ES2248229T3 - Combinacion farmaceutica para el tratamiento de daños en tejidos debidos a defectos de irrigacion arterial. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con la medicina humana y en particular con una combinación farmacéutica de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y un péptido mimético del factor de liberación de la hormona de crecimiento (GHRP), la cual es útil en la prevención y/o restauración del daño tisular que se provoca por falta de irrigación sanguínea a un órgano determinado debido a diferentes condiciones patológicas. La mencionada combinación puede ser empleada dentro de una misma composición farmacéutica o aplicarse a un mismo individuo por separado como parte de un único tratamiento que favorece la vitalidad celular en órganos cuando estos son sometidos a privación parcial o totalmente del suministro de sangre oxigenada durante un período tiempo. Esta combinación también atenúa la formación de especies y metabolitos tóxicos en dichos órganos, por lo que es particularmente útil en tejidos sometidos a prolongados períodos de isquemia. La combinación farmacéutica puede ser aplicada además con carácter profiláctico en sujetos conentidades que pueden conducir a la disfunción o daño múltiple de órganos de diverso origen como quemados, politraumatizados, síndrome de distress respiratorio, neonatos hipóxicos, shock hipovolémico, enterocolitis necrotizante, así como a sujetos sometidos a grandes intervenciones quirúrgicas.

Description

Combinación farmacéutica para el tratamiento de daños en tejidos debidos a defectos de irrigación arterial.

La invención se refiere a medicina humana, y particularmente con una combinación farmacéutica entre factor de crecimiento epidérmico (EGF) y un hexapéptido secretagogo de la hormona del crecimiento (GHRP); que es útil para prevenir daños de tejidos debidos a supresión de flujo sanguíneo y a potenciar la reparación de tejidos después de los daños isquémicos.

Todos los órganos en el cuerpo animal son susceptibles de daños irreversibles que siguen a la pérdida parcial o total del flujo sanguíneo arterial, o debidos a fallos en el drenaje venoso. En estos escenarios, la muerte celular es la secuela de una cascada progresiva de cambios patofisiológicos, los cuales pueden eventualmente amenazar el funcionamiento multiorgánico y la supervivencia del individuo.

La generación exagerada de ROS es una consecuencia patológica clave de una miríada de procesos ligados a la hipofusión de tejidos, isquemia/reperfusión, e inflamación (peritonitis, pancreatitis, etc.). La hipofusión de tejidos y la sobreproducción de ROS se asocian también con cirugía importante, cirugía de revascularización, quemaduras extensas y traumatismos múltiples. La peroxidación de lípidos de membrana mediante el ataque de ROS es responsable de la muerte celular en muchas condiciones patológicas (T.D. Lucas y I.L. Szweda. ``Cardiac Reperfusion injury. Aging, lipid peroxidation and mitocondrial dysfunction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 95 (2): 510-
514).

La depleción de las reservas celulares de ATP es la consecuencia más aguda y amenazadora de isquemia (Burns T.A., Davies R.D. McLaren, J.A., Cerundolo L., Morris J.P., Fuggle, V.S. Apoptosis in isquemia/reperfusion injury of human renal allografts. Transplantation. 1988, 6 (7): 872-876). A lo largo del proceso isquémico, las reservas de ATP se degradan a hipoxantina y xantina, actuando ambas como sustratos para la enzima xantina oxidasa (XO). La gran disponibilidad de oxígeno molecular entrante durante el periodo de reperfusión conduce a la oxidación de las purinas mediante activación de XO, dando como resultado anión superóxido y generación de peróxido de hidrógeno (Paller M.S., Hoidall J.R., Ferris, J.E. Oxigen free radicals in ischaemic acute renal failure in the rat. J. Clin. Invest. 1994, 74: 1156-1164).

Durante los periodos de isquemia/reperfusión la generación de ROS y el fallo microvascular se combinan para actuar como un círculo vicioso en el cual las células endoteliales vasculares y el reclutamiento/adhesión de leucocitos circulantes incrementa adicionalmente la perfusión tisular territorial y así la hipoxia celular (Redl H., Gasser H., Hallstrom S., Schlag G. Radical related cell injury. In Pathobiology of shock, sepsis, and organ failure. G. Schlag, H. Redl, editores. Springer-Verlag, Heidelberg. Alemania 1993, 92-110); (Ledebur H.C., Parks T.P. Transcriptional regulation of the intercellular adhesion molecule 1 gene by inflammatory cytokines in human endotelial cells: essential roles of a variant NF-kB site and p65 homodimers, J. Biol. Chem. 1995, 270: 933-943).

ROS puede activar NF-kB en tejidos infiltrados con células inflamatorias (Conner E.M., Brand S.J., Davis J.M., Kang D.Y., Grisham M.B. Role of reactive metabolites of oxigen and nitrogen in inflamammatory bowel disease: toxins mediators, and modulators of the gene expression. Inflamm. Bowel Dis. 1996, 2: 133-147), mientras que el sistema enzimático de la mieloperoxidasa (MPO) se activa en células polimorfonucleares que se infiltran en tejidos hipóxicos los cuales amplifican adicionalmente la cascada de daño tisular (Kurose I., Argenbrigth L.W., Wolf R., Lianxi L., Granger DN. Ischemia/reperfusion-induced microvascular dysfunction: role of oxidants and lipid mediators. Am. J. Physiol 1997, 272: H2976-H2982). En este ambiente hostil se activan mecanismos trombogénicos locales los cuales dan como resultado taponamiento capilar y expansión territorial de hipoxia. Como una consecuencia de esta cascada, la muerte celular resulta de necrosis y/o apoptosis, las cuales pueden poner en peligro la viabilidad de los órganos (Tredger M.J. Ischaemia-reperfusion injury of the liver: treatment in theory and practice. Biofactors 1998, 8 (1-2): 161-164). La reactividad de las células endoteliales/inflamatorias presenta un gran número de mediadores químicos solubles tales como óxido nítrico, citoquinas proinflamatorias, agentes pro-coagulantes y vasoactivos los cuales activan el Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SIRS) si el cuerpo es incapaz de contrarrestar esta disonancia inmune (Kowal-Vern A., McGill V., Gamelli R.L. Ischaemic necrotic bowel disease in thermal injury. Archives of Surgery 1997, 132(4): 440-
443).

Las quemaduras graves son emergencias médicas que demandan esfuerzos médicos intensivos y múltiples para salvar la vida de los pacientes. En los pacientes quemados, la hipoperfusión/isquemia del intestino parece jugar un papel crítico en orquestar el SRIS (Wang P., Ba Z.F., Cioffi W.G., Bland K.I., y Chaudry I.H. Is gut the "motor" for producing hepatocellular disfunction after trauma and hemorragic shock? Journal of Surgical Research 1998, 74: 141-148). El fallo de la barrera intestinal es de suma relevancia clínica ya que el epitelio intestinal actúa como una frontera entre un lúmen séptico/tóxico y un ambiente interno estéril (Sheridan, R.L., Ryan C.M., Yin L.M., Hurley J., Tompkins R.G. Death in the burn unit. Sterile multiple organ failure. Burns 1998, 24 (4): 307-311).

En este aspecto, tanto los hallazgos experimentales como los clínicos convergen para mostrar la importancia de una perfusión intestinal adecuada durante el estrés sistémico como para preservar la integridad de la barrera (Tabata T., de Serres S., Meyer A.A. Differences in IgM synthesis to gut bacterial peptidoglycan polysaccharide after burn injury and gut ischemia. Journal of Burn Care and Rehabilitation 1996, 17 (3): 231-236). Además, evidencias recientes indican también que el tejido intestinal actúa como una fuente proinflamatoria generadora de citoquinas cuando el tejido linfoide asociado al intestino se activa mediante isquemia. MOF es una causa primera de muertes en pacientes admitidos bajo condiciones de cuidados intensivos, y es la complicación más frecuente para víctimas de quemaduras, involucrando hasta un 70% de pacientes en unidades de tratamiento de quemados altamente especializadas.

Con el fin de atenuar las consecuencias de los procedimientos de la isquemia/reperfusión en ciertos órganos, un gran número de compuestos naturales o sintéticos se han examinado clínica o preclínicamente. Para el caso de isquemia intestinal, los inhibidores de angiotensina II se evaluaron experimentalmente (Tadros T., Taber D.L., Heggers J.P., Herndon D,N. Angiotensin II inhibitor DuP753 attenuates burn and endotoxin-induced gut ischemia, lipid peroxidation, mucosal permeability and bacterial translocation. Ann. Surg. 2000; 231: 566-576). Los inhibidores de factores de activación plaquetaria (Sun Z., Wang X., Deng X., Lasson A., Soltesz V., Borjesson A., Andersson R. Benefical effects of lexipafant, a PAF antagonist on gut barrier dysfunction caused by intestinal ischemia and reperfusion in rats. Dig. Surg. 2000; 17: 57-65), y potenciadores de la liberación de óxido nítrico se estudiaron también (Ward D.T., Lawson S.A., Gallagher C.M., Conner W.C., Shea-Donohue D.T.).

Producción de óxido nítrico sostenida por medio de administración mejora efectos de la isquemia-reperfusión intestinal. J. Surg. Res. 2000; 89: 13-19). Otras aproximaciones incluyen terapia antioxidante tal como alopurinol sólo o en combinación con vitaminas C y E (Kacmaz M., Otzurk H.S., Karaayvaz M., Guven C., Durak I. Enzymatic antioxidant defense mechanism in rat intestinal tissue is changed after ischemia-reperfusion. Effects of allopurinol plus antioxidant combination. Can. J. Surg. 1999; 42: 427-431).

A pesar de esto, los esfuerzos planificados para activar mecanismos defensivos naturales celulares son escasos (Pialli S.B., Hinmn C.E., Luquette M.H., Nowicki, P.T., Besner G.E. Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor protects rat intestine from ischemia/reperfusion injury. J. Surg. Res. 1999; 87: 225-231).

La muerte renal que sigue a la isquemia/reperfusión ha estimulado la búsqueda de agentes neoprotectores, incluyendo la generación de los así llamados lazaroides, los cuales han mostrado conferir protección global al riñón isquémico (De Vecchi E., Lubatti L., Beretta C., Ferrero S., Rinaldi P., Galli K.M., Trazzi R., Paroni R. Protection from renal ischemia-reperfusion injury by the 2-methylaminochroman U83836. Kidney Int. 1988, 54: 857-863). Otros estudios documentan los efectos saludables de teofilina en protección renal, principalmente como un antagonista de receptores de adenosina (Jenik A.G., Ceriani J.M., Gorenstein A., Ramirez J.A., Vain N., Armadans M., Ferraris J.R., Randomized, double-blind, placebo-controlled trial of the effect of theophylline or renal function in term neonates with perinatal asphyxia. Pedriatrics 2000; 105: E45).

La administración del péptido natriurético atrial (Auriculina) no muestra reducir mortalidad en pacientes afectados por fallo renal agudo. Ninguna de las complicaciones de los órganos remotos se reduce (Weisberg L.S., Allgren R.L., Genter F.C., Kurnik B.R. Cause of acute tubular necrosis affects in prognosis. The Auriculin Anaritide Acute Renal Failure Study Group. Arch. Intern. Med. 1997; 157: 1833-1839). La neoprotección se ha atribuido a la enzima superóxido dismutasa (SOD) cuando se inyecta a altos niveles en pacientes que sufren cirugía del transplante de riñón (Schneeberger H., Schleibner S., Illner, W.D., Messmer K., Land W. The impact of free-radical mediated reperfusion injury on acute and chronic rejection events following cadaveric renal transplantation. Clin. Transplant. 1993; 219-232).

Los beneficios de EGF y TGF-alfa en mejorar el fallo renal agudo tóxico e isquémico se muestran en la patente de los Estados Unidos Nº.: 5.360.790. Aunque la administración parenteral de muchos factores de crecimiento que muestran efectos neoprotectores ha demostrado ser efectiva en modelos experimentales, los resultados clínicos son desalentadores hasta el momento. Un ensayo clínico controlado multicentro no muestra los beneficios esperados de IGF-I en pacientes con fallo renal agudo cuando se compara con sus contrapartidas placebo (Hischberg R., Kopple J., Lipsett P., Benjamin E., Minei J., Albertson T., Munger M., Meztler M., Zaloga G., Murray M., Lowry S., y col. Multicenter clinical trial of recombinant human insulin-like growth factor I in patients with acute renal failure. Kidney Int., 1999, 55: 2423-2432). En un ensayo clínico adicional que emplea IGF-I para fallo renal agudo, se confirma la carencia de efecto (Kopple J.D., Hirschberg R., Guler H.P., Pike M., y Chiron Study Group: lack of effect of recombinant human insuline-like growth factor -1 (IGF-1) in patients with acute renal failure (ARF). J. Soc. Nephrol. 1996; 7: 1375).

Los escasos progresos logrados en la tecnología de preservación de los órganos permanecen así como la limitación más importante de disponibilidad de nuevos órganos para el transplante. Además, los agentes de preservación ex vivo han producido efectos conflictivos (Schlumpf-R.; Candinas-D.; Weber-M.; Rothlin-M.; Largiader-F. Preservation of kidney transplants with a modified UW solution initial clinical results. Swiss-Surg. 1995(4): 175-80; discusión 180-1); y el deterioro bioquímico y funcional de los órganos tras la implantación en el receptor, sigue siendo la principal causa del no rechazo inmune (Barber E., Menéndez S., León O.S., Barber M.O., Merino N., Calunga J.L., Cruz E., y Bocci V. Prevention of renal injury after induction of ozone tolerance in rats submitted to warm ischemia. Mediators of Inflammation 1999; 8: 37-41). Un efecto adverso comunicado para algunos agentes de preservación es su interferencia en el mecanismo de agregación plaquetaria, conduciendo así a sangrado profuso (Salat A., Mueller, M.R., Boehm. D., Stangl. P., Pulaki S., Laengle F. Influence of UW solution on in vitro platelet aggregability Transpl-Int. 1996; 9 supl. 1: S429-431). La constricción de los vasos sanguíneos y la trombosis en los órganos tras la reperfusión de éstos están entre los inconvenientes reportados (Jeng-L.B.; Lin-P.J.; Yao-P.C.; Chen-M-F.; Tsai-K.T.; Chang-C.H. Impaired endothelium-dependent relaxation of human hepatic arteries after preservation with the University of Wisconsin solution. Arch-Surg. enero 1997; 132(1): 7-12). La comunidad médica aún espera para soluciones de preservación de órganos más eficientes y menos caras (Rentsch M., Post S., Palma P., González A.P., Menger M.D., Messmer K. Intravital studies on beneficit effects of warm Ringer's lactate rinse in liver transplantation. Transpl. Int. 1996; 9(5): 461-7). El fallo de IGF-I en proporcionar un efecto neoprotector eficiente en el campo de batalla clínico ha introducido la noción de que la terapia con un factor de crecimiento simple no es suficiente para estimular la supervivencia celular durante isquemia/reperfusión, y que los cócteles de factores de crecimiento sean más eficaces (Playford R.J. Peptides and gastrointestinal mucosa integrity. Gut. 1995; 37: 595-
597).

Los efectos saludables del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) en proteger daños orgánicos durante episodios de isquemia/reperfusión se reivindicó mediante Patente Europea EP 0 357 240 B1. Sin embargo, la protección cerebral sólo se logra con muy altas concentraciones de EGF (1 mg/kg). Una dosis más baja de 0,1 mg/kg sólo mostró un modesto efecto protector a pesar de que la dosis es aún alta para una sustancia tal como un factor de crecimiento. Estos hechos imponen limitaciones a la invención, la primera se refiere al alto coste del tratamiento en tanto se requieren inyecciones repetidas (4 a 5) para lograr un efecto en el animal. Como un ejemplo, un sujeto humano de 70 kg requerirá 70 mg de EGF en una inyección individual, la cual tendrá que repetirse periódicamente para asegurar un efecto clínico. La segunda limitación es farmacológica. Los ejemplos mostrados en la patente sugieren que hay una ventana terapéutica muy estrecha que dificulta la posibilidad de establecer una dosis efectiva 50 (ED_{50}) y una curva de respuesta a dosis. Una tercera limitación es aquella asociada con las altas dosis de EGF. Existen notificaciones que demuestran que en ratas y monos EGF puede disminuir el rendimiento del corazón y la presión arterial (Keiser J.A., Ryan N.J. Hemodynamic effect of EGF in conscious rats and monkeys. PNAS USA 1996; 93 (10): 4957-4961). La progresión del ciclo celular normal se puede perturbar mediante altas concentraciones de EGF (Bennett N.T., Schultz G.S. Growth factors and wound healing: Biochemical properties of growth factors and their receptors. Am. J. Surg. 1993, 165: 728-737). Los beneficios potenciales de la intervención de EGF con el fin de proteger el hígado y los intestinos contra isquemia/reperfusión parecen esperar la elucidación. Las evidencias que aumentan indican que la administración parenteral de EGF parece conferir protección a una diversidad de órganos epiteliales internos tras la supresión aguda del flujo sanguíneo. En condiciones experimentales de animales expuestos a productos químicos, los cuales bloquean la síntesis de ATP o incrementan la velocidad de generación de ERO, la intervención de EGF prueba ser útil reduciendo daños de los órganos. Además, las administraciones repetidas de EGF ayudan en potenciar la regeneración, adaptación y funcionalidad de los tejidos. Todos estos beneficios de terapia con EGF se pueden logar sólo bajo regímenes de administración repetida y altas concentraciones del polipéptido. A menudo, estos beneficios son modestos, lo cual fortalecen adicionalmente la noción de que una terapia combinada de factores de crecimiento es más preferible.

En el contexto de isquemia, EGF parece atenuar el daño de tejidos si el tiempo de isquemia es de menos de 60 minutos. Para mayores periodos de isquemia la terapia con EGF es despreciable. Esta es una limitación obvia para la terapia con EGF en tanto se requiere protección durante periodos isquémicos mayores en la práctica quirúrgica.

Aunque la necesidad de combinación de factores de crecimiento se ha reclamado enfáticamente durante un periodo de tiempo largo, no hay combinación disponible en el equipamiento clínico.

La novedad de la presente composición farmacéutica se da por la sinergia farmacológica expuesta mediante la combinación de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y péptido secretagogo de la Hormona del Crecimiento (seis) (GHRP-6). Esta combinación potencia la viabilidad celular en órganos o tejidos, los cuales tienen supresión de sangre parcial o total subyacente, suministrar durante un periodo de minutos a horas. Esta combinación reduce o previene la generación de ERO y otros metabolitos tóxicos en órganos hipóxicos o anóxicos, los cuales estimulan supervivencia celular durante periodos isquémicos. La combinación de estos dos péptidos ejerce una potente actividad sinérgica en potenciar la adaptación de los órganos; es decir, adaptación intestinal tras traumatismos extensivos u los procedimientos de reparación.

Por medio de una intervención preacondicionada preventiva, la combinación de los péptidos permite la activación de mecanismos autodefensivos celulares, incrementando así la tolerancia celular a agentes citotóxicos o condiciones estresantes. Así, mediante preacondicionamiento celular esta combinación, que por el contrario es letal bajo condiciones ordinarias, se vuelve no letal. Esto permite la aplicabilidad de esta combinación a órganos u organismos bajo condiciones críticas y amenazantes como isquemia, estados de bajo flujo, choque, fallo hemodinámico, etc. Junto a los efectos protectores de la combinación, ella potencia reparación de tejidos, regeneración y adaptación funcional tras traumatismos. Los sujetos que muestran daños por quemaduras extensivos, traumatismos múltiples, choque, son tributarios para recibir la combinación lo más pronto posible con el fin de atenuar la cascada en curso de daños de órganos internos como para prevenir o retrasar la aparición de fallo múltiple de órganos. Los sujetos elegidos para cirugía principal o prolongada, soporte con máquina circulatoria extracorpórea, etc., deben recibir la presente combinación con el fin de mejorar los riesgos de daño esplácnico y otros daños de órganos internos como para atenuar el Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica. La combinación es aplicable igual que para atenuar daños asociados a trombosis y embolismo una vez se establece la terapia trombolítica apropia-
da.

Debido al efecto sinérgico de los péptidos en relación con acciones tróficas/regenerativas, esta combinación es útil para acelerar la adaptación intestinal en pacientes en el intestino grueso. La regeneración de la masa hepática y del sistema renal tubular se puede estimular también mediante la combinación.

En una realización preferida de esta invención, una composición farmacéutica combina en un solo producto EGF y GHRP-6, el cual ejerce una acción citoprotectora potente en tejidos y órganos expuestos a eventos hipóxicos o anóxicos. La combinación proporciona citoprotección mediante diferentes mecanismos, los cuales se regulan al alza siguiendo una dosificación individual preacondicionada. La combinación se puede asociar a cualquiera de las modalidades terapéuticas antioxidantes estándar.

Por otro lado, la administración terapéutica de la combinación cuando se orienta para estimular la regeneración de tejidos requiere de administraciones repetidas. El EGF referido comprende aquel de orígenes naturales, sintéticos o recombinantes. El péptido secretagogo preferido es el hexapéptido que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}. Se refiere como GHRP-6 como abreviatura de péptido de liberación de hormona del crecimiento.

La combinación se refiere también a la administración independiente de ambos péptidos a un único individuo pero en un esquema terapéutico individual.

Cuando la combinación se aplica preventivamente para prevenir el daño tisular isquémico, la concentración de EGF en la combinación farmacéutica está entre 0,5 y 50 \mug/ml con independencia de su presentación y una sal liofilizada o como una disolución. La concentración de GHRP-6 puede variar entre de 2 a 100 \mug/ml en el mismo vehículo. Los intervalos de dosificación de 0,5 y 1 \mug/kg se recomiendan tanto para EGF como para GHRP-6 para metas
preventivas.

La combinación debe administrarse como una inyección intravenosa rápida. Las vías de administración pueden implicar venas periféricas o profundas, intraarterial y/o intraperitoneal. Los vehículos a usarse para administraciones incluyen: disolución salina normal, disolución de Ringer con lactato, plasma humano, disolución de albúmina humana, dextrosa al 5%, o mezclas de las mismas.

Con el fin de asegurar la eficacia más alta en la terapia, la primera administración debería hacerse tan pronto como sea posible cuando se diagnostica la isquemia, se sospecha de ella o cuando ésta se creará quirúrgicamente. Para pacientes portadores de quemadura extendida, múltiples traumatismos, choque, etc., el tratamiento se debería iniciar a pesar de la ausencia de cualquier indicación clínica o complementaria de isquemia esplácnica como una intervención preventiva. Los pacientes portadores de pancreatitis no séptica son también tributarios del tratamiento bajo las anteriores especificaciones.

El programa de administración preventiva puede fluctuar de acuerdo a la gravedad del cuadro clínico y/o la magnitud de la agresión, lo cual es a discreción de un profesional experto en la técnica. La administración de inyección intravenosa rápida se puede repetir cada 6 horas como para completar cuatro administraciones por día. Es necesario mantener un periodo de demora de 6 horas entre cada aplicación. La combinación de péptidos se puede administrar usando dispositivos de tecnología de liberación lenta. La combinación de los productos, si está liofilizada se puede resuspender antes de usar.

Como se ha descrito previamente cuando la combinación es para metas terapéuticas, lo cual significa que su uso se dirige a estimular regeneración y adaptación, los tratamientos se pueden administrar preferiblemente por medio de dispositivos de tecnología de liberación lenta o a través de medios alternativos como para asegurar un equilibrio bicompartimental de fases. Las infusiones de inyección intravenosa rápida no son efectivas para estimular la regeneración de tejidos. Si se usan las líneas venosas, el periodo de administración se puede calibrar al menos durante aproximadamente 4 horas. Más de dos administraciones en un periodo de 24 horas se pueden llevar a cabo si un periodo libre de al menos 8 horas está entre los tratamientos. Las dosis recomendadas de ambos péptidos para regeneración son desde 0,01 \mug/kg/hora hasta 5 \mug/kg/hora. Esta administración y regímenes de dosificación permiten restaurar los tejidos dañados debido a isquemia en los cuales están implicados necrosis y/o apoptosis. Cuando los tejidos se exponen a periodos de isquemia breves administrar la composición interrumpe complicaciones adicionales. El uso de combinación se recomienda tras la cirugía de transplante como para potenciar curación anastomótica, regeneración de tejidos, y readaptación del órgano implantado.

Las administraciones repetidas de la combinación se recomiendan también para tratar el síndrome del intestino grueso y el fallo intestinal agudo tras la cirugía del intestino delgado.

Ejemplos

Ejemplo 1

Efecto citoprotector del secretagogo hexapéptido GH (GHRP-6) en un modelo animal de daño gástrico agudo por estrés

Ratones OF-1 machos, adultos (20-23 gramos) se asignaron aleatoriamente para recibir GHRP-6 (0,1 \mug/animal) o disolución salina normal al 0,9% (ambas intraperitonealmente). De diez a treinta minutos más tarde los animales se forzaron a nadar en agua fría durante 30 minutos y más tarde se retuvieron durante otro periodo de 20 minutos a 4ºC. Los animales fueron a partir de entonces anestesiados y matados para inspección de la mucosa gástrica. Las muestras se tamponaron al 10% se fijaron en formalina y H&E, y se tiñeron con PAS para estudio microscópico. La erosión, la hemorragia y la ulceración fueron los criterios de patología flagrantes considerados en el experimento (Playford, R.J. Peptides and gastrointestinal mucosa integrity. Gut 1995, 37: 595-597). La ulceración microscópica se consideró sólo cuando se implicó más profundamente que el primer tercio de la mucosa glandular. El sangrado luminal se estudió midiendo hemoglobina por el procedimiento de la metahemoglobina de ciano (Reactivos Spinreact, Barcelona). Los datos se expresaron en g/dl. Todas las determinaciones se hicieron en una forma ciega usando un código
simulado.

Como se muestra en la tabla 1, GHRP-1 reduce significativamente la intensidad del daño mucosal como el número de úlceras de la mucosa oxíntica.

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TABLA 1

Efecto gastroprotector del GHRP-6 administrado sistemáticamente
Daño	Controles (solución salina al 0,9%)	GHRP-6
Erosión epitelial	20 (100%)	6 (30%)*
Hemorragia mucosal	16 (80%)	0 (0%)*
Hemorragia luminal	12 (60%)	0 (0%)*
Hemoglobina luminal	4,3	0*
Total de úlceras	68	3*
Un total de 20 ratones se usaron para cada grupo.
*p < 0,01 establecida por prueba bilateral. Nivel de significancia de p < 0,05.

Este experimento demuestra el efecto citoprotector de la GHRP-6, expresado en la mucosa gástrica de animales expuestos a un estrés sistémico severo. La isquemia/reperfusión de la mucosa gástrica se ha implicado en la patofisiología de este modelo de daño agudo.

Ejemplo 2

Efecto citoprotector de la administración profiláctica de EGF y GHRP-6 en un modelo animal de isquemia/reperfusión renal Diseño experimental

Los efectos nefroprotectores potenciales de cada uno de los péptidos solos o en combinación se estudiaron en un modelo de isquemia/reperfusión bilateral renal en rata. En una primera fase se estableció ensayo y periodo de isquemia de 1 hora seguido por un periodo de reperfusión de 3 horas. Ratas hembra de Wistar (200-220 g) se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos experimentales (N = 10):

Grupo I: isquemia fingida.

Grupo II: isquemia y disolución salina al 0,9%.

Grupo III: isquemia y EGF - 20 \mug/rata.

Grupo IV: isquemia y GHRP-6 - 50 \mug/rata.

Grupo V: combinación entre EGF (5 \mug) y GHRP-6 (10 \mug).

Todos los tratamientos se administraron intraperitonealmente 30 minutos antes de isquemia.

Modelo de isquemia

Las arterias renales se graparon con grapas microvasculares (Moria, Fine Science Tools, USA) durante 60 minutos. Completadas tres horas de reperfusión los animales se sometieron a seguimiento durante otros 30 minutos para establecer el funcionamiento renal.

Funcionamiento renal

La velocidad de filtración glomerular (GRF) y el flujo plasmático renal (RPF) se estudiaron usando marcadores de peso molecular como inulina y p-aminohipúrico. El coeficiente de despeje se determinó como sigue:

C = Uv (m) x [PM]u / [PM]p

Uv(m) volumen máximo de orina por minuto.

[PM]u y [PM]p representa plasma y concentraciones en orina de cada marcador. Los datos se expresaron como ml/minuto/gramo de peso.

Volumen de diuresis

Se fijó un catéter en la vejiga urinaria y la uretra se grapó. El extremo libre del catéter se insertó en un tubo graduado y el volumen de orina se recogió durante 10 minutos.

Determinaciones bioquímicas

Los tejidos renales se homogeneizaron en tampón KCl/histidina (pH 7,3) y el sobrenadante se usó para medir la actividad de las enzimas PLA2, catalasa, como el metabolito del reactivo MDA.

Determinaciones Histológicas

Las muestras de tejido renal se tamponaron al 10% finas en formalina, embebidas en parafina, teñidas en H&E y estudiadas mediante patólogos independientes usando los siguientes criterios: número de glomérulos colapsados, hemorragia cortical, hemorragia medular, daño tubular severo, y daño intestinal severo.

Como se muestra en la Tabla 2, el evento de isquemia/reperfusión provocó un marcado deterioro en la capacidad de formación de orina renal. La intervención de EGF atenuó la oliguria con respecto a controles tratados con disolución salina. La intervención de GHRP-6 incrementó formación de orina 4 veces en comparación con animales tratados con disolución salina, lo cual argumenta a favor de protección funcional renal. La administración combinada EGF/GHRP-6 mostró prevenir completamente el fallo renal de tal forma que la diuresis fue similar a un grupo no isquémico de referencia. Estos datos confirman el efecto sinérgico de la presente combinación de péptidos.

TABLA 2

Producción de orina durante el periodo de reperfusión
Fingida	Isquemia/disolución	Isquemia/EGF	Isquemia/GHRP	Combinación
	salina al 0,9%	(20 \mug)	(50 \mug)
311 \pm14**	51 \pm 40	114 \pm 51	208 \pm 47*	382 \pm 19**
Datos expresados como media y D.E.
** Diferencia media p < 0,01 en relación a animales isquémicos que reciben disolución salina al 0,9%.
\hskip0,1cm * Diferencia media p < 0,05 en relación a animales isquémicos que reciben disolución salina al 0,9%.
\hskip0,3cm Prueba de Mann Whitney-U.

El examen microscópico mostró que la isquemia afectó las tres estructuras principales del riñón: glomérulos, aparato tubular, y el tejido intersticial. Los daños fueron severos en animales que reciben disolución salina. Tanto EGF como GHRP-6 mostraron conferir protección renal a los animales asignados a cada tratamiento independiente. En general y en términos cualitativos GHRP-6 parece proporcionar mayor protección al parénquima renal que el EGF solo. La combinación de ambos péptidos es continuamente mejor en comparación con cada agente solo. Los datos se muestran en la tabla 3.

TABLA 3 Porcentaje de animales/grupo que muestran daño de tejido renal

Grupos	Glomérulos	Hemorragia	Hemorragia	Daño	Daño
	dañados	cortical	medular	tubular	intersticial
Fingida	0	0	0	0	0
Isquemia/disolución salina	100	97	100	100	98
Isquemia/EGF	59\ding{171}	68\ding{171}	63\ding{171}	53\ding{171}	75\ding{171}
Isquemia/GHRP-6	49\ding{171}	17\ding{171}	25\ding{171}	25\ding{171}	22\ding{171}
Combinación	5**\ding{168}	0**\ding{168}	2**\ding{168}	0**\ding{168}	0**\ding{168}
** Diferencia media (p < 0,01) con los grupos isquémicos que reciben disolución salina.
\hskip0,0cm \ding{171} Diferencia media (p < 0,05) con los grupos isquémicos que reciben disolución salina.
\hskip0,0cm \ding{168} \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia media p < 0,01 entre los grupos que reciben EGF y GHRP-6 en comparación con el grupo tratado con la combinación de péptidos.\end{minipage}
\hskip0,4cm Comparaciones mediante ANOVA de sentido único y prueba de múltiples intervalos de Duncan.

Los datos de histopatología se confirmaron mediante pruebas funcionales renales dadas por el despeje de ambos marcadores plasmáticos. EGF y GHRP-6 atenúan parcialmente el fallo renal cuando dan independencia. La combinación de nuevo, ha demostrado conferir protección renal total. Estos datos se muestran en la tabla 4.

TABLA 4 Función renal

Grupos	Flujo plasmático renal	Velocidad de filtración renal
	(ml/minuto/100 g)	(ml/minuto/100 g)
Fingida	2,53 \pm 0,4	0,71 \pm 0,12
Isquemia/disolución salina	0,66 \pm 0,2	0,22 \pm 0,11
Isquemia/EGF	1,2 \pm 0,61	0,3 \pm 0,15
Isquemia/GHRP-6	1,88 \pm 0,8#	0,46 \pm 0,23#
Combinación	2,67 \pm 0,66*\ding{168}	0,73 \pm 0,1 *\ding{168}
(*) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia entre el grupo tratado con la combinación de péptidos y el que recibe la disolución salina normal (p < 0,01).\end{minipage}
(\ding{168}) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia entre el grupo tratado con la combinación de péptidos y aquellos que reciben cada péptido solo (p < 0,05).\end{minipage}
(#) \begin{minipage}[t]{155mm}p < 0,05 entre el grupo que recibe GHRP-6 y el que recibe la disolución salina normal. Comparaciones mediante ANOVA de sentido único y prueba de múltiples intervalos de Duncan.\end{minipage}

Durante una segunda fase de estudio, se introdujo un periodo de isquemia mayor el cual permitió estudiar el efecto del péptido en un modelo más práctico con respecto a la práctica clínica. Los riñones se expusieron a un periodo de isquemia de tres horas y un tiempo de reperfusión similar. Como se demuestra en la tabla 5 tras 3 horas de periodo de isquemia, se presta atención a fallo renal patente. El volumen de orina recogido de animales que recibieron disolución salina y EGF es despreciable y contiene hemoglobina. La nefroprotección parcial es detectable en animales tratados con GHRP-6, de tal forma que la diuresis es significativamente mayor que la que se ve en disolución salina y grupos EGF. Fue menor que la que se detectó para el grupo no isquémico de referencia. La combinación EGF/GHRP-6 proporcionó neuroprotección a juzgar por la similaridad de los valores de diuresis con el grupo no isquémico de referencia.

TABLA 5 Producción de orina durante el periodo de repercusión

Isquemia fingida	Isquemia/disolución	Isquemia/EGF	Isquemia/GHRP	Combinación
	salina al 0,9%	(20 \mug)	(50 \mug)
395\pm43	28\pm10	83\pm21	168\pm33*	282\pm32\ding{168}#
\hskip0,4cm Datos expresados como media y D.E.
(*) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia (p < 0,05) entre el grupo GHRP-6 y el que recibe la disolución salina normal.\end{minipage}
(\ding{168}) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia entre el grupo tratado con la combinación de péptidos, tratados con EGF y el control de isquemia que recibe disolución salina (p < 0,01).\end{minipage}
(#) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia entre el grupo que recibe la combinación en comparación con el grupo de GHRP-6 solo. Comparaciones mediante ANOVA de sentido único y prueba de múltiples intervalos de Duncan.\end{minipage}

A partir del punto de vista histopatológico, los daños renales fueron masivos y severos en la mayoría de los animales. La protección en términos cualitativos se detectó como sigue: combinación de péptidos/GHRP-6/EGF. Fuera de los animales que reciben la combinación peptídica, la protección mediante EGF y GHRP-6 fue despreciable cuando se dio independientemente. En la tabla 6 se mostraron los datos que demuestran la protección conferida mediante la combinación de péptidos.

TABLA 6 Porcentaje de animales/grupo que forman daño tisular renal

Grupos	Glomérulos	Hemorragia	Hemorragia	Daño	Daño
	dañados	cortical	medular	tubular	intersticial
Fingida	0	0	0	0	0
Isquemia/disolución salina	100	100	100	100	90
Isquemia/EGF	80	70	80	90	80
Isquemia/GHRP-6	60\ding{169}	40\ding{169}	80	50\ding{169}	30\ding{169}
Combinación	10\ding{171}	0\ding{171}	10\ding{171}	10\ding{171}	0\ding{171}
(\ding{169}) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia entre el grupo tratado con GHRP-6 y el grupo control isquémico que recibe disolución salina (p < 0,05).\end{minipage}
(\ding{168}) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia media entre el grupo que recibe la combinación de péptidos y el resto de los grupos bajo isquemia sin tener en cuenta al tratamiento (p < 0,05/p < 0,01). Nivel de significancia para p < 0,05. Comparaciones mediante ANOVA de sentido único y prueba de múltiples intervalos de Duncan.\end{minipage}

El análisis funcional renal mostró de nuevo que la combinación de péptidos aseguró velocidades apropiadas de flujo sanguíneo glomerular y filtración tubular. Incluso bajo las presentes afecciones de isquemia estos marcadores funcionales estuvieron en intervalos normales como se detectaron en los animales con isquemia fingida. Los datos se muestran en la tabla 7.

TABLA 7 Función renal

Grupos	Flujo plasmático renal	Velocidad de filtración
	(ml/minuto/100 g)	renal (ml/minuto/100 g)
Fingida	2,75 \pm 0,7	0,82 \pm 0,1
Isquemia/disolución salina	0,02 \pm 0,01	0
Isquemia/EGF	0,1\pm 0,05	0,24\pm 0,15
Isquemia/GHRP-6	1,07 \pm 0,8\ding{168}	0,38\pm 0,2\ding{168}
Combinación	2,15 \pm 0,36*	0,78 \pm 0,01*
(*) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia entre el grupo que recibe la combinación y el resto de los grupos isquémicos (p < 0,01).\end{minipage}
(\ding{168}) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia entre el grupo tratado con GHRP-6 y el grupo tratado con disolución salina (p < 0,05). Nivel de significancia para p < 0,05. Comparaciones mediante ANOVA de sentido único y prueba de múltiples intervalos de Duncan.\end{minipage}

Este estudio ha confirmado la superioridad de la combinación de péptidos en prevenir daños estructurales renales y la desaparición funcional mediante periodos prolongados de isquemia/reperfusión.

Ejemplo 3 Efectos protectores de la combinación de EGF/GHRP-6 en un modelo de isquemia intestinal/reperfusión

Se asignaron aleatoriamente ratas macho Sprague Dawley (220-250 g) a los siguientes grupos de tratamiento.

I: isquemia/disolución salina normal.

II: isquemia 500 \mug/rata de EGF.

III: isquemia 100 \mug/rata de GHRP-6.

IV: isquemia/combinación -EGF (5 \mug)/GHRP-6 (2 \mug)/rata.

Todos los tratamientos se administraron intraperitonealmente 30 minutos antes de iniciar el periodo de isquemia.

Modelo experimental

Bajo anestesia con metoxifluorano y manta térmica, se practicó una cuidadosa laparotomía para exponer el primer ramal en orden de la arteria mesentérica superior. La arteria se grapó durante un periodo de 2 horas, provocando así un tiempo de isquemia severa en las partes del intestino delgado yeyuno e íleo. La reperfusión se permitió durante 3 horas. Las ratas se mataron y se sometieron a autopsia completa. El intestino delgado se reseccionó y se registró la longitud del daño mucosal y/o luminal hemorrágico. El contenido luminal se eliminó mediante flujo con un volumen estándar de disolución salina para determinar el contenido en hemoglobina. La mucosa intestinal se lavó con disolución salina normal cálida, se pesó y los fragmentos se usaron para determinar el contenido proteico total mediante el procedimiento de Lowry. Otros fragmentos se usaron para el contenido en DNA total y análisis microscópicos. El daño de vellosidades/mucosal se analizó microscópicamente y se descubrió por Chiu. Esta escala considera Grado 0 a la mucosa intacta avanzando hasta Grado 5 como desnudamiento de todo el grosor.

Con el fin de dilucidar plenamente el efecto protector del tratamiento de combinación en este modelo de isquemia/reperfusión, los supervivientes se sometieron a seguimiento hasta 96 horas de reperfusión.

Los animales que reciben disolución salina normal fueron seriamente afectados por el periodo de reperfusión por isquemia usado aquí, exhibiendo una úlcera transmural con desnudamiento total y sangrado profuso. Como se muestra en la tabla 8, muchos de los segmentos intestinales estudiados en este grupo mostraron un patrón de daño de grado 5. El tratamiento con EGF confirió una protección mínima. Una protección parcial se evidenció en animales que recibieron el GHRP-6 tal que el daño mucosal fue más superficial y estuvo más circunscrito. De nuevo, la combinación de péptidos redujo significativamente los daños mucosales (tabla 8). Todos los criterios usados en el estudio confirman que la combinación de péptidos confiere un efecto citoprotector notable por todo el evento isquemia/reperfusión.

TABLA 8 Parámetros de daño intestinal

Grupos	% de daño	Peso	Contenido en	Hemoglobina	Contenido en	Índice de
experimentales	intestinal	mucosal (g)	proteínas (mg/cm)	luminal (g/dl)	DNA (pg/cm)	daño (0-5)
Isquemia/	96,3\pm 1,1	8,53\pm 2,18	0,72\pm0,4	6,44\pm1,37	0,25\pm0,13	5
disolución salina
EGF – 500 \mug	78,7\pm2,8	10,7\pm4,5	1,08\pm0,6	3,5\pm1,02	0,4\pm0,11	4,2
GHRP-6 100 \mug	63\pm14,5\ding{168}	11,3\pm1,6\ding{168}	1,88\pm0,75\ding{168}	1,23\pm0,82\ding{168}	0,58\pm0,24\ding{168}	3,88\ding{168}
Combinación	11,5\pm6,4*	14,5\pm1,2*	2,85\pm0,66*	0*	0,79\pm0,03*	1,27*
EGF+ GHRP-6
\hskip0,4cm Datos expresados como media y D.E.
(*) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia media entre el grupo que recibe la combinación de péptidos y el grupo isquémico que recibe la disolución salina (p < 0,01).\end{minipage}
(\ding{168}) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia media entre el grupo que recibe el GHRP-6 y el grupo tratado con disolución salina (p < 0,05). Comparaciones mediante ANOVA de sentido único y prueba de múltiples intervalos de Duncan.\end{minipage}

El examen microscópico de los órganos internos principales demostró una correspondencia cercana entre la magnitud del daño intestinal y los cambios extraintestinales encontrados en órganos remotos. Los daños principales hallados atenuados en animales tratados con la combinación fueron: (I) infiltración de neutrófilos en parénquima de los pulmones, (II) prevención de oncosis en hepatocitos y (III) prevención de colapso de mechón glomerular y cambios tubulares.

Un segundo e independiente experimento se condujo con el fin de aprender si los animales estimulados por la combinación sobreviven. La metodología experimental es como se describe anteriormente. Todas las ratas recibieron inyección intraperitoneal de Ringer con lactato tras el cierre de la herida. Los animales se sometieron a seguimiento durante 96 horas una vez se inició la reperfusión. El 100% de las ratas que reciben la combinación peptídica sobrevivió 96 horas y más allá. (tabla 9).

TABLA 9

Supervivencia por grupo
Grupos experimentales (N = 10)	Supervivencia (%)
Isquemia/disolución salina	0
EGF (500 \mug)	20
GHRP-6 (100 \mug)	40
EGF (5 \mug) + GHRP-6 (2 \mug)	100

El estudio de la patología de estos animales confirmó los hallazgos previos en los que la combinación peptídica no sólo proporcionó una protección intestinal estable reduciendo la aparición de cambios necróticos. Adicionalmente, los daños en pulmones y riñones como órganos diana remotos afectados mediante reclutamiento de neutrófilos se atenuó también. Estos hallazgos confirman la protección sistémica y multiorgánica activada por la combinación EGF/GHRP-6.

Ejemplo 4

Efecto de la administración terapéutica del EGF/GHRP-6 en un modelo experimental de daño a múltiples órganos mediante quemadura extensiva

La región dorsal de ratones Balb/c (22-25 g) se depiló y sometió a escaldado hipodérmico implicando un 25% del área corporal, mediante inmersión en agua equilibrada a 95-97ºC durante 5 segundos. Todos los ratones recibieron 1,5 ml de disolución salina normal como fluido de resucitación inmediatamente después. Este modelo animal se ha establecido y calibrado previamente en nuestro laboratorio, y es útil para nuestras metas como cambios internos extensivos que se reproducen constantemente. En las siguientes 24 horas los ratones supervivientes se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos:

Referencia: ratones quemados fingidamente que reciben disolución salina al 0,9% (N = 5).

Escaldados que reciben sólo disolución salina normal al 0,9% (N = 7).

Escaldados y tratados con EGF (N = 10; EGF/animal 0,1 \mug).

Escaldados y tratados con GHRP-6 (N = 9; 0,1 \mug GHRP-6/animal).

Escaldados, tratados con la combinación de péptidos (N = 10). EGF (0,01 \mug) y GHRP-6 (0,01 \mug).

Las administraciones se hacen dos veces en un día y hasta el día 10º tras el escaldamiento. Una vez los tratamientos se completaron los animales se pesaron de nuevo y se mataron para necropsia y examen microscópico. Seis horas antes de la muerte, cada ratón recibió una inyección de vincristina (1 mg/kg) para frenar las células en metafase. Los intestinos se reseccionaron, se lavaron mediante flujo y se pesaron. Los fragmentos se recogieron para contenido total de DNA y proteínas. Otros fragmentos se fijaron en formalina y se usaron para procesamiento de rutina o para microdisección intestinal de vellosidades y criptas. Los procedimientos monoméricos de las láminas microscópicas se derivaron del sistema de procesamiento de imágenes DIGIPAT.

Se consideran en este estudio los siguientes parámetros:

Peso de los animales.

Peso intestinal, contenido en proteínas y DNA.

Número de células en metafase por cripta.

Número de criptas que se bifurcan.

Altura de la vellosidad.

Profundidad de la cripta.

Todos los ratones que reciben EGF, GHRP-6 solo o en combinación mostraron un significativo incremento en peso corporal al final del experimento. La diferencia fue incluso mayor en aquellos animales que reciben ambos péptidos. Estos datos se muestran en la tabla 10. Este hallazgo indica el efecto trófico ejercido mediante la combinación de la mucosa intestinal.

TABLA 10

Peso corporal a lo largo del experimento
Grupos	Peso inicial	Peso final	% de incremento
Escaldado-disolución salina al 0,9%	23,8\pm1,2	25,3\pm3,6	6
Escaldado-EGF (0,01 \mug)	22,1\pm 2,2	28,2\pm3,3*	27
Escaldado-GHRP(0,01 \mug)	23,3\pm1,6	28,4\pm1,8*	23
Escaldado-combinación	23,5\pm1,7	31,7\pm4,0*#	34
EGF + GHRP-6
\begin{minipage}[t]{155mm}Pesos finales registrados en el día 10^{o} tras el escaldado y después de que se completaran 20 administraciones. Los datos se expresan en media y D.E.\end{minipage}
(*) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia media entre el peso corporal inicial y el final p < 0,05.\end{minipage}
(#) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia entre el grupo que recibe la combinación y el resto de los grupos. ANOVA de sentido único y Duncan.\end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

Como se muestra en la tabla 11 cada péptido individual ejerció un efecto trófico/regenerativo sobre la mucosa intestinal comparada con el tratamiento con disolución salina. Los efectos más importantes se encontraron efectivamente en el grupo que recibe la combinación con el péptido.

TABLA 11 Respuesta intestinal regenerativa

Grupos	Peso intestinal(g)	Proteína total(mg/cm)	DNA total(\mug/cm)
Referencia intacta	1,53\pm0,25	2,6\pm0,81	0,66\pm0,05
Escaldado-disolución	0,84\pm0,16	1,04\pm0,62	0,41\pm0,11
salina al 0,9%
Escaldado-EGF (0,01 \mug)	1,49\pm0,21\ding{168}	2,22\pm0,48\ding{168}	0,61\pm0,08\ding{168}
Escaldado-GHRP (0,01 \mug)	1,33\pm0,15\ding{168}	2,05\pm0,33\ding{168}	0,59\pm0,01\ding{168}
Escaldado-combinación	1,96\pm0,1 *	3,04\pm0,2*	0,88\pm0,03*
EGF + GHRP-6
\hskip0,4cm Los datos se expresan como media y D.E.
(*) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia media entre el grupo que recibe la combinación de péptidos y el grupo tratado con disolución salina (p < 0,1).\end{minipage}
(\ding{168}) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia media entre los grupos que reciben cada péptido solo y el grupo salino (p < 0,05). ANOVA de sentido único y Duncan.\end{minipage}

La evidencia más relevante de este experimento es la demostración de que la combinación peptídica acelera el crecimiento intestinal y la adaptación dada por la estimulación de los procesos de fisión de la cripta a lo largo del intestino delgado y el colon.

La cripta es la unidad de crecimiento y proliferativa de la mucosa intestinal y es como la sustanciación morfológica de la adaptación de la masa intestinal. La tabla 12 muestra los datos que se refieren a la reconstitución morfológica de los intestinos. Las ampliaciones de las vellosidades y las criptas están en correspondencia con la regeneración de tejidos y la absorción de nutrientes.

TABLA 12 Restitución de la mucosa intestinal

Grupos	Nº. de metafases	Nº. de criptas	Altura de la	Profundidad de la
	por cripta (x 200)	en fisión (x 200)	vellosidad (\mum)	cripta (\mum)
Escaldado-disolución	41\pm16	12\pm10	96,3\pm26	33,6\pm 7
salina al 0,9%
Escaldado-EGF (0,01 \mug)	101\pm35\ding{170}	25\pm8	118,7\pm19\ding{170}	48\pm 9
Escaldado-GHRP (0,01 \mug)	59\pm12	19\pm6	99,2\pm10	40,8\pm13
Escaldado-combinación	168\pm22*	77\pm18*	215\pm21*	67,5\pm7*
EGF + GHRP-6
\hskip0,4cm Los datos se expresan como media y D.E.
(*) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia media entre el grupo que recibe la combinación de péptidos y el resto de la (p < 0,05).\end{minipage}
(\ding{170}) \begin{minipage}[t]{155mm}Diferencia media entre el grupo EGF y el que recibe disolución salina 0,9% (p < 0,05). ANOVA de sentido único y Duncan.\end{minipage}

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La presente invención tiene las siguientes ventajas

1. La combinación puede ejercer efectos profilácticos y/o terapéuticos, los cuales dependen de los requisitos para que se encuentre la afección patológica a tratarse. Los efectos se modulan con facilidad mediante el régimen de administración mediante un profesional experto en la técnica.

2. El procedimiento para inducir protección celular se basa en la estimulación de mecanismos autodefensivos en cada célula del cuerpo. Los mecanismos para activarse son diferentes pero funcionalmente redundantes. Muchas soluciones previas para la protección celular introducen estructuras químicas extrañas (xenobióticas).

3. Pequeñas dosis son suficientes para inducir la respuesta terapéutica esperada sin ningún riesgo de toxicidad. Los péptidos han demostrado ser seguros a muy altas dosis en diferentes especies de mamífero. Los intentos previos requieren dosis más altas para efecto modesto.

4. La respuesta se activa rápidamente en la interacción tanto de EFG como de GHRP-6 a un receptor celular específico. Esto descarta la necesidad de exposiciones prolongadas a los péptidos, reduciendo los riesgos tóxicos.

5. La combinación de péptidos no tiene contraindicaciones y se puede usar en cualquier sujeto sin riesgo. No ocurre interacción de fármaco no deseada.

6. El procedimiento es para usarse para un amplio intervalo de afecciones clínicas comunes y comorbilidad, muchas de ellas con elección terapéutica no disponible hasta el momento.

7. El procedimiento está indicado para un número de afecciones patológicas que incluyen aquellos pacientes que sufren cirugía de transplante.

8. Los efectos citoprotectores de la presente invención tiene una amplia ventana terapéutica en términos de tiempo de protección contra isquemia/reperfusión. El tiempo de protección satisface las necesidades clínicas actuales para transplante, revascularización, manipulaciones diagnósticas, procedimientos de gestión, etc.

9. Desde el punto de vista mecanicista la combinación puede contrarrestar la cascada del daño por isquemia/reper-
fusión en diferentes puntos críticos, lo cual vuelve su mecanismo farmacológico como polivalente y así eficaz.

10. El uso de la presente combinación es único como agente trófico/regenerativo para muchos órganos epiteliales como el intestino, hígado, páncreas y riñón.

11. La presente invención ha demostrado ser útil para la corrección del síndrome del intestino grueso/adaptación intestinal. Este procedimiento no tiene ninguna elección alternativa en la práctica clínica actual.

Claims (22)

1. Composición farmacéutica o kit que comprende un péptido que tiene actividad de Factor de Crecimiento Epidérmico y un hexapéptido secretagogo de hormona del crecimiento (GHRP-6).

2. Composición o kit de acuerdo con la reivindicación 1 en la que el péptido que tiene actividad de Factor de Crecimiento Epidérmico se elige del grupo de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), Factor de Crecimiento Transformante tipo alfa (TGF-\alpha), y Factor de Crecimiento similar a EGF de Unión a Heparina (HB-EGF).

3. Composición o kit de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que el péptido que tiene actividad de Factor de Crecimiento Epidérmico y el hexapéptido secretagogo de hormona del crecimiento (GHRP-6) son componentes de una composición farmacéutica individual la cual comprende adicionalmente un excipiente apropiado.

4. Composición o kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el péptido que tiene actividad de factor de crecimiento epidérmico está presente en una concentración de 0,5-50 \mug/ml cuando se prepara como una disolución o en forma liofilizada.

5. Composición o kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el hexapéptido secretagogo de hormona del crecimiento (GHRP-6) está presente en una concentración de 2-100 \mug/ml cuando se prepara como una disolución o en una forma liofilizada.

6. Composición o kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para usar en tratamiento médico.

7. Composición o kit de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el tratamiento médico comprende profilaxis o tratamiento de daño tisular debido a déficit de flujo sanguíneo arterial y consecuencias del mismo en un organismo o animal humano.

8. Uso de una composición o kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la elaboración de un medicamento para profilaxis o tratamiento de tejido dañado debido a déficit de flujo sanguíneo arterial y consecuencias del mismo en un organismo humano o animal.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la cual el péptido que tiene actividad de Factor de Crecimiento Epidérmico y el hexapéptido secretagogo de hormona del crecimiento (GHRP-6) están para administrarse simultáneamente o independientemente.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en el que el medicamento está para administrarse parenteralmente como una inyección intravenosa rápida para tener actividad profiláctica, inducible en un intervalo de dosis de 0,5-1 \mug de cada péptido activo por kilogramo de peso corporal.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en el que el medicamento está para administrarse como una infusión continua para inducir efectos tróficos/regenerativos en un intervalo de dosificación de 0,01-5 \mug de cada péptido activo por kilogramo de peso corporal.

12. Uso de un hexapéptido secretagogo de hormona del crecimiento (GHRP-6) y un excipiente adecuado para la elaboración de un medicamento para inducir profilaxis contra daño isquémico tal como para prevenir daño tisular cuando el flujo de sangre arterial ha fallado en un organismo humano o animal.

13. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para prevenir daño tisular sea letal o no en tejidos y/o órganos afectados por isquemia total sin ningún reflujo, estados de flujo lento, o isquemia/reperfusión.

14. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para atenuar o corregir estrés respiratorio del adulto (ARDS), como una terapia adjunta.

15. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para prevenir o corregir síndrome de disfunción orgánico múltiple o un procedimiento relacionado que demanda medidas de cuidado intensivo.

16. Uso de acuerdo con la reivindicación 15 en un tratamiento de una víctima de quemaduras, un paciente de politraumatismo, un paciente de cirugía extensiva, un receptor de cirugía de trasplante, un paciente que sufre cirugía de revascularización, un paciente acoplado a una máquina de corazón-pulmón, un paciente que recibe terapia trombolítica y/o fibrinolítica y que tiene reperfusión realizada, síndrome de aplastasmiento, un paciente que presenta hipovolemia, apoplegia, o rendimiento cardiaco bajo.

17. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para una terapia adjunta para hemorragia, mala distribución de fluidos, apoplegia o reperfusión/isquemia esplácnica.

18. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11 en el que el medicamento sirve como un profiláctico o agente preacondicionador para cirugía de transplante, isquemia prolongada mediada por cirugía, o cualquier otra afección que conduzca a la aparición de isquemia esplácnica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica o disfunción orgánica múltiple.

19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18 para preservar homeostasis de órganos internos y tejidos durante la cirugía de revascularización, o para potenciar supervivencia del injerto seguido de transplante de órganos como riñones, hígado, páncreas, intestinos, pulmones, corazón o colgajos cutáneos.

20. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para prevenir daño celular siguiendo una situación que puede entorpecer la perfusión tisular con sangre oxigenada.

21. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para restaurar la conformidad morfofuncional de tejido/órgano tras un episodio isquémico que ha conducido a necrosis y/o apoptosis.

22. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para acelerar la adaptación intestinal tras enterectomía, síndrome del intestino grueso, fallo intestinal asociado o no con nutrición parenteral total.