ES2240959T3 - Conjugados tioeter. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN COMPUESTOS DE MEDICAMENTOS/LIGANDOS DE LA FORMULA (I) EN LA QUE D ES UNA PARTE DEL MEDICAMENTO; N ES UN ENTERO DE 1 A 10; P ES UN ENTERO DE 1 A 6; Y ES O O NH2+C1-; Z ES 0 O 1; Q ES CASI 1 HASTA CASI 10; X ES UN LIGANDO; A ES UN ADUCTO DE ADICION MICHAEL. EN UNA REALIZACION PREFERIDA, EL LIGANDO ES UNA INMUNOGLOBULINA, CON PREFERENCIA UN ANTICUERPO QUIMERICO O FRAGMENTO DE EL. TAMBIEN SE DESCRIBEN FORMULACIONES QUE COMPRENDEN COMO UN INGREDIENTE ACTIVO UN COMPUESTO DE LA FORMULA (I), INTERMEDIOS UTILES PARA PREPARAR LOS COMPUESTOS DE LA FORMULA (I), PROCESOS PARA PREPARAR LOS COMPUESTOS DE LA FORMULA (I), Y METODOS PARA USAR LOS COMPUESTOS DE LA INVENCION.
Description
Conjugados tioéter.
La presente invención se refiere a conjugados
tioéter, formulaciones farmacéuticas que comprenden dichos
conjugados, su uso para tratar enfermedades neoplásicas, un
procedimiento para preparar dichos conjugados y compuestos
intermediarios útiles para la preparación de conjugados tioéter.
Se conocen compuestos bifuncionales que unen
reactivos citotóxicos a anticuerpos. Estos compuestos han sido
particularmente útiles en la formación de inmunoconjugados dirigidos
frente a antígenos asociados a tumor. Dichos inmunoconjugados
permiten el suministro selectivo de fármacos tóxicos a células
tumorales. (Véase por ejemplo, Hermentin y Seiler, "Investigation
With Monoclonal Antibody Drug Conjugates", Behring Insti.
Mitl. 82:197-215 (1998); Gallego y col.
"Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal
Antibody 791T/36 Conjugates With Anti-Tumor
Activity". Int. J. Cancer 33:737-44
(1984); Arnon y col., "In Vitro and In Vivo
Efficacy of Conjugates of Daunomycin with Anti-Tumor
Antibodies, "Immunological Rev. 62:5-27
(1982) documento EP 0 169 111 A1; documento EP 0 306 943 A2;
documento EP 0 296 188 A2.
Greenfield y col. han descrito
recientemente la formación de inmunoconjugados sensibles a ácido que
contiene el compuesto acilhidrazina,
3-(2-piridil-ditio)propionil
hidrazida conjugado mediante un enlace acilhidrazona en la posición
13-ceto de una molécula de antraciclina, y la
conjugación de este derivado de antraciclina con su molécula de
anticuerpo (documento EP 0 398 305 A2; Greenfield y col.,
Publicación de Patente Europea EP 0 328 147 A2, publicada el 16 de
agosto de 1989, que corresponde el documento de Estados Unidos en
trámite Nº de serie 07/270.509, presentado el 16 de noviembre de
1988 y el documento de Estados Unidos Nº de serie 07/155.181,
presentado el 11 de febrero de 1988, abandonado ahora). Esta última
referencia también describe engarces y conjugados específicos que
contienen tioéter, incluyendo inmunoconjugados que contienen tioéter
de hidrazona.
Kaneko y col. (documento de Estados Unidos
Nº de serie 07/522.996, presentado el 14 de Mayo de 1990, que es
equivalente a la Publicación de Patente Europea EP A 0 457 250 A2,
publicada el 21 de noviembre de 1991) también ha descrito la
formación de conjugados que contienen antibióticos de antraciclina
unidos a un engarce bifuncional por un enlace acilhidrazona en la
posición C-13 de una molécula de antraciclina. En su
invención los engarces contienen un grupo reactivo piridinilditio- u
orto-nitrofenilditio-, por el cual el engarce reacciona con
un grupo apropiado unido a un ligando reactivo celular, para formar
el conjugado completo.
Podría ser útil proporcionar compuestos
adicionales que contienen un enlace sensible a ácido entre las
moléculas de marcaje y reactivo para su uso en terapia in
vivo. Por tanto, la presente invención proporciona una nueva
química para unir una molécula de fármaco terapéuticamente activa a
un ligando capaz de reconocer una población celular diana
seleccionada. Esta química de engarce después se usa parar preparar
conjugados terapéuticamente activos. También se proporcionan por la
invención formulaciones que contienen los conjugados, un
procedimiento para preparar un conjugado de la invención, el uso de
los conjugados para preparar composiciones farmacéuticas para tratar
o prevenir una patología seleccionada que comprende administrar a un
paciente un conjugado de la invención. También se describe un
procedimiento para preparar un anticuerpo reducido que es útil como
ligando de marcaje para su uso en la preparación de un conjugado de
la invención.
De acuerdo con la invención cada molécula de
fármaco se une al ligando mediante un brazo de engarce que contiene
tioéter. El fármaco se une a ese engarce a través de un enlace
acilhidrazona. El enlace tioéter se crea por reacción de un grupo
sulfhidrilo en el ligando, o en un resto "espaciador" corto
unido al ligando, con un "Receptor de Adición de Michael" que
se convierte, después de la reacción, en un "Aducto de Adición de
Michael". En una realización preferida, el ligando de marcaje se
une directamente al engarce a través de un enlace tioéter
covalente.
El nuevo conjugado formado de este modo tiene la
estructura general de Fórmula (Ia):
en la
que
R_{1} es -CH_{3}, -CH_{2}OH,
-CH_{2}OCO(CH_{2})_{3}CH_{3} o -CH_{2}OCOCH
(OC_{2}H_{5})_{2};
R_{3} es -OCH_{3}, -OH o hidrógeno;
R_{4} es -NH_{2}, -NHCOCF_{3},
4-morfolinilo,
3-ciano-4-morfolinilo,
1-piperidinilo,
4-metoxi-1-piperidinilo,
bencilamina, dibencilamina, cianometilamina o
1-ciano-2-metoxietilamina;
R_{5} es -OH, -OTHP o hidrógeno;
R_{6} es -OH o hidrógeno, a condición de que
R_{6} no sea -OH cuando R_{5} es -OH u -OTHP;
n es un número entero de 1 a 10;
p es un número entero de 1 a 6;
Y es O o NH_{2}^{+}Cl^{-};
z es 0 ó 1;
q es 1 a 10; y,
X es un ligando.
En una realización el resto de fármaco es un
antibiótico de antraciclina y el ligando es un anticuerpo.
La antraciclina se une a la porción engarce del
conjugado a través de un enlace acilhidrazona en la posición
13-ceto del compuesto de antraciclina. El anticuerpo
después se une, a través del engarce, al compuesto de antraciclina.
En una realización especialmente preferida, esta unión sucede a
través de un grupo disulfuro reducido (es decir, un grupo
sulfhidrilo libre (-SH)) en un anticuerpo.
En una realización más preferida el resto de
fármaco de antraciclina es adriamicina, el Receptor de Adición de
Michael, a partir del cual se obtiene el Aducto de Adición de
Michael, es un grupo maleimido-, y el resto de anticuerpo es un
anticuerpo quimérico.
Los conjugados de la invención mantienen tanto la
especificidad como actividad del fármaco terapéutico para el
tratamiento de una población celular diana seleccionada. Pueden
usarse en una composición farmacéutica, tal como una que comprenda
una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula
(Ia) asociado con un vehículo, diluyente o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
La Figura 1(a) proporciona un esquema
sintético para la preparación de un anticuerpo tiolado usando SPDP
como agente de tiolación.
La Figura 1(b) proporciona un esquema
sintético para la preparación de un inmunoconjugado de la invención
en el que el ligando es un anticuerpo tiolado con SPDP.
La Figura 1(c) proporciona un esquema
sintético para la preparación de un inmunoconjugado de la invención
en el que el ligando es un anticuerpo tiolado con iminotiolano.
La Figura 2 muestra un procedimiento para reducir
don DTT un anticuerpo para preparar un anticuerpo "relajado" y
síntesis de un inmunoconjugado de la invención.
La Figura 3 proporciona datos de actividad
citotóxica in vitro para conjugados
BR64-Adriamicina de la invención frente a tumores
L2987.
La Figura 4 proporciona datos de actividad
citotóxica in vivo para conjugados
BR64-Adriamicina de la invención frente a tumores
L2987.
La Figura 5 proporciona datos de actividad
citotóxica in vivo comparativos para terapia de combinación
usando BR64, Adriamicina y un conjugado de no unión
(SN7-Adriamicina).
La Figura 6 proporciona datos de actividad
citotóxica in vivo para conjugados
Bombesina-Adriamicina de la invención frente a
tumores H345.
\newpage
La Figura 7 proporciona datos de actividad
citotóxica in vitro para conjugados de Adriamicina de BR96
quimérico relajado y BR96 quimérico tiolado con SPDP.
La Figura 8 proporciona datos de actividad
citotóxica in vivo para conjugados de Adriamicina de BR64
relajado y L6 quimérico relajado frente a tumores L2987.
Las Figuras 9 a 11 proporcionan datos de
actividad citotóxica in vivo para conjugados de Adriamicina
de BR96 quimérico relajado frente a tumores L2987 en comparación con
Adriamicina libre y conjugados de no unión.
La Figura 12 proporciona datos de actividad
citotóxica in vivo para conjugados de Adriamicina de BR96
quimérico relajado frente a tumores de mama humanos MCF7.
La Figura 13 proporciona datos de actividad
citotóxica in vivo para conjugados de Adriamicina de BR96
quimérico relajado frente a tumores de colon humano RCA.
La Figura 14 proporciona un gráfico del efecto en
el título de -SH como función de la proporción molar de DTT a
anticuerpo en la preparación, en una atmósfera inerte, de un
anticuerpo relajado.
La siguiente descripción detallada se proporciona
para que la invención se pueda entender completamente.
La presente invención proporciona nuevos
conjugados de fármaco compuestos de un ligando capaz de marcar una
población de células seleccionada, un fármaco, y un engarce que
contiene tioéter que se une al ligando y al fármaco. El fármaco se
une al engarce a través de un enlace acilhidrazona. En una
realización preferida, el ligando se une directamente al engarce a
través de un enlace tioéter. Normalmente, este enlace se creará por
reacción de un grupo sulfhidrilo (-SH) reactivo en el ligando, o en
un resto espaciador (por ejemplo, uno obtenido de la química SPDP o
iminotiolano descrita a continuación) con un Receptor de Adición de
Michael.
La invención también proporciona procedimientos
para la producción de estos conjugados de fármaco y composiciones
farmacéuticas y procedimientos para suministrar los conjugados a
células diana en las que se desea una modificación en el
procedimiento biológico, tal como en el tratamiento de enfermedades
tales como cáncer, infecciones virales u otras infecciones
patogénicas, trastornos autoinmunes, u otras patologías.
Los conjugados comprenden al menos una molécula
de fármaco conectada por un engarce de la invención a una molécula
ligando de marcaje que es reactiva con la población celular diana
deseada. La molécula ligando puede ser una proteína inmunorreactiva
tal como un anticuerpo, o fragmento del mismo, una proteína no
inmunorreactiva o un ligando peptídico tal como bombesina o un
ligando de unión que reconoce un receptor asociado a la célula tal
como una lectina o molécula esteroide.
Como se ha observado previamente, un conjugado de
la invención se representa por la Fórmula general (Ia).
Los conjugados particulares de la invención se
representan por la Fórmula (Ib):
en la
que
n es un número entero de 1 a 10;
q es de 1 a 10; y
x se define como en este documento;
en la
que
q es de 4 a 8; y
x se define como en este documento; y
en la que q es de 4 a 8 e Ig es un
anticuerpo BR96 quimérico relajado, o un fragmento del
mismo.
Para una mejor interpretación de la invención,
los fármacos y ligandos se analizarán individualmente. Los
intermediarios usados para la preparación de los conjugados y la
síntesis de los conjugados se explicarán después.
Un especialista en la técnica entiende que la
presente invención requiere que el fármaco y el ligando se unan por
medio de un enlace acilhidrazona, a través de un Aducto de Adición
de Michael y un engarce que contiene tioéter. No se pretende que ni
el fármaco específico ni el ligando específico limiten la presente
invención. Los engarces de la presente invención pueden usarse con
cualquier fármaco que tenga cualquier propósito terapéutico, de
modificación de la actividad biológica o profiláctico deseado,
limitado sólo en que el fármaco usado para preparar el conjugado sea
capaz de formar un enlace hidrazona. Preferiblemente, para preparar
la hidrazona, el fármaco debe tener un grupo carbonilo disponible de
forma reactiva, tal como, por ejemplo, un resto aldehído o cetona
reactivo que sea capaz de formar una hidrazona (es decir, un enlace
-C=N-NH). Además, la reacción de ese grupo
disponible de manera reactiva con el engarce preferiblemente no debe
destruir la actividad terapéutica final del conjugado, sea la
actividad el resultado del fármaco a suministrar en el sitio deseado
de acción o sea el conjugado intacto, en sí mismo, el responsable de
dicha actividad.
Un especialista en la técnica entiende que para
los fármacos que carecen de un grupo carbonilo disponible de manera
reactiva, puede prepararse un derivado que contenga dicho grupo
carbonilo usando procedimientos conocidos en la técnica. Como se
puede apreciar, el conjugado preparado a partir de dicho fármaco
derivado debe mantener la actividad terapéutica cuando está presente
en el sitio activo, sea debido al conjugado intacto, o a otra cosa.
Como alternativa, el fármaco derivado o, por ejemplo, un profármaco,
debe suministrarse en una forma tal que esté presente una forma
terapéuticamente activa del fármaco en el sitio activo.
Los conjugados de fármaco construidos de este
modo son eficaces para los propósitos habituales para los que los
fármacos correspondientes son eficaces, y tiene una eficacia
superior a causa de la capacidad, inherente en el ligando, de
transportar el fármaco a la célula deseada donde es de particular
beneficio.
Los fármacos para su uso en la presente invención
son fármacos citotóxicos. Los preferidos son los que se usan para
terapia de cáncer. Los miembros particularmente útiles de esas
clases incluyen, por ejemplo, adriamicina, carminomicina y
daunorrubicina. Como se ha observado previamente, un especialista en
la técnica puede hacer modificaciones químicas al compuesto deseado
para hacer reacciones de ese compuesto más adecuadas para propósitos
de preparación de conjugados de la invención.
Un grupo preferido de agentes citotóxicos para su
uso como fármacos en la presente invención incluye fármacos de los
antibióticos de antraciclina de la siguiente Fórmula (11):
en la
que
R_{1} es -CH_{3}, -CH_{2}OH,
-CH_{2}OCO(CH_{2})_{3}CH_{3} o -CH_{2}OCOCH
(OC_{2}H_{5})_{2}
R_{3} es -OCH_{3}, -OH o -H
R_{4} es -NH_{2}, -NHCOCF_{3},
4-morfolinilo,
3-ciano-4-morfolinilo,
1-piperidinilo,
4-metoxi-1-piperidinilo,
bencilamina, dibencilamina, cianometilamina,
1-ciano-2-metoxietilamina
R_{5} es -OH, -OTHP, o -H; y,
R_{6} es -OH o -H a condición de que R_{6} no
sea -OH cuando R_{5} es -OH u OTHP.
Un especialista en la técnica entiende que esta
fórmula estructural incluye compuestos que son fármacos, o son
derivados de fármacos, que han adquirido en la técnica diferentes
nombres genéricos o triviales. La tabla I, a continuación,
representa varios fármacos de antraciclina y sus nombres genéricos o
triviales y que son especialmente preferidos para su uso en la
presente invención.
De los compuestos mostrados en la Tabla I, el
fármaco más altamente preferido es adriamicina. La adriamicina
(también mencionada en este documento como "ADM") es una
antraciclina de Fórmula (11) en la que R_{1} es -CH_{2}OH,
R_{3} es -OCH_{3}, R_{4} es -NH_{2}, R_{5} es -OH, y
R_{6} es -H.
Un especialista en la técnica entiende que
"ligando" incluye en su alcance cualquier molécula que se una
específicamente o se asocie de manera reactiva o se compleje con un
receptor u otro resto receptivo asociado a una población celular
diana dada. Esta molécula reactiva celular, a la que el reactivo de
fármaco se une mediante el engarce en el conjugado, puede ser
cualquier molécula que se una a, se compleje con o reaccione con la
población celular buscada para modificarla terapéuticamente o
biológicamente de otra manera y, que tenga un grupo sulfhidrilo
(-SH) reactivo libre o pueda modificarse para que contenga uno de
dichos grupos sulfhidrilo. La molécula reactiva de células funciona
para suministrar el resto de fármaco terapéuticamente activo a la
población celular diana particular con la que reacciona el ligando.
Dichas moléculas incluyen, aunque sin limitación, proteínas de gran
peso molecular (generalmente más de 10.000 dalton) tales como, por
ejemplo, anticuerpos, proteínas de peso molecular más pequeño
(generalmente, menos de 10.000 dalton), ligandos polipeptídicos o
peptídicos, y ligandos no peptídicos.
La proteína, polipéptido, o ligandos peptídicos
no inmunorreactivos que pueden usarse para formar los conjugados de
esta invención pueden incluir, aunque sin limitación, transferrina,
factores de crecimiento epidérmico ("EGF"), bombesina,
gastrina, péptido de liberación de gastrina, factor de crecimiento
derivado de plaquetas, IL-2, IL-6,
factores de crecimiento tumoral ("TGF"), tales como
TGF-\alpha y TGF-\beta, el
factor de crecimiento vaccinia ("VGF"), insulina y factores de
crecimiento I y II tipo insulina. Los ligandos no peptídicos pueden
incluir, por ejemplo, esteroides carbohidratos y lectinas.
Los ligandos inmunorreactivos comprenden una
inmunoglobulina de reconocimiento de antígeno (también mencionada
como "anticuerpo"), o un fragmento de reconocimiento de
antígeno de la misma. Las inmunoglobulinas particularmente
preferidas son las inmunoglobulinas que pueden reconocer un antígeno
asociado a tumor. Como se usa, "inmunoglobulina" puede
referirse a cualquier clase o subclase reconocida de
inmunoglobulinas tal como IgG, IgA, IgM, IgD, o IgE. Las
inmunoglobulinas preferidas son las que se encuentran en la clase
IgG de inmunoglobulinas. La inmunoglobulina puede obtenerse de
cualquier especie. Preferiblemente, sin embargo, la inmunoglobulina
es de origen humano, murino, o de conejo. Además, la inmunoglobulina
puede ser policlonal o monoclonal, preferiblemente monoclonal.
Como se observa, un especialista en la técnica
apreciará que la invención también abarca el uso de fragmentos de
inmunoglobulina de reconocimiento de antígeno. Dichos fragmentos de
inmunoglobulina pueden incluir, por ejemplo, los fragmentos Fab',
F(ab')_{2}, F_{v} o Fab, u otros fragmentos de
inmunoglobulina de reconocimiento de antígeno. Dichos fragmentos de
inmunoglobulina pueden preparase, por ejemplo, por digestión con
enzimas proteolíticas, por ejemplo, por digestión con pepsina o
papaína, alquilación reductora, o técnicas recombinantes. Los
materiales y procedimientos para preparar dichos fragmentos de
inmunoglobulina son bien conocidos por los especialistas en la
técnica. Véase, en líneas generales, Parham, J. Immunology,
131, 2895 (1983); Lamoyi y col., J. Immunological
Methods, 56, 235 (1983); Parham, id., 53,
133 (1982); y Matthew y col., id., 50, 239
(1982).
La inmunoglobulina puede ser un "anticuerpo
quimérico" como se reconoce ese término en la técnica. Además, la
inmunoglobulina puede ser un anticuerpo "bifuncional" o
"híbrido", es decir, un anticuerpo que puede tener un brazo que
tiene una especificidad para un sitio antigénico, tal como un
antígeno asociado a tumor mientras que el otro brazo reconoce una
diana diferente, por ejemplo, un hapteno que es, o al que se une, un
agente letal para la célula tumoral que contiene el antígeno. Como
alternativa, el anticuerpo bifuncional puede ser uno en el que cada
brazo tenga especificidad para un epítopo diferente de un antígeno
asociado a tumor de la célula a modificar terapéutica o
biológicamente. En cualquier caso, los anticuerpos híbridos tienen
una especificidad dual, preferiblemente con uno o más sitios de
unión específicos para el hapteno de elección de uno o más sitios de
unión específicos para un antígeno diana, por ejemplo, un antígeno
asociado a un tumor, un organismo infeccioso, u otra patología.
Los anticuerpos bifuncionales biológicos se
describen, por ejemplo, en la Publicación de Patente Europea EPA 0
105 360, al que se remite a los especialistas en la técnica. Dichos
anticuerpos híbridos o bifuncionales pueden obtenerse, como se ha
observado, biológicamente, por técnicas de fusión celular, o
químicamente, especialmente con agentes entrecruzantes o reactivos
de formación de puentes disulfuro, y pueden estar comprendidos de
anticuerpos completos y/o fragmentos de los mismos. Los
procedimientos para obtener dichos anticuerpos híbridos se
describen, por ejemplo, en la Solicitud PCT WO083/03679, publicada
el 27 de octubre de 1983, y la Solicitud Europea Publicada EPA 0 217
577, publicada el 8 de abril de 1987, ambas cuales se incorporan en
este documento como referencia. Los anticuerpos bifuncionales
particularmente preferidos son los preparados biológicamente a
partir de un "polidoma" o "cuadroma" o que se preparan
sintéticamente con agentes entrecruzantes tales como
bis-(maleimido)-metil éter ("BMME"), o con
otros agentes entrecruzantes familiares para los especialistas en la
técnica.
Además, la inmunoglobulina puede ser un
anticuerpo de única cadena ("SCA"). Estos pueden constar de
fragmentos Fv de cadena única ("scFv") en los que le dominio
ligero variable ("V_{L}") y el dominio pesado variable
("V_{H}") están unidos por un enlace peptídico o por enlaces
disulfuro. Además, la inmunoglobulina puede constar de dominios
V_{H} únicos (sAb) que tienen actividad de unión a antígeno.
Véase, por ejemplo, G. Winter y C. Milstein, Nature,
349, 295 (1991); R. Glockshuber y col.,
Biochemistry 29, 1362 (1990); y, E. S. Ward y
col., Nature 341, 544 (1989).
Se prefieren especialmente anticuerpos
monoclonales quiméricos para su uso en la presente invención,
preferiblemente los anticuerpos quiméricos que tienen especificidad
para un antígeno asociado a tumor. Como se usa en este documento, el
término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo
monoclonal que comprende una región variable, es decir, región de
unión, de una fuente o especia y al menos una porción de una región
constante obtenida de una fuente o especie diferente, habitualmente
preparado por técnicas de AND recombinante. Los anticuerpos
quiméricos que comprenden una región variable murina y una región
constante humana se prefieren especialmente en ciertas aplicaciones
de la invención, particularmente terapia humana, porque dichos
anticuerpos se preparan fácilmente y pueden ser menos inmunogénicos
que los anticuerpos monoclonales totalmente murinos. Dichos
anticuerpos quiméricos murinos/humanos son el producto de genes de
inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que
codifican regiones variables de inmunoglobulina murina y segmentos
de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina humana.
Otras formas de anticuerpos quiméricos incluidos por la presente
invención son aquellas en las que la clase o subclase se ha
modificado o cambiado a partir de la del anticuerpo original. Dichos
anticuerpos "quiméricos" también se mencionan como
"anticuerpos de clase cambiada". Los procedimientos para
producir anticuerpos quiméricos implican técnicas de ADN
recombinante y transfección génica convencionales bien conocidos
ahora en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, S. L, y
col., Proc. Nat'l Acad. Sci., 81, 6851 (1984).
El término "anticuerpo quimérico" abarca el
concepto de "anticuerpo humanizado" que es aquellos anticuerpos
en los que las regiones flanqueantes o determinantes de
complementariedad ("CDR") se han modificado para comprender el
CDR de una inmunoglobulina de diferente especificidad en comparación
con la de la inmunoglobulina parental. En una realización preferida,
se injerta un CDR murino en la región flanqueante de un anticuerpo
humano para preparar el "anticuerpo humanizado". Véase, por
ejemplo, L. Riechmann y col., Nature 332, 323 (1988);
M. S. Neuberger y col., Nature 314, 268 (1985).
Los CDR particularmente preferidos corresponden a los que
representan secuencias de reconocimiento de antígenos observados
anteriormente para los anticuerpos quiméricos y bifuncionales. Se
hace referencia al contenido del documento EPA 0 239 400 (publicado
el 30 de septiembre de 1987), incorporado en este documento como
referencia, por su contenido de anticuerpos de CDR modificado.
Un especialista en la técnica reconocerá que un
anticuerpo quimérico bifuncional puede prepararse para que tenga los
beneficios de inmunogenicidad más baja del anticuerpo quimérico o
humanizado, así como la flexibilidad, especialmente para el
tratamiento terapéutico, de los anticuerpos bifuncionales descritos
anteriormente. Dichos anticuerpos bifuncionales quiméricos pueden
sintetizarse, por ejemplo, por síntesis química usando agentes de
entrecruzamiento y/o procedimientos recombinantes del tipo descrito
anteriormente. En cualquier caso, la presente invención no debe
entenderse como limitada en el alcance por ningún procedimiento
particular de producción de un anticuerpo sea bifuncional,
quimérico, quimérico bifuncional, humanizado, o un fragmento de
reconocimiento de antígeno o derivado de los mismos.
Además, la invención abarca en su alcance
inmunoglobulina (como se ha definido anteriormente) o fragmentos de
inmunoglobulina a los que se fusionan proteínas activas, por
ejemplo, una enzima del tipo descrito en Neuberger, y col.,
Solicitud PCT, WO86/01533, publicada el 13 de marzo de 1986. La
descripción de dichos productos se incorpora en este documento como
referencia.
Como se ha observado, las construcciones de
anticuerpo "bifuncional", "fusionado", "quimérico"
(incluyendo humanizado), y "quimérico bifuncional" (incluyendo
humanizado) también incluyen, en sus contextos individuales
construcciones que comprenden fragmentos de reconocimiento de
antígeno. Como un especialista en la técnica reconocerá, dichos
fragmentos podrían prepararse por escisión enzimática tradicional de
anticuerpos bifuncionales, quiméricos, humanizados, o quiméricos
bifuncionales intactos. Si, sin embargo, los anticuerpos intactos no
son susceptibles de dicha escisión, a causa de la naturaleza de la
construcción implicada, las construcciones observadas pueden
prepararse con fragmentos de inmunoglobulina usados como materiales
de partida; o, si se usan técnicas recombinantes, las secuencias de
ADN, en sí mismas, pueden adaptarse para que codifiquen el
"fragmento" deseado que, cuando se expresa, pueden combinarse
in vivo o in vitro, por un medio químico o biológico,
para preparar el "fragmento" de inmunoglobulina intacta deseado
final. Por lo tanto, es en este contexto en el que se usa el término
"fragmento".
Además, como se ha observado anteriormente, la
inmunoglobulina (anticuerpo) o fragmento de la misma, usada en la
presente invención puede ser de naturaleza policlonal o monoclonal.
Sin embargo, los anticuerpos monoclonales son las inmunoglobulinas
preferidas. La preparación de dichos anticuerpos policlonales o
monoclonales ahora es bien conocida por los especialistas en la
técnica que, por su puesto, son completamente capaces de producir
inmunoglobulinas útiles que pueden usarse en la invención. Véase,
por ejemplo, G. Kohler y C. Milstein, Nature 256, 459
(1975). Además, están disponibles al público hibridomas y/o
anticuerpos monoclonales que se producen por dichos hibridomas y que
son útiles en la práctica de la presente invención a partir de
fuentes tales como la American Type Culture Collection ("ATCC")
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 o, en el mercado,
por ejemplo, de Boehringer-Mannheim Biochemicals,
P.O. Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250.
Los anticuerpos monoclonales particularmente
preferidos para su uso en la presente invención son los que
reconocen antígenos asociados a tumor. Dichos anticuerpos
monoclonales, no son, sin embargo, para limitar, y pueden incluir,
por ejemplo, los siguientes:
En la realización más preferida, el conjugado que
contiene ligando se obtiene de anticuerpo quimérico BR96,
"ChiBR96", descrito en el documento de Estados Unidos Nº de
serie 07/544.246, presentado el 26 de junio de 1990, y que es
equivalente a la Solicitud Publicada PCT, WO 91/00295, publicada el
10 de enero de 1991. ChiBR96 es un anticuerpo quimérico
murino/humano de internalización y es reactivo, como se ha
observado, con el antígeno Y de Lewis fucosilado expresado por
células de carcinoma humano tales como las obtenidas de carcinomas
de mama, pulmón, colon y ovario. El hibridoma que expresa BR96
quimérico e identificado como ChiBR96 se depositó el 23 de mayo de
1990, en los términos del tratado de Budapest, en la American Type
Culture Collection ("ATCC"), 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852. Las muestras de este hibridoma están disponibles con
el número de acceso ATCC HB 10460. ChiBR96 se obtiene, en parte, de
su fuente parental, BR96. El hibridoma que expresa BR96 se depositó,
el 21 de febrero de 1989, en la ATCC, en los términos del tratado de
Budapest, y está disponible con el número de acceso HB 10036. El
hibridoma deseado se cultiva y los anticuerpos resultantes se aíslan
del sobrenadante del cultivo celular usando técnicas convencionales
bien conocidas ahora en la técnica. Véase, por ejemplo,
"Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications",
Hurell (ed.) (CRC Press, 1982).
En otra realización altamente preferida el
inmunoconjugado se obtiene del anticuerpo monoclonal murino BR64
descrito en los documentos de Estados Unidos Nº de serie 07/289.635,
presentado el 22 de diciembre de 1988, y, 07/443.696, presentado el
29 de noviembre de 1989, equivalente a la Solicitud Publicada
Europea EP A 0 375 562, publicada el 27 de junio de 1990. Como se ha
observado anteriormente, este anticuerpo también es de
internalización y es reactivo con el antígeno Y de Lewis expresado
por células de carcinoma obtenidas del colon, mama, ovario y pulmón
humano. El hibridoma que expresa anticuerpo BR64 y se identifica
como BR64 se depositó el 3 de noviembre de 1988, en los términos del
tratado de Budapest, en la ATCC y está disponible con el número de
acceso HB 9895. El hibridoma se cultiva y el anticuerpo deseado se
aísla usando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica,
tales como las mencionadas anteriormente.
En un tercera realización altamente preferida, un
inmunoconjugado de la invención se obtiene del anticuerpo monoclonal
murino L6 descrito en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.906.562
expedida el 6 de marzo de 1990, y 4.935.495, expedida el 19 de Junio
de 1990. L6 es un anticuerpo de no internalización activo frente a
un antígeno de gangliósido expresado por células de carcinoma
humanas obtenidas de carcinomas de pulmón de células no pequeñas, de
mama, colon u ovario humano. El hibridoma que expresa L6 e
identificado como L6 se depositó en los términos del tratado de
Budapest el 6 de diciembre de 1984 en la ATCC y está disponible con
el número de acceso HB 8677. El hibridoma se cultiva y el anticuerpo
deseado se aísla usando las técnicas convencionales mencionadas
anteriormente. Una forma quimérica del anticuerpo L6, si se desea,
se describe en el documento de Estados Unidos Nº de serie
07/923.244, equivalente a la Solicitud Publicada PCT WO 88/03145,
publicada el 5 de mayo de 1988.
Por tanto, el modo en que se usa
"inmunoglobulina" o "anticuerpo" abarca en su significado
todas las formas inmunoglobulina/anticuerpo o construcciones
observadas anteriormente.
La invención proporciona como intermediarios
útiles para la preparación de un conjugado de la invención un
Receptor de Adición de Michael y un derivado de fármaco que contiene
acilhidrazona de Fórmula (IIc):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
R_{1} es -CH_{3}, -CH_{2}OH,
-CH_{2}OCO(CH_{2})_{3}CH_{3} o
-CH_{2}OCOCH(OC_{2}H_{5})_{2};
R_{3} es -OCH_{3}, -OH o hidrógeno;
R_{4} es -NH_{2}, -NHCOCF_{3},
4-morfolinilo,
3-ciano-4-morfolinilo,
1-piperidinilo,
4-metoxi-1-piperidinilo,
bencilamina, dibencilamina, cianometilamina o
1-ciano-2-metoxietilamina
R_{5} es -OH, -OTHP o hidrógeno;
R_{6} es -OH o hidrógeno, a condición de que
R_{6} no sea -OH cuando R_{5} es -OH o u -OTHP; Y
n es un número entero de 1 a 10.
También se usa como intermediario de la invención
un ligando de marcaje que contiene un grupo sulfhidrilo reactivo
libre. El grupo sulfhidrilo puede estar contenido en el ligando de
marcaje nativo o puede obtenerse directamente del ligando o de una
forma derivada del ligando. En el procedimiento preferido para
preparar los conjugados de la invención, un grupo sulfhidrilo del
ligando o ligando modificado reacciona directamente con el Receptor
de Adición de Michael del intermediario de Fórmula (IIc) para formar
el conjugado final. Usando este procedimiento, pueden unirse
generalmente entre aproximadamente una y aproximadamente diez
moléculas de fármaco a cada ligando. Por tanto, en la Fórmula (Ia),
q puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.
Cuando se forma el conjugado, la porción del
Receptor de Adición de Michael se convierte en un "Aducto de
Adición de Michael", como se usa en este documento. Por tanto,
por ejemplo, como apreciará un especialista en la técnica, como el
resto de Receptor de Adición de Michael en el compuesto de Fórmula
(IIc) es un resto maleimido, la porción "Aducto de Adición de
Michael" correspondiente del conjugado final de Fórmula (I) será
un resto succinimido. Por tanto, un "Aducto de Adición de
Michael" se refiere a un resto que podría obtenerse de un
Receptor de Adición de Michael, o como se define con más detalle a
continuación, que ha experimentado una reacción de Adición de
Michael.
Por tanto, en una realización adicional de la
invención, se proporciona un procedimiento para preparar un
compuesto de Fórmula (Ia), como se ha definido anteriormente, que
comprende hacer reaccionar un compuesto de Fórmula (IIc), como se ha
definido anteriormente, con un ligando que contiene, o está
modificado o derivado para que contenga, un grupo sulfhidrilo
reactivo, y si se desea, asilar el producto. Este es el
procedimiento preferido para preparar los compuestos de Fórmula
(Ia). Como alternativa, los compuestos de Fórmula (Ia) podrían
prepararse haciendo reaccionar directamente el fármaco, o fármaco
modificado, con la porción engarce de acilhidrazida unido ya de
manera covalente al ligando, ligando modificado, o ligando derivado.
En particular, se proporciona un procedimiento para preparar un
conjugado de la presente invención que comprende:
(a) hacer reaccionar un compuesto de Fórmula
(IIc):
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{1}, R_{3},
R_{4}, R_{5}, R_{6} y n se ha definido como
anteriormente
con un compuesto de Fórmula (III):
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X, p, Y, z y q son como
se ha definido anteriormente;
o
(b) hacer reaccionar un compuesto de Fórmula
(11):
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{1}, R_{3},
R_{4}, R_{5}, R_{6} y n son como se han definido
anteriormente
con un compuesto de Fórmula (IVb):
en la que n, X, p, Y, z y q son
como se ha definido anteriormente; y, si se desea, asilar el
producto.
Un especialista en la técnica entiende que en la
síntesis de compuestos de la invención, se puede necesitar proteger
o bloquear diversas funcionalidades reactivas en los compuestos de
partida e intermediarios mientras se realiza una reacción deseada en
otras porciones de la molécula. Después de que se completen las
reacciones deseadas, o en cualquier momento deseado, normalmente
dichos grupos de protección se retiraran por, por ejemplo medios
hidrolíticos o hidrógenolíticos. Dichas etapas de protección y
desprotección son convencionales en química orgánica. Un
especialista en la técnica se remite a Protective Groups in
Organic Chemistry, McOmie, ed., Pelnum Press, N.Y., N.Y.,
(1973); y, Protective Groups in Organic Synthesis, Greene,
ed., John Wiley & Sons, Nueva York, Nueva York, (1981) para el
contenido de grupos de protección que pueden ser útiles en la
preparación de compuestos de la presente
invención.
invención.
Sólo a modo de ejemplo, los grupos de protección
de amino pueden incluir, por ejemplo, grupos alcanoílo
C_{1}-C_{10} tales como formilo, acetilo,
dicloroacetilo, propionilo, hexanoílo,
3,3-dietilhexanoílo,
\gamma-clorobutirilo, y similares; grupos
alcoxicarbonilo C_{1}-C_{10} y ariloxicarbonilo
C_{5}-C_{15} tales como
terc-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, aliloxicarbonilo,
4-nitro-benciloxicarbonilo y
cianomoiloxicarbonilo; haloalcoxicarbonilo
C_{1}-C_{10} tal como
2,2,2-tricloroetoxicarbonilo; y aralquilo
C_{1}-C_{15} y grupos alquenilo tales como
bencilo, fenetilo alilo, tritilo, y similares. Otros grupos de
protección de amino habitualmente usados son los que están en forma
de enaminas preparados con \beta-cetoésteres tales
como metil o etil acetoacetato.
Los grupos de protección de carboxi útiles pueden
incluir, por ejemplo, grupos alquilo
C_{1}-C_{10} tales como metilo,
terc-butilo, decilo; halo alquilo
C_{1}-C_{10} tal como
2,2,2-tricloroetilo, y 2-yodoetilo;
aralquilo C_{5}-C_{15} tal como bencilo,
4-metoxibencilo, 4-nitrobencilo,
trifenilmetilo, difenilmetilo; alcanoiloxi metilo
C_{1}-C_{10} tal como acetoximetilo,
propionoximetilo y similares; y grupos tales como fenacilo,
4-halofenacilo, alilo, dimetilalilo,
tri(alquil C_{1}-C_{3}) sililo, tal como
trimetilsililo, \beta-p-toluenosulfoniletilo,
\beta-p-nitrofenil-tioetilo,
2,4,6-trimetilbencilo,
\beta-metiltioetilo, ftalimidometilo,
2,4-dinitrofenilsulfenilo,
2-nitrobenzohidrilo y grupos relacionados.
De manera similar, los grupos protectores de
hidroxi útiles pueden incluir, por ejemplo, el grupo formilo, el
grupo cloroacetilo, el grupo bencilo, el grupo benzohidrilo, el
grupo tritilo, el grupo 4-nitrobencilo, el grupo
trimetilsililo, el grupo fenacilo, el grupo terc-butilo, el
grupo metoximetilo, el grupo tetrahidropiranilo, y similares.
En general, el intermediario Receptor de Adición
de Michael que contiene derivado de fármaco de hidrazona de Fórmula
(IIc) puede prepararse por reacción del fármaco (o fármaco derivado)
(representado como "[D-(C=O)]") con el Receptor de Adición de
Michael R que contiene una hidrazida del modo general descrito en el
procedimiento A:
Procedimiento
A
Como se aprecia a continuación, el procedimiento
A es el procedimiento preferido de la invención de acuerdo con que
el Receptor de Adición de Michael es un resto maleimido.
Como alternativa, el compuesto de Fórmula (IIc)
puede prepararse por reacción de fármaco con una hidrazida para
formar un intermediario de derivado de fármaco de hidrazona seguido
por la reacción de este compuesto con el Receptor de Adición de
Michael que contiene el resto de acuerdo con el procedimiento
general descrito en el procedimiento B:
\newpage
Procedimiento
B
En el procedimiento A y procedimiento B, el
fármaco D, n y el Receptor de Adición de Michael R tienen los
significados observados previamente. En el procedimiento B, L
representa un grupo saliente, tal como por ejemplo, halógeno,
mesilato o tosilato, capaz de experimentar un desplazamiento
nucleófilo donde C representa un grupo que hace al Receptor de
Adición de Michael, R, un bien reactivo nucleófilo. Los grupos
particularmente útiles representados por C pueden incluir, por
ejemplo, iones de metales alcalinos tales como Na^{+}, K^{+} o
Li^{+}.
Un "Receptor de Adición de Michael", como un
especialista en la técnica entenderá, es un resto capaz de
reaccionar con un reactivo nucleófilo de modo que experimente una
reacción de adición nucleófila característica de una reacción de
Adición de Michael. Como se ha observado, después de que suceda la
adición nucleófila, el resto del Receptor de Adición de Michael se
menciona como "Aducto de Adición de Michael".
Para un análisis general de la reacción de
Adición de Michael, se menciona a E. D. Bergman, D. Ginsberg, y R.
Pappo, Org. React. 10, 179-555 (1959); y D.
A. Oare y C. H. Heathcock, Topics in Stereochemistry, Vol.
20, eds., E. L. Eliel y S. H. Wilen, John Wiley y Sons, Inc. (1991),
y referencias citadas en ellos.
Las condiciones de reacción precisas usadas para
preparar los intermediarios de Fórmula (IIc) dependerán de la
naturaleza del fármaco y el Receptor de Adición de Michael usado en
la reacción. El intermediario de la invención es el representado por
Fórmula (IIc), anterior, en el que el resto del fármaco es un
fármaco de antraciclina y el Receptor de Adición de Michael es un
grupo maleimido. Como se ha observado anteriormente, para esta
reacción, se usa el Procedimiento A, descrito anteriormente. Después
de la reacción con el ligando (tiolado, modificado o de otro modo),
el Receptor de Adición de Michael maleimido del intermediario se
convierte en un grupo succinimido (el "Aducto de Adición de
Michael") en el conjugado final.
Los ligandos que contiene sulfhidrilo existen en
la naturaleza (es decir, el ligando no se ha modificado) o pueden
producirse, por ejemplo, (a) por tiolación del ligando por reacción
con un reactivo de tiolación tal como SMCC o
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato
("SPDP") seguido por reducción del producto; (b) tiolación del
ligando nativo por reacción con iminotiolano ("IMT"); (c)
adición de un resto de aminoácido que contiene sulfhidrilo, por
ejemplo, un resto de cisteína, al ligando debiendo el ligando, por
ejemplo, un péptido proteico o polipéptido, no tener un resto
reactivo y sulfhidrilo disponible; o, (d) reducción de un enlace
disulfuro en una molécula nativa usando un agente reductor útil para
dichos propósitos, por ejemplo, ditiotreitol ("DTT"). El
procedimiento (d) es el procedimiento más preferido para la
producción de grupos sulfhidrilo en moléculas de anticuerpo usadas
en los conjugados de la invención.
Si se usa un reactivo de tiolación tal como SPDP
o iminotiolano para preparar un conjugado de la invención, un
especialista en la técnica apreciará que podrá insertarse un pequeño
resto "espaciador" entre el resto del Receptor de Adición de
Michael y el ligando en el conjugado de Fórmula (Ia). En dicho caso,
z será 1 en el compuesto de Fórmula (Ia). En el caso en el que el
grupo sulfhidrilo libre del ligando se usa directamente, por ejemplo
por uso de un ligando reducido con DTT (particularmente un
anticuerpo "relajado" preparado usando, por ejemplo, DTT), o en
el que un resto reactivo, por ejemplo, cisteína, se inserta en la
porción del ligando de la molécula, z en la Fórmula (Ia) será 0 y
existirá un enlace tioéter directo entre el ligando de unión y la
porción de Adición de Michael de la molécula.
Para formar el conjugado, el ligando tiolado, o
el ligando que tiene un grupo sulfhidrilo reactivo libre, se hace
reaccionar con el Receptor de Adición de Michael que contiene
hidrazona de Fórmula (IIc). En general, las condiciones de reacción
deben elegirse con respecto a la estabilidad del ligando, el fármaco
y la cantidad deseada de restos de fármaco a unir al ligando. Por
ejemplo, un especialista en la técnica apreciará que la cantidad
media de moléculas de fármaco unidas al ligando puede variarse por
(1) modificación de la cantidad del intermediario
fármaco-hidrazona de Fórmula (IIc) en relación con
la cantidad de grupos sulfhidrilo reactivos en el resto del ligando
del conjugado; o, (2) (a) modificar la cantidad de grupos
sulfhidrilo reactivos del ligando reduciendo, por ejemplo, sólo
parcialmente el ligando (en el caso de una proteína, péptido o
polipéptido), (b) insertando una cantidad limitada de, por ejemplo,
restos de cisteína a una proteína, péptido o polipéptido, o (c)
limitando el grado de tiolación usando cantidades inferiores a las
máximas de agentes de tiolación, por ejemplo, SPDP o inminotiolano.
Aunque el título de -SH puede variarse, el nivel preferido de grupos
sulfhidrilo libres, particularmente para un anticuerpo relajado, es
el máximo obtenible usando los reactivos particulares en cuestión.
El grado de variación en el título de -SH se controla fácilmente en
el procedimiento de anticuerpo relajado. Por ejemplo, la Figura 14
muestra el efecto en el título de -SH para anticuerpos BR64 y BR96
quiméricos dependiendo del la proporción molar de DTT al ligando, a
37ºC, durante una reacción de 1,5 horas. Un especialista en la
técnica apreciará que diferentes clases o subclases de
inmunoglobulinas pueden tener diferentes cantidades de puentes
disulfuro susceptibles de reducción por reactivos tales como DTT.
Por tanto, una consideración adicional en la determinación del nivel
deseado de conjugación de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo es
la cantidad de grupos disulfuro disponibles para reducción a grupos
-SH libres. En general, sin embargo, el conjugado preferido de
Fórmula (Ia) tendrá, de media a partir de una reacción dada, de
aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de fármaco por
molécula de ligando. Una proporción molar de fármaco a ligando media
especialmente preferida ("MR") es de aproximadamente 4 a
aproximadamente 8.
Después de que se complete la reacción del
conjugado, el conjugado puede asilarse y purificarse usando
procedimientos de diálisis, cromatografía y/o filtración
habitualmente conocidos. Una solución final que contiene el
conjugado puede generalmente liofilizarse para proporcionar el
conjugado en una forma seca, estable que puede almacenarse de manera
segura y transportarse. El producto liofilizado finalmente puede
reconstituirse con agua estéril u otro diluyente apropiado para
administración. Como alternativa, el producto final puede
congelarse, por ejemplo en nitrógeno líquido, y calentarse y
llevarse a temperatura ambiente antes de la administración.
En una primera realización preferida la hidrazona
antracíclica de Fórmula (IIc) se hace por reacción de la
antraciclina con una maleimido-alquil
(C_{1-}C_{10})hidracida, o una sal del mismo. Esta
reacción se describe en el Procedimiento A, descrito anteriormente.
La reacción generalmente se realiza en dos etapas. Primero se
prepara la maleimido-alquil
(C_{1}-C_{10})hidracida o su sal. Después
de purificación por, por ejemplo, cromatografía y/o cristalización,
la base libre de la hidrazida o la sal se hace reaccionar con la
antraciclina o sal de antraciclina deseada. Después de la
concentración de la solución de reacción, se recoge el producto de
reacción de hidrazona que contiene maleimido de Fórmula (IIc), y si
se desea, se purifica por técnicas de purificación
convencionales.
La hidrazona de Fórmula (IIc) después se hace
reaccionar con un anticuerpo que contiene sulfhidrilo como se ha
descrito anteriormente. Si el anticuerpo se tiola usando, por
ejemplo,
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato
("SPDP"), la reacción de tiolación generalmente se realiza en
dos etapas: (1) Reacción de un grupo amino libre del anticuerpo con
SPDP; y, (2) reducción con DTT del disulfuro SPDP para producir un
grupo -SH libre. En un procedimiento preferido, en el etapa (1) de
la reacción de tiolación, la proporción molar SPDP/anticuerpo varía
de aproximadamente 7,5:1 a aproximadamente 60:1, dependiendo de la
cantidad de grupos sulfhidrilo deseados, con un intervalo preferido
de aproximadamente 7,5:1 a aproximadamente 30:1, especialmente para
BR64, y preferiblemente aproximadamente 20:1 para BR96. La reacción
se realiza entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 50ºC, siendo
la temperatura más preferida de aproximadamente 30ºC. La reacción
puede realizarse a un intervalo de pH entre aproximadamente 6 y
aproximadamente 8 siendo el pH más preferido de aproximadamente 7,4.
La reducción de la etapa (2), usando preferiblemente DTT, se
realiza usando una proporción molar DTT/SPDP de aproximadamente
2,5:1 a aproximadamente 10:1. La proporción molar DTT/SPDP más
preferida es aproximadamente 5:1 y la cantidad de moles de SPDP es
la que se añade en la etapa (1) de la reacción. La reacción
generalmente se realiza de aproximadamente 0ºC a aproximadamente
40ºC, preferiblemente 0ºC y habitualmente se completa después de
aproximadamente 20 minutos. Después de la diálisis y concentración
de la solución del ligando tiolado (un anticuerpo en la realización
mas preferida), se determina la concentración molar de grupos
sulfhidrilo en el ligando y el ligando tiolado se hace reaccionar
con la proporción molar deseada del derivado hidrazona de Fórmula
(IIc) en relación a la cantidad molar de grupos sulfhidrilo
reactivos del ligando. Preferiblemente, la proporción es al menos
aproximadamente 1:1. Esta reacción generalmente se realiza a una
temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 25ºC,
preferiblemente aproximadamente 4ºC. El conjugado resultante después
puede purificarse por procedimientos convencionales. Este esquema de
reacción se describe en las Figuras 1a y 1b.
En una segunda realización preferida, la
hidrazona de Fórmula (IIc) se hace como se ha descrito
anteriormente. La hidrazona después se hace reaccionar, como se
describe en la Figura 1c, con un anticuerpo que se ha tiolado
previamente con iminotiolano ("IMT"). La tiolación del ligando
(preferiblemente un anticuerpo) con IMT generalmente es una reacción
de una etapa. La proporción IMT/anticuerpo puede variar de
aproximadamente 30:1 a aproximadamente 80:1, preferiblemente
aproximadamente 50:1. La reacción se realiza durante aproximadamente
30 minutos a aproximadamente 2 horas, preferiblemente
aproximadamente 30 minutos, a un pH de aproximadamente 7 a
aproximadamente 9,5, preferiblemente a un pH de aproximadamente 9, a
una temperatura de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 40ºC,
preferiblemente aproximadamente 30ºC. El producto de reacción
después se hace reaccionar con la hidrazona de Fórmula (IIc) a una
temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 25ºC,
preferiblemente aproximadamente 4ºC y a un pH de aproximadamente 7 a
aproximadamente 9,5, preferiblemente aproximadamente 7,4. Después el
conjugado se purifica usando procedimientos convencionales en la
técnica, por ejemplo, diálisis, filtración o cromatografía.
En una tercera realización especialmente
preferida el intermediario de hidrazona de Fórmula (IIc) se hace
como se ha descrito anteriormente. Después la hidrazona se hace
reaccionar con un ligando, más preferiblemente, un anticuerpo, en el
que al menos un grupo disulfuro se ha reducido para formar al menos
un grupo sulfhidrilo. Un ligando especialmente preferido es un
"anticuerpo relajado", como se describe a continuación. El
agente reductor preferido para preparar un grupo sulfhidrilo libre
es DTT aunque un especialista en la técnica entenderá que pueden ser
apropiados otros agentes reductores para este propósito.
Un anticuerpo "relajado" es uno en el que
uno o más, o preferiblemente tres o más puntes disulfuro se han
reducido. Más preferiblemente, un anticuerpo relajado es uno en el
que al menos cuatro puentes disulfuro se han reducido. En un
procedimiento preferido para preparar un anticuerpo relajado (es
decir, reducido), la reducción, especialmente con DTT, y la
purificación del producto de reacción, se realiza en ausencia de
oxígeno, en una atmósfera inerte, por ejemplo, en una atmósfera de
nitrógeno o argón. Este procedimiento, como se describe con detalle
a continuación, permite controlar cuidadosamente el grado de
reducción. Por tanto, este procedimiento permite reproducir en
cualquier momento el nivel deseado de reducción de un ligando y, por
lo tanto, la cantidad de grupos -SH libres disponibles para preparar
un conjugado de la invención.
En un procedimiento alternativo, la reacción se
realiza en condiciones ambientales, sin embargo, se usa una cantidad
suficientemente grande de agente reductor, preferiblemente DTT, para
evitar cualquier reoxidación de los enlaces disulfuro reducidos que
pueda suceder. En cualquier caso, la purificación del producto, se
realiza tan pronto como es posible después de que se complete la
reacción y más preferiblemente en una atmósfera inerte tal como una
atmósfera de argón o nitrógeno. El procedimiento preferido para
preparar el ligando que contiene sulfhidrilo libre, sin embargo, es
el procedimiento en el que el oxígeno atmosférico se excluye de la
reacción. Un anticuerpo producido por cualquier procedimiento se
menciona como anticuerpo "relajado". El producto preparado, sin
embargo, debe usarse para una reacción posterior tan rápido como sea
posible o almacenarse en condiciones que eviten la exposición a
oxígeno, preferiblemente en una atmósfera inerte.
En el procedimiento en el que se excluye el
oxígeno de la reacción (es decir, la reacción se realiza en una
atmósfera inerte), se incuba el ligando, durante un periodo de
aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 4 horas,
preferiblemente aproximadamente 3 horas, con un exceso molar de DTT.
Las proporciones DTT/ligando pueden variar de aproximadamente 1:1 a
aproximadamente 20:1, preferiblemente de aproximadamente 1:1 a
aproximadamente 10:1, más preferiblemente de aproximadamente 7:1 a
aproximadamente 10:1, dependiendo de la cantidad de grupos
sulfhidrilo deseados. Para una reducción realizada en presencia de
oxígeno, la proporción molar de DTT al ligando varía de
aproximadamente 50:1 a aproximadamente 400:1 preferiblemente de
aproximadamente 200:1 a aproximadamente 300:1. Esta última reacción
se realiza durante aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas,
preferiblemente 1,5 horas, a una temperatura entre aproximadamente
20ºC y aproximadamente 50ºC, siendo una temperatura preferida
aproximadamente 37ºC. La reacción se realiza a un pH entre
aproximadamente 6 y aproximadamente 8, preferiblemente de
aproximadamente 7 a 7,5. Después el producto se purifica usando
técnicas de purificación convencionales tales como diálisis,
filtración y/o cromatografía. Un procedimiento de purificación
preferido es diafiltración. Para evitar la reoxidación de grupos
-SH, durante la purificación y el almacenamiento, el producto
preferiblemente se mantiene en una atmósfera inerte para excluir la
exposición a oxígeno.
Un especialista en la técnica apreciará que los
diferentes ligandos, particularmente un anticuerpo, pueden tener
diferentes grados de susceptibilidad a reducción y/o reoxidación.
Por consiguiente, las condiciones de reducción descritas
anteriormente pueden necesitar modificarse para obtener un ligando
reducido dado tal como el descrito anteriormente. Además, un medio
alternativo para preparar un anticuerpo reducido útil en el
procedimiento de conjugación será evidente para un especialista en
la técnica. Por tanto, un ligando reducido, preparado, usado en la
preparación de un conjugado de Fórmula (Ia) se entiende incluido por
la presente invención.
Para preparar un conjugado de Fórmula (Ia), como
se ha observado anteriormente, el producto de reacción de anticuerpo
reducido se hace reaccionar con el intermediario de hidrazona de
Fórmula (IIc). La reacción preferiblemente se realiza en una
atmósfera inerte a una temperatura de aproximadamente 0ºC a
aproximadamente 10ºC, preferiblemente aproximadamente 4ºC y a un pH
de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, preferiblemente
aproximadamente 7,4. El inmunconjugado se purifica usando técnicas
convencionales tales como diálisis, filtración, o cromatografía.
En otra realización de la invención, se une una
antraciclina de Fórmula (11) a un ligando al que se añade un resto
que tiene un grupo sulfhidrilo libre. En dicha realización, el
ligando es un ligando no anticuerpo, por ejemplo, bombesina. El
sulfhidrilo puede, por ejemplo, ser parte de un resto de cisteína
añadido a la molécula de bombesina. La antraciclina se une a través
de un resto de hidrazona a un resto que contiene un Receptor de
Adición de Michael que después reacciona con la bombesina modificada
para formar un conjugado de Fórmula (Ia). Después el producto se
purifica por técnicas convencionales tales como diálisis,
centrifugación o cromatografía.
En una realización adicional, se proporciona el
uso de los presentes conjugados para el tratamiento de una
enfermedad o modificación de una función biológica que comprende
administrar a un animal de sangre caliente en necesidad del mismo,
una cantidad terapéuticamente eficaz o que modifique la función
biológica de un conjugado de Fórmula (Ia). Como se puede apreciar,
el conjugado particular usado dependerá de la patología a tratar o
el sistema biológico a modificar. En particular, un especialista en
la técnica será capaz de seleccionar un ligando particular y fármaco
para preparar un conjugado de Fórmula (Ia) que tenga especificidad
para el tratamiento de la enfermedad o sea capaz de modificar la
función biológica deseada. Una realización preferida se refiere al
tratamiento de una enfermedad neoplásica que comprende administrar a
un animal de sangre caliente en necesidad del mismo una cantidad
terapéuticamente eficaz de un conjugado citotóxico de Fórmula
(Ia).
El aspecto más preferido de esta última
realización es un inmunoconjugado de Fórmula (Ia) en el que el resto
de fármaco es adriamicina y la porción de ligando se selecciona
entre el grupo constituido por BR64, BR96, L6, BR64 quimérico, BR96
quimérico, L6 quimérico y los fragmentos de reconocimiento de
antígeno de los mismos. El ligando más preferido para esta
realización es BR96 quimérico, especialmente BR96 quimérico
relajado, y los fragmentos de reconocimiento de antígeno del
mismo.
Los conjugados de la invención se administran al
paciente en forma de una formulación farmacéutica que comprende un
conjugado de Fórmula (Ia) y un vehículo, excipiente o diluyente
farmacéuticamente aceptable para el mismo. Como se usa,
"farmacéuticamente aceptable" se refiere a los agentes que son
útiles en el tratamiento o diagnostico de un animal de sangre
caliente incluyendo, por ejemplo, un ser humano, equino, porcino,
bovino, murino, canino, felino, u otro mamífero así como un ave u
otro animal de sangre caliente. El modo de administración preferido
es por vía parenteral, particularmente por vía intravenosa,
intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intralinfática. Dichas
formulaciones pueden prepararse usando vehículos, diluyentes o
excipientes familiares para un especialista en la técnica. A este
respecto, véase, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences,
16ª ed., 1980, Mack Publishing Company, editado por Osol y
col. Dichas composiciones pueden incluir proteínas, tales como
proteínas séricas, por ejemplo, albúmina de suero humana, tampones o
sustancias tamponantes tales como fosfatos, otras sales, o
electrolitos, y similares. Los diluyentes apropiados pueden incluir,
por ejemplo, agua estéril, solución salina isotónica, dextrosa
acuosa diluida, un alcohol polihídrico o mezclas de dichos
alcoholes, por ejemplo, glicerina, propilenglicol, o
polietilenglicol. Las formulaciones pueden contener conservantes
tales como alcohol de fenetilo, metil y propil parabenos, timerosal,
y similares. Si se desea, la formulación puede incluir del 0,05 a
aproximadamente el 0,20% en peso de un antioxidante tal como
metabisulfito sódico o bisulfito sódico.
Para administración intravenosa, la formulación
preferiblemente se preparará de modo que la cantidad administrada al
paciente será de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 g del
conjugado deseado. Preferiblemente, la cantidad administrada estará
en el intervalo de aproximadamente 0,2 g a aproximadamente 1 g del
conjugado. Los conjugados de la invención son eficaces en un
intervalo de dosificación amplio dependiendo de factores tales como
patología a tratar o el efecto biológico a modificar, el modo en el
que se administra el conjugado, la edad, peso y condición del
paciente así como otros factores a determinar por el médico. Por
tanto, la cantidad administrada a cualquier paciente dado debe
determinarse en una base individual.
Un especialista en la técnica apreciará que
aunque los reactivos y condiciones de reacción específicos se
describen en las siguientes Preparaciones y Ejemplos, pueden hacerse
modificaciones que se entienden incluidas por el espíritu y el
alcance de la invención. Las siguientes Preparaciones y Ejemplos,
por lo tanto, se proporcionan para ilustrar adicionalmente la
invención.
Preparación
1
Se disolvió ácido maleimidocaproico (2,11g, 10
mmol) [Véase, por ejemplo, D. Rich y col., J. Med. Chem.,
18, 1004 (1975); y, O. Keller, y col., Helv. Chim.
Acta, 58 531 (1975)] en tetrahidrofurano seco (200 ml).
Se agitó la solución en una atmósfera de nitrógeno, se enfrió hasta
4ºC y se trató con N-metilmorfolina (1,01 g, 10 mmol) seguido
por adición gota a gota de una solución de cloroformiato de
isobutilo (1,36 g, 10 mmol) en THF (10 ml). Después de 5 minutos se
añadió gota a gota una solución de carbazato de t-butilo
(1,32 g, 10 mmol) en THF (10 ml). La mezcla de reacción se mantuvo a
4ºC durante media hora y a temperatura ambiente durante 1 hora. Se
evaporó el disolvente y el residuo se repartió entre acetato de
etilo y agua. La fase orgánica se lavó con solución de HCl diluida,
agua y solución de bicarbonato diluida, se secó sobre sulfato sódico
anhidro y se evaporó el disolvente. El material se purificó por
cromatografía ultrarrápida usando un sistema de gradiente en
disolvente de cloruro de metileno:metanol (100:1-2).
La hidrazida protegida se obtuvo con un rendimiento del 70% (2,24
g).
Este material (545 mg, 2,4 mmol) se disolvió y se
agitó en ácido trifluoroacético a 0-4ºC durante 8
minutos. Se retiró el ácido a alto vacío a temperatura ambiente. Se
trituró el residuo con éter para producir una sal cristalina de
ácido trifluoroacético de maleimidocaproil hidrazida (384 mg, 70%).
Se preparó una muestra analítica por cristalización en metanol-éter,
para prepara el producto, pf 102-105ºC. La RMN y EM
fueron coherentes con la estructura. Análisis calculado para
C_{10}H_{15}N_{3}O_{3}\cdot0,8CF_{3}COOH: C, 44.02; H,
4.99; N, 13,28. Encontrado (análisis por duplicado): C, 44.16,
44.13; H 4,97, 5,00; N, 12.74, 12,75.
La sal (220 mg) se convirtió a la base libre por
cromatografía en sílice usando un sistema de disolvente cloruro de
metileno:metanol:NH_{4}OH concentrado (100:5:0,5). El material
obtenido (124 mg, 80%) se cristalizó en cloruro de metileno-éter
para preparar un producto final, pf 92-93ºC. La RMN
y EM fueron coherentes con la estructura. Análisis calculado para
C_{10}H_{15}N_{3}O_{3}: C, 53,33, H, 6,67; N 18,67.
Encontrado: C, 53,12; H, 6,67; N, 18,44.
Preparación
2
Se preparó una mezcla de clorhidrato de
adriamicina (44 mg, 0,075 mmol) maleimidocaproil hidrazida (23 mg,
0.102 mmol), de acuerdo con el procedimiento descrito en la
Preparación 1, y se agitaron 2-3 gotas de ácido
trifluoroacético en metanol absoluto (25 ml) durante 15 horas en una
atmósfera de nitrógeno y se protegió de la luz. Al final de este
periodo no se detectó adriamicina libre por HPLC (fase móvil acetato
de amonio 0,01 molar:acetonitrilo, (70:30)). La solución se
concentró a temperatura ambiente al vacío a 10 ml y se diluyó con
acetonitrilo. La solución transparente se concentró a un pequeño
volumen, el sólido se recogió por centrifugación, y el producto se
secó a alta vació para producir el compuesto del título. La RMN fue
coherente con la estructura. EM de alta resolución, calculada para
C_{31}H_{42}N_{4}O_{13}: 751,2827; encontrado 751,2804.
La hidrazona también se formó usando adriamicina
y la sal del ácido trifluoroacético de la hidrazida. Por tanto, la
sal (70 mg, 0,12 mmol), preparada de acuerdo con el procedimiento
descrito en el Procedimiento 1, y clorhidrato de adriamicina (50 mg,
0,086 mmol), se agitaron en metanol (30 ml) durante 15 horas. La
solución se concentró a 2 ml y se diluyó con acetonitrilo. El sólido
rojo se recogió por centrifugación y se secó al vacío. El producto
(28 mg, 43%) fue idéntico en RMN y CCF al descrito anteriormente. EM
de alta resolución calculada para C_{31}H_{42}N_{4}O_{13}:
751,2827; encontrado 751,2819.
Se trató una solución del anticuerpo BR64 (25 ml,
10,37 mg/ml; determinado por UV a 280 nm, 1,4 unidades de
absorbancia igual a 1 mg de proteína) con solución de SPDP en etanol
absoluto (1,3 ml de una solución de 10 mmol). La solución se incubó
durante 1 hora a 31-32ºC, después se enfrió en hielo
y se trató con una solución de DTT en solución salina tamponada con
fosfato ("PBS") (1,3 ml de una solución de 50 mmol). La
solución se mantuvo en hielo durante 1 hora, después se transfirió a
un tubo de diálisis y se dializó tres veces frente a PBS (2 l por
diálisis) durante un periodo de al menos 8 horas. Después de la
diálisis, se midió la concentración de proteína, como anteriormente,
seguido por una determinación de concentración molar de grupos
sulfhidrilo libres por el procedimiento de Ellman.
La proteína tiolada (3 ml) se trató con una
cantidad molar de tiol equivalente de maleimidocaproil hidrazona de
adriamicina, preparada como en la Preparación 2, se disolvió en
dimetilformamida (DMF) (5 mg/ml, 0,131 ml) y la mezcla se incubó a
4ºC durante 24 horas. La solución de dializó tres veces frente a PBS
(1000 ml) durante un periodo de al menos 8 horas. La solución se
centrifugó y el sobrenadante se agitó durante una pocas horas con
Bio-beads™ SM-2 (perlas poliméricas
de poliestireno macroporosas neutras no polares,
Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804) y
finalmente se filtró a través de una unidad de filtro de 0,22 \mum
Millex-GV (Millipore Corporation, Bedford, MA
01730). La cantidad media global de moléculas de adriamicina por
molécula de anticuerpo ("MR") se determinó midiendo la cantidad
de adriamicina a partir de la absorción a 495 nm (e=8030
cm^{-1}M^{-1}) y la cantidad de proteína a partir de la
absorción a 280 nm, después de corregir la absorción de adriamicina
a 280 nm de acuerdo con la fórmula:
Anticuerpo
(mg/mL)= \frac{A_{280}-(0,724 \ x \
A_{495})}{1,4}
La EM encontrada para el producto fue 5,38; 0,14%
de adriamicina libre; rendimiento de proteína del 60%.
Se agitó una solución de anticuerpo BR64 (405 ml,
11,29 mg/ml) y se trató con solución de SPDP en etanol absoluto
(22,3 ml de una solución de 10 mmol). La solución se incubó durante
1 hora a 31-32ºC mientras se agitaba suavemente,
después se enfrío en hielo hasta 4ºC, se agitó y se trató con una
solución de DTT en PBS (22,3ml de una solución de 5 mmol). La
solución se mantuvo en hielo durante 1 hora, después se dividió en
dos partes iguales, se transfirió cada una a un tubo de diálisis y
se dializó seis veces frente a PBS (6 l por diálisis) durante un
periodo de al menos 8 horas. Después de eso se combinaron los
contenidos de los tubos (400 ml) y se determinó la concentración de
proteína y grupos tiol libres (proporción molar de -SH a proteína es
8,5).
La solución de proteína tiolada se agitó y se
trato con una cantidad molar de tiol equivalente de maleimidocaproil
hidrazona de adriamicina disuelta en DMF (5 mg/ml, 35,7 ml)) y la
mezcla se incubó a 4ºC durante 24 horas. La solución se dividió en
dos partes iguales, se transfirió a tubos de diálisis y se dializó
cinco veces frente a PBS (6 l por diálisis) durante un periodo de al
menos 8 horas. Se combinaron los contenidos de los tubos de
diálisis, se filtraron a través de un filtro de acetato de celulosa
de 0,22 \mu, y el filtrado se agitó durante 24 horas con
Bio-beads™ SM-2
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804). L
solución se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de
0,22 \mu. Se determinó la concentración de proteína y adriamicina
(6,26 mg/ml y 162,4 \mug/ml, respectivamente) produciendo una
proporción molar (MR) de 7,18. El rendimiento de proteína fue del
77%. La adriamicina no conjugada presente fue del 0,07%.
De un modo análogo al descrito en los Ejemplos 1A
y 1B, se tioló el anticuerpo SN7 monoclonal, un anticuerpo que no se
une al antígeno reconocido por BR64, con SPDP y se hizo reaccionar
con la maleimidocaproil hidrazona de adriamicina produciendo un
conjugado con una proporción molar (MR) de 4. El rendimiento de
proteína fue del 51%. La adriamicina no conjugada presente fue del
0,36%.
Se trató una solución de anticuerpo BR96
quimérico, ChiBR96, (27,5 ml, 12,53 mg/ml) con una solución 10 mM de
SPDP en etanol absoluto (1,7 ml). La solución se incubó a 31ºC
durante 35 minutos, se enfrió en hielo y se trató con una solución
0,50 mM de DTT en PBS (1,7 ml) durante 15 minutos a 4ºC. La solución
se transfirió a un tubo de diálisis y se dializó cuatro veces en
PBS-tampón histidina 0,1 M (4,5 l por diálisis)
durante un periodo de al menos 8 horas. Se determinó la cantidad de
proteína y la concentración molar de grupos tiol (9,29 mg/ml y 2,06
x 10^{-4} M, respectivamente). La solución (17 ml) se trató con
una cantidad molar equivalente de la maleimidocaproil hidrazona de
adriamicina en DMF (5 mg/ml, 0,59 ml) y la mezcla de reacción se
incubó a 4ºC durante 24 horas. La mezcla de reacción se dializó tres
veces, en el mismo tampón (4,5 l por diálisis), durante al menos 8
horas. La solución dializada se centrifugó y el sobrenadante se
agitó suavemente con Biobeads™ SM-2
(Bio-Rad Laboratories, Richmond CA 94804) durante
unas pocas horas a 4ºC. La solución se centrifugo y se determinó la
concentración de proteína y adriamicina en el sobrenadante (19 ml)
(6,5 mg/ml y 67,86 \mug/ml, respectivamente). La proporción molar
de fármaco a proteína es 2,9. El rendimiento de proteína es del 72%;
la adriamicina no conjugada presente es del 1,2%.
La bombesina no contiene un grupo sulfhidrilo
reactivo libre que pueda usarse para unir el fármaco a través del
engarce que contiene Receptor de Adición de Michael. Por tanto, se
preparó una bombesina modificada que contiene un resto de cisteína
adicional en el amino terminal de la bombesina nativa. Además, el
resto 3 de la bombesina nativa se ha cambiado a un resto de lisina.
La bombesina modificada, por lo tanto, se denomina
"Cys^{0}-lys^{3}-bombesina".
Cys^{0}-lys^{3}-bombesina
(11,3 mg) se disolvió en 1,1 ml de agua desionizada y ajustada a pH
7-7,5 con 10 \mul de Tris-HCl 1,5
M, pH 8,8 y después se hizo reaccionar con 0, 45 ml de
maleimidocaproil hidrazona de adriamicina (15 mg/ml en agua
desionizada) a temperatura ambiente durante varias horas. La mezcla
de reacción se dializó frente a agua durante una noche en tubos de
diálisis (punto de corte de peso molecular: 1000). El precipitado se
retiró por centrifugación (12.000 x g) y se salvo el sobrenadante.
El contenido de adriamicina ("AMD") del conjugado
bombesina-adriamicina se midió diluyendo 1:50 en
tampón acetato, pH 6,0. El contenido de adriamicina ("AMD") se
calculó usando la fórmula:
[D.O._{495}/8030] X 50 = ADM
(M)
Para esta preparación D.O._{495} = 0,116 por lo
que el contenido de adriamicina fue 7,2 x 10^{-4}M.
El producto se sometió a cromatografía por HPLC
usando una columna C_{18} (Beckman Instruments, Ultrasphere 5
\mu, 4,6 mm x 25 cm). Tampón A: NH_{4}OAc 10 mM pH 4,5; Tampón
B: acetonitrilo al 90%/tampón A al 10%. La columna se equilibró con
tampón A al 90%/tampón B al 10% y las condiciones de cromatografía
fueron: tampón A al 90%/tampón B al 10% a tampón A al 60%/tampón B
al 60% durante 2 minutos, gradiente a tampón A al 50%/tampón B al
50% durante 15 minutos. El producto tuvo un tiempo de retención de
9,3 minutos en estas condiciones.
Se dializó BR96 quimérico (15 ml, 9,05 mg/ml) dos
veces frente a 4 litros de carbonato sódico 0,1 M/tampón
bicarbonato, pH 9,1. La solución de anticuerpo después se calentó
con iminotiolano (0,75 ml, 20 mM) a 32ºC durante 45 minutos. La
solución después se dializó frente a 4 litros de carbonato
sódico/tampón bicarbonato, pH 9,1 seguido por diálisis frente a 4
litros de PBS 0,0095 M/L-histidina 0,1 M, pH 7,4.
Esta solución tuvo una proporción molar de -SH/proteína de 1,35.
Después la proteína se volvió a violar como se ha descrito
anteriormente produciendo una solución con una proporción molar de
-SH/proteína de 5,0.
La maleimidocaproil hidrazona de adriamicina (3,2
mg en 0,640 ml de DMF) se añadió con agitación a 4ºC a la solución
de proteína tiolada. El conjugado se incubó a 4ºC durante 16 horas,
después se dializó frente a 4 litros de PBS 0,0095
M/L-histidina 0,1 M, pH 7,4. El conjugado dializado
se filtró a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22
\mu en un tubo estéril al que se añadió una pequeña cantidad
(>5% (v/v)) de BioBeads™ SM-2
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804). Después
de 24 horas de agitación suave, las perlas se extrajeron por
filtración y el conjugado se congeló en nitrógeno líquido y se
almacenó a -80ºC. El conjugado resultante tuvo una proporción molar
de 3,4 moléculas de adriamicina a 1 molécula de proteína y se obtuvo
con un rendimiento del 24% de BR96 quimérico.
Se diluyó IgG humana (obtenida de Rockland,
Gilbertsville, PA) con PBS 0,0095 M a una concentración proteica de
10,89 mg/ml. Esta solución (350 ml) se calentó a 37ºC en un baño de
agua en una atmósfera de nitrógeno. Se añadió ditiotreitol (16,8 ml,
10 mM) en PBS y se agitó la solución durante 3 horas a 37ºC. Se
dividió la solución en partes iguales entre dos células de
ultrafiltración agitadas Amicon Modelo 8400 (Amicon Division of W.
R. Grace and Co., Beverly, MA 01915), cada una ajustada con una
membrana de ultrafiltración Amicon YM 30 (punto de corte de PM de
30.000, diámetro de 76 mm) y conectadas mediante un selector de
concentración/diálisis Amicon Modelo CDS10 a una
mini-reserva Amicon Modelo RC800. Cada reserva
contenía 700 ml de PBS 0,0095 M/L-histidina 0,1 M.
Las soluciones de proteína se dializaron hasta que la concentración
de tiol libre en el filtrado fue de 41 \muM. Se determinó que la
proporción molar de -SH/proteína en el retenido fue de 8,13.
El retenido se transfirió de las células a un
recipiente estéril mantenido en una atmósfera de nitrógeno y se
añadió una solución de maleimidocaproil hidrazona de adriamicina
(36,7 ml, 5mg/ml en agua) con agitación. El conjugado se incubo a
4ºC durante 48 horas después de lo cual se filtró a través de una
membrana de acetato de celulosa de 0,22 \mu. Se empaquetó una
Bio-Rad Econocolumn™ (2,5 cm x 50 cm,
Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804) con una
suspensión de 100 g de BioBeads™ SM-2
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804) en tampón
L-histidina 0,00095 M-0,1 M. Las
perlas se habían preparado por lavado en metanol, seguido con agua y
después varios volúmenes de tampón. El conjugado filtrado se percoló
a través de esta columna a 2 ml/min. Después de la cromatografía el
conjugado se filtró a través de una membrana de acetato de celulosa
de 0,22 \mu y se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a
-80ºC. El conjugado obtenido tuvo una proporción molar media de 7,45
moléculas de adriamicina por molécula de proteína y se obtuvo con un
rendimiento del 99% de IgG humana.
Se trató una solución de BR64 (435 ml; 11,31
mg/ml, 7,07 x 10^{-5} M) con DTT (947 mg) y se calentó a
42ºC-43ºC con agitación suave durante 2 horas. La
solución se enfrió en hielo, se transfirió a 2 tubos de diálisis y
cada tubo se dializó 5 veces frente a PBS (14 l por diálisis)
durante 8 horas a 4ºC. Se combinaron los contenidos de los tubos
(400 ml) y se determinó el contenido de proteína y -SH (10,54 mg/ml,
6,58 x 10^{-5} M; 5,14 x 10^{-4} M, respectivamente). La
proporción molar de -SH a proteína fue 7,8.
Se añadió una solución de maleimidocaproil
hidrazona de adriamicina en DMF (5 mg/ml, 32,6 ml) a la solución de
anticuerpo con agitación suave y después se incubó a 4ºC durante 24
horas. La solución se filtró a través de un filtro de acetato de
celulosa de 0,22 \mu y después se transfirió a dos tubos de
diálisis y se dializó como se ha descrito anteriormente. Después de
la diálisis, se combinaron los contenidos de los tubos, se filtraron
y se agitaron con BioBeads™ SM-2
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804) durante
24 horas a 4ºC. Las perlas se extrajeron por filtración usando un
filtro de acetato de celulosa produciendo la solución conjugada. Se
determinó la concentración de proteína y adriamicina (8,66 mg/ml,
5,42x10^{-5} M; 168 \mug/ml, 2,89 x 10^{-4} M,
respectivamente). El rendimiento de proteína es del 97%. La
proporción molar de adriamicina a proteína es 5,33; y, la
adriamicina no conjugada es del 0,5%.
1. Se protege continuamente una solución (300 ml)
de anticuerpo (3 g, 10 mg/ml) en tampón PBS (nota 1) en una
atmósfera de nitrógeno, sumergida en un baño de agua a 37ºC y se
agita suavemente con un agitador magnético. La solución se trata con
7 equivalentes molares de DTT (notas 2, 3) durante 3 horas. La
proporción molar de grupos -SH ("MR") a proteína se termina en
principio y cada hora y, para un producto conjugado al máximo, debe
permanecer constante a aproximadamente 14 (notas 2,4).
2. La solución se transfiere tan rápido como es
posible a una célula de diafiltración Amicon (Amicon, División of
W.R. Grace and Co., Beverly, MA 01915) (nota 5) mantenida a de
aproximadamente 4ºC a aproximadamente 7ºC. El sistema se presuriza
con argón y nitrógeno y se comienza la diafiltración usando tampón
PBS que contiene histidina 0,1 M que se ha preenfriado de
aproximadamente 4ºC a aproximadamente 7ºC. La temperatura inicial
del efluente, inmediatamente después de iniciar la diafiltración es
de 16-18ºC y baja a 8-9ºC en
aproximadamente 90 minutos. El efluente se controla para una EM de
-SH a proteína y, cuando este valor es <1, la diafiltración está
completa
(nota 6).
(nota 6).
3. La solución se vuelve a transferir a un matraz
de fondo redondo equipado con un agitador magnético y mantenido en
hielo. La solución se protege continuamente con una atmósfera de
nitrógeno. El volumen de la solución se anota. Se toman alícuotas de
0,1 ml y se diluyen con tampón PBS a 1,0 ml para determinar la
cantidad de proteína en mg/ml (y también el equivalente molar de
proteína) y la molaridad de los grupos -SH (por lo tanto la MR de
-SH a proteína). Se prepara una solución de maleimidocaproil
hidrazona de adriamicina en agua destilada (5 mg/ml, 6,3x10^{-3}
M) (nota 7,8). La cantidad (en ml) de esta solución necesaria para
conjugación se termina por la fórmula:
\frac{(\text{molaridad de -SH}) \
x \ (\text{volumen de solución protéica}) \ x \ 1,05}{6,3 \ x \
10^{-3}}
(nota 9) y esta cantidad se añade
lentamente a la solución de proteína que se agita suavemente. La
solución se mantiene a 4ºC durante 30
minutos.
4. Se prepara una columna de
Bio-Beads™ SM-2, malla de
20-50 (Bio-Rad Laboratories,
Richmond, CA 948 04) (nota 10) a 4ºC. La solución de proteína roja
se filtra a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,22
\mu, después se pasa a través de la columna a una velocidad de 2,5
ml/min y se recoge el efluente rojo. Finalmente se vierte
PBS-tampón histidina 0,1 M en la parte superior de
la columna y se recoge el efluente hasta que es incoloro. Se anota
el volumen de la solución roja recogida. Se diluye un alícuota de
0,1 ml a 1ml con tampón PBS y se mide la cantidad de proteína y
adriamicina. Se determina la cantidad de adriamicina conjugada por
absorbancia a 495 nm (e=8030 cm^{-1}M^{-1}) y se expresa en
micromoles y microgramos por ml. La cantidad de proteína, expresada
en mg por ml y micromoles, se determina como anteriormente leyendo
la absorbancia a 280 nm con una corrección de la absorbancia de
adriamicina a la misma longitud de onda de acuerdo con la fórmula
general
Anticuerpo
(mg/mL)=\frac{A_{280}-(0,724 \ x \
A_{495})}{1,4}
en la que A es la absorbancia
observada a la longitud de onda anotada. La MR de adriamicina a
proteína se calcula
después.
5. Se pasa una alícuota de 5 ml de conjugado a
través de una columna Econo-Pac™ 10
SM-2 (una columna pre-empaquetada de
Bio-Beads™ SM-2
(Bio-Rad Laboratories, Richmond CA 94804), volumen
10 ml, que se ha lavado y equilibrado con PBS/tampón histidina 0,1
M) del modo descrito anteriormente. Se determina la cantidad de
proteína y adriamicina conjugada y se determina la MR. Esta valor
debe ser el mismo que el de la masa de la solución (nota 11).
6. El conjugado se congela en nitrógeno líquido y
se almacena a -80ºC. Puede tomarse alícuotas para determinar la
citotoxicidad, unión y presencia de adriamicina libre (nota 12).
1. La concentración de anticuerpo es generalmente
7-10 mg/ml (\sim6,25 x 10^{-5} M), y es la
concentración preferida. Si la concentración es más alta la solución
puede diluirse con tampón. Si la concentración es de menos de 10
mg/ml, se usa de ese modo. La concentración se determina por
absorción en UV a 280 nm: 1 mg/ml = 1,4 unidades de absorbancia.
2. El DTT usado es de Boeringer Mannhein
Biochemicals, Indianapolis, Indiana 46250, pf
42-43ºC. Debe recristalizarse el DTT (por ejemplo,
en éter-hexano) si existen cuestiones de calidad. La
pureza se determina por pf, RMN y contenido de -SH. La titulación de
sulfhidrilo se realiza de acuerdo con el procedimiento de Ellman
(Anal. Biochem. 94, 75-81, 1979) del
siguiente modo: Se diluye un alícuota de 0,1 ml a 1 ml con PBS y se
trata con 0,05 ml de reactivo (una solución 50 nmolar en
ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico)
("DTNB") en Na_{2}HPO_{4} 100 nmolar; pH 7,04). Se trata un
blanco de 1 ml de PBS con DTNB del mismo modo. Después de 5 minutos
se mide la absorbancia (A) de la muestra y el blanco a 412 nm y se
determina la concentración molar de -SH ("MC_{SH}") de
acuerdo con la siguiente fórmula:
MC_{SH}=\frac{(A_{muestra}-A_{blanco})
\ x \ 10}{1,415 \ x \
10^{4}}
3. Puede añadirse DTT en forma de sólido o de
solución. Preferiblemente, se usa una solución 10 mM recién
preparada en tampón. Para propósitos de proporcionar la escala de
reacción, se usa generalmente 13,13 ml.
4. Se determina la MR de -SH a proteína midiendo
la concentración molar de -SH de acuerdo con el procedimiento de
Ellman (véase nota 2) y dividiendo esa concentración por la
concentración molar de proteína. Si este valor es menor de 14
durante la reacción se añade una cantidad adicional apropiada de
DTT.
5. En una escala de 3 g/300 ml, se usan dos
células Amicon de 350 ml cada una, dividiendo la solución en dos
porciones de 150 ml por célula.
6. En la escala de reacción proporcionada, la
diafiltración habitualmente dura 2-4 horas. La
duración dependerá de factores tales como la edad de la membrana, la
velocidad de agitación de la solución y la presión en la célula.
7. La hidrazona no es muy soluble en PBS y se
forma un precipitado en un corto tiempo.
8. Breves aplicaciones de un sonicador facilitará
la disolución en agua destilada. La solución resultante estable.
9. Esta cantidad proporciona un exceso del 5% de
hidrazona. El procedimiento descrito en líneas generales dura
aproximadamente 15-20 minutos.
10. Las Bio-Beads™ se preparan
para cromatografía hinchándolas en metanol durante al menos una
hora, preferiblemente durante una noche, lavándolas con agua
destilada y finalmente equilibrándolas con PBS/tampón histidina
0,1M. Para 3 g de proteína se usan 100 g de perlas para formar una
columna de 2,5 cm x 30 cm.
11. A causa del error inherente de los
procedimientos de espectroscopia usados, se acepta una variación de
una unidad MR como resultado satisfactorio. Generalmente, sin
embargo, el MR varía menos de 0,5 unidades MR.
12. Los valores de adriamicina libre en el
conjugado son generalmente mucho menores del 1%.
BR96 quimérico, preparado del modo descrito
previamente, se diluyó con PBS 0,0095 M a una concentración proteica
de 10,49 mg/ml. Esta solución (500 ml) se calentó hasta 37ºC, en una
atmósfera de nitrógeno, en un baño de agua. Se añadió ditiotreitol
(26,2 ml, 10 mM) en PBS y se agitó la solución durante 3 horas a
37ºC. La solución se dividió en partes iguales entre dos células de
ultrafiltración agitadas Amicon Modelo 8400 ajustada cada una con un
ultrafiltro YM 30 (punto de corte de PM 30.000, diámetro de 36 mm) y
conectadas mediante un selector de concentración/diálisis Modelo
CDS10 a una minirreserva Modelo RC800 (Amicon, Division of W.R.
Grace and Co., Berverly MA 01915-9843). Cada reserva
contenía 800 ml de PBS 0,0095 M/L-histidina 0,1 M.
Se dializaron las soluciones de proteína hasta que la concentración
de tiol libre en el filtrado fue de 63 \muM. Se determinó que la
proporción molar de -SH/proteína en el retenido fue de 8,16. El
retenido se transfirió de las células a un recipiente estéril en una
atmósfera de nitrógeno y se añadió una solución de maleimidocaproil
hidrazona de adriamicina (42,6 ml, 5 mg/ml en agua) con agitación.
El conjugado se incubó a 4ºC durante 48 horas después de lo cual se
filtró a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22
\mu. Se empaquetó una Bio-Rad Econocolumn de 2,5
cm x 50 cm con una suspensión de 100 g de BioBeads™
SM-2 (Bio-Rad Laboratories, Richmond
California 94804) en 0,00095 M/tampón L-histidina
0,1 M. Las perlas se habían preparado por lavado en metanol, seguido
con agua, y después varios volúmenes de tampón. El conjugado
filtrado se percoló a través de esta columna a 2 ml/min. Después de
la cromatografía se filtro el conjugado a través de una membrana de
acetato de celulosa de 0,22 \mu, se congeló en nitrógeno líquido y
se almacenó a 80ºC. El conjugado obtenido tuvo una proporción molar
de 6,77 de Adriamicina a proteína y se obtuvo con un rendimiento del
95% de BR96 quimérico.
El anticuerpo L6 murino, preparado como se ha
definido anteriormente se diluyó con PBS 0,0095 M a una
concentración proteica de 11,87 mg/ml. Esta solución (350 ml) se
calentó hasta 37ºC, en una atmósfera de nitrógeno, en un baño de
agua. Se añadió ditiotreitol (18,2 ml, 10 mM) en PBS y se agitó la
solución durante 3 horas a 37ºC. La solución se dividió en partes
iguales entre dos células de ultrafiltración agitadas Amicon Modelo
8400 ajustada cada una con un ultrafiltro YM 30 (punto de corte de
PM de 30.000, diámetro de 76 mm) y conectadas mediante un selector
de concentración/diálisis Modelo CDS10 a una minirreserva Modelo
RC800 (Amicon, Division of W.R. Grace and Co., Beverly MA
01915-9843). Cada reserva contenía 800 ml de PBS
0,0095 M/L-histidina 0,1 M. Las soluciones de
proteína se dializaron hasta que la concentración de tiol libre en
el filtrado fue de 14 \muM. Se determinó que la concentración
molar de -SH/proteína en el retenido fue de 9,8. El retenido se
transfirió de las células a un recipiente estéril en una atmósfera
de nitrógeno y se añadió una solución de maleimidocaproil hidrazona
de adriamicina (40,4 ml, a 5 mg/ml en agua) con agitación. El
conjugado se incubó a 4ºC durante 48 horas después de lo cual se
filtró a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22
\mu. Se empaquetó una Bio-Rad Econocolumn de 2,5
cm x 50 cm con una suspensión de 100 g de BioBeads™
SM-2 (Bio-Rad Laboratories, Richmond
California 94804) en tampón L-histidina 0,00095
M-0,1 M. Las perlas se habían preparado por lavado
en metanol, seguido por agua después varios volúmenes de tampón. El
conjugado filtrado se percoló a través de esta columna a 2 ml/min.
Después de la cromatografía el conjugado se filtró a través de una
membrana de acetato de celulosa de 0,22 \mu, se congeló en
nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC. El conjugado obtenido tuvo
una proporción molar de 7,39 de Adriamicina a proteína y se obtuvo
con un rendimiento del 100% de L6 murino.
Los conjugados representativos de la presente
invención se ensayaron tanto en sistemas in vitro como en
sistemas in vivo para determinar la actividad biológica. En
estos ensayos, la potencia de conjugados de fármacos citotóxicos se
determinó midiendo la citotoxicidad de los conjugaos frente a
células de origen cancerígeno humano. A continuación se describen
los ensayos representativos usados y los resultados obtenidos. En
todos los datos presentados, los conjugados se refieren a usar la
proporción molar de ligando a fármaco de la forma
ligando-fármaco. Por tanto, por ejemplo,
"BR64-ADM-5,33", se refiere a
un conjugado entre anticuerpo BR64 y adriamicina y la proporción
molar de fármaco a anticuerpo es 5,33. Un especialista en la técnica
reconocerá que podría usarse cualquier línea tumoral que exprese el
antígeno deseado en sustitución de las líneas tumorales específicas
usadas en los siguientes análisis.
Ensayo
I
Los inmunoconjugados de los Ejemplos 1B y 2 se
ensayaron in vitro frente a una línea de carcinoma de pulmón
humano, L2987 [obtenido de I. Hellström,
Bristol-Myers Squibb Seattle; véase también I.
Hellström, y col., Cancer Research 50:2183 (1990)],
que expresa los antígenos reconocidos por anticuerpos monoclonales
BR64, LS y BR96. Los cultivos monocapa de células L2987 se
recogieron usando tripsina-EDTA (GIBCO, Grand
Island, NY), y se contaron las células y se resuspendieron a 1 x 10
^{5}/ml en RPMI-1640 que contenía suero de ternera
fetal inactiva por calor al 10% ("RPMI-FCS al
10%"). Se añadieron las células (0,1 ml/pocillo) a cada pocillo
de placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos y se
incubaron durante una noche a 37ºC en una atmósfera húmeda de
CO_{2} al 5%. Se retiraron los medios de las placas y se añadieron
diluciones en serie de adriamicina o los conjugados de anticuerpo de
adriamicina a los pocillos. Todas las diluciones se realizaron por
cuadruplicado. Después de 2 horas de exposición al fármaco o al
conjugado, se centrifugaron las placas (100 x g, 5 min), se retiró
el fármaco o conjugado, y se lavaron las placas tres veces con
RPMI-FCS al 10%. Se cultivaron las células en
RPMI-FCS al 10% durante 48 horas adicionales. En ese
momento se pulsaron las células durante 2 horas con 1,0
\muCi/pocillo de ^{3}H-timidina (New England
Nuclear, Boston, MA). Se recolectaron las placas y se determinaron
las cuentas por minuto ("CPM"). Se determinó la inhibición de
la proliferación por comparación de la media de CPM para muestras
tratadas con la de controles no tratados. Los datos presentados en
la Figura 3 demuestran la citotoxicidad frente a células de pulmón
L2987 de inmunoconjugado de unión (MR de adriamicina a BR64 igual a
7,18, denominado
"BR64-THADMHZN-7,18") en
comparación con un inmunoconjugado de no unión de SN7 y adriamicina
(MR de adriamicina a SN7 igual a 4, denominado
"SN7-THADMHZN-4"). Los
conjugados BR64 preparados por el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1B son activos y demuestran citotoxicidad específica de
antígeno en esta exploración in vitro.
Ensayo
II
Los inmunoconjugados de los Ejemplos 1B y 2 se
evaluaron in vivo para actividad antitumoral específica de
antígeno. Se usaron ratones hembra congénitamente atímicos de fondo
BALB/c (BALB/c nu/nu; Harlan Sprague-Dawley,
Indianapolis, IN) en estos estudios. Los ratones se metieron en
unidades de jaula Thoren en lechos estériles con temperatura y
humedad controlados. Los animales recibieron comida estéril y agua
ad libitum. La línea de tumor de pulmón humano L2987,
descrito anteriormente, se usó en estos estudios. Se ha mostrado que
esta línea mantiene la expresión de los antígenos BR64, BR96 y L6
después de pases repetidos in vivo. Las líneas tumorales se
mantuvieron durante varios pases en ratones atímicos como se ha
descrito previamente (P. A. Trail, y col., in vivo
3:319-24 (1989)). Se midieron los tumores, usando
calibres, en 2 direcciones perpendiculares a intervalos semanales
o
bisemanales.
bisemanales.
El volumen del tumor se calculó de acuerdo con la
ecuación:
V(mm^{3})=\frac{(L \ x \
W^{2})}{2}
en la
que
- V= volumen (mm^{3})
- L= medida del eje longitudinal (mm)
- W= medida del eje perpendicular a L (mm).
Los datos se presentan como tamaño tumoral medio
para grupos tratados y de control. Cada grupo de tratamiento o
control contenía 8-10 animales. La terapia se inició
cuando los tumores habían alcanzado un tamaño medio de
50-100 mm^{3}. La terapia se administró por vía ip
o iv en diversos programas como se indica. Se diluyó adriamicina en
solución salina normal y los anticuerpos nativos y los conjugados de
adriamicina se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato
("PBS") para administración. Todas las dosificaciones se
administraron en base al peso (mg/kg) y se calculó para cada animal.
En estos estudios la actividad antitumoral de inmunoconjugados BR64
de unión se comparó con la de dosificaciones optimizadas de
adriamicina, mezclas de BR64 nativo y adriamicina, y conjugados de
no unión. La adriamicina no conjugado se administró de acuerdo con
la vía, dosificación, y programa que se demostró que era óptimo para
el modelo de xenoinjerto humano L2987. La adriamicina no conjugada,
por lo tanto, se administró a una dosis de 8 mg/kg por vía iv cada
cuatro días para un total de 3 inyecciones (indicado "8 mg/kg,
q4dx3, iv"). Los inmunconjugados de unión (BR64) y no unión (SN7)
se administraron en varias dosis por vía ip cada cuatro días para un
total de 3 inyecciones (indicado "q4dx3, ip"). Como se muestra
en la Figura 4 se observó actividad antitumoral significativa
después de la administración de dosis toleradas (10 y 15
mg/kg/inyección) del conjugado BR64-adriamicina. La
actividad antitumoral observada después de terapia con el conjugado
BR64 fue significativamente mejor que la observada para terapia con
adriamicina optimizada y dosis coincidentes de un conjugado de no
unión (SN7).
En este experimento, se observaron regresiones
tumorales completas en el 66% de los animales después de tratamiento
con 15 mg/kg/inyección del conjugado de BR64 y se observó un 50% de
regresiones tumorales completas después de tratamiento con 10
mg/kg/inyección del conjugado de BR64. No se han observado
regresiones parciales o completas de tumores L2987 establecidos
después de terapia con adriamicina optimizada, mezclas de BR64
nativo y adriamicina, o dosis equivalentes de conjugados de no
unión.
Para demostrar que la actividad observada
necesitaba la unión covalente del anticuerpo a la adriamicina, se
realizaron varios experimentos de control usando mezclas de BR64
nativo y adriamicina. Los datos representativos para varios tipos de
terapia combinada se muestran en las Figuras 5a-c.
La actividad antitumoral observada para diversos modos de terapia
combinada con MAb y adriamicina no fue significativamente diferente
de la observada para terapia con adriamicina optimizada sola.
Tomados juntos estos datos indican que la unión covalente de BR64 a
adriamicina es necesaria para observar la actividad antitumoral
descrita en la Figura 4.
Ensayo
III
El conjugado del Ejemplo 4 se evaluó in
vivo para actividad antitumoral. Se implantaron piezas tumorales
de carcinoma de pulmón de células pequeñas humanas H345 (obtenidas
de Dr. D. Chan, University of Colorado Medical School, CO) en
ratones desnudos atímicos BALB/c, por vía subcutánea, usando
trocares. Se dejaron crecer los tumores hasta 50-100
mm^{3} antes del inicio del tratamiento. Los ratones se trataron
i.v. 23, 26, 28 y 30 días después del implante con adriamicina sola
(1,6 mg/kg), o los conjugados bombesina-adriamicina
("BN-ADM(TH)", en una cantidad
equivalente a 1,6 mg/kg de adriamicina) o conjugado P77- adriamicina
("P77-ADM(TH)", en una cantidad
equivalente a 1,6 mg/kg de adriamicina). P77 es un péptido de 12
aminoácidos con un resto de cisteína interno (secuencia =
KKLTCVQTRLKI) que no se une a células H345 y se conjugó a la
maleimidocaproil hidrazona de adriamicina de acuerdo con el
procedimiento descrito en el Ejemplo 4. Por tanto, el conjugado
representa un conjugado de no unión con respecto a células H345. Los
tumores se midieron con calibres y se calculó el volumen del tumor
usando la fórmula:
V(mm^{3})=\frac{(L \ x \
W^{2})}{2}
en la que V, L, y W son como se ha
definido en el Ensayo
II.
Los volúmenes del tumor medios se determinaron y
los resultados observados se muestran en la Figura 6.
Ensayo
IV
Se prepararon inmunoconjugados de adriamicina y
anticuerpo ChiBR96 usando el procedimiento general para preparar
anticuerpos relajados como se describe en el Ejemplo 8. Se ensayaron
los conjugados, usando el siguiente protocolo, para citotoxicidad
in vitro y se comparó su citotoxicidad a la de adriamicina
libre, e inmunoconjugados tiolados con SPDP preparados por el
procedimiento descrito en el Ejemplo 1B. Los resultados de estos
ensayos se proporcionan en la Figura 7.
Se mantuvieron cultivos monocapa de células de
pulmón humano L2987 en medio RPMI-1640 que contenía
suero de ternera fetal inactivado por calor al 10%
(RPMI-FCS al 10%). Las células se recolectaron
usando tripsina-EDTA (GIBCO, Grand Island, NY), y se
contaron las células y se resuspendieron a 1 x 10^{5}/ml en
RPMI-FCS al 10%. Las células (0,1 ml/pocillo) se
añadieron a cada pocillo de placas de microtitulación de 96 pocillos
y se incubaron durante una noche a 37ºC en una atmósfera húmeda de
CO_{2} al 5%. Se retiraron los medios de las placas y se añadieron
diluciones en serie de adriamicina o conjugados anticuerpo/ADM a los
pocillos. Todas las diluciones se realizaron por cuadruplicado.
Después de exposición de 2 horas al fármaco o conjugado, las placas
se centrifugaron y (200 x g, 5 min), se retiró el fármaco o
conjugado, y se lavaron las placas 3 X con RPMI-FCS
al 10%. Las células se cultivaron en RPMI-FCS al 10%
durante 48 horas adicionales. En ese momento las células se pulsaron
durante 2 horas con 1,0 \muCi/pocillo de
^{3}H-timidina (New England Nuclear, Boston, MA).
Las placas se recolectaron y se determinaron las cuentas por minuto
("CPM"). Se determinó la inhibición de proliferación comparando
la media de CPM para muestras tratadas con la del control no
tratado. Los valores de CI_{50} se indican como \muM de
equivalentes de
adriamicina.
adriamicina.
\newpage
Ensayo
V
Se evaluó la actividad antitumoral in vivo
de inmunoconjugados de adriamicina y BR64 relajado o L6 relajado.
Los datos observados se proporcionan en la Figura 8.
Se usaron ratones hembra congénitamente atímicas
de fondo BALB/c (BALB/c nu/nu; Harlan
Sprague-Dawley, Indianápolis, IN). Los ratones se
metieron en unidades de jaula Thoren en lechos estériles con
temperatura y humedad controlados. Los animales recibieron comida
estéril y agua ad libitum.
La línea de tumor humano L2987 se estableció como
modelos de xenoinjerto tumoral en ratones atímicos. La línea tumoral
se mantuvo durante varios pases in vivo. Los tumores se
midieron en 2 direcciones perpendiculares en intervalos semanales o
bisemanales usando calibres. El volumen del tumor se calculó de
acuerdo con la ecuación:
V(mm^{3})=\frac{(L \ x \
W^{2})}{2}
en la
que:
- V= volumen (mm^{3})
- L= medida del eje longitudinal (mm)
- W= medida del eje perpendicular a L
En general, había 8-10 ratones
por grupo de control o tratamiento. Los datos se presentan como
tamaño tumoral medio para grupos de control o tratados. La actividad
antitumoral se expresa como logaritmo de muerte celular total
("LCK") donde:
LCK=\frac{T-C}{3,3
\ x \
TVDT}
T-C se define como
el tiempo medio (días) para que los tumores tratados alcancen el
tamaño diana menos el tiempo medio para que los tumores de control
alcancen el tamaño diana y TVDT es el tiempo (días) para que los
tumores de control dupliquen su volumen (250-500
mm^{3}). La regresión tumoral parcial ("PR") se refriere a
una disminución del volumen del tumor hasta =50% del volumen del
tumor inicial; la regresión tumoral completa ("CR") se refiere
a un tumor que durante un periodo de tiempo no es palpable; y
curación se define como un tumor establecido que no es palpable
durante un periodo de tiempo de =10
TVDT.
Para animales que contienen el tumor de pulmón
humano L2987, la terapia típicamente se inició cuando el tamaño
tumoral medio fue de 75 mm^{3} (12-14 días después
del implante del tumor). El TVDT medio fue de 4,8\pm0,9 días y la
actividad antitumoral se evaluó a un tamaño tumoral de 500 ml^{3}.
En varios experimentos (descritos a continuación en el Ensayo VI) la
terapia se inició cuando los tumores L2987 fueron de 225 mm^{3} de
tamaño.
Los materiales en investigación se administraron
por vía ip o iv. La adriamicina se diluyó en solución salina normal;
el anticuerpo y conjugados anticuerpo/adriamicina se diluyeron en
solución salina tamponada con fosfato. Los compuestos se
administraron en una base mg/kg calculada para cada animal, y las
dosis se presentan como mg/kg de equivalente de
adriamicina/inyección. Los inmunoconjugados se administraron en un
programa q4dx3. La dosis tolerada máxima ("MTD") para un
régimen de tratamiento se define como la dosis más alta en un
programa dado que da como resultado una letalidad de =20%.
En los datos mostrados en la Figura 8, la
inyección de dosis optimizadas de adriamicina produjo actividad
antitumoral equivalente a 1,1 LCK y no se observaron regresiones
tumorales. El conjugado BR64-ADM produjo actividad
antitumoral equivalente a >10 LCK en todas las dosis ensayadas y
se observaron curaciones del 89%, 78% y 100% a dosis de 5 mg/kg, 8
mg/kg y 10 mg/kg de BR64-ADM, respectivamente. A
dosis de 8 mg/kg o 10 mg/kg el conjugado L6-ADM
produjo actividad antitumoral (1,8 y 3,5 LCK, respectivamente) que
fue significativamente mejor que la de adriamicina optimizada pero
menor que la de dosis equivalentes de conjugados
BR64-ADM de internalización. Por tanto, los datos
muestran que la actividad antitumoral de conjugados
L6-ADM de no internalización de unión es superior a
la de adriamicina no conjugada. El tratamiento con conjugado
L6-adriamicina da como resultado una actividad
antitumoral inferior de la que se observa con dosis equivalentes del
conjugado BR64-adriamicina de
internalización.
internalización.
\newpage
Ensayo
VI
La actividad antitumoral de conjugados
ChiBR96-ADM se evaluó frente a tumores de pulmón
humano ("L2987"), mama ("MCF7", obtenible de la ATCC con
el número de acceso ATCC HTB 22; véase también I. Hellström, y
col., Cancer Research 50:2183 (1990)), y colon ("RCA" de M.
Brattain, Baylor University; véase también I. Hellström, y col.,
Cancer Research 50:2183 (1990)) establecidos.
Los animales se mantuvieron y se establecieron
modelos de xenoinjerto tumoral para las líneas tumorales humanas
MCF7, RCA y L2987 como se ha descrito para L2987 en el Ensayo V. Los
materiales se administraron como se ha descrito en el Ensayo V.
Para animales que contienen el tumor de pulmón
humano L2987, la terapia típicamente se inició cuando el tamaño
tumoral medio fue de 75 mm^{3} (12-14 días después
del implante del tumor). El TVDT medio fue de 4,8\pm0,9 días y la
actividad antitumoral se evaluó a un tamaño tumoral de 500 mm^{3}.
En varios experimentos la terapia se inició cuando los tumores L2987
fueron de 225 mm^{3} de tamaño.
El tumor MCF7 es una línea tumoral de mama humana
dependiente de estrógenos. Se implantaron a ratones atímicos 0,65 mg
(velocidad de liberación de 65 días) gránulos de estradiol
(Innovative Research of America, Toledo, Ohio) el día del implante
del tumor. La terapia se inició cuando el tamaño tumoral medio fue
de 100 mm^{3} (típicamente 13 días después del implante del
tumor). El tumor MCF7 tuvo un TVDT medio de 6,4\pm2,0 días y la
actividad antitumoral se ensayó a 500 mm^{3}.
Para animales que contienen el tumor de colon
RCA, la terapia se inició 15 días después del implante del tumor
cuando el tamaño tumoral medio fue de 75 mm^{3}. El TVDT medio
para xenoinjertos de tumor RCA fue de 9,5\pm1,5 días y la
actividad antitumoral se evaluó a 400 mm^{3}. Los datos para la
actividad antitumoral de adriamicina optimizada en los modelos de
xenoinjerto L2987, MCF7, y RCA se resumen en las siguientes Tablas y
se hace mención de ellos en las Figuras.
La actividad antitumoral de los conjugados
ChiBR96-ADM se comparó con la de adriamicina
optimizada y dosis equivalentes de inmunoconjugados de no unión
(IgG). En cada modelo, se observaron regresiones tumorales completas
y/o curaciones de tumores establecidos después de la administración
de dosis toleradas de conjugados ChiBR96-ADM.
Los datos representativos que demuestran la
actividad antitumoral específica de antígeno de conjugados
ChiBR96-ADM se presentan en las Figuras 9 y 10. Como
se muestra en la Figura 9, la administración ip de conjugado
ChiBR96-ADM (MR = 4,19) a una dosis de 10 mg/kg
equivalente de adriamicina produjo actividad antitumoral equivalente
a >10 LCK. A esta dosis de conjugado ChiBR96-ADM,
se curó el 78% de los ratones del tumor y un 11% adicional de
ratones mostró una regresión tumoral completa. La administración de
5 mg/kg del conjugado ChiBR96-ADM también produjo
actividad antitumoral equivalente a >10 LCK con un 88% de
curación de tumor y un 12% de regresiones tumorales completas. La
activad antitumoral observada después de la administración de
conjugados ChiBR96-ADM (>10 LCK) fue
sustancialmente mejor que la observada para adriamicina optimizada
(1,0 LCK). El conjugado ChiBR96-ADM también fue más
potente que adriamicina optimizada; es decir, la actividad
antitumoral del conjugado ChiBR96-ADM ensayada a una
dosis de 5 mg/kg equivalente de adriamicina fue superior al de
adriamicina ensayada a una dosis de 8 mg/kg. El conjugado de IgG
humana de no unión (MR =
7,16) fue no activo frente a xenoinjertos de L2987 cuando se ensayaron a una dosis de 10 mg/kg equivalente de adriamicina indicando que la actividad superior del conjugado ChiBR96-ADM se debió a la unión específica de antígeno del inmunoconjugado a células tumorales L2987.
7,16) fue no activo frente a xenoinjertos de L2987 cuando se ensayaron a una dosis de 10 mg/kg equivalente de adriamicina indicando que la actividad superior del conjugado ChiBR96-ADM se debió a la unión específica de antígeno del inmunoconjugado a células tumorales L2987.
Se presentan datos similares en la Figura 10.
Como se ha mostrado, el conjugado ChiBR96-ADM (MR =
5,8) ensayado a una dosis equivalente de 10 mg/kg de adriamicina dio
como resultado una actividad antitumoral equivalente a >10 LCK. A
esta dosis, se observaron un 90% de curación del tumor y un 10% de
regresiones tumorales completas. La administración de 5 mg/kg del
conjugado ChiBR96-ADM dio como resultado 4,8 LCK con
un 10% de curaciones, un 50% de regresión tumoral completa y un 10%
de regresión tumoral parcial. La actividad antitumoral del conjugado
ChiBR96-AMD rebasó enormemente la de adriamicina
optimizada (1,6 LCK) y, como se ha descrito anteriormente, el
conjugado ChiBR96-ADM fue más potente que
adriamicina no conjugada. El conjugado IgG-ADM de no
unión (MR =
7,16) fue no activo a una dosis de 10 mg/kg.
7,16) fue no activo a una dosis de 10 mg/kg.
La actividad antitumoral de diversas
preparaciones de conjugados ChiBR96-ADM preparadas
por la técnica de anticuerpo "relajado" y evaluada frente a
xenoinjerto de tumor de pulmón L2987 establecido se presenta en la
tabla II.
\newpage
Como se ha mostrado, la actividad antitumoral de
conjugados ChiBR96-ADM es superior a la de
adriamicina optimizada y los conjugados ChiBR96-ADM
son 6-8 veces más potentes que adriamicina no
conjugada.
La actividad antitumoral de conjugados
ChiBR96-ADM también se evaluó frente a tumores L2987
establecidos grandes (225 mm^{3}) (Figura 11). La administración
del conjugado ChiBR96-ADM (MR = 6,85) a una dosis de
10 mg/kg de equivalente de adriamicina dio como resultado una
actividad antitumoral equivalente a >10 LCK y se observó un 70%
de curaciones y un 30% de regresiones tumorales parciales.
La actividad antitumoral de anticuerpo ChiBR96 no
conjugado se evaluó usando xenoinjertos de tumor de pulmón humano
L2987 establecido (50-100 mm^{3}). Como se muestra
en la Tabla III, los anticuerpos ChiBR96 administrados a dosis de
100, 200 o 400 mg/kg fueron no activos frente a tumores L2987
establecidos. La actividad antitumoral de mezclas de ChiBR96 y
adriamicina no fue diferente de la de adriamicina administrada sola.
Por lo tanto, la actividad antitumoral de los conjugados
ChiBR96-ADM refleja la eficacia del conjugado en sí
mismo en lugar de un efecto antitumoral sinérgico de anticuerpo y
adriamicina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa página
siguiente)
\newpage
En resumen, los conjugados
ChiBR96-ADM demostraron actividad antitumoral
específica de antígeno cuando se evaluaron frente a tumores de
pulmón humano L2987 establecidos. La actividad antitumoral de
conjugados ChiBR96-ADM fue superior a la de
adriamicina optimizada, mezclas de ChiBR96 y adriamicina, y dosis
equivalente de conjugados de no-unión. Los
conjugados ChiBR96-ADM fueron aproximadamente 6
veces más potentes que adriamicina no conjugada. Se observaron
curaciones o regresiones completas de tumores establecidos en el 50%
de los animales tratados con dosis de = 2,5 mg/kg de conjugado
ChiBR96-ADM.
Como se muestra en la Figura 12, los conjugados
ChiBR96-ADM (MR = 7,88) demostraron actividad
antitumoral específica de antígeno frente a tumores MCF7
establecidos (75-125 mm^{3}). La actividad del
conjugado ChiBR96-ADM administrado a una dosis de 5
mg/kg por vía ip o iv (4,2 LCK) fue superior a la de adriamicina
optimizada (1,4 LCK) o dosis equivalentes de conjugado de IgG de no
unión (1,2 LCK). La actividad antitumoral de conjugados
ChiBR96-ADM e IgG-ADM de no unión se
resume en la Tabla IV. El MTD de conjugados
ChiBR96-ADM como el de adriamicina libre es inferior
al modelo MCF7 debido al suplemento de estradiol requerido para el
crecimiento tumoral.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa página
siguiente)
\newpage
La actividad antitumoral específica de antígeno y
la respuesta a dosis de conjugados ChiBR96-ADM
también se evaluaron en el modelo de carcinoma de colon humano RCA.
Los tumores RCA son menos sensibles a adriamicina no conjugada que
los tumores L2987 y MCF7. Además, como se ha descrito previamente,
los tumores RCA tienen un tiempo de duplicación de volumen tumoral
más grande que los tumores L2987 o MCF7, se vascularizan peor, y la
localización de anticuerpo BR64 radiomarcado es inferior en tumores
RCA que en tumores L2987. Como se muestra en la Figura 13, la
actividad antitumoral del conjugado ChiBR96-ADM (MR
= 7,88) administrado a una dosis de 10 mg/kg fue superior a la de
adriamicina y una dosis equivalente de conjugado de IgG de no unión
(MR = 7,16). Como se muestra en la Tabla V, el conjugado
ChiBR96-ADM ensayado a una dosis de 10 mg/kg produjo
actividad antitumoral equivalente a >3 LCK. A esta dosis de
conjugado ChiBR96-ADM, sucedió un 89% de curación y
un 11% de regresiones tumorales parciales. En este experimento, la
adriamicina no conjugada mostró actividad antitumoral, equivalente a
0,4 LCK. Por tanto, en este experimento, el conjugado
BR96-ADM produjo un 89% de curaciones de tumores
establecidos mientras que la adriamicina no conjugada fue
inactiva.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa página
siguiente)
\newpage
En resumen, el conjugado
ChiBR96-ADM demostró actividad antitumoral
específica de antígeno en el modelo de tumor de colon humano RCA.
Las curaciones y las regresiones completas de tumores RCA
establecidos se observaron después de la administración de conjugado
ChiBR96-ADM a dosis de 5-10
mg/kg.
La invención se ha descrito con referencia a
ejemplos, materiales y datos específicos. Como un especialista en la
técnica apreciará, pueden estar disponibles medios alternativos para
usar o preparar los diversos aspectos de la invención. Dichos medios
alternativos se entienden como incluidos en el propósito y el
espíritu de la presente invención como definidos por las siguientes
reivindicaciones.
Claims (30)
1. Un compuestos de Fórmula (Ia):
en la
que
R_{1} es -CH_{3}, -CH_{2}OH, -CH_{2}OCO
(CH_{2})_{3}CH_{3} o
-CH_{2}OCOCH(OC_{2}H_{5})_{2};
R_{3} es -OCH_{3}, -OH o hidrógeno;
R_{4} es -NH_{2}, -NHCOCF_{3},
4-morfolinilo,
3-ciano-4-morfolinilo,
1-piperidinilo,
4-metoxi-1-piperidinilo,
bencilamina, dibencilamina, cianometilamina o
1-ciano-2-metoxietilamina;
R_{5} es -OH, -OTHP o hidrógeno;
R_{6} es -OH o hidrógeno, a condición de que
R_{6} no sea -OH cuando R_{5} es -OH u -OTHP;
n es un número entero de 1 a 10;
p es un número entero de 1 a 6;
Y es O o NH_{2}^{+}Cl^{-};
z es 0 ó 1;
q es 1 a 10; y
X es un ligando.
2. Un compuesto de la reivindicación 1 en el que
X es una inmunoglobulina, o un fragmento de la misma.
3. Un compuesto de la reivindicación 2 en el que
X es una inmunoglobulina seleccionada entre el grupo constituido por
BR96, BR64, L6, un BR96 relajado, un BR64 relajado, un L6 relajado,
un BR96 quimérico, un BR64 quimérico, un L6 quimérico; un BR96
quimérico relajado, un BR64 quimérico relajado, un L6 quimérico
relajado; y, fragmentos de los mismos.
4. Un compuesto de la reivindicación 3 en el que
X es un BR96 quimérico, un BR96 quimérico relajado; o un fragmento
de los mismos.
5. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que
X es una proteína, polipéptido o ligando peptídico.
\newpage
6. Un compuesto de la reivindicación 5 en el que
X es un ligando seleccionado entre el grupo constituido por
bombesina, EGF, transferrina, gastrina, péptido de liberación de
gastrina, factor de crecimiento derivado de plaquetas,
IL-2, IL-6-
TGF-\alpha, TGF-\beta, VGF,
insulina y factores de crecimiento I y II tipo insulina.
7. Un compuesto de la reivindicación 6 en el que
X es bombesina.
8. Un compuesto de la reivindicación 1 en el que
X es in ligando seleccionado entre el grupo constituido por
carbohidratos, esteroides y lectinas.
9. Un compuesto de una cualquiera de la
reivindicación 1 a 8 en el que el resto de antibiótico de
antraciclina se selecciona entre el grupo constituido por
adriamicina, daunomicina, detorrubicina, carminomicina,
idarrubicina, epirrubicina, AD-32,
4-morfolinil-adriamicina y
3'-desamino-3'-(3-ciano-4-morfolinil)-desoxirrubicina.
10. Un compuesto de la reivindicación 9 en el que
el resto de antraciclina es adriamicina.
11. Un compuesto de la reivindicación 10, en el
que n es 5.
12. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que Y es O, p es 2, y z es 1.
13. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que Y=NH_{2}^{+}Cl^{-}, p es 3,
y z es 1.
14. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que z es 0.
15. Un compuesto de la reivindicación 1 de
Fórmula (Ib):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
n es un número entero de 1 a 10;
q es 1 a 10; y
X se define como en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
16. Un compuesto de la reivindicación 1 de
Fórmula (Ic):
en la
que
q es 4 a 8; y
X se define como en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
17. Un compuesto de la reivindicación 1 de
Fórmula (Id):
en la que q es de 4 a 8 e Ig es un
anticuerpo BR96 quimérico relajado, o un fragmento del
mismo.
18. Una formulación farmacéutica que comprende un
compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, asociado
con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable
para los mismos.
19. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17 para su uso en terapia.
20. El uso de un compuesto de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 17 para preparar una composición
farmacéutica para tratar una enfermedad neoplásica.
21. Un procedimiento para preparar un compuesto
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende
a) hacer reaccionar un compuesto de Fórmula
(IIc):
en la que R_{1}, R_{3},
R_{4}, R_{5}, R_{6} y n son como se han definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a
17.
con un compuesto de Fórmula (III):
en la que X, p, Y, z y q son como
se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17;
o
b) hacer reaccionar un compuesto de Fórmula
(11):
en la que R_{1}, R_{3},
R_{4}, R_{5} y R_{6} son como se han definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a
17.
Con un compuesto de Fórmula (IVb):
en la que n, X, p, Y, z y q son
como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
17;
y,
si se desea, asilar el producto.
22. El procedimiento de la reivindicación 21 para
preparar un compuesto en el que z es 0 y el ligando X es una
proteína que contiene sulfhidrilo, comprendiendo adicionalmente
dicho procedimiento:
(a) reducir dicha proteína en una atmósfera
inerte; y
(b) recuperar el producto para producir el
compuesto de Fórmula (III), en el que z y X son como se han definido
anteriormente y q se define en la reivindicación 21.
23. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22 en el que el agente reductor es DTT.
24. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 23 en el que la proporción molar de DTT a ligando es
1:1 a 10:1.
25. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24 en el que la proporción molar de DTT a ligando es
6:1 a 10:1.
26. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 en el que el pH de la
etapa de reducción es de 6,0 a 8,0.
27. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 26 en el que el pH de la etapa de reducción es de 7,0
a 7,5.
28. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27 en el que el producto se
purifica por diafiltración.
29. Un compuesto de Fórmula (IIc):
en la que R_{1}, R_{3},
R_{4}, R_{5}, R_{6} y n son como se han definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a
17.
\newpage
30. Un compuesto de Fórmula (IVb):
en la que n, p, Y, z, X y q son como se han
definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
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