ES2240687T3 - Derivados de imidazolidina, su preparacion y su uso como agente atiinflamatorio. - Google Patents

Derivados de imidazolidina, su preparacion y su uso como agente atiinflamatorio.

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ES2240687T3 ES02700268T ES02700268T ES2240687T3 ES 2240687 T3 ES2240687 T3 ES 2240687T3 ES 02700268 T ES02700268 T ES 02700268T ES 02700268 T ES02700268 T ES 02700268T ES 2240687 T3 ES2240687 T3 ES 2240687T3
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Abstract

Un compuesto de fórmula I, **(Fórmula)** en la que A es ciclopropilmetilo o isobutilo; E es -CO-R6, -CO-H o -CH2-O-R7; Z es oxígeno o azufre; R1 es hidrógeno o metilo; R2 es fenilo, piridilo o alquilo (C1-C4), donde el resto alquilo puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor, y el resto fenilo puede estar sustituido con uno o más sustituyentes iguales o diferentes del grupo que consta de alquilo(C1-C4), alcoxi (C1-C4), metilendioxi, etilendioxi, halógeno, trifluorometilo y trifluorometoxi; R3 y R4 son metilo o trifluorometilo; R5 es hidrógeno o alquilo (C1-C4), donde el resto alquilo puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor; R6 es hidroxilo, alcoxi (C1-C10), fenil-alcoxi(C1-C8), feniloxi, alquil(C1-C8)-carboniloxi-alcoxi(C1-C6), fenilcarboniloxi-alcoxi(C1-C6), fenil-alquil(C1-C6)-carboniloxi-alcoxi(C1-C6), alcoxi(C1-C8)-carboniloxi-alcoxi(C1-C6), feniloxi-carboniloxi-alcoxi(C1-C6), fenil-alcoxi(C1-C6)-carboniloxi-alcoxi(C1-C6), amino, mono(alquil(C1-C10))-amino o di (alquil(C1-C10))-amino; R7 es hidrógeno o alquilo (C1-C4); en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, o sus sales fisiológicamente tolerables.

Description

Derivados de imidazolidina, su preparación y su uso como agente antiinflamatorio.
La presente invención se refiere a nuevos derivados de imidazolidina de fórmula I,
1
en la que A, E, Z, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} tienen los significados indicados a continuación. Los compuestos de fórmula I son valiosos compuestos farmacéuticos activos, que son adecuados, por ejemplo, para tratar enfermedades inflamatorias, por ejemplo artritis reumatoide, o enfermedades alérgicas. Los compuestos de fórmula I son inhibidores de la adhesión y migración de leucocitos y/o antagonistas del receptor de adhesión VLA-4 perteneciente al grupo de las integrinas. Generalmente son adecuados para tratar enfermedades que son causadas por un grado no deseado de adhesión de leucocitos y/o migración de leucocitos, o están asociadas con esto, o en las que juegan un papel las interacciones célula-célula o célula-matriz que se basan en interacciones de receptores VLA-4 con sus ligandos. La invención además se refiere a procedimientos para preparar los compuestos de fórmula I, a su uso y a preparaciones farmacéuticas que contienen compuestos de fórmula I.
Las integrinas son un grupo de receptores de adhesión que juegan un papel importante en los procesos de unión célula-célula y célula-matriz extracelular. Tienen una estructura \alpha\beta-heterodímera y presentan una amplia distribución celular y una alta conservación evolutiva. Entre las integrinas se incluyen, por ejemplo, el receptor de fibrinógeno en plaquetas, que interacciona especialmente con la secuencia RGD del fibrinógeno, o el receptor de vitronectina en osteoclastos, que interacciona especialmente con la secuencia RGD de la vitronectina o de la osteopontina. Las integrinas se dividen en tres grupos principales, la subfamilia \beta2 que contiene las LFA-1, Mac-1 y p150/95 representativas, que son responsables en particular de las interacciones célula-célula del sistema inmunitario, y las subfamilias \beta1 y \beta3, cuyos representantes principalmente median la adhesión celular a componentes de la matriz extracelular (Ruoslahti, Annu. Rev. Biochem. 1988, 57, 375). Las integrinas de la subfamilia \beta1, llamadas también proteínas VLA (antígeno (de activación) muy tardío), incluyen al menos seis receptores que interaccionan específicamente con fibronectina, colágeno y/o laminina como ligandos. Dentro de la familia de VLA, la integrina VLA-4 (\alpha4\beta1) es atípica en cuanto que está principalmente restringida a células linfoides y mieloides, y es responsable en éstas de las interacciones célula-célula con un gran número de células distintas. VLA-4 media, por ejemplo, las interacciones de linfocitos T y B con el fragmento de unión de la heparina II de la fibronectina (FN) del plasma humano. La unión de VLA-4 con el fragmento de unión de la heparina II de la fibronectina del plasma se basa especialmente en una interacción con una secuencia LDVP. En contraste con el receptor de fibrinógeno o vitronectina, VLA-4 no es una integrina de unión a RGD típica (Kilger y Holzmann, J. Mol. Meth. 1995, 73, 347).
Los leucocitos que circulan en la sangre normalmente presentan sólo una baja afinidad por las células endoteliales vasculares que revisten los vasos sanguíneos. Las citoquinas que son liberadas de tejido inflamado producen la activación de las células endoteliales y por lo tanto la expresión de un gran número de antígenos de superficie celular. Entre estos se incluyen, por ejemplo, las moléculas de adhesión ELAM-1 (molécula de adhesión celular endotelial-1; también denominada E-selectina) que entre otros, se unen a neutrófilos, ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular-1), que interacciona con LFA-1 (antígeno asociado a la función de leucocito 1) en leucocitos, y VCAM-1 (molécula de adhesión celular vascular-1), que se une a diferentes leucocitos, entre otros linfocitos (Osborn et al., Cell 1989, 59, 1203). VCAM-1, como ICAM-1, es un miembro de la superfamilia de los genes inmunoglobulina. VCAM-1 (primero conocido como INCAM-110) se identificó como una molécula de adhesión que es inducida en células endoteliales por citoquinas inflamatorias tales como TNF e IL-1, y lipopolisacáridos (LPS). Elices et al. (Cell 1990, 60, 577) mostraron que VLA-4 y VCAM-1 forman una pareja receptor-ligando que media la unión de linfocitos al endotelio activado. La unión de VCAM-1 a VLA-4 no se produce debido a una interacción de VLA-4 con una secuencia RGD, VCAM-1 no contiene dicha secuencia (Bergelson et al., Current Biology 1995, 5, 615). Sin embargo, VLA-4 se encuentra también en otros leucocitos, y la adhesión de leucocitos distintos de los linfocitos, también es mediada por el mecanismo de adhesión VCAM-1/VLA-4. Por lo tanto VLA-4 representa un ejemplo individual de un receptor integrina \beta-1 que, mediante los ligandos VCAM-1 y fibronectina, juega un papel importante tanto en interacciones célula-célula como en interacciones célula-matriz extracelular.
Las moléculas de adhesión inducidas por citoquinas juegan un papel importante en el reclutamiento de leucocitos en regiones del tejido extravascular. Los leucocitos son reclutados en las regiones del tejido inflamatorio por moléculas de adhesión celular que son expresadas en la superficie de células endoteliales y sirven como ligandos para las proteínas de superficie celular del leucocito o complejos de proteína (receptores) (los términos ligando y receptor también se pueden usar viceversa). Los leucocitos de la sangre se deben adherir primero a las células endoteliales antes de que puedan migrar a la sinovia. Puesto que VCAM-1 se une a células que llevan la integrina VLA-4 (\alpha4\beta1), tales como eosinófilos, linfocitos T y B, monocitos o neutrófilos, ésta y el mecanismo VCAM-1/VLA-4 tienen la función de reclutar células de este tipo de la corriente sanguínea en zonas de focos de infección o inflamación (Elices et al., Cell 1990, 60, 577; Osborn, Cell 1990, 62, 3; Issekutz et al., J. Exp. Med. 1996, 183, 2175).
El mecanismo de adhesión VCAM-1/VLA-4 se ha conectado con una serie de procesos fisiológicos y patológicos. Aparte de inducida por citoquina en el endotelio, VCAM-1 es expresada adicionalmente, entre otros, en las siguientes células: mioblastos, células dendríticas linfoides y macrófagos de tejidos, sinovia reumatoide, células neurológicas estimuladas por citoquina, células epiteliales parietales de la cápsula de Bowman, el epitelio tubular renal, tejido inflamado durante el rechazo en el trasplante de corazón y riñón, y por tejido intestinal en injerto frente a enfermedades huésped. También se encuentra que VCAM-1 es expresada en aquellas zonas de tejido del endotelio arterial que corresponden a placas ateroscleróticas tempranas de un modelo de conejo. Además, VCAM-1 es expresada en células dendríticas foliculares de nódulos linfáticos humanos y se encuentra en células del estroma de la médula ósea, por ejemplo en el ratón. El último descubrimiento apunta a una función de VCAM-1 en el desarrollo de células B. Aparte de en células de origen hematopoyético, VLA-4 también se encuentra, por ejemplo, en líneas celulares de melanoma, y el mecanismo de adhesión VCAM-1/VLA-4 está conectado con la metástasis de dichos tumores (Rice et al., Science 1989, 246, 1303).
La forma principal en la que VCAM-1 se produce in vivo en células endoteliales y que es la forma dominante in vivo, se denomina VCAM-7D y lleva siete dominios de inmunoglobulina. Los dominios 4, 5 y 6, son similares en sus secuencias de aminoácidos a los dominios 1, 2 y 3. En una forma adicional que consta de seis dominios, denominada aquí VCAM-6D, el cuarto dominio es eliminado por corte y empalme alternativo. VCAM-6D también se puede unir a células que expresan VLA-4.
Se encuentran detalles adicionales relacionados con VLA-4, VCAM-1, integrinas y proteínas de adhesión, por ejemplo, en los artículos de Kilger y Holzmann, J. Mol. Meth. 1995, 73, 347; Elices, Cell Adhesion in Human Disease, Wiley, Chichester 1995, p. 79; Kuijpers, Springer Semin. Immunopathol. 1995, 16, 379.
Debido al papel del mecanismo VCAM-1/VLA-4 en procesos de adhesión celular que son importantes, por ejemplo, en infecciones, inflamación o aterosclerosis, se ha intentado controlar trastornos mediante intervenciones en estos procesos de adhesión, en particular, por ejemplo, inflamaciones (Osborn et al., Cell 1989, 59, 1203). Un método para hacer esto, es usar anticuerpos monoclonales que son dirigidos contra VLA-4. Se conocen anticuerpos monoclonales (ACm) de este tipo, que como antagonistas de VLA-4 bloquean la interacción entre VCAM-1 y VLA-4. Así, por ejemplo, el ACm anti-VLA-4 HP2/1 y HP1/3 inhibe la unión de células Ramos que expresan VLA-4 (células tipo células B) a células endoteliales del cordón umbilical humano y a células COS transfectadas con VCAM-1. Igualmente, el ACm anti-VCAM-1 inhibe la adhesión de células Ramos, células Jurkat (células tipo células T) y células HL60 (células tipo granulocito) a células COS transfectadas con construcciones genéticas que hacen que se expresen VCAM-6D y VCAM-7D. Los datos in vitro con anticuerpos que son dirigidos contra la subunidad \alpha4 de VLA-4, muestran que se bloquea la adhesión de linfocitos a las células endoteliales sinoviales, una adhesión que juega un papel en la artritis reumatoide (van Dinther-Janssen et al., J. Immunol. 1991, 147, 4207).
Los experimentos in vivo han mostrado que la encefalomielitis autoinmune experimental se puede inhibir con ACm anti-\alpha4. La migración de leucocitos a un foco inflamatorio es bloqueada igualmente por un anticuerpo monoclonal contra la cadena \alpha4 de VLA-4. También se ha investigado la influencia del mecanismo de adhesión dependiente de VLA-4 usando anticuerpos en un modelo de asma, con el fin de investigar el papel de VLA-4 en el reclutamiento de leucocitos en tejido pulmonar inflamado (documento WO-A-93/13798). La administración de anticuerpos anti-VLA-4 inhibió la reacción de fase tardía y la hiperreacción de la vía aérea en ovejas alérgicas. La importancia de VLA-4 como diana para tratar el asma se discute con detalle en Metzger, Springer Semin. Immunopthol. 1995, 16, 467.
También se investigó el mecanismo de adhesión celular dependiente de VLA-4 en un modelo de primate de enfermedad inflamatoria del intestino (EII). En este modelo, que corresponde a la colitis ulcerativa en el hombre, la administración de anticuerpos anti-\alpha4 dio como resultado una reducción significativa de la inflamación aguda.
Además, fue posible mostrar que la adhesión celular dependiente de VLA-4 juega un papel en los siguientes estados clínicos, incluyendo los siguientes procesos inflamatorios crónicos: artritis reumatoide (Cronstein and Weismann, Arhtritis Rheum. 1993, 36, 147; Elices et al., J. Clin. Invest. 1994, 93, 405), diabetes mellitus (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 10494), lupus eritematoso sistémico (Takeuchi et al., J. Clin. Invest. 1993, 92, 3008), alergias de tipo retardado (alergia de tipo IV) (Elices et al., Clin. Exp. Rheumatol. 1993, 11, S77), esclerosis múltiple (Yednock et al., Nature 1992, 356, 63), malaria (Ockenhouse et al., J. Exp. Med. 1992, 176, 1183), aterosclerosis (O'Brien et al., J. Clin. Invest. 1993, 92, 945; Shih et al., Circ. Res. 1999, 84, 345), trasplante (Isobe et al., Transplatation Proceedings 1994, 26, 867), diferentes tumores malignos, por ejemplo melanoma (Renkonen et al., Am. J. Pathol. 1992, 140, 763), linfoma (Freedman et al., Blood 1992, 79, 206) y otros (Albelda et al., J. Cell Biol. 1991, 114, 1059).
La interacción de VLA-4 con VCAM-1 y fibronectina está conectada con algunos procesos fisiopatológicos en enfermedades cardiovasculares. En un sistema de célula in vitro, los neutrófilos infiltrados inhiben la contracción celular (inotropía negativa) de cardiomiocitos en 35%. Se pudo inhibir esta acción inotrópica negativa de los neutrófilos con un anticuerpo anti-\alpha4, pero no con un anticuerpo anti-CD18 (Poon et al., Circ. Res. 1999, 84, 1245). Se mostró la importancia de VLA-4 en la patogénesis de la aterosclerosis en un modelo de ratón de aterosclerosis. Por lo tanto, el péptido CS-1, que se dirige contra el sitio de unión de VLA-4 de la fibronectina, inhibe el reclutamiento de leucocitos y la acumulación de grasa en la aorta, y por lo tanto la formación de placas ateroscleróticas en ratones knockout receptores LDL alimentados aterogénicamente (Shih et al., Circ. Res. 1999, 84, 345). Usando el mismo péptido CS-1, se pudo además mostrar en un modelo de trasplante de corazón heterotópico en el conejo, que la formación de una vasculopatía de trasplante puede disminuir significativamente por bloqueo de la interacción de VLA-4 y fibronectina (Molossi et al., J. Clin. Invest. 1995, 95, 2601).
Por lo tanto, el bloqueo de VLA-4 con antagonistas adecuados ofrece posibilidades terapéuticas eficaces para tratar, por ejemplo, en particular diferentes estados inflamatorios incluyendo asma y EII. Como ya se ha expuesto, la particular importancia de los antagonistas de VLA-4 para tratar la artritis reumatoide resulta aquí del hecho de que los leucocitos de la sangre se deben adherir primero a células endoteliales antes de que puedan migrar a la sinovia, y que el receptor VLA-4 juega un papel en esta adhesión. El hecho de que VCAM-1 es inducido en células endoteliales por agentes inflamatorios (Osborn, Cell 1990, 62, 3; Stoolman, Cell 1989, 56, 907), y el reclutamiento de diferentes leucocitos en zonas de infección y focos inflamatorios ya se ha discutido antes. Aquí, las células T se adhieren al endotelio activado principalmente por los mecanismos de adhesión LFA-1/ICAM-1 y VLA-4/VCAM-1 (Springer, Cell 1994, 76, 301). En las mayoría de las células T sinoviales, la capacidad de unión de VLA-4 con VCAM-1 aumenta en la artritis reumatoide (Postigo et al., J. Clin. Invest. 1992, 89, 1445). Además, se ha observado una mayor adhesión de las células T sinoviales a la fibronectina (Laffon et al., J. Clin. Invest. 1991, 88, 546; Morales-Ducret et al., J. Immunol. 1992, 149, 1424). Así, VLA-4 es sobrerregulado tanto con respecto a su expresión como con respecto a su función en los linfocitos T de la membrana sinovial reumatoide. El bloqueo de la unión de VLA-4 a sus ligando fisiológicos VCAM-1 y fibronectina hace posible una prevención eficaz o alivio de los procesos inflamatorios articulares. Esto también se confirma con experimentos con el anticuerpo HP2/1 en ratas Lewis con artritis adyuvante, en las que se observó una prevención eficaz de la enfermedad (Barbadillo et al., Springer Semin. Immunopathol. 1995, 16, 427). Los peptidomiméticos de CS-1 que contienen una unidad de ácido aspártico o uno de sus derivados en la molécula, y que inhiben la unión de VLA-4 a la secuencia CS-1 de la proteína de matriz fibronectina, se describen en el documento WO-A-00/02903. Por lo tanto, VLA-4 es una molécula diana terapéutica importante.
Los anticuerpos de VLA-4 antes mencionados y el uso de anticuerpos como antagonistas de VLA-4 se describe en las solicitudes de patente WO-A-93/13798, WO-A-93/15764, WO-A-94/16094, WO-A-94/17828 y WO-A-95/19790. Las solicitudes de patente WO-A-94/15958, WO-A-95/15973, WO-A-96/00581, WO-A-96/06108 y WO-A-96/20216 describen compuestos peptídicos como antagonistas de VLA-4. Sin embargo, el uso de anticuerpos y compuestos peptídicos como productos farmacéuticos está aquejado de desventajas, por ejemplo, carece de disponibilidad oral, fácil degradabilidad o acción inmunogénica en administración a largo plazo, y por lo tanto son necesarios antagonistas de VLA-4 que tengan un perfil de propiedades favorable para usar en la terapia y profilaxis de diferentes estados de enfermedad.
Los documentos WO-A-95/14008, WO-A-93/18057, US-A-5.658.935, US-A-5.686.421, US-A-5.389.614, US-A-5.397.796, US-A-5.424.293 y US-A-5.554.594, describen anillos de heterociclo de 5 miembros sustituidos que tienen una función amino, amidino o guanidino en el extremo N-terminal de la molécula, y que muestran acciones de inhibición de agregación de plaquetas. El documento EP-A-796855 describe otros heterociclos que son inhibidores de la resorción ósea. Los documentos EP-A-842943, EP-A-842945 y EP-A-842944, describen que los compuestos de estas series y compuestos adicionales también inhiben sorprendentemente la adhesión de leucocitos y son antagonistas de VLA-4.
Los documentos EP-A-903353, EP-A-905139, EP-A-918059, WO-99/23063, WO-A-99/24398, WO-A-99/54321 y WO-A-99/60015, describen compuestos adicionales que inhiben la adhesión de leucocitos y son antagonistas de VLA-4. Sin embargo, las propiedades de estos compuestos, todavía no son satisfactorias en diferentes sentidos, y son necesarios compuestos que tengan un perfil de propiedades mejorado. El documento EP-A-918.059 menciona, entre otros, derivados de imidazolidina en los que el anillo de imidazolidina está unido por su posición 1 al átomo de carbono de la posición 2 de una unidad 2-(cicloalquilalquil)acetilamino o una unidad 2-isobutilacetilamino. Sin embargo, no se describen específicamente los derivados de imidazolidina de fórmula I de la presente invención, que se distinguen por su ventajoso perfil de propiedades y en particular por su potencia marcadamente mayor.
La presente invención se refiere a compuestos de fórmula I,
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en la que
A es ciclopropilmetilo o isobutilo;
E es -CO-R^{6}, -CO-H o -CH_{2}-O-R^{7};
Z es oxígeno o azufre;
R^{1} es hidrógeno o metilo;
R^{2} es fenilo, piridilo o alquilo (C_{1}-C_{4}), donde el resto alquilo puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor, y el resto fenilo puede estar sustituido con uno o más sustituyentes idénticos o diferentes del grupo que consta de alquilo (C_{1}-C_{4}), alcoxi (C_{1}-C_{4}), metilendioxi, etilendioxi, halógeno, trifluorometilo y trifluorometoxi;
R^{3} y R^{4} son metilo o trifluorometilo;
R^{5} es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4}), donde el resto alquilo puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor;
R^{6} es hidroxilo, alcoxi (C_{1}-C_{10}), fenil-alcoxi(C_{1}-C_{8}), feniloxi, alquil(C_{1}-C_{8})-carboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), fenilcarboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), fenil-alquil(C_{1}-C_{6})-carboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), alcoxi(C_{1}-C_{8})-carboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), feniloxi-carboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), fenil-alcoxi(C_{1}-C_{6})-carboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), amino, mono(alquil(C_{1}-C_{10}))-amino o di(alquil(C_{1}-C_{10}))-amino;
R^{7} es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});
en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, y sus sales fisiológicamente tolerables.
Los restos alquilo pueden ser de cadena lineal o ramificada. Esto también se aplica si llevan sustituyentes o están como sustituyentes en otros restos, por ejemplo, en restos fluoroalquilo, restos alcoxi o restos alcoxicarbonilo. Ejemplos de restos alquilo son metilo, etilo, n-propilo, isopropilo (= 1-metiletilo = iC_{3}H_{7}), n-butilo, isobutilo (= 2-metilpropilo), sec-butilo (= 1-metilpropilo), terc-butilo (= 1,1-dimetiletilo), n-pentilo, isopentilo, terc-pentilo, neopentilo, n-hexilo, 3-metilpentilo, isohexilo, neohexilo, n-heptilo, 2,3,5-trimetilhexilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo. Los restos alquilo preferidos son metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo. En los restos alquilo, uno o más, por ejemplo 1, 2, 3, 4 ó 5 átomos de hidrógeno se pueden sustituir por átomos de flúor. Ejemplos de estos restos fluoroalquilo son trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, pentafluoroetilo, heptafluoroisopropilo. Los restos alquilo sustituidos, por ejemplo restos fenilalquilo o restos fluoroalquilo, pueden estar sustituidos en cualesquiera posiciones deseadas.
Los restos fenilo pueden no estar sustituidos o estar mono o polisustituidos, por ejemplo, mono- di-, tri-, tetra- o pentasustituidos, con sustituyentes idénticos o diferentes. Si un resto fenilo está sustituido, preferiblemente lleva uno o dos sustituyentes iguales o diferentes. Esto también se aplica a restos fenilo sustituidos en grupos tales como fenilalquilo, fenilcarbonilo, etc. Restos fenilalquilo son, por ejemplo, bencilo, 1-feniletilo o 2-feniletilo, en particular bencilo, todos los cuales también pueden estar sustituidos.
En restos fenilo monosustituidos, el sustituyente puede estar situado en la posición 2, la posición 3 o la posición 4. El fenilo disustituido puede estar sustituido en la posición 2,3, posición 2,4, posición 2,5, posición 2,6, posición 3,4 o posición 3,5. En restos fenilo trisustituidos, los sustituyentes pueden estar situados en la posición 2,3,4, posición 2,3,5, posición 2,4,5, posición 2,4,6, posición 2,3,6 o posición 3,4,5. Si un resto fenilo lleva sustituyentes del grupo que consta de metilendioxi (-O-CH_{2}-O-) y etilendioxi (-O-CH_{2}-CH_{2}-O-), preferiblemente lleva sólo un sustituyente de este grupo (si se desea además de otros sustituyentes).
Ejemplos de restos fenilo sustituidos que pueden representar R^{2} son 2-metilfenilo, 3-metilfenilo, 4-metilfenilo, 2,3-dimetilfenilo, 2,4-dimetilfenilo, 2,5-dimetilfenilo, 2,6-dimetilfenilo, 3,4-dimetilfenilo, 3,5-dimetilfenilo, 2,4,5-trimetilfenilo, 2,4,6-trimetilfenilo, 3,4,5-trimetilfenilo, 2-(n-butil)fenilo, 3-(n-butil)fenilo, 4-(n-butil)fenilo, 2-isobutilfenilo, 3-isobutilfenilo, 4-isobutilfenilo, 3-terc-butilfenilo, 4-terc-butilfenilo, 2-metoxifenilo, 3-metoxifenilo, 4-metoxifenilo, 2,3-dimetoxifenilo, 2,4-dimetoxifenilo, 2,5-dimetoxifenilo, 2,6-dimetoxifenilo, 3,4-dimetoxifenilo, 3,5-dimetoxifenilo, 2,4,5-trimetoxifenilo, 2,4,6-trimetoxifenilo, 3,4,5-trimetoxifenilo, 2-(n-butoxi)fenilo, 3-(n-butoxi)fenilo, 4-(n-butoxi)fenilo, 2-isobutoxifenilo, 3-isobutoxifenilo, 4-isobutoxifenilo, 2-terc-butoxifenilo, 3-terc-butoxifenilo, 4-terc-butoxifenilo, 2,3-metilenedioxifenilo, 3,4-metilenedioxifenilo, 2,3-etilenedioxifenilo, 3,4-etilenedioxifenilo, 2-fluorofenilo, 3-fluorofenilo, 4-fluorofenilo, 2,3-difluorofenilo, 2,4-difluorofenilo, 2,5-difluorofenilo, 2,6-difluorofenilo, 3,4-difluorofenilo, 3,5-difluorofenilo, 2,4,5-trifluorofenilo, 2,4,6-trifluorofenilo, 3,4,5-trifluorofenilo, 2,3,5,6-tetrafluorofenilo, 2,3,4,5,6-pentafluorofenilo, 2-clorofenilo, 3-clorofenilo, 4-clorofenilo, 2,3-diclorofenilo, 2,4-diclorofenilo, 2,5-diclorofenilo, 2,6-diclorofenilo, 3,4-diclorofenilo, 3,5-diclorofenilo, 2-bromofenilo, 3-bromofenilo, 4-bromofenilo, 3-yodofenilo, 4-yodofenilo, 2-trifluorometilfenilo, 3-trifluorometilfenilo, 4-trifluorometilfenilo, 3,4-bis-(trifluorometil)fenilo, 3,5-bis(trifluorometil)fenilo, 2-trifluorometoxifenilo, 3-trifluorometoxifenilo, 4-trifluorometoxifenilo, etc. Sin embargo, en restos fenilo sustituidos, puede haber sustituyentes diferentes en cualquier combinación deseada, tal como por ejemplo, en retos 3-metoxi-4-metilfenilo, 4-fluoro-3-metoxifenilo, 3-fluoro-4-metoxifenilo, 3,5-difluoro-4-metoxifenilo, 3-fluoro-4,5-metilendioxifenilo, 3-fluoro-4,5-etilendioxifenilo, 2-cloro-3-metilfenilo, 3-cloro-4-metilfenilo, 3-cloro-4-fluorofenilo, etc.
Halógeno es flúor, cloro, bromo o yodo, preferiblemente flúor o cloro.
Piridilo es 2-piridilo, 3-piridilo o 4-piridilo. En los restos piridilo, el átomo de nitrógeno también puede estar oxidado, y el correspondiente compuesto de fórmula I puede estar presente como un N-óxido de piridina, que está igualmente incluido en la presente invención.
Las sales fisiológicamente tolerables de los compuestos de fórmula I, son en particular sales no tóxicas o farmacéuticamente utilizables. Los compuestos de fórmula I que contienen grupos ácido, por ejemplo un grupo ácido carboxílico que representa el grupo E, pueden estar presentes, por ejemplo, como sales de metal alcalino o sales de metal alcalino-térreo, por ejemplo sales de sodio, sales de potasio, sales de magnesio y sales de calcio, o como sales de amonio, tal como por ejemplo, sales con iones amonio cuaternarios fisiológicamente tolerables y sales de adición de ácido con amoniaco y aminas orgánicas fisiológicamente tolerables, tales como por ejemplo, metilamina, etilamina, trietilamina, 2-hidroxietilamina, tris(2-hidroxietil)amina, \alpha,\alpha,\alpha-tris(hidroximetil)metilamina (trometamina) o aminoácidos, en particular aminoácidos básicos. Las sales de un compuesto ácido de fórmula I con una amina orgánica pueden contener los dos componentes en una relación 1:1 o aproximadamente 1:1 o en otra relación, por ejemplo, en una relación de aproximadamente 1:0,5 a aproximadamente 1:4 (1 molécula de fórmula I por de 0,5 a 4 moléculas de la amina), en particular en una relación de aproximadamente 1:0,5 a aproximadamente 1:2 (1 molécula de fórmula I por de 0,5 a 2 moléculas de la amina).
Los compuestos de fórmula I que contienen grupos básicos, por ejemplo un grupo piridilo, pueden estar presentes como sales de adición de ácido, por ejemplo como sales con ácidos inorgánicos tales como por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, o como sales con ácidos carboxílicos orgánicos o ácidos sulfónicos, tales como por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido metanosulfónico o ácido p-toluensulfónico. Los compuestos que contienen tanto grupos ácidos como grupos básicos, también pueden estar presentes en forma de sales internas, iones híbridos o betaínas, que están igualmente incluidos en la presente invención.
Las sales se pueden obtener de los compuestos de fórmula I por procedimientos habituales conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, por combinación con un ácido o base orgánico o inorgánico en un disolvente o diluyente, o a partir de otras sales por intercambio de anión o de catión.
Los compuestos de fórmula I pueden estar presentes en formas estereoisómeras. Con respecto a cada centro asimétrico en los compuestos de fórmula I, independientemente de cualquier otro centro asimétrico, pueden estar presentes con la configuración S o la configuración R o mezclas R/S. Por lo tanto, el átomo de carbono asimétrico al cual está unido el resto R^{2} puede tener la configuración R o configuración S, o el compuesto de fórmula I puede estar presente como una mezcla R/S con respecto a este átomo de carbono. Igualmente, el átomo de carbono asimétrico al cual están unidos el grupo A y el anillo de imidazolidina puede tener la configuración R o configuración S, o el compuesto de fórmula I puede estar presente como una mezcla R/S con respecto a este átomo de carbono. Igualmente todos los demás átomos de carbono asimétricos pueden tener la configuración R o la configuración S, o el compuesto de fórmula I puede estar presente como una mezcla R/S con respecto a cada uno de estos átomos de carbono. En las mezclas R/S los estereoisómeros individuales pueden estar presentes en cualquier proporción incluyendo una proporción 1:1.
La invención incluye todos los posibles estereoisómeros de los compuestos de fórmula I, por ejemplo enantiómeros puros o en buena parte puros, y diastereoisómeros puros o en buena parte puros, y mezclas de dos o más formas estereoisómeras, por ejemplo mezclas de enantiómeros y/o diastereoisómeros, en todas las proporciones. Por lo tanto, la invención se refiere a enantiómeros en forma enantiómera pura, tanto como antípodas levorrotatorios como dextrorrotatorios, en forma de racematos y en forma de mezclas de dos enantiómeros en todas las proporciones. Igualmente la invención se refiere a distereoisómeros en forma diastereoisómera pura y en forma de mezclas en todas las relaciones. Ejemplos de estereoisómeros individuales que están comprendidos en la invención, son los compuestos de fórmula Ia, Ib, Ic y Id.
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La preparación de estereoisómeros individuales, si conviene, se puede llevar a cabo usando sustancias iniciales estereoquímicamente uniformes en la síntesis, por síntesis estereoselectiva o por separación de una mezcla de acuerdo con los métodos habituales, por ejemplo, por cromatografía o cristalización, y en el caso de enantiómeros, por ejemplo, por cromatografía en fases quirales. Si es adecuado, se puede llevar a cabo la formación de un derivado antes de la separación de estereoisómeros. La separación de una mezcla de estereoisómeros se puede llevar a cabo en la etapa de los compuestos de fórmula I o en la etapa de las sustancias iniciales o de un producto intermedio en el transcurso de la síntesis.
Los compuestos de fórmula I de acuerdo con la invención, pueden contener átomos de hidrógeno móviles, es decir, pueden estar presentes en diferentes formas tautómeras. La presente invención comprende todos los tautómeros de los compuestos de fórmula I. La presente invención también comprende solvatos y compuestos de adición o aductos de compuestos de fórmula I, por ejemplo, aductos con agua, es decir hidratos, o aductos con alcoholes o aminas. La invención además comprende derivados de compuestos de fórmula I, por ejemplo, ésteres, amidas, profármacos y otros derivados fisiológicamente tolerables, y metabolitos activos de los compuestos de fórmula I. La invención, en particular también se refiere a profármacos de los compuestos de fórmula I, que in vitro no son necesariamente farmacológicamente activos, pero que in vivo, en condiciones fisiológicas, se convierten en compuestos activos de fórmula I. Los expertos en la técnica conocen profármacos adecuados para los compuestos de fórmula I, es decir derivados químicamente modificados de los compuestos de fórmula I que tienen propiedades mejoradas de una forma deseada. Se encuentra información más detallada en relación a los profármacos, por ejemplo, en Fleisher et al., Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1996) 115; Design of Prodrugs, H. Bundgaard, Ed., Elsevier, 1985; H, Bundgaard, Drugs of the Future 16 (1991) 443. Profármacos adecuados para los compuestos de fórmula I, son especialmente profármacos éster, profármacos amida, profármacos aldehído y profármacos alcohol de grupos ácido carboxílico, por ejemplo de un grupo ácido carboxílico que representa el grupo E. Por lo tanto, también los compuestos de fórmula I en los que el grupo E es hidroximetilo, alcoximetilo o formilo, y que presentan antagonismo de VLA-4 in vivo, son profármacos de los compuestos de fórmula I en los que el grupo E es hidroxicarbonilo. Ejemplos de profármacos éster y profármacos amida que se puede mencionar son ésteres de alquilo (C_{1}-C_{4}) tales como ésteres de metilo, ésteres de etilo, ésteres de isopropilo, ésteres de isobutilo, ésteres de alquilo sustituido tales como ésteres de hidroxialquilo, ésteres de aciloxialquilo, ésteres de aminoalquilo, ésteres de acilaminoalquilo, ésteres de dialquilaminoalquilo, amidas no sustituidas o N-alquil(C_{1}-C_{4})-amidas tales como metilamidas o etilamidas.
Entre los ejemplos de compuestos de fórmula I de acuerdo con la invención que se pueden mencionar, están los siguientes compuestos de fórmulas Ie y If, que tienen la configuración S en el átomo de carbono que lleva el grupo A, y tienen la configuración S en el átomo de carbono que lleva el grupo R^{2}, si R^{2} es fenilo o piridilo, y tienen la configuración R en el átomo de carbono que lleva el grupo R^{2}, si R^{2} es metilo. Igualmente la presente invención se refiere a sales fisiológicamente tolerables de los compuestos de fórmulas Ie y If, por ejemplo, sales de metales o sales con cationes de amonio orgánicos de los compuestos de fórmulas Ie y If que contienen un grupo ácido carboxílico, o sales de adición de ácido de los compuestos de fórmulas Ie y If que contienen restos piridilo, por ejemplo los hidrocloruros.
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Compuestos de fórmulas Ie y If
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Los elementos estructurales individuales en los compuestos de fórmula I de acuerdo con la invención, preferiblemente tienen los siguientes significados, y pueden tener independientemente uno u otro significado.
R^{2} preferiblemente es alquilo (C_{1}-C_{4}) que puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor, o piridilo, o fenilo no sustituido, o fenilo que está sustituido con un resto metilendioxi o un resto etilendioxi, o fenilo que está sustituido con uno o dos grupos alcoxi (C_{1}-C_{4}). El grupo alcoxi que representa R^{2}, que opcionalmente puede estar sustituido con flúor, es en particular uno de los grupos metilo, etilo, isopropilo, trifluorometilo y 2,2,2-trifluoroetilo. Los sustituyentes alcoxi en un grupo fenilo que representa R^{2} son en particular grupos metoxi. Preferiblemente particularmente, R^{2} es metilo, piridilo, fenilo no sustituido, fenilo que está sustituido con un resto metilendioxi o un resto etilendioxi o fenilo que está sustituido con uno o dos grupos metoxi. Muy preferiblemente particularmente, R^{2} es metilo, fenilo no sustituido o piridilo.
R^{3} y R^{4} pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, los dos grupos R^{3} y R^{4} son idénticos. En una realización de la presente invención, R^{3} y R^{4} son ambos metilo. En otra realización de la presente invención, R^{3} y R^{4} son ambos trifluorometilo.
Un grupo alquilo que representa R^{5}, que puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor, preferiblemente es un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo trifluorometilo. Preferiblemente, R^{5} es alquilo (C_{1}-C_{4}), que puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor. Preferiblemente particularmente, R^{5} es metilo o trifluorometilo, muy preferiblemente particularmente metilo.
R^{6} preferiblemente es hidroxilo, alcoxi (C_{1}-C_{6}), fenil-alcoxi(C_{1}-C_{4}), feniloxi o amino (NH_{2}), preferiblemente particularmente hidroxilo, alcoxi (C_{1}-C_{6}) o amino, muy preferiblemente particularmente hidroxilo o alcoxi (C_{1}-C_{6}), especialmente preferiblemente hidroxilo o alcoxi (C_{1}-C_{4}), en particular hidroxilo.
R^{7} preferiblemente es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{3}), preferiblemente particularmente hidrógeno o metilo, muy preferiblemente particularmente hidrógeno.
E es preferiblemente -CO-R^{6}, -CO-H, -CH_{2}-OH o -CH_{2}-OCH_{3}, preferiblemente particularmente -CO-R^{6}, -CH_{2}-OH o -CH_{2}-OCH_{3}, muy preferiblemente particularmente -CO-R^{6} o -CH_{2}-OH, además preferiblemente -COOH,
-COOC_{2}H_{5}, -COOiC_{3}H_{7} o -CH_{2}-OH, en particular -COOH.
En una realización de la presente invención Z es azufre, en otra realización Z es oxígeno.
En una realización de la presente invención A es el resto isobutilo (resto 2-metilpropilo, (CH_{3})_{2}CH-CH_{2}-), en otra realización A es el resto ciclopropilmetilo (ciclopropil-CH_{2}-). Además, en una realización de la presente invención R^{1} es hidrógeno y en otra realización R^{1} es metilo.
Los compuestos preferidos de fórmula I son los que tienen una configuración uniforme en uno o más centros quirales, por ejemplo en el átomo de carbono que lleva el resto R^{2}, y/o en el átomo de carbono que lleva el resto A y el resto imidazolidina. Es decir, se prefieren compuestos que están presentes con una configuración uniforme o esencialmente uniforme en uno o más centros quirales, en la configuración R o en la configuración S, pero no como una mezcla R/S. Sin embargo, como se ha explicado, los centros quirales individuales en estos compuestos de fórmula I pueden tener, independientemente uno de otro, la configuración R o la configuración S y tener configuraciones iguales o diferentes. Los compuestos particularmente preferidos de fórmula I son los que el átomo de carbono que lleva el resto A y el resto imidazolidina está presente con la configuración S, es decir, con la configuración con respecto a este estereocentro que se muestra en las fórmulas Ia y Ib. Compuestos particularmente preferidos de fórmula I también son los que el átomo de carbono que lleva el grupo R^{2} está presente en la configuración mostrada en las fórmulas Ia y Ic. Si R^{2}, por ejemplo, es fenilo, fenilo sustituido o piridilo, en estos compuestos particularmente preferidos el átomo de carbono que lleva el grupo R^{2} tiene la configuración S, si R^{2} es metilo, etilo o isobutilo, tiene la configuración R. Son compuestos de fórmula I muy preferidos particularmente aquellos en los que los estereocentros antes mencionados están presentes con las configuraciones mostradas en la fórmula Ia.
Los compuestos preferidos de fórmula I son los compuestos en los que uno o más restos tienen significados preferidos, o tienen un significado específico seleccionado de los significados incluidos en la presente invención en relación a todas las combinaciones de significados preferidos y/o significados específicos de los restos. Ejemplos de compuestos preferidos son, por ejemplo, compuestos en los que, simultáneamente, R^{1}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son metilo, y A es isobutilo, o compuestos en los que, simultáneamente R^{1}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son metilo y A es ciclopropilmetilo, o compuestos en los que, simultáneamente R^{1} es metilo, R^{3} y R^{4} son trifluorometilo, R^{5} es metilo y A es isobutilo, o compuestos en los que, simultáneamente, R^{1} es metilo, R^{3} y R^{4} son trifluorometilo, R^{5} es metilo y A es ciclopropilmetilo, o compuestos en los que, simultáneamente R^{1} es hidrógeno, R^{3}, R^{4} y R^{5} son metilo y A es isobutilo, o compuestos en los que simultáneamente R^{1} es hidrógeno, R^{3}, R^{4} y R^{5} son metilo y A es ciclopropilmetilo, o compuestos en los que, simultáneamente R^{1} es hidrógeno, R^{3} y R^{4} son trifluorometilo, R^{5} es metilo y A es isobutilo, o compuestos en los que, simultáneamente, R^{1} es hidrógeno, R^{3} y R^{4} son trifluorometilo, R^{5} es metilo y A es ciclopropilmetilo, y los otros grupos tienen los significados generales antes indicados en los compuestos de fórmula I o tienen significados preferidos o tienen significados específicos de sus respectivas definiciones.
Son compuestos particularmente preferidos, por ejemplo, compuestos de fórmula I en la que
A es ciclopropilmetilo o isobutilo;
E es -CO-R^{6}, -CH_{2}-OH;
Z es oxígeno;
R^{1} es hidrógeno o metilo;
R^{2} es piridilo, fenilo no sustituido, fenilo que está sustituido con un resto metilendioxi o un resto etilendioxi, fenilo que está sustituido con uno o dos grupos alcoxi (C_{1}-C_{4}), o alquilo (C_{1}-C_{4}) que puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor;
R^{3} y R^{4} son metilo;
R^{5} es metilo;
R^{6} es hidroxilo, alcoxi (C_{1}-C_{6}), fenil-alcoxi(C_{1}-C_{4}), feniloxi, o amino;
en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, y sus sales fisiológicamente tolerables.
Son compuestos particularmente muy preferidos, por ejemplo, los compuestos de fórmula I en la que
A es ciclopropilmetilo o isobutilo;
E es -COOH, -COOC_{2}H_{5}, -COOiC_{3}H_{7} o -CH_{2}-OH;
Z es oxígeno;
R^{1} es metilo;
R^{2} es piridilo, fenilo no sustituido, fenilo que está sustituido con un resto metilendioxi o un resto etilendioxi, fenilo que está sustituido con uno o dos grupos metoxi, o alquilo (C_{1}-C_{4}) que puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor;
R^{3} y R^{4} son metilo;
R^{5} es metilo;
en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, y sus sales fisiológicamente tolerables.
Son compuestos especialmente preferidos, por ejemplo, los compuestos de fórmula I en la que
A es ciclopropilmetilo o isobutilo;
E es -COOH, -COOC_{2}H_{5}, -COOiC_{3}H_{7} o -CH_{2}-OH;
Z es oxígeno;
R^{1} es metilo;
R^{2} es fenilo no sustituido, piridilo, metilo o 2,2,2-trifluoroetilo;
R^{3} y R^{4} son metilo;
R^{5} es metilo;
en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, y sus sales fisiológicamente tolerables.
Son compuestos particularmente especialmente preferidos, por ejemplo, los compuestos de fórmula I en la que
A es ciclopropilmetilo o isobutilo;
E es -COOH, -COOC_{2}H_{5}, -COOiC_{3}H_{7} o -CH_{2}-OH;
Z es oxígeno;
R^{1} es metilo;
R^{2} es fenilo no sustituido, piridilo o metilo;
R^{3} y R^{4} son metilo;
R^{5} es metilo;
en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, y sus sales fisiológicamente tolerables.
Todas las definiciones anteriores de subgrupos de los compuestos de fórmula I, se aplican análogamente a compuestos de fórmula I, en la que R^{3} y R^{4} son ambos trifluorometilo en lugar de metilo. Así, por ejemplo, también son compuestos particularmente especialmente preferidos los compuestos de fórmula I, en la que
A es ciclopropilmetilo o isobutilo;
E es -COOH, -COOC_{2}H_{5}, -COOiC_{3}H_{7} o -CH_{2}-OH;
Z es oxígeno;
R^{1} es metilo;
R^{2} es fenilo no sustituido, piridilo o metilo;
R^{3} y R^{4} son trifluorometilo;
R^{5} es metilo;
en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, y sus sales fisiológicamente tolerables.
Los compuestos de fórmula I se pueden preparar, por ejemplo, por condensación de un compuesto de fórmula II
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con un compuesto de fórmula III,
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donde en las fórmulas II y III los grupos A, E, Z, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} se definen como se ha indicado antes, o alternativamente en estos grupos puede haber grupos funcionales en forma protegida o en forma de precursores, y donde G es hidroxicarbonilo, alcoxi(C_{1}-C_{6})-carbonilo o derivados de ácido carboxílico activados, tales como por ejemplo, cloruros de ácido o ésteres activos.
En la condensación de los compuestos de fórmulas II y III, como norma es necesario que el grupo ácido carboxílico que está presente, pero no está implicado en la reacción de condensación, esté protegido con un grupo protector reversible, y por lo tanto esté presente, por ejemplo, en forma de un éster de alquilo (C_{1}-C_{6}) adecuado tal como el éster de terc-butilo o éster de bencilo. Cuando se van a preparar los compuestos de fórmula I en la que el grupo E, por ejemplo, es un grupo hidroxicarbonilo o un grupo que se prepara a partir de un grupo hidroxicarbonilo, en los compuestos de fórmula III, por ejemplo, el resto E puede ser primero un grupo hidroxicarbonilo en forma protegida, y después de la condensación de los compuestos de fórmulas II y III, el grupo hidroxicarbonilo se puede liberar y/o se puede sintetizar el grupo final E deseado en una o más etapas adicionales.
Los precursores de grupos funcionales son grupos que se pueden convertir en el grupo funcional deseado de acuerdo con los procedimientos de síntesis habituales conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un grupo ciano que se puede convertir en un grupo ácido carboxílico por hidrólisis se puede designar como un precursor para este grupo. Un grupo alcohol que se puede oxidar a un grupo aldehído se puede designar como un precursor para este grupo. Ya se han mencionado ejemplos de grupos protectores que se pueden introducir antes de llevar a cabo una reacción o una secuencia de reacciones y después se eliminan otra vez.
Para la condensación de los compuestos de fórmulas II y III, se usan ventajosamente los métodos de acoplamiento de la química de péptidos que son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie [Métodos de Química Orgánica], Volumen 15/1 y 15/2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Son ejemplos de posibles agentes de condensación o reactivos de acoplamiento, por ejemplo, carbonildiimidazol, carbodiimidas tales como diciclohexilcarbodiimida (DCC) o diisopropilcarbodiimida, tetrafluoroborato de O-((ciano(etoxicarbonil)-metilen)amino)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TOTU) o anhídrido propilfosfónico (PPA). Las condensaciones se pueden llevar a cabo en condiciones patrón que son bien conocidas por los expertos en la técnica. En general, se llevan a cabo en un disolvente o diluyente inerte, por ejemplo en un disolvente aprótico tal como N,N-dimetiformamida (DMF), dimetisulfóxido (DMSO), N-metil-2-pirrolidona (NMP), tetrahidrofurano (THF) o dimetoxietano (DME). Dependiendo de la condensación llevada a cabo en el caso concreto, puede ser ventajoso añadir una base tal como una amina terciaria o reactivos auxiliares, por ejemplo un compuesto N-hidroxi tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBT). El tratamiento de la mezcla de reacción y purificación del producto se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos patrón habituales. Después de la condensación, se eliminan los grupos protectores presentes de una forma adecuada. Por ejemplo, los grupos bencilo en ésteres bencílicos se pueden eliminar por hidrogenación catalítica, o los grupos protectores del tipo terc-butilo se pueden eliminar por tratamiento con un ácido adecuado. La preparación de los compuestos de fórmula I, también se puede llevar a cabo, por ejemplo, sintetizando los compuestos por etapas en una fase sólida de acuerdo con los métodos habituales, siendo posible introducir los elementos estructurales individuales de la molécula en diferentes secuencias.
Los compuestos amino de fórmula III, están disponibles en el comercio o se pueden sintetizar de acuerdo con o de forma análoga a procedimientos patrón conocidos, a partir de materias primas que están disponibles en el comercio, o a su vez se pueden obtener de acuerdo con o de forma análoga a procedimientos de la bibliografía. Por ejemplo, los ácidos 3-aminopropiónicos 3-sustituidos ópticamente activos de fórmula III o sus ésteres, en particular ésteres de ácido 3-fenil-3-aminopropiónico, se pueden preparar a partir de los ácidos acrílicos 3-sustituidos correspondientes, que a su vez se pueden obtener a partir de los aldehídos correspondientes. Los ácidos acrílicos 3-sustituidos se convierten en los cloruros de ácido usando cloruro de oxalilo, y éstos se convierten en los ésteres usando un alcohol, por ejemplo, en ésteres de terc-butilo usando terc-butanol. Para introducir el grupo amino, los ésteres después se hacen reaccionar con la sal de litio de una amina ópticamente activa, por ejemplo, la sal de litio de (R)-(+)-N-bencil-N-(1-feniletil)amina, y después el grupo bencilo y el grupo feniletilo en el 3-(N-bencil-N-(1-feniletil)amino)propionato de terc-butilo 3-sustituido se eliminan por hidrogenación catalítica. Para preparar los compuestos de fórmula III en la que E es el grupo hidroximetilo CH_{2}OH, o un grupo hidroximetilo eterificado, se puede usar en la reacción de condensación 3-aminopropanoles 3-sustituidos o sus éteres que se pueden obtener a partir de ácidos 3-aminopropiónicos 3-sustituidos o sus ésteres, por reducción del grupo ácido o el grupo éster, por ejemplo el éster de etilo o éster de terc-butilo, usando hidruro de litio y aluminio o hidruro de litio y aluminio/tricloruro de aluminio.
Los compuestos de fórmula II se pueden preparar, por ejemplo, haciendo reaccionar primero compuestos de fórmula IV
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en una reacción de Bucherer, por ejemplo con carbonato amónico y cianuro potásico, para dar compuestos de fórmula V
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que después se hacen reaccionar con un reactivo de alquilación de fórmula LG-CHA-G, que introduce el resto de fórmula -CHA-G en la molécula, para dar compuestos de fórmula VI,
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donde A, R^{3}, R^{4} y G se definen como se ha indicado antes. La reacción de los compuestos de fórmula VI con un segundo reactivo de alquilación de fórmula VII,
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en la que Z, R^{1} y R^{5} son como se han definido antes, conduce después a los correspondientes compuestos de fórmula II. El grupo LG es un grupo lábil nucleófilamente sustituible, por ejemplo halógeno, en particular cloro o bromo, o sulfoniloxi tal como tosiloxi, metilsulfoniloxi o triflurometilsulfoniloxi.
Los compuestos de fórmula II también se pueden preparar, por ejemplo haciendo reaccionar un compuesto de fórmula VI primero con un reactivo de fórmula 4-(PG-NH)-C_{6}H_{3}(OR^{5})-CH_{2}-LG, en la que LG es un grupo lábil nucleófilamente sustituible como se ha explicado antes, para dar un compuesto de fórmula VIII,
20
donde los significados indicados antes se aplican para A, G, R^{3}, R^{4} y R^{5}, y PG es un grupo protector de amino, por ejemplo terc-butoxicarbonilo o benciloxicarbonilo, Después de eliminar el grupo protector PG, los compuestos de fórmula II se obtienen por reacción del grupo amino NH_{2} resultante con isocianato de fenilo, isotiocianato de fenilo, isocianato de 2-metilfenilo o isotiocianato de 2-metilfenilo. Tal como los compuestos de fórmula VIII, se pueden preparar y usar compuestos en la síntesis, en los que en la fórmula VIII el grupo PG-NH- se sustituye por un grupo que es un precursor de un grupo amino, y que después se convierte en un grupo amino en una etapa de reacción adicional. Por ejemplo, un compuesto de fórmula VI se puede hacer reaccionar primero con un grupo nitro de la fórmula 4-O_{2}N-C_{6}H_{3}(OR^{5})-CH_{2}-LG para dar un compuesto correspondiente al compuesto de fórmula VIII, después el grupo nitro se puede convertir en el grupo amino, por ejemplo, por hidrogenación catalítica, y después el grupo amino se puede convertir en el compuesto deseado de fórmula II usando isocianato de fenilo, isotiocianato de fenilo, isocianato de 2-metilfenilo o isotiocianato de 2-metilfenilo.
En general, las etapas individuales para preparar los compuestos de fórmula I, se pueden llevar a cabo de acuerdo con o de forma análoga a métodos conocidos familiares para los expertos en la técnica. Dependiendo del caso concreto, puede ser adecuado en cualquier etapa de la síntesis, como ya se ha explicado, bloquear temporalmente grupos funcionales que pueden conducir a reacciones secundarias o reacciones indeseadas, mediante una estrategia de grupo protector adecuada al problema de síntesis específico, cuyo procedimiento es conocido por el experto en la técnica.
Los compuestos de fórmula I también se pueden obtener como sigue. Mediante reacción de aminoácidos N-sustituidos o preferiblemente sus ésteres, por ejemplo ésteres de metilo, ésteres de etilo, ésteres de terc-butilo o ésteres de bencilo, cuyos compuestos se pueden obtener de acuerdo con procedimientos patrón, por ejemplo de compuestos de fórmula IX,
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en la que Z, R^{1}, R^{3}, R^{4} y R^{5} se definen como se ha indicado antes, con un isocianato de fórmula X,
22
para la que se aplican las definiciones anteriores de A, E y R^{2}, y que se puede obtener de acuerdo con procedimientos patrón a partir del correspondiente compuesto que en lugar del grupo isocianato contiene un grupo NH_{2}, se obtienen derivados de urea, por ejemplo compuestos de fórmula XI,
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para la que se aplican las definiciones antes indicadas. Después, los compuestos de fórmula XI se pueden ciclar calentado con ácido para dar los compuestos de fórmula I. La ciclación de los compuestos de fórmula XI en los compuestos de fórmula I, también se puede llevar a cabo por tratamiento con bases en disolventes inertes, por ejemplo, por tratamiento con hidruro sódico en un disolvente aprótico, tal como dimetilformamida. Durante las reacciones, como se ha explicado antes, puede haber presentes grupos funcionales en forma protegida.
Los compuestos de fórmula I también se pueden obtener haciendo reaccionar un compuesto de fórmula IX con un isocianato de fórmula XII
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en la que A tiene los significados antes indicados y Q, por ejemplo, es un grupo alcoxi, por ejemplo un grupo alcoxi (C_{1}-C_{4}) tal como metoxi, etoxi, o terc-butoxi, o un grupo aril(C_{6}-C_{14})-alcoxi(C_{1}-C_{4}), por ejemplo benciloxi. En esta reacción, se obtiene un compuesto de fórmula XIII,
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en la que A, Q, Z, R^{1}, R^{3}, R^{4} y R^{5} se definen como se ha indicado antes, que después se cicla en presencia de un ácido o base, como se ha descrito antes para la ciclación de los compuestos de fórmula XI, en un compuesto de fórmula XIV,
26
en la que A, Q, Z, R^{1}, R^{3}, R^{4} y R^{5} se definen como se ha indicado antes. Después, en el compuesto de fórmula XIV se puede convertir el grupo CO-Q en el grupo ácido carboxílico COOH, por ejemplo, por hidrólisis. Si la ciclación del compuesto de fórmula XIII en el compuesto de fórmula XIV se lleva a cabo usando un ácido, la conversión del grupo CO-Q en el grupo COOH también se puede llevar a cabo simultáneamente con la ciclación. Por posterior acoplamiento con un compuesto de fórmula III, como se ha descrito antes para el acoplamiento de los compuestos de fórmulas II y III, se obtiene después un compuesto de fórmula I. En este procedimiento de síntesis también puede haber presentes grupos funcionales en forma protegida o en forma de precursores.
Un método adicional para preparar compuestos de fórmula I es, por ejemplo, hacer reaccionar compuestos de fórmula XV,
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para la que se aplican las definiciones antes indicadas, con fosgeno o equivalentes (análogamente a S. Goldschmidt and M. Wick, Liebigs Ann. Chem. 575 (1952), 217, y C. Tropp, Chem. Ber. 61 (1928), 1431).
Los compuestos de fórmula I también se pueden preparar acoplando primero un compuesto de fórmula XVI,
28
en la que R^{3} y R^{4} tienen los significados antes indicados, y PG es un grupo protector de amino, tal como por ejemplo, un grupo benciloxicarbonilo, con un compuesto de fórmula XVII,
29
en la que A tiene el significado antes indicado, y Q' es un grupo hidroxilo de ácido carboxílico protegido, por ejemplo, un grupo alcoxi tal como terc-butoxi, para dar un compuesto de fórmula XVIII
30
en la que A, R^{3}, R^{4}, PG y Q' tienen los significados antes indicados. En el compuesto de fórmula XVIII, el grupo protector PG, después se puede eliminar selectivamente del grupo amino, por ejemplo, por hidrogenación en el caso de un grupo benciloxicarbonilo, y por introducción de un grupo CO se puede llevar a cabo el cierre de anillo para dar un compuesto de fórmula XIX,
31
en la que A, R^{3}, R^{4} y Q' tienen los significados antes indicados. Para introducir el grupo carbonilo, se puede usar, por ejemplo, fosgeno o un equivalente del fosgeno tal como difosgeno (análogamente a la reacción de los compuestos de fórmula XV antes explicada). Como producto intermedio en la conversión del compuesto de fórmula XVIII en el compuesto de fórmula XIX, se puede producir o preparar específicamente, por ejemplo, un isocianato. La conversión del compuesto de fórmula XVIII en el de fórmula XIX se puede llevar a cabo en una o más etapas. Por ejemplo, se puede introducir primero el grupo carbonilo, y después en una etapa separada, se puede llevar a cabo la ciclación en presencia de una base tal como hidruro sódico como se ha descrito para las ciclaciones antes mencionadas. Los compuestos de fórmula XVIII en la que PG es el grupo benciloxicarbonilo, también se pueden convertir directamente en compuestos de fórmula XIX, sin usar una unidad estructural sintética tal como fosgeno para introducir el grupo carbonilo. Si los compuestos de fórmula XVIII en la que PG es benciloxicarbonilo, se tratan con una base tal como hidruro sódico, se pueden obtener directamente los compuestos de fórmula XIX.
Después, los compuestos de fórmula XIX se pueden alquilar, como se ha explicado antes para los compuestos de fórmula VI, en el grupo NH usando un reactivo de fórmula VII, y después de convertir el grupo ácido carboxílico protegido CO-Q' en el grupo ácido carboxílico COOH, se pueden sintetizar los compuestos deseados de fórmula I como se ha descrito antes para los compuestos de fórmulas VI y II. En este procedimiento de síntesis también puede haber presentes grupos funcionales en forma protegida o en forma de precursores.
Además, los compuestos de fórmula I se pueden preparar haciendo reaccionar primero un compuesto de fórmula XX
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en la que R^{3}, R^{4} y Q' tienen los significados antes indicados, con un isocianato de fórmula XII para dar un compuesto de fórmula XXI,
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en la que A, R^{3}, R^{4}, Q y Q' tienen los significados antes indicados. Después, el compuesto de fórmula XXI se cicla por tratamiento con un ácido fuerte, por ejemplo ácido clorhídrico semiconcentrado, para dar un compuesto de fórmula XXII.
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Los compuestos de fórmula XXII también se pueden preparar, preparando primero un compuesto de fórmula XVIII en la que A, R^{3}, R^{4} y Q' tienen los significados indicados y PG es un grupo alcoxicarbonilo tal como alcoxi(C_{1}-C_{4})-carbonilo, un grupo aril(C_{6}-C_{14})-alcoxi(C_{1}-C_{4})-carbonilo tal como fenil-alcoxi(C_{1}-C_{4})-carbonilo, o un grupo ariloxi(C_{6}-C_{14})carbonilo tal como feniloxicarbonilo, convirtiendo dicho compuesto, por liberación del grupo ácido carboxílico protegido CO-Q', en un compuesto de fórmula XVIII en el que CO-Q' es el grupo ácido carboxílico libre CO-OH, PG es alcoxi(C_{1}-C_{4})-carbonilo, aril(C_{6}-C_{14})-alcoxi(C_{1}-C_{4})-carbonilo o ariloxi(C_{6}-C_{14})-carbonilo, y A, R^{3} y R^{4} tienen los significados indicados, y ciclando dicho compuesto con una base, tal como por ejemplo, carbonato sódico en el compuesto de fórmula XXII.
Los compuestos de fórmula IIa
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en la que A, Z, R^{1}, R^{3}, R^{4} y R^{5} tienen los significados antes indicados, se pueden obtener después haciendo reaccionar los compuestos de fórmula XXII en presencia de un exceso de base, por ejemplo en presencia de un exceso de n-butil-litio, con un reactivo de alquilación de fórmula VII, y después acidificando. El grupo 4-(3-arilureido)bencilo o 4-(3-ariltioureido)bencilo también se puede introducir por pasos, de forma análoga a la preparación de los compuestos de fórmula VIII y los compuestos de fórmula II obtenidos a partir de éstos, en los compuestos de fórmula XXII.
Los compuestos de fórmula I en los que los restos R^{3} y R^{4} son triflurometilo se pueden preparar ventajosamente haciendo reaccionar un isonitrilo de fórmula XXIII con 2-terc-butoxi-4,4-bis(trifluorometil)-1,3-oxazabuta-1,3-dieno de fórmula XXIV para dar un compuesto de fórmula XXV,
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donde A y Q tienen los significados antes indicados. Es decir, el grupo C(=O)-Q, por ejemplo, es un grupo éster y Q, por ejemplo, es alcoxi tal como alcoxi (C_{1}-C_{4}) incluyendo metoxi, etoxi y terc-butoxi o aril(C_{6}-C_{14})-alcoxi(C_{1}-C_{4}) incluyendo benciloxi. La reacción de los compuestos de fórmulas XXIII y XXIV para dar los compuestos de fórmula XXV se lleva a cabo ventajosamente en un hidrocarburo o éter como disolvente, por ejemplo en benceno o tolueno, calentando, por ejemplo a temperaturas de aproximadamente 40ºC a aproximadamente 80ºC, por ejemplo a aproximadamente 60ºC.
Los isonitrilos (isocianuros) de fórmula XXIII se pueden obtener de acuerdo con los métodos patrón conocidos por los expertos en la técnica a partir de los correspondientes ésteres de ácido amino-carboxílico de fórmula H_{2}N-CHA-C(=O)-Q, en la que A y Q tienen los significados antes indicados. Ventajosamente, el éster del ácido amino-carboxílico de fórmula H_{2}N-CHA-C(=O)-Q se convierte primero, por reacción con un éster de ácido fórmico reactivo, por ejemplo formiato de cianometilo, en el éster del ácido N-formilamino de fórmula HC(=O)-NH-CHA-C(=O)-Q, que después se convierte en el isocianuro de fórmula XXIII, por ejemplo, por reacción con fosgeno o un equivalente de fosgeno tal como difosgeno o trifosgeno en presencia de una amina terciaria tal como trietilamina. El 2-terc-butoxi-4,4-bis(trifluorometil)-1,3-oxazabuta-1,3-dieno de fórmula XXIV se puede obtener, de acuerdo con el procedimiento descrito por Steglich et al., Chemische Berichte 107 (1974), 1488, a partir de carbamato de terc-butilo ((CH_{3})_{3}C-O-CO-NH_{2}) y hexafluoroacetona anhidra y posterior tratamiento del 2-terc-butoxicarbonilamino-2-hidroxi-1,1,1,3,3,3-hexafluoropropano inicialmente obtenido con anhídrido trifluoroacético en presencia de una base tal como quinolina.
Después, los compuestos de fórmula XXV se pueden alquilar, por ejemplo con compuestos de fórmula VII, en el grupo NH para dar compuestos de fórmula XIV, que, si se desea, después de convertir el grupo éster CO-Q en el grupo ácido carboxílico CO-OH, por reacción con compuestos de fórmula III, dan compuestos de fórmula I como se ha descrito antes. En los compuestos de fórmula XXV, también se puede primero convertir el grupo éster CO-Q de acuerdo con procedimientos patrón en el grupo ácido carboxílico CO-OH y convertir el compuesto de fórmula XXII obtenido como se ha descrito antes con un reactivo de alquilación de fórmula VII en presencia de exceso de base en un compuesto de fórmula IIa, que después da un compuesto de fórmula I por reacción con un compuesto de fórmula III. Análogamente a la preparación de compuestos de fórmula VIII antes descrita y de compuestos de fórmula II o IIa obtenidos a partir de éstos, el grupo 4-(3-arilureido)bencilo o grupo 4-(3-ariltioureido)bencilo también se puede introducir por etapas en los compuestos de fórmula XXV. En estas reacciones, también puede haber grupos funcionales presentes en forma protegida o en forma de precursores.
Los compuestos de fórmula I en los que E, por ejemplo, es hidroxicarbonilo o hidroximetilo, se pueden convertir, de acuerdo con procedimientos patrón, en compuestos de fórmula I en la que E tiene otros significados, o en otros profármacos o derivados de los compuestos de fórmula I. Por lo tanto, para preparar los ésteres, los compuestos de fórmula I en la que E es hidroxicarbonilo, se pueden esterificar usando los alcoholes adecuados, por ejemplo, en presencia de un reactivo de condensación tal como DCC, o los compuestos de fórmula I en la que E es hidroxicarbonilo, se pueden alquilar con haluros de alquilo tales como cloruro de alquilo o bromuros de alquilo, por ejemplo con haluros de aciloxialquilo, para dar compuestos de fórmula I en la que E es aciloxialcoxi-CO-. Los compuestos de fórmula I en la que E es hidroxicarbonilo, se pueden convertir en amidas usando amoniaco o aminas orgánicas en presencia de un reactivo de condensación. Los compuestos de fórmula I en la que E es CO-NH_{2} también se pueden obtener ventajosamente en fase sólida acoplando el compuesto en el que E es COOH en presencia de un agente de condensación tal como TOTU en resina de amida Rink, y después eliminándolo de la resina otra vez usando ácido trifluoroacético. Los compuestos de fórmula I en la que E es el grupo hidroximetilo CH_{2}OH, se pueden eterificar en el grupo hidroxilo de acuerdo con procedimientos patrón. De acuerdo con procedimientos patrón para oxidar selectivamente alcoholes a aldehídos, por ejemplo usando hipoclorito sódico en presencia de 4-acetamido-2,2,6,6,-tetrametilpiperidin-1-oxilo (4-acetamido-TEMPO), los compuestos de fórmula I en la que E es CH_{2}OH se pueden convertir en compuestos de fórmula I en la que E es el grupo aldehído -CO-H.
Los compuestos de fórmula I en la que R^{5} es hidrógeno también se pueden preparar llevando a cabo una eliminación de éter en compuestos de fórmula I en la que R^{5} es metilo. Por ejemplo, un grupo metoxi que representa R^{5}O se puede convertir en un grupo hidroxilo por tratamiento con tribromuro de boro.
Los compuestos de fórmula I son compuestos farmacéuticos activos valiosos que son adecuados, por ejemplo, para tratar enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas o asma. Los compuestos de fórmula I y sus sales y derivados fisiológicamente tolerables se pueden administrar de acuerdo con la invención, a animales, preferiblemente a mamíferos, y en particular a seres humanos, como productos farmacéuticos para tratar estados de enfermedad, entendiéndose en general el tratamiento como medio tanto de terapia de síntomas de enfermedad aguda o crónica así como de profilaxis o prevención de síntomas de enfermedad, es decir, por ejemplo, la prevención de la aparición de síntomas de enfermedad alérgica o asmática aguda o la prevención de infarto de miocardio o de reinfarto de miocardio en pacientes apropiados. Los compuestos de fórmula I y sus sales y derivados se pueden administrar solos, mezclados entre sí, o en forma de preparaciones farmacéuticas que permiten la administración entérica o parenteral, y que como constituyente activo contienen una dosis eficaz de al menos un compuesto de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables y un vehículo farmacéuticamente tolerable.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables para usar como productos farmacéuticos (o medicamentos), al uso de compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables para preparar productos farmacéuticos para tratar las enfermedades mencionadas antes o a continuación, por ejemplo, para tratar enfermedades inflamatorias, y al uso de los compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables para tratar estas enfermedades. Además, la presente invención se refiere a preparaciones farmacéuticas (o composiciones farmacéuticas) que contienen una dosis eficaz de al menos un compuesto de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables y un vehículo farmacéuticamente tolerable, que son uno o más vehículos y/o aditivos farmacéuticamente inocuos.
Los productos farmacéuticos se pueden administrar sistémica o localmente. Se pueden administrar, por ejemplo, vía oral en forma de píldoras, pastillas, comprimidos revestidos con película, comprimidos revestidos con azúcar, gránulos, cápsulas de gelatina dura y blanda, polvos, soluciones, jarabes, emulsiones, suspensiones o en otras formas farmacéuticas. Sin embargo, la administración también se puede llevar a cabo vía vaginal o rectal, por ejemplo, en forma de supositorios, o vía parenteral o como implantes, por ejemplo en forma de soluciones para inyección o soluciones para infusión, microcápsulas o varillas, o vía tópica o percutánea, por ejemplo en forma de cremas, pomadas, polvos, soluciones, emulsiones o tinturas, o de otra forma, por ejemplo en forma de pulverizadores nasales o mezclas de aerosol. La administración parenteral de soluciones se puede realizar, por ejemplo, vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intra-articular, intrasinovial o de otra forma.
Las preparaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se preparan de una forma conocida, mezclando el compuesto o compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables con vehículos y/o aditivos inorgánicos y/u orgánicos farmacéuticamente inertes, y poniéndolos en una forma de dosificación y forma de administración adecuadas. Para preparar píldoras, comprimidos, comprimidos revestidos con azúcar y cápsulas de gelatina dura, se puede usar, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz o sus derivados, talco, ácido esteárico o sus sales, polietilenglicoles etc., para cápsulas de gelatina blanda y supositorios, por ejemplo, grasas, ceras y polioles semisólidos y líquidos, polietilenglicoles, aceites naturales y endurecidos etc. Vehículos adecuados para preparar soluciones, por ejemplo soluciones para inyección, o emulsiones o jarabes son, por ejemplo, agua, alcoholes, glicerina, dioles, polioles, sacarosa, azúcar invertido, glucosa, aceites vegetales etc. Vehículos adecuados para microcápsulas, implantes o varillas son, por ejemplo, copolímeros de ácido glicólico y ácido láctico. Las preparaciones farmacéuticas normalmente contienen de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 90% en peso de los compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables. La cantidad de compuesto activo de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables en las preparaciones farmacéuticas normalmente es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1000 mg, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza de la preparación farmacéutica, la cantidad de compuesto activo también puede ser mayor.
Además de los compuestos activos y vehículos, las preparaciones farmacéuticas también pueden contener excipientes o aditivos, por ejemplo, cargas, desintegrantes, aglutinantes, lubricantes, agentes humectantes, estabilizantes, emulsionantes, conservantes, edulcorantes, colorantes, agentes de sabor, aromas, agentes espesantes, diluyentes, sustancias tampón, disolventes, solubilizantes, agentes para lograr un efecto de depósito, sales para cambiar la presión osmótica, agentes de revestimiento o antioxidantes. También pueden contener dos o más compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables. Además de al menos un compuesto de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables, también pueden contener uno o más compuestos farmacéuticamente activos diferentes, por ejemplo sustancias que tienen acción antiinflamatoria.
Si los compuestos de fórmula I o las preparaciones farmacéuticas que los comprenden se administran en forma de aerosoles, por ejemplo como aerosoles nasales o por inhalación, esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando un pulverizador, un nebulizador, un nebulizador con bomba, un aparato de inhalación, un inhalador con medidor o un inhalador de polvo seco. Las formas farmacéuticas para administrar los compuestos de fórmula I como un aerosol se pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos por el experto en la técnica. Para prepararlos se pueden usar, por ejemplo, soluciones o dispersiones de los compuestos de fórmula I en agua, mezclas de agua/alcohol o soluciones salinas adecuadas, usando aditivos habituales, por ejemplo, alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, potenciadores de la absorción para aumentar la biodisponibilidad, solubilizantes, dispersantes y otros, y si es adecuado, propelentes habituales, por ejemplo clorofluorocarbonos y/o fluorocarbonos.
Otros compuestos farmacéuticos activos que pueden contener las preparaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención además de los compuestos de fórmula I, pero con los que los compuestos de fórmula I también se pueden combinar de otras formas en el contexto de un tratamiento de combinación, son en particular los compuestos activos que son adecuados para el tratamiento, es decir, la terapia o profilaxis de las enfermedades mencionadas antes o a continuación, para cuyo tratamiento los compuestos de fórmula I son adecuados. Ejemplos de clases de compuestos activos de este tipo que se pueden mencionar son esteroides, sustancias antiinflamatorias no esteroideas, derivados de ácido acético antiinflamatorios no esteroideos, derivados de ácido propiónico antiinflamatorios no esteroideos, antiasmáticos no esteroideos, derivados de ácido salicílico, pirazolonas, oxicams, antagonistas de leucotrienos, inhibidores de biosíntesis de leucotrienos, inhibidores de ciclooxigenasa, inhibidores de ciclooxigenasa-2 (inhibidores de COX-2), antihistaminas, antagonistas de histamina-H1, antihistaminas no sedantes, compuestos de oro, agonistas \beta-2, anticolinérgicos, antagonistas de muscarina, agentes que disminuyen los lípidos, agentes de disminuyen el colesterol, inhibidores de reductasa HMG-CoA, estatinas, derivados de ácido nicotínico, inmunodepresores, ciclosporinas, \beta-interferones, productos terapéuticos para tumores, citostáticos, inhibidores de metástasis, antimetabolitos, derivados de ácido 5-aminosalicílico, antidiabéticos, insulinas, sulfonilureas, biguanidas, glitazones, inhibidores de \alpha-glucosidasa, y otros. Ejemplos de compuestos activos adecuados que se pueden mencionar son ácido acetilsalicílico, benorilato, sulfasalazina, fenilbutazona, oxifenbutazona, metamizol, mofebutazona, feprazona, celecoxib, rofecoxib, diclofenaco, fentiazac, sulindac, zomepirac, tolmetina, indometacina, acemetacina, ibuprofeno, naproxeno, carprofeno, fenbufeno, indoprofeno, ketoprofeno, pirofreno, ácido tiaprofénico, diflunisal, ácido flufenámico, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, ácido niflúmico, ácido tolfenámico, piroxicam, isoxicam, tenoxicam, ácido nicotínico, prednisona, dexametosa, hidrocortisona, metilprednisolona, betametasona, beclometasona, budesonida, montelukast, pranlukast, zafirlukast, zileuton, ciclosporina, ciclosporina A, rapamicina, tacrolimus, metotrexato, 6-mercaptopurina, azatioprina, interferón-beta-1a, interferón-beta-1b, ácido 5-aminosalicílico, leflunomida, D-penicilamina, cloroquina, glibenclamida, glimepirida, troglitazona, metformina, acarbosa, atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, simvastatina, pravastatina, colestipol, colestiramina, probucol, clofibrato, fenofibrato, bezafibrato, gemfibrozilo, bromuro de ipatropio, clenbuterol, fenoterol, metaproterenol, pirbuterol, tulobuterol, salbutamol, salmeterol, terbutalina, isoetarina, ketotiofeno, efedrina, bromuro de oxitropio, atropina, ácido cromoglícico, teofilina, fexofenadina, terfenadina, cetirizina, dimetindeno, difenhidramina, difenilpiralina, feniramina, bromfeniramina, clorfeniramina, dexclorfeniramina, alimezaina, antazolina, astemizol, azatadina, clemastina, ciproheptadina, hidroxizina, loratidina, mepiramina, prometazina, tripelenamina, triprolidina y otros.
Si se van a usar compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables en un tratamiento de combinación junto con uno o más compuestos activos distintos en una sola preparación farmacéutica, esto se puede llevar a cabo como se ha mencionado administrando todos los compuestos activos juntos en una sola preparación farmacéutica, por ejemplo un comprimido o cápsula. La presente invención se refiere igualmente explícitamente a preparaciones farmacéuticas de este tipo, para las cuales se aplican todas las correspondientes explicaciones anteriores. La cantidad de los compuestos activos en estas preparaciones farmacéuticas, en general se elige de forma que haya presente una cantidad eficaz de cada compuesto activo. Sin embargo, un tratamiento de combinación también se puede llevar a cabo estando presentes los compuestos activos en una o más preparaciones farmacéuticas separadas, que pueden estar presentes en un solo paquete o dos o más paquetes separados. La administración de los compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables y otros compuestos activos se puede llevar a cabo junto con o de forma separada y simultánea o sucesiva, en cualquier orden. La administración también se puede llevar a cabo de diferentes formas, por ejemplo, un compuesto activo se puede administrar vía oral y otro vía inyección, inhalación o aplicación tópica. Todos dichos tratamientos están comprendidos en la presente invención.
Los compuestos de fórmula I, por ejemplo, tienen capacidad de inhibir los procesos de interacción célula-célula y procesos de interacción célula-matriz, en los que juegan un papel las interacciones entre VLA-4 y sus ligandos. La actividad de los compuestos de fórmula I se puede demostrar, por ejemplo, en un ensayo en el que se mide la unión de células que contienen el receptor VLA-4, por ejemplo de leucocitos, a ligandos de este receptor, por ejemplo, a VCAM-1, que para este propósito también se puede preparar ventajosamente por ingeniería genética. A continuación se describen detalles de dicho ensayo. En particular, los compuestos de fórmula I, tienen capacidad de inhibir la adhesión y migración de leucocitos, por ejemplo, la adhesión de leucocitos a células endoteliales, que, como se ha explicando antes, es controlada por el mecanismo de adhesión VCAM-1/VLA-4. Por lo tanto, a parte de como antiinflamatorios, los compuestos de fórmula I y sus sales y derivados fisiológicamente tolerables, en general son adecuados para el tratamiento, es decir para la terapia y profilaxis, de enfermedades que se basan en la interacción entre el receptor VLA-4 y sus ligandos, o pueden estar influidas por una inhibición de esta interacción, y en particular son adecuados para tratar enfermedades causadas al menos parcialmente por un grado no deseado de adhesión de leucocitos y/o migración de leucocitos, o están conectadas con esto, y para cuya prevención, alivio o cura se debe disminuir la adhesión y/o migración de leucocitos.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables, para inhibir la adhesión y/o migración de leucocitos, o para inhibir el receptor VLA-4, y al uso de los compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables, para preparar productos farmacéuticos, es decir, productos farmacéuticos para tratar enfermedades en las que la adhesión de leucocitos y/o migración de leucocitos muestra un grado no deseado, o para tratar enfermedades en las que juegan un papel los procesos de adhesión dependiente de VLA-4, y al uso de los compuestos de fórmula I y/o sus sales y/o derivados fisiológicamente tolerables para tratar enfermedades de este tipo.
Los compuestos de fórmula I se pueden usar como antiinflamatorios en el caso de síntomas inflamatorios de causas muy diferentes, con el fin de prevenir, reducir o suprimir las secuelas no deseadas o dañinas de la inflamación. Se usan, por ejemplo, para el tratamiento, es decir, para terapia o profilaxis, de artritis, de artritis reumatoide, de poliartritis, o de enfermedades inflamatorias de intestino (colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn), de lupus eritematoso sistémico, de enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central tal como, por ejemplo, esclerosis múltiple, o de asma o alergias tales como, por ejemplo, alergias de tipo retardado (alergia de tipo IV). Además, son adecuados para cardioprotección, para protección de ataques de apoplejía y para la profilaxis secundaria de ataques de apoplejía, y para el tratamiento, es decir terapia y profilaxis, de enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, infarto de miocardio, reinfarto de miocardio, o síndrome coronario agudo, ataque de apoplejía, restenosis, diabetes, daño en trasplantes de órganos, enfermedades inmunitarias, enfermedades autoinmunes, crecimiento de tumores o metástasis de tumores en diferentes tumores malignos, malaria, y de otras enfermedades en las que un bloqueo de la integrina VLA-4 y/o una influencia de la actividad del leucocito parece adecuada para prevenir, aliviar o curar. Un uso preferido es la prevención de infarto de miocardio o de reinfarto de miocardio.
La dosis cuando se usan los compuestos de fórmula I puede variar dentro de límites anchos, y como es habitual y como sabe el médico, se debe ajustar en cada caso individual a las condiciones individuales. Depende, por ejemplo, de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se va a tratar, del estado del paciente, del compuesto usado o de si se va a tratar un estado de enfermedad agudo o crónico, o se lleva a cabo profilaxis, o de si además de los compuestos de fórmula I, se administran compuestos activos adicionales. En general, en el caso de administración oral, es adecuada una dosis diaria de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg (en cada caso mg por kg de peso corporal), en el caso de administración a un adulto que pesa aproximadamente 75 kg para lograr resultados eficaces. En el caso de administración intravenosa, la dosis diaria en general es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg (en cada caso mg por kg de peso corporal). La dosis diaria se puede dividir, en particular en el caso de administración de cantidades relativamente grandes, en una serie, por ejemplo 2, 3 ó 4 administraciones parciales. Si es adecuado, dependiendo del comportamiento individual, puede ser necesario salirse hacia arriba o hacia abajo de la dosis diaria indicada.
A parte de como compuestos farmacéuticos activos en medicina humana y veterinaria, los compuestos de fórmula I y sus sales y derivados que son adecuados para el uso deseado se pueden usar además para propósitos de diagnóstico, por ejemplo en diagnósticos in vitro de muestras celulares o muestras de tejidos, y como herramienta auxiliar o científica en investigaciones bioquímicas en las que se desea un bloqueo de VLA-4 o una influencia en las interacciones célula-célula o célula-matriz. Además, los compuestos de fórmula I y sus sales se pueden usar como productos intermedios para preparar otros compuestos, en particular otros compuestos farmacéuticos activos, que se pueden obtener a partir de compuestos de fórmula I, por ejemplo, por modificación o introducción de restos o grupos funcionales, por ejemplo por esterificación, reducción, oxidación u otras transformaciones de grupos funcionales.
Ejemplos Ejemplo 1 Ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopro- pilmetil)acetilamino)-3-metilpropiónico
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1a) Alcohol 4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencílico
Se hidrogenaron 15 g (81,8 mmoles) de alcohol 3-metoxi-4-nitrobencílico sobre 1,3 g de paladio/carbón (al 10% de concentración, agua al 50%) en 500 ml de metil-terc-butil-éter enfriando con hielo. Después de completarse la absorción de hidrógeno, el catalizador se filtró, y se añadieron al filtrado 10,14 ml (81,8 mmoles) de isocianato de 2-metilfenilo agitando en el transcurso de 30 minutos. La mezcla de reacción se dejó reposar toda la noche, y el sólido precipitado se filtró con succión y se lavó con metil-terc-butil-éter. Rendimiento: 20,5 g (88%).
1b) Cloruro de 4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencilo
Se añadieron gota a gota 7,65 ml (104,8 mmoles) de cloruro de tionilo enfriando con hielo, a una suspensión de 15 g (52,4 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1a en 300 ml de diclorometano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, se dejó reposar toda la noche y se vertió en 1000 ml de heptano. El heptano se decantó del aceite separado, el residuo se suspendió otra vez en heptano y el heptano se decantó. Este procedimiento se repitió dos veces más. Después el residuo se disolvió en diclorometano y se vertió en 800 ml de diisopropil-éter enfriado con hielo. La mezcla se agitó durante 2 horas enfriando con hielo, y el producto se filtró con succión, se lavó con diisopropil-éter y se secó sobre pentóxido de fósforo. Rendimiento: 12 g (75%).
1c) (S)-2-Amino-3-ciclopropionato de bencilo
Se añadió una solución de hidróxido sódico 1N a 0ºC a una suspensión de 10 g (77,5 mmoles) de ácido (S)-2-amino-3-ciclopropilpropiónico en 160 ml de dioxano hasta que se alcanzó pH 8-9. Después se añadieron 16,9 g (77,5 mmoles) de dicarbonato de diterc-butilo, se quitó el baño de hielo y el pH se mantuvo a 8-9 por adición posterior de solución de hidróxido sódico 1N. Después de dejar reposar toda la noche, se separó el dioxano a vacío, se añadió acetato de etilo a la fase de agua, y se separaron las fases. La fase de agua se ajustó a pH 4,5 usando ácido clorhídrico 1 N y se extrajo con acetato de etilo. La fase de acetato de etilo obtenida se secó sobre sulfato sódico, el sulfato sódico se filtró y el filtrado se concentró a vacío. El residuo se disolvió en 1000 ml de diclorometano y se trató con 53,4 ml de alcohol bencílico, 8,37 g de 4-dimetilaminopiridina y 18,8 g de DCC. Después de agitar durante 6 horas y dejar reposar toda la noche, la mezcla se filtró, el filtrado se concentró y el residuo se trató con 300 ml de ácido trifluoroacético al 90% de concentración. Después de agitar a temperatura ambiente durante 10 minutos, el ácido trifluoroacético se separó a vacío y el residuo se cromatografió dos veces sobre gel de sílice (diclorometano/metanol, 95/5). Rendimiento: 11,48 g (68%).
1d) Ácido (S)-2-(4,4-dimetil-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acético
Se añadieron 321 mg de HOBT y 4,75 g (23,7 mmoles) de DCC a una solución de 3,82 g (23,7 mmoles) de ácido 2-metoxicarbonilamino-2-metilpropiónico (preparado a partir de ácido 2-amino-2-metilpropiónico y cloroformiato de metilo) y 5,2 g (23,7 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1c en 100 ml de THF, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Después de dejar reposar toda la noche y filtrar, el THF se separó a vacío, el residuo se recogió en metil-terc-butil-éter y la solución se lavó dos veces en cada caso con solución saturada de NaHCO_{3} y solución acuosa de KHSO_{4}/K_{2}SO_{4}. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, y después de filtrar, el disolvente se separó a vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se hidrogenó en presencia de paladio/carbón (al 10% de concentración; 50% en agua). El catalizador se filtró, y se añadieron 500 ml de agua y 10,1 g de carbonato sódico a la fase orgánica. Después de extraer por agitación y separación de fase, la fase acuosa se agitó a 100ºC durante 24 horas. Después de dejar reposar toda la noche, se añadieron 500 ml de ácido clorhídrico 6 N, y la fase acuosa se extrajo tres veces con metil-terc-butil-éter. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico, y después de filtrar se concentraron a vacío. El residuo se cristalizó usando diisopropil-éter y el producto se filtró. Rendimiento: 2,88 g (51%).
1e) Ácido (S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclo- propilmetil)acético
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Se añadieron 9,44 ml de una solución de n-butil-litio (2,5 M en hexano) a -40ºC en atmósfera de argón, a una solución de 2,85 g (11,8 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1d en 60 ml de THF absoluto. Después de agitar a -40ºC durante 30 minutos, la mezcla de reacción se dejó calentar a 0ºC, y se añadió una solución de 3,6 g (11,8 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1b en 20 ml de N-metil-2-pirrolidona. La mezcla de reacción se dejó calentar a 0ºC y después se agitó durante 2 horas a 0ºC. Se añadieron 15 ml de ácido clorhídrico 1N y el THF se separó a vacío. El residuo se vertió en 300 ml de metil-terc-butil-éter. Se separaron las fases, y la fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre sulfato sódico, y después de filtrar se concentró a vacío. El residuo se purificó por HPLC preparativo. Después de concentrar las fracciones con producto y liofilizar, se obtuvieron 1,33 g (22%) del compuesto del título.
1f) (R)-3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclo- propilmetil)acetilamino)-3-metilpropionato de terc-butilo
Se añadieron sucesivamente 626 mg (1,91 mmoles) de TOTU y 308 \mul (1,81 mmoles) de N,N-diisopropiletilamina enfriando con hielo, a una solución de 974 mg (1,91 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1e, y 305 mg (1,91 mmoles) de (R)-3-amino-butanoato de terc-butilo en 10 ml de DMF absoluta. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, el disolvente se separó a vacío, el residuo se disolvió en acetato de etilo y la solución de acetato de etilo se lavó sucesivamente dos veces en cada caso con una solución acuosa de KHSO_{4}/K_{2}SO_{4}, una solución saturada de NaHCO_{3} y agua. Después de secar la fase orgánica sobre sulfato sódico y filtrar, el disolvente se separó a vacío y el residuo se cromatografió en gel de sílice usando acetato de etilo/heptano (1/1). Después de concentrar las fracciones con producto, se obtuvieron 880 mg (71%) del compuesto del título.
1g) Ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2- (ciclopropilmetil)acetilamino)-3-metilpropiónico
Se trataron 880 mg (1,35 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1f con 10 ml de ácido trifluoroacético al 90% de concentración. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró a vacío. El residuo se recogió en diclorometano y se concentró a vacío. Este procedimiento se repitió una segunda vez. El residuo obtenido se recogió en diclorometano, y la fase de diclorometano se lavó tres veces con agua y se secó sobre sulfato sódico. Después de filtrar y concentrar a vacío, el residuo se recogió en acetonitrilo/agua y se liofilizó. Rendimiento: 730 mg (91%).
ES(+)-MS: 594,2 (M+H)^{+}
Ejemplo 2 Sal sódica del ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)-ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acetilamino)-3-metilpropiónico
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Se añadieron 1,64 ml de solución de hidróxido sódico 0,1N en porciones con agitación a una suspensión de 100 mg (0,168 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1 en 10 ml de agua, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de filtrar y liofilizar el filtrado, se obtuvieron 104 mg (100%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 594,3 (ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acetilamino)-3-metilpropiónico + H)^{+}, 616,2 (M^{+}).
Ejemplo 3 (R)-3-((S)-2-(4,4-Dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilme- til)acetilamino)-3-metilpropanol
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Se trataron 535 mg (1,05 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1e en 15 ml de DMF absoluta enfriando con hielo con 140 mg (1,05 mmoles) de HOBT y 260 mg (1,26 mmoles) de DCC. La mezcla se agitó durante 45 minutos enfriando con hielo, después se añadieron 112 mg (1,26 mmoles) de (R)-3-amino-3-metilpropanol y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de dejar reposar toda la noche, la mezcla se filtró, el filtrado se concentró, el residuo se disolvió en acetato de etilo, y la fase de acetato de etilo se lavó dos veces con solución acuosa de KHSO_{4}/K_{2}SO_{4}. Después de secar sobre sulfato sódico, filtrar y concentrar, el resto se cromatografió en gel de sílice usando acetato de etilo. Después de concentrar las fracciones con producto, se obtuvieron 423 mg (70%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 580,3 (M+H)^{+}
Preparación de (R)-3-amino-metilpropanol
Se añadieron 5,68 g (149 mmoles) de hidruro de litio y aluminio en porciones en atmósfera de argón a una solución de 19,9 g (149 mmoles) de tricloruro de aluminio en 250 ml de éter dietílico absoluto, y la mezcla se calentó a reflujo durante 30 minutos. Se añadieron lentamente gota a gota 6 g (37,7 mmoles) de (R)-3-aminobutanoato de terc-butilo en 50 ml de éter dietílico absoluto y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2 horas. Después se añadieron gota a gota cuidadosamente 10,8 ml de agua y 25,3 g de hidróxido potásico disueltos en 43 ml de agua, enfriando con hielo. La mezcla se dejó reposar toda la noche a temperatura ambiente, la fase de éter se decantó y el residuo se hirvió tres veces con diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico. Después de filtrar y separar el disolvente a vacío, se obtuvieron 2,5 g (75%) del compuesto del título.
Ejemplo 4 (R)-3-((S)-2-(4,4-Dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilme- til)acetilamino)-3-metilpropionamida
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Se añadieron 131 mg (0,636 mmoles) de DCC a una solución de 330 mg (0,555 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1 y 125 mg (0,926 mmoles) de HOBT en 5 ml de DMF absoluta, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, y después se añadieron 47 \mul (0,555 mmoles) de una solución acuosa de amoniaco al 25% de concentración. La mezcla se dejó reposar toda la noche a temperatura ambiente, se añadieron 16 \mul adicionales de una solución acuosa de amoniaco al 25% de concentración, y la mezcla se agitó durante 4 horas. Después de filtrar, el filtrado se concentró a vacío, el residuo se disolvió en acetato de etilo, y la fase de acetato de etilo se lavó dos veces en cada caso con una solución acuosa de KHSO_{4}/K_{2}SO_{4}, una solución saturada de NaHCO_{3} y agua. Después de secar la fase orgánica sobre sulfato sódico y filtrar, el disolvente se separó a vacío y el residuo se cromatografió en gel de sílice usando acetato de etilo. Después de concentrar las fracciones con producto y liofilizar, se obtuvieron 272 mg (82%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 593,3
Ejemplo 5 Ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-hidroxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclo- propilmetil)acetilamino)-3-metilpropiónico
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Se añadieron 211 \mul de tribromuro de boro en atmósfera de argón a una solución de 100 mg (0,169 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1 en 20 ml de diclorometano absoluto a -78ºC, y la mezcla de reacción se dejó calentar a 0ºC enfriando con hielo. Después de 30 minutos a 0ºC, se añadió agua cuidadosamente. Las fases se separaron y la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico. Después de filtrar, separar el disolvente a vacío, purificar por cromatografía por HPLC preparativo y liofilizar las fracciones con producto, se obtuvieron 35 mg (36%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 580,2 (M+H)^{+}
Ejemplo 6 (R)-3-((S)-2-(4,4-Dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-hidroxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropil- metil)acetilamino)-3-metilpropanol 
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43 
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Se añadieron 488 \mul de tribromuro de boro en atmósfera de argón a una solución de 220 mg (0,39 mmoles) del compuesto del Ejemplo 3 en 40 ml de diclorometano absoluto a -78ºC, y la mezcla de reacción se dejó calentar a 0ºC enfriando con hielo. Después de 30 minutos a 0ºC, se añadió agua cuidadosamente. Las fases se separaron, y la fase orgánica se lavó cuatro veces con agua, y se secó sobre sulfato sódico. Después de filtrar, separar el disolvente a vacío, purificar por cromatografía por HPLC preparativo y liofilizar las fracciones con producto, se obtuvieron 81 mg (37%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 566,3 (M+H)^{+}
Ejemplo 7 Ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-fenilureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acetilamino)-3-metilpropiónico 
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44 
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7a) Cloruro de 4-(3-fenilureido)-3-metoxibencilo
Se añadieron gota a gota 7,55 ml (103,4 mmoles) de cloruro de tionilo a una suspensión de 14,07 g (51,7 mmoles) de alcohol 4-(3-fenilureido)-3-metoxibencílico (preparado como se ha descrito en el Ejemplo 1, usando isocianato de fenilo en lugar de isocianato de 2-metilfenilo) en 200 ml de diclorometano. Después la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, se dejó reposar toda la noche y se vertió en 800 ml de heptano. El heptano se decantó del aceite separado, el residuo se suspendió varias veces en heptano, y en cada caso se decantó el heptano. El residuo se disolvió en 100 ml de diclorometano y se añadió gota a gota a 800 ml de diisopropil-éter. La mezcla se agitó durante 1 hora enfriando con hielo, y el producto se filtró con succión, se lavó con diisopropil-éter y se secó a vacío.
7b) Ácido (S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-fenilureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acético 
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45 
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Se añadieron 9,32 ml de solución de n-butil-litio (2,5 M en hexano) a -40ºC en atmósfera de argón, a una solución de 2,8 g (11,6 mmoles) del compuesto del Ejemplo 1d, en 60 ml de THF absoluto. Después de agitar a -40ºC durante 30 minutos, la mezcla de reacción se dejó calentar a 0ºC, y se añadió una solución de 5,07 g (17,4 mmoles) del compuesto del Ejemplo 7a en 20 ml de N-metil-2-pirrolidona. La mezcla de reacción se dejó calentar a 0ºC, y después se agitó durante 2 horas a 0ºC. Se añadieron 15 ml de ácido clorhídrico 1N, se separó el THF a vacío y el residuo se vertió en 300 ml de metil-terc-butil-éter. Se separaron las fases, la fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre sulfato sódico y, después de filtrar, se concentró a vacío. El residuo se purificó por HPLC preparativo. Después de concentrar las fracciones con producto y posterior liofilización, se obtuvieron 484 mg (8%) del compuesto del título.
7c) Ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-fenilureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopro- pilmetil)acetilamino)-3-metilpropiónico
El compuesto se obtuvo de forma análoga al Ejemplo 1, a partir de 120 mg (0,242 mmoles) del compuesto del Ejemplo 7b y 38 mg (0,242 mmoles) de (R)-3-aminobutanoato de terc-butilo, por acoplamiento, purificación por cromatografía, eliminación del éster terc-butílico y liofilización. Rendimiento: 113 mg (81%).
ES(+)-MS: 580,2 (M+H)^{+}
Ejemplo 8 (R)-3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-fenilureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acetilamino)-3-metilpropanol 
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46 
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El compuesto se preparó de forma análoga al Ejemplo 3, a partir de 172 mg (0,348 mmoles) de compuesto del Ejemplo 7b y 31 mg (0,417 mmoles) de (R)-3-amino-3-metilpropanol (véase Ejemplo 3), por acoplamiento, purificación cromatográfica (acetato de etilo/heptano, 9/1), concentración de las fracciones con producto y liofilización. Rendimiento: 117 mg (59%).
ES(+)-MS: 566,3 (M+H)^{+}
Ejemplo 9 3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil) acetilamino)-3-(3-piridil)propionato de etilo 
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47 
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Se añadieron 129 mg (0,393 mmoles) de TOTU y 64 \mul (0,374 mmoles) de N,N-diisopropiletilamina enfriando con hielo, a una solución de 200 mg (0,393 mmoles) de compuesto del Ejemplo 1d y 76,4 mg (0,393 mmoles) de 3-amino-3-(3-piridil)propionato de etilo (para la preparación véase J.G. Rico et al., J. Org. Chem. 58 (1993) 7948) en 5 ml de DMF absoluta. Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, se separó el disolvente a vacío y el residuo se recogió en acetato de etilo. La solución de acetato de etilo se lavó sucesivamente dos veces en cada caso con solución saturada de NaHCO_{3} y agua. Después de secar la fase orgánica sobre sulfato sódico y filtrar, el disolvente se separó a vacío y el residuo se cromatografió en gel de sílice usando acetato de etilo. Después de concentrar las fracciones con producto, se obtuvieron 195 mg (72%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 685,4 (M+H)^{+}
Ejemplo 10 Hidrocloruro del ácido 3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acetilamino)-3-(3-piridil)propiónico 
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48 
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Se añadieron 0,82 ml (0,82 mmoles) de una solución acuosa de hidróxido de litio 1 M a una solución de 141 mg (0,206 mmoles) del compuesto del Ejemplo 9 en 7,25 ml de metanol, y la mezcla de reacción se dejó reposar toda la noche a temperatura ambiente. Después el metanol se separó a vacío, el residuo se ajustó a pH 2 usando ácido clorhídrico 1 N, y la mezcla se concentró a vacío. El residuo se cromatografió en gel de sílice usando diclorometano/metanol/ácido acético glacial/agua (95/5/0,5/0,5). Después de concentrar las fracciones con producto, el residuo se trató con 1,1 equivalentes de ácido clorhídrico 1 N y se liofilizó. Rendimiento: 120 mg (89%).
ES(+)-MS: 657,4 (M+H)^{+}
Ejemplo 11 3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil) acetilamino)-3-(3-piridil)propionato de isopropilo
49
Se añadieron 56 \mul (0,731 mmoles) de isopropanol y 23,6 mg (0,193 mmoles) de 4-dimetilaminopiridina, a una suspensión de 80 mg (0,122 mmoles) del compuesto del Ejemplo 11 en 3 ml de diclorometano. Se añadieron 38 mg (0,183 mmoles) de DCC disueltos en 1 ml de diclorometano a la solución transparente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, la mezcla se dejó reposar toda la noche a temperatura ambiente. Después de filtrar, el filtrado se concentró a vacío y el residuo se cromatografió en gel de sílice usando heptano/acetato de etilo (3/1) y acetato de etilo/heptano (20/1). Después de concentrar las fracciones con producto, se obtuvieron 70 mg (82%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 699,4 (M+H)^{+}
Ejemplo 12 3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil) acetilamino)-3-(4-piridil)propionato de etilo
50
El compuesto se preparó de forma análoga al Ejemplo 9, a partir de 200 mg (0,393 mmoles) de compuesto del Ejemplo 1d y 76,4 mg (0,393 mmoles) de 3-amino-3-(4-piridil)propionato de etilo (para la preparación véase J.G. Rico et al., J. Org. Chem. 58 (1993) 7948). Rendimiento: 199 mg (74%).
ES(+)-MS: 685,4 (M+H)^{+}
Ejemplo 13 Hidrocloruro del ácido 3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acetilamino)-3-(4-piridil)propiónico
51
El compuesto se preparó de forma análoga al Ejemplo 10 a partir de 143 mg (0,209 mmoles) de compuesto del ejemplo 12. Rendimiento: 126 mg (87%).
ES(+)-MS: 657,2 (M+H)^{+}
Ejemplo 14 3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil) acetilamino)-3-(4-piridil)propionato de isopropilo
52
El compuesto se preparó de forma análoga al Ejemplo 11 a partir de 83 mg (0,126 mmoles) de compuesto del Ejemplo 13. Rendimiento: 34,6 mg (39%).
ES(+)-MS: 699,4 (M+H)^{+}
Ejemplo 15 3-((S)-2-(4,4-Dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil) acetilamino)-3-(2-piridil)propionato de etilo
53
El compuesto se preparó de forma análoga al Ejemplo 9 a partir de 200 mg (0,393 mmoles) de compuesto del ejemplo 1d y 76,4 mg (0,393 mmoles) de 3-amino-3-(2-piridil)propionato de etilo (para la preparación véase J.G. Rico et al., J. Org. Chem. 58 (1993) 7948). Rendimiento: 226 mg (84%).
ES(+)-MS: 685,4 (M+H)^{+}
Ejemplo 16 Ácido 3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropil- metil)acetilamino)-3-(2-piridil)propiónico
54
El compuesto se preparó de forma análoga al Ejemplo 10 a partir de 170 mg (0,248 mmoles) de compuesto del ejemplo 15, pero no se convirtió en el hidrocloruro por adición de ácido clorhídrico. Rendimiento: 160 mg (98%).
ES(+)-MS: 657,4 (M+H)^{+}
Ejemplo 17 3-((S)-2-(4,4-dimetil-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil) acetilamino)-3-(2-piridil)propionato de isopropilo
55
El compuesto se preparó de forma análoga al Ejemplo 11 a partir de 90 mg (0,137 mmoles) de compuesto del ejemplo 16. Rendimiento: 39 mg (41%).
ES(+)-MS: 699,4 (M+H)^{+}
Ejemplo 18 Ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acetilamino)-3-metilpropiónico
56
18a) 2-terc-Butoxi-4,4-bis(trifluorometil)-1,3-oxazabuta-1,3-dieno
El compuesto se preparó de forma análoga a W. Steglich et al., Chem. Ber. 107 (1974), 1488-1498. Para preparar hexafluoroacetona anhidra (HFA), se añadió HFA trihidrato gota a gota en ácido sulfúrico concentrado que se había calentado a 80ºC. El gas resultante se lavó una vez más con ácido sulfúrico concentrado y después se pasó al espacio de gas del matraz de reacción. Se ajustó un refrigerante de reflujo relleno con acetona/hielo seco a la salida de gas del matraz.
Como se ha descrito antes, se hizo reaccionar una solución de 20 g (170 mmoles) de carbamato de terc-butilo en 150 ml de diclorometano con HFA gaseoso anhidro hasta que se saturó la solución de la reacción. El disolvente se separó a vacío y el 2-terc-butoxicarbonilamino-2-hidroxi-1,1,1-3,3,3-hexafluoropropano bruto resultante (rendimiento: 48,3 g, 100%) se usó en la siguiente etapa de reacción.
Se añadieron gota a gota 13,6 g de anhídrido trifluoroacético y posteriormente 5 gotas de quinolina a 0ºC, a una solución de 50,05 g (176 mmoles) de 2-terc-butoxicarbonilamino-2-hidroxi-1,1,1,3,3,3-hexafluoropropano en 300 ml de éter dietílico. Después de agitar a 0ºC durante 10 minutos, se añadieron gota a gota 27,2 g adicionales de anhídrido trifluoroacético. La mezcla de reacción se agitó a 0ºC (temperatura externa) durante 30 minutos, subiendo la temperatura interna de la mezcla a 8-10ºC. Después de enfriar a 0ºC se añadieron 50,01 g (388 mmoles) de quinolina, empezando a cristalizar la sal del ácido trifluoroacético de quinolina. Después de agitar a 0ºC durante 2 horas, la mezcla se filtró. La sal residual se separó del filtrado destilando a vacío en un recipiente colector enfriado con acetona/hielo seco. Después el destilado se destiló por una columna Vigreux. Se obtuvieron 36,2 g (77%) del compuesto del título. Punto de ebullición: 126-130ºC.
18b) Éster terc-butílico de la (S)-\beta-ciclopropilalanina
Se añadieron 3,5 g (27,1 mmoles) de (S)-\beta-ciclopropilalanina a temperatura ambiente a una mezcla de 50 ml de dioxano y 5 ml de ácido sulfúrico concentrado (preparado por adición gota a gota con precaución del ácido a dioxano a 5ºC). La solución se transfirió a un tubo con cierre hermético en el que se habían condensando 40 ml de isobutileno a -78ºC. El tubo con cierre hermético se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas en un agitador. Después de abrir el tubo con cierre hermético (enfriando), la mezcla de reacción se introdujo cuidadosamente en una mezcla agitada, enfriada a 0ºC, de 30 ml de trietilamina y 50 ml de agua. Después de separar el exceso de isobutileno, el producto se extrajo con éter (2 x 50 ml). Después de secar las fases de éter sobre sulfato magnésico, filtrar y separar el disolvente a vacío, el producto bruto obtenido (aceite amarillo pálido) se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional. Rendimiento 4,2 g (84%).
18c) Éster terc-butílico de la (S)-N-formil-\beta-ciclopropilalanina
Una mezcla de 10 g (54 mmoles) de éster terc-butílico de la (S)-\beta-ciclopropilalanina y 4,7 g (55,2 mmoles) de formiato de cianometilo en 100 ml de diclorometano se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Después de separar el disolvente a vacío, el residuo obtenido se destiló a vacío. Rendimiento: 8,8 g (76%). Punto de ebullición 210ºC/40 Pa.
18d) (S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acetato de terc-butilo
Se añadieron 2,4 g (12,1 mmoles) de difosgeno a -30ºC a una solución de 2,5 g (11,7 mmoles) de éster terc-butílico del ácido (S)-N-formil-\beta-ciclopropilalanina y 2,5 g (24,7 mmoles) de trietilamina en 100 ml de diclorometano seco. La solución de la reacción se dejó calentar a -15ºC en el transcurso de 1 hora, y se continuó agitando a esta temperatura hasta completar la reacción. Después la solución de la reacción se lavó dos veces a temperatura ambiente con solución de hidrogeno-carbonato sódico al 7% de concentración, y la fase orgánica se secó sobre sulfato magnésico. Después de filtrar, el disolvente se separó a vacío y el residuo se recogió en 70 ml de benceno. Se añadieron gota a gota 3,05 g (11,5 mmoles) de 2-terc-butoxi-4,4-bis(trifluorometil)-1,3-oxazabuta-1,3-dieno en 10 ml de benceno a esta solución a temperatura ambiente. La solución de la reacción se calentó toda la noche a 60ºC y después se separó el benceno a vacío. El residuo se cromatografió en gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 8/1). Rendimiento: 3,7 g (78%). Punto de fusión: 76-77ºC. [\alpha]^{20} = -28ºC (c = 1, CHCl_{3}).
18e) Ácido (S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acético
A una solución de 7 g (17,3 mmoles) del compuesto del Ejemplo 18d en 20 ml de diclorometano, se añadió a 10ºC una mezcla de 30 ml ácido trifluroacético y 50 ml de diclorometano, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de separar el ácido trifluoroacético y diclorometano a vacío, se obtuvieron 5,9 g (98%) del compuesto del título.
Punto de fusión: 123-125ºC, [\alpha]^{22} = -26º (c = 2, metanol).
18f) Ácido (S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acético
57
Se añadieron 3,2 ml de una solución de n-butil-litio (2,5 M en hexano) a -40ºC en atmósfera de argón a una solución de 1,39 g (4 mmoles) del compuesto del Ejemplo 18e en 40 ml de THF absoluto. La mezcla de reacción se dejó calentar a 0ºC con agitación, se añadió una solución de 2,43 g (8 mmoles) de cloruro de 4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencilo en 20 ml de THF absoluto, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añadieron 20 ml de ácido clorhídrico 1 N y se separó el THF a vacío. La fase acuosa se extrajo dos veces con metil-terc-butil-éter. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico, y después de filtrar, se concentraron a vacío. El residuo se purificó por HPLC preparativo. Después de concentrar las fracciones de producto y liofilizar, se obtuvieron 1,41 g (57%) del compuesto del título.
18g) Ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metil-fenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)-acetilamino)-3-metilpropiónico
El compuesto del título se puede obtener como se describe en los Ejemplos 1f y 1g, a partir del compuesto del Ejemplo 18f y (R)-3-aminobutanoato de terc-butilo por acoplamiento y posterior escisión del éster terc-butílico.
Ejemplo 19 Ácido (S)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)acetilamino)-3-fenilpropiónico
58
19a) (S)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1- il)-2-(ciclopropilmetil)acetilamino)-3-fenilpropionato de etilo
Se añadieron 748 mg (2,28 mmoles) de TOTU (tetrafluoroborato de O-((ciano(etoxicarbonil)metilen)amino)-N,N,N',N'-tetrametiluronio) y 368 \mul de N,N-diisopropil-etilamina a 0ºC a una solución de 1,41 g (2,28 mmoles) de compuesto del Ejemplo 18f y 442 mg (2,28 mmoles) de (S)-3-amino-3-fenilpropionato de etilo en 20 ml de dimetilformamida absoluta (DMF). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, se separó la DMF a vacío, el residuo se recogió en acetato de etilo, y la solución de acetato de etilo se lavó sucesivamente con una solución acuosa de KHSO_{4}/K_{2}SO_{4}, una solución saturada de NaHCO_{3} y agua. Después de secar la fase orgánica sobre sulfato sódico y filtrar, el disolvente se separó a vacío, y el residuo se cromatografió en gel de sílice usando heptano/acetato de etilo (3/2). Concentrando las fracciones con producto, se obtuvieron 1,48 g (82%) del compuesto del título.
19b) Ácido (S)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metil-fenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)-acetilamino)-3-fenilpropiónico
Una solución de 1,46 g (1,84 mmoles) de compuesto del Ejemplo 19a en 40 ml de N-metil-2-pirrolidona y 20 ml de ácido clorhídrico 6N se calentó a 60ºC durante 6 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vertió en 300 ml de agua, y el precipitado se filtró con succión, se lavó con agua y se secó sobre pentóxido de fósforo. El producto bruto se cromatografió dos veces en gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol/ácido acético/agua = 95/5/0,5/0,5). Después de concentrar las fracciones con producto, el residuo se recogió en diclorometano y la fase orgánica se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico. Después de filtrar, separar el disolvente a vacío y liofilizar, se obtuvieron 1,19 g (85%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 764,2 (M+H)^{+}
Ejemplo 20 Ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(metilpropil)acetilamino)-3-metilpropiónico
59
20a) Éster terc-butílico de la N-formil-L-leucina
La preparación se llevó a cabo de forma análoga a W. Duczek et al., Synthesis 1996, 37-38. Se añadió una solución de 4,04 g (40 mmoles) de trietilamina en 10 ml de diclorometano a 0ºC, a una solución de 8,94 g (40 mmoles) de hidrocloruro del éster terc-butílico de L-leucina y 3,4 g (40 mmoles) de formiato de cianometilo en 60 ml de diclorometano. La solución de la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente, se agitó toda la noche a temperatura ambiente y después se lavó dos veces con solución saturada de NaCl. Las fases se separaron y la fase orgánica se secó sobre sulfato magnésico. Después de filtrar y separar el disolvente a vacío, el residuo obtenido se destiló a vacío. Rendimiento: 7,5 g (87%). Punto de ebullición: 118ºC/2,7 Pa.
20b) (S)-2-(4,4-Bis(trifluorometil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(2-metil-propil)acetato de terc-butilo
Se añadieron 2,4 g (12,1 mmoles) de difosgeno a -30ºC a una solución de 2,5 g (11,6 mmoles) de éster terc-butílico de la N-formil-L-leucina y 2,5 g (24,7 mmoles) de trietilamina en 100 ml de diclorometano seco. La solución de la reacción se dejó calentar a -10ºC en el transcurso de 1 hora, y se continuó agitando a esta temperatura hasta completar la reacción. Después la solución de la reacción se lavó dos veces a temperatura ambiente con solución de hidrógeno-carbonato sódico al 7% de concentración. Las fases se separaron y la fase orgánica se secó sobre sulfato magnésico. Después de filtrar el disolvente se separó a vacío y el residuo se recogió en 70 ml de benceno. Se añadieron gota a gota a esta solución 3 g (11,3 mmoles) de 2-terc-butoxi-4,4-bis(trifluorometil)-1,3-oxazabuta-1,3-dieno en 10 ml de benceno, a temperatura ambiente. La solución de la reacción se calentó a 60ºC toda la noche y después se separó el benceno a vacío. Después de cromatografía del residuo en gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo =10/1)), se obtuvieron 3,7 g (80%) del compuesto del título. Punto de fusión: 105-106ºC- [\alpha]^{20} = -24º (c = 1, CHCl_{3}).
20c) Ácido (S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(2-metilpropil)acético
Se añadió una solución de 7 g (17,2 mmoles) del compuesto del Ejemplo 20b en 20 ml de diclorometano a 10ºC, a una mezcla de 30 ml de ácido trifluoroacético y 50 ml de diclorometano y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de separar el ácido trifluoroacético y diclorometano a vacío, se obtuvieron 6,0 g (99%) del compuesto del título. Punto de fusión: 154-156ºC. [\alpha]^{22} = -23º (c = 2, metanol).
20d) Ácido (R)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)-ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(metilpropil)-acetilamino)-3-metilpropiónico
El compuesto del título se preparó como se describe en los Ejemplos 1f y 1g, a partir de 500 mg (0,809 mmoles) de ácido (S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(metilpropil)acético de fórmula
60
que se había preparado a partir de ácido (S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)- 2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(metilpropil)acético y cloruro de 4-(3-(2-metil-fenil)ureido)-3-metoxibencilo como se describe en el Ejemplo 18f, y 128 mg (0,809 mmoles) de (R)-3-aminobutanoato de terc-butilo. Después de acoplamiento, purificación por cromatografía en gel de sílice (eluyente: heptano/acetato de etilo = 3/2) y escisión del éster de terc-butilo, se obtuvieron 299 mg (53%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 704,5 (M+H)^{+}
Ejemplo 21 Ácido (S)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(metilpropil)-acetilamino)-3-fenilpropiónico
61
21a) (S)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1- il)-2-(metilpropil)-acetilamino)-3-fenilpropionato de etilo
Se añadieron 1,89 g (5,77 mmoles) de TOTU y 932 \mul de N,N-diisopropiletilamina a 0ºC a una solución de 3,57 g (5,77 mmoles) de ácido (S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(metilpropil)acético (preparado a partir de ácido (S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(metilpropil)acético y cloruro de 4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencilo como se describe en el Ejemplo 18f), y 1,11 g (5,77 mmoles) de (S)-3-amino3-fenilpropionato de etilo en 30 ml de DMF absoluta. Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, se separó la DMF a vacío, el residuo se recogió en acetato de etilo y la solución de acetato de etilo se lavó sucesivamente con solución acuosa de KHSO_{4}/K_{2}SO_{4}, una solución saturada de NaHCO_{3} y agua. Después de secar la fase orgánica sobre sulfato sódico y filtrar, el disolvente se separó a vacío y el residuo se cromatografió en gel de sílice usando acetato de etilo/heptano (2/3). Después de concentrar las fracciones con producto, se obtuvieron 3,26 g (71%) del compuesto del título.
21b) Ácido (S)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(metilpropil)-acetilamino)-3-fenilpropiónico
Se añadieron 45 ml de ácido clorhídrico 6N a una solución de 3,25 g (4,09 mmoles) del compuesto del Ejemplo 21a en 90 ml de N-metil-2-pirrolidona, y la mezcla se calentó a 60ºC durante 6 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se vertió en 60 ml de agua. El precipitado se filtró con succión, se lavó con agua y se secó sobre pentóxido de fósforo. Después de purificar por cromatografía dos veces el producto bruto en gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol/ácido acético/agua = 95/5/0,5/0,5) y concentrar las fracciones con producto, el residuo se recogió en diclorometano, La fase orgánica se lavó dos veces con agua y se secó sobre sulfato magnésico. Después de filtrar, concentrar y liofilizar, se obtuvieron 2,7 g (86%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 766,2 (M+H)^{+}
Ejemplo 22 Sal sódica del ácido (S)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(metilpropil)-acetilamino)-3-fenilpropiónico
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Se añadieron 1,24 ml de solución de hidróxido sódico 1N (diluido con 20 ml de agua) con agitación a una suspensión de 1 g (1,3 mmoles) del compuesto del Ejemplo 21 en 100 ml de acetonitrilo y 200 ml de agua. Después de liofilizar la solución, se obtuvieron 1,01 g (79%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 766,2 (ácido 3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(2-metilpropil)-acetilamino)-3-fenilpropiónico+H)^{+}
Ejemplo 23 Sal sódica del ácido (S)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)-acetilamino)-3-fenilpropiónico 
\vskip1.000000\baselineskip
63 
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de 720 mg de compuesto del Ejemplo 19b, de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 22, se obtuvieron 720 mg (99%) del compuesto del título.
ES(+)-MS: 764,3 (ácido (S)-3-((S)-2-(4,4-bis(trifluorometil)-3-(4-(3-(2-metilfenil)ureido)-3-metoxibencil)-2,5-
dioxoimidazolidin-1-il)-2-(ciclopropilmetil)-acetilamino)-3-fenilpropiónico+H)^{+}
Investigación de la actividad biológica A) Ensayo de adhesión celular U937/VCAM-1
El método de ensayo usado para la actividad de los compuestos de fórmula I en la interacción entre VCAM-1 y VLA-4 es el ensayo descrito a continuación, que es específico para esta interacción. Los componentes de unión celular, es decir, las integrinas VLA-4, son suministradas en su forma natural como moléculas de superficie en células humanas U937 (ATCC CRL 1593), que pertenecen al grupo de los leucocitos. Como componentes de unión específicos, se usan proteínas de fusión recombinantes solubles preparadas por ingeniería genética, que constan del dominio extracitoplasmático de VCAM-1 humano y la región constante de una inmunoglobulina humana de subclase IgG1.
Ensayo para medir la adhesión de células U937 (ATCC CRL 1593) a hVCAM-1(1-3)-IgG 1. Preparación de VCAM-1(1-3)-IgG humano y CD4-IgG humano
Se usó una construcción genética para expresar el dominio extracelular de VCAM-1 humano, combinado con la secuencia genética de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana IgG1 (regiones bisagra, CH2 y CH3) (de Dr. Brian Seed, Massachusetts General Hospital, Boston, USA; Damle and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 6403). La proteína de fusión soluble hVCAM-1(1-3)-IgG contenía los tres dominios extracelulares de amino terminal tipo inmunoglobulina de VCAM-1 humano (Damle and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 6403). CD4-IgG (Zettlmeissl et al., DNA and Cell Biology 1990, 9, 347) servía como una proteína de fusión para testigos negativos. Las proteínas recombinantes se expresaron como proteínas solubles después de la transfección de DNA mediada por DEAE/dextrano en células COS (ATCC CRL 1651) de acuerdo con procedimientos patrón (Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994).
2. Ensayo para medir la adhesión de células U937 a hVCAM-1(1-3)-IgG
2.1 Se incubaron placas de ensayo de microvaloración de 96 pocillos (Nunc Maxisorb) a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 \mul/pocillo de una solución de anticuerpo de IgG anti-humano de cabra (10 \mug/ml en tris 50 mM, pH 9,5). Después de separar la solución de anticuerpo, se llevó a cabo un lavado con PBS.
2.2 Se incubaron 150 \mul/pocillo de un tampón de bloqueo (BSA al 1% en PBS) en las placas a temperatura ambiente durante 0,5 horas. Después de separar el tampón de bloqueo, se llevó a cabo un lavado con PBS.
2.3 Se incubaron 100 \mul por pocillo de un líquido sobrenadante de cultivo celular de células COS transfectadas, en placas a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Las células COS se transfectaron con un plásmido que codifica los tres dominios N-terminales tipo inmunoglobulina de VCAM-1, acoplados a la parte Fc de la IgG_{1} humana (hVCAM-1(1-3)-IgG). El contenido de hVCAM-1(1-3)-IgG era aproximadamente 0,5-1 \mug/ml. Después de separar el líquido sobrenadante del cultivo, se llevó a cabo un lavado con PBS.
2.4. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos con 100 \mul/pocillo de tampón de bloqueo del receptor Fc (1 mg/ml \gamma-globulina, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 100 \muM, MnCl_{2} 100 \muM, CaCl_{2} 100 \muM, 1 mg/ml de BSA en HEPES 50 mM, pH 7,5). Después de separar el tampón de bloqueo del receptor Fc, se llevó a cabo un lavado con PBS.
2.5 Se introdujeron 20 \mul de tampón de unión (NaCl 100 mM, MgCl_{2} 100 \muM, MnCl_{2} 100 \muM, CaCl_{2} 100 \muM, 1 mg/ml de BSA en HEPES 50 mM, pH 7,5), las sustancias que se van a ensayar se añadieron en 10 \mul de tampón de unión y se llevó a cabo la incubación durante 20 minutos. Sirvieron como testigo anticuerpos frente a VCAM-1 (BBT, No. BBA6) y frente a VLA-4 (Immunotech, No. 0764).
2.6 Se incubaron células U937 durante 20 minutos en un tampón de bloqueo de receptor Fc, y después se añadieron con pipeta en una concentración de 1 x 10^{6}/ml y en una cantidad de 100 \mul por pocillo (volumen final 125 \mul/pocillo).
2.7 Las placas se sumergieron lentamente con un ángulo de 45º en tampón de parada (NaCl 100 mM, MgCl_{2} 100 \muM, MnCl_{2} 100 \muM, CaCl_{2} 100 \muM en tris 25 mM, pH 7,5) y se agitaron. Se repitió el procedimiento.
2.8 Después se incubaron 50 \mul/pocillo de una solución colorante (16,7 \mug/ml de colorante Hoechst 33258, formaldehído al 4%, Triton X-100 al 0,5% en PBS) en las placas durante 15 minutos.
2.9 Las placas se agitaron y se sumergieron lentamente con un ángulo de 45º en un tampón de parada (NaCl 100 mM, MgCl_{2} 100 \muM, MnCl_{2} 100 \muM, CaCl_{2} 100 \muM en tris 25 mM, pH 7,5). Se repitió el procedimiento. Después, con el líquido presente (tampón de parada), se midieron las placas en un citofluorímetro (Millipore) (sensibilidad: 5, filtro: longitud de onda de excitación: 360 nm, longitud de onda de emisión: 460 nm).
La intensidad de la luz emitida por las células U937 teñidas es una medida del número de células U937 adheridas a hVCAM-1(1-3)-IgG y que quedan en la placa, y por lo tanto una medida de la capacidad de la sustancia de ensayo añadida para inhibir esta adhesión. A partir de la inhibición de la adhesión a diferentes concentraciones de la sustancia de ensayo, se calculó la CI_{50} que conduce a un 50% de inhibición de la adhesión.
3. Resultados
Los siguientes resultados se obtuvieron en el ensayo de adhesión celular U937/VCAM-1 (valores de CI_{50} en nM (nanomoles/litro)).
Compuesto de ejemplo nº CI_{50} (nM)
1 0,3
2 0,5
5 25,9
7 2,1
10 0,6
13 1,8
16 0,9
19 4,4
Las propiedades farmacológicas de los compuestos de fórmula I también se pueden investigar en los siguientes modelos.
B) Adhesión de leucocitos en la rata
En el modelo de adhesión de leucocitos en la rata, se investiga la influencia de los compuestos de fórmula I en la adhesión de leucocitos en vénulas de rata. La adhesión de leucocitos en el endotelio de vénulas postcapilares se considera una etapa importante en reacciones inflamatorias (J.M. Harlan, Blood 1985, 65, 513). En el reclutamiento de leucocitos de la sangre en zonas inflamadas, se produce una secuencia dinámica bien coordinada de sucesos en la que las citoquinas quimiotácticas y las moléculas de adhesión celular juegan un papel activo. Se ha encontrado que las interacciones VCAM-1/VLA-4 juegan un papel crucial en la adhesión y emigración de leucocitos, y en la mayor permeabilidad de los vasos a macromoléculas que son inducidas por diferentes sustancias mediadoras y citoquinas (D. Seiffge, Int. J. Microcirc. 1995, 15, 301). En el presente modelo, se produce una inflamación generalizada o artritis reumatoide que conduce a una adhesión de los leucocitos y a su emigración a zonas enfermas del órgano, por inyección local o sistémica de endotoxinas, por ejemplo zimosan, toxinas bacterianas tales como lipopolisacáridos (LPS) o adyuvante de Freund. Se determina la mayor adhesión al endotelio de las vénulas producida por la endo-
toxina.
Para determinar la adhesión de leucocitos, se usa un microscopio de cámara invertida (Zeiss) que está equipado con un sistema de vídeo. Se inyecta zimosan o endotoxinas bacterianas en ratas macho Sprague-Dawley (peso corporal aproximadamente 250 g) bajo premedicación con halotano. Los animales testigo recibieron un volumen idéntico de solución salina al 0,9% de concentración. Después se administra a los animales la sustancia de ensayo vía subcutánea u oral como una dosis individual o como una dosis múltiple. Para llevar a cabo la medición, las ratas se anestesian por inyección intramuscular de 1,25 g/kg de uretano. Se deja que respiren espontáneamente por un tubo traqueal. La temperatura corporal se mantiene a 37ºC mediante una pastilla calefactora regulada. Se expone cuidadosamente el mesenterio en una ventana con termostato de la fase del microscopio mediante una incisión hipogástrica y se recubre con parafina líquida a 37ºC. La zona ileocecal del mesenterio se mantiene en posición usando tres agujas de punta roma y arcilla plástica. Después de un periodo de 30 minutos de equilibrado, durante el cual se deja que el tejido se estabilice, se determina la adhesión de leucocitos en las vénulas postcapilares de 20-30 \mum de diámetro y aproximadamente 100 \mum de longitud, contando en 2-3 segmentos de las vénulas en intervalos de 10 minutos durante 1 hora. Se considera que un leucocito se adhiere al endotelio si está fijo durante más de 30 segundos. Después del experimento, se determina el recuento sistémico de leucocitos y el contenido de fibrinógeno de la sangre. La inhibición de la adhesión de leucocitos por la sustancia de ensayo se indica por la disminución (en %) del número de leucocitos adherentes en los animales tratados comparado con el número en los animales testigo.
C) Hipersensibilidad de tipo retardado en el ratón
En el modelo de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH, por sus siglas en inglés), se investiga la acción antialérgica o antiinflamatoria de los compuestos de fórmula I. La DTH es una reacción inflamatoria de la piel que es inducida por sensibilización con sustancias antígenas. Con el fin de determinar la correspondiente reacción inflamatoria y el reclutamiento de leucocitos en la zona inflamada in vivo, se ensayan las sustancias en el siguiente modelo de DTH en el ratón (véase también T.B. Issekutz, J. Immunol. 1991, 147, 4178).
Grupos de ratones BALB/c hembras (peso corporal aproximadamente 20 g) se sensibilizan vía epicutánea en una parte afeitada de la piel con 150 \mul de una solución al 3% de concentración de oxazolona, que induce una fuerte reacción inflamatoria de DTH. 6 días después, la reacción se estimula por administración de 20 \mul de una solución de oxazolona al 1% de concentración en la oreja derecha de los animales. Las sustancias de ensayo se administran vía subcutánea u oral, en cada caso 44 horas antes del estímulo de la reacción, 20 horas antes del estímulo y 4 horas después del estímulo. Directamente antes del estímulo de la reacción y 24 horas después del estímulo, se mide en la oreja derecha el grosor de la oreja alterada debido al hinchamiento inflamatorio de la oreja, usando un micrómetro Mitutoyo Engineering. Se determina la diferencia entre estas dos medidas para cada animal del grupo. Se comparan por una parte los valores medios de las diferencias de un grupo de animales tratado con la sustancia de ensayo, y por otra parte de un grupo testigo no tratado. Como medida del efecto de la sustancia, se indica el porcentaje de inhibición de hinchamiento de la oreja.
D) Acción antiasmática en el cobayo
El efecto en la función pulmonar y la acción antiasmática de los compuestos de fórmula I se puede determinar en un modelo de cobayo que sigue el método descrito por G. Mosacevic, Arch. Toxicol. 1975, 34,1. Para esto, se llevan a cabo las preparaciones técnicas para la investigación de acuerdo con los detalles descritos por Moacevic. Se usan cobayos macho albinos con un pero corporal de 300-500 g. Los animales se ponen en un pletismógrafo (de FMI) y se registran tres valores iniciales de los parámetros de velocidad respiratoria y amplitud respiratoria. En este modelo la respiración asmática se caracteriza por la disminución de la amplitud respiratoria (= disminución del volumen respiratorio debido a la bronquioconstricción) y aumento de la velocidad respiratoria (=reacción refleja). Este estado en los pacientes de asma se conoce como disnea.
Los cobayos albinos se sensibilizan 22 días antes de empezar el estudio con 1 ml por animal de una solución de ovalbúmina al 0,1% de concentración en dos días sucesivos. El ataque de asma experimental es inducido por inhalación de una solución de ovalbúmina al 0,3% de concentración durante 1 minuto. Después de una fase de recuperación de 40-60 minutos, los animales inhalan la sustancia de ensayo en forma de una solución acuosa. Inmediatamente después, se administra solución de ovalbúmina al 0,3% de concentración durante 1 minuto. En la siguiente fase de recuperación de 30 minutos, los animales respiran aire normal. Este procedimiento se repite dos veces. Si los ataques de asma amenazan la vida, se administra oxígeno a los animales.
Se puede determinar el efecto antiasmático en ovejas, por ejemplo, como describen Abraham et al., J. Clin. Invest. 1994, 93, 776.
E) La acción antiaterosclerótica se puede investigar en los siguientes modelos animales Modelo de brazal de formación de neoíntima
Los ratones de tipo salvaje de cepa C57BL/6J son suministrados por el servicio de cría de Charles River Wiga GMbH (Sulzfeld, FRG) y los ratones KO homozigotos de cepa C57BL/6J-ApoE tm 1 Unc (ApoE KO) son suministrados por The Jackson Laboratory (Maine, USA). Todos los ratones tienen entre 10 y 12 semanas de edad al inicio del experimento y se mantienen en habitaciones completamente climatizadas a una temperatura de 22ºC. La fase de día/noche del programa de luz controlado se ajusta a un periodo de 12 horas. Los ratones primero se anestesian con 60 mg/kg de peso corporal de pentobarbital sódico i.p. Después cada animal recibe adicionalmente 0,01 mg/10g de peso corporal de xilazina i.m.
Los ratones se fijan en posición supina, y se afeitan y desinfectan las superficies interiores de ambas patas traseras. Después se abre la piel de la cara interior del muslo izquierdo mediante una incisión longitudinal de aproximadamente 1 cm y se aísla la arteria femoral del tejido que la rodea y de la vena femoral y el nervio ciático. Después se corta un trozo de tubo de polietileno de aproximadamente 2 mm de longitud (diámetro interno 0,58 mm, diámetro externo 0,965 mm, Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) de acuerdo con la longitud y se pone alrededor de la arteria femoral y se fija con hilo Prolene (7/0, 0,5 métrico de Ethicon, Norderstedt, FRG). Posteriormente se vuelve a cerrar la piel mediante una sutura continua. La pata trasera derecha se opera de manera análoga, pero sin poner un brazal alrededor de la arteria femoral. Posteriormente el animal se devuelve a su jaula. A partir de la operación, los animales se tratan diariamente con la sustancia de ensayo.
Al final del experimento, los ratones se anestesian otra vez con 60 mg/kg de peso corporal de pentobarbital sódico i.p., y 0,01 mg/10 g de peso corporal de xilazina i.m. Para fijar los vasos in situ, cada ratón recibe después una inyección de solución de formalina al 4% de concentración en la aorta abdominal. Después se quitan las arterias femoral derecha e izquierda. En el lado izquierdo, se quita la parte de la arteria que incluye la sección de aproximadamente 1 mm próxima al brazal, la sección encerrada por el propio brazal y la sección del vaso que dista 1 mm. En el lado derecho, esta parte corresponde a la sección que sólo se aísla durante la operación, pero no se encierra con un brazal.
La parte de las arterias femoral izquierda y derecha fijada en solución de formalina al 4% de concentración se sumerge en parafina. Se preparan una serie de secciones transversales de tejido de la sección de arteria izquierda encerrada por el brazal, y de la correspondiente sección de la arteria derecha testigo, que después se tiñen con hematoxilina y eosina para el análisis morfométrico asistido por software (LeicaQWin de Leica Imaging Systems, Cambridge, GB).
Se evalúan para cada ratón tres secciones transversales de tejido de la zona de la arteria femoral izquierda encerrada por el brazal y tres secciones transversales de tejido de la correspondiente zona de la arteria derecha testigo. Después de marcar la lámina elástica externa, la lámina elástica interna y el borde entre el lumen y el endotelio, se calculan las siguiente áreas con el programa de análisis: lumen, neoíntima y media. El tamaño de estas áreas se indica en unidades de \mum^{2}. El efecto de un compuesto se indica por la reducción de la proporción neoíntima/media en comparación con el grupo testigo.
Trasplante de corazón
En el modelo de trasplante de corazón alogénico, se llevan a cabo transplantes entre dos cepas de ratas genéticamente incompatibles. Para este propósito, se usan ratas Wistar-Furth como animales donantes y ratas Lewis como animales receptores. Los animales se obtienen del servicio de cría de Charles River Wiga GmbH (Sulzfeld, FRG). Ratas macho Lewis de 270-330g y de 2,5 a 3 meses de edad, y ratas Wistar-Furth macho de 200-250 g y de 1,5 a 2 meses de edad, se mantienen en condiciones controladas constantemente (temperatura 19-22ºC; humedad relativa 50-55%; la fase de día/noche del programa de luz controlada se ajusta a un periodo de 12 horas).
Para la operación, las ratas recibieron una combinación de 3,3 mg/kg de peso corporal de xilazina y 115 mg/kg de peso corporal de ketamina. Después del inicio de la acción anestésica, se abre el abdomen del receptor mediante incisión. Se separan la aorta abdominal y la vena cava inferior entre la arteria y la vena renal y los vasos iliolumbales. Después la aorta se cierra cranealmente usando un clip de vasos. Se pone un hilo de seda caudalmente alrededor de ambos vasos y se aprieta. Hay un segundo hilo de seda sin apretar alrededor del extremo craneal de la vena cava inferior. Después de abrir la cavidad abdominal, el animal donante se mata cortando los vasos abdominales mayores. Este momento señala el inicio del periodo isquémico del órgano del donante. Después se abre el diafragma y se saca el corazón. La vena cava superior e inferior se liga y corta en el lado de la ligadura distal del corazón. Se lleva a cabo una ligadura de masa de las venas pulmonares usando un hilo de seda. Después la arteria pulmonar y aorta se sacan con fórceps y se cortan. Después se eliminan los residuos de sangre en el sistema vascular del trasplante. Después se levanta el corazón, se extrae junto con la ligadura de masa del pulmón y se almacena en solución de NaCl fisiológica fría durante de uno a dos minutos. Después se lleva a cabo una anastomosis lateroterminal de la aorta y de la arteria pulmonar del órgano del donante con la arteria abdominal y vena cava inferior respectivamente del animal receptor. Después de completar la anastomosis de vasos, se liberan sucesivamente la circulación venosa seguida de la circulación arterial. Finalmente, se vuelve a cerrar la cavidad abdominal, usando una sutura de peritoneo/músculo y una sutura de piel. Después de liberar la circulación sanguínea y una corta fase de recuperación, el corazón transplantado late con una velocidad sinusal de aproximadamente 100 a 120 latidos/minuto. Se administra ciclosporina A (CSA) para la inmunodepresión vía subcutánea (s.c.) u oral con el agua de beber. Después de superar el periodo de rechazo agudo, la dosis se puede reducir de 25 mg/kg de peso corporal a partir del 15º día p.op. a 5 mg/kg de peso corporal. Las inyecciones se realizan una vez al día por la mañana en la zona del cuello de los animales.
El cambio de administrar CSA s.c. a administrar CSA oral se produce el día 22 p.op. con el fin de haber superado de forma segura el periodo de rechazo agudo. La sustancia que se va a investigar se administra durante 100 días a partir de la operación. Después de finalizar el intervalo de tiempo de observación (100 días), los animales se anestesian y se abre la cavidad abdominal. Después se extrae el corazón protegiendo los cabos de vasos de los vasos abdominales, se corta en láminas y se almacenan en solución de formalina al 4%. Después de fijar las láminas de corazón, se sumergen en parafina y se tiñe la elástica de acuerdo con la técnica histológica de van Gieson patrón. Se lleva a cabo la clasificación de la proliferación de neoíntima y la constricción del lumen vascular asociado con ésta, de acuerdo con Adams et al. (Transplantation 1993, 56, 794). Se clasifican las adhesiones entre la lámina elástica interna y el endotelio. El colorante especial de acuerdo con van Gieson que enfatiza selectivamente las fibras elásticas facilita la valoración. El efecto de un compuesto se indica por la reducción de la proliferación de neoíntima, y por lo tanto de la aterosclerosis del trasplante en comparación con el grupo testigo.
Modelo de aterosclerosis en ratones knockout (KO) ApoE
Los ratones KO homozigotos de la cepa C57BL/6J-ApoE tm 1 Unc (ApoE KO) son suministrados por The Jackson Laboratory (Maine, USA). Todos los ratones tienen entre 10 y 12 semanas de edad al inicio del experimento, y se mantienen en lechos patrón para animales de laboratorio (Altromin, Lage, FRG) en habitaciones completamente climatizadas a una temperatura de 22ºC. La fase de día/noche del programa de luz controlado se ajusta a un periodo de 12 horas. Los animales se tratan con la sustancia de ensayo durante 4 meses. Al final del experimento, se anestesiaron los ratones con 60 mg/kg de peso corporal de pentobarbital sódico i.p. y 0,01 mg/10 g de peso corporal de xilazina i.m. Después se extraen el corazón y arco aórtico y la aorta torácica descendente y se fijan en solución de formalina al 4% de concentración. La aorta descendente se trata con Aceite Rojo O para teñir lesiones con grasa. El análisis morfométrico de las lesiones con grasa se lleva a cabo usando un microscopio (tipo Leitz DM RBE de Leica, Bensheim), con una cámara unida que tiene una unidad de control (tipo CF 15 MCC, Kappa Me\betatechnik, Gelichen) y un ordenador (Leica, Bensheim). Las mediciones se llevan a cabo con ayuda de un programa de ordenador para análisis de imágenes (LeicaQWin de Leica Imaging Systems, Cambridge, GB). Se cortan el corazón y el arco aórtico longitudinalmente y se tiñen con hematoxilina y eosina para el análisis morfométrico. En cada caso se analizan 15-20 secciones. Se estudian los macrófagos y linfocitos T inmunohistoquímicamente en otras secciones. El efecto de un compuesto se indica por la reducción de la formación de placa en la aorta en comparación con el grupo testigo.
F) Se puede investigar la acción cardioprotectora, por ejemplo, en el siguiente modelo animal Infarto cardiaco en la rata
Se obtienen ratas macho Wistar del servicio de cría Charles River Wiga GmbH (Sulzfeld, FRG) con una edad de 2,5 a 3 meses y que tienen un peso corporal de 270-330 g. Los animales se mantienen en condiciones controladas constantemente (temperatura 19-22ºC; humedad relativa 50-55%; la fase de día/noche del programa de luz controlado se ajusta a un periodo de 12 horas). Para la operación, las ratas reciben una combinación de 3,3 mg/kg de peso corporal de xilazina y 115 mg/kg de peso corporal de ketamina. Después los animales se intuban y ventilan con oxígeno al 30%. Se afeita el tórax, se desinfecta y abre mediante una toracostomía lateral izquierda. La arteria coronaria izquierda se liga permanentemente 2-3 mm por debajo de la aurícula izquierda del corazón durante 48 horas o 4 semanas, o se liga durante 30 minutos y se realiza reperfusión durante 47,5 horas o 4 semanas.
Después de la operación se vuelve a cerrar el tórax y los animales se desentuban después de empezar la respiración espontáneamente. La sustancia de ensayo se administra 30 minutos después de la ligadura o inmediatamente antes de la reperfusión. Después los animales se tratan diariamente con la sustancia de ensayo. Al final del experimento, los animales se anestesian otra vez con una combinación de 3,3 mg/kg de peso corporal de xilazina y 115 mg/kg de peso corporal de ketamina. Para analizar el movimiento de las paredes, se investigan los animales en cuyos corazones se ha realizado reperfusión, mediante "Formación de imágenes de resonancia magnética nuclear". En los animales con corazones sin reperfusión, se introduce una punta de catéter por la arteria carótida derecha para medir la presión ventricular y la contracción en la cámara izquierda del corazón. Después se extrae el corazón de todos los animales y se realiza perfusión de una manera retrógrada en un aparato Langendorff por la aorta con solución caliente Azul de Evans al 1% de concentración a 37ºC, para determinar la zona de riesgo anatómico y la zona no isquémica. Después los corazones se cortan en 5-6 láminas finas y se incuban en solución de cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio durante 15 minutos para determinar los tejidos cardiacos vivos y muertos. El análisis planimétrico de la zona de riesgo y de la región de infarto se lleva a cabo usando una cámara (Leica, Bensheim) y una unidad de ordenador unida con software de análisis (Leitz, Bensheim). La zona de riesgo se expresa en porcentaje basado en el ventrículo izquierdo más septo, y la región de infarto en porcentaje basado en la zona de riesgo. El efecto de un compuesto se indica por la reducción de la región de infarto basado en la zona de riesgo en comparación con el grupo testigo.

Claims (16)

1. Un compuesto de fórmula I,
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en la que
A es ciclopropilmetilo o isobutilo;
E es -CO-R^{6}, -CO-H o -CH_{2}-O-R^{7};
Z es oxígeno o azufre;
R^{1} es hidrógeno o metilo;
R^{2} es fenilo, piridilo o alquilo (C_{1}-C_{4}), donde el resto alquilo puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor, y el resto fenilo puede estar sustituido con uno o más sustituyentes iguales o diferentes del grupo que consta de alquilo (C_{1}-C_{4}), alcoxi (C_{1}-C_{4}), metilendioxi, etilendioxi, halógeno, trifluorometilo y trifluorometoxi;
R^{3} y R^{4} son metilo o trifluorometilo;
R^{5} es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4}), donde el resto alquilo puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor;
R^{6} es hidroxilo, alcoxi (C_{1}-C_{10}), fenil-alcoxi(C_{1}-C_{8}), feniloxi, alquil(C_{1}-C_{8})-carboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), fenilcarboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), fenil-alquil(C_{1}-C_{6})-carboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), alcoxi(C_{1}-C_{8})-carboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), feniloxi-carboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), fenil-alcoxi(C_{1}-C_{6})-carboniloxi-alcoxi(C_{1}-C_{6}), amino, mono(alquil(C_{1}-C_{10}))-amino o di(alquil(C_{1}-C_{10}))-amino;
R^{7} es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});
en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, o sus sales fisiológicamente tolerables.
2. Un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, en la que R^{3} y R^{4} son ambos metilo o son ambos trifluorometilo, en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, o sus sales fisiológicamente tolerables.
3. Un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1 y/o 2, en la que Z es oxígeno, en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, o sus sales fisiológicamente tolerables.
4. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, en la que R^{1} es metilo y R^{5} es metilo, en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, o sus sales fisiológicamente tolerables.
5. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, en la que R^{2} es piridilo, fenilo no sustituido, fenilo que está sustituido con un resto metilendioxi o un resto etilendioxi, fenilo que está sustituido con uno o dos grupos alcoxi (C_{1}-C_{4}), o alquilo (C_{1}-C_{4}) que puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor, en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, o sus sales fisiológicamente tolerables.
6. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, en la que E es -CO-R^{6} o -CH_{2}-OH y R^{6} es hidroxilo, alcoxi (C_{1}-C_{6}), en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, o sus sales fisiológicamente tolerables.
7. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, en la que
A es ciclopropilmetilo o isobutilo;
E es -COOH, -COOC_{2}H_{5}, -COOiC_{3}H_{7} o -CH_{2}-OH;
Z es oxígeno;
R^{1} es metilo;
R^{2} es fenilo no sustituido, piridilo o metilo;
R^{3} y R^{4} es metilo;
R^{5} es metilo;
en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, o sus sales fisiológicamente tolerables.
8. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, en la que
A es ciclopropilmetilo o isobutilo;
E es -COOH, -COOC_{2}H_{5}, -COOiC_{3}H_{7} o -CH_{2}OH;
Z es oxígeno;
R^{1} es metilo;
R^{2} es fenilo no sustituido, piridilo o metilo;
R^{3} y R^{4} son trifluorometilo;
R^{5} es metilo;
en todas sus formas estereoisómeras y sus mezclas en todas las proporciones, o sus sales fisiológicamente tolerables.
9. Un procedimiento para preparar compuestos de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula II con un compuesto de fórmula III
\vskip1.000000\baselineskip
65
donde A, E, Z, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son como se definen en las reivindicaciones 1 a 8, o hay grupos funcionales en forma protegida o en forma de precursores, y donde G es hidroxicarbonilo, alcoxi(C_{1}-C_{6})-carbonilo o derivados de ácido carboxílico activados.
10. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 8 y/o sus sales fisiológicamente tolerables para usar como medicamento.
11. Una preparación farmacéutica que comprende uno o más compuestos de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, y/o sus sales fisiológicamente tolerables y un vehículo farmacéutico tolerable.
12. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 8 y/o sus sales fisiológicamente tolerables, para usar como antiinflamatorios.
13. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 8 y/o sus sales fisiológicamente tolerables, para usar para tratar la artritis, artritis reumatoide, poliartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple o enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central.
14. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 8 y/o sus sales fisiológicamente tolerables, para usar para tratar el asma o alergias.
15. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 8 y/o sus sales fisiológicamente tolerables, para usar para tratar enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, infarto de miocardio, síndrome coronario agudo, ataque de apoplejía, restenosis, diabetes, daño en trasplantes de órganos, enfermedades inmunitarias, enfermedades autoinmunes, crecimiento de tumor, metástasis de tumor, malaria, cardioprotección o profilaxis secundaria del ataque de apoplejía.
16. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 8 y/o sus sales fisiológicamente tolerables, para usar como inhibidores en la adhesión y/o migración de leucocitos, o para inhibir el receptor VLA-4.
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