ES2243314T3

ES2243314T3 - Composiciones para la prevencion y el tratamiento del rechazo de trasplantes.

Info

Publication number: ES2243314T3
Application number: ES00972507T
Authority: ES
Inventors: Alexandra Lucas; Grant D. Mcfadden; Robert Zhong
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2020-10-27
Also published as: DE60020727D1; US20030171263A1; EP1223971A2; WO2001030379A2; US7514405B2; CA2385312A1; EP1223971B1; US7906483B2; WO2001030379A3; JP2003512436A; US20090221472A1; PT1223971E; AU1123001A; CA2385312C; DE60020727T2; ATE297217T1

Abstract

Utilización de la composición que comprende Serp-1, un análogo de Serp-1 o un fragmento de la misma biológicamente activo, uno o más agentes inmunosupresores y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del rechazo del transplante de aloinjertos en un órgano en un mamífero receptor de transplante.

Description

Composiciones para la prevención y el tratamiento del rechazo de trasplantes.

La presente invención se refiere a la utilización de una proteína vírica, Serp-1, y sus análogos y fragmentos biológicamente activos de la misma en combinación con un agente inmunosupresor para tratar el rechazo inmune agudo y crónico en los mamíferos.

El éxito de los trasplantes quirúrgicos de órganos y tejidos depende en gran parte de la capacidad de los clínicos para modular la respuesta inmune del receptor del trasplante. Específicamente, la respuesta inmunológica dirigida contra el tejido extraño trasplantado se debe controlar si el tejido ha de sobrevivir y funcionar. Se conoce que el sistema inmune que funciona normalmente del receptor del trasplante reconoce el órgano trasplantado como tejido "no suyo" y a partir de ahí produce una respuesta inmune a la presencia del órgano trasplantado. Dejada sin control, la respuesta inmune generará una multitud de células y proteínas que finalmente producirán la pérdida de la función biológica o la muerte del órgano trasplantado.

El rechazo de los trasplantes sigue siendo el principal impedimento a la supervivencia de los injertos en los seres humanos. La terapia inmunosupresora actual utilizada para tratar las reacciones de rechazo suprime la actividad de las células T y B pero no modifica las respuestas inflamatorias que se cree que contribuyen al rechazo de los trasplantes [Fryer et al., Transplantation 62(5): 553-559 (1996)].

Los receptores de trasplantes de órganos y tejidos son tratados generalmente con uno o más agentes citotóxicos en un esfuerzo para suprimir la respuesta inmune del receptor del trasplante contra el órgano o tejido trasplantado. Por ejemplo, la Ciclosporina A, (p. ej., Neoral® o Sandimmune®), un péptido cíclico que consiste en 11 residuos de aminoácido y producido por la especie de hongos Tolypocladium Inflatum Gams, se utiliza en la actualidad para administrar a los receptores de aloinjertos de riñón, hígado, páncreas y corazón (es decir, aquéllos en los que receptor y donante son de la misma especie). Sin embargo, la administración de ciclosporina A no está libre de complicaciones ya que el fármaco puede producir toxicidad en el hígado y riñón así como también hipertensión. Además, la utilización de la ciclosporina A puede producir cánceres (tales como linfoma) y conduce a infecciones oportunistas debidas a la inmunosupresión sistémica que induce en los pacientes que reciben un tratamiento a largo plazo con el fármaco, es decir, la respuesta inmune protectora normal del huésped a los microorganismos patógenos está negativamente regulada aumentando así el riesgo de infecciones producidas por dichos microorganismos.

Los agentes inmunosupresores actualmente disponibles tales como la ciclosporina A fracasan en prevenir el rechazo refractario tanto agudo como crónico. Cerca del 20% de los injertos de riñón y corazón de cadáveres se pierden durante el primer año post-trasplante, principalmente debido al rechazo agudo [Uretsky et al., Circulation 76: 827-834 (1987); Hosenpud et al., Transplantation 13: 561-570 (1994); Canadian Organ Replacement Register 1993 Report pag. 187; Cook et al., Clinical Transplants 277-285 (1987)]. El rechazo crónico supone obstáculos formidables para las terapias inmunosupresoras existentes. El 50% de los trasplantes de pulmón desarrollan bronquitis obliterans, el indicador de rechazo crónico de aloinjerto [Miller, L., J. Heart Lung Transplant 14: S109-S110 (1995); von Willebrand et al., Transplantation Proc. 29:1530-1531 (1997); Hayry et al., Transplantation Proc. 28:2337-2338 (1996); Tilney et al., Transplantation Proc. 27:2123-2125 (1995); Tilney et al., Transplantation Proc. 52: 389-398 (1991)]. Solamente el 20% de los trasplantes renales de cadáveres continúan funcionando a los 10 años post trasplante (Uretsky et al., Circulation 76:827-834 (1987); Hosenpud et al., Transplantation 13: 561-570 (1994); Canadian Organ Replacement Register 1963 Report p. 187; Cook et al., Clinical Transplants 277-285 (1987)]. La vasculopatía del trasplante, inducida por el rechazo crónico y la isquemia, es la principal causa de la pérdida del injerto de trasplante cardiaco después del primer año post trasplante [Miller, L., J. Heart Lung Transplant 14: S109-S110 (1995)]. Además, la terapia post trasplante actual necesita una administración continua (p. ej., diaria) de un agente antirrechazo durante el resto de la vida del receptor de trasplante.

Aunque el rechazo agudo está principalmente activado por las células T, la función de la inflamación ha sido recientemente implicada en la patogénesis del rechazo [Hayry et al., Transplantation Proc. 28:2337-2338 (1996)]. La activación de muchas citoquinas (p. ej., IL-2, IFN\gamma, TNF\alpha) y quimioquinas (p. ej. RANTES, IL-8, MCP-1 y MIP-1\alpha) tiene lugar durante las respuestas inflamatorias al rechazo de los injertos (Hayry et al. Transplantation Proc. 29:2551 (1997); von Willebrand et al., Transplantation Proc. 29:1530-1531 (1997); Tilney et al., 25:861-862 (1993)]. Se cree que la disminución de la inflamación puede conducir a velocidades inferiores de rechazo agudo y a largo plazo y a una mejor función del injerto [Fryer et al., Transplantation 62(5):553-559 (1995)].

EL rechazo crónico resulta más difícil de comprender. Históricamente, el rechazo vascular crónico se ha descrito como un daño repetido del endotelio que conduce a la proliferación de la íntima, hipertrofia seguida de la oclusión del lumen (Tilney et al., Transplantation Proc. 27:2123-2125 (1995); Tilney et al., Transplantation Proc. 52:389-398 (1991)]. Algunos investigadores han propuesto mecanismos cicatrizantes no específicos, inflamatorios, humorales, celulares y relacionados con las citoquinas, como las etiologías del rechazo crónico [Hayry, et al., Transplantation Proc. 28:2337-2338 (1996); Tilney et al., Transplantation Proc., 27;2123-2125 (1995); Tilney et al, Transplantation Proc., 52:389-398 (1991)]. En la actualidad se conoce que factores independientes de aloantígenos desempeñan una función esencial en el rechazo crónico. Por ejemplo, los injertos de riñón humano entre gemelos idénticos pierden su injerto en diez años (Tilney et al., Worl J. Surgery 10:381-388 (1986); Classock et al., Medicine 47:411-454 (1968)]. Se cree que tales perdidas de isoinjertos son una consecuencia de los daños durante la conservación y reperfusión. Los daños debidos a una multiplicidad de etiologías activan cascadas trombóticas e inflamatorias en la pared vascular que convergen, iniciando una respuesta rápida y generalizada que estimula la migración celular, invasión y proliferación en los lugares de daño vascular [Aziz et al., Lung Transplat 14:S123-S136 (1995); Libby et al., Circulation 86:Supp:III:47-52 (1992)]. Como consecuencia, los mediadores de la inflamación y las citoquinas son regulados positivamente y segregados como respuesta al daño del endotelio, lo que resulta en la acumulación de macrófagos que, a su vez, regulan positivamente más quimioquinas (p.ej. RANTES, IL-8, MCP-1 y MIP-1\alpha) [von Willbrand et al. Transplantation Proc. 29:1530-1531 (1997)], citoquinas (p. ej., IL-1, IL-6, TNF\alpha) [Tilney et al., 25:861-862 (1993)] y factores de crecimiento [Hayry et al., Transplantation Proc. 29:2551 (1997)].

Los virus de ADN grandes han desarrollado a lo largo de millones de años una multiplicidad de mecanismos muy efectivos que incrementan o inhiben las cascadas trombóticas/trombolíticas e inflamatorias y alteran la invasión celular en las zonas de daño tisular [Gooding, et al., Cell 667:141-150 (1992); Spriggs, M. K. Annu. Rev. Immunol. 14:101-130 (1996); Smith G. L. Trends Microbiol. 82:80-88 (1994)]. Se ha demostrado recientemente que las serina proteinasas trombóticas/trombolíticas y las cascadas de citoquinas inflamatorias estimulan la quimiotaxia celular y la mitogénesis [Blasi, F. Trends in Immunol. Today, 18:415-419 (1997); Luster, A.D., N. Eng. Journal, 338:436-445 (1998)]. Las proteínas segregadas por el virus myxoma imitan frecuentemente a las moléculas de la inmunidad celular tales como los receptores de las citoquinas y actúan uniéndose e inhibiendo las citoquinas, quimioquinas u otras proteínas reguladoras [McFadden et al., Leukocyte Biol., 57:731-738 (1995); Mossman et al., J. Biol. Chem., 270:3031-3038 (1995). Anteriormente se ha publicado que la Serp-1, un inhibidor de las serina proteinasas, inhibe el desarrollo de inflamación y ateroma en los modelos de conejos y rata después del daño mediante globo y reduce dramáticamente la invasión de los macrófagos y el crecimiento de las placas ateroscleróticas en conejos alimentados con colesterol después del daño por angioplastia [Lucas et al., Circulation 94:2890-2900 (1996)]. Los estudios preliminares en un modelo de aloinjerto de aorta en ratas han demostrado asimismo una reducción significativa tanto de la invasión de células mononucleares como de las vasculopatías de trasplante después de la infusión de dichas proteínas víricas [Miller et al., Circulation, 101:1598-1605 (2000); Mossman et al., Virology 215:17-30 (1996)].

La Serp-1 es una glicoproteína de 55 kD que inhibe una multiplicidad de serina proteinasas que regulan la respuesta inflamatoria. La Serp-1 regula las proteínas trombolíticas, plasmina, activador tisular del plasminógeno (tPA) y la uroquinasa. Una única infusión local de la proteína Serp-1, clonada y expresada a partir de un vector de vaccinia, en el lugar del daño por globo disminuye dramáticamente el subsiguiente crecimiento de placa y la invasión de macrófagos [Lucas et al., supra (1996)]. La Serp-1 modula la transcripción de elementos de la cascada trombolítica poco después del daño del endotelio. La Serp-1 constituye el objeto de tres patentes; US nº 5.686.409 titulada "Antirestenosis Protein"; nº 5.919.014 y nº 5.939.525 tituladas ambas "Methods of Treating Inflammation and Compositions Therefor".

Se ha descubierto de acuerdo con la presente invención, que la co-administración de Serp-1, análogos de la Serp-1 y fragmentos biológicamente activos de las mismas y un agente inmunosupresor es capaz de prevenir el rechazo de los aloinjertos y xenoinjertos en los mamíferos sin necesidad de la administración sostenida de un agente antirrechazo.

Se ha descubierto que, sorprendentemente, de acuerdo con la presente invención, la coadministración de Serp-1, sus análogos y fragmentos biológicamente activos de la misma, y un agente inmunosupresor sirve para tratar los aloinjertos y xenoinjertos en los animales, incluyendo los seres humanos. De acuerdo con la presente invención, sorprendentemente se ha descubierto asimismo que la coadministración de Serp-1 y un agente inmunosupesor durante un período de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 días post-trasplante es efectiva para tratar el rechazo de los injertos sin la administración adicional de un agente inmunosupresor. En una forma de realización preferida, la coadministración de Serp-1 y un agente inmunosupresor tiene lugar durante un período comprendido entre aproximadamente 8 y aproximadamente 15 días post trasplante.

La presente invención proporciona una composición para su utilización en el tratamiento del rechazo de los injertos en los mamíferos. El rechazo de injerto tratable según la presente invención incluye los órganos trasplantados por aloinjerto y xenoinjerto. De acuerdo con la presente invención, la Serp-1, análogos de la Serp-1 o fragmentos biológicamente activos de la misma, se han de administrar con un agente inmunosupresor a un sujeto que necesita dicho tratamiento durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para tratar el rechazo del injerto.

Una forma de realización de la presente invención se refiere al tratamiento del rechazo de trasplantes de riñón en mamíferos. Otra forma de realización de la presente invención se refiere al tratamiento del rechazo del trasplante de corazón en mamíferos. Todavía otra forma de realización de la presente invención se refiere al tratamiento del rechazo del trasplante de órganos entre una especie de mamífero y otra especie de mamífero diferente. En dichas formas de realización de la presente invención, la Serp-1, el análogo de la Serp-1 o el fragmento biológicamente activo de la misma se ha de administrar junto con un agente inmunosupresor, p. ej., Cyclosporiona A, de un modo consistente con los procedimientos convencionales asociados al trasplante de órganos de mamíferos para tratar el rechazo de los injertos.

Estos y otros objetivos de la presente invención se logran mediante la co-administración de Serp-1, sus análogos y fragmentos biológicamente activos de la misma en cantidades suficientes para lograr el efecto terapéutico deseado.

la Figura 1 describe un modelo quirúrgico de trasplante de riñón en ratones;

la Figura 2 describe una comparación histopatológica entre aloinjertos renales tratados con Serp-1 y controles;

la Figura 2(A) describe un aloinjerto renal representativo tratado con CsA solamente que muestra el típico engrosamiento de la íntima en una arteriola;

la Figura 2(B) describe un aloinjerto renal representativo tratado con CsA y un tratamiento corto con Serp-1 (dosis elevada) que muestra la apariencia normal de una arteriola;

la Figura 2(C) describe un aloinjerto renal representativo tratado con CsA solamente, que muestra la cicatrización típica en un glomérulo;

la Figura 2(D) describe un aloinjerto renal representativo tratado con CsA y un tratamiento corto con Serp-1 (dosis elevada) mostrando la arquitectura normal de un glomérulo;

la Figura 3 muestra que la Serp-1/Neoral® produce una disminución significativa del porcentaje de vasos coronarios enfermos, contra los controles;

la Figura 4 describe la calificación media por palpación de los cuatro grupos durante un período de seguimiento de 13 semanas. La calificación media por palpación del grupo control fue inferior a la de los tres grupos tratados con Serp-1 y Neoral®.

la Figura 5 muestra que la Serp-1/CsA protege los vasos coronarios contra la enfermedad vascular del injerto, comparado con el tratamiento con CsA solamente.

Según la presente invención, se ha descubierto sorprendentemente que la proteína Serp-1, un inhibidor de la serina proteasa producida por el virus del fibroma maligno del conejo (MRV) y el virus mixoma (MYX), sus análogos y los fragmentos biológicamente activos de la misma en combinación con un agente inmunosupresor, sirve para tratar el rechazo agudo y crónico de los injertos en los mamíferos. La presente invención, por consiguiente, es útil para el tratamiento del rechazo de los trasplantes. En la presente invención, el término "tratar", "tratando" o "tratamiento" incluye evitar, inhibir, reducir la ocurrencia y/o disminuir los efectos fisiológicos del rechazo de injertos. El término "rechazo del injerto" significa el rechazo de aloinjertos y xenoinjertos.

Se ha descubierto sorprendentemente que la co-administración de Serp-1 y un agente inmunosupresor durante un período comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 días post-trasplante es eficaz para el tratamiento del rechazo del injerto sin la administración adicional de un agente inmunosupresor. Preferentemente, la Serp-1 y el agente inmunosupresor se han de co-administrar durante un período comprendido entre aproximadamente 8 y aproximadamente 15 días post trasplante. Se contempla además que el período de co-administración de la Serp-1 y el agente inmunosupresor sea sustancialmente continuo. "Sustancialmente continuo" significa durante un período de días secuencial. Por ejemplo, desde un lunes hasta el lunes siguiente.

La presente invención, por consiguiente, proporciona unos medios para el tratamiento del rechazo de los trasplantes. Sin querer estar vinculados a ningún mecanismo en particular, se cree que el agente inmunosupresor de la presente invención bloquea complejos inmunes que funcionan mejorando la reacción al tejido extraño. La Serp-1 inhibe los componentes reguladores inflamatorios tempranos. Por "componentes reguladores inflamatorios tempranos" se entienden las actividades de los neutrófilos, monocitos, macrófagos o células asesinas naturales (NK). El efecto sinérgico de los componentes activos de la presente invención mejora drásticamente el resultado del trasplante a corto y largo plazo, de modo que no resulta necesario administrar un agente inmunosupresor después de aproximadamente 1 y aproximadamente 30 días de tratamiento.

Según la presente invención, el rechazo de los trasplantes se caracteriza por una disminución aguda o crónica de la función fisiológica del órgano trasplantado. Dicha disminución de la función se mide mediante factores fisiológicos específicos del órgano trasplantado. Por ejemplo, para la evaluación del rechazo del trasplante de riñón, los indicadores del rechazo del injerto son el incremento de la atrofia glomerular, el engrosamiento de la íntima, la atrofia tubular, la fibrosis intersticial, la infiltración de linfocitos y la cicatrización cortical, independientemente o en combinación. De modo similar, para la evaluación del rechazo del trasplante de corazón son indicadores del rechazo del injerto el incremento en la enfermedad vascular cardiaca post-trasplante y el incremento en la hiperplasia de la íntima del injerto, independientemente o en combinación.

El término "agente inmunosupresor" significa, tal como se utiliza en la presente memoria, cualquier agente farmacéutico inmunosupresor comercialmente disponible que reduce la tendencia del órgano trasplantado a ser rechazado por el receptor del trasplante. El tratamiento del rechazo del trasplante se valora según la presente invención mediante uno o más de los siguientes parámetros órgano-dependientes: la disminución de la hiperplasia de la íntima del injerto coronario en comparación con los vasos injertados como control; el funcionamiento renal tal como se mide mediante los niveles seriados de creatinina sérica; la prolongación de la supervivencia del injerto; la hialinización y cicatrización cortical en los injertos renales.

Los agentes inmunosupresores contemplados en la presente invención incluyen específicamente, pero sin limitarse a ellos, ciclosporina (por ejemplo, Ciclosporina A, Sandimmune®, Neoral® (Novartis), Rapimmune® (American Home Products) FK501 (Fujisawa), CELLCEPT® (Roche, Syntex), IMUREK®, SPANIDIN® y PROGRAF®). El término "sujeto" tal como se utiliza en la presente memoria significa cualquier paciente mamífero al que se pueden administrar las composiciones de la presente invención. Los sujetos para los que específicamente está destinado el tratamiento con las composiciones de la presente invención incluyen humanos, así como también primates no humanos, ovejas, caballos, vacas, cabras, cerdos, perros, gatos, conejos, cobayas, aves de corral, hámsters, ratas y ratones, así como también los órganos derivados u originados a partir de dichos huéspedes.

En las formas de realización de la presente invención mencionadas anteriormente, la composición Serp-1/agente inmunosupresor se administra, para tratar el rechazo de los trasplantes, de un modo consistente con los procedimientos convencionales asociados a los trasplantes de órganos de mamíferos, tales como por ejemplo, intravenosamente, intraarticularmente, intraperitonealmente, intramuscularmente o subcutáneamente. En una forma de realización preferida, la Serp-1 se co-administra con Ciclosporina (p. ej., Ciclosporina A (CsA) o Neoral®).

La combinación de Serp-1/CsA preferida de la presente invención se puede administrar a un paciente humano, preferentemente como una composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente efectiva. Las composiciones farmacéuticas para utilización en la presente invención contienen una dosis terapéuticamente efectiva de las combinaciones de agente inmunosupresor y proteína Serp-1, homólogos o análogos de la misma o fragmentos biológicamente activos de la proteína Serp-1, junto con vehículos farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, se contempla que una cantidad terapéuticamente efectiva de agente inmunosupresor o combinación del mismo, se pueda administrar durante aproximadamente 1 y aproximadamente 30 días antes de la administración de la cantidad terapéuticamente efectiva de Serp-1 sola y/o Serp-1 junto con el agente inmunosupresor, para lograr el tratamiento deseado del rechazo del injerto. "Antes" significa dentro de aproximadamente 1 día de la co- administración de la combinación de Serp-1/agente inmunosupresor de la presente invención.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la dosis necesaria para tratar efectivamente los efectos fisiológicos del rechazo del injerto.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "análogo" incluye sustituciones o alteraciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína Serp-1, sustituciones o alteraciones (p. ej. adiciones y deleciones) que mantienen las propiedades antiinflamatorias de la proteína cuando se administra al lugar de la inflamación, directamente en el lugar, es decir localmente, o sistémicamente. Para los objetivos de la presente invención, el término "análogo" incluye los derivados por inserción de aminoácidos de la Serp-1 tales como las fusiones amino y/o carboxi terminales así como las inserciones intrasecuencia de uno solo o de múltiples aminoácidos. Las variantes por inserción de la secuencia de aminoácidos son aquéllas en las que se introduce uno o más residuos de aminoácido en un lugar predeterminado de la proteína. La inserción al azar también es posible con una selección adecuada de producto resultante. Las variantes por eliminación se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes por sustitución de aminoácidos son aquéllas en las que por lo menos se inserta un residuo en su lugar. Cuando se derivatiza la proteína por sustitución de aminoácidos, los aminoácidos generalmente se reemplazan por otros aminoácidos con propiedades físicas y químicas similares tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, electronegatividad, cadenas laterales voluminosas y similares. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no-polar (hidrófobo) tal como la isoleucina, valina, leucina o metionina por otro. De modo similar, la presente invención contempla la sustitución de residuos polares (hidrófilos) tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y esparraguina y entre glicina y serina. Además, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro o la sustitución de un residuo ácido tal como el ácido aspártico y/o el ácido glutámico por otro, también se contempla.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "análogo" también comprende los homólogos de la Serp-1, es decir, las secuencias de aminoácidos derivadas de otras serpinas que tienen las mismas o sustancialmente las mismas propiedades inflamatorias. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "fragmentos biológicamente activos" significa fragmentos de la Serp-1 o análogos de la Serp-1 que no comprenden toda la longitud del polipéptido de la Serp-1 pero que sin embargo mantienen las propiedades antiinflamatorias de todo el polipéptido de la Serp-1 o análogo de la misma cuando son administrados al lugar de inflamación tanto en el lugar (es decir localmente) como sistémicamente.

Las variantes de la Serp-1 se pueden producir fácilmente utilizando procedimientos de síntesis de péptidos bien conocidos en la técnica, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida (síntesis de Merrifield) y similares o mediante procedimientos de ADN recombinante bien conocidos en la técnica. Los procedimientos para hacer mutaciones por sustitución en lugares predeterminados del ADN incluyen, por ejemplo, mutagénesis de M13. La manipulación de la secuencia de ADN para producir variantes por sustitución, inserción o eliminación están convenientemente descritos en otras publicaciones tales como Sambrook, et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y.

Para los objetivos de la presente invención, los análogos de la Serp-1 también incluyen sustituciones únicas o múltiples, eliminaciones y/o adiciones de cualquier componente(s) natural(es) o artificialmente asociado(s) con la Serp-1 tal como carbohidrato, lípido y/o otros partes proteináceas. Dichas moléculas están todas comprendidas por el término "análogos de la Serp-1".

En una forma de realización de la presente invención, para incrementar la actividad especifica de la proteína Serp-1 preparada, el residuo de cisteína en la posición 244 se puede sustituir por otro residuo de aminoácido, por ejemplo alanina. Dicha sustitución hace que la proteína Serp-1 sea biológicamente más activa ya que el residuo de cys^{244} está en la posición prevista para la formación de dímeros de Serp-1 a través de puentes de disulfuro. Debido a que la cys^{244} está muy cerca del centro activo de la proteína Serp-1, se cree que los dímeros de Serp-1 tienen un centro activo perturbado y ofuscado que los hace biológicamente inactivos [Lomas et al., J. Biol. Chem., 268(1):516-521 (1993)]. Una mutación en la posición 244 evita la formación de dímeros de Serp-1 durante la producción de Serp-1 mediante procedimientos de ADN recombinante. La disminución de la presencia de dímeros de Serp-1 en una muestra de preparación resulta útil ya que la actividad específica de la proteína aislada aumentará y se necesitará menos proteína en una preparación farmacéutica.

Se cree que la actividad inhibidora de las serpinas sobre las serina proteinasas gira alrededor de la lenta disociación de la serpina entre los residuos P1 y P1' en la región activa [Upton et al., Virology 179:618-631 (1990)]. La secuencia de aminoácidos Arg/Asp ha sido recientemente localizada en el lugar predicho P1-P1' de la Serp-1 (residuos de aminoácido 319 y 320) y es el lugar predicho de corte por las serina proteinasas. La sustitución de uno cualquiera o de los dos residuos de aminoácido produce análogos de la Serp-1 con diversas actividades biológicas útiles en la práctica de la presente invención. Los análogos, homólogos y variantes de la Serp-1 se describen en las patentes estadounidenses nº 5.686.409 titulada "Antirestenosis protein" y nº 5.939.525 titulada "Methods of treating inflammation and compositions therefor".

La formulación de composiciones farmacéuticas es generalmente conocida en la técnica y convenientemente se pueden hacer referencias a la publicación Pharmaceutical Sciences de Remington, 17ª edición, Mack Publishing Co., Easton, Pa. La formulación de Serp-1/agente inmunosupresor para su utilización en la presente invención debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y también se debe preservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como las bacterias y los hongos. La preservación contra la contaminación de los microorganismos se puede lograr mediante la adición de diversos agentes antibacterianos y antifúngi-
cos.

Las formas farmacéuticas de la Serp-1/agente imunosupresor adecuadas para la infusión incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. En todo caso, la forma debe ser estéril y debe ser fluida al extremo de que exista un fácil uso por jeringa. Los vehículos típicos comprenden un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, soluciones acuosas tamponadas (es decir, tampones biocompatibles), etanol, polioles tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, mezclas adecuadas de éstos, detergentes, o aceites vegetales. La esterilización se puede lograr mediante un procedimiento reconocido en la técnica, que incluye, pero sin limitarse a ello, la filtración o adición de agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico o timerosal. Además, se pueden incorporar agentes isotónicos tales como azúcares o cloruro sódico en las composiciones.

La producción de soluciones inyectables estériles que contienen la composición en cuestión se logra mediante la incorporación de estos compuestos en la cantidad adecuada en el disolvente adecuado con los múltiples ingredientes necesarios enumerados anteriormente, seguida de esterilización, preferentemente esterilización por filtración. Para obtener un polvo estéril, las anteriores soluciones se secan al vacío o se liofilizan según sea necesario.

Dichas composiciones se combinan así para una conveniente y efectiva administración en cantidades farmacéuticamente efectivas con vehículos farmacéuticamente aceptables en una dosis terapéuticamente efectiva.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "vehículo o y/o diluyente farmacéuticamente aceptable" comprende cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, agentes antibacterianos y antifúngicos, microcápsulas, liposomas, vehículos de lípidos catiónicos, agentes isotónicos y ralentizadores de la absorción y similares que no son incompatibles con los ingredientes activos, p. ej. Serp-1, Ciclosporina A, Rapimmune® o FK501. La utilización de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. También se pueden incorporar ingredientes activos suplementarios en las composiciones y utilizarlos en los procedimientos de la presente invención. Los ingredientes activos suplementarios contemplados en la presente invención, incluyen, pero sin limitarse a ellos, los corticoesteroides.

La cantidad precisa terapéuticamente efectiva de, p. ej., Serp-1/ciclosporina A que se utilizará en los procedimientos de la presente invención aplicada a humanos, se puede determinar por los expertos en la materia teniendo en consideración las diferencias individuales en edad, peso, tamaño de órganos y condiciones del paciente. En general se puede afirmar que la preparación farmacéutica Serp-1/agente inmunosupresor de la presente invención debe ser preferentemente administrada en una cantidad comprendida entre por lo menos aproximadamente 1 pg/kg y aproximadamente 1 g/kg por dosis de infusión, más preferentemente en una cantidad comprendida entre aproximadamente 3 \mug/kg y aproximadamente 1 mg/kg por dosis.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en formas unitarias de dosis para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosis unitaria tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis para los sujetos mamíferos que deben ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. Las especificaciones para las nuevas formas de dosis unitarias de la presente invención están dictadas por, y son directamente dependientes de las características únicas del material activo (p. ej. la proteína Serp-1, Ciclosporina A, Neoral©, FK501, Rapimmune®) y las limitaciones inherentes en la técnica de combinar dichos materiales activos para el tratamiento del rechazo de los trasplantes tal como se da a conocer en la presente solicitud en detalle.

Los ingredientes activos principales se combinan para una administración conveniente y efectiva en cantidades efectivas con un vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable en formas de dosis unitarias tal como se dio a conocer anteriormente. Una forma de dosis unitaria puede, por ejemplo, contener los componentes activos principales en cantidades comprendidas entre aproximadamente 1 pg/kg y aproximadamente 1 g/kg. El agente inmunosupresor (p. ej. Ciclosporina A) o combinaciones de agentes inmunosupresores (p. ej., Ciclosporina A y FK501) están contenidos en una forma de dosis unitaria en cantidades comprendidas entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg. Cuando se utilizan combinaciones de agentes inmunosupresores, se contempla que la forma de dosis unitaria total de dichos agentes esté comprendida entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 40 mg/kg. En el caso de composiciones que contienen ingredientes activos suplementarios, la dosificación se determina por referencia a la dosis habitual y a las formas de administración del ingrediente.

El material de embalaje utilizado para contener p. ej., el ingrediente activo Serp-1/CsA, puede comprender vidrio, plástico, metal o cualquier otro material inerte adecuado siempre y cuando el material de embalaje no reaccione químicamente con ninguno de los ingredientes contenidos en el mismo.

La composición de la presente invención se puede administrar de modo compatible con la formulación de las dosis y en cantidades tales que sean terapéuticamente efectivas. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar de cualquier modo médicamente aceptable lo que puede depender del tipo de trasplante que se debe tratar. Las vías de administración posibles incluyen inyecciones por vías parenterales tales como intravenosa, intravascular, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural u otras. Las composiciones también se pueden aplicar directamente (tópicamente) a las superficies del tejido durante el trasplante. La administración sostenida también se incluye específicamente en la invención, por medios tales como inyección de depósitos o implantes erosionables.

La presente invención se describe con mayor detalle mediante los siguientes ejemplos específicos pero que no limitan en modo alguno la presente invención.

Ejemplo 1 Rechazo crónico de aloinjerto en un modelo de riñón de rata evitado por Serp-1/CsA

Ratas macho F344 sirvieron como donantes y ratas Lewis como receptores en los trasplantes ortotópicos de riñón. Se extrajeron los riñones nativos de los receptores en el momento de la cirugía (Figura 1). La supervivencia de los animales dependió exclusivamente de la función del riñón trasplantado. Los animales recibieron CsA subterapéutico (0,75 mg/kg sc) durante 10 días para evitar el rechazo inicial agudo. Se esperó que más del 60% de los animales sobreviviese hasta el día post-operación (POD) 140 y mostrase características de rechazo crónico de aloinjerto renal (es decir, engrosamiento de la íntima, esclerosis glomerular, atrofia tubular, fibrosis intersticial así como también cortical). Dichos animales se incluyeron en el análisis final.

Grupos

Grupo 1: F344 a Lewis con CsA, n = 10 (control)

Grupo 2: F344 a Lewis con CsA + Serp-1 10 ng/g IV día post operatorio (POD) 0-10 dosis intermedia, n = 12;

Grupo 3: F344 a Lewis con CsA + Serp-1 50 ng/g IV POD 0-10 dosis elevada, n = 12;

Evaluación

1) Niveles séricos seriados de creatinina en POD 140

2) Niveles de CsA en POD 7

3) Patología de rutina en POD 140

Resultados Supervivencia y función

La Tabla 1 muestra la supervivencia, los niveles de CsA y la función renal. El 91% y el 67% de los animales sobrevivieron hasta el sacrificio el día 140 (P > 0,05 contra el control). Todos los animales tratados con Serp-1 mostraron ganancia de peso de entre 100 y 120 g y no se encontraron efectos secundarios en dichos animales. La función renal, tal como se midió mediante los niveles de creatinina en suero en el grupo tratado con la dosis de Serp-1 elevada fue significativamente mejor que la del grupo control (P > 0,01).

Hallazgos histopatológicos en la necropsia

Las secciones microscópicas teñidas con hematoxilina-eosina (HE) y tricorne fueron medidas ciegamente por el Dr. B. García, Profesor de Patología, University of Western Ontario. La gravedad del rechazo crónico se calificó como 0- sin cambio, 1- cambio mínimo, 2- cambios ligeros, 3- cambios moderados y 4- cambios notables. La calificación media de los cambios histopatológicos y el porcentaje de casos positivos se presentan en la Tabla 2. Los aloinjertos renales en el grupo control desarrollaron rechazo crónico típico caracterizado por engrosamiento de la íntima, hialinización y cicatrizado cortical (Figura 2A). Por el contrario, no hubo o sólo hubo cambios vasculares mínimos en los aloinjertos renales tratados con la combinación de dosis baja de CsA y un tratamiento corto con una dosis elevada de Serp-1 (Figura 2B). No hubo mejora histológica en los aloinjertos renales tratados con una dosis intermedia de Serp-1.

Los resultados demostraron que un tratamiento corto con Serp-1/CsA mejora significativamente la función renal y la histopatología, evitando así el rechazo crónico del injerto en este modelo. Estos datos sugieren que la proteína vírica (Serp-1) en combinación con una dosis baja de CsA se puede utilizar en el trasplante clínico para evitar el rechazo del injerto.

TABLA 1 Supervivencia y niveles de creatinina

1

Nota:

CsA administrada SC en el POD 0-9

Serp-1 administrada IV en el POD 0-10

\gg Sacrificados

** p = 0,029 contra el control experimental

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Cambios histopatológicos

2

Nota:

- los datos son el porcentaje de los animales que muestran evidencia del patrón de daño indicado;

- El número entre paréntesis indica la calificación media de daño;

- Control = CsA 0,75 mg/kg subcutánea (SC) en el día post operación POD 0-9;

- Control experimental = CsA 0,75 mg/kg SC en POD 0-9 + solución salina 2 cc en IV en el POD 0-10;

- Proteína vírica dosis med. = CsA 0,75 mg/kg SC en POD 0-9 + Serp-1 10 ng/g IV en POD 0-10;

- Proteína vírica dosis alta = CsA 0,75 mg/kg en POD 0-9 + Serp-1 50 ng/g IV en POD 0-10;

* P < 0,05, contra control, prueba Mann-Whitney

Ejemplo 2

El tratamiento de ratas receptores en un modelo de trasplante heterotópico de corazón con Serp-1 y Neoral® Ciclosporina (CsA) evitó el desarrollo de la enfermedad vascular del injerto (Figura 3).

El modelo utilizado más generalmente en la investigación preclínica de la enfermedad vascular del injerto es un modelo en el que se realiza un trasplante heterotópico de corazón en ratas no emparejadas por MHC. En dicho modelo, los roedores tratados con Ciclosporina A durante solamente los primeros 7 días siguientes al trasplante, desarrollan enfermedad vascular del injerto cuando se analizan una vez sacrificados en el día 90 post operación.

Con base en la experiencia del solicitante más reciente con dicho modelo, se utilizó la combinación PVG a ACI en la que el receptor se trató con 7,5 mg/kg de Neoral® mediante gavaje desde el día 0 al día 9. En este modelo, la incidencia de rechazo agudo (y por consiguiente la pérdida del animal) fue del 30%. El estrechamiento medio del lumen en este modelo fue del 50% en el día 90.

Para el modelo de trasplante heterotópico de corazón en ratas, se ataron las venas pulmonares y las venas cava en el momento de la cosecha del injerto en el animal donante. El corazón sé perfundió con una solución preservante e inmediatamente se implantó a continuación en el animal receptor. Ello se logró mediante la anastomosis de la aorta del donante a la aorta abdominal del receptor y de la arteria pulmonar del donante a la vena cava del receptor. Se extrajeron a continuación las pinzas vasculares y una vez reperfundido, el corazón del donante comenzó a latir. Por consiguiente, se creó un modelo de trasplante corazón primariamente vascularizado, no funcional. La función del injerto se monitorizó mediante palpaciones diarias. La calidad del funcionamiento del injerto se calificó mediante una escala de 0 a 4, en la que 0 fue injerto no latiente y 4 se consideró como un injerto de corazón latiendo vigorosamente. Se diagnosticó rechazo agudo clínicamente cuando la calificación por palpación fue inferior a 1. Se definió rechazo subagudo en éste modelo cuando la calificación por palpación fue inferior a 2 con evidencia histológica de infiltrados inflamatorios masivos. Los animales receptores se siguieron durante 90 días, tras los cuales se sacrificaron los animales. Se extrajo el corazón. Se analizaron secciones finas de muestras embebidas en parafina teñidas con eosina y hematoxilina (H&E) por un patólogo que ignoraba el régimen de tratamiento para determinar la existente enfermedad vascular del injerto. El patólogo calificó los vasos individuales con base en una escala de calificación de cinco puntos (0 = sin implicación, 1 = implicación parcial de la íntima, 2 = engrosamiento concéntrico de la íntima, 3 = implicación concéntrica grave hasta el 50% de estrechamiento del lumen, 4 = más del 50% de estrechamiento luminal). Además, las lesiones se cuantificaron mediante análisis morfométrico. A continuación, la calificación y el estrechamiento medio valorado morfométricamente se comparó entre los grupos experimentales individuales (Figura 4).

Grupos experimentales

-: Grupo 1 (control): monoterapia Neoral® (7,5 mg/kg día post operación (poday) 0-9);

-: Grupo 2 (Serp- 1 1ng/g): Neoral® (7,5 mg/kg poday 0-9) más Serp-1 a 1 ng/g IV poday 0-9;

-: Grupo 3 (Serp- 1 10 ng/g): Neoral® (7,5 mg/kg poday 0-9) más Serp-1 a 10 ng/g IV poday 0-9;

-: Grupo 4 (Serp- 1 10 ng/g + 30 + 60): Neoral® (7,5 mg/kg poday 0-9) más Serp-1 a 10 ng/g IV poday 0-9; Readministración de Serp-1 (10 ng/g) + Neoral® (7,5 mg/kg) a poday 30 y 60.

Período de seguimiento

90 días seguido de sacrificio.

Parámetros de seguimiento

-: Determinación de la calificación por palpación del injerto: 4 = palpitación fuerte, 3 = palpitación moderada, 2 = palpitación débil, 1 = sin palpitación.

-: Determinación del peso durante los días de tratamiento con el fármaco y al momento del sacrificio. El peso se expresó como el porcentaje de cambio en el peso en comparación con el peso en el momento de la cirugía.

Análisis morfométrico

Cada corazón se cortó horizontalmente a lo largo del eje longitudinal del injerto y se tiñeron 4 secciones con H & E.

Se identificaron todas las arterias coronarias de cada sección y se analizaron por separado mediante morfometría.

El análisis morfométrico incluyó la determinación del lumen vascular libre, no ocluido, el área del vaso dentro de la membrana basal (íntima más lumen libre) y el área total del vaso.

Las variables morfométricas resultantes fueron:

(a): número de vasos enfermos, en el que la enfermedad se define como cualquier cantidad de íntima detectable; y

(b): porcentaje de área de la íntima; área del vaso dentro de la membrana basal menos el lumen libre dividido por el área del vaso dentro de la membrana basal.

Resultados Supervivencia del injerto

Grupo 1; 1 animal (#2) rechazó el injerto en el día 14 postoperación, el otro lo rechazó en el día 7 (POD) (#10).

Grupo 2: 1 animal (#10) rechazó el injerto el día 31 postoperación.

Grupo 3: todos los aloinjertos palpitaban al final del período de seguimiento.

Grupo 4: todos los aloinjertos palpitaban al final del período de seguimiento.

Calificación de palpación del injerto

La calificación de palpitación del injerto se describe como la media de cada semana de seguimiento para cada animal de cada grupo individual.

Grupo 1

Control

3

\newpage

Grupo 2

- Serp-1 (1 ng/g) + Neoral® (7,5 mg/kg)

4

\vskip1.000000\baselineskip

Grupo 3

- Serp-1 (10 ng/g) + Neoral® (7,5 mg/kg)

5

\newpage

Grupo 4

- Serp-1 (10 ng/g) + Neoral® (7,5 mg/kg); Readministración al día 30 y día 60 postoperación

6

Análisis morfométrico

Se analizó por morfometría un total de 1658 arterias coronarias de 58 aloinjertos. El número de vasos y el número de arterias coronarias enfermas por aloinjerto se describen en las tablas siguientes.

\vskip1.000000\baselineskip

Número de coronarias por aloinjerto

7

\newpage

Número de coronarias enfermas por aloinjerto

8

Porcentaje de vasos enfermos por aloinjerto

Porcentaje de coronarias enfermas por aloinjerto

9

Porcentaje de vasos enfermos por grupo

10

La coadministración de Serp-1 y Neorat® es capaz de disminuir el número de vasos coronarios enfermos.

Ejemplo 3

Se investigó la eficacia de la Serp-1 (1 ng/g a 10 \mug/g) en combinación con Ciclosporina A (a una dosis de entre 5 mg/kg/día y 20 mg/kg/día) para el tratamiento del rechazo agudo y crónico de los trasplantes en un modelo de trasplante de aloinjerto heterotópico de corazón (Figura 6).

Detalles del protocolo quirúrgico de los animales

El modelo de trasplante heterotópico de corazón se realizó tal como se describió anteriormente. (Transplantation 62:1267). Brevemente, se realiza una esternotomía media en el donante y se ligan las venas cavas derecha e izquierda superior. La aorta ascendiente y la arteria pulmonar del donante se anastomosaron extremo con lado con la aorta y vena cava inferior del receptor, respectivamente.

Modelo de rechazo agudo

Para el modelo de rechazo agudo, se utilizaron ratones macho consanguíneos C57BL/6(H2^{b}) y BALB/c(H2^{d}) como donante y receptor, respectivamente. Dicha combinación de líneas estaba desemparejada tanto en el MHC mayor como en el menor. Anteriormente se demostró que el injerto se rechaza en 9 días después del injerto, Zhong, et al., (supra).

Criterios de rechazo

La palpación directa del corazón injertado se realizó a diario. El cese completo de los impulsos cardíacos se consideró como el criterio de rechazo. El animal se sacrificó y se realizó la necropsia. Se utilizaron los siguientes criterios para evaluar el rechazo: infiltración de linfocitos, vasculitis, infarto, isquemia y trombosis. Los animales se siguieron hasta el desarrollo del criterio de rechazo o se sacrificaron a los 30 días para el rechazo agudo.

Resultados

1.: Serp-1 solamente: no hubo prolongación de la supervivencia del injerto utilizando dosis de 1 ng/g día post operación (POD 0, 2, 4 y 7), 10 ng/g (POD 0) o 1 \mug (POD 0 - 8) (n+4, 1&1).

2.: Serp-1 (10 ng/g IV POD 0, 2, 4 y 7) + CsA (20 mg/kg) contra CsA solo: prolongación significativa de la supervivencia del injerto (36 contra 18,5 días, p < 0,05) pero los corazones no laten con fuerza (n = 4).

3.: Serp-1 + CsA (5 mg/kg) contra CsA solo: no hay prolongación de la supervivencia del injerto (n = 4)

Aloinjerto de corazón - ratones B6 a Balb/c

11

Ejemplo 4

La eficacia de la Serp-1 (100 ng/g) en combinación con Ciclosporina A (a una dosis comprendida entre 0,25 mg/kg/día y 0,5 mg/kg/día) en el tratamiento del rechazo agudo de los trasplantes se valoró en un modelo de trasplante heterotópico de injerto de corazón de rata.

Detalles de los protocolos quirúrgicos animales

El modelo de trasplante heterotópico de corazón se realizó tal como se ha descrito en el Ejemplo 3.

Modelo de rechazo agudo

Para los modelos de rechazo agudo se utilizaron ratas Brown-Norway y ratas Lewis como donantes y receptores, respectivamente.

Criterios de rechazo

La palpación directa del aloinjerto de corazón se realizó a diario. El cese por completo de los impulsos cardíacos se consideró como el punto de rechazo. Se utilizaron los siguientes criterios para evaluar el rechazo: infiltración linfocítica, vasculitis, infarto, isquemia y trombosis. Los animales fueron seguidos hasta que se desarrolló el punto final de rechazo o se sacrificaron a los 30 días para determinar el rechazo agudo.

Resultados

1.: Ciclosporina A (CsA) solo: no hubo prolongación de la supervivencia del injerto utilizando dosis de 0,25 mg/kg y 0,5 mg/kg, diariamente (n = 8).

2.: Serp-1 (100 ng/g IV día post operación 0-10) + CsA (0,5 mg/kg) contra CsA solamente (0,5 mg/kg diaria) prolongación significativa de la supervivencia del injerto (> 73 contra 33,5 días) (n = 8).

3.: Serp-1 (100 ng/g IV día post operación 0-10) + CsA (0,25 mg/kg) contra CsA solamente (0,25 mg/kg, diaria): prolongación significativa de la supervivencia del injerto (> 26,25 contra 12,88) (n = 8).

Aloinjerto de corazón - ratas Brown-Norway a ratas Lewis

12

Claims

1. Utilización de la composición que comprende Serp-1, un análogo de Serp-1 o un fragmento de la misma biológicamente activo, uno o más agentes inmunosupresores y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del rechazo del trasplante de aloinjertos en un órgano en un mamífero receptor de trasplante.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho receptor de trasplante es un ser humano.

3. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho órgano es un riñón.

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho órgano es un corazón.

5. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho trasplante es un aloinjerto.

6. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho trasplante es un xenoinjerto.

7. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha composición comprende Serp-1 en una cantidad comprendida entre aproximadamente 1 pg/kg y aproximadamente 1 g/kg y un agente inmunosupresor en una cantidad comprendida entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg.

8. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha composición comprende Serp-1 en una cantidad comprendida entre aproximadamente 3 \mug/kg y aproximadamente 1 mg/kg.

9. Utilización de una composición que comprende Serp-1, Ciclosporina A y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del rechazo de los trasplantes de aloinjertos en un órgano en un mamífero receptor de un trasplante.