ES2200891T3 - Hidroxilacion de compactina a pravastatina por micromonospora. - Google Patents
Hidroxilacion de compactina a pravastatina por micromonospora.Info
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Abstract
Un procedimiento microbiano para la preparación del compuesto de fórmula (I) a partir de un compuesto de la fórmula general (II) en la que R representa un metal alcalino o un ion amonio, mediante cultivo sumergido de una cepa de Micromonospora que es capaz de hidroxilar un compuesto de fórmula (II) en la posición 6 en condiciones de aerobiosis, y mediante separación y purificación del compuesto de fórmula (I) formado en el curso de la bioconversión, que comprende las etapas de: a) cultivar una cepa de Micromonospora que es capaz de hidroxilar en la posición 6 un compuesto de fórmula (II), en la que R es como se ha definido anteriormente, a una temperatura de 25ºC-32ºC, en un medio nutriente que contiene fuentes de carbono y de nitrógeno disponibles y sales minerales, posteriormente b) añadir al cultivo en desarrollo el sustrato a transformar, después c) hidroxilar el sustrato hasta la finalización de la bioconversión, a continuación d) separar el compuesto de fórmula (I) del caldo de cultivo y, si se desea, purificar el mismo.
Description
Hidroxilación de compactina a pravastatina por
micromonospora.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento microbiano para la preparación de pravastatina.
Más particularmente esta invención se refiere a
un procedimiento microbiano para la preparación de pravastatina de
fórmula (I)
a partir de un compuesto de la fórmula general
(II)
en la que R representa un metal alcalino o un ion
amonio; con un microorganismo, siendo dicho microorganismo un
procariota del género Micromonospora que es capaz de
hidroxilar un compuesto de la fórmula general (II) en la posición
6\beta.
La hipercolesterolemia ha sido reconocida como el
principal factor de riesgo en la enfermedad ateroesclerótica,
específicamente en las enfermedades cardiacas coronarias. Durante
las dos últimas décadas se ha estudiado extensamente la
3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima
A reductasa (HMG-CoA reductasa EC. 1.1.1.34) como la
principal enzima limitante de la velocidad de biosíntesis del
colesterol. Se encontró que la mevinolina y los compuestos
relacionados biosintetizados por cepas seleccionadas de diferentes
especies de hongos eran inhibidores competitivos de esta enzima.
[Endo, A. y col., J. Antibiotics 29, 1346-1348
(1976); Endo, A. y col., FEBS Lett. 72, 323-326
(1976); Kuo, C.H. y col., J. Org. Chem. 48,
1991-1998 (1983)].
La pravastatina es también un miembro de la
familia de los inhibidores de la HMG-CoA reductasa.
Al principio se descubrió que la pravastatina era un metabolito
urinario minoritario de la compactina en perros [Tanaka, M. y col.,
sin publicar] en el curso de los estudios metabólicos de la
compactina [Arai, M. y col., Sankyo Kenkyusho Nempo 40,
1-38 (1988)].
1-38 (1988)].
La principal propiedad característica de la
pravastatina como el producto hidroxilado de la compactina es su
selectividad tisular. Este fármaco inhibe fuertemente la síntesis de
esteroles en el hígado y en el intestino, pero débilmente en otros
órganos. Es ventajoso que la pravastatina posea menor toxicidad que
los otros inhibidores de la HMG-CoA reductasa.
Se ha publicado que la hidroxilación microbiana
de la compactina puede ser llevada a cabo en grado diferente por
varias cepas de especies pertenecientes a muchos géneros diferentes
de hongos, y por cepas de especies de actinomicetos pertenecientes a
los géneros Nocardia, Actinomadura y Streptomyces, entre
otros Streptomyces roseochromogenes y Streptomyces
carbophilus (patente de EE.UU. nº 5.179.013, patente de EE.UU.
nº 4.448.979, patente de EE.UU. nº 4.346.227, patente de EE.UU. nº
4.537.859 y patente de Japón nº 58.010.572).
Un problema al usar hongos para la producción de
pravastatina a partir de compactina es que estos organismos
generalmente no toleran concentraciones más altas de compactina en
medios de cultivo líquidos, presumiblemente debido a su actividad
antifúngica [Serizawa, N. y col., J. Antibiotics 36,
887-891 (1983)]. En Streptomyces carbophilus
se ha mostrado que se requiere el sistema del citocromo P450 para la
hidroxilación de compactina a pravastatina [Matsuoka, T. y col.,
Eur. J. Biochem. 184, 707 -713 (1989)]. La dificultad de una mejora
genética de la capacidad de hidroxilación con el uso de tal enzima
es que es un complejo de proteínas más que una sola proteína.
La investigación de la solicitante se ha centrado
en encontrar una cepa de actinomicetos que produjera pravastatina a
partir de sales de la forma ácida de la compactina con un mayor
rendimiento, y aplicando a la bioconversión mayor concentración de
sustrato que las conocidas a partir de las memorias descriptivas de
patentes anteriores.
Durante la selección, que abarcaba
aproximadamente 6000 actinomicetos, mayoritariamente nuestros
propios aislamientos, aunque también cepas auténticas de las
colecciones de cepas internacionales, se seleccionaron cinco
Streptomyces y cinco Micromonospora para los estudios
posteriores, porque demostraron ser capaces de hidroxilar la sal
sódica de la forma ácida de la compactina a pravastatina. Estas diez
cepas de actinomicetos, de las cuales se han identificado
taxonómicamente ocho cepas a nivel de especie en nuestro
laboratorio, eran las siguientes:
Streptomyces violaceus (según Kämpfer y
col., 1991), cepa nº 1/43.
Streptomyces rochei (Berger y col., 1949;
Waksman y Lechevalier, 1953), cepa nº 1/41.
Streptomyces resistomycificus (Lindenbein,
1952), cepa nº 1/44.
Streptomyces sp., cepa nº 1/28.
Streptomyces lanatus (Frommer, 1959), cepa
nº 1/16.
Micromonospora sp., cepa nº
IDR-P_{3}.
Micromonospora purpurea (Luedemann y Brodsky,
1964), cepa nº IDR-P_{4}.
Micromonospora echinospora (Luedemann y
Brodsky, 1964), cepa nº IDR-P_{5}.
Micromonospora megalomicea (Weinstein y
col., 1969), cepa nº IDR-P_{6}.
Micromonospora rosaria (Horan y Brodsky,
1986), cepa nº IDR-P_{7}.
Puesto que hasta el momento no hay datos en la
bibliografía sobre la capacidad de Micromonospora para
convertir sales de la forma ácida de la compactina en pravastatina,
los autores han estudiado exhaustivamente no sólo esta capacidad
enzimática particular, sino también la posición taxonómica de estas
cepas de Micromonospora enumeradas anteriormente.
Todas estas cepas produjeron micelios bien
desarrollados compuestos de hifas ramificadas de aproximadamente 0,4
a 0,7 \mum de diámetro. No hay micelio aéreo o sólo se encuentra
en trazas. Las esporas no mótiles se encuentran individualmente
sobre esporóforos. Las hifas del micelio sustrato son Gram positivas
y no son resistentes a ácido. Las cepas n^{os}
IDR-P_{3} a IDR- P_{7} son aerobias,
quimioorganotrofas y sensibles a un pH inferior a 6,0. Las paredes
contienen ácido meso-diaminopimélico. Las
propiedades diagnósticas enumeradas anteriormente, como
características clave, demuestran claramente que estas cepas de
actinomicetos monoespóricos son miembros típicos del género
Micromonospora.
Propiedades micromorfológicas el micelio
sustrato se compone de filamentos bien desarrollados, más bien
curvados que rectos, ramificados monopodialmente. Las esporas sobre
el esporóforo son únicas, esféricas, de aproximadamente 1,8 \mum
de diámetro y están dispersas más o menos regularmente sobre los
filamentos de las hifas. Las esporas bien son sésiles o bien están
sobre el extremo de esporóforos cortos. En cultivos de caldo no se
observaron esporas sobre las hifas, presumiblemente porque la
liberación de las esporas maduras es muy rápida.
Agar sacarosa de Czapek: crecimiento
medio, las colonias tienen coloración rojiza cubierta por áreas de
esporulación negras semejantes a puntos.
Agar asparagina – glucosa: Se registró un
crecimiento como de colonias semejantes a puntos y elevadas, marrón
rojizas o negras. Pigmentos difusibles rojizos.
Agar nutritivo: buen crecimiento, colonias
elevadas, de color marrón rojizo o negro. Exopigmento marrón rojizo
en el medio.
Agar extracto de malta - extracto de levadura
(ISP Med. 2): colonias bien desarrolladas, elevadas y rugosas,
marrones, cubiertas parcialmente por áreas de esporulación negras o
por un "micelio pseudoaéreo" (éste aparece como un
florecimiento blanquecino o grisáceo restringido). Pigmento soluble
pardo o rojo parduzco.
Agar almidón - sales inorgánicas (ISP Med.
4): crecimiento medio de colonias marrón rojizas elevadas y
rugosas. Pigmento rojizo claro.
Agar asparagina - glicerol (ISP Med. 5):
crecimiento sólo en trazas, colonias de coloración crema o naranja
claro, planas, pigmento soluble rosa claro.
Utilización de una fuente de carbono: buen
crecimiento y utilización positiva de L-arabinosa,
D-galactosa,
D-fructosa, D-glucosa, D-xilosa, lactosa, melibiosa, sacarosa, D-manitol, dulcitol, glicerol e inositol. El crecimiento con L-ramnosa, D-rafinosa e inulina era ligeramente mejor que sobre el medio de control negativo.
D-fructosa, D-glucosa, D-xilosa, lactosa, melibiosa, sacarosa, D-manitol, dulcitol, glicerol e inositol. El crecimiento con L-ramnosa, D-rafinosa e inulina era ligeramente mejor que sobre el medio de control negativo.
Utilización de una fuente de nitrógeno:
buen crecimiento con extracto de levadura y amina NZ, ninguna o
débil utilización de NaNO_{3}.
Otras propiedades
fisiológico-bioquímicas: la celulosa y el
almidón son hidrolizados, la leche es digerida fuertemente. El
ensayo de reducción de nitrato es negativo. No hay crecimiento
sobre láminas de patata sin carbonato de calcio (pH
5,8-6,0). No hay producción de pigmento
melanoide.
Esta cepa nº IDR-P_{3} de
Micromonospora sp. se aisló a partir de una muestra de lodo
del Lago Balaton (Hungría).
Posición sistemática: serían necesarios
más estudios comparativos sistemáticos para clarificar la posición
taxonómica exacta de esta cepa entre las especies del género
Micromonospora. Sobre la base de ciertas propiedades no
parece imposible que la cepa IDR-P_{3} represente
una nueva especie dentro del género Micromonospora.
En los medios diagnósticos enumerados
anteriormente generalmente hay buen crecimiento, colonias de
coloración naranja a naranja-roja, roja, a veces
amarillenta o rosa. No se producen pigmentos solubles ni un micelio
aéreo. El número de esporas únicas es relativamente bajo. Aparecen
terminalmente sobre los esporóforos. El micelio sustrato se compone
de hifas bien ramificadas. No hay micelio aéreo. Ningún crecimiento
sobre D-melibiosa, rafinosa, manitol, glicerol,
lactosa, L-ramnosa, pero buen crecimiento sobre
D-arabinosa, glucosa, D-xilosa y
crecimiento débil sobre D-galactosa y
D-fructosa. Sobre la base de estas propiedades
diagnósticas convencionales los autores han identificado esta cepa
como un miembro de la especie Micromonospora purpurea (Luedemann y
Brodsky, 1964).
Esta cepa produce principalmente esporóforos
solitarios y esporas esféricas marrones oscuras o negras
(0,8-1,5 \mum de diámetro), que se adhieren
firmemente a los esporóforos hasta la maduración. De acuerdo con
nuestras observaciones de microscopía electrónica sobre la
superficie de estas esporas se pueden observar unas estructuras
verrugosas o salientes ("espinas romas" según el vol. 4 del
Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática 1989, páginas 2448),
lo cual es muy característico de las esporas de Micromonospora
echinospora. Por otro lado, las propiedades de diagnóstico
cultivo-morfológicas y fisiológicas de esta cepa son
también muy similares a las de M. echinospora. El color de
las colonias bien desarrolladas en los medios diagnósticos
estándares es naranja-marrón o púrpura oscuro. La
capa de esporulación es negra o negra purpúrea, cérea. No hay
micelio aéreo. No se produce ningún pigmento melanoide. Digiere la
leche. Buen crecimiento sobre D-xilosa,
D-arabinosa, D-glucosa y sacarosa,
pero ningún crecimiento con L-ramnosa, rafinosa,
D-galactosa, D-fructosa,
D-melibiosa y glicerol. Los autores consideran esta
cepa como un miembro típico de Micromonospora
echinospora.
En la mayoría de los medios diagnósticos presenta
un crecimiento moderado a débil. Las colonias naranja o
naranja-rojo consisten en filamentos ramificados
largos (aproximadamente de 0,6 \mum de diámetro) y un número
limitado de esporas únicas, esféricas, de coloración oscura
(0,6-1,0 \mum de diámetro). No produce micelio
aéreo. En ciertos medios se forman pigmentos solubles de coloración
débilmente rojiza o rosa. En agar tirosina no se produjeron
pigmentos melanoides. En medio basal esta cepa ha utilizado las
siguientes fuentes de carbono: D-xilosa y
D-fructosa; solo débilmente:
D-melibiosa, manitol y galactosa, pero no se observó
ningún crecimiento o se observó un crecimiento esporádico con
glicerol, L-ramnosa, lactosa y rafinosa (véase
también Kawamoto, I. y col.; Agric. Biol. Chem. 47,
203-215, 1983). La cepa nº
IDR-P_{6} muestra una similitud considerable con
la especie Micromonospora megalomicea (Weinstein, 1972) y los
autores la consideran como un miembro de esta especie.
Buen a moderado crecimiento con agar de Bennett,
agar sacarosa de Czapek, agar asparagina-glucosa,
agar nutritivo, agar harina de avena, agar dextrosa- patata, etc. El
color de los pigmentos del micelio vegetativo varía desde marrón
rojizo hasta marrón purpúreo. Con ciertos medios se forman pigmentos
difusibles rojo vino. Sobre la superficie de las colonias se
producen frecuentemente manchas negras. Las hifas vegetativas
(diámetro medio: 0,5 \mum) están intensamente ramificadas. Las
esporas (1,4-1,7 \mum de diámetro) nacen de forma
solitaria, sésil o sobre esporóforos cortos y aparecen a lo largo de
la longitud de la hifa. El crecimiento y la esporulación son del
tipo de tejido abierto de Luedemann. Los siguientes compuestos son
utilizados por esta cepa como única fuente de carbono en el
medio:
D-glucosa, lactosa, D-manitol, L-ramnosa, sacarosa y D-xilosa. No utiliza dulcitol, glicerol, D-melibiosa y D-rafinosa. Los autores han identificado la cepa IDR-P_{7} como un miembro típico de Micromonospora rosaria (Horan y Brodsky, 1986).
D-glucosa, lactosa, D-manitol, L-ramnosa, sacarosa y D-xilosa. No utiliza dulcitol, glicerol, D-melibiosa y D-rafinosa. Los autores han identificado la cepa IDR-P_{7} como un miembro típico de Micromonospora rosaria (Horan y Brodsky, 1986).
Las cepas de Micromonospora presentadas
anteriormente se depositaron en la colección National Collection of
Agricultural and Industrial Microorganisms (NCAIM), Budapest,
Hungría, bajo las designaciones numéricas que dadas
continuación:
Micromonospora sp.
IDR-P_{3} NCAIM (P) B 001268
Micromonospora purpurea
IDR-P_{4} NCAIM (P) B 001271
Micromonospora echinospora ssp.
echinospora IDR-P_{5} NCAIM (P) B 001272
Micromonospora megalomicea ssp. nigra
IDR-P_{6} NCAIM (P) B 001273
Micromonospora rosaria
IDR-P_{7} NCAIM (P) B 001274
Basándose en lo anterior, la invención se refiere
a un nuevo procedimiento microbiano para la preparación de
pravastatina de fórmula (I)
a partir de un compuesto de fórmula general
(II)
en la que R representa un metal alcalino o un ion
amonio,
mediante el cultivo sumergido de una cepa, la
cual es capaz de hidroxilar en la posición 6\beta un compuesto de
fórmula (II) en una fermentación aeróbica, y mediante la separación
y purificación del compuesto de fórmula (I) formado en el curso de
la bioconversión que comprende las etapas de:
a) cultivar a 25-32ºC una cepa de
una especie perteneciente al género Micromonospora que es
capaz de hidroxilar en la posición 6\beta un compuesto de fórmula
(II) en la que R es como se definió anteriormente, en un medio
nutriente que contiene fuentes de carbono y nitrógeno asimilables y
sales minerales, posteriormente
b) añadir al cultivo en desarrollo el sustrato a
transformar, después
c) hidroxilar el sustrato hasta el final de la
bioconversión, después
d) separar el compuesto de fórmula (I) del caldo
de cultivo y, si se desea, purificar el mismo.
El alcance de la invención se extiende a las
cepas salvajes y a cualquier mutante de las especies pertenecientes
al género Micromonospora que sean capaces de hidroxilar la
sal sódica de la forma ácida de compactina a pravastatina.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención la pravastatina se produce con una cepa de
Micromonospora seleccionada del grupo consistente en
Micromonospora sp. IDR-P_{3} [NCAIM (P) B
001268], Micromonospora purpurea IDR-P_{4}
[NCAIM (P) B 001271], Micromonospora echinospora
IDR-P_{5} [NCAIM (P) B 001272], Micromonospora
megalomicea IDR-P_{6} [NCAIM (P) B 001273] y
Micromonospora rosaria IDR-P_{7} [NCAIM (P) B
001274].
De acuerdo con la realización más preferida de la
invención, la pravastatina se produce con la cepa
IDR-P_{3} [NCAIM (P) B 001268] de
Micromonospora sp.
La presente invención puede ser llevada a cabo
mediante un procedimiento de fermentación in situ, que es
cuando la hidroxilación se efectúa con la participación de un
cultivo de Micromonospora en crecimiento activo.
La hidroxilación se puede llevar a cabo empleando
agitación, como cultivo en matraz con agitación, o aireación y
agitación en fermentadores, cuando el compuesto de fórmula (II) se
añade a los cultivos en crecimiento. En tales casos se puede emplear
un agente antiespumante. La densidad adecuada del cultivo de esta
cepa podría conseguirse mediante el uso de un medio apropiado que
contenga de fuentes de carbono y nitrógeno disponibles, sales
inorgánicas, así como oligoelementos.
Por ejemplo, se ha probado que la glucosa, el
glicerol, la dextrina, el almidón, la ramnosa, la xilosa, la
sacarosa y el almidón soluble son fuentes de carbono asimilable,
mientras que la harina de soja, el licor de maíz, la peptona, el
extracto de levadura, el extracto de carne, el citrato de amonio y
el sulfato de amonio son buenas fuentes de nitrógeno. Pueden
añadirse sales inorgánicas, tales como carbonato cálcico, fosfato
sódico, fosfato potásico etc. al medio de cultivo. Los medios
preferidos para el crecimiento de esta cepa seleccionada son
aquéllos que se describen en los ejemplos.
La bioconversión de compactina en pravastatina
puede hacerse mediante diferentes técnicas de fermentación, por
ejemplo, cultivo discontinuo, cultivo discontinuo alimentado.
Preferiblemente se usa el cultivo líquido sumergido agitado. La
temperatura preferida es aproximadamente 25ºC a 37ºC. más
preferiblemente aproximadamente 25ºC a 32ºC.
El pH preferido es de alrededor de 6,0 a 9,0, más
preferiblemente de alrededor de 7,0 a 8,5. Las condiciones de
agitación preferidas son de aproximadamente 200 rpm a 400 rpm, más
preferiblemente de unas 250 rpm.
La invención proporciona un procedimiento para
convertir la sal ácida de sodio de la compactina en pravastatina. En
esta invención se puede usar la sal ácida de sodio de la compactina
a cualquier concentración, lo cual dará como resultado la producción
de pravastatina. Preferiblemente la concentración de compactina está
entre 0,1 y 10 g/litro, más preferiblemente está entre 0,3 y 3,0
g/litro.
La invención tiene la intención de abarcar
cualquier porcentaje de conversión de compactina en pravastatina por
las cepas de especies de Micromonospora, al menos un 30%, y
más preferiblemente al menos un 90% aproximadamente.
Durante el curso de la fermentación se controla
la composición del caldo de cultivo mediante cromatografía líquida
de alto rendimiento (HPLC). Según el procedimiento de HPLC la
muestra del caldo se diluye dos veces con metanol, se centrifuga y
se usa el sobrenadante para el análisis. Los parámetros del sistema
de HPLC usados para el análisis son: equipo de HPLC analítica
Waters; relleno de la columna: Waters Novapack C_{18} 5\mum;
medida a 237 nm; volumen de inyección 10 \mul; velocidad de flujo
0,6-0,9 ml/min gradiente lineal; se usa elución en
gradiente, eluyentes: disolvente A=
acetonitrilo-NaH_{2}PO_{4} 0,1M en agua
(25:75), disolvente B= acetonitrilo-agua (pH 2 con
H_{3}PO_{4}) (70:30).
| Tiempo | Velocidad de | Eluyente | Eluyente B |
| (minutos) | flujo (ml/min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 0,6 | 100 | 0 |
| 2 | 0,7 | 100 | 0 |
| 12 | 0,9 | 0 | 100 |
| 21 | 0,9 | 0 | 100 |
| 22 | 0,9 | 100 | 0 |
| 27 | 0,7 | 100 | 0 |
Tiempos de retención: pravastatina (sal de Na)
10,6 minutos; compactina (sal ácida de Na) 19,5 minutos;
pravastatina (forma lactona) 17,3 minutos; compactina (forma
lactona) 23,5 minutos.
Para el aislamiento de la pravastatina puede
usarse cualquier procedimiento conocido, por ejemplo,
extracción-reextracción, cromatografía de
intercambio aniónico, precipitación.
Para la recuperación del producto del caldo es
ventajoso considerar el hecho de que durante la bioconversión la
pravastatina se produce en su forma ácida, por tanto, se puede
aislar a partir del filtrado del caldo mediante su adsorción en una
columna de resina de intercambio aniónico. Para el aislamiento del
producto es ventajoso usar una resina de intercambio aniónico
fuertemente básica que sea un polímero
poliestireno-divinilbenceno portador de grupos
activos de amonio cuaternario, por ejemplo resinas Dowex AL 400
(OH^{-}), Dowex 1 x 2 (OH^{-}), Dowex 2 x 4 (OH^{-}),
Amberlite IRA 900 (OH^{-}). El producto adsorbido en la resina de
intercambio iónico se puede eluir de la columna mediante ácido
acético acuoso o mediante una mezcla de agua-acetona
que contenga cloruro sódico, preferiblemente mediante una mezcla de
agua-acetona (1:1) que contenga cloruro sódico al
1%. Las fracciones que contienen pravastatina se combinan y la
acetona que está en el eluato se destila al vacío. El pH del
concentrado se ajusta con ácido sulfúrico al 15% dentro del
intervalo de 3,5-4,0 y la solución acuosa
acidificada se extrae con acetato de etilo. La pravastatina puede
extraerse a partir del extracto de acetato de etilo con hidrógeno
carbonato sódico al 5% o agua débilmente alcalina (pH
7,5-8,0) en una relación volumétrica de 1/10 a 1/20.
Se ha probado que la pravastatina puede recuperarse en forma pura a
partir del extracto acuoso alcalino obtenido anteriormente mediante
cromatografía en columna en una resina de adsorción no iónica. Un
procedimiento ventajoso consiste es primero retirar todo el acetato
de etilo disuelto en la fase acuosa mediante destilación al vacío
del extracto acuoso alcalino y después cargar el extracto acuoso en
una columna Diaion HP-20. La pravastatina adsorbida
en la columna se purifica mediante una elución con acetona acuosa en
la que el contenido de acetona se incrementa de forma gradual,
seguidamente se combinan las fracciones cromatográficas que
contienen pravastatina como componente único y se concentran al
vacío. El concentrado se aclara con carbón vegetal y se liofiliza y
después se cristaliza en una mezcla de
etanol-acetato de etilo produciendo pravastatina de
calidad aceptable para una aplicación farmacéutica.
Después de finalizada la bioconversión se puede
extraer la pravastatina bien del caldo de cultivo o bien del
filtrado obtenido después de la separación de la masa del micelio.
Este último puede retirarse por filtración o por centrifugación,
sin embargo, especialmente a escala industrial, es ventajoso hacer
una extracción completa del caldo. Antes de la extracción se ajusta
el pH del caldo de fermentación o del filtrado del caldo a
3,5-3,7 con un ácido mineral, preferiblemente con
ácido sulfúrico diluido. La extracción se hace con un éster de
ácido acético con un alcohol alifático de 2-4 átomos
de carbono, preferiblemente con acetato de etilo o con acetato de
isobutilo. El extracto de acetato de etilo se lava con agua y se
seca con sulfato sódico anhidro. A continuación se ajusta el
derivado lactona de la pravastatina. El cierre del anillo de lactona
se lleva a cabo en una disolución de acetato de etilo seco a
temperatura ambiente, en condiciones de agitación continua,
induciendo la formación de la lactona con una cantidad catalítica de
ácido trifluoroacético. El cierre del anillo de lactona se
comprueba mediante análisis cromatográfico de capa fina (TLC).
Después de finalizar la formación de lactona se lava la solución de
acetato de etilo primero con una solución acuosa de hidrógeno
carbonato de sodio al 5% y después con agua, y se seca con sulfato
sódico anhidro y se evapora al vacío. El residuo se purifica
mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando como
eluyente mezclas de acetato de
etilo-n-hexano con un contenido de
acetato de etilo que se incrementa de forma gradual. La pravastatina
se prepara a partir de la lactona de pravastatina mediante
hidrólisis a temperatura ambiente en acetona con una cantidad
equivalente de hidróxido sódico. Cuando la formación de la sal de
sodio de pravastatina se ha completado se precipita la pravastatina
con acetona. A continuación se filtra el precipitado y se lava con
acetona y n-hexano y se seca al vacío, después se
cristaliza en una mezcla de etanol-acetato de
etilo.
Se encontró que la cromatografía en gel Sephadex
LH-20 se aplica de forma ventajosa para purificar la
pravastatina. Mediante la aplicación de este procedimiento se puede
producir pravastatina de una pureza superior al 99,5% (medida con
HPLC).
En el curso de los experimentos de estos autores
se ha reconocido la siguiente invención:
a partir del extracto del disolvente orgánico,
preferiblemente a partir de un extracto de acetato de etilo o de
acetato de isobutilo, del caldo o del filtrado del caldo de la cepa
de Micromonospora sp. IDR-P_{3}, que es
capaz de hidroxilar en la posición 6\beta un compuesto de fórmula
general (II), se puede precipitar pravastatina en forma de sal
cristalina con aminas secundarias. Además se encontró que para la
formación de la sal son adecuadas varias aminas secundarias que
contienen sustituyentes alquilo, cicloalquilo, aralquilo o arilo.
Por conveniencia se seleccionaron las aminas secundarias no tóxicas
entre ellas, por ejemplo, la dioctilamina, diciclohexilamina,
dibencilamina. El aislamiento de los productos intermedios de sal
de amina secundaria orgánica, por ejemplo, la sal de bencilamina se
llevó a cabo añadiendo dibencilamina en una cantidad de 1,5
equivalentes respecto al contenido de pravastatina del extracto, a
continuación se concentra el extracto mediante destilación al vacío
al 5% de su volumen original, después se añade al concentrado otra
cantidad de dibencilamina en una proporción de 0,2 equivalentes. La
sal de dibencilamina cristalina se precipita a partir del
concentrado. El producto bruto cristalino se filtra y se seca al
vacío y se aclara con carbón vegetal en una disolución de metanol o
de acetona. Después, con la recristalización del producto aclarado
en acetona, se puede obtener una sal intermedia de dibencilamina de
la pravastatina cromatográficamente pura.
Las sales de amina secundaria orgánica de
pravastatina pueden transformarse en pravastatina con hidróxido de
sodio o con un alcóxido sódico, preferiblemente etóxido sódico.
El aislamiento de pravastatina a través de una
sal intermedia de amina secundaria es un procedimiento más sencillo
que cualquiera de los otros procedimientos conocidos. Durante este
procedimiento no se forman artefactos, y se puede resolver de forma
ventajosa la separación de la pravastatina de los subproductos de la
bioconversión y de los diversos productos metabólicos
biosintetizados por el microorganismo hidroxilante.
El procedimiento según la invención se ilustra
mediante los siguientes ejemplos:
Se obtuvieron las esporas a partir de la
superficie de un cultivo inclinado en agar de almidón soluble
(abreviadamente SM) de 7-10 días de la cepa de
Micromonospora sp. IDR-P_{3} [NCAIM (P) B
001268] y se suspendieron en 5 ml de agua destilada estéril. A
continuación se usó esta suspensión para inocular 100 ml de medio de
inóculo TI estéril en un matraz Erlenmeyer de 500 ml.
Composición del medio SM
| Almidón soluble | 10,0 g |
| Na_{2}HPO_{4} | 1,15 g |
| KH_{2}PO_{4} | 0,25 g |
| KCl | 0,2 g |
| MgSO_{4} x 7H_{2}O | 0,2 g |
| Agar | 15,0 g |
| en 1.000 ml de agua destilada |
El pH del medio se ajustó a 7,0 antes de la
esterilización y la mezcla se esterilizó a 121ºC durante 25
minutos.
Composición del medio TI
| Almidón soluble | 20,0 g |
| Extracto de levadura | 10,0 g |
| en 1.000 ml de agua corriente |
El pH del medio se ajustó a 7,0 antes de la
esterilización y se trató con calor a 121ºC durante 25 minutos.
El cultivo en desarrollo se agitó en un agitador
rotatorio (250 rpm; amplitud: 2,5 cm) durante 3 días a 32ºC, a
continuación se usaron alícuotas de 5 ml y para inocular 10 matraces
Erlenmeyer de un volumen de 500 ml, conteniendo cada uno 100 ml de
medio TT esterilizado a 121ºC durante 25 minutos.
Composición del medio TT
| Almidón de papata | 30,0 g |
| Harina de soja | 30,0 g |
| CaCO_{3} | 5,0 g |
| CoCl_{2} x 6H_{2}O | 2,0 mg |
| aceite de palma | 2,0 g |
| en 1.000 ml de agua corriente |
El pH se ajustó a 7,0 antes de la esterilización
por calor.
La incubación se llevó a cabo a 32ºC durante 72
horas, a continuación se añadieron a cada probeta 50 mg de sal ácida
de sodio de compactina en agua destilada y el cultivo llevó a cabo
durante 96 horas. La tasa de conversión de la sal ácida de sodio de
compactina en pravastatina, medida mediante HPLC, fue del 82%.
Después de completar la fermentación se unieron
los cultivos, y a partir del caldo de la fermentación colectiva
obtenido que contenía 410 mg de pravastatina se llevó a cabo el
aislamiento de esta última de la siguiente manera: el caldo de
fermentación se centrifugó a 2.500 rpm durante 20 minutos. Se
prepararon el sobrenadante del caldo y la masa del micelio, a
continuación esta última se resuspendió en 250 ml de agua y la
suspensión obtenida se agitó durante una hora y se filtró. El pH del
caldo centrifugado combinado y del filtrado se ajustó a 4,0
mediante ácido sulfúrico al 15%, después, se extrajo el filtrado
ácido con 3 x 300 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados
de acetato de etilo se lavaron con 300 ml de agua, se secaron con
sulfato sódico anhidro y se concentraron al vacío a un volumen de
100 ml. A continuación se preparó lactona de pravastatina a partir
de pravastatina añadiendo una cantidad catalítica de ácido
trifluoroacético a temperatura ambiente y en agitación constante. La
formación de la lactona de pravastatina se controló mediante un
procedimiento de TLC: adsorbente: lámina de aluminio Kieselgel 60
F_{254} DC (Merck); disolvente de desarrollo: mezcla de
acetona-benceno-ácido acético (50:50:1,5);
detección: con un reactivo de ácido fosfo-molíbdico.
El valor R_{f} de la lactona de pravastatina fue 0,7. Después de
completar la formación de la lactona se lavó el acetato de etilo con
2 x 20 ml de hidrógeno carbonato de sodio acuoso al 5% y después con
20 ml de agua, se secó con sulfato sódico anhidro y se evaporó al
vacío. . Se obtuvieron 0,5 g de residuo de evaporación que se
sometieron a cromatografía en una columna que contenía 10 g de
adsorbente Kieselgel 60 (diámetro de la columna: 1,2 cm, altura del
lecho adsorbente: 17 cm). Para la elución se usaron mezclas de
acetato de etilo-n-hexano, en las
que el contenido de acetato de etilo se incrementó de forma
gradual. La lactona de pravastatina se eluyó de la columna con una
mezcla de acetato de etilo al 60% - n-hexano al 40%.
Las fracciones que contenían la lactona de pravastatina se
combinaron y se evaporaron al vacío. El residuo obtenido, que
contenía 230 mg de lactona de pravastatina, se disolvió en 5 ml de
acetona y después con agitación 110% mol de hidróxido sódico en una
solución de etanol 1 M. La agitación de la solución continuó durante
media hora a temperatura ambiente. Posteriormente se concentró la
solución hasta un volumen de 2 ml y se añadieron 4 ml de acetona al
concentrado. La mezcla se guardó a + 5ºC durante una noche. El
precipitado se filtró, se lavó con 2 ml de acetona y después con 2
ml de n-hexano y se secó al vacío a temperatura
ambiente. La pravastatina bruta resultante se disolvió en etanol, se
aclaró con carbón vegetal y después se cristalizó en una mezcla de
etanol-acetato de etilo. De esta manera se
obtuvieron 170 mg de pravastatina.
Punto de fusión 170ºC-173ºC
(descomp.)
[\alpha]^{2}_{D} = +156º (c=0,5, en
agua).
Espectro de absorción ultravioleta (20 \mug/ml,
en metanol): \lambda_{max} = 231, 237, 245 nm (log \varepsilon
= 4,263; 4,311; 4,136).
Espectro de absorción de infrarrojos (KBr):
\nuOH 3415, \nuCH 2965, \nuC= 0 1730, \nuCOO^{-} 1575
cm^{-1}.
Espectro de RMN-^{1}H
(D_{2}O, \delta, ppm): 0,86, d, 3H
(2-CH_{3}); 5,92, dd, J=10,0 y 5,4 Hz, 1H
(3-H); 5,99, d, J=10,0 Hz, 1H (4-H);
5,52, br, 1H (5-H); 4,24, m, 1H
(6-H); 5,34, br, 1H (8-H); 4,06, m,
1H (\beta-H), 3,65, m, 1H
(\delta-H); 1,05, d, 3H
(2'-CH_{3}); 0,82, t, 3H
(4'-H_{3}).
Espectro RMN-^{13}C (D_{2}O,
\delta, ppm): 15,3, q (2-CH_{3}); 139,5, d
(C-3); 129,5, d (C-4); 138,1, s
(C-4a); 127,7, d (C-5); 66,6, d
(C-6); 70,1, d (C-8); 182,6, s
(COO^{-}); 72,6, d (C-\beta); 73,0, d
(C-\delta); 182,0, s (C-1');
18,8, q (2'-CH_{3}); 13,7, q
(C-4').
Espectro de masa FAB positivo (iones
característicos): [M + Na]^{+} 469; [M + H]^{+}
447.
\newpage
Espectro de masa FAB negativo (iones
característicos): [M - H]^{-} 445, [M - Na]^{-}
423, m/z 101 [2-metil-ácido
butírico-H]^{-}.
En 10 matraces Erlenmeyer de un volumen de 500 ml
cada uno que contenían 100 ml de medio de bioconversión MT_{1} se
introdujo el cultivo de inóculo preparado como se ha descrito en el
Ejemplo 1, a continuación se incubaron a 28ºC durante 96 horas y se
añadieron a cada matraz 50 mg de sal ácida de sodio de compactina en
agua destilada, después se llevó a cabo la hidroxilación durante 72
horas, tras lo cual se añadieron a los cultivos otros 50 mg de
sustrato en agua destilada y se continuó la fermentación durante 72
horas.
Composición del medio de bioconversión
MT_{1}
| Almidón de patata | 10,0 g |
| Dextrosa | 20,0 g |
| Harina de soja | 10,0 g |
| Extracto de levadura | 10,0 g |
| CaCO3 | 5,0 g |
| Aceite de girasol | 2,0 g |
| en 1000 ml de agua corriente |
Antes de la esterilización se ajustó a 7,0 el pH
del medio de bioconversión. La mezcla se esterilizó a 121ºC durante
25 minutos.
Después de completar el periodo de bioconversión,
se unieron los cultivos y se aisló la pravastatina del caldo de
cultivo colectivo según el siguiente procedimiento:
El caldo unido, que contenía 750 mg de
pravastatina según el ensayo de HPLC, se centrifugó a 2.500 rpm
durante 20 minutos. La masa de micelio separada se agitó con 250 ml
de agua durante una hora y después se filtró. El caldo centrifugado
y el filtrado se combinaron y el pH de la disolución resultante se
ajustó a un valor de 3,5-4,0 con ácido sulfúrico al
15%, a continuación se extrajo la solución con 3 x 300 ml de acetato
de etilo. Después se añadieron al extracto de acetato de etilo 150%
mol de dibencilamina, calculados para el contenido de pravastatina.
El extracto de acetato de etilo se evaporó hasta aproximadamente un
volumen de 30 ml y la suspensión se mantuvo a 0-5ºC
durante una noche. La sal ácida de bencilamina de pravastatina
precipitada se filtró y se lavó en el filtro con acetato de etilo
enfriado y n-hexano y, por último, se secó al
vacío. Se disolvieron 1,1 g de la sal ácida de bencilamina de
pravastatina bruta en 33 ml de acetona a una temperatura de
62ºC-66ºC y la solución se aclaró con 0,1 g de
carbón vegetal durante media hora. A continuación se retiró el
carbón vegetal de la solución mediante filtración. Los cristales
precipitados en la solución aclarada se disolvieron de nuevo a la
temperatura anterior y después se mantuvo la solución a +5ºC durante
una noche. El precipitado se filtró, se lavó con acetona enfriada y
n-hexano y se secó al vacío. La sal ácida de
bencilamina de pravastatina obtenida (0,7 g) se suspendió en 10 ml
de etanol y después se añadió 110% mol de hidróxido sódico a la
solución alimentando una disolución acuosa 1 M. La agitación de la
solución alcalina continuó durante media hora a temperatura
ambiente. Después de completar la formación de la sal de sodio se
añadieron 30 ml de agua y se neutralizó el pH de la disolución,
después se destiló el etanol al vacío. El concentrado acuoso se
sometió a cromatografía en una columna rellena con 50 ml de resina
Diaion HP 20 (diámetro de la columna: 1,5 cm, altura del lecho de la
resina: 28 cm). La columna se eluyó con mezclas de
acetona-agua desionizada en las que la concentración
de acetona se incrementó en etapas de 5%. La pravastatina se pudo
eluir de la columna con una mezcla de acetona-agua
desionizada que contenía acetona al 15%. Las fracciones se
analizaron mediante el procedimiento de TLC dado en el Ejemplo 1. El
valor R_{f} de la pravastatina fue 0,5. Las fracciones que
contenían la pravastatina se combinaron y el contenido de acetona se
evaporó al vacío. Mediante la liofilización del residuo acuoso se
obtuvieron 390 mg de pravastatina cromatográficamente pura.
En un fermentador de laboratorio se esterilizaron
a 121ºC 4,5 litros de medio TT/2 durante 45 minutos y se inocularon
500 ml de cultivo de inóculo agitado preparado como se describe en
el Ejemplo 1, a continuación se incubaron a 32ºC, se airearon con
250 l de aire estéril/hora y se agitaron con un agitador de pala
plana a 300 rpm. La incubación continuó durante 72 horas y se
añadieron 2,5 g de sal ácida de sodio de compactina al cultivo.
Después de un periodo de bioconversión de 48 horas, se había
consumido por completo el sustrato compactina del caldo de
fermentación, por tanto se añadieron de nuevo al cultivo 2,5 g
adicionales de sal ácida de sodio de compactina. La segunda dosis de
compactina se consumió en 24 horas. En el procedimiento de
bioconversión la tasa de conversión de la sal ácida de sodio de
compactina en pravastatina fue aproximadamente un 90%.
\newpage
Composición del medio de bioconversión
TT/2
| Glucosa | 75,0 g |
| Almidón soluble | 50,0 g |
| Harina de soja | 50,0 g |
| Extracto de levadura | 50,0 g |
| Peptona | 5,0 g |
| NaNO_{3} | 20,0 g |
| CaCO_{3} | 25,0 g |
| en 4.500 ml de agua corriente |
Se esterilizaron 4,5 litros de medio de
fermentación TT/1 en un fermentador de laboratorio a 121ºC durante
45 minutos y se inocularon con 500 ml de cultivo de inóculo agitado
preparado como se describe en el Ejemplo 1, a continuación se
incubaron a 28ºC, se airearon con 200 l de aire estéril/hora y se
agitaron con un agitador de pala plana a 400 rpm.
Composición del medio de bioconversión
TT/1
| Glucosa | 125,0 g |
| Almidón de patata | 25,0 g |
| Harina de soja | 50,0 g |
| Extracto de levadura (Gistex) | 50,0 g |
| Peptona | 50,0 g |
| CoCl_{2} x 6H_{2}O | 10,0 mg |
| Aceite de girasol | 10,0 g |
| en 4.500 ml de agua corriente |
El pH del medio de bioconversión se ajustó a 7,0
antes de la esterilización.
El cultivo continuó a 28ºC durante 96 horas. En
este momento se añadieron al cultivo 2,5 g de sal ácida de sodio de
compactina en disolución acuosa estéril filtrada. Al quinto día de
la fermentación la sal ácida de sodio de compactina se había
consumido por completo en el caldo de fermentación. A continuación
se repitió la adición de sustrato diariamente durante otros 3 días
en porciones de 2,5 g/día. El sustrato, la sal ácida de sodio de
compactina, se consumió gradualmente durante los cuatro días y se
convirtió por completo en pravastatina. Según los resultados de las
mediciones de HPLC al final del periodo de fermentación se habían
producido 9 g de pravastatina a partir del 10 g de sustrato
compactina.
Después de completar la bioconversión se aisló la
pravastatina formada a una concentración de 1.800 \mug/ml de la
siguiente manera:
Se centrifugaron 5 litros de caldo de cultivo a
2.500 rpm durante 20 minutos. Después se añadieron 2 litros de agua
a la masa de micelio separada y la suspensión se agitó durante una
hora y se filtró. Estos dos filtrados se unieron y se hicieron
pasar a través de columna que contenía 300 g (540 ml) de resina
Dowex AI 400 (OH^{-}) (diámetro de la columna: 4 cm, altura del
lecho de la resina: 43 cm), a una velocidad de flujo de 500
ml/hora, a continuación el lecho de la resina se lavó con 1 litro de
agua desionizada. A partir de ese momento se eluyó la columna con 1
litro de una mezcla acetona-agua (1:1) que contenía
10 g de cloruro sódico recogiendo fracciones de 50 ml. Las
fracciones se analizaron mediante el procedimiento de TLC expuesto
en el Ejemplo 1. Las fracciones que contenían el producto se
combinaron y la acetona se destiló al vacío. El pH del concentrado
se ajustó a un valor de 3,5-4,0 con ácido sulfúrico
al 15% y después se extrajo con 3 x 250 ml de acetato de etilo. Se
añadieron 40 ml de agua desionizada al extracto combinado de acetato
de etilo y después de ajustó el pH a un valor de
7,5-8,0 con hidróxido sódico 1 M. Tras agitar
durante 15 minutos se separaron las fases acuosa y de acetato de
etilo y se extrajo la solución de acetato de etilo con 2 x 40 ml de
agua desionizada como se ha expuesto anteriormente. Después se
concentró la solución acuosa alcalina combinada hasta un volumen de
50 ml y se sometió a cromatografía en una columna rellena con 600 ml
de la resina adsorbente no iónica Diaion HP20 (Mitsubishi Co.,
Japón) (diámetro de la columna: 3,8 cm, altura del lecho de la
resina: 53 cm). La columna se lavó con 600 ml de agua desionizada y
después se eluyó con mezclas de acetona-agua
desionizada en las que la concentración de acetona se fue aumentando
en fases de 5%, recogiendo fracciones de 50 ml. El eluato se analizó
con el procedimiento de TLC descrito en el Ejemplo 1. La
pravastatina se eluyó de la columna con una mezcla de
acetona-agua desionizada que contenía 15% de
acetona. Las fracciones que contenían pravastatina como componente
único se combinaron y la solución se concentró al vacío hasta un
volumen de 150 ml. Posteriormente se añadieron 0,6 g de carbón
vegetal a la solución acuosa concentrada y se aclaró la pravastatina
a temperatura ambiente durante una hora. Después se filtró el carbón
vegetal y el filtrado se liofilizó. Los 6,5 g de pravastatina
liofilizada resultantes se cristalizaron dos veces en una mezcla de
etanol y acetato de etilo. El precipitado se filtró y se lavó con 20
ml de acetato de etilo y 20 ml de n-hexano, y se
secó al vacío a temperatura ambiente. De este modo se obtuvieron 4,6
g de pravastatina cromatográficamente pura.
Se preparó una suspensión de esporas con 5 ml de
agua destilada estéril a partir de la superficie de un cultivo
inclinado de 10 días en agar almidón soluble, como se describe en
el Ejemplo 1, de la cepa de Micromonospora echinospora ssp.
echinospora IDR-P_{5} [NCAIM (P) b 001272], capaz
de hidroxilar la sal ácida de sodio de compactina en la posición
6\beta, y la suspensión de esporas obtenida se usó para inocular
100 ml de medio de inóculo TI esterilizado en un matraz Erlenmeyer
de 500 ml. La composición del medio TI también se ha descrito en el
Ejemplo 1. El medio inoculado se agitó en un agitador rotatorio
(250 rpm, amplitud de 2,5 cm) durante 3 días a 28ºC, a continuación
se transfirieron alícuotas de 5ml del cultivo desarrollado a 100 ml
de medio de bioconversión TT/1 esterilizado en matraces Erlenmeyer
de 500 ml durante 25 minutos a 121ºC. La composición del medio TT/1
se describe en el Ejemplo 4. Los matraces se agitaron en un agitador
rotatorio (250 rpm, amplitud de 2,5 cm) durante 3 días a 25ºC,
después se añadieron a los cultivos 10 mg del sustrato compactina
(sal ácida de sodio de compactina) en solución acuosa filtrada
estéril y la fermentación continuó durante 168 horas.
Al final de la bioconversión se determinó
mediante HPLC el contenido en pravastatina del caldo de
fermentación. En este momento la concentración media de pravastatina
era de 40 \mug/ml.
La fermentación, la alimentación con sustrato y
la bioconversión se llevaron a cabo con la cepa
IDR-P_{6} [NCAIM (P) B 001273] de
Micromonospora megalomicea ssp. nigra, como se describió en
el Ejemplo 5. El contenido en pravastatina del caldo de fermentación
se determinó mediante HPLC. Al final de la bioconversión el
contenido en pravastatina del caldo era de 50 \mug/ml.
Se usaron alícuotas de 5 ml de un cultivo de
inóculo de la cepa IDR-P_{4} [NCAIM (P) B 001271]
de Micromonospora purpurea, preparado como se describe en el
Ejemplo 1, para sembrar 100 ml de medio TT/14 dispensado en matraces
Erlenmeyer de 500 ml y esterilizado durante 25 minutos a 121ºC.
Composición del medio TT/14
| Almidón de patata | 5,0 g |
| Glucosa | 25,0 g |
| Extracto de levadura (GISTEX) | 15,0 g |
| Peptona | 15,0 g |
| CaCO_{3} | 1,0 g |
| en 1.000 ml de agua corriente |
El pH del medio de bioconversión se ajustó a 7,o
antes de la esterilización.
Los matraces se agitaron en un agitador rotatorio
(250 rpm, amplitud de 2,5 cm) durante 3 días. La alimentación con el
sustrato, la bioconversión y la determinación del contenido de
pravastatina se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 5. Al
final de la bioconversión el contenido en pravastatina del caldo de
fermentación era de 40 \mug/ml.
La fermentación, la alimentación con sustrato y
la bioconversión se llevaron a cabo con la cepa
IDR-P7 [NCAIM (P) B 001274] de Micromonospora
rosaria, como se describió en el Ejemplo 1. Al final de la
bioconversión se midieron 350 \mug/ml de pravastatina en el caldo
de fermentación mediante HPLC.
Claims (7)
1. Un procedimiento microbiano para la
preparación del compuesto de fórmula (I)
a partir de un compuesto de la fórmula general
(II)
en la que R representa un metal alcalino o un ion
amonio,
mediante cultivo sumergido de una cepa de
Micromonospora que es capaz de hidroxilar un compuesto de
fórmula (II) en la posición 6\beta en condiciones de aerobiosis,
y mediante separación y purificación del compuesto de fórmula (I)
formado en el curso de la bioconversión, que comprende las etapas
de:
a) cultivar una cepa de Micromonospora que
es capaz de hidroxilar en la posición 6\beta un compuesto de
fórmula (II), en la que R es como se ha definido anteriormente, a
una temperatura de 25ºC-32ºC, en un medio nutriente
que contiene fuentes de carbono y de nitrógeno disponibles y sales
minerales, posteriormente
b) añadir al cultivo en desarrollo el sustrato a
transformar, después
c) hidroxilar el sustrato hasta la finalización
de la bioconversión, a continuación
d) separar el compuesto de fórmula (I) del caldo
de cultivo y, si se desea, purificar el mismo.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se aplica la cepa IDR-P_{3} de
Micromonospora sp., depositada en la National Collection of
Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría, bajo
el número NCAIM (P) B 001268, o una cepa mutante de la misma, que es
capaz de hidroxilar en la posición 6\beta un compuesto de fórmula
general (II).
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se aplica la cepa IDR-P_{4} de
Micromonospora purpurea, depositada en la National
Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest,
Hungría, bajo el número NCAIM (P) B 001271, o una cepa mutante de la
misma, que es capaz de hidroxilar en la posición 6\beta un
compuesto de fórmula general (II).
4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se aplica la cepa IDR-P_{5} de
Micromonospora echinospora ssp. echinospora, depositada en
la National Collection of Agricultural and Industrial
Microorganisms, Budapest, Hungría, bajo el número NCAIM (P) B
001272, o una cepa mutante de la misma, que es capaz de hidroxilar
en la posición 6\beta un compuesto de fórmula general (II).
5. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se aplica la cepa IDR-P_{6} de
Micromonospora megalomicea ssp. nigra, depositada en la
National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms,
Budapest, Hungría, bajo el número NCAIM (P) B 001273, o una cepa
mutante de la misma, que es capaz de hidroxilar en la posición
6\beta un compuesto de fórmula general (II).
6. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se aplica la cepa IDR-P_{7} de
Micromonospora rosaria, depositada en la National Collection
of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría,
bajo el número NCAIM (P) B 001274, o una cepa mutante de la misma,
que es capaz de hidroxilar en la posición 6\beta un compuesto de
fórmula general (II).
7. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto de fórmula (I)
formado durante la fermentación se separa del caldo de cultivo
mediante adsorción en una resina de intercambio iónico aniónica o
mediante extracción con un disolvente orgánico inmiscible en agua,
seguido de la preparación de su derivado lactona o su sal de amina
secundaria como producto intermedio, o mediante purificación del
extracto acuoso alcalino obtenido a partir del extracto del
disolvente orgánico del caldo de fermentación con cromatografía en
una resina de adsorción no iónica.
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