ES2243932T3 - Secuencias de nucleotidos mediadores de la fertilidad masculina y procedimientos de utilizacion correspondientes. - Google Patents
Secuencias de nucleotidos mediadores de la fertilidad masculina y procedimientos de utilizacion correspondientes.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN SECUENCIAS DE NUCLEOTIDO QUE MEDIAN LA FERTILIDAD MASCULINA EN PLANTAS, CON MOLECULA DE ADN Y SECUENCIAS DE AMINOACIDOS ESTABLECIDAS. TAMBIEN SE DESCRIBE EL USO DE LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDO PARA MEDIAR LA FERTILIDAD EN PLANTAS. EN UN METODO, SE UTILIZA UN PROMOTOR INDUCIBLE PARA REGULAR LA EXPRESION DE LA MOLECULA DE ADN. LAS SECUENCIAS DE CONTROL SON MODIFICADAS POR LO QUE ESTAN NORMALMENTE "FUERA DE SITIO" Y COMO RESULTADO LAS PLANTAS SON ESTERILES MASCULINAS. CUANDO SE DESEA REPRODUCIR LAS PLANTAS ESTERILES MASCULINAS, LA FERTILIDAD MASCULINA SE RESTAURA TRATANDO A LAS PLANTAS CON UN PRODUCTO QUIMICO NO FITOTOXICO QUE INDUCE LA EXPRESION DEL GEN CRITICO.
Description
Secuencias de nucleótidos mediadores de la
fertilidad masculina y procedimientos de utilización
correspondientes.
El objetivo de la mejora genética de plantas es
combinar en una única variedad/híbrido varias características
deseables de las líneas parentales. Para los cultivo se campo, estas
características pueden incluir resistencia a enfermedades e
insectos, tolerancia al calor y a la sequía, reducción del tiempo
necesario para que madure el cultivo, mayor rendimiento y una mejor
calidad agronómica. Con la recolección mecánica de muchos cultivos,
es importante la uniformidad de las características de la planta
tales como la germinación y la determinación de la cosecha en pie,
la velocidad de crecimiento, la madurez y el tamaño de los
frutos.
Los cultivos de campo son mejorados mediante
técnicas que aprovechan el método de polinización de la planta. Una
planta tiene autopolinización si el polen de una flor es transferido
a la misma flor o a otra flor de la misma planta. Una planta tiene
polinización cruzada si el polen procede de una flor de una planta
diferente.
En el caso de Brassica, la planta es
normalmente autoestéril y sólo puede ser polinizada de manera
cruzada. En las especies con autopolinización, tales como la soja y
el algodón, las plantas masculinas y femeninas son anatómicamente
yuxtapuestas. Durante la polinización natural, los órganos
reproductores masculinos de una flor dada polinizan los órganos
reproductores femeninos de la misma flor.
Las plantas de maíz (Zea mays L.)
presentan una única situación en cuanto a que pueden ser mejoradas
genéticamente mediante técnicas de autopolinización y polinización
cruzada. El maíz tiene flores masculinas, localizadas en la panoja,
y flores femeninas, localizadas en la mazorca, en la misma planta.
Puede autopolinizarse o tener polinización cruzada. La polinización
natural tiene lugar en el maíz cuando el viento lleva el polen desde
las panojas hasta las sedas que sobresalen de la parte superior de
las mazorcas incipientes.
Un método fiable para controlar la fertilidad
masculina en las plantas ofrecería la oportunidad de una genética
mejorada de las plantas. Esto es especialmente cierto para el
desarrollo de híbridos de maíz, que se basa en cierto tipo de
sistema de esterilidad masculina.
La producción de híbridos de maíz requiere el
desarrollo de líneas endógamas homozigotas, el cruce de estas líneas
y la evaluación de los cruces. El método genealógico de mejora
genética y la selección recurrente son dos de los métodos de mejora
genética utilizados para desarrollar líneas endógamas a partir de
poblaciones. Los programas de mejora genética combinan
características deseables de dos o más líneas endógamas o de varias
fuentes de base amplia en grupos de mejora a partir de los cuales se
desarrollan nuevas líneas endógamas mediante autofecundación y
selección de los fenotipos deseados. Una variedad de maíz híbrido es
el cruce de dos de tales líneas endógamas, cada una de las cuales
puede tener una o más características deseables de las que carece la
otra línea o que complementan a la otra línea. Las nuevas endógamas
son cruzadas con otras líneas endógamas y los híbridos de estos
cruces son evaluados para determinar cuáles tienen potencial
comercial. La progenie híbrida de la primera generación es
denominada F_{1}. En el desarrollo de híbridos se buscan solamente
las plantas híbridas F_{1}. El híbrido F_{1} es más vigoroso que
sus padres endógamos. Este vigor del híbrido, o heterosis, puede ser
manifestado de muchas formas, incluyendo un crecimiento vegetativo
incrementado y un rendimiento incrementado.
La semilla de maíz híbrido se produce típicamente
mediante un sistema de esterilidad masculina que incorpora el
despanojamiento manual. Hileras alternas de dos variedades endógamas
de maíz son plantadas en un campo y las panojas portadoras de polen
son extraídas de una de las endógamas (femenina). Siempre que haya
aislamiento suficiente de fuentes de polen de maíz foráneo, las
mazorcas de la endógama despanojada serán fertilizadas únicamente
con polen de la otra endógama (masculina), y la semilla resultante
será por tanto híbrida y formará plantas híbridas. Desgraciadamente,
el proceso de despanojamiento manual no es totalmente fiable.
Ocasionalmente, una planta femenina será tumbada por una tormenta y
escapará del despanojamiento. La variación natural en el desarrollo
de las plantas puede tener también como resultado la formación de
panojas en las plantas una vez que se ha completado el
despanojamiento manual. O, un despanojador no extraerá completamente
la panoja de la planta. En cualquiera de los casos, la planta
femenina esparcirá polen con éxito y algunas plantas femeninas serán
autopolinizadas. Esto tendrá como resultado semillas de la planta
endógama femenina recogidas junto con las semillas híbridas que se
producen normalmente.
Alternativamente, la planta endógama femenina
puede ser despanojada mecánicamente. El despanojamiento mecánico es
aproximadamente tan fiable como el despanojamiento manual, pero es
más rápido y menos costoso. Sin embargo, la mayoría de las máquinas
de despanojación producen más daño a las plantas que la
despanojación manual. Por tanto, actualmente ninguna forma de
despanojación es totalmente satisfactoria y continúa existiendo la
necesidad de alternativas que reduzcan adicionalmente los costes de
producción y eliminen la autopolinización en la producción de
semillas híbridas.
El laborioso proceso de despanojamiento puede ser
evitado mediante la utilización de plantas endógamas estériles
masculinas citoplásmicas (CMS). Las plantas de una endógama CMS son
estériles masculinas como resultado de factores resultantes del
genoma citoplásmico, en lugar del genoma nuclear. De este modo, esta
característica es heredada exclusivamente a través del parental
femenino en las plantas de maíz, ya que solamente la hembra
proporciona el citoplasma a la semilla fertilizada. Las plantas CMS
son fertilizadas con polen de otra planta endógama que no sea
estéril masculina. El polen procedente de la segunda planta endógama
puede aportar o no genes que conviertan a las plantas híbridas en
fértiles masculinas. Normalmente la semilla procedente del maíz
normal despanojado y la semilla producida por la CMS del mismo
híbrido deben ser mezcladas para asegurar que estén disponibles las
cargas de polen adecuadas para la fertilización cuando se cultiven
las plantas híbridas.
Puede haber otros inconvenientes con las CMS. Uno
de ellos es una asociación observada históricamente de una variante
específica de CMS con susceptibilidad a ciertas enfermedades de los
cultivos. Este problema ha llevado al abandono virtual de la
utilización de esa variante CMS en la producción de maíz
híbrido.
Otra forma de esterilidad, la esterilidad
masculina génica, está descrita en las Patentes de EE.UU. 4.654.465
y 4.727.219 para Brar y col. Sin embargo, esta forma de esterilidad
masculina genética requiere el mantenimiento de múltiples genes
mutantes en posiciones separadas dentro del genoma y requiere un
complejo sistema de marcadores para seguir la pista a los genes y
utilizar convenientemente el sistema. Patterson describió también un
sistema génico de translocaciones cromosómicas que es eficaz pero
complicado. Patentes de EE.UU. N^{os} 3.861.709 y 3.710.511.
Se han llevado a cabo otros muchos intentos para
mejorar estas desventajas. Por ejemplo, Fabijanski y col.
desarrollaron varios métodos para producir esterilidad masculina en
plantas (ver EPO 89/3010153.8, nº de publicación 329.308 y solicitud
PCT PCT/CA90/00037 publicada como WO 90/08828). Un método incluye el
suministro a la planta de un gen que codifica una sustancia
citotóxica asociado con un promotor específico de tejido masculino.
Otro implica un sistema antisentido en el que se identifica un gen
crítico para la fertilidad y se inserta en la planta un antisentido
respecto al gen. Maniari y col. muestran también varias secuencias
génicas que codifican citotoxinas, junto con promotores específicos
de tejido masculino y mencionan un sistema antisentido. Ver EP
89/401.194. Otros sistemas más utilizan genes "represores" que
inhiben la expresión de otro gen crítico para la esterilidad
masculina. PCT/GB90/00102, publicada como WO 90/08829.
Según se ha indicado, un aspecto esencial de
mucho del trabajo en marcha con sistemas de esterilidad masculina es
la identificación de genes que afecten a la fertilidad
masculina.
Tal gen puede ser utilizado en una variedad de
sistemas para controlar la fertilidad masculina. Previamente, se ha
identificado un gen de esterilidad masculina en Arabidopsis
thaliana y se utilizado para producir una planta estéril
masculina. Aarts y col., "Transposon Tagging of a Male Sterility
Gene in Arabidopsis", Nature, 363:715-717
(24 de Junio, 1993). En la presente invención los inventores
proporcionan una nueva molécula de ADN y la secuencia de aminoácidos
que codifica la misma, la cual es crítica para la fertilidad
masculina en plantas.
Además, los inventores presentan una única
variación del método para controlar la esterilidad masculina
mediante la utilización de la molécula de ADN para hacer que una
planta sea estéril masculina después de la transformación, con
fertilidad, no esterilidad, inducida.
Por tanto, un objeto de la invención es
proporcionar una secuencia de ácido nucleico, cuya expresión es
crítica para la fertilidad masculina en plantas.
Otro objeto de la invención es proporcionar una
molécula de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos, cuya
expresión es crítica para la fertilidad masculina en plantas.
Un objeto más de la invención es proporcionar un
método de utilización de tales moléculas de ADN para mediar la
fertilidad masculina en plantas.
Otro objeto todavía más es proporcionar un método
para mediar la fertilidad masculina en plantas mediante la
regulación de la expresión de la molécula de ADN que existe de
manera natural en la planta.
Otro objeto más es proporcionar un método para
mediar la fertilidad masculina en plantas mediante el suministro de
la molécula de ADN a una planta de tal manera que pueda controlarse
la expresión de la molécula de ADN.
Otro objeto es proporcionar plantas en las que la
fertilidad masculina de las plantas esté mediada por la molécula de
ADN.
Un objeto adicional es la utilización de plantas
con fertilidad masculina mediada por las moléculas de ADN en un
sistema de mejora genética de plantas.
Objetos adicionales de la invención serán obvios
en la descripción y reivindicaciones que siguen.
Esta invención se refiere a secuencias de ácido
nucleico y, específicamente, a moléculas de ADN y a las secuencias
de aminoácidos codificadas por las moléculas de ADN, que son
críticas para la fertilidad masculina. Se refiere también a la
utilización de tales moléculas de ADN para mediar la fertilidad en
plantas. Uno de tales métodos es convertir a las plantas en
estériles masculinas de manera controlable mediante la utilización
de un promotor inducible para regular la expresión de la molécula de
ADN, de tal manera que el gen esté normalmente "inactivo" y la
planta sea por tanto estéril. Cuando el promotor es inducido, la
planta se vuelve fértil.
La Fig. 1 es un mapa de restricción del
transposón Ac.
La Fig. 2 es un gel de un análisis de
Transferencia Southern de ADN digerido con PvuII procedente de una
familia de Ac que segregaba por esterilidad e hibridado con
un fragmento interno de HindIII de 1,6 kb procedente de
Ac.
La Fig. 3 es una representación esquemática de
una reacción en cadena de la polimerasa inversa.
La Fig. 4 es una representación gráfica del
aislado de ADN de 1,4 kb y sus secuencias intermedias.
La Fig. 5 es un gel de un análisis de
Transferencia Southern de ADN digerido con PvuII procedente de una
familia de Ac que segregaba por esterilidad e hibridado con
el aislado de ADN de 1,4 kb.
La Fig. 6 es un gel de un análisis de
Transferencia Northern hibridado con el gen de la fertilidad
masculina MS45.
La Fig. 7 muestra la secuencia de nucleótidos y
de aminoácidos del ADN de la planta convertida de nuevo en fértil
después de la transposición de Ac.
La Fig. 8 es un mapa RFLP del cromosoma 9 que
muestra el gen de la fertilidad masculina MS45.
A no ser que se definan de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el
mismo significado que el conocido comúnmente por una persona con
experiencia habitual en la técnica a la que pertenece esta
invención. A no ser que se mencione de otro modo, las técnicas
empleadas o contempladas en la presente son metodologías estándar
bien conocidas por las personas con experiencia habitual en la
técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente
ilustrativos y no limitantes.
La esterilidad masculina genética es el resultado
de una mutación en uno de los genes responsables de una etapa
específica de la microesporogénesis, aplicado el término al proceso
completo de formación del polen. Estos genes pueden referidos
colectivamente como genes de la fertilidad masculina. Hay muchas
etapas de la ruta total en las que una mutación puede lugar a
esterilidad masculina. Esto parece apoyado acertadamente por la
frecuencia de esterilidad masculina genética en el maíz. Se han
descubierto nuevos alelos de mutantes de esterilidad masculina en
materiales que varían desde plantas endógamas de elite hasta
poblaciones inadaptadas. Hasta la fecha, la investigación sobre la
esterilidad masculina genética publicada ha sido en su mayoría
descriptiva. Se han hecho algunos esfuerzos para determinar el
mecanismo de la esterilidad en el maíz, pero pocos han sido
satisfactorios. Esto no debería ser sorprendente dado el número de
genes que han sido identificados como responsables de la esterilidad
masculina. Es poco probable que un mecanismo sea aplicable a todas
las mutaciones.
La invención tiene que ver con un gen fértil
masculino de una planta. Se han descrito extensamente ADNcs
específicos para el desarrollo del polen y para el desarrollo de la
panoja. Hasta la fecha, ninguno de ellos ha dado lugar al clonaje de
un gen que pueda ser referido como impactante para el desarrollo del
polen.
Lo siguiente se presenta a manera de ilustración
y no tiene la intención de limitar el ámbito de la invención.
El Ac (Activador) es un elemento
transponible bien conocido caracterizado por primera vez por Barbara
McClintock en 1954 (McClintock, B., Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol. 21:197-216 (1956); McClintock, B.,
Carnegie Inst. Wash. Yrbook, 53:254-260
(1954); ver también Federoff, Patente de EE.UU. Nº 4.732.856
publicada el 22 de Marzo de 1988 y Dooner, Patente de EE.UU. Nº
5.013.658 publicada el 8 de Mayo de 1991). El Ac fue
utilizado para clonar esta molécula de ADN. Un mapa de restricción
de Ac utilizado en la presente está representado en la Figura
1. Los expertos en la técnica están familiarizados con los sitios de
restricción de Ac. En resumen, el transposón Ac iba
desde el locus P-vv en el cromosoma 1 al
cromosoma 9. El único gen de esterilidad masculina actualmente
descrito en el cromosoma 9 es ms2, que no ha sido nunca clonado ni
secuenciado. Ver Albertsen, M. y Phillips, R.L., "Developmental
cytology of 13 genetic male sterile loci in maize", Canadian
Jnl. of Genetics and Cytology 23:195-208 (Enero
de 1981). El único gen de fertilidad clonado es el gen de
Arabidopsis descrito. Aarts y col., supra. El análisis de la
progenie del cruce ha confirmado que los genes no son alélicos.
Se utilizaron tres líneas de maíz, todas las
cuales están ampliamente disponibles para los genetistas del maíz y
son utilizadas regularmente por los expertos en la técnica y están
descritas en Chen y col., "Transposition of Ac from the P
locus of maize into unreplicated chromosomal sites",
Genetics 117:109-116 (Septiembre de 1987).
Tales líneas pueden ser obtenidas, por ejemplo, de los autores del
artículo anterior, de Pioneer Hi-Bred International,
Inc., o de cualquiera de las muchas fuentes públicas tales como el
Maize Genetics Stock Cooperation Center, University of Illinois,
Urbana/Champagne, Department of Agronomy S-123
Turner Hall, 1102 South Goodwin Avenue, Urbana, Illinois, 61801.
La primera línea es
W23P-vv. El alelo P-vv es
producido por la inserción del elemento móvil Ac en el
locus P. Emerson, R., "The inheritance of a recurring
somatic variation in variegated ears of maize", Am. Nat.
48:87-115 (1914); Brink, R. y Nilan, R., "The
relation between light variegated and medium variegated pericarp in
maize", Genetics 37:519-544 (1952) y
Barclay, P. y Brink, R., "The relation between modulator
and Activator in maize", Proc. Nat'l. Acad Sci. USA
40:1118-1126 (1954). El gen P es un gen del maíz
bien caracterizado y completamente detallado en la técnica. El gen P
induce la pigmentación del pericarpio del maíz. La flavanona es
reducida a flobafenos que producen la pigmentación del pericarpio.
Un ejemplo de la información detallada sobre el gen P que está
disponible para los expertos en la técnica es la discusión de
Lechelt y col., "Isolation and molecular analysis of the maize P
locus", Mol. Gen. Genet.
219:225-234 (1989) y Chen y col., "Molecular
Analysis of Ac transposition and DNA replication"
Genetics. Éste es un gen marcador excelente debido a su
función en la regulación del color del pericarpio, y tiene como
resultado un pericarpio de rayas rojas. Las rayas rojas muestran la
escisión de Ac de P, restaurando la función del gen y
proporcionando un pericarpio rojo.
El gen P (P-vv) está en el mismo
cromosoma que los estériles masculinos genéticos conocidos mapeados
previamente en el cromosoma 1. Se ha mostrado que Ac se
transpone en el mismo cromosoma el 67% de las veces. Van Schaik,
N.V. y Brink, R.A., "Transpositions of modulator, a
component of the variegate pericarp allele in maize",
Genetics 44:725-738 (1959). Sin embargo, esto
no ocurría aquí, ya que el Ac se transponía al cromosoma 9.
El propio P-vv facilita enormemente el marcaje de
transposones, ya que es posible observar visualmente cuando el
Ac se ha transpuesto desde el gen P y está en cualquier otro
lugar del genoma.
La 4C063 es una línea endógama blanca que se
combina bien con W23P-vv para dar buenas
plantas híbridas con granos fácilmente valorados.
W22r-sc:m3 es una línea con el elemento Ds en
el locus R. La planta es genéticamente dominante en todos los
genes de la ruta de la antocianina (A1, A2, Bz1, Bz2, C1, C2, Pr,
R). Como Ds hace que R sea disfuncional, no se produce
antocianina en el grano.
Ésta fue acoplada con la utilización de cepas de
W22r-sc:m3, en las que Ds está integrado en
el gen R. El elemento Ds responde a la presencia de
Ac, por transposición a otro sitio en el genoma. Es de hecho
un Ac defectuoso. El transposón Ac puede moverse
dentro y fuera de un gen por sí mismo, mientras que Ds no
puede moverse a no ser que esté presente Ac en algún lugar
del genoma. El gen R es un gen del maíz estudiado en considerable
profundidad. Se sabe que codifica enzimas requeridos para la
síntesis de pigmentos antocianinas. Un ejemplo de la información
detallada conocida concerniente al gen R es la descripción y la
información sobre la secuenciación encontradas en Dellaporta y col.,
Stadler Symposium 18:263 (1988) y Ludwig y col.,
"Lc, a member of the maize R gene family responsible for
tissue-specific anthocyanin production, encodes a
protein similar to transcripcional activators and contains the
myc-homology region", Proc. Nat. Acad. Sci.
86:7092-7096 (Septiembre de 1989) y la utilización
del gen como marcador visual descrita en Bowen y col., "R Genes as
visual markers for corn transformation", Abstract edit.
Gallagher, Academic Press (Octubre de 1989) y Ludwig y col., "A
regulatory gene as a novel visible marker for maize
transformation", Science 247:449-450 (26
de Enero de 1990).
En la cepa W22r-sc:m3, todos los
genes de la antocianina del grano son dominantes. Sin embargo, el
color del grano es amarillo debido a que Ds interrumpe la
función del gen R. En presencia de Ac, sin embargo, el
elemento Ds puede transponerse, teniendo como resultado granos con
manchas de color púrpura. Por tanto, era posible 1) determinar
visualmente cuando Ac se transponía lejos del gen P
(pericarpio con rayas rojas o completamente rojo) y 2) determinar si
Ac era todavía activo (manchas de color púrpura en la
aleurona). Mediante la selección de todos los granos rojos o de los
granos con rayas rojas en el pericarpio sobre el embrión que tiene
también manchas púrpura en la aleurona, era posible enriquecer
enormemente con aquellos casos en los que un Ac activo se
había transpuesto a otra posición en el genoma. Mediante la
autofecundación de las plantas resultantes de estos granos, pueden
someterse a selección familias de la progenie por cualquier mutación
que afecte al desarrollo de la panoja o de la antera. En este caso,
se crearon familias autofecundadas para la segregación de las
plantas estériles masculinas.
La realización del análisis de cosegregación para
el marcaje y el clonaje de genes específicos mediante un abordaje
estrictamente molecular puede ser tediosa y de larga duración. El
sistema Ac es, sin embargo, muy adecuado para el análisis de
cosegregación a nivel de genética de campo. Puede utilizarse la
interacción entre Ac y Ds activos en el gen R
(r-sc:m3). Plantas cruzadas con Ac fueron
autofecundadas y cultivadas, identificándose aquellas familias que
se segregaban por esterilidad masculina. Una vez que se había
identificado una familia que se había segregado por esterilidad
masculina, se plantaron semillas adicionales para el cruce con
r-sc:m3 para el análisis de la cosegregación. Cada
planta (fértiles y estériles) fue cruzada con
r-sc:m3, se observó la segregación de colores del
grano en cada mazorca y se correlacionó con el hecho de que las
plantas fueran fértiles masculinas o estériles masculinas.
Se observó una familia en la que las plantas eran
mayoritariamente estériles masculinas, con unas cuantas anteras
anormales extruidas alrededor de la panoja. En la mayoría de los
casos, estas anteras anormales no tenían polen presente. Cuando cada
planta de esta familia fue cruzada con r-sc:m3, se
observó la cosegregación de Ac con el fenotipo estéril
masculino, según se muestra en la tabla siguiente.
| Fenotipo de | Fenotipo de la Mazorca | Número | Número |
| la Planta | Observado | Esperado | |
| Estéril | Todos los granos con manchas de | 8 | 8,25 |
| color púrpura | |||
| Fértil | 1/2 granos con manchas púrpura | 16 | 16,50 |
| 1/2 granos sin manchas | |||
| Fértil | Todos los granos sin manchas | 9 | 8,25 |
Las plantas estériles masculinas producían
siempre mazorcas con todos los granos con manchas de color púrpura.
Dos tercios de las plantas fértiles tenían mazorcas que segregaban
un 50% de granos con manchas y un 50% de granos amarillos. Un tercio
de las fértiles producían mazorcas con todos los granos amarillos.
Esto demostraba que Ac se había transpuesto a un gen
responsable de la fertilidad masculina e interrumpía su función. El
gen actúa como recesivo y, cuando está en homozigosis, tiene como
resultado la esterilidad masculina. Esta segregación fue verificada
en posteriores plantaciones.
Se llevó a cabo un análisis Southern para
confirmar la asociación de Ac con la esterilidad. El análisis
Southern es una técnica bien conocida por los expertos en el oficio.
Este procedimiento habitual implica el aislamiento del ADN de la
planta, el corte con endonucleasas de restricción y el
fraccionamiento del ADN cortado en un gel de agarosa y la
transferencia a membranas de nitrocelulosa para separar el ADN por
peso molecular. Posteriormente se hibrida con el fragmento de la
sonda que estaba marcado radioactivamente con ^{32}P y se lava en
una solución de SDS. Southern, E., "Detection of a specific
sequence among DNA fragments by gel electrophoresis", J. Mol.
Biol. 98:503-517 (1975).
El ADN fue aislado de la progenie cruzada estéril
y de la progenie cruzada fértil, manteniendo las plántulas de grano
con manchas de color púrpura separadas de las plántulas con grano
amarillo. El ADN fue aislado de las dos hojas superiores de plantas
de un mes de edad utilizando un procedimiento con urea según está
descrito en Dellaporta y col., "A plant DNA minipreparation:
version II", Plant Mol. Bio. Rep. 1:19-21
(1983). El ADN aislado fue cortado con PvuII con el fin de encontrar
un fragmento de 2,5 kb asociado únicamente con Ac según se
muestra en el mapa de restricción (Fig. 1). Aproximadamente 8 \mug
de ADN fueron digeridos con el enzima apropiado de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (Promega). Los digestos de ADN fueron
sometidos a electroforesis en un gel de agarosa Sea Kem GTG al 0,75%
y transferidos a una membrana de nailon Duralon-UV
mediante transferencia capilar y fijados a la membrana por
calentamiento en estufa durante 1 hora a 85ºC. El fragmento de
HindIII de 1,6 kb de Ac fue utilizado como sonda en el
análisis de Transferencia Southern.
Los resultados están mostrados en el gel de la
Figura 2. En la Figura 2, los estériles masculinos son las calles
3-10. La calle 2 es la planta fértil heterozigota y
la calle 1 el tipo salvaje. Según confirma este gel, aparecía una
banda del fragmento de 2,5 kb en todas las plantas estériles (granos
con manchas de color púrpura) y no aparecía en ninguna de las
plantas fértiles (granos amarillos). Esto confirma que el Ac
estaba ligado estrechamente al locus de la fertilidad
masculina o bien estaba insertado en el locus, inhibiendo la
función del gen y teniendo como resultado un fenotipo estéril
masculino.
El ADN adyacente a la secuencia conocida del
Ac fue clonado y utilizado en la obtención del gen
completo.
Para resumir, el ADN de la planta fértil
masculina y el ADN de la planta estéril masculina fueron digeridos
con las endonucleasas de restricción PstI, EagI, SalI, SacI y XbaI
para localizar una única banda con el elemento Ac. Los
fragmentos fueron sometidos a electroforesis, sometidos a
transferencia Southern e hibridados con el fragmento de HindIII de
Ac. Se identificó un fragmento de PstI de 6 kb que
cosegregaba con el elemento de la esterilidad masculina. Se utilizó
el método de PCR inversa de Baker y col. para aislar el ADN asociado
con Ac. Earp, D.J., Lowe, B. y Baker, B., "Amplification of
genomic sequences flanking transposable elements in host and
heterologous plants: a tool for transposon tagging and genomic
characterization", Nucleic Acids Research
18:3271-3279 (1990).
Una representación esquemática del procedimiento
bien conocido de la reacción en cadena de la polimerasa inversa está
mostrado en la Figura 3. Después de obtener el fragmento de 6 kb, se
volvieron a ligar los extremos. Los cebadores A y B fueron
identificados fácilmente ya que se conoce la secuencia de Ac.
De este modo, pudieron identificarse los oligonucleótidos 5' y 3' y,
de acuerdo con la técnica de PCR inversa, se hicieron reaccionar
para amplificar las secuencias intermedias. Los cebadores A y B se
hicieron funcionar desde cada lado del círculo religado en el que
había estado el Ac. De esta forma, se amplificó el ADN entre
los extremos del Ac y se aisló un segmento de ADN de 1,3 kb.
El fragmento de Ac de 4,8 kb conocido más el producto
amplificado de la PCRI de 1,3 kb eran casi equivalentes al fragmento
de PstI de 6,0 kb aislado previamente.
Los detalles de este procedimiento resumido
anteriormente son según sigue. Se aisló el ADN genómico según se
describió anteriormente. Se sometieron a digestión 20 \mug de ADN
con 20 unidades de PstI de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Promega). El ADN digerido fue sometido a electroforesis
según se describió anteriormente utilizando un peine preparativo. Un
fragmento del gel, que contenía ADN con un peso molecular de entre
5,5 y 6,5 kilobases, fue escindido del gel. El ADN fue electroeluido
de la agarosa mediante la utilización de una membrana #2 de
Spectra/Por, con un corte de peso molecular de
12-14000 (Spectrum Medical Industries, Inc.) que
contenía 0,4 ml de agua estéril y sometido de nuevo a electroforesis
frente a tampón Tris-acetato 1X pH 8,0 (TAE). El ADN
aislado fue extraído consecutivamente con fenol equilibrado con Tris
pH 7,0:cloroformo (1:1), cloroformo, posteriormente fue precipitado
con etanol, secado y resuspendido en agua estéril. Las ligaduras se
realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bethesda
Research Laboratories) utilizando el ADN genómico digerido con PstI
a una concentración final de 20 ng/u. Las ligaduras se realizaron
durante 18 horas a 14ºC.
Los cebadores oligonucleotídicos fueron
sintetizados en un sintetizador de ADN/ARN de Applied Biosystems
modelo 394. El cebador B5 era esencialmente el mismo que el descrito
por Earp y col., supra, excepto en que se había creado un
sitio de EcoRI en el extremo 5' y tenía dos bases extra en el
extremo 3'. Las secuencias de ambos cebadores utilizados en la
reacción de PCR inversa de Ac son según sigue:
A5: 5' GATAGAATTCGGTACGGGATTTTCCCATCCTACTT 3'
B5: 5' GGTAGAATTCGTTTTCGTTTCCGTCCCGCAAGTT 3'
La PCR fue llevada a cabo utilizando 25 ng de ADN
genómico circularizado molde en una reacción que contenía 2 \muM
de cada cebador, 0,24 mM de cada dNTP, 3 unidades de polimerasa Hot
Tub (Amersham) en un tampón de reacción 1X suministrado por el
fabricante. La amplificación se realizó en un termociclador de MJ
Research Inc. modelo PTC-100-96 bajo
las mismas condiciones que las descritas por Earp y col.,
supra. Los productos de la reacción fueron sometidos a
electroforesis en geles de agarosa LMP al 1% (Bethesda Research
Laboratories). El producto de la amplificación fue aislado del gel
utilizando un kit "Magic PCR Kit" (Promega) y reamplificado
utilizando las condiciones anteriores.
Los procesos de selección de bibliotecas de ADNc
son comúnmente conocidos entre las personas expertas en la técnica y
están descrito en Maniatis, T. y col., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York. Las bibliotecas fueron creadas según sigue. Se
aisló ARN de panojas de Z. mays utilizando el método del
tiocianato de guanidina seguido por la formación de bandas en un
gradiente de cloruro de cesio. Se seleccionó el ARN poli A+
utilizando oligo dT celulosa. Se construyeron dos bibliotecas de
ADNc en los vectores pCDNAII (Invitrogen) y Uni-Zap
XR (Stratagene) utilizando 5 \mug de ARNm para cada uno de acuerdo
con las instrucciones del fabricante.
El producto de la PCR inversa de 1,3 fue sondado
sobre la biblioteca de ADNc de la panoja desplegada de 1000 clones
aproximadamente y a partir de ésta se obtuvo un único clon homólogo
con un tamaño de inserto de 1,4 kb aproximadamente. Tenía 1550 pares
de bases y está representado gráficamente en la Figura 4. El
fragmento genómico variará, por supuesto, de acuerdo con el fondo de
la planta de la que se ha aislado y los intrones pueden estar o no
presentes. Esto, sin embargo, muestra cómo el elemento Ac
aparecía en este aislado.
Las 1,4 kb fueron hibridadas a la membrana de
segregación de PvuII para asegurar que la banda de cosegregación de
3,4 kb encontrada con el producto de la PCR inversa era una nueva
región genómica y no pequeñas cantidades de ADN de Ac
contenidas en los extremos del fragmento. Los resultados están
mostrados en el gel de la Figura 5. Como puede observarse, las 1,4
kb de la biblioteca hibridadan en las plantas estériles con el mismo
fragmento de 3,4 kb que cosegregaba con el fenotipo estéril
masculino y las plantas de grano con manchas de color púrpura
procedentes del heterozigoto fértil.
El segmento de 1,4 kb fue utilizado
posteriormente frente a una segunda biblioteca de ADNc de la panoja
y se obtuvo el ADNc de longitud completa, y se denominó MS45.
Se aisló tejido de las panojas, mazorcas y hojas
de plantas estériles y fértiles según se describió previamente, y se
llevó a cabo en los extractos un análisis de Transferencia Northern.
El análisis Northern es también una técnica comúnmente utilizada por
los expertos en el oficio y es similar al análisis Southern excepto
en que se aísla ARN y se coloca en un gel de agarosa. El ARN es
luego hibridado con una sonda marcada. Potter, E. y col.,
"Thyrotropin releasing hormone exerts rapid nuclear effects to
increase production of the primary prolactin mRNA transcript",
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78:6662-6666
(1981); Lechelt y col., supra. Se aisló el ARN total de 1)
hojas de plantas cultivadas aproximadamente 2 meses; 2) panojas en
la etapa de vacuolización media aproximadamente y 3) mazorcas
inmaduras de entre 4,5 - 5,0 cm de longitud. El tejido fue triturado
en nitrógeno líquido y posteriormente tratado de manera secuencial
con una extracción con detergente, una precipitación diferencial con
LiCl y una precipitación con etanol. El gel fue hibridado con el
ADNc MS45 aislado según se describió anteriormente. El ADNc
hibridaba solamente con el ADN procedente de panojas fértiles según
puede verse en la Fig. 6.
Para confirmar adicionalmente que el gen era
crítico para la fertilidad masculina, se identificaron las plantas
que habían revertido. Como no sería posible distinguir normalmente
las plantas fértiles de las plantas que habían revertido, se
seleccionaron las plantas que presentaban esterilidad pero
desprendían algo de polen. Éstas fueron cruzadas como plantas
masculinas con líneas no relacionadas y tuvieron como resultado
plantas que no eran estériles masculinas. El ADNc MS45 fue
recuperado y analizado para encontrar que el Ac había dejado
una "huella" cuando se transpuso fuera del gen de seis pares de
bases, manteniendo la secuencia en marco. Ver la Figura 7, que
muestra que se han añadido dos aminoácidos, pero que el marco no se
ha desplazado.
Se hicieron mapas de RFLP del fragmento IPCR en
una población F2 de B73 X Mo17. Mapeaba en el cromosoma 9L entre las
sondas y Burr 7.21 según está descrito en Maize Genetics
Cooperation Newsletter 67:165 (15 de Marzo de 1990) y está
representado en la Figura 8.
La secuenciación del clon MS45 se llevó a cabo
utilizando el método de la terminación de la cadena en didesoxi de
Sanger y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA
74:5463-5464 (1977).
Con referencia al ADN MS45, debe comprenderse que
lo que se indica es una secuencia de ADN según se describe más
adelante que produce la secuencia de aminoácidos también descrita
más adelante. Una persona con experiencia en la técnica apreciará
fácilmente que más de un codón de tres miembros puede codificar la
misma secuencia de aminoácidos.
Es evidente para una persona experta en la
técnica que el ADN descrito en la presente puede ser utilizado en
cualquiera de una amplia variedad de métodos para controlar la
fertilidad masculina en plantas. Lo siguiente se presenta a manera
de ilustración de varios de estos métodos y no tiene la intención de
limitar las utilizaciones posibles de las moléculas de ADN aquí
descritas, ni tampoco el ámbito de la invención.
Una vez que se tiene una molécula de ADN que es
crítica para la fertilidad masculina en plantas, es posible crear
una secuencia que esté en orientación inversa respecto a la
orientación normal 5' a 3' de esa secuencia de ADN. Cuando esta
molécula antisentido es suministrada a la planta, impide la
expresión normal de la secuencia fértil masculina. Se cree que el
ADN antisentido se transcribe para producir un ARN que es
complementario a, y capaz de hibridar con, el ARNm producido por el
gen de la fertilidad masculina e inhibir por tanto la traducción. La
proteína codificada por el ARNm no se produce y no puede desempeñar
su función en la fertilidad masculina. Con el gen de la fertilidad
masculina descrito en la presente, se suministra una construcción a
la planta que tiene en la misma ADN MS45, teniendo la construcción
un segmento promotor de la transcripción, un segmento de terminación
de la transcripción y un segmento de ADN que produce una secuencia
de ribonucleótidos complementaria a una secuencia de ribonucleótidos
del ADN MS45.
Esta utilización del antisentido para inhibir o
controlar la expresión de un gen es conocida por los expertos en la
técnica y está descrita con detalle en la Patente de EE.UU.
5.190.931 de Inouye, publicada el 2 de Marzo de 1993. En una
realización, los inventores de la misma describen el corte del ADN
con endonucleasas de restricción para tener como resultado un
plásmido religado que ha perdido un fragmento entre dos sitios de
restricción y en el cual puede insertarse otro fragmento de ADN. El
ADN normal es digerido, purificado, y se inserta un fragmento en
orientación opuesta. Inhibían así la expresión de lpp,
OmpA y OmpC en bacterias y controlaban el desarrollo
del colifago SP utilizando tales construcciones. Un ARN antisentido
complementario a la región líder 5' del ARN de OmpA, pero que
no incluía la secuencia de Shine-Dalgarno, era menos
eficaz que un transcrito que incluía el sitio de unión de ribosomas
y el codón de inicio. Una visión extensa de la regulación con
secuencias antisentido es proporcionada por Claude Helene y
Jean-Jacques Toulme en una revisión, "Specific
regulation of gene expression by antisense, sense and antigene
nucleic acids", Biochemica et Biophysica Acta (1990)
99-125.
Otro ejemplo de antisentido y su utilización en
la inhibición o en el control de un gen incluye construcciones
antisentido para genes que codifican la biosíntesis de flavonoides
en las anteras para proporcionar esterilidad masculina. Van der Meer
y col., "Antisense inhibition of flavonoid biosyntesis in petunia
anthers results in male sterility", The Plant Cell
4:253-262 (Marzo de 1992). Genes de la síntesis de
chalcona antisentido con secuencias homólogas a otros genes
expresados en las anteras y un promotor de CaMV355, tienen como
resultado un polen blanco estéril masculino. Como puede verse, la
utilización de secuencias antisentido para controlar la expresión
génica es bien conocida. Ver también, por ejemplo, Bourque, June E.
y Folk, William R., "Suppression of gene expression in plant cells
utilizing antisense sequences transcribed by RNA polimerase II",
Plant Molecular Biology 19:641-647 (1992);
Weintrab y col., Trends Gen. 1:22-25
(1985).
Otro método para controlar la expresión génica es
mediante la modificación de activadores transcripcionales. Durante
la expresión génica, el ADN de doble hebra es transcrito al ARN
mensajero de hebra sencilla correspondiente. La hebra sentido se
separa de su pareja antisentido y los enzimas ensamblan una molécula
de ARN que complementa a la secuencia sobre la hebra antisentido. El
ARNm migra hacia los ribosomas que leen la información codificada
para producir aminoácidos.
La transcripción de genes eucarióticos está
influenciada por varios elementos, incluyendo proteínas reguladoras
de la transcripción que se unen al ADN de una forma específica de la
secuencia. Estos activadores transcripcionales pueden ser
modificados para que se unan al ADN pero no puedan llevar a cabo su
función activadora normal. Los activadores transcripciones tienen
dos dominios, un dominio de unión y un dominio de activación.
Alterando la secuencia de aminoácidos de las proteínas activadoras
de la transcripción de un gen, proporcionando una secuencia de ADN
que codifica la misma, y suministrando ese ADN a la planta, puede
bloquearse la expresión del gen diana. Ver Goff, S.A. y col.,
"Transactivation of the Anthocyanin pathway structural genes with
wild-type and altered c1 proteins", Maize
Genetics Cooperation Newsletter 64:6 (1 de Marzo de 1990).
Una variación de este método es el aislamiento de
elementos supresores genéticos que codifican proteínas mutantes
negativas dominantes o ARN antisentido inhibidor mediante
fragmentación aleatoria del ADN y la identificación por selección
funcional por el fenotipo asociado con la supresión de la diana.
Esto es lo que Holzmayer y col., describieron en su artículo,
"Isolation of dominant negative mutants and inhibitory antisense
RNA sequences by expression selection of random DNA fragments",
Nucleic Acids Research, Vol. 20, Nº 4,
711-717 (3 de Diciembre de 1991). En ese trabajo
fragmentaron aleatoriamente ADN del bacteriófago lambda con el fin
de proteger células de E. coli de la lisis inducida por
lambda. Se aislaron múltiples elementos supresores genéticos que
codificaban proteínas o fragmentos de ARN antisentido.
Se ha observado también inhibición de la
expresión génica normal cuando se encontró que la expresión
adicional o sobreexpresión de un gen endógeno suprimía la expresión
génica. Esta "inhibición sentido", referida algunas veces como
"cosupresión", ha sido bien documentada. Ver, por ejemplo,
Brussian y col., "An Arabidopsis mutant with reduced level of cab
140 RNA is a result of cosuppression", The Plant Cell
5:667-677 (Junio de 1993); Van der Krol y col.,
"Flavonoid genes in Petunia: addition of a limited member of gene
capus may lead to suppression of gene expression", The Plant
Cell 2:291-299 (Abril de 1990).
Otro medio de regulación negativa control incluye
la represión de la transcripción génica. En un sistema, factores que
contienen dominios de unión a ADN pero que carecen de dominios de
activación funcionales, compiten con activadores para unirse a los
mismos sitios y bloquean la activación. Otros heterodimerizan con
activadores, reduciendo su afinidad por la unión a ADN o su
capacidad para activar la transcripción. Otros represores
interaccionan con factores activadores cuando se unen al ADN y
bloquean la función de transactivación. Un tipo más de reguladores
por disminución comprende proteínas inhibidoras que secuestran al
activador en un complejo que es incapaz de unirse al ADN. Ver
revisiones por Jackson, M.E., J. Cell Sci.
100:1-7 (1991); Jones, N., Curr. Biol.
1:224-226 (1991); Mitchell, P.J. y Tjian, R.,
Science 245:371-378 (1989).
La mutación directa del propio gen endógeno
cambiará también el gen de la fertilidad masculina en un gen de
esterilidad masculina. La irradiación causa la ruptura y la
reordenación de los cromosomas y la modificación de la composición
de genes individuales. La exposición a rayos x es un método de
mutación génica bien conocido desde hace tiempo. Ver, por ejemplo,
Stadler, L.J., "On the genetic nature of induced mutations in
plants", Reimpresión, Proceedings of the Sixth International
Congress of Genetics, Vol. 1, 274-294 (1932). Otras
técnicas incluyen la exposición a mutágenos químicos tales como
metanosulfonato de etilo y
N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina,
según fue realizado por Neuffer, M.G. y Coe Jr., E.H. en granos de
polen y está descrito en uno de sus primeros trabajos: "Paraffin
oil technique for treating mature corn pollen with chemical
mutagens", Maydica XXIII (1978) 21-28; también,
ver Thurling, N. y Depittayanan, "EMS induction of early flowering
mutants in spring Rape (Brassica napus)", Plant
Breeding, 108:177-184 (1992). Otros métodos
incluyen el tratamiento con azida de sodio (Rao, B., "A case of
genic male sterility induced by sodium azide in Pearl Millet",
Biol. Zentralbl. 104:579-521 (1985); Conger,
B.V. y Carabia, J.V., "Mutagenic effectiveness and efficiency of
sodium azide versus ethyl methanesulfonate in maize: induction of
somatic mutations at the yg_{2} locus by treatment of seeds
differing in metabolic state and cell population", Mutation
Research 46:285-296 (1977)) y la exposición a
radiación gamma (Filippetti, A. y DePace, C., "Improvement of seed
yield in Vicia falsa L. by using experimental mutagenesis II
comparisons of gamma-radiation and
ethyl-methanesulfonate (EMS) in production of
morphological mutants", Euphytica 35:49-59
(1986)).
Por tanto, es claramente evidente para una
persona con experiencia en la técnica, que un gen de la fertilidad
masculina, una vez identificado, puede ser utilizado en una variedad
de métodos para mediar la fertilidad masculina en las plantas. Todo
lo anterior ilustra unos cuantos de tales métodos que pueden ser
utilizados con un nuevo gen de la fertilidad masculina. Un nuevo
método más creado por los inventores de esta solicitud se describe a
continuación.
Esta invención difiere de los abordajes
convencionales de la esterilidad masculina en la mejora genética de
plantas y la producción de semillas, en que se utiliza un promotor
inducible para regular la expresión del gen que se sabe que es
crítico para la fertilidad masculina de la planta. La primera etapa
en la práctica de esta invención es por tanto la selección de un gen
del que dependa la fertilidad. Un tipo son las moléculas de ADN MS45
descritas supra.
El gen seleccionado es clonado, su promotor
nativo activado y el gen modificado es insertado en una secuencia de
expresión con un promotor inducible sensible a un control externo.
Preferiblemente, el promotor es uno que responda a la aplicación a
la planta de un agente químico no fitotóxico específico.
Utilizando transformación y sustitución génica,
el gen es inactivado en el genoma de la planta y sustituido por el
gen manipulado genéticamente incorporado a la secuencia de expresión
con el promotor inducible.
Esta invención es única en cuanto a que el
proceso tiene como resultado la utilización del promotor inducible
para inducir fertilidad, no esterilidad. En esta invención, las
secuencias promotoras del gen seleccionado son eliminadas, de tal
manera que el gen no se transcribe y la planta es estéril masculina.
Cuando se desea incrementar la planta estéril masculina, se restaura
la fertilidad masculina mediante la inducción de la expresión del
gen crítico. En la realización preferida esto se lleva a cabo
mediante el tratamiento de plantas estériles masculinas en
crecimiento con un agente químico específico no fitotóxico.
La inducción del promotor inducible por
tratamiento químico dependerá de varios factores asociados con el
propio tratamiento químico y de varias condiciones medioambientales
en el momento del tratamiento. Si el gen crítico estuviera
normalmente "activado", para ser inactivado mediante
tratamiento químico, un fallo del tratamiento tendría como resultado
la autopolinización y la producción y venta de semillas endógamas en
lugar de semillas híbridas. Las leyes sobre las semillas que
gobiernan la venta de semillas híbridas requieren un alto grado de
pureza de las semillas, de tal manera que los porcentajes de
semillas que no cumplan la especificación de híbridas deben ser
mantenidos muy bajos. Como una planta de maíz puede producir más de
seis millones de granos de polen, incluso un fallo limitado del
tratamiento podría tener como resultado un elevado porcentaje de
autopolinización. Por estas razones, la presente invención es
practicada de tal manera que el gen está normalmente
"inactivado" y no se expresa la característica correspondiente,
de manera que bajo condiciones normales no puede tener lugar la
autopolinización. Además, teniendo el gen crítico normalmente
"inactivado" el tratamiento químico no es necesario en la
producción a gran escala de semillas híbridas, de tal manera que se
minimiza la utilización de agentes químicos (y los gastos asociados)
y el riesgo de fracaso del tratamiento está presente solamente en la
producción a escala limitada, cuidadosamente controlada, de la
semilla parental, en la que se desea la autopolinización. Como el
fracaso del tratamiento en tal caso tiene como resultado la
subproducción de polen, y como normalmente el polen es
superproducido en un amplio margen, el proceso de esta invención
para la producción de semillas parentales tolerará una tasa de
fallos del tratamiento tan elevada como del 70% al 80% con efectos
mínimos sobre la producción de las semillas parentales.
En general, de acuerdo con la invención descrita
en la presente, la molécula de ADN aquí descrita es incorporada a la
planta junto con un promotor necesario que es inducible. La planta
será estéril, ya que la molécula de ADN no se expresa, y cuando el
promotor es inducido la planta será fértil. El gen nativo que
produce el producto de la molécula de ADN está en una planta
normalmente fértil y puede ser inactivado mediante una variedad de
métodos descritos más adelante, tales como el retrocruzamiento o la
recombinación homóloga.
En la práctica de esta invención la región
promotora es eliminada de un gen clonado responsable de la
fertilidad masculina y es sustituida por un promotor que responde
solamente a un estímulo externo específico. De este modo, el gen no
será transcrito excepto como respuesta al estímulo externo. Mientras
que el gen no se transcriba, su producto génico - que es necesario
para completar el desarrollo del polen - no se producirá. Esto
produce una ruptura en una o más de las rutas
bioquímicas/fisiológicas del desarrollo del polen, que tiene como
resultado la esterilidad masculina. La planta sólo se convertirá en
fértil bajo el estímulo específico que activa al promotor
seleccionado.
Un ejemplo de un sistema promotor sensible que
puede ser utilizado en la práctica de esta invención es el sistema
de la glutation-S-transferasa (GST)
en el maíz. Las GSTs son una familia de enzimas que pueden
destoxificar varios compuestos electrofílicos hidrofóbicos que son a
menudo utilizados como herbicidas preemergentes (Wiegand y col.,
"Messenger RNA Encoding a
Glutathione-S-Transferase
Responsible for Herbicide Tolerance in Maize is Induced in Response
to Safener Treatment", Plant Molecular Biology
7:235-243, 1986). Se ha descubierto que el
tratamiento de semillas de maíz con GSTs incrementa la tolerancia
del maíz a los herbicidas. Hay estudios que han demostrado que las
GSTs están implicadas directamente en la inducción de esta
tolerancia incrementada. Esta acción está mediada primariamente a
través de un producto específico de la transcripción de un ARNm de
1,1 kb. Brevemente, el maíz tiene un gen quiescente ya presente que
existe de manera natural, que puede responder a las GSTs y que puede
ser inducido con el fin de producir un producto génico. Este gen ya
ha sido identificado y clonado. De este modo, en una realización de
esta invención, se elimina el promotor del gen sensible a la GST y
se une al gen de la fertilidad masculina del que se había eliminado
previamente su promotor nativo. Este gen manipulado es la
combinación de un promotor que responde a un estímulo químico
externo y un gen responsable del desarrollo con éxito de polen
fértil.
Se conocen en la técnica varios métodos para
transferir ADN clonado al maíz. Éstos incluyen la captación de ADN
por los protoplastos del maíz facilitada por electroporación (Rhodes
y col., "Genetically Transformed Maize Plants from
Protoplasts", Science, Vol. 240 (8 de Abril de 1988)); el
tratamiento de los protoplastos del maíz con polietilén glicol
(Lyznik y col., "Stable Co-Transformation of Maize
Protoplasts with Gus A and Neo Genes", Plant Molecular
Biology 13:151-161, 1989); y el bombardeo de
células del maíz con microproyectiles cargados de ADN (Klein y col.,
"Genetic Transformation of Maize Cells by Particle
Bombardment", Plant Physiol. (1989)
91:440-444) y Klein y col., "Factors Influencing
Gene Delivery into Zea Mays Cells by High-Velocity
Microprojectiles", Bio/Technology Vol. 6, Mayo de
1988).
Cada una de estas técnicas tiene ventajas y
desventajas. En cada una de las técnicas, ADN de un plásmido es
manipulado genéticamente para que contenga no sólo el gen de interés
sino también genes marcadores seleccionables y susceptibles de ser
sometidos a cribado. Se utiliza un gen marcador seleccionable con el
fin de seleccionar solamente aquellas células que tengan copias del
plásmido integradas (la construcción es tal que el gen de interés y
los genes seleccionables y susceptibles de ser sometidos a cribado
son transferidos como una unidad). El gen susceptible de ser
sometido a cribado proporciona otra comprobación del cultivo con
éxito de únicamente aquellas células portadoras de los genes de
interés. Un gen marcador seleccionable comúnmente utilizado es el de
la fosfotransferasa de neomicina II (NPTII). Este gen transmite
resistencia a kanamicina, un compuesto que puede ser añadido
directamente al medio de crecimiento en el que crecen las células.
Las células vegetales son normalmente susceptibles a kanamicina y,
como resultado, mueren. La presencia del gen NPTII vence los efectos
de la kanamicina y cada célula con este gen permanece viable. Otro
gen marcador seleccionable que puede ser empleado en la práctica de
esta invención es el gen que confiere resistencia al herbicida
glufosinato (Basta). Un gen susceptible de ser sometido a cribado
utilizado comúnmente es el gen de la b-glucuronidasa
(GUS). La presencia de este gen es caracterizada mediante la
utilización de una reacción histoquímica en la que una muestra de
células supuestamente transformadas es tratada con una solución de
ensayo de GUS. Después de una incubación apropiada, las células que
contienen el gen GUS se convierten en azules. Otro gen susceptible
de ser sometido a cribado es un activador transcripcional para la
biosíntesis de antocianinas, según está descrito en Bowen y col.,
"R Genes as visual markers for corn transformation", Edición
del Resumen Gallagher, Academic Press (Octubre de 1989); Ludwig y
col., "A regulatory gene as a novel visible marker for maize
transformation" Science 247:449-450 (26 de
Enero de 1990). Este gen produce la síntesis del pigmento
antocianina. Las células transformadas con un plásmido que contenga
este gen se vuelven rojas. Preferiblemente, el plásmido contendrá
genes marcadores seleccionables y genes marcadores susceptibles de
ser sometidos a cribado.
El plásmido que contiene uno o más de estos genes
es introducido en los protoplastos del maíz o en células del callo
mediante cualquiera de las técnicas previamente mencionadas. Si el
gen marcador es un gen seleccionable, solamente aquellas células que
hayan incorporado el paquete de ADN sobrevivirán después de la
selección con el agente fitotóxico apropiado. Una vez que las
células apropiadas son identificadas y propagadas, se regeneran las
plantas. La progenie de las plantas transformadas debe ser analizada
para asegurarse de que el paquete de ADN se ha integrado con éxito
en el genoma de la planta.
Será fácilmente apreciado por los expertos en la
técnica que se conoce una amplia variedad de métodos para inactivar
el gen nativo. La recombinación homóloga es uno de los métodos
conocidos por los expertos en la técnica para convertir un gen
nativo en inoperante. Por tanto, cuando el gen manipulado es
recombinado homólogamente en la planta, el gen nativo se convertirá
en inoperante. Un buen compendio de este proceso general está
proporcionada por Yoder, J.I. y Kmic, Eric, en "Progress Towards
Gene Targeting in Plants", Genetic Engineering, Vol. 13
(Plenum Press, New York, 1991). En la página 265 de esta referencia,
los autores indican que "puede utilizarse la vectorización de
genes para silenciar o sustituir el gen endógeno por un alelo
manipulado; de este modo el fenotipo del gen alterado, o sus
secuencias reguladoras, puede ser evaluado in planta". Se
señala que tiene lugar recombinación genética mediante la ruptura y
la nueva unión del ADN y que el mecanismo de reunificación aparea
las secuencias de ADN complementarias. (Ver, por ejemplo, 271,
supra).
Una discusión adicional de la recombinación
homóloga intracromosómica en las plantas se discute en Peterhans,
A., Schlupmann, H., Basse, C. y Paszkowski, J., "Intrachromosomal
Recombination in Plants", The EMBO Journal, Vol. 9, Nº 11,
pp. 3437-3445, 1990.
Una variedad de diferentes medios, además de
estos ejemplos específicos, estaría disponible para una persona con
experiencia en la técnica. Un ejemplo adicional más incluye el
retrocruzamiento, utilizando técnicas de mejora genética de plantas
generalmente aceptadas, para "eliminar" efectivamente el gen
nativo. El retrocruzamiento se utiliza a menudo en la mejora
genética de plantas para transferir una característica específica
deseable desde una planta endógama o fuente a una planta endógama
que carezca de esa característica. Esto puede ser realizado, por
ejemplo, cruzando primeramente una planta endógama superior (A)
(parental recurrente) con una planta endógama donante (parental no
recurrente), que lleve el(los) gen(es)
apropiado(s) para la característica en cuestión. La progenie
de este cruce es vuelta a cruzar posteriormente con el parental
recurrente superior (A), seguido por un proceso de selección en la
progenie resultante por la característica deseada que iba a ser
transferida desde el parental no recurrente. Después de cinco o más
generaciones de retrocruzamiento con un proceso de selección por la
característica deseada, la progenie será heterozigota para los loci
que controlan la característica que está siendo transferida, pero
será similar al parental superior para la mayoría o para casi todos
los demás genes. La última generación de retrocruzamiento será
autofecundada para dar una progenie genéticamente pura para
el(los) gen(es) que está(n) siendo
transferido(s). Un resultado de cualquier método de
retrocruzamiento es que el gen "nativo" es sustituido por el
gen deseado.
Se discute un único método en la revista
Science de 1991, que informa sobre un trabajo anterior
relacionado con la utilización de "tijeras transgénicas". Este
artículo describe un método en el que los científicos pueden
eliminar un gen marcador que está unido a un gen que tiene una
característica deseada en una planta. La "tijera", de acuerdo
con este método, es un enzima obtenido de un virus bacteriano
conocido como "Cre" para el control de la recombinación.
Science, p. 1457, 6 de Diciembre de 1991. El enzima es capaz
de eliminar mediante corte cualquier ADN situado entre un par de
secuencias de 34 pares de bases, denominadas lox, por locus
de sobrecruzamiento. Esto está descrito con mayor detalle en la
solicitud de patente registrada por Du Pont, y publicada como WO
91/09957.
Una vez que el gen ha sido introducido en una
planta, se seleccionan los tipos de planta apropiados, esto es las
plantas que son estériles masculinas. Estas plantas son estériles
masculinas porque el gen de la fertilidad masculina aislado y
clonado no tiene su promotor nativo y, por tanto, no está
produciendo su producto génico que es crucial para el desarrollo con
éxito del polen. Por tanto, el gen manipulado actúa como un alelo
mutante recesivo de ese gen. En la biotecnología de plantas
normales, una vez que se ha identificado el genotipo deseado después
de la transformación y la regeneración, las plantas son
autofecundadas para recuperar ese genotipo. Sin embargo, en la
práctica de esta invención, el genotipo deseado no puede ser
autofecundado en la primera generación porque es estéril masculino.
Para obtener la progenie debe inducirse la fertilidad mediante la
pulverización de las plantas con un compuesto que induzca la
transcripción del gen por activación del promotor alterado. En el
caso de los promotores de la GST, el compuesto es preferiblemente un
compuesto inductor de GST tal como
N,N-dialil-2-2-dicloroacetanida.
El promotor unido al gen de la fertilidad masculina responde a este
agente químico y hace que comience la transcripción del gen. Una vez
que esto ocurre, se produce el producto génico normal a partir del
gen y se induce cierto nivel de fertilidad masculina. El polen de
esta planta es utilizado posteriormente para llevar a cabo la
polinización del genotipo seleccionado original.
Una vez que se ha completado el aislamiento
inicial y la propagación del genotipo deseado, el procedimiento es
más directo. Solamente las plantas endógamas que son utilizadas como
parentales hembra en los cruces de híbridos son transformadas en
variantes estériles masculinas. Una vez que se han transformado,
debe incrementarse la cantidad de semilla estéril masculina/fértil
femenina. Esto se consigue plantando en un área aislada (lejos de
otro polen de maíz) y pulverizando con un agente químico al que
responda el promotor. La pulverización induce al promotor a iniciar
la transcripción del gen unido a él. Esto producirá cierto grado de
fertilidad. Una ventaja particular de este sistema, en comparación
con los sistemas tales como el descrito en la publicación PCT WO
89/10396 de Mariani y col. (basada en la Solicitud Internacional Nº
PCT/EP89/00495), en el que se induce esterilidad, es que el
tratamiento no tiene que ser un 100% eficaz, ya que normalmente se
produce mucho más polen por una planta de maíz que el que es
realmente necesario para la fertilización de todas las sedas
disponibles. Por tanto, incluso una baja restauración de la
fertilidad será eficaz para obtener niveles aceptables de incremento
de semillas. Al mismo tiempo, no tiene lugar autopolinización en la
producción de semillas híbridas, ya que las plantas de esta
invención son normalmente estériles masculinas y deben ser tratadas
para convertirlas en fértiles. En los sistemas en los que se induce
esterilidad, la inducción de esterilidad debe ser un 100% eficaz
para evitar la autopolinización cuando se produce una semilla
híbrida.
Todas las semillas recogidas continúan siendo
homozigotas y estériles, ya que la fertilidad es restaurada
únicamente en una sola generación parental mediante el tratamiento
con el agente químico inductor de fertilidad. Esta semilla es luego
utilizada en un campo de producción de híbridos, donde se utiliza
como parental femenino. Como las plantas son estériles masculinas,
no tienen que ser despanojadas. Todas las plantas híbridas
producidas a partir de tales semillas son fértiles masculinas, ya
que la progenie resultante hereda un gen modificado del parental
femenino y un gen normal del parental masculino. Tiene lugar la
producción de polen normal.
Aunque todo lo anterior ilustra la realización
preferida de la invención, se apreciará que pueden realizarse varios
cambios sin alejarse del espíritu y del ámbito de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencia de Nucleótidos que Media la Fertilidad Masculina y un Método de Utilización de la Misma
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 700 Capital Square, 400 Locust Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Des Moines
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 50309
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, 1,44 Mb de capacidad
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Microsoft Windows Notepad
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/537.183
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 12 de Junio de 1990
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sweeney, Patricia A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.733
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 125R2-PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (515) 248-4897
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (515) 248-4844
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1419 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: Clon de ADNc MS45 de Zea mays
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Zea mays
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 473 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Zea mays
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (37)
1. Una secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.
2. Una molécula de ARN de acuerdo con la
reivindicación 1.
3. Una molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, que media la fertilidad en plantas.
4. Una molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 3, ligada a un promotor inducible sensible a un
control externo.
5. Una molécula de ADN que media la fertilidad en
plantas, que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 1.
6. Un vector plasmídico que contiene la secuencia
de nucleótidos de la reivindicación 1.
7. Una planta o una célula vegetal transformada
por la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 4 ó 5.
8. Una planta de la reivindicación 7 que es una
planta de maíz.
9. Una célula vegetal de la reivindicación 7 que
es una célula vegetal de maíz.
10. Un método para mediar la fertilidad de una
planta, que comprende la mediación en la planta de una secuencia de
nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº
2.
11. El método de la reivindicación 10, en el que
la secuencia de nucleótidos mediada es una molécula de ARN.
12. El método de la reivindicación 10, en el que
la secuencia de nucleótidos mediada es una molécula de ADN.
13. Un método para mediar la fertilidad de una
planta, que comprende la mediación de una molécula de ADN con la
secuencia de la SEC ID Nº 1 en la planta.
14. Un método para mediar la fertilidad masculina
en una planta, que comprende la producción de represión de la
expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.
15. Un método para mediar la fertilidad masculina
en una planta, que comprende la producción de represión de la
expresión de la molécula de ADN con la secuencia de la SEC ID Nº
1.
16. El método de la reivindicación 14, en el que
la expresión de la secuencia de nucleótidos es reprimida por
mutación de la secuencia de nucleótidos.
17. El método de la reivindicación 14, que
comprende además el suministro a la planta de una segunda secuencia
de nucleótidos que reprime la expresión de la secuencia de
nucleótidos.
18. El método de la reivindicación 15, en el que
la expresión de la molécula de ADN es reprimida por mutación de la
molécula de ADN.
19. El método de la reivindicación 15, que
comprende además el suministro a la planta de una segunda secuencia
de nucleótidos orientada en dirección antisentido con relación a la
molécula de ADN, reprimiendo de este modo la expresión de la
molécula de ADN.
20. El método de la reivindicación 15, que
comprende además el suministro a la planta de una segunda molécula
de ADN que reprime la expresión de la molécula de ADN.
21. Una planta con fertilidad masculina mediada
obtenible mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones
10 a 20.
22. Un método para proporcionar a una planta
esterilidad masculina heredable, controlable externamente, que
comprende:
- la unión de la molécula de ADN de la reivindicación 3 a una secuencia de expresión con un promotor inducible sensible a un control externo;
- el suministro de la secuencia de expresión al genoma de la planta y
- la inactivación de la molécula de ADN que codifica el producto de la molécula de ADN de la reivindicación 3 procedente del genoma nativo de la planta.
23. El método de la reivindicación 22, en el que
la secuencia de aminoácidos de la secuencia de ADN está codificada
por la molécula de ADN de la reivindicación 5.
24. Un método para reproducir una planta que
tiene esterilidad masculina heredable, controlable externamente,
resultante de la sustitución de una primera molécula de ADN nativa
de la planta que codifica el producto de la molécula de ADN de la
reivindicación 3, por una segunda molécula de ADN de la
reivindicación 3 que está ligada en una secuencia de expresión con
un promotor inducible, que comprende:
- la plantación de las semillas de la planta para proporcionar plantas estériles masculinas en crecimiento;
- la inducción de la conversión de las plantas en crecimiento en una forma fértil masculina bajo condiciones que inducen al promotor para que exprese la segunda molécula de ADN y
- la polinización abierta de las plantas en crecimiento en aislamiento para producir semillas y
la recogida de las semillas.
25. El método de la reivindicación 24, en el que
la secuencia de aminoácidos de la molécula de ADN está codificada
por la molécula de ADN de la reivindicación 5.
26. Una planta estéril masculina transformada de
manera controlable con una secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la reivindicación 1, unida a un promotor inducible sensible a un
control externo; y en la que la molécula de ADN que codifica el
producto de la molécula de ADN de la reivindicación 3 en el genoma
nativo de la planta está inactivada, o la expresión de la molécula
de ADN que codifica el producto de la molécula de ADN de la
reivindicación 3 está reprimida.
27. Un casete de expresión que contiene la
secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 unida operativamente
a secuencias reguladoras vegetales que producen la expresión de la
secuencia de nucleótidos en células vegetales.
28. Una planta con fertilidad masculina mediada,
en la que una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº 2 está inactivada, o en la que la
expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 está reprimida.
29. Una planta de acuerdo con la reivindicación
28, en la que la expresión de dicha secuencia de nucleótidos está
reprimida por la expresión de una molécula de ADN que reprime la
expresión de la secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos
de la SEC ID Nº 2.
30. Una planta de acuerdo con la reivindicación
29, en la que la expresión de dicha secuencia está reprimida por la
expresión de una secuencia antisentido.
31. Una planta de acuerdo con la reivindicación
30, en la que dicha secuencia de nucleótidos es inactivada por
mutación.
32. Una planta de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 26 ó 28 a 31, que es una planta de maíz.
33. Una semilla híbrida obtenible mediante:
- la polinización cruzada como parental hembra de una planta que tiene esterilidad masculina resultante de la inactivación o la represión de la expresión de la secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en el genoma nativo de la planta, y que comprende una molécula de ADN adicional de la reivindicación 3 unida en una secuencia de expresión a un promotor inducible sensible a un control externo; con, como parental masculino, una planta fértil masculina;
semilla que contiene en su genoma dicha molécula
de ADN de la reivindicación 3 unida a dicho promotor inducible.
34. La semilla de la reivindicación 33 en la que,
en dicha planta parental femenina dicha represión es a través de una
mutación de dicha secuencia de ADN que codifica dicha secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº 2.
35. La semilla de la reivindicación 33 en la que,
en dicha planta parental femenina, dicha represión es a través de la
introducción de una segunda secuencia de nucleótidos que reprime la
expresión de dicha secuencia de ADN que codifica dicha secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº 2.
36. La semilla de la reivindicación 33 en la que,
en dicha planta parental femenina, dicha represión es a través de la
introducción de una segunda secuencia de nucleótidos orientada en
dirección antisentido con relación a dicha secuencia de ADN que
codifica dicha secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.
37. Una semilla de cualquiera de las
reivindicaciones 33 a 36 que es una semilla de maíz.
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