente orgánico mediante solución acuosa de
hidróxido sódico, y se purifica en una resina de adsorción no
iónica.
18. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que dicho compuesto de fórmula (I) es precipitado a partir del
extracto en forma cristalina con una amina secundaria que contiene
sustituyentes alquilo-, cicloalquilo-, aralquilo-, o arilo-.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que la sal cristalina de amina secundaria se suspende en una
mezcla de un éster alquilo que contiene un átomo de carbono
1-4 de ácido acético y agua; se añade una cantidad
equivalente de hidróxido sódico en solución acuosa a la suspensión,
de tal modo que se forman una fase orgánica y una fase acuosa; las
fases acuosa y orgánica se separan; la fase acuosa se lava con
acetato de isobutilo, clarificándose a continuación con carbón
activado; y la solución acuosa es liofilizada.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que dicho éster alquilo es éster isobutílico.
21. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que la sal cristalina de amina secundaria se suspende en un
alcohol que contiene un átomo de carbono 1-4; a
partir de la suspensión, se prepara una solución del compuesto de
fórmula (I), añadiendo una solución etanólica de hidróxido sódico; y
el compuesto de fórmula (I) se precipita a partir de la solución con
acetona.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que dicho alcohol que contiene un átomo de carbono
1-4 es etanol.
23. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que la sal cristalina de amina secundaria se disuelve en una
mezcla de un éster alquilo que contiene un átomo de carbono
1-4 de un ácido carboxílico alcano que contiene un
átomo de carbono 1-4 y un alcohol que contiene un
átomo de carbono 1-4; y a partir de la solución el
compuesto de fórmula (I) se precipita en forma cristalina añadiendo
hidróxido sódico.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que dicha mezcla es una mezcla de acetato de
etilo-etanol.
25. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que la pravastatina es aislada a partir del caldo de fermentación
mediante la sal de dibencilamina de la forma ácida del compuesto de
fórmula (I).
26. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que el derivado ácido del compuesto de fórmula (I) se purifica a
través de su sal de dioclohexilamina.
27. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que el ácido derivado del compuesto de fórmula (I) se purifica a
través de su sal de dioctilamina.
28. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que el compuesto de fórmula (I) se purifica hasta por lo menos un
99,5%, tal como se mide mediante HPLC, utilizando cromatografía en
gel.
29. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha cepa de Mortieriella maculata se cultiva entre
aproximadamente 25 y 30ºC.
30. Cultivo biológicamente puro de la cepa
E-97 n. sp. de Mortierella maculata
depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial
Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro
NCAIM(P)F 001266.
31. Cultivo biológicamente puro de la cepa
E-97/15/13 n. sp. de Mortierella maculata
depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial
Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro
NCAIM(P)F 001267.
32. Cultivo de Mortierella capaz de
6\beta-hidroxilar un compuesto de fórmula (II)
en la que R representa un metal
alcalino o un ión amónico, que consiste esencialmente en una nueva
cepa de Mortierella maculata n. sp. E-97
depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial
Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro
NCAIM(P)F
001266.
33. Cultivo de Mortierella capaz de
6\beta-hidroxilar un compuesto de fórmula (II)
en la que R representa un metal
alcalino o un ión amónico, que consiste esencialmente en una nueva
cepa de Mortierella maculata n. sp.
E-97/15/13 depositada en la National Collection of
Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría, con
el número de registro NCAIM(P)F
001267.
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