ES2201132T3 - Dispositivo para la realizacion de uno o mas inmunoanalisis competitivos. - Google Patents
Dispositivo para la realizacion de uno o mas inmunoanalisis competitivos.Info
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Abstract
UN DISPOSITIVO Y UN METODO RELACIONADO PARA DESARROLLAR UNO O MAS INMUNOENSAYOS A FIN DE DETECTAR LA PRESENCIA DE LOS CORRESPONDIENTES ANALITOS EN UNA MUESTRA. EL DISPOSITIVO INCLUYE EL USO DE UN MATERIAL ABSORBENTE UNITARIO CON UNA O MAS VIAS DE FLUJO QUE TIENEN UN ORIGEN COMUN Y VARIAS ZONAS QUE APORTAN LOS REACTIVOS NECESARIOS PARA REALIZAR UN INMUNOENSAYO COMPETITIVO CON LECTURA VISUAL PARA DETECTAR LA PRESENCIA DEL ANALITO CORRESPONDIENTE.
Description
Dispositivo para la realización de uno o más
inmunoanálisis competitivos.
La presente invención se refiere al sector de los
inmunoanálisis diagnósticos y dispositivos correspondientes para
realizar dichos ensayos. En otro aspecto, la invención se refiere
al análisis de análitos como drogas o sus metabolitos. En otro
aspecto, la invención se refiere a dispositivos o medios para la
realización simultánea de análisis múltiples de análitos diferentes
dentro de una sola muestra.
La utilización de ensayos analíticos, inclusive
los utilizados para determinar la presencia de fármacos de
adicción (drogas), se ha incrementado rápidamente en la década
pasada. En 1993, el mercado de ensayo de fármacos solamente se
estimó en por lo menos 500 M dólares. La industria de análisis de
fármacos está esperando un nuevo crecimiento como resultado de la
nueva normativa federal de los Estados Unidos, que incrementará
notablemente el número de trabajadores sometidos a análisis por
adicción a drogas y alcohol.
En la actualidad, la mayoría de las pruebas de
fármacos incluyen la recogida de muestras, seguidas de análisis en
laboratorio con instrumentos de "química húmeda". Sin embargo,
el mercado in situ, o "punto de asistencia" ha crecido
rápidamente, los pasados dos años. Aunque no se dispone de ninguna
cifra actual, el mercado de kits para las pruebas de fármacos de
adicción, con inmunoanálisis no instrumental parece estar creciendo
al ritmo de 20-40% por año.
En la actualidad, existe en el mercado toda una
serie de pruebas diagnósticas de fármacos de adicción, basadas en
inmunoanálisis de un análito. Se pueden citar por ejemplo las
pruebas fabricadas por Roche Diagnostic Systems, Hansen Hong
Biomedical Co. Ltd., Drug Screening Systems, Editek, Inc. Hycor
Biomedical, U.S. Drug Testing Inc., Thermedics Detection, Inc., y
Fingerprint Biotek. Estos dispositivos suelen funcionar bien en
situaciones en las cuales se sospecha la existencia de una droga /
fármaco específico. En muchos casos sin embargo, como por ejemplo
en las salas de urgencia, sería particularmente deseable disponer
de un análisis rápido, independiente, para detectar una o más
drogas en un paciente dado.
Se ha descrito toda una variedad de kits de
análisis, que permiten realizar análisis diagnósticos. Por ejemplo,
toda una serie de patentes concedidas a Olson (patente US n°.
4.959.307; 4.963.468; 5,.085.987; y 5.085.988) se refiere a una
cinta de inmunoseparación, que tiene un material absorbente, un
primer receptor ligado de forma no difusiva y un segundo receptor
ligado de forma no difusiva. En cada realización sin embargo, el
método de utilización del dispositivo requiere que la primera etapa
de preparación de una solución de prueba separada contenga la
muestra, anticuerpo para el análito y un conjugado del análito y un
marcador. Una vez formada, la reacción competitiva progresa en la
medida de lo deseado en la fase de solución. La solución es
transferida entonces por el usuario, hasta la parte de contacto del
dispositivo analítico, donde comienza su circulación a lo largo de
la vía (véase por ejemplo la patente `987 columna 13, líneas
35-38 y columna 20, líneas
10-11).
Otras describen la utilización de kits, que
permiten realizar dos o más análisis que incluyen formatos in
situ multi-análitos. Un kit que ofrece Biosite
(marca "Triage") permite, según se dice, la detección
diferencial de la presencia de diversas drogas comunes en una sola
muestra de orina y suero. Véase por ejemplo Buechler, et al,
Clin. Chem. 38(9):1678-1684 (1992).
Por lo menos uno de los inconvenientes de este dispositivo es la
necesidad de añadir por separado la muestra a una región que
contiene reactivos liofilizados, donde se deja durante cierto
período de tiempo (10 minutos), con el fin de permitir que la
muestra se reconstituya y equilibre con los reactivos.
Este y otros kits de prueba de un solo analito o
de múltiples análitos que se encuentran habitualmente en el mercado
presentan varias desventajas. Los formatos actuales tienden a ser
muy complejos, con constantes de afinidad específica, que
desempeñan una función clave en las reacciones de fijación
competitiva.
Además, los formatos pueden verse afectados por
resultados falsos si el paciente tiene elevadas dosis del fármaco
análito. Los formatos actuales suelen requerir también
concentraciones de reactivos exactas (es decir, relaciones entre
análito y anti-análito), que se pueden ver
comprometidas si un miembro del par
ligando-receptor empieza a deteriorarse.
Particularmente molestos son los kits que se
basan en la utilización de un anticuerpo inmovilizado o reactivo de
fijación, donde la cantidad de este reactivo tiene que controlarse
estrictamente. La capacidad de fijación de receptores inmovilizados
puede depender en gran medida de los métodos y condiciones
particulares de inmovilización. Esta dependencia hace que la
fabricación de estos análisis sea impredecible y difícil de
reproducir. También puede verse afectada la estabilidad del tiempo
de durabilidad.
La solicitud de patente europea n°. 02761652
describe un dispositivo de inmunoanálisis de circulación
ortográfica, en el que una muestra a analizar atraviesa una matriz
absorbente en un primer plano y la vía de circulación se
re-dirige hacia un segundo plano en un lugar de
fijación, donde se crea una señal en relación con la presencia de
análito. Uno de los problemas asociados con dicho dispositivo es
que, una vez que se ha añadido la muestra, el usuario tiene que
realizar cierto número de actos ulteriores para finalizar el
análisis y obtener un resultado legible. Lo que se necesita
claramente es un kit de prueba de analito, que se pueda utilizar
para cierto número de drogas diferentes, y particularmente uno que
se pueda utilizar simultáneamente para realizar una pluralidad de
análisis, de forma más fácil de fabricar y de uso sencillo y
fiable.
La figura 1 representa un diagrama de una
realización preferida de la presente invención, que tiene un
formato de prueba in situ basado en inmunoanálisis, de un
solo análito.
La figura 2 representa un diagrama de una
realización preferida de la presente invención, que tiene un
formato de prueba in situ, basado en inmunoanálisis, de
análito múltiple.
La presente invención presenta un dispositivo y
un método correspondiente para realizar uno o más inmunoanálisis
competitivos para detectar la presencia de análitos
correspondientes en una muestra. El dispositivo puede ser un
dispositivo unitario, es decir, en el que cada una de las etapas y
reactivos son independientes en el dispositivo y cada una de las
etapas se realiza de forma independiente, es decir que se efectúan
de forma autónoma al aplicar una muestra. Una vez aplicada la
muestra al dispositivo, todo el análisis (inclusive la reacción
competitiva) se desarrolla únicamente por etapas, que suponen una
circulación capilar desde cada lugar o zona hasta el siguiente.
Debido a ello, un dispositivo de este tipo se puede utilizar sin
necesidad de realizar por separado una reacción de análisis
competitivo en una solución, o de transferir físicamente la
solución de una forma no capilar a un dispositivo o zona
separada.
En una realización preferida, el dispositivo
comprende un material absorbente que ofrece una o más vías de
circulación, cada una de las cuales comprende:
(a) un lugar de origen para la aplicación de una
muestra de fluido,
(b) una pluralidad de zonas de reactivos que
proceden del lugar de origen y proporcionan los reactivos
necesarios para realizar una lectura visual, un inmunoanálisis
competitivo de la presencia del análito correspondiente,
comprendiendo las zonas, en el orden y sentido de circulación:
(i) una zona de competencia en comunicación
fluida con el lugar de origen, y que comprende un análito -
conjugado detectable y un asociado de fijación para el análito,
estando ambos posicionados de forma difusa, de modo que el análito
libre presente en la muestra puede fijarse al asociado de fijación,
de forma competitiva con el análito - conjugado;
(ii) una zona de retención en comunicación fluida
latente con la zona de competición y que comprende una cantidad en
exceso de un reactivo de captura, ligado de forma no difusiva, que
puede fijarse a un asociado de fijación libre, o ligado para
quitarlo de la circulación continua en la vía de circulación; y
(iii) una zona de lectura en comunicación fluida
con la zona de retención y que comprende un receptor ligado, no de
forma difusa, capaz de fijarse de forma detectable al conjugado del
análito, pero no al análito no conjugado. En la utilización de un
dispositivo como el descrito anteriormente, la presencia de
cantidades cada vez mayores de análito libre en una muestra se
corresponde con la menor fijación del análito conjugado al asociado
de fijación. A su vez, una cantidad incrementada de análito -
conjugado libre puede seguir, aguas abajo, por la vía de
circulación. Por último, el análito - conjugado libre queda ligado,
de forma no difusiva, a un asociado de fijación correspondiente en
la zona de lectura, y se le detecta para ofrecer una indicación
positiva de la presencia de análito en la muestra original.
En una realización preferida, el dispositivo y
método se pueden utilizar para realizar de forma simultánea una
pluralidad de inmunoanálisis para detectar la presencia de análitos
correspondientes en una muestra. En esta realización preferida
"multi-análito", el dispositivo comprende un
material absorbente, que presenta una o más vías de circulación,
cada una de las cuales comprende:
(a) un lugar de origen común sobre el material
absorbente para la aplicación simultánea de una muestra de
fluido,
(b) una pluralidad de zonas reactivas
correspondientes en comunicación fluida activa o latente con el
origen, proporcionando las zonas de reactivo de cada vía de
circulación los reactivos necesarios para realizar una lectura
visual, un inmunoanálisis competitivo de la presencia del análito
correspondiente, comprendiendo las zonas de cada vía de
circulación, en el orden y en sentido de circulación:
(i) una zona de competencia en comunicación
fluida con el origen y que comprende un análito - conjugado
detectable y un asociado de fijación para el análito
correspondiente, estando posicionados, de modo difuso, el conjugado
y el asociado de fijación, de forma que un análito libre presente
en la muestra es capaz de fijarse al asociado de fijación de forma
competitiva con el análito - conjugado;
(ii) una zona de retención en comunicación fluida
latente con una zona de competencia correspondiente y que comprende
una cantidad en exceso de un reactivo de captura ligado, de forma
no difusiva, que puede fijarse a un asociado de fijación, libre o
ligado, para quitarlo de la circulación continua en la vía de
circulación; y
(iii) una zona de lectura en comunicación fluida
con una zona de retención correspondiente y que comprende un
receptor ligado, no de forma difusiva, capaz de fijarse de forma
detectable al análito -conjugado, pero no al análito no
conjugado.
Las vías de circulación comprenden de preferencia
cada una de ellas una o más zonas de control de procedimiento
positivo y/o negativo y reactivos. En una realización preferida, el
dispositivo comprende además un lugar terminal, aguas abajo de las
zonas de reactivos secuenciales y que comprende un reactivo
indicador para confirmar la finalización del análisis
correspondiente.
En una realización particularmente preferida, el
dispositivo comprende un receptáculo inerte, con una parte superior
e inferior para soportar el material absorbente, ofreciendo la
parte superior una abertura para el acceso de la muestra de fluido
al origen común, así como unas aberturas para ver la lectura
respectiva y unos lugares indicadores terminales a lo largo de cada
vía de circulación.
En una realización, se pueden presentar las vías
de circulación para una pluralidad de análisis de forma solapante
y/o contigua, y en la misma dirección a lo largo del material
absorbente. En una realización alternativa, el dispositivo ofrece
una vía de circulación discreta, separada para cada análito, estando
colocas las vías de circulación de forma que se extienden en
dirección radial desde el origen común.
En una realización particularmente preferida, la
presente invención ofrece un análisis multi-análito
capaz de detectar de forma diferencial la presencia de una a
cuatro drogas en una sola muestra de orina o suero. Estos análitos
pueden ser: tetrahidrocannabinol (THC), cocaína, opiáceos y
anfetaminas, que se detectan sin interferencia de los demás
análitos.
En la presente especificación, las siguientes
palabras o conjunto de palabras tendrán el significado que aquí se
indica:
"Zona" se refiere a un lugar separado, que
contiene uno o más reactivos y está situado a lo largo de la vía de
circulación de un análisis particular, teniendo cada zona o lugar
una superficie inferior a la del material absorbente;
"Aguas abajo", aplicado a zonas, se refiere
a una zona separada de la zona precedente en el sentido de
circulación de una muestra. En una realización típica, por ejemplo,
cada zona estará separado de la otra, del orden de uno o más mm.
Además, puede haber dos o más regiones discretas dentro de las
zonas, como las regiones que llevan análito - conjugado y asociado
de fijación, respectivamente, en la zona de competencia.
Alternativamente, con reactivos que no interfieren, puede haber
ocasionalmente unas zonas y/o regiones dentro de las zonas situadas
en una configuración de solapamiento con las zonas anteriores y/o
siguientes.
"Unitario", aplicado al material absorbente
significa que se puede añadir una sola muestra acuosa al origen y
progresar por circulación capilar activa o latente a través de cada
una de las zonas a lo largo de una vía de circulación
correspondiente. "Absorbente", a su vez, se refiere a material,
o a una combinación de materiales suficiente para permitir la
circulación capilar de la muestra desde el origen y a través de
cada zona de reactivo.
"Simultáneo" significará que cada uno de una
pluralidad de ensayos en un dispositivo
multi-análito puede realizarse prácticamente al
mismo tiempo y aplicando una sola muestra al origen.
"Competitivo", significará que la cantidad
de análito - conjugado que se fija en el asociado de fijación libre
depende y está relacionado con la presencia o la ausencia de
análito en la muestra.
"Ligado no de forma difusiva" se utilizará
de forma intercambiable con la palabra "inmovilizado" para
describir reactivos retenidos de forma estable en una zona
particular en condiciones de uso.
La presente invención ofrece un dispositivo y un
método para la realización simultánea de uno o más inmunoanálisis
para detectar la presencia de análitos correspondientes en una
muestra. Entre los análitos adecuados se encuentran aquellos que
pueden presentarse en forma de conjugado. Alternativamente, el
análito puede tener la forma de un derivado o metabolito del
compuesto de interés.
Por lo general, un análito es todo compuesto por
detectar, capaz de ser fijado por un receptor, y capaz de ser
recuperado en forma sintética y/o purificada, suficiente para
permitir conjugarlo y utilizarlo en un análisis competitivo con
análito de muestra y el receptor. Estos compuestos incluyen análitos
mono - epitópicos, de peso molecular relativamente pequeño (por
ejemplo aproximadamente 100 a 2000) y antígenos poli - epitópicos
de peso molecular superior (por ejemplo superiores a 2000
aproximadamente). Como análitos representativos, se pueden citar
los descritos por ejemplo en las patentes U.S. n°. 4.299.916 y
4.275.149.
Como ejemplos de análitos adecuados, se puede
mencionar, aunque esto no suponga limitación alguna, pesticidas y
sus metabolitos y derivados (por ejemplo bifenilos polihalogenados,
ésteres de fosfato, tiofosfatos, carbamatos, sulfonamidas
polihalogenadas), y drogas y sus metabolitos y derivados (por
ejemplo alcaloides, esteroides, lactamas, aminoalquilbencenos,
benzheterociclícos, purinas, vitaminas, antibióticos, nucleósidos y
nucleótidos, drogas derivadas de la marihuana y drogas varias.
El dispositivo y método de la presente invención
se puede utilizar con cualquier muestra adecuada. Por lo general, y
de preferencia, la muestra es acuosa y se obtiene directamente de
la fuente (por ejemplo orina o sangre). Alternativamente, la muestra
se puede preparar mezclando o extrayendo una muestra no acuosa (por
ejemplo, tejido) con un disolvente acuoso (por ejemplo solución
tampón). Por lo general, la muestra es cualquier sustancia
sospechosa de contener el compuesto o compuestos de interés. Esto
incluye el análisis de aguas subterráneas para encontrar
contaminantes, el análisis de productos agrícolas para encontrar
agentes tóxicos naturales como aflatoxina y similares.
Algunas veces, los análisis de este tipo
requerirán una etapa de extracción, en la cual se mezcla una
muestra con un medio de extracción líquido que puede ser acuoso,
orgánico, o una mezcla acuosa / orgánica. Una vez extraído el
material de interés, la solución de extracción misma se puede
utilizar como muestra y se puede evaluar directamente o
concentrarse, diluirse, evaporarse y reconstituirse, etc. antes de
la evaluación en el dispositivo instantáneo.
Otros ejemplos adicionales de evaluaciones que
requieren extracción pueden ser residuos pesticidas, metabolitos
bacterianos y otros contaminantes en la carne o en los mariscos, y
residuos de herbicidas u otros contaminantes en muestras de
tierra.
Un dispositivo preferido de la presente invención
comprende un material absorbente unitario, que presenta una o más
vías de circulación. De preferencia, aunque no necesariamente, el
material absorbente se presentará realmente en forma de un solo
material esencial. Alternativamente, lo absorbente puede estar
formado por la superposición o el empalme de materiales que, de
otro modo, están separados. Como ejemplos de materiales absorbentes
adecuados, se puede citar (membranas de nitrocelulosa, membranas de
nylon u otras membranas que se encuentran en el comercio).
Los materiales absorbentes útiles en el
dispositivo instantáneo pueden ser materiales porosos, que pueden
ser atravesados por un medio acuoso en respuesta a una fuerza
capilar. Estos materiales son por lo general hidrófilos o pueden
volverse hidrófilos e incluyen polvos inorgánicos como sílice y
alúmina; materiales polímeros naturales, particularmente materiales
celulósicos como papel de filtro, papel cromatográfico y similares;
polímeros sintéticos o modificados naturalmente como nitrocelulosa,
acetato de celulosa, poli (vinil cloruro), poliacrilamida, dextrano
reticulado, agarosa, etc.; utilizados solos o junto con otros
materiales. Un material absorbente preferido puede ser papel de
filtro a base de fibra de vidrio. El material absorbente se puede
fijar a un soporte, o puede proporcionar su propio soporte. El
material absorbente puede contener grupos funcionales, o ser capaz
de ser funcionalizado para permitir enlaces covalentes o receptores
con otras mitades.
Cuando se utilizan dos o más vías de circulación
en un solo dispositivo, cada vía comprende, de preferencia, un
lugar de origen común sobre el material absorbente para la
aplicación simultánea de una muestra de fluido. Como se puede ver,
el origen es "común" por el hecho de que la aplicación de una
sola muestra sirve para comenzar la circulación de la muestra
simultáneamente en cada vía de circulación.
Cada vía de circulación en un dispositivo de la
presente invención comprende además una pluralidad de zonas
reactivas correspondientes en el lugar de origen y aguas abajo de
este lugar. Las zonas reactivas de cada inmunoanálisis proporcionan
los reactivos necesarios para realizar una lectura visual, un
inmunoanálisis competitivo de la presencia del análito
correspondiente. En una realización preferida, las zonas reactivas
proporcionan cada una de ellas los reactivos necesarios, es decir
sin tener que quitar físicamente y volver a aplicar reactivos (por
ejemplo utilizando una pipeta) a lo largo de la vía o durante el
análisis.
Las zonas de una vía de circulación particular
comprende, en el orden y en el sentido de circulación, una zona de
competencia que comprende análito - conjugado y asociado de
fijación para el análito, estando ambos posicionados de forma
difusiva, de modo que todo análito libre presente en la muestra sea
capaz de fijarse al asociado de fijación de modo competitivo con el
conjugado del análito.
La zona de competencia puede servir a su vez como
lugar de origen para la aplicación de la muestra o puede estar
aguas abajo del origen mismo. Además, los diversos reactivos
presentes en la zona de competencia pueden estar alternados o
dispuestos de cualquier forma adecuada para alterar o afectar la
cinética de la reacción de competencia.
Por ejemplo, el asociado de fijación puede estar
situado aguas arriba del conjugado del analito, con el fin de
permitir al análito reaccionar con el asociado de fijación antes de
que este último se exponga al conjugado del análito. Esta forma de
proceder proporcionará al análito una ventaja competitiva con
respecto al conjugado para lugares de fijación sobre el asociado de
fijación. A su vez, esta forma de proceder se puede utilizar para
aumentar la sensibilidad de detección de un análito particular.
El asociado de fijación es, de preferencia un
receptor para el análito. Un receptor es todo compuesto o
composición capaz de reconocer una organización espacial o polar
particular del análito de interés. Como receptores ilustrativos se
pueden mencionar los receptores que se producen de forma natural,
por ejemplo anticuerpos, enzimas, lectinas y similares. Una receptor
preferido para el análito es un anticuerpo del análito. Un
anticuerpo es una inmunoglobulina o derivado o fragmento de la
misma que tiene una área en la superficie o en una cavidad que se
fija específicamente a, y se define como complementaria de, una
organización espacial y polar particular de otra molécula. El
anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y se puede preparar
mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica, como
inmunización de un huésped y recogida o tecnología de línea celular
híbrida o suero.
Alternativamente, el reactivo de fijación puede
adoptar a su vez la forma de un complejo de moléculas, por ejemplo
un complejo de un primer anticuerpo para el análito y segundo
anticuerpo específico del primer anticuerpo. Los componentes de
dicho complejo se pueden presentar por separado en la zona de
competencia y/o en cualquier lugar adecuado que conduzca a la zona
de retención. Dichos complejos pueden ser útiles, para mejorar la
eliminación del reactivo de fijación en la zona de retención,
aumentando su tamaño o afinidad por el reactivo de captura.
El análito - conjugado se presenta por lo general
en forma de un marcador o trazador, por ejemplo un catalizador,
habitualmente una enzima conjugada al análito. Un marcador puede
ser por ejemplo cualquier molécula o sistemas de moléculas ligado o
conjugado al análito, capaz de producir una señal perceptible. Un
marcador preferido consiste en partículas metálicas coloidales o
partículas de un sol a las que se ha dado color. Las personas
versadas en el arte reconocerán que muchos elementos pueden
funcionar como marcador, inclusive, aunque esto no suponga
limitación, radionúclidos, especies fluorescentes, especies
fosforescentes, materiales quimio-luminiscentes,
materias colorantes, enzimas, partículas de sol, materiales
polímeros de color, y similares. Sobre la base de la conocida
cinética de fijación de los anticuerpos antidroga monoclonales, se
pueden utilizar técnicas standard para preparar conjugados de droga
que tienen el epítope correcto disponible para la fijación del
anticuerpo.
Una vía de circulación comprende además una zona
de retención en comunicación fluida latente con la zona de
competencia. Por "comunicación fluida latente" se entiende que
la comunicación fluida entre la zona de competencia y la zona de
retención puede retrasarse lo suficiente y/o la tasa de reacción
aumentarse lo suficiente, para permitir que la reacción de
competencia progrese hasta unos límites deseados. Además de aumentar
el tiempo de reacción dentro de la zona de competencia, la amplitud
de la reacción se puede mejorar por otros medios también como por
ejemplo elevando la temperatura de la reacción y/o mejorando las
características de mezcla de los reactivos (por ejemplo, por
efervescencia).
El dispositivo de demora para lograr la
circulación capilar latente puede ser de naturaleza pasiva (es
decir que se produce automáticamente durante la utilización) o de
naturaleza activa, (es decir que requiere algún acto por parte del
usuario). Dada la presente descripción, las personas versadas en el
arte apreciarán la forma en que se pueden disponer dispositivos de
demora WO 92/21434 y WO 93/24231.
En un enfoque adecuado, el tiempo de permanencia
de la solución en la zona de competencia se incrementa configurando
las zonas de competencia y retención correspondientes (y/o un
interface entre las mismas) de modo que la circulación de la
separación desde la zona de competencia se demore de forma
controlable. Como ejemplos de dispositivos de demora adecuados, sin
que esto suponga limitación alguna, se puede mencionar la
utilización de una barrera física disoluble, una barrera física
permeable o un material de puenteo expandible.
Por ejemplo, puede entremezclarse una barrera
porosa o disoluble entre las zonas para permitir que la solución
permanezca en la zona de competencia durante un período de tiempo
suficiente antes de que la barrera misma se permeé o se disuelva.
De forma similar, se puede hacer que la vía de circulación capilar
tome una ruta tortuosa entre las zonas, incrementando el tiempo de
reacción efectivo para el análisis. Según otro ejemplo más, se
puede utilizar un material hidratable, expandible, (por ejemplo
esponjoso) en la zona de competencia, de forma que el material no
se encuentre inicialmente en contacto físico con la zona de
retención. Una vez hidratada la solución de prueba, y mientras se
deja que se produzca la reacción competitiva, el material se puede
expandir o hinchar hasta que entra en contacto físico y permite
comunicación de fluido con la zona de retención.
En una realización alternativa, la circulación
capilar latente entre las zonas de competencia y retención puede
ser iniciada activamente por el usuario, es decir manipulando o
liberando una barrera entre las zonas, formando un puente capilar
entre las mismas o colocando zonas físicamente juntas (por ejemplo
presionando), véase por ejemplo, la patente U.S. n°. 4.826.759.
La zona de retención comprende una cantidad en
exceso de reactivo de captura ligado de forma no difusiva capaz de
fijarse al asociado de fijación libre o ligado con el fin de
eliminarlo de la circulación continua en la vía de circulación.
Este reactivo de captura suele ser un receptor capaz de fijarse al
asociado de fijación. Un reactivo de captura preferida es un
anticuerpo capaz de fijarse al asociado de fijación.
Como el asociado de fijación es de preferencia un
anticuerpo del análito, el reactivo de captura es de preferencia un
anticuerpo capaz de fijarse al anticuerpo del análito. Puede ser
por ejemplo un anticuerpo cultivado en una especie diferente que la
utilizada para cultivar el anticuerpo del análito. El reactivo de
captura puede ser también un receptor, como proteína A, que se fija
en un lugar particular de la molécula de inmunoglobulina. En otra
realización, el asociado de fijación puede estar acoplado a una
molécula, como biotina, y el reactivo de captura puede ser
específico de dicha molécula, por ejemplo antibiotina o
avidina.
La forma de proceder de la presente invención
proporciona una ventaja particular con respecto a muchos análisis
convencionales que utilizan receptores inmovilizados. Como se
describe anteriormente, la capacidad de fijación de dichos
receptores inmovilizados puede depender de los métodos y
condiciones de inmovilización, por lo que la fabricación de dichos
análisis es impredecible y resulta difícil de reproducir. En la
presente invención, el reactivo de captura inmovilizado puede
estar presente en una cantidad en exceso, permitiendo por lo tanto
el desarrollo de un análisis con características de realización
predecibles.
La inmovilización del reactivo de captura es
suficientemente estable para evitar la disociación de reactivo del
material, que podría conducir, a su vez, a resultados falsos. Como
protección adicional contra el error debido al reactivo de captura
disociado, las personas versadas en el arte apreciarán la forma en
que se puede utilizar un reactivo adicional para fijar a su vez y
retener un reactivo de captura disociado. Una forma de proceder
adecuada comprende la utilización de una segunda zona de retención,
por ejemplo en o entre la primera zona de retención y la zona de
lectura, habiendo inmovilizado un segundo reactivo de captura
específico del primer reactivo de captura (es decir el reactivo de
captura presente en la zona de retención).
Finalmente, una vía de circulación comprende
además una zona de lectura con un receptor ligado no difusivamente
capaz de fijarse al análito - conjugado pero no al análito no
conjugado, de forma detectable.
El receptor ligado no difusivamente es capaz de
fijarse al análito - conjugado pero no al análito solo. Este
receptor se fija pues, a la parte de marcador del conjugado o a una
mitad adicional proporcionada por el conjugado (por ejemplo en
virtud de la fijación de análito y marcador) pero ausente del
análito solo.Un receptor preferido, ligado no difusivamente es un
anticuerpo capaz de fijarse en la mitad espaciadora que se utiliza
para conjugar el análito con el marcador.
En una realización particularmente preferida, la
lectura se presenta en forma de la realización de un signo más
("+") que indica la presencia de análito. En dicha
realización, la parte menos ("-") de la lectura puede ser
proporcionada por cualquier dispositivo adecuado.
En una realización, la parte menos es
proporcionada por la utilización de reactivos adicionales colocados
a lo largo de la vía de circulación. Por ejemplo, un conjugado
detectable está situado a lo largo de la vía de circulación y de
preferencia en el origen mismo. La parte menos de la lectura puede
proporcionarse en forma de anticuerpo ligado no difusivamente frente
al conjugado detectable. Por ejemplo, cuando se encuentra presente
conjugado de oro-KLH en forma difusiva, con un
anticuerpo anti-KLH ligado de forma no difusiva,
formando la parte menos de la zona de lectura.
Finalmente, la vía de circulación comprende de
preferencia además un lugar terminal aguas abajo de las zonas de
reactivo secuenciales y que comprenden un reactivo indicador para
confirmar la realización del análisis correspondiente. El reactivo
indicador suele ser material sensible a la presencia de la muestra.
Por lo general es un material que cambia de color en respuesta a la
presencia de alguna mitad en la solución de muestra. Como ejemplos
de dichos reactivos se puede citar, materias colorantes indicadoras
de pH, colorantes sensibles a la presencia de proteínas, y
colorantes sensibles a los estados de hidratación.
El dispositivo de la presente invención puede ser
de cualquier forma y dimensiones adecuadas para alcanzar el
objetivo deseado. En una realización preferida, el dispositivo se
presenta en forma de un receptáculo inerte que comprende unas
partes inferior e inferior para soportar el material absorbente,
presentando la parte superior una abertura para el acceso de la
muestra de fluido al origen común, así como unas aberturas para ver
la lectura respectiva y unos lugares indicadores terminales a lo
largo de cada vía de circulación.
La fabricación de un diseño típico del presente
formato de prueba se describirá con referencia a las figuras 1
(formato de un solo análito) y a la figura 2 (formato
multi-análito). Para el usuario, la prueba de la
figura 2 aparecerá como un solo dispositivo de prueba 10 que tiene
unas vías 12 que proceden y leen en cada una de las cuatro
direcciones. La muestra se añade al pocillo de centro 14 y la
prueba estará completa cuando las cuatro ventanas indicadoras de
finalización 16 cambien de color. Si el análisis se está realizando
de forma adecuada, la parte negativa 18 del signo aparece como
cambio de color para cada uno de los análitos. Si el paciente da
resultados positivos ante alguno de los análitos, entonces la parte
más correspondiente del signo de lectura 20 aparecerá también.
Los dispositivos de las figuras 1 y 2 muestran un
formato preferido para la detección de un solo análito o una
pluralidad de análitos, respectivamente. Dichos dispositivos pueden
prepararse y utilizarse de la siguiente forma.
Oro-KLH. La "Keyhole
limpit hemocyanin" ("KLH") y el oro coloidal se obtienen
de diversas fuentes comerciales, y se conjugan según métodos
standard.
Drogas-oro ovalbúmina. La
ovalbúmina se obtiene en el comercio y se acopla con el análito
deseado así como con oro coloidal. El marcado de la proteína
portadora con oro coloidal se realiza mediante métodos standard. Las
condiciones de la reacción se controlan para garantizar que el oro
coloidal no interfiera con la reacción de fijación de hapteno de la
droga con el anticuerpo antidroga. Se utilizan métodos químicos
similares para preparar conjugados para THC (marihuana),
benzoilecgonina (cocaína), opiáceos (morfina, morfina glucurónica),
anfetamina (anfetamina y metanfetamina).
Reactivos ligados no difusivamente. Los
reactivos se pueden inmovilizar al material absorbente utilizando
técnicas adecuadas como comprenderán fácilmente las personas
versadas en el arte. Como métodos de fijación directa se pueden
mencionar la adsorción no difusiva, a la absorción no difusiva, la
fijación a micropartículas atrapadas a su vez en la posición
adecuada, y enlace covalente, así como utilizando bromuro de
cianógeno, carbonil diimidazol, o glutaraldehido.
"Nodifusivo", tal como se utiliza aquí significa que el
reactivo está suficientemente estable en su posición en las
condiciones del análisis.
Reactivos posicionados difusivamente. Se
utilizan métodos convencionales par impregnar substratos como papel
con biomoléculas de química sea. Estos métodos resultan útiles
para: 1) optimizar la capacidad del substrato; 2) optimizar la
humectabilidad de los reactivos secos; y 3) aumentar la estabilidad
de los reactivos secos.
Cinta indicadora. Se utilizan métodos
convencionales para la preparación de un indicador terminal, por
ejemplo, utilizando un indicador de pH que cambia de color cuando
hay orina.
En una realización del dispositivo, los reactivos
posicionados difusivamente se aplican a la zona de competencia en
las concentraciones adecuadas de forma que se genera una señal
perceptible visualmente en la zona de lectura únicamente cuando la
muestra aplicada al lugar de origen contiene análito en o por
encima de una concentración determinada. Cuando se detectan
múltiples análitos de la misma muestra esta concentración
predeterminada puede ser diferente para cada análito.
El funcionamiento del dispositivo se puede
evaluar, por ejemplo, preparando muestras de una sola droga en
tampones, utilizando concentraciones variables de cada droga. Se
tendrá que comprobar la interreactividad limitada frente a otras
sustancias de abuso así como diversas drogas/fármacos de
prescripción común. Se prueban también muestras multi drogas, con
particular énfasis en la generación de señal y la posible
interferencia de señal. La generación de señal se puede calificar
"visualmente" frente a una carta de color standard.
En una realización, se toma orina humana normal
con dosis variables de las cuatro drogas. Se utilizan un total de 5
fuentes. La evaluación incluye la comparación de: 1) generación de
señal visualmente calificada; 2) tiempo para la terminación de la
prueba; y 3) la presencia de fijación no específica.
El método de la presente invención comprende las
etapas de proporcionar un dispositivo del tipo descrito
anteriormente que comprende un material absorbente, de la siguiente
forma y:
(a) aplicar una muestra acuosa al material
absorbente en el lugar de origen de una o más vías de
circulación,
(b) permitir que la muestra circule
simultáneamente por cada una de las vías de circulación y,
secuencialmente, por una pluralidad de zonas de reactivos
correspondientes que proporcionan los reactivos necesarios para
realizar una lectura visual, un inmunoanálisis competitivo de la
presencia del análito correspondiente, comprendiendo las zonas, en
el orden y el sentido de circulación:
(i) una zona de competencia en comunicación
fluida con el lugar de origen y que comprende un análito -
conjugado detectable y un asociado de fijación para el análito,
estando ambos posicionados difusivamente de modo que todo análito
libre presente en la muestra sea capaz de fijarse al asociado de
fijación de forma competitiva con el conjugado del análito.
(ii) una zona de retención en comunicación fluida
latente con la zona de competencia y que comprende una cantidad en
exceso de un reactivo de captura ligado no difusivamente, capaz de
fijarse a un asociado de fijación libre o ligado para quitarlo de
la circulación continua en la vía de circulación; y
(iii) una zona de lectura en comunicación fluida
con la zona de retención y que comprende un receptor ligado, no
difusivamente, capaz de fijarse al análito - conjugado pero no a un
análito no conjugado, de forma detectable;
(c) permitiendo que la muestra circule a través
de un lugar terminal aguas abajo de las zonas de reactivo
secuenciales y que comprende un reactivo indicador que confirma la
finalización del análisis respectivo,
(d) determinar la presencia de cada análito en la
muestra detectando la presencia del análito - conjugado respectivo
en cada zona de lectura, y evaluando los controles positivo
negativo en cada vía de circulación con el fin de determinar la
realización adecuada del análisis correspondiente.
Claims (15)
1. Dispositivo para la realización de un
inmunoanálisis competitivo, que proporciona una lectura positiva de
la presencia de análito mono epitópico o poli epitópico en una
muestra, dispositivo que comprende un material absorbente, que
ofrece una o más vías de circulación, cada una de las cuales
comprende:
(a) un lugar de origen en el material absorbente
para recibir una muestra de fluido,
(b) una pluralidad de zonas de reactivos que
proceden del lugar de origen y proporcionan los reactivos
necesarios para realizar una lectura visual, un inmunoanálisis
competitivo de la presencia del análito correspondiente,
comprendiendo las zonas, en el orden y sentido de circulación:
(i) una zona de competencia en comunicación
fluida con el lugar de origen, y que comprende un análito -
conjugado detectable y un asociado de fijación para el análito,
estando ambos posicionados de forma que el análito libre presente
en la muestra puede fijarse al asociado de fijación de forma
competitiva con el análito - conjugado.
(ii) una zona de retención en comunicación fluida
latente con la zona de competencia y que comprende una cantidad en
exceso de un reactivo de captura ligado de forma no difusiva, que
puede fijarse a un asociado de fijación libre o ligado para
quitarlo de la circulación continua en la vía de circulación; y
(iii) una zona de lectura en comunicación fluida
con la zona de retención y que comprende un receptor ligado, no de
forma difusiva, capaz de fijarse de forma detectable al conjugado
de un análito y marcador, pero no capaz de fijarse a un análito no
conjugado.
2. Dispositivo para la realización simultánea de
una pluralidad de inmunoanálisis competitivos para proporcionar una
lectura positiva de la presencia de análitos correspondientes en
una muestra, dispositivo que comprende un material absorbente
unitario, que ofrece una o más vías de circulación, cada una de las
cuales comprende:
(a) un lugar de origen común en el material
absorbente para recibir una muestra de fluido,
(b) una pluralidad de zonas de reactivos
correspondientes desde el origen, donde las zonas de reactivos de
cada inmunoanálisis proporciona los reactivos necesarios para
realizar una lectura visual, un inmunoanálisis competitivo de la
presencia del análito correspondiente, comprendiendo las zonas, en
el orden y el sentido de circulación:
(i) una zona de competencia que comprende un
análito - conjugado detectable y un asociado de fijación para el
análito, estando ambos posicionados de forma difusiva, de modo que
todo análito libre presente en la muestra puede fijarse al asociado
de fijación de forma competitiva con el análito - conjugado.
(ii) una zona de retención, que comprende una
cantidad en exceso de un reactivo de captura ligado de forma no
difusiva, que puede fijarse a un asociado de fijación libre o
ligado para quitarlo de la circulación continua en la vía de
circulación; y
(iii) una zona de lectura que comprende un
receptor ligado, no de forma difusiva, capaz de fijar, de forma
detectable, el conjugado de un análito y marcador, aunque no capaz
de fijarse a un análito no conjugado.
3. Dispositivo según la reivindicación 2, que
proporciona una vía de circulación separada, discreta, para cada
análito, estando situadas las vías de circulación de forma que se
extienden en sentido radial desde el origen común.
4. Dispositivo según la reivindicación 2 ó 3, en
el que el análisis puede detectar de forma diferencial la
presencia de dos o más fármacos / drogas en una sola muestra de
orina o suero.
5. Dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además una o más zonas
de control de procedimiento positivas y/o negativas en comunicación
fluida con una o más zonas de reactivos.
6. Dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la zona de control positivo
comprende un lugar terminal, aguas abajo de las zonas de reactivos
secuenciales y comprende un reactivo indicador para confirmar la
finalización del análisis correspondiente
7. Dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además un receptáculo
inerte, con una parte superior e inferior para soportar el material
absorbente, ofreciendo la parte superior una abertura para el
acceso de la muestra de fluido al origen común, así como unas
aberturas para ver la lectura respectiva y unos lugares indicadores
terminales a lo largo de cada vía de circulación.
8. Dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende unos medios para
retardar la circulación capilar de la muestra desde la zona de
competencia a la zona de retención.
9. Dispositivo según la reivindicación 8, en el
que el dispositivo de retardo se elige dentro del grupo formado por
una barrera física disoluble, una barrera física permeable, y un
material expandible.
10. Dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se elige un análito dentro
del grupo formado por tetrahidrocannabinol, cocaína, opiáceos y
anfetaminas.
11. Dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que se utiliza una mitad
espaciadora par conjugar el análito con el marcador, y el receptor
ligado de modo no difusivo es capaz de fijarse a la mitad
espaciadora.
12. Dispositivo según la reivindicación 11, donde
el marcador comprende una partícula metálica coloidal.
13. Método de realización de un inmunoanálisis
competitivo para proporcionar una lectura positiva de la presencia
de un análito mono epitópico o poli epitópico en una muestra,
método que comprende las etapas de:
(a) disponer un dispositivo que comprende un
material absorbente que tiene un lugar de origen y una o más vías
de circulación, que comprende cada una de ellas, una zona de
reactivos correspondiente que proporciona los reactivos necesarios
para realizar una lectura visual, un inmunoanálisis competitivo de
la presencia del análito correspondiente,
(b) y aplicación de una muestra acuosa al lugar
de origen,
(c) permitir que la muestra circule
simultáneamente por cada una de las vías de circulación y
secuencialmente por la zona de reactivos correspondiente que
proporciona los reactivos necesarios para realizar una lectura
visual, un inmunoanálisis competitivo de la presencia del análito
correspondiente, comprendiendo las zonas, en el orden y en el
sentido de circulación:
(i) una zona de competencia en comunicación
fluida con el lugar de origen, y que comprende un análito -
conjugado detectable y un asociado de fijación para el análito,
estando ambos posicionados de forma que el análito libre presente
en la muestra puede fijarse al asociado de fijación de forma
competitiva con el análito - conjugado.
(ii) una zona de retención en comunicación fluida
latente con la zona de competencia y que comprende una cantidad en
exceso de un reactivo de captura ligado de forma no difusiva, que
puede fijarse a un asociado de fijación libre o ligado para
quitarlo de la circulación continua en la vía de circulación; y
(iii) una zona de lectura en comunicación fluida
con la zona de retención y que comprende un receptor ligado, no de
forma difusiva, capaz de fijarse de forma detectable al conjugado
de un análito y marcador, pero no capaz de fijarse a un análito no
conjugado.
(d) permitir que la muestra circule a través de
un lugar terminal aguas abajo de las zonas de reactivos
secuenciales y que comprende un reactivo indicador para confirmar
que se ha finalizado el análisis correspondiente.
(e) determinar la presencia de cada análito en la
muestra detectando la presencia del análito - conjugado
correspondiente en cada zona de lectura, y evaluando la
finalización del análisis en cada vía de circulación con el fin de
determinar la realización adecuada del análisis correspondiente.
14. Método para realizar simultáneamente una
pluralidad de inmunoanálisis competitivos para detectar la
presencia de análitos mono epitópicos o poli epitópicos
correspondientes en una muestra, comprendiendo el método las etapas
siguientes de ofrecer un dispositivo que comprende:
(a) un lugar de origen común sobre el material
absorbente para recibir una muestra de fluido,
(b) una pluralidad de zonas de reactivos
correspondiente aguas abajo del origen, donde las zonas de
reactivos de cada inmunoanálisis proporcionan los reactivos
necesarios para realizar una lectura visual, un inmunoanálisis
competitivo de la presencia del análito respectivo, comprendiendo
las zonas, en el orden y el sentido de la circulación:
(i) una zona de competencia en comunicación
fluida con el lugar de origen, y que comprende un análito -
conjugado detectable y un asociado de fijación para el análito,
estando ambos posicionados de forma que el análito libre presente
en la muestra puede fijarse al asociado de fijación de forma
competitiva con el análito - conjugado.
(ii) una zona de retención en comunicación fluida
latente con la zona de competencia y que comprende una cantidad en
exceso de un reactivo de captura ligado de forma no difusiva, que
puede fijarse a un asociado de fijación libre o ligado para
quitarlo de la circulación continua en la vía de circulación; y
(iii) una zona de lectura en comunicación fluida
con la zona de retención y que comprende un receptor ligado, no de
forma difusiva, capaz de fijarse de forma detectable al conjugado
de un análito y marcador, pero no capaz de fijarse a un análito no
conjugado.
comprendiendo el método las etapas de:
(a) aplicar una muestra acuosa al material
absorbente unitario en un lugar de origen común de una o más vías
de circulación,
(b) permitir que la muestra circule
simultáneamente por cada una de las vías de circulación y
secuencialmente por una pluralidad de zonas de reactivos
correspondientes que proporcionan los reactivos necesarios para
realizar una lectura visual, un inmunoanálisis competitivo de la
presencia del análito correspondiente.
15. Método según la reivindicación 14, que puede
realizar simultáneamente una pluralidad de inmunoanálisis para
detectar la presencia de análitos correspondientes en una muestra,
donde la presencia de cantidades cada vez mayores de análito libre
en una muestra conduce a la fijación de menos análito - conjugado
al asociado de fijación.
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