ES2244680T3 - Procedimiento para detectar analitos en muestras por medio de analisis. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la detección mejorada de analitos basada en una reacción de afinidad, analitos tales como antígenos, anticuerpos, ligandos de receptores, receptores, ADN y ARN y otras moléculas bioafines en muestras biológicas analíticas por medio de elementos de análisis, especialmente como tiras de prueba, caracterizado porque, adicionalmente a los recubrimientos y configuraciones habituales con moléculas de afinidad complementarias en la zona de detección, el elemento de análisis presenta entre la zona de aplicación de la muestra y la zona de detección al menos un elemento de captura de afinidad umbral (SAF) que consta de al menos un anticuerpo de captura (AcC umbral) frente a al menos un analito dirigido para una reacción de afinidad analito-anticuerpo anterior, en una concentración que elimina el valor normal del analito que va a determinarse de una persona sana, de una muestra medioambiental u otro valor fijado, de modo que los anticuerpos de captura están dispuestos espacialmenteen el elemento de análisis de manera que esta reacción de la reacción de detección transcurre como umbral precedente y, por tanto, sólo serán visibles en la reacción de detección los valores que se encuentren por encima del valor umbral.

Description

Procedimiento para detectar analitos en muestras por medio de elementos de análisis.

La invención se refiere a un procedimiento para detectar numerosos analitos, como por ejemplo de antígenos, anticuerpos, ligandos de receptores, receptores, ADN y ARN en muestras biológicas u otras muestras líquidas, por medio de elementos de análisis, especialmente como tiras de prueba, de modo que el procedimiento se basa en reacciones de afinidad.

Preferiblemente se refiere a la detección de antígenos. En este caso se trata, en el sentido de la invención, por ejemplo, de antígenos de alto peso molecular, como por ejemplo proteínas, o haptenos de bajo peso molecular, como por ejemplo pesticidas, otras sustancias nocivas u hormonas.

Además, la invención se refiere a correspondientes elementos de análisis en sí. Los resultados pueden determinarse directamente a partir del ensayo. Los campos de aplicación de la invención son sobre todo el diagnóstico médico, la industria farmacéutica y la protección medioambiental.

Se conocen en sí los elementos de análisis, como por ejemplo tiras de prueba (tiras inmunorreactivas laterales), para la detección de numerosos analitos en líquidos biológicos o para la detección de sustancias nocivas en muestras ambientales. Se determinan en principio según el principio de sándwich, o bien según el principio de competencia.

El uso de ensayos de afinidad, por ejemplo, inmunoensayos, ensayos de receptor y de ADN, tiene cada vez mayor importancia para aplicaciones clínicas y otras numerosas aplicaciones como en la protección del medioambiente.

La prueba inmunitaria de flujo lateral ("Immuno-Lateral-Flow-Test") es muy común. El ensayo utilizado en esta investigación se compone de cuatro partes sobre una tira de prueba: un campo de aplicación de la muestra, un campo de conjugado, un campo de análisis (normalmente una membrana de nitrocelulosa) y un campo de absorción. El líquido de muestra fluye por el campo de muestra por medio de fuerzas capilares al campo de conjugado. En y sobre el campo de conjugado están almacenados anticuerpos marcados (por ejemplo, marcados con oro coloidal, lo que da como resultado una coloración rojiza, o con enzimas). El líquido de muestra fluye por este campo de conjugado y disuelve así los anticuerpos marcados. Entonces, la disolución de muestra, que conduce conjuntamente los anticuerpos marcados y los analitos, fluye desde el campo de conjugado al campo de análisis, sobre el que están adsorbidos anticuerpos de captura. Finalmente, fluye por la membrana del campo de análisis al campo de absorción. Juntos forman las tiras de prueba.

Frecuentemente, en un ensayo para antígenos de alto peso molecular están fijadas dos líneas inmunorreactivas sobre el campo de análisis: una para la fijación de los analitos de interés (por ejemplo, anticuerpos frente a un marcador de infarto cardíaco como FABP) y una línea situada detrás como control positivo para la prueba (por ejemplo, anticuerpos anti-ratón). La tira de prueba puede encontrarse en un soporte de plástico adicional o sumergirse directamente en el líquido. En una tira de prueba para más de un parámetro, este intervalo de unión doble se amplía en el número de analitos que se miden de más, por ejemplo, para 3 analitos hay tres intervalos de unión que son específicos para los analitos, y uno para el control de que los anticuerpos utilizados están intactos. Si la prueba no contiene ningún analito, los anticuerpos marcados fluyen libres hacia el campo de absorción y sólo se unen al anticuerpo de control. Por medio del color rojo del marcador de oro coloidal muestran que en principio el ensayo funciona. Si por el contrario hay analito (por ejemplo, FABP) en la muestra, se une en primer lugar en el campo de conjugado a los anticuerpos marcados con oro y fluye con ellos al campo de análisis. Allí, el complejo de analito (FABP) y anticuerpos marcados se une a los anticuerpos de captura fijados frente a los analitos (FABP). El resto de los anticuerpos marcados (sin analito) que no se ha unido se une a los anticuerpos de control situados detrás. Así, las dos líneas rojas muestran la señal del analito y la señal de control.

También son posibles ensayos similares para receptores y ADN, aunque todavía no están tan ampliamente puestos en práctica como el inmunoensayo.

En la actualidad está disponible una pluralidad de pruebas inmunológicas (perspectiva general de P.Tijssen: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Amsterdam 1985, páginas 9-20; D.S. Hage, Immunoassays. Analytical Chemistry 71 (12) 1999, páginas 294R-304R). Todas utilizan para el análisis las características únicas de los anticuerpos, el reconocimiento y la unión específica de moléculas. Lo mismo es válido para otros ensayos de afinidad como los ensayos de ADN. Aquí se reconocen en la mayoría de los casos fragmentos de ADN fijados a una superficie mediante sondas de oligonucleótidos, que se unen y están marcados.

Un ejemplo concreto debe explicar el estado de la técnica: un campo de aplicación importante para estos ensayos es el diagnóstico de infartos cardiacos. Mientras que el ECG clásico sólo en aproximadamente el 40-50% de los casos a la llegada al hospital encuentra un diagnóstico claro, un marcador bioquímico "prematuro" de infarto cardiaco como la proteína que liga ácidos grasos (FABP) puede mejorar considerablemente el diagnóstico prematuro (Renneberg, R., Cheng, S., Kaptein, W.A., McNeil, C.J., Rishpon, J., Gründig, B., Sanderson, J., Chu, A., Glatz, J.F.C. Novel immunosensors for rapid diagnosis of acute myocardial infarction: A case report, Advances in Biosensors ed. A. P.F. Turner, R. Renneberg, Biosensors: a Chinese perspective, volumen 4 (1999)).

Sin embargo, las pruebas disponibles hasta la fecha para marcadores "tardíos" de infarto cardiaco son o bien pruebas de laboratorio que, por tanto, requieren personal bien formado, aparatos caros y un tiempo de permanencia largo, o bien son pruebas rápidas. Éstas miden distintas moléculas marcadoras con un dispositivo lector calibrado, cuantitativamente (por ejemplo, el marcador "tardío" troponina T - documento EP 00394819 A2), o cualitativamente (por ejemplo, Jackowski, George / documento US-A 5.604.105).

Las pruebas de sándwich, evaluadas hasta el momento de forma visual, para el Ag de alto peso molecular funcionan como sigue: cuando el analito (aquí un Ag) en líquido de muestra correspondiente (por ejemplo, plasma) se aplica en el hasta entonces campo de aplicación seco, se une a anticuerpos detectores aplicados disueltos (AcD) que, por su parte, tienen unidos una sustancia marcadora (M). El complejo antígeno-anticuerpo-marcador (Ag-AcD-M) se mueve con el líquido de soporte mediante fuerzas capilares en la dirección del campo de detección y el Ag-AcD-M se une a los anticuerpos de captura allí fijados (AcC) por medio del Ag. Se forma un complejo de sándwich que es visible la mayoría de las veces como línea coloreada y muestra que el analito estaba contenido en la muestra.

En este sentido, la línea coloreada es proporcional a la concentración de analito. Una concentración de analito de una persona sana que contiene cantidades normales de marcadores cardiacos, por ejemplo, 10 ng de FABP por mL, también produce, por ejemplo, una coloración que es, por ejemplo, aproximadamente 20 veces menos intensa que la coloración que se genera por la muestra de un paciente con infarto cardiaco con 200 ng/mL. Pero la persona que realiza la prueba puede interpretar la débil línea coloreada apenas visible, en el caso de personas sanas, de manera absolutamente subjetiva como una muestra positiva o no queda seguro.

Por tanto, los 10 ng de FABP/mL en sangre son un valor normal. En el caso de angina de pecho, el valor asciende hasta aproximadamente 50 ng/mL, por el contrario, en el caso de infarto cardiaco aumenta muy por encima. Debido a que el desarrollo de color de las pruebas aumenta de manera lineal con la cantidad de analito, una prueba para FABP indica, incluso ya con valores normales como 10 ng/mL, una línea muy débil, pero visible. Esto puede realmente malinterpretarse, especialmente cuando se trata de vida o muerte, como señal positiva. Esto conduce a inseguridad de la persona que realiza la prueba. Ésta supone que esta débil línea significa una señal positiva (como, por ejemplo, la existencia de un infarto cardiaco). También el entrenamiento muscular intenso puede aumentar adicionalmente el valor del marcador cardiaco en el plasma, también si es insignificante. Mediante esto, la prueba da un valor positivo falso.

Por tanto, sería deseable indicar los analitos sólo después de alcanzar el valor umbral, de modo que la prueba no muestre ninguna coloración para personas sanas, es decir, hasta 10 ng de FABP/mL. Hasta la fecha, esto sólo podía alcanzarse porque se configuraba la prueba total de manera menos perceptible.

Por el contrario, las pruebas conocidas según el principio de competencia funcionan de otra manera: debido al pequeño tamaño del Ag (la mayoría de las veces inferior a un peso molecular de 1.000, también denominado hapteno), sólo puede unirse a un Ac, por tanto, no puede construirse un sándwich. Por tanto, no hay ningún Ac detector marcado. En este caso, se marca una cantidad definida de Ag con marcadores (Ag-M) y se mueve simultáneamente con el Ag que va a detectarse y el líquido de prueba, de manera capilar, hacia los Ac de captura en el campo de detección. Allí, compiten una cantidad definida de Ag marcados y no marcados (que van a detectarse) por la unión a los AcC unidos allí fijamente. Si no había ningún Ag en la muestra, los AcC solamente se unen a Ag marcados (coloreados) y muestran una línea coloreada, si por el contrario había una gran cantidad de Ag en la muestra, se unen casi exclusivamente los Ag (no coloreados) de la muestra, no apareciendo ninguna línea de color. Esta marcha en sentido contrario (cuanta más señal, menos analito en la muestra) conduce frecuentemente a malentendidos de la persona que realiza la prueba, sobre todo en el caso de legos. Se desea que la existencia de un analito en la muestra no sólo conduzca a una señal de color proporcional, sino a que tampoco se muestren valores normales de antígeno.

A partir del documento EP 0 833 159 A2 (documento US-A 5.798.273) se conocen tiras de prueba (ensayos de flujo lateral) para la detección de antígenos pequeños (por ejemplo, de PCB (biología celular farmacéutica)) según el principio de competencia, que constan de tres zonas: 1. una zona de aplicación para aplicar la muestra, marcada con anticuerpos anti-analito con partículas coloreantes y trazadores independientes, 2. una zona de captura (zona 2) con analito y análogos de analito que están inmovilizados en partículas, y 3. una zona de lectura ("red-out") con una y varias líneas de anticuerpos anti-analito. Por tanto, cada zona tiene diferentes recubrimientos. Cuando una muestra no contiene ningún analito, los anticuerpos marcados de la zona de aplicación se unen en la zona 2, por el contrario, cuando hay analito presente, se une rápidamente a los anticuerpos y ya no se une en la zona 3 y se hace visible en la zona 3. Así, con un aumento de la concentración de analitos también puede alcanzarse un aumento de la señal.

La invención se basó en el objetivo de desarrollar un ensayo rápido y fiable para analizar preferiblemente materiales biológicos, que sea fácil de manejar y que evite falsos resultados positivos que pudieran aparecer ya que en la muestra ya está presente analito en una pequeña cantidad, también en el caso de un valor normal, y se muestra como una señal débil. Deben facilitarse procedimientos y elementos de análisis que posibiliten una reacción de detección de analitos no falseada, de modo que sólo deben mostrarse valores que se encuentren por encima de un valor normal existente u otro valor fijado.

También los siguientes documentos pertenecen al estado le la técnica:

el documento US 5 962 339 describe un procedimiento inmunoquímico para la detección de antígenos y anticuerpos. En este sentido, se utiliza una región umbral que consta de un segundo agente de unión, que retiene una parte determinada del primer agente sin formar complejo (extracto de la reivindicación 1, columna 6, línea 34). Para detectar anticuerpos como analitos, se colocan en la zona de muestra antígenos marcados con colorante (primer agente de unión) frente a los anticuerpos. Cuando los anticuerpos que van a detectarse están presentes en la muestra en una concentración pequeña, no todos los antígenos marcados con colorante se unen a los anticuerpos. El exceso se une a los anti-anticuerpos (segundo agente de unión) del umbral y no aparece ninguna señal en la zona de detección. Si la concentración de anticuerpos supera un valor determinado, los anticuerpos-analitos bloquean todos los antígenos marcados con colorante en la zona de muestra. Mediante esto, en el umbral no se une ningún antígeno marcado ya que el segundo agente de unión está dirigido contra el primer agente de unión (antígeno). Pero para esto los anticuerpos-antígenos formados (marcados con colorante) se unen en la zona de detección y proporcionan allí una señal coloreada. Por tanto, se indica cuando se supera una concentración de analito.

En el documento EP 0 696 735 se explica una prueba inmunocromatográfica con sensibilidad controlada que se limita a la detección de analito de alto peso molecular (por ejemplo, la hemoglobina) y al principio de sándwich. En este sentido, mediante secado se depositan sueltos anticuerpos no marcados frente a los analitos que ya están en la zona de aplicación de la muestra. Si la concentración de analito (antígeno) supera un valor determinado, entonces los antígenos no unidos se mueven por la zona de conjugado, donde forman complejos con un anticuerpo marcado, hacia la zona de detección y generan allí una señal coloreada.

El documento US 5 786 220 describe una prueba inmunocromatográfica que muestra valores de progesterona y hCG (gonadotropina coriónica humana) como tiras coloreadas por debajo o por encima de un valor normal fijado (valor umbral). En este sentido, los analitos, o sus derivados, se marcan con color sobre las tiras y compiten por los sitios de unión con los analitos no marcados a detectar de la muestra según el principio de competencia o de desplazamiento. Sólo cuando la concentración de analitos en la muestra supera un valor umbral las moléculas de analito marcadas con color se unen en la zona de detección.

El documento EP 0 427 534 describe una tira de prueba (por ejemplo, una prueba de colesterol enzimática), que preferiblemente muestra señales generadas por enzimas, cuya distancia del sitio de aplicación de la muestra es proporcional a la cantidad de analito. En este sentido no se utiliza ningún captador de afinidad umbral.

El documento US 6 329 145 describe la determinación de sustancias que se unen a moléculas de ácidos nucleicos. Mediante la unión se desplaza un ácido nucleico marcado con colorante y a continuación se detecta. No es nuevo que los aptámeros pueden utilizarse como sustancias para uniones de este tipo, sino que pertenece al estado de la técnica.

La revisión del documento Methods 22 (2000): 92 - 106 describe como pueden sintetizarse polímeros impresos y utilizarse para el análisis. En este sentido, se nombran los polímeros impresos como posibles sustancias para la detección.

El documento DE 199 40 394 describe fluoróforos que pueden utilizarse como elementos de marcado para la detección de diferentes sustancias.

El documento US 6 197 881 se ocupa de copolímeros electroquímicamente activos y su producción. En este caso, los copolímeros se unen por medio de estreptavidina-biotina a las superficies.

La invención se realiza según las reivindicaciones. El procedimiento según la invención puede utilizarse universalmente y transcurre basándose en reacciones de afinidad en muestras analíticas biológicas u otras muestras líquidas, como, por ejemplo, muestras de sangre y suero o muestras medioambientales, por medio de elementos de análisis, especialmente como tiras de prueba. Para la detección son adecuados múltiples analitos, como por ejemplo de antígenos, anticuerpos, ligandos de receptores, receptores, ADN y ARN. Preferiblemente se refiere a la detección de antígenos. En este caso se trata, en el sentido de la invención, por ejemplo, de antígenos de alto peso molecular, como, por ejemplo, proteínas, o haptenos de bajo peso molecular, como, por ejemplo, pesticidas, sustancias nocivas u hormonas.

A continuación se explica la idea de la invención con el ejemplo del inmunoensayo. En lugar de antígenos y anticuerpos también pueden utilizarse ligandos y receptores, lectina, proteína A y G, distintas formas de ADN y ARN.

El procedimiento se caracteriza porque, adicionalmente a los recubrimientos y configuraciones habituales con moléculas de afinidad complementarias en la zona de detección, el elemento de análisis presenta entre la zona de aplicación de la muestra y la zona de detección al menos una sustancia captadora como elemento de captura de afinidad umbral (SAF, en inglés, treshold affinity catcher) visible u oculto, para una reacción de afinidad anterior, en una concentración que elimina el valor normal de los analitos que van a determinarse de una persona sana, de una muestra medioambiental u otro valor fijado, de modo que las sustancias captadoras están dispuestas espacialmente en el elemento de análisis de tal manera que esta reacción de la reacción de detección transcurre anteriormente como umbral y, por tanto, sólo los valores por encima del valor umbral serán visibles en la reacción de detección.

Mediante la reacción de detección de reacciones inmunológicas ("umbrales inmunológicos") desarrolladas anteriormente o no visibles (ocultas), en el caso del principio de sándwich, la molécula captadora dirigida contra un analito (el elemento de captura de afinidad umbral (SAF)) en una concentración determinada, desde el punto de vista temporal y espacial, antes de la reacción de detección se une fijamente al material de soporte correspondiente (véase la figura 1A).

Según la invención, la cantidad de analito (A) se une a un valor normal u otro valor fijado (en lo sucesivo denominada "cantidad umbral de analito") mediante un "umbral inmunológico" según el principio de valoración y así ya no alcanza más las moléculas de afinidad de captadores en el campo de detección.

El umbral inmunológico consta de una concentración definida de moléculas captadoras fijamente unidas directamente o por medio de proteínas portadoras, que están dosificadas de manera que unen de forma segura exactamente las cantidades de un complejo de analito -molécula de afinidad detectora - marcador (complejo A-Mad-M) que se corresponden con la cantidad umbral determinada de analito. Por tanto, si una muestra de plasma de 100 microlitros contiene, por ejemplo, 20 ng de FABP/mL, la cantidad absoluta de 2 ng de FABP, unida al Mad-M correspondiente, se capta ya en el umbral inmunológico y no puede alcanzar el campo de detección.

Preferiblemente, el umbral inmunológico está cubierto y puede cubrirse fácilmente con una funda de tira de prueba que sólo muestre el campo de prueba real como ventana. En este caso, la tira de prueba muestra sólo una línea coloreada cuando en la muestra están contenidas concentraciones superiores a 20 ng/mL (figura 1B)

Según la invención, para la detección de analitos de bajo peso molecular, como son, por ejemplo, los haptenos, al campo de detección también le precede un umbral inmunológico preferiblemente tapado, aunque también construido de otra manera. Este umbral inmunológico anterior consta preferiblemente de Ac de captura fijamente unidos, como SAF, y está construido de manera que en el caso de una concentración normal de un analito en la muestra, todas las moléculas de A y A-M permanezcan en el umbral inmunológico. Por tanto, al campo de detección no llega ninguna A-M y permanece sin línea coloreada (figura 2A). En el caso de una cantidad superior de A en la muestra, es decir, superior a la concentración umbral, una parte proporcional de A-M (coloreadas) llega al campo de detección (figura 2B).

Los anticuerpos y antígenos representan ejemplos de otras moléculas de afinidad, por ejemplo, pueden utilizarse diferentes anticuerpos monoclonales o policlonales o sus fragmentos o productos de fusión, avidina, estreptavidina y biotina, proteína A y G, lectina, receptores y ligandos de receptores, ADN o ARN de una o dos cadenas o sus fragmentos, aptámeros o los denominados “polímeros impresos”.

Los materiales preferidos para las tiras de prueba son distintas membranas de celulosa, pero también fibra de vidrio, nailon, otros soportes líquidos, como papel, algodón o estructuras de vidrio, silicona, plástico, metal con canales incrustados o materiales porosos con formas similares a tiras de prueba.

Los ensayos de flujo lateral según la invención (tiras de prueba) pueden prepararse con moléculas de afinidad iguales o distintas que se aplican sobre la superficie en líneas, puntos u otras superficies geométricas de diferente tamaño que se forman mediante moléculas de afinidad fijadas. También son posibles variaciones, según el objetivo concreto, con respecto a la concentración de las moléculas de afinidad por línea u otra superficie geométrica. Las sustancias captadoras se encuentran preferiblemente unidas directamente por medio de sustancias espaciadoras o proteínas portadoras sobre el elemento de análisis y pueden presentarse en diferentes estructuras geométricas, tal como, por ejemplo, en forma de línea, forma de círculo, como puntos, elipses u otras figuras geométricas. Para no irritar al usuario, preferiblemente están dispuestas de manera tapada (no visible) sobre el elemento de análisis.

En el umbral puede estar contenido SAF tanto para un analito, como para también varios analitos. Esto tiene la ventaja de que también pueden eliminarse sustancias que molestarían en el zona de detec-
ción.

En una variante de realización preferida de la invención, se trata de un procedimiento para la detección de antígenos, que se caracteriza porque adicionalmente a los recubrimientos y configuraciones inmunológicos habituales, el elemento de análisis presenta como SAF al menos un anticuerpo de captura (AcC umbral) para una reacción antígeno-anticuerpo anterior, en una concentración que elimina el valor normal del antígeno de una persona sana, de una muestra medioambiental u otro valor fijado, de modo que los AcC están dispuestos espacialmente en el elemento de análisis de tal manera que esta reacción de la reacción de detección transcurre anteriormente como umbral inmunológico (en inglés, Immuno treshold). Estos AcC se denominan en lo sucesivo AcC umbral (treshold catcher antibodies).

En una variante de realización especial de la invención, el procedimiento para la detección de analitos de alto peso molecular, preferiblemente de antígenos (Ag), tales como, por ejemplo, proteínas, transcurre, según el principio de sándwich, en detalle como sigue:

El elemento de análisis comprende en la zona de aplicación de la muestra moléculas de afinidad detectoras (Mad) que se mueven libremente, anticuerpos detectores (Acd) para la detección de antígenos, los cuales se presentan en la forma seca unidos fijamente de manera química con un marcador (M) para la formación de una señal. Después de la aplicación de la muestra líquida que va a examinarse, forman con los analitos añadidos un complejo analito - anticuerpo detector - marcador (A-MaD-M) que se mueve, mediante fuerzas capilares, en dirección al campo de detección, que asimismo comprende las moléculas captadoras que están dirigidas contra los analitos para la reacción de detección.

En este sentido, el complejo pasa los SAF, que están orientados contra los analitos a analizar y que se presentan fijamente unidos al elemento de análisis directamente por medio de sustancias espaciadoras o por medio de proteínas portadoras. Los SAF presentan una concentración definida, de manera que se de forma segura exactamente a la cantidad de A-MaD-M que se corresponde con el valor normal del analito de una persona sana, de una muestra medioambiental u otro valor fijado.

Por tanto, según la invención, la cantidad de analito se une a un valor normal u otro valor fijado mediante el denominado "umbral inmunológico" según el principio de valoración y así ya no alcanza más las moléculas captadoras en el campo de detección. Por tanto, cuando están contenidos, por ejemplo, 10 ng de FABP/mL en una muestra de plasma de 100 microlitros, las cantidades absolutas de 1 ng de FABP, unidas a los correspondientes MaD-M, se captan ya en el umbral inmunológico y no pueden alcanzar el campo de detección.

Según la invención, para la detección de analitos de bajo peso molecular, al campo de detección también le precede un umbral inmunológico preferiblemente cubierto, aunque también construido de otra manera. El procedimiento se caracteriza porque para la detección de analitos de bajo peso molecular se trabaja preferiblemente según el principio de competencia.

Además, el elemento de análisis presenta en la zona de aplicación de la muestra una cantidad definida de analito (A) unida fijamente de manera química con un marcador (M) que transmite una señal (A-M), que está unido por adsorción y puede moverse libremente, y que se desplaza, mediante fuerzas capilares, en la dirección de la zona de detección junto con el analito en la muestra que va a analizarse.

En este sentido, el complejo pasa los SAF, que están orientados frente a los analitos a analizar y que se presentan fijamente unidos al elemento de análisis directamente por medio de sustancias espaciadoras o por medio de proteínas portadoras. Estos SAF están dosificados de manera que se unen a una cantidad fija de A-M, de modo que

a) en el caso de concentración normal de analito en la muestra que va analizarse, no aparece ninguna señal en la zona de detección visible,

b) en el caso de que se supere el valor normal de analito en la muestra, éste compite con el A-M por la unión al SAF y cuánto más analito se encuentre por encima del valor normal en la muestra y pueda unirse a los SAF, más A-M llegará a la zona de detección, de modo que se forma una señal que es equivalente a la concentración de Ag en la muestra.

Objeto de la invención son además elementos de análisis para la detección real de antígenos de alto peso molecular en muestras analíticas.

Las figuras 1A y 1B representan, por ejemplo, tiras de prueba para el uso del principio de sándwich. Presentan las siguientes zonas:

- una zona (1) visible de aplicación de muestra, que comprende al menos una molécula detectora (MaD) que puede moverse libremente, que está presente fijamente unida con un marcador (M) (MaD-M), y

- una zona (2) visible de detección, en la que ambos están en contacto de transferencia de líquido, de modo que esta zona (2) contiene al menos una molécula de afinidad para la unión del analito y una sustancia indicadora, así como

- una zona (3) umbral preferiblemente no visible, que se encuentra entre la zona (1) de aplicación de la muestra y la zona (2) de detección y que contiene al menos un SAF para los analitos de alto peso molecular que van a determinarse, que presenta una concentración definida para la unión del valor umbral del analito que va a determinarse.

Las figuras 2A y 2B muestran un elemento de análisis para la detección real de analitos de bajo peso molecular, preferiblemente de haptenos en muestras analíticas. Representan, por ejemplo, una tira de prueba para el uso del principio de competencia y comprenden:

- una zona (1) visible de aplicación de muestra, que presenta de forma adsorbente (es decir, móvil) una cantidad definida de analito de bajo peso molecular con sustancia marcadora (M) unida fijamente de manera química (A-M), y

- una zona (2) visible de detección, en la que ambos están en contacto de transferencia de líquido, de modo que esta zona (2) contiene al menos una molécula de afinidad para la unión del analito, así como

- una zona (3) umbral preferiblemente no visible, que se encuentra entre la zona (1) de aplicación de muestra y la zona (2) de detección y que contiene al menos un SAF para los analitos de bajo peso molecular.

La figura 3 muestra un elemento de análisis para la detección real de analitos (A) de bajo peso molecular y de alto peso molecular, preferiblemente de antígenos (Ag), en muestras analíticas. Esta tira de prueba combina el principio de sándwich y el de competencia y comprende:

- una zona (1) visible de aplicación de la muestra, que presenta moléculas de afinidad detectoras (MaD) que pueden moverse libremente, preferiblemente anticuerpos detectores (AcD) unidos fijamente con marcador (M) (MaD-M) y A-M, y

- una zona (2) visible de detección, en la que ambas están en contacto de transferencia de líquido, de modo que esta zona (2) comprende varias moléculas captadoras diferentes (anticuerpos de captura), así como

- una zona (3) umbral no visible que se encuentra entre la zona (1) de aplicación de la muestra y la zona (2) de detección y que comprende varias moléculas captadoras diferentes.

Las ventajas de la invención consisten especialmente en que:

El ensayo es barato y muy fácil de manejar.

Puede llevarse a cabo con una cantidad de muestra mínima, es decir, no se necesita ninguna cantidad de muestra tan grande como para ELISA.

Se tiene ya en pocos minutos el resultado.

Es especialmente ventajoso que pueda llevarse a cabo por mano de obra técnica (por ejemplo, enfermeras) o incluso por legos.

Se evitan malas interpretaciones (un positivo falso) ya que no muestra absolutamente ninguna señal en el caso de valores normales.

La invención debe explicarse con más detalle a continuación mediante un ejemplo de realización, sin limitarse al mismo.

Ejemplo

Determinación de FABP de corazón en plasma con una tira de prueba

Se unen varias membranas solapándose para formar una tira de prueba. Se recubre nitrocelulosa con un aparato Biodot con las siguientes cantidades de anticuerpos en forma de tira: umbral: 0,2 \mug de 2F12 IgG anti-FABP cardiaco humano en 10 mM de tampón fosfato sódico (pH 7,2), prueba: 2 mg de 2F12 en 10 mM de tampón fosfato sódico (pH 7,2), control: 1 \mug de IgG de cabra anti-ratón en 10 mM de tampón fosfato sódico (pH 7,2).

Los anticuerpos se unen fijamente a la nitrocelulosa. El campo de aplicación de las muestras (0,5 x 1,5 cm) está por encima del campo de conjugado (0,5 x 1 cm). En el presente documento se unen, aplicados de forma adsorbente, 5 ml de anticuerpos detectores marcados con oro coloidal (F5E10-cgc IgG anti-FABP). Se seca la tira de prueba. Se aplica una muestra de 80 ml de plasma (50 ng de FABP/mL). La membrana de nitrocelulosa tiene la dimensión de 0,5 x 2,5 cm. En el otro extremo de la tira se encuentra un material de absorción de soporte de 0,5 x 2 cm.

Se mantienen las siguientes distancias de los anticuerpos en la nitrocelulosa: 0,8 cm para el umbral, 1,4 cm para la prueba, 2 cm para el control.

Después de 5 min. son visibles tanto las tiras de prueba, como también las de control. El umbral que se encuentra delante del campo de prueba se tapa visualmente y se une a la parte del FABP que corresponde al valor normal.

Claims (13)

1. Procedimiento para la detección mejorada de analitos basada en una reacción de afinidad, analitos tales como antígenos, anticuerpos, ligandos de receptores, receptores, ADN y ARN y otras moléculas bioafines en muestras biológicas analíticas por medio de elementos de análisis, especialmente como tiras de prueba, caracterizado porque, adicionalmente a los recubrimientos y configuraciones habituales con moléculas de afinidad complementarias en la zona de detección, el elemento de análisis presenta entre la zona de aplicación de la muestra y la zona de detección al menos un elemento de captura de afinidad umbral (SAF) que consta de al menos un anticuerpo de captura (AcC umbral) frente a al menos un analito dirigido para una reacción de afinidad analito-anticuerpo anterior, en una concentración que elimina el valor normal del analito que va a determinarse de una persona sana, de una muestra medioambiental u otro valor fijado, de modo que los anticuerpos de captura están dispuestos espacialmente en el elemento de análisis de manera que esta reacción de la reacción de detección transcurre como umbral precedente y, por tanto, sólo serán visibles en la reacción de detección los valores que se encuentren por encima del valor umbral.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como antígenos pueden detectarse sustancias de alto peso molecular, como proteínas, o haptenos de bajo peso molecular, como pesticidas, otras sustancias nocivas u hormonas.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque los SAF se encuentran fijamente unidos directamente al elemento de análisis por medio de sustancias espaciadores o proteínas portadoras.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los SAF se encuentran en el elemento de análisis como círculo, punto, elipse y otras estructuras geométricas.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los SAF están cubiertos y, por tanto, están dispuestos de manera no visible sobre el elemento de análisis.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque como SAF actúan anticuerpos monoclonales o policlonales o sus fragmentos o productos de fusión, de modo que los SAF son las mismas moléculas de afinidad que también se utilizan en el campo de análisis de detección visible.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los SAF están dirigidos contra un analito o contra varios analitos diferentes.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque para la detección de analitos (A) de alto peso molecular se trabaja según el principio de sándwich, de modo que el elemento de análisis comprende en la zona de aplicación de la muestra moléculas de afinidad detectoras (MaD) adsorbidas y, por tanto, libremente móviles que se presentan en la forma seca unidas fijamente de manera química con un marcador (M) para la formación de una señal, y que después de la aplicación de la muestra líquida a analizar con el analito introducido forman un complejo analito - molécula de afinidad detectora - marcador (A-MaD-M) que se desplaza, mediante fuerzas capilares, en dirección al campo de detección, y en este sentido pasa los SAF, que están dirigidos contra los analitos a analizar y que se presentan fijamente unidos al elemento de análisis directamente por medio de sustancias espaciadoras o por medio de proteínas portadoras, de modo que los SAF presentan una concentración definida, de manera que de forma segura se une exactamente la cantidad de A-MaD-M que se corresponde con el valor normal del analito de una persona sana, una muestra medioambiental u otro valor fijado.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque para la detección de analitos (A) de bajo peso molecular se trabaja según el principio de competencia, de modo que el elemento de análisis presenta en la zona de aplicación de la muestra una cantidad definida de analito (A) unida fijamente de manera química con un marcador (M) que emite una señal (A-M), que está unido por adsorción y que puede moverse libremente, y que se mueve mediante fuerzas capilares en la dirección de la zona de detección junto con el analito en la muestra que va a examinarse, de modo que pasa los SAF, que están dirigidos contra los analitos que van a analizarse y que se presentan fijamente unidos al elemento de análisis directamente por medio de espaciadores o por medio de proteínas portadoras y están dosificados de manera que se unen a una cantidad determinada de A-M, de modo que

a) en el caso de concentración normal de analito en la muestra a analizar no aparece ninguna señal en la zona de detección visible,

b) en el caso de que se supere el valor normal de analito en la muestra, éste compite con el A-M por la unión al SAF y cuánto más analito se encuentre por encima del valor normal en la muestra y pueda unirse a los SAF, más A-M llegará a la zona de detección, de modo que se forma una señal que es equivalente a la concentración de Ag en la muestra.

10. Elemento de análisis para la detección de analitos moleculares en muestras analíticas, como tiras de prueba, con el uso del principio de sándwich o/y de competencia, que comprende

a) una zona (1) visible de aplicación de la muestra, que comprende al menos un tipo de molécula de afinidad detectora que puede moverse libremente fijamente unida con marcador (M) (MaD-M) o/y una cantidad definida de analito adsorbida, fijamente unida con marcador (M) de manera química (A-M),
y

b) una zona (2) de detección visible (2), en la que ambas están en contacto de transferencia de líquido, de modo que esta zona (2) contiene al menos un tipo de moléculas de afinidad para la unión del analito, así como

c) una zona (3) umbral no visible, que se encuentra entre la zona (1) de aplicación de la muestra y la zona (2) de detección y que contiene al menos un captador de afinidad umbral (SAF) para el analito molecular que va a determinarse.

11. Elemento de análisis según la reivindicación 10, caracterizado porque está configurado como tira de prueba según el principio de sándwich para la detección real de analitos de alto peso molecular en muestras biológicas analíticas, de modo que

a) el analito molecular es uno de alto peso molecular, y

b) la zona (1) de aplicación de la muestra comprende al menos un tipo de MaD-M unidos por adsorción que, por tanto, son libremente móviles después de la adición de líquido, y

c) el SAF de la zona (3) umbral presenta una concentración definida para la formación de valor umbral del analito de alto peso molecular que va a determinarse.

12. Elemento de análisis según la reivindicación 10, caracterizado porque está configurado como tira de prueba según el principio de competencia para la detección real de analitos de bajo peso molecular en muestras biológicas analíticas, de modo que

a) el analito molecular es uno de bajo peso molecular, y

b) la zona (1) de aplicación de la muestra presenta una concentración definida de A-M de bajo peso molecular de forma adsorbente.

13. Elemento de análisis según la reivindicación 10, caracterizado porque para la detección simultánea de antígenos de bajo peso molecular y de alto peso molecular en muestras analíticas se trabaja según una combinación del principio de sándwich y de competencia, de modo que

a) los analitos moleculares son antígenos de bajo peso molecular y de alto peso molecular, y

b) MaD-M como anticuerpo detector Acd está especificado fijamente unido con marcador (M),

c) la zona (1) de aplicación de la muestra presenta MaD-M libremente móviles y A-M, y

d) la zona (2) de detección comprende varios anticuerpos de captura diferentes como moléculas de afinidad, así como

e) la zona (3) umbral comprende varios SAF diferentes.