ES2245411T3 - Composicion que comprende una cepa de lactobacillus pentosus y usos de la misma. - Google Patents

Abstract

Una cepa de Lactobacillus depositada con el número de registro NCIMB 41114. Según una aspecto de la invención, se proporciona una cepa de Lactobacillus pentosus que tiene el número de depósito NCIMB 41114. Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un cultivo biológicamente puro de una cepa de Lactobacillus que tiene todas las características indentificadoras de la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114. Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una composición nutricional o farmacéutica que comprende la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114. Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una composición o kit nutricional o farmacéutica que comprende la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114 y un antibiótico. Según otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114 como medicamento.

Description

Composición que comprende una cepa de Lactobacillus pentosus y usos de la misma.

Campo de la invención

La invención se refiere a una nueva cepa probiótica de Lactobacillus pentosus a composiciones comestibles y farmacéuticas que incorporan dicha bacteria y a aplicaciones médicas de la bacteria para promover un buen estado de salud, en particular para estimular el sistema inmunológico, para combatir Candidiasis, para facilitar la digestión en general, y para aliviar los síntomas del Síndrome del Intestino Irritable (IBS).

Antecedentes de la invención

La microflora intestinal residente sana comprende una multitud de bacterias beneficiosas, predominantemente miembros de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium. El equilibrio de microorganismos puede resultar perturbado por infección, por alteración de la dieta, a través del tratamiento con antibióticos y por estrés o trauma fisiológico. Cuando esto ocurre, puede dispararse un número de reacciones adversas. Los modelos digestivos pueden resultar alterados, con aparición de diarrea, estreñimiento y otros síntomas de irritabilidad del intestino. El sistema inmunológico puede verse comprometido, con la consecuente menor resistencia a enfermedades infecciosas. Las bacterias u hongos patógenas se apoderan, formando colonias, del sistema digestivo u otras partes del cuerpo.

Tradicionalmente, los productos lácteos fermentados, tales como yogures, han sido considerados como alimentos sanos capaces de reconfortar el sistema digestivo; esta observación se explica ahora por la presencia de bacterias lácticas. Los microorganismos tales como Lactobacilos y Bifidobacterias que pueden mejorar la salud se conocen como "probióticos". Investigaciones realizadas han demostrado que microorganismos probióticos particulares pueden influenciar la composición de la microflora intestinal al competir con bacterias y levaduras patógenas. También se ha alegado que los microorganismos probióticos promueven la curación de la mucosa intestinal, por ejemplo en pacientes con alergia a la leche, al reducir la permeabilidad del intestino y aumentar las respuestas inmunológicas intestinales locales. El uso de probióticos ha sido propuesto para la profilaxis y tratamiento de diarrea y para aumentar la recuperación de la flora comensal después de la terapia con antibióticos. En pruebas clínicas con probióticos se ha demostrado también la actividad anticarcinógena de los mismos.

Varios productos lácteos "vivos" existentes en el mercado son reivindicados como conteniendo recuentos particularmente elevados de ciertas especies probióticas de Lactobacilos y Bifidobacterias para favorecer la digestión y promover un sistema inmunológico sano. Sin embargo, la variedad completa de efectos probióticos deseables sólo es exhibida por unas cuantas cepas seleccionadas de bacterias. Igualmente, ha de tenerse en cuenta que la capacidad de supervivencia de una cepa en el tracto gastrointestinal (GI) resulta crucial para la eficacia biológica de dicha cepa in situ. Con el fin de que la cepa se implante y establezca por sí misma en el intestino, idealmente deberá adherirse a la superficie mucosal del tracto GI y ser capaz de sobrevivir a los rigores del tránsito, tal como la exposición a los ácidos del estómago y biliares.

La presente invención se refiere a una nueva cepa probiótica de Lactobacillus, denominada Lactobacillus pentosus LPK, que fue depositada el 28 de agosto de 2001 a tenor del Tratado de Budapest en el NCIMB, Aberdeen, UK y que recibió el número de registro NCIMB 41114. Además de exhibir las características típicas de Lactobacilos en general, esta cepa tiene otra propiedad sorprendente: es capaz de suprimir el desarrollo de especies de Candida en un grado jamás conseguido anteriormente por medio del uso de un probiótico. Por otro lado, la tetraciclina y antibióticos relacionados no tienen efecto sobre el desarrollo de esta cepa. Esta combinación única de propiedades puede ser aprovechada para combatir el desarrollo indeseable de Candida en cualquier región del cuerpo. En particular, puesto que Candida es considerada como un factor causativo en el Síndrome del Intestino Irritable (IBS), queda contemplado que esta nueva cepa de L. pentosus podría utilizarse en el tratamiento o prevención de dicho trastorno.

Resumen de la invención

Según una aspecto de la invención, se proporciona una cepa de Lactobacillus pentosus que tiene el número de depósito NCIMB 41114.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un cultivo biológicamente puro de una cepa de Lactobacillus que tiene todas las características indentificadoras de la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una composición nutricional o farmacéutica que comprende la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114.

Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una composición o kit nutricional o farmacéutica que comprende la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114 y un antibiótico.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114 como medicamento.

Según otro aspecto más de la invención, se proporciona el uso de la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114 en la preparación de un medicamento o formulación nutricional para favorecer una microflora intestinal sana; y para la profilaxis o tratamiento de: infecciones bacterianas o por levaduras; Candidiasis; diarrea u otras perturbaciones gastrointestinales; Síndrome de Intestino Irritable o síntomas del mismo; y un sistema inmunológico debilitado.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para aislar una cepa probiótica de bacterias de ácido láctico, que comprende desarrollar un cultivo de células fecales en presencia de un nivel bactericida de tetraciclina, y recoger las células bacterianas viables de ácido láctico a partir del cultivo; y una cepa bacteriana de ácido láctico obtenida por este procedimiento.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra el crecimiento en co-cultivo de Candida albicans (\blacksquare) y L. pentosus NCIMB 41114 (\blacklozenge) y el crecimiento en cultivo puro de Candida albicans (\blacktriangle) bajo las mismas condiciones y en medios idénticos.

Descripción detallada de la invención

La nueva cepa de L. pentosus que constituye la materia objeto de la presente invención fue aislada a partir de un cultivo fecal obtenido de un individuo adulto sano y cultivada en presencia de tetraciclina.

Dos observaciones sorprendentes e inesperadas condujeron al descubrimiento y aislamiento de este microorganismo. En primer lugar, la cepa de Lactobacillus de la invención, y dicha cepa bacteriana por sí sola, sobrevivieron y prosperaron en medio que contiene tetraciclina, un antibiótico de amplio espectro que destruyó todas las otras bacterias lácticas de los cultivos. En segundo lugar, aunque Candida estaba presente en la mayoría de los cultivos fecales desde el inicio, el crecimiento de esta levadura se atascó en presencia del Lactobacillus de la invención. En contraste, en cultivos fecales que carecen de la nueva cepa de la invención, Candida creció para dominar el nicho dejado por las bacterias destruidas por tetraciclina.

La nueva bacteria de la invención y las composiciones que comprenden esta bacteria son en general beneficiosas para la salud y bien toleradas por personas de todas las edades. L. pentosus NCIMB 41114 se puede emplear profiláctica o terapéuticamente en personas sanas para protegerse contra dolencias pequeñas tales como estómago desarreglado, gastritis, úlceras gástricas, diarrea suave (incluyendo diarrea asociada con antibióticos), modelos digestivos irregulares, pirosis y otras complicaciones digestivas. La población en general puede verse también beneficiada por efectos tales como favorecimiento de una microflora intestinal sana, estimulación inmunológica, prevención del cáncer, estimulación del crecimiento óseo y reducción del colesterol. La nueva bacteria de la invención puede ser también particularmente beneficiosa para pacientes hospitalizados, individuos que residen en sanatorios, personas inmunocomprometidas, pacientes que se encuentran en tratamiento con antibióticos, así como niños, por ejemplo, niños recién nacidos. Por ejemplo, la bacteria de la invención se puede emplear también para hacer que la microflora de niños sea más similar a la microflora de los que toman leche materna.

La bacteria de la invención se puede emplear también para reconocer estados de enfermedad particulares, en especial como una alternativa al tratamiento con fármacos o en combinación con el tratamiento con fármacos. Por ejemplo, a través del consumo de la bacteria de la invención se puede curar o aliviar diarrea infantil (por ejemplo, aquella causada por rotavirus), cólera, disentería e infecciones con Shigella, E. coli 01587:H7, Clostridium difficile and Salmonella. Para personas que están inmunocomprometidas por cualquier motivo (por ejemplo, después de quimioterapia, leucemia, VIH/SIDA, etc.), la ingestión de L. pentosus NCIMB 41114 puede ser un tratamiento profiláctico y terapéutico muy útil para prevenir o suprimir infecciones por microorganismos patógenos.

Debido a que L. pentosus LPK es resistente a tetraciclina y antibióticos relacionados, los beneficios probióticos de consumir o aplicar este microorganismo siguen existiendo durante el tratamiento con antibióticos.

Una ventaja importante de esta especie de Lactobacillus respecto de otros Lactobacilli conocidos es que la cepa es capaz de combatir el crecimiento excesivo de levaduras, especialmente infecciones por Candida. Las infecciones por Candida se encuentran habitualmente en ciertas categorías de individuos susceptibles, incluyendo individuos que se encuentran en sanatorios, pacientes inmunocomprometidos tales como pacientes positivos a VIH o pacientes con SIDA, pacientes sometidos a radioterapia, quimioterapia y transplante de médula ósea, pacientes hospitalizados expuestos a Candida, niños recién nacidos, mujeres que toman píldoras anticonceptivas y cualquier persona que esté siendo tratada con antibióticos. La Candidiasis puede ser causada por Candida parapsilosis, Candida tropicalis o Torulopsis glabrata, pero habitualmente es causada por Candida albicans.

Candida albicans puede infectar la boca (afta oral), tracto urinario, vagina (afta vaginal o vaginitis), esófago, tracto intestinal y la piel (por ejemplo, sarpullido por pañales), dando lugar a irritación, inflamación y otros síntomas. Estas infecciones son curadas generalmente a través del tratamiento con agentes antifúngicos. También se ha postulado el sobrecrecimiento de Candida en IBS. Los tratamientos actuales de IBS consisten principalmente en el uso de preparados farmacéuticos dirigidos a aliviar los síntomas, más que la causa subyacente del trastorno. Aunque se ha indicado que ciertas cepas de bacterias probióticas tienen actividad anti-Candida, el nivel aparente de actividad no ha sido lo suficientemente alto para merecer un gran interés entre los gastroenterólogos como un tratamiento terapéutico potencial. Debido a la capacidad sorprendente de L. pentosus LPK, es decir, la cepa NCIMB 41114, para suprimir el desarrollo de Candida, la presente invención constituye un enfoque prometedor en el tratamiento y prevención de infecciones por Candida.

De este modo, según un aspecto de la invención, se puede emplear la administración de una cantidad eficaz de la cepa de Lactobacillus en un método para prevenir o tratar cualquiera de: infecciones bacterianas o por levaduras; Candidiasis, en particular infecciones del tracto urinario, por ejemplo, infecciones urinarias, afta; diarrea u otras perturbaciones gastrointestinales; Síndrome del Intestino Irritable o síntomas del mismo; y un sistema inmunológico debilitado. La nueva bacteria de la invención se puede emplear también en un método para favorecer el desarrollo de una microflora intestinal sana.

En una modalidad de la invención, se proporciona un método para el tratamiento o prevención de: infecciones por bacterias o levaduras, por ejemplo infecciones por Candida, infecciones urinarias, afta, Síndrome del Intestino Irritable (IBS) o sus síntomas, diarrea u otras perturbaciones gastrointestinales, que comprende administrar, a un sujeto necesitado de dicho tratamiento, una cantidad eficaz de una composición que comprende la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114 viva, atenuada o muerta.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para promover una microflora intestinal sana y para estimular el sistema inmunológico, que comprende administrar, a un sujeto necesitado de dicho tratamiento, una cantidad eficaz de una composición que comprende la cepa de Lactobacillus pentosus NCIMB 41114 viva, atenuada o muerta.

Las composiciones nutricionales o farmacéuticas de la invención que comprenden L. pentosus NCIMB 41114 se pueden administrar por vía enteral, por ejemplo, oral, parenteral, o por contacto físico con la piel o membranas mucosas. Las composiciones nutricionales o farmacéuticas de la invención se pueden administrar directamente al intestino, por ejemplo, a través de un tubo o catéter.

La cepa de L. pentosus de la invención se puede cultivar a gran escala y utilizarse terapéuticamente en forma liofilizada, secada por congelación o hidratada. La nueva bacteria de la invención se puede administrar también en combinación con una sustancia vehículo farmacéuticamente aceptable o matriz nutritiva.

En el caso de un preparado farmacéutico, el producto se puede proporcionar en forma de comprimidos, cápsulas, implantes, supositorios, pesarios, por ejemplo pesarios vaginales, polvo, soluciones, gel, suspensiones bacterianas líquidas y similares. Las formas de lenta liberación pueden ser particularmente convenientes. En una modalidad de la invención, la nueva cepa de L. pentosus se administra como terapia auxiliar a un curso de tratamiento antibacteriano con antibióticos (por ejemplo, tetraciclina), con el fin de mitigar los riesgos y efectos secundarios de los antibióticos. Para este fin, el antibiótico y la bacteria se pueden formular de forma conjunta en una única forma de dosificación. Alternativamente, las bacterias y el antibiótico o antibióticos se pueden proporcionar en forma de un kit, para su uso por separado, simultáneo o secuencial. Otra opción consiste en co-administrar L. pentosus NCIMB 41114 y un agente antifúngico, tal como aquellos tradicionalmente utilizados para tratar Candidiasis, incluyendo fluconazol, itraconazol y cotrimazol. Estos dos componentes funcionan juntos para combatir el crecimiento fúngico y se pueden disponer en una única forma de dosificación o en forma de un kit para su administración por separado, simultánea o secuencial.

Cuando ha de administrarse L. pentosus NCIMB 41114 en formato nutricional, la misma se puede añadir a cualquier producto alimenticio o bebida, en particular productos lácteos refrigerados, congelados o de larga vida de conservación, tales como leche, polvos a base de leche, yogur, kéfir, helado, ponches de leche y huevo, queso, crema, cuajada, leches fermentadas y productos fermentados a base de leche, así como también productos de soja, productos fermentados a base de cereales, productos alimenticios para untar, productos de panadería, productos nutricionales completos, formulaciones de alimentación por tubo y fórmulas infantiles. También es posible suministrar la bacteria en formatos comestibles adecuados para alimentar animales, tales como caballos y animales de compañía.

Con frecuencia, es preferible cultivar la cepa bacteriana de la invención sobre un sustrato fermentable tal como leche, o sustratos que contienen almidón tal como gachas de cereales, y utilizar luego el producto fermentado en una composición nutricional, por ejemplo, un alimento o bebida.

En una composición nutricional, por ejemplo, formulaciones de alimentos o bebidas, el producto puede comprender uno o más componentes nutricionales seleccionados entre grasa, proteína, carbohidrato, fibra, minerales y vitaminas, además de la bacteria de L. pentosus LPK. A la vista de la importancia de la fibra a la hora de regular la digestión, es preferible incluir fibra de algún tipo en un producto nutricional o farmacéutico de la invención. Se sabe que las bacterias probióticas son estimuladas para proliferarse cuando se proporcionan con sustratos de fibra dietética, conocidos como componentes "prebióticos". Esto presenta las ventajas de favorecer la colonización del tracto GI y sustentar la vitalidad del cultivo incluso después de terminar el consumo del probiótico. Por tanto, en una modalidad preferida de la invención, la cepa probiótica de la invención se administra junto con un sustrato prebiótico, bien en una única forma de dosificación común, o bien como un kit de componentes para administración simultánea, por separado o secuencial.

Aunque la nueva cepa de L. pentosus es capaz por sí misma de aportar beneficios para la salud, también existe la posibilidad de co-administrar esta bacteria con cualesquiera otras bacterias conocidas por tener propiedades probióticas.

La cepa se añade preferentemente a un producto alimenticio o vehículo farmacéutico en una cantidad de alrededor de 10^{5} cfu/g a 10^{11} cfu/g, con preferencia de alrededor de 10^{6} cfu/g a 10^{10} cfu/g y con suma preferencia de alrededor de 10^{7} cfu/g a 10^{9} cfu/g del vehículo. Es preferible administrar la cepa bacteriana en forma viva, pero antes de su consumo la bacteria puede ser atenuada o sacrificada.

Habitualmente, la administración de al menos 10^{4} cfu/día de la cepa de la invención resultará clínicamente eficaz. Las dosis diarias más preferidas son del orden de 10^{6} a 10^{12} cfu/día. Con suma preferencia son de 10^{7} a 10^{10} cfu/día.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de la cepa de L. pentosus LPK (NCIMB 41114)

(i) Sistema de cultivo continuo: Se dispusieron tres quimiostatos en un paralelo; cada uno se mantuvo bajo gas nitrógeno a 37ºC, pH 6,5, y una velocidad de dilución de 0,066 h^{-1}. Estas condiciones fueron establecidas para simular las condiciones habitualmente encontradas en la región distal del colon humano. Los quimiostatos se alimentaron con un medio de crecimiento de control que comprendía (gl^{-1} en agua destilada): extracto de levadura 2, peptona-agua 2, NaCl 0,1, K_{2}HPO_{4} 0,04, KH_{2}PO_{4}0,04, MgSO_{4}. 7H_{2}O 0,01, CaCl_{2}.H_{2}O 0,01, NaHCO_{3} 2, Tween 80 2, hemina 0,05, Vitamina K1 0,01, cisteina.HCl 0,5, sales biliares 0,5, glucosa 0,4, almidón 3, pectina 2 y arabinogalactano 1. El medio fue autoclaveado a 121ºC durante 30 minutos y, mientras estaba todavía caliente, se colocó bajo gas nitrógeno. Una vez que ha enfriado el medio, se añadió asépticamente, al recipiente del medio, 1 gl^{-1} de tetraciclina esterilizada por filtración o 1 gl^{-1} de nistatina esterilizada por filtración. Se emplearon también quimiostatos de control sin añadir antimicrobianos.

(ii) Inoculación: Se obtuvieron muestras fecales recientemente evacuadas de voluntarios sanos (n=6) y se prepararon anaeróbicamente suspensiones espesas al 10% (p/v) empleando 0,1 moll^{-1} de tampón fosfato pH 7 (26). Ninguno de los voluntarios tenía una historia previa de trastorno gastrointestinal y no habían tomado antibióticos durante al menos 3 meses antes del estudio. Los recipientes de los quimiostatos de 300 ml se llenaron hasta la mitad con medio y a cada recipiente se añadieron 150 ml de la suspensión. El sistema se dejó entonces durante 24 horas para que alcanzara el equilibrio antes de poner en marcha las bombas de medio. El experimento se repitió con 6 donantes de heces diferentes por triplicado para cada uno de ellos.

(iii) Técnicas de cultivo microbiano: Se tomó una muestra de cada suspensión fecal utilizada como inóculo y se retiraron también muestras de 1 ml de cada quimiostato cuando el sistema de fermentación había alcanzado un estado de equilibrio (después de 164 horas). Dichas muestras fueron entonces diluidas en serie (6 veces) con agua de peptona con una concentración reducida previamente a la mitad. Cada dilución se depositó, por triplicado, sobre agares reducidos (bajo una atmósfera anaeróbica, 10% CO_{2}, 10% H_{2}, 80% CO_{2}, a 37ºC) destinados a seleccionar los grupos predominantes de bacterias intestinales: Wilkins Chalgren (Oxoide) para el total de anaerobios, Rogosa (Oxoide) para lactobacilos, Beerens para bifidobacterias, KVLB para bacteroides, agar de Clostridios reforzado (Oxoide) + novobocina 8 mg/l y colostina 8 mg/l para clostridios y agar de Azida (Oxoide) para cocos Gram-postivos. Cada dilución se depositó entonces aeróbicamente sobre Agar Nutriente (Oxoide) para seleccionar el total de aerobios, agar de dextrosa Sabouraud + cloranfenicol y ciclohexamida para levadura y agar de MacConkey No.3 (Oxoide) para coliformas y se incubó a 37ºC. Después de 24-48 horas de incubación, se contaron las colonias aeróbicas y después de 48-72 horas de incubación, se enumeraron las placas anaeróbicas. También se recogieron de las placas colonias con diferentes morfotipos para proceder a la mancha gram, examen microscópico y caracterización fenotípica (bioquímica) para confirmar identidades en el cultivo.

Resultados: Después de alcanzar condiciones de régimen constante en los quimiostatos de control se mantuvieron números de microorganismos intestinales predominantes en los seis inóculos utilizados. Esto confirmó que el medio de crecimiento utilizado era eficaz a la hora de sustentar dichas poblaciones en los experimentos de cultivo continuo. Por tanto, cualesquiera diferencias en los perfiles resultantes de la exposición al antibiótico se debieron auténticamente a dichas adiciones más que a cualquier variación experimental. Se detectaron levaduras en 4 de las 6 muestras fecales ensayadas.

El efecto de la tetraciclina consistió en reducir de forma notable las poblaciones de todas las bacterias ensayadas, en comparación con los controles, confirmando ello su amplio espectro de actividad. Una observación importante fue que el efecto de la tetraciclina permitió el incremento de las levaduras en los sistemas de fermentación en comparación con los niveles de los quimiostatos de control. Esto tiene implicaciones clínicas para el uso de tetraciclina y riesgos asociados con el sobrecrecimiento de levaduras. De hecho, en uno de los inocuos aquí empleados, inicialmente no se detectaron levaduras, pero se presentó un enriquecimiento de las mismas durante los quimiostatos con tetraciclina.

Como cabría esperar, las levaduras resultaron inhibidas en los quimiostatos con nisatina. Sin embargo, también fueron afectados ciertos géneros bacterianos. Principalmente, esto implicó una reducción de lactobacilos que son microorganismos probióticos comunes considerados como importantes para la salud gastrointestinal. La indicación clara es que el uso de nistatina no es conducente para el mantenimiento de niveles probióticos indígenos.

Durante los experimentos con quimiostatos de tetraciclina, una de las pruebas dio lugar a un resultado inesperado. Estaban presentes levaduras al comienzo del experimento pero, en contra de la tendencia general observada, no crecieron más. En su lugar se detectó un bastón Gram-positivo predominantemente sin otros tipos de células. Por tanto, para identificar este microorganismo se llevó a cabo un trabajo genotípico.

(iv) Aislamiento y amplificación de 16S rRNA: se extrajo el DNA total del Lactobacillus empleando una Matriz InstaGene (Biorad, Hemel Hempstead, Hertfordshire, UK) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los genes 16S rRNA fueron amplificados entonces mediante PCR empleando cebadores conservados próximos a los extremos 3' y 5' del gen. El fragmento amplificado correspondía a las posiciones -30 a -1500 del gen 165 rRNA de Escherichia coli. En un volumen final de 50 \mul, la mezcla de reacción contenía cebadores de la amplificación, deoxinucleósido trifosfatos premezclados, MgCl_{2}, molde y Taq DNA polimerasa, la cual se añadió después de una etapa de preciclación en donde la mezcla de reacción se calentó a 96ºC durante 4 minutos y luego se mantuvo a 0ºC. Las condiciones de la amplificación PCR fueron de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 55ºC y 1,5 minutos a 72ºC para 30 ciclos. Después del ciclo final, la reacción se extendió a 72ºC durante 10 minutos y luego se mantuvo a 10ºC. Los productos de la amplificación fueron visualizados por electrofóresis a través de un gel de agarosa al 1% (p/w). En 1xTAE (40 mM Trisacetato 1 mmol 1^{-1} EDTA conteniendo bromuro de etidio (0,5 \mug ml^{-1}). Los productos de reacción que mostraron bandas correspondientes a los productos del tamaño correcto (1500 pares de bases para cebadores pA-pH) fueron purificados empleando el kit de purificación QIA-quick PCR (QIAGen, Crawley, West Sussex, UK).

(v) Secuenciación de rRNA: Para la secuenciación de productos PCR, se reconocieron aproximadamente 1500 nucleótidos proximales al extremo 5' del rRNA empleando un kit de secuenciación de ciclos terminadores dRhodamine kit (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City California, USA) y un secuenciador automático de DNA modelo 377 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City California, USA). Las secuencias generadas fueron comparadas con las secuencias del gen 16S rRNA disponibles en la base de datos GenBank/EMBL empleando el programa FASTA y el Ribosomal Database Project (RDP) para generar el porcentaje de puntos de identidad con otras especies bacterianas.

Resultados: De las 1600 bases de este gen se secuenciaron aproximadamente 1500, demostrándose que el organismo era parejo con respecto a Lactobacillus pentosus y Lactobacillus plantarum, los cuales son similares filogenéticamente.

Posteriormente, se depositó L. pentosus LPK de acuerdo con el Tratado de Budapest el 28 de agosto de 2001 en el NCIMB, Aberdeen, UK, recibiendo el número de registro NCIMB 41114.

Ejemplo 2 Interacciones entre Lactobacillus aislado y Candida albicans

Experimento 1

Se hicieron crecer durante la noche Candida albicans y un Lactobacillus aislado de los quimiostatos, en un caldo de Dextrosa Sabouraud (Oxoide) y caldo MRS (Oxoide) respectivamente. Se inoculó entonces 1 ml de cada uno de ellos en un fermentador discontinuo de 750 ml que contiene los siguientes constituyentes en el (gl^{-1} en agua destilada): extracto de levadura 2, agua de peptona 2, NaCl 0,1, K_{2}HPO_{4} 0,04, KH_{2}PO_{4}0,04, MgSO_{4}.7H_{2}O 0,01, CaCl_{2}.H_{2}O 0,01, NaHCO_{3} 2, Tween 80 2, cisteina.HCl 0,5 y glucosa. El medio fue autoclaveado a 121ºC durante 30 minutos y, mientras estaba todavía caliente, se colocó bajo gas nitrógeno. La fermentación de co-cultivo se mantuvo anaeróbicamente a 37ºC y pH 6,5. Se tomaron muestras regulares durante 48 horas y se enumeraron microscópicamente los números de células. La identidad de cultivo se confirmó a través de una combinación de rasgos fenotípicos y bioquímicos. Al término de la fermentación, se retiró 1 ml del fermentador, se diluyó en serie y se depositó sobre agares de MRS y Dextrosa Sabouraud y se incubó anaeróbicamente durante 48 horas.

Experimento 2

Se hicieron crecer durante la noche Candida albicans y el Lactobacillus aislado en caldos de Dextrosa Sabouraud y de MRS respectivamente. Se vertieron seis placas de agar MRS (2% p/v) hasta una profundidad uniforme y se redujeron anaeróbicamente. El cultivo de Lactobacillus aislado fue listado entonces sobre cada una de las placas. Se mantuvieron a 50ºC 7 ml de agar de Dextrosa Sabouraud (0,7% p/v) y se inoculó con 50 \mul del cultivo de C. albicans. Se vertió esto entonces uniformemente sobre las placas listadas con el cultivo de Lactobacillus. Las placas fueron incubadas anaeróbicamente durante 48 horas a 37ºC y se examinaron respecto a las zonas de inhibición. Ambos experimentos se repitieron 6 veces. (Salvo que se indique otra cosa, todos los productos químicos fueron adquiridos en Sigma Chemical Co.).

En el Experimento 1, esta nueva cepa de Lactobacillus creció bien e inhibió el crecimiento de Candida, restringiéndola a los niveles de inoculación (Figura 1). En el Experimento 2, se presentaron grandes zonas de inhibición por encima de las colonias de Lactobacillus en donde Candida había sido incapaz de crecer (datos no mostrados). La resistencia de esta cepa al ataque antimicrobiano y su poderoso antagonismo hacia Candida spp. es de relevancia para el posible mantenimiento de la función intestinal durante la terapia para estados tal como IBS.

En base a estos experimentos, puede anticiparse que el microorganismo se puede aplicar como un auxiliar o alternativa a la terapia convencional para estados relacionados con levaduras, tales como afta e IBS.

Claims (16)

1. Una cepa de Lactobacillus depositada con el número de registro NCIMB 41114.

2. Un cultivo biológicamente puro de una cepa de Lactobacillus que tiene todas las características de identificación de la cepa de Lactobacillus NCIMB 41114.

3. Una composición nutricional o farmacéutica que comprende la cepa de Lactobacillus NCIMB 41114 viva, atenuada o muerta y un vehículo convencional.

4. Una composición según la reivindicación 3, que comprende de 10^{5} a 10^{11} cfu de la cepa de Lactobacillus NCIMB 41114 por gramo de la composición.

5. Una composición según la reivindicación 3 ó 4 en forma de un comprimido, cápsula, implante, supositorio, pesario, polvo, solución, gel o suspensión bacteriana líquida.

6. Una composición o kit nutricional o farmacéutica que comprende la cepa de Lactobacillus NCIMB 41114 y un antibiótico.

7. Una composición o kit farmacéutica según la reivindicación 6, en donde el antibiótico es tetraciclina o un antibiótico relacionado.

8. Una composición o kit farmacéutica según la reivindicación 6, en donde el antibiótico es un agente antifúngico.

9. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 que en una dosis diaria proporciona de 10^{6} a 10^{12} cfu de la cepa de Lactobacillus NCIMB 41114.

10. La cepa de Lactobacillus NCIMB 41114 de utilidad como medicamento.

11. Uso de la cepa de Lactobacillus NCIMB 41114 en la preparación de un medicamento o formulación nutricional para la profilaxis o tratamiento de infecciones por bacterias o levaduras.

12. Uso de la cepa de Lactobacillus NCIMB 41114 en la preparación de un medicamento o formulación nutricional para la prevención o tratamiento de Candidiasis.

13. Uso de la cepa de Lactobacillus NCIMB 41114 en la preparación de un medicamento o formulación nutricional para promover una microflora intestinal sana y para prevenir o tratar el Síndrome del Intestino Irritable o sus síntomas.

14. Uso de la cepa de Lactobacillus NCIMB 41114 en la preparación de un medicamento o formulación nutricional para la prevención o tratamiento de diarrea u otras perturbaciones gastrointestinales.

15. Uso de la cepa de Lactobacillus NCIMB 41114 en la preparación de un medicamento o formulación nutricional para estimular el sistema inmunológico.

16. Una cepa de Lactobacillus según la reivindicación 1 obtenida mediante un procedimiento que comprende hacer crecer un cultivo de células fecales en presencia de un nivel bactericida de tetraciclina, y recoger del cultivo las células bacterianas de ácido láctico viables.