ES2245510T3 - Inhibidores de proteasa derivados de tuberculos o raices para prevenir o tratar la inflamacion o el prurito. - Google Patents

Inhibidores de proteasa derivados de tuberculos o raices para prevenir o tratar la inflamacion o el prurito.

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Abstract

Uso de un inhibidor derivado de tubérculo o raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreática y de granulocitos para preparar una composición farmacéutica para reducir o prevenir la inflamación causada por las heces.

Description

Inhibidores de proteasa derivados de tubérculos o raíces para prevenir o tratar la inflamación o el prurito.
La invención se refiere a medios para prevenir, tratar o reducir la inflamación mediante la inhibición de la actividad proteolítica, más específicamente para prevenir o reducir inflamaciones de la piel o el intestino.
Las inflamaciones de la piel (dermatitis) o del intestino (enteritis) tienen son de naturaleza diversa. Inicialmente, las reacciones alérgicas, infecciones con microorganismos (patógenos), excoriación por medios químicos o físicos, y otras causas son instrumentos de una inflamación. Estos acontecimientos causales se siguen inmediatamente con la reacción necesaria del organismo, lo que tiene como resultado una interacción de acciones y acontecimientos dirigidos a la restauración de la piel o el intestino a su estado original. En esta interacción de causa y efecto, se observan varias actividades de encimas proteolíticas. Los granulocitos, los mastocitos, los macrófagos y otros intermediarios de las respuestas inflamatorias y atraídos por las citoquinas hacia un punto de inflamación contienen (y secretan) proteasas, tales como proteasa quimotríptica y elastasa, que actúan como mediadores o son instrumentos en la escisión y eliminación de proteínas derivadas de patógenos o del tejido degenerado del entorno. Las bacterias, bien como agente causal principal o durante una infección secundaria, y otros microorganismos (patógenos), secretan proteasas que dañan el tejido adyacente para sus fines. En este campo de batalla entre el huésped y el invasor, el exceso de reacciones proteolíticas se mantiene a raya mediante inhibidores de proteasa, a menudo muy específicos. Son bien conocidos los sistemas inhibidores proteinasa/proteinasa, tales como el inhibidor PMN-elastasa/alfa-1-proteinasa y catepsina G/alfa-1-antiquimotripsina.
Sin embargo, las propias enzimas proteolíticas pueden también ser una causa de inflamación. Esto es especialmente el caso de las enzimas digestivas, que se encuentran en el tracto intestinal. Con el fin de degradas las proteínas de la dieta, el estómago, el páncreas y el borde en cepillo del intestino delgado secretan varias clases de proteasas. La pepsina del estómago funciona de forma óptima a pH 2, las enzimas pancreáticas y del borde en cepillo, tales como la tripsina, la quimotripsina y la elastasa funcionan de forma óptima a pH 7-8. En adultos, el intestino delgado tiene una longitud de siete metros y el tiempo de tránsito de sus contenidos es de aproximadamente 3 horas.; esta parte del intestino está colonizada por sólo unas pocas bacterias, aunque está llena con una mezcla acuosa de alimentos y una gran matriz de grandes cantidades de enzimas digestivas, tal como lipasas y proteasas. Sin embargo, en el intestino grueso (el colon y el ciego), el contenido de agua está muy reducido y la actividad de las enzimas está neutralizada por, por ejemplo, bacterias. Por últimos, los residuos neutralizados y digeridos de los alimentos y las bacterias (heces) salen del organismo a través del recto. Únicamente cuando el colon no puede reducir de forma eficaz el contenido de agua y neutralizar las enzimas, las heces pueden contener todavía actividad proteolítica que, durante periodos de diarrea o de incontinencia fecal pueden ser muy irritantes para la piel intraanal y perineal.
La piel, especialmente en seres humanos, es, aunque está protegida por el estrato córneo compuesto principalmente por queratina, como cualquier otra sustancia proteinácea, muy susceptible a la acción proteolítica de las proteasas, en consecuencia, el fluido como el contenido del intestino delgado puede producir inflamación grave.
En bebés y lactantes, el intestino está mucho menos desarrollado, especialmente el colon funciona de forma diferente a como lo hace en adultos. Esta es la razón por la cual las enzimas digestivas en las heces de bebés y lactantes no están neutralizadas; los contenidos de las heces son más similares a los contenidos del intestino delgado, aunque habiendo pasado el colon. Por tanto, la dermatitis perineal (perianal) se encuentra con más frecuencia en bebés o lactantes que en adultos. Asimismo, los lactantes y niños (hospitalizados) con trastornos gastrointestinales son susceptibles a tales dermatitis. Tal dermatitis o prurito, definidos por eritema cutáneo irritante, vesículas, humedad, edema o alteración (excoriación) de la piel perianal, también se encuentra con el eritema del pañal, y se puede manifestar en formas desde bastante leves a muy graves. Con el eritema del pañal, factores que lo complican son la acumulación de orina, en la que la urea se convierte en amoniaco por la acción de las bacterias fecales, lo que aumenta el pH hasta un valor incluso mejor para la actividad de las enzimas proteolíticas. Dado que la piel es extremadamente susceptible a las infecciones, se debe tomar precauciones para prevenir tales inflamaciones relacionadas con la actividad proteolítica (fecal).
Otros casos más de dermatitis se encuentran con pacientes que se han sometido a resecciones de colon y/o ileon con un estoma. La reservoritis, inflamación intestinal, es una complicación importante de la anastomosis ileoanal con construcción de una bolsa tras la resección del colon y se caracteriza por síntomas clínicos e inflamación del depósito (bolsa). La dermatitis periestomal (circumestomal) se encuentra en los pacientes a los que se les ha realizado un ileostoma que se abre en la superficie del abdomen y termina en un depósito artificial que necesita vaciarse diariamente. En las enfermedades intestinales inflamatorias (III, tales como la enfermedad de Crohn (EC), la colitis ulcerosa (CU) y la reservoritis) y la inflamación de etiología desconocida, no se conoce el papel de la flora intestinal y los patógenos, de las enzimas proteolíticas derivadas de estos microorganismos y las enzimas proteolíticas endógenas (p. ej., pancreáticas o de leucocitos/granulocitos), y su contribución a la degradación de mucoglicoproteínas protectoras y los tejidos subyacentes.
Especialmente en los casos anteriores, en los que se elimina el colon o su función está afectada o es inmadura, es evidente que cuando las heces se excretan la actividad proteolíticas es todavía muy elevada, lo que conduce a dermatitis perineal de varios grados.
No es necesario decir que se han desarrollado muchos medicamentos e instrumentos de atención personal con el fin de remedia las consecuencias de picor (intensos) y a menudo doloroso de las inflamaciones comentadas anteriormente. El tratamiento general con antiinflamatorios a menudo recurre al tratamiento con corticosteroides, a pesar de los graves efectos adversos que se suelen observar con estos medicamentos. Otras formas de tratamiento se basan principalmente en proporcionar una capa protectora a la piel por ejemplo mediante la aplicación de un ungüento con base lipídica, que contienen aditivos tales como cinc, o limpiando frecuentemente una zona de riesgo. Se han desarrollado instrumentos especiales para la atención personal, que varían desde toallitas húmedas para el cuidado de la zona perineal, pañales que permanecen muy secos a pesar de que el niño o el paciente los ensucia mucho, hasta instrumentos para el cuidado del estoma), tales como discos adhesivos y absorbentes y fluido para limpiar el estoma, que están diseñados específicamente para el cuidado del estoma de pacientes con ileostomía o anastomosis ileoanal.
El documento JP-A-03176033 describe un extracto de soja que contiene tripsina para controlar el eritema del pañal.
Sin embargo, ninguno de estos tratamientos puede de verdad hacer algo más que aliviar uno o más de los síntomas clínicos que se han descrito antes y que se describirán a continuación.
La invención proporciona un procedimiento para tratar, reducir o prevenir una inflamación o prurito que comprende someter a un mamífero a un tratamiento con al menos in inhibidor que sea capaz de inhibir la actividad proteolítica. Preferentemente, la invención proporciona un procedimiento por el que se inhibe una proteasa producida o secretada, por ejemplo por granulocitos, mastocitos, macrófagos y otros productos intermedios en los procesos inflamatorios. La invención es aplicable a la medicina y la asistencia humana y veterinaria.
La invención queda definida por las reivindicaciones 1-12.
Una forma de realización preferida de la invención es en la que dicho mamífero es un ser humano que padece, por ejemplo, dermatitis o prurito. Tratar por ejemplo una dermatitis, con un inhibidor de la proteasa reduce la actividad proteolítica de las proteasas implicadas en el prurito de la inflamación. Especialmente en la interacción de causas y efectos observados durante la inflamación, la actividad de las enzimas proteolíticas es demasiado elevada, la invención proporciona un procedimiento para reducir esta actividad (ya sea del huésped o del invasor) mediante el tratamiento con al menos un inhibidor que sea capaz de inhibir la actividad proteolítica.
Dicho tratamiento se proporciona mediante la aplicación de dicho inhibidor en un ungüento, una crema, un gel, un polvo o cualquier otra forma adecuada a la localización de la inflamación. Estas sustancias pueden portarse también, por ejemplo, en toallitas impregnadas con un inhibidor, en atomizadores o en fluido de lavado.
En una forma de realización preferida de la invención, el tratamiento se proporciona para una inflamación intestinal, perineal o periestomal, como se observa, por ejemplo, con bebés o lactantes con eritema del pañal, con niños o adultos con diarrea o incontinencia fecal, con pacientes con síndrome intestinal inflamatorio y con pacientes con estoma, en los que todos ellos padecen los efectos de la actividad proteolítica que es principalmente fecal.
El tratamiento de la actividad proteolítica fecal se puede realizar mediante la aplicación de dicho inhibidor en un ungüento, una crema, un gel, un polvo o cualquier otra forma adecuada a la localización perineal o periestomal de la inflamación. Las inflamaciones intestinales, tales como las que se observan con las III o la reservoritis, se pueden tratar limpiando la localización afectada en el tracto digestivo mediante, por ejemplo, la administración de un enema, o pueden administrarse por vía oral, preferentemente en una composición farmacéutica, tal como un jarabe o una píldora mixta, que puede pasar por el esófago y el estómago sin verse afectadas relativamente.
Estas sustancias inhibidoras pueden portarse también, por ejemplo, en toallitas impregnadas con un inhibidor, en atomizadores o en el fluido de lavado. Asimismo, es posible impregnar un pañal (durante la producción de los pañales o poco antes de su uso) con un inhibidor, lo que proporciona un procedimiento y medios contra el eritema o prurito del pañal. En una forma de realización preferida, tal pañal se trata o impregna con un inhibidor, según se proporciona mediante la invención en al menos la zona del pañal (u las partes subyacentes) que tiene, cuando se está usando, contacto con el perineo del bebé, lactante, niño o adulto. Con los pañales, dicha zona de contacto normalmente comprende la superficie del pañal, que está en contacto con el perineo.
La invención proporciona un procedimiento de tratamiento que comprende la administración al paciente o mamífero susceptible a una inflamación, de un inhibidor como se define en la reivindicación 1. Los inhibidores de la actividad proteolítica son muy conocidos. Por ejemplo, el ácido tiene un efecto inhibidor sobre la hidrólisis de proteínas mediante proteasas pancreáticas y, por tanto, se puede usar una sustancia que disminuya el pH como inhibidos según la invención.
Asimismo, las sustancias de adsorción, tal como carbón activado (uno de tales productos se conoce como Norit), pueden actuar como inhibidor de la proteasa mediante sus propiedades de adsorción. En la parte experimental se proporcionan varios ejemplos de un tratamiento proporcionado por la invención en el que se usa carbón activado, por ejemplo Norit®, para tratar una inflamación tal como, por ejemplo, reservoritis.
Se conocen muchos inhibidores de la proteasa (véase, por ejemplo, G. Salvesen y H. Nagase. Proteolytic enzymes, a practical approach. Eds. R. J. Beynon y J.S. Bond En: The Practical approach series. 1989.). Aunque se conocen inhibidores inespecíficos (es decir, \alpha-macroglobulina plasmática humana), la mayoría discrimina entre clases, o incluso subclases, de proteasa. Las sustancias tales como aldehídos peptídicos o péptidos cetonas de clorometilo son muy específicas de subclases de proteasas (proteinasas), según la secuencia peptídica a la que imitan. Otras, tales como quelantes metálicos, actúan sólo contra metaloproteinasas o proteinasas dependientes de calcio. Se encuentran inhibidores específicos de clase contra la serinproteinasa, contra la cisteína proteinasa, contra la aspártico proteinasa y así sucesivamente. Estos inhibidores de la proteasa a menudo están disponibles en el mercado en forma de sustancias purificadas para usar en preparaciones bioquímicas y pueden ser caros.
El procedimientos según la invención es un procedimiento en el que un inhibidor deriva de una planta que puede dar lugar a tubérculos o raíces. En la presente memoria descripitiva derivado, por ejemplo, comprende derivado por purificación o aislamiento (parcial) o mediante la obtención de la información genética necesaria y la producción mediante tecnología recombinante moderna conocida en la técnica.
Las plantas a menudo protegen sus hojas, frutos, semillas, tubérculos o raíces contra las plagas mediante la inclusión de potentes inhibidores de proteasa y mezclas de los mismos en tales hojas, frutos, semillas, tubérculos y raíces. Por ejemplo, los cereales y las legumbres, tales como el trigo o la soja, contienen inhibidores de proteasa tales como el inhibidor de la tripsina de soja (SBTI), que generalmente posee actividad contra la tripsina o la quimotripsina pero no contra otras clases de proteinasas. Los tubérculos y las raíces, tales como la patata y la yuca, aunque también el boniato, la remolacha azucarera y la batata, y otros, contienen potentes inhibidores de una amplia variedad de proteasas del tracto digestivo tal como aminopeptidasas, carboxipeptidasas, quimotripsina, tripsina y elastasa, y, a causa de esta amplio abanico, se usan los productos vegetales que derivan de tubérculos o raíces, que comprende actividad proteolítica según la invención.
Los tubérculos de patata son una fuente extraordinariamente rica de una variedad de inhibidores de todas las principales endo y exoproteinasas digestivas intestinales de animales (Pearce y col., Arch. Biochem. Biophys, 213, 456-462, 1982). Tales inhibidores actúan como antinutrientes que están presentes como parte de los mecanismos de defensa químicos naturales de plantas tales como tubérculos y raíces contra las plagas que la atacan. En las patatas, los principales inhibidores son el inhibidor polipeptídico de tripsina (PTI), los inhibidores polipeptídicos de quimotripsina I y II (PCI-I y PCI-II) y el inhibidor II contra la quimotripsina y la tripsina, y el inhibidor de la carboxipeptidasa, todos los cuales tienen análogos en otras plantas. Estos actúan solos y en conjunto contra las principales proteinasas digestivas animales.
La invención proporciona el uso de un inhibidor o un producto o extracto vegetal capaz de inhibir la actividad proteolítica para preparar una composición farmacéutica o para la atención personal según las reivindicaciones, para reducir o prevenir una inflamación o prurito. En la parte experimental, se proporciona un ejemplo de tal producto, que comprende zumo de patata o un inhibidor derivado del mismo, por ejemplo mediante liofilización. Tal composición puede comprender un ungüento, crema, gel, polvo o cualquier otra forma adecuada por la que un inhibidor se puede aplicar a un paciente. En una forma de realización preferida de la invención, la invención proporciona el uso de un inhibidor o producto vegetal capaz de inhibir la actividad proteolítica según las reivindicaciones, para preparar una composición para reducir o prevenir una inflamación o prurito que sea inflamación o prurito intestinal, perineal o periestomal. Tal composición puede estar en forma de un fluido de lavado, puede estar contenida en cápsulas que pasan a través del esófago y el estómago, puede esta en toallitas o pañales (prefabricados), en los que el inhibidor (o el producto vegetal) se añade durante la producción o poco antes de su uso. En una forma de realización preferida, la invención proporciona el uso de un inhibidor según las reivindicaciones para preparar una composición de asistencia personal o médica para el cuidado perineal (perianal) y/o periestomal, por ejemplo, para contar la actividad proteolítica que sea fecal.
Por ejemplo, es posible prevenir la dermatitis perineal mediante el lavado del reservorio y la piel perineal con un inhibidor de la proteasa que contiene fluido o un ungüento protector con inhibidores de la proteasa. Asimismo, es posible tratar previamente los pañales o las composiciones de atención personal que adsorben la suciedad con un polvo inhibidor.
La invención proporciona el uso de un inhibidor o un producto vegetal capaz de inhibir la actividad proteolítica para preparar una composición farmacéutica o de atención personal, en la que dicho inhibidor o producto deriva de una planta en la que dicha planta puede dar lugar a tubérculos o raíces, tales como una planta de patata. Tal inhibidor (producto, composición o mezcla), como se ha explicado anteriormente, es activa contra una proteasa que se selecciona del grupo de proteasas pancreáticas y granulocíticas. En una forma de realización concreta de la invención, dicho inhibidor (composición o mezcla) es capaz de inhibir la papaína y/o la pronasa, lo que ilustra su amplio espectro y eficacia.
La invención también proporciona un producto farmacéutico o de atención personal (por ejemplo, ungüentos, polvo, fluidos) que comprende inhibidores de la actividad proteasa que sean capaces de, por ejemplo, prevenir inflamación o prurito causado por las heces (proteasas fecales mediante la inhibición de las enzimas proteolíticas de origen pancreático y del borde en cepillo; de origen bacteriano (flora intestinal); de origen leucocitario (granulocitos, mastocitos, macrófagos) en caso de inflamación del intestino; o curar la inflamación o el prurito causado por las heces mediante la inhibición de las proteasas (tales como elastasa, catepsinas) producidas por macrófagos, granulocitos, mastocitos tisulares; o curar la inflamación de la piel, y otras enfermedades en las que la inflamación y la actividad de la enfermedad está relacionada con las células inflamatorias infiltrantes (células efectoras) y la liberación de proteasa; o
curar el prurito en general (el tratamiento a menudo consiste en antihistamínicos), la aplicación local de ungüentos con inhibidor de proteasa impide la liberación de histamina a partir de mastocitos/liberación de proteasa desde los fagocitos.
La invención también proporciona una composición para la atención personal, líquidos de lavado, toallitas húmedas, polvo, ungüentos, para el cuidad perianal y/o periestomal o un pañal que comprende un inhibidor de actividad proteolítica según las reivindicaciones. La atención al cuidado de la piel puede comenzar ya en el momento de la cirugía, por ejemplo un fluido de lavado que contenga inhibidor. Los inhibidores se pueden incorporar en los instrumentos del estoma, tales cono discos adhesivos y de adsorción y en fluidos de lavado del estoma y ungüentos.
La invención se describe además en la parte experimental, que no limita la invención.
Parte experimental
En adultos, el intestino delgado tiene una longitud de siete metros y el tiempo de tránsito de sus contenidos es de aproximadamente 3 horas; esta es la razón por la cual esta parte del intestino, en comparación con el intestino grueso, está colonizado por sólo unas pocas bacterias. Sin embargo, el colon está colonizado por un gran número de bacterias (10^{10}-10^{11}/gramo). El tránsito es lento (24 horas) y la función principal del colon es la absorción de agua.
Finalmente, las heces están compuestas por una parte de sólidos y dos partes de agua. La mitad del material seco son bacterias; los residuos son, en gran medida, fibra de la dieta y material derivado del huésped, tal como células epiteliales desprendidas y mucus. El lugar de fermentación bacteriana más activo es el sitio en el que los contenidos del íleon alcanzan el ciego. Existe una gran cantidad de nutrientes disponible, el porcentaje de agua es elevado y la flora dispone de las condiciones óptimas para su multiplicación. Se conocen algunos datos acerca de este parte del intestino (humano), aunque el pH, medido en víctimas de muerte súbita, es muy bajo (pH 4,5-5,5).
La flora del colon consiste en un 99,9% de bacterias anaerobias obligadas; las bacterias aerobias anaerobias facultativas, tales como las coliformes, son una minoría (alrededor de 104-107 bacterias/gramo de heces). La flora anaerobia del colon es muy estable y es casi imposible inducir alteraciones a nivel de especie o de género, incluso mediante cambios drásticos en la dieta (sin embargo, los antibióticos o la presencia de infección con enteropatógenos podría alterar la flora residente). Una de las causas de este fenómeno es que los nutrientes más importantes derivan de material endógeno, fluidos digestivos, mucus, etc. Una parte de las proteínas digestivas (también los ácidos biliares) se reabsorben desde la parte distal del íleon, el resto se convierte o digiere en el colon. Se piensa que la flora del colon desempeña un papel importante en la activación de las enzimas pancreáticas digestivas tales como las proteasas.
En bebés y lactantes, el intestino está mucho menos desarrollado, especialmente el colon no funciona tan bien como en adultos. Esta es la razón por la cual las enzimas digestivas de las heces de bebés y lactantes no se neutralizan y/o reabsorben; sus contenidos se asemejan más a los contenidos del intestino delgado, incluida una actividad proteolítica elevada aunque haya pasado por el colon.
Las principales fuentes de nutrientes endógenos son, probablemente, glicoproteínas del mucus gástrico e intestinal que contienen hasta un 90% de hidratos de carbono. Las glicosidasas bacterianas degradan las cadenas laterales de los oligosacáridos que protegen la glicoproteína de la destrucción proteolítica. Cuando el núcleo proteico carece de la protección de los hidratos de carbono, ya no es resistente a la proteolisis a través de las proteasas pancreáticas (y bacterianas). En el colon sano existe un equilibrio entre la producción y la degradación de mucus.
Se ha prestado mucho atención a las enfermedades intestinales inflamatorias (III): enfermedad de Crohn (EC), la colitis ulcerosa (CU) y la reservoritis. La reservoritis es una complicación importante de la anastomosis ileoanal con construcción de reservorio, tras la resección de colon por CU, y se caracteriza por síntomas clínicos e inflamación del reservorio (bolsa). Se investigó el papel de la flora intestinal en las III e relación con los patógenos y su contribución a la degradación de las mucusglicoproteínas protectoras.
Los pacientes con inflamaciones intestinales muestran una pérdida de integridad de la mucosa. Los inventores han estudiado el posible papel perjudicial de las glicosidasas bacterianas y de las proteasa bacterianas y derivadas del huésped mediante la degradación de las glicoproteínas del mucus. Por tanto, en pacientes con III, se estimó la composición de la flora intestinal y la actividad de las glicosidasas y las proteasas. Asimismo se midió la actividad enzimática en ratas libres de gérmenes para establecer la influencia de la flora.
Estos estudios mostraron que las heces de pacientes con EC activa con una ileostomía y de pacientes con una bolsa tienen una actividad proteolítica elevada. Las proteasas entran en el duodeno en gran medida en forma de secreciones procedentes del hígado, del borde en cepillo y del páncreas. Una parte de la actividad se pierde en el íleon terminal, probablemente a causa de la absorción y/o acción de los inhibidores endógenos. En heces de sujetos sanos, únicamente se estimó una actividad enzimática muy baja, o ninguna, que probablemente sea en su mayoría de origen bacteriano. sin embargo, animales sin gérmenes, tales como ratas, muestran una actividad proteolítica elevada en todo el intestino grueso. Se encontró que los pacientes con III activa, pacientes con ileostomía y pacientes con una bolsa tenían una actividad proteolítica fecal elevada. A la luz de estos datos podemos concluir que es necesaria una flora colónica completa y un tránsito normal (lento) para inactivar estas enzimas.
La elevada actividad proteolítica en las heces de pacientes con III puede producir una degradación aumentada de glicoproteínas de mucus y puede desempeñar un papel en el mantenimiento de la inflamación de la mucosa. En experimentos in vitro se confirmó esta hipótesis. La idea nació para tratar pacientes tales como los que tienen una anastomosis ileoanal (AIA) con inhibidores de la proteasa para prevenir la dermatitis perineal. Los pacientes intervenidos por CO o por poliposos adenomatosa familiar (PAF) se consideran para la construcción de un reservorio del íleon tras la resección de colon. Este pequeño reservorio está conectado con el ano. El periodo tras la intervención resulta muy duro para la mayoría de los pacientes. Poco después de la intervención, las heces de los pacientes tienen una consistencia acuosa, a menudo los pacientes (todavía) no presentan continencia y esto tiene como resultado irritación y prurito de la piel perineal (dermatitis perineal). La causa principal de la dermatitis perineal es la degradación de la epidermis (que consiste en su mayoría en la proteína queratina) por la acción de las proteasas.
La actividad proteolítica se midió en las heces de estos pacientes y se encontró que era muy elevada. Además, el 75% de los pacientes desarrollo una dermatitis perineal moderada a grave; el 25% no presentó ningún signo de irritación.
Materiales y procedimientos Actividad proteolítica/sujetos
Se estudiaron muestras fecales de veintisiete pacientes con enfermedad de Crohn (EC). Doce pacientes, de 27-58 años de edad, se habían sometido a cirugía intestinal 3-12 años antes; las localizaciones de las resecciones fueron el íleon terminal, el íleon y el ciego, y el colon. Un segundo grupo de pacientes no se había operado; los lugares principales de la inflamación fueron el íleon, el íleon y el colon, y el colon. El diagnóstico de EC se estableció con los criterios clínicos, radiológicos e histopatológicos habituales. Todos los pacientes eran ambulatorios.
Para comparar se estudiaron doce voluntarios sanos de 23-48 años de edad.
Se obtuvieron los efluentes de ileostomía de cinco pacientes adultos con una ileostomía convencional (de 38-71 años de edad). Había sufrido una colectomía total más de cinco años antes para aliviar la EC o la colitis ulcerosa (CU) y en la actualidad todos tenían buena salud.
Se estudiaron catorce pacientes con una bolsa (media de edad 27 años). Los pacientes se habían sometido a una proctocolectomía restauradora por CU o poliposis adenomatosa familiar. En 12 pacientes se construyó una bolsa en S, mientras que en dos pacientes se creó una bolsa en W. Este estudio se llevó a cabo al menos un año después de la colectomía restauradora. El diagnóstico de reservoritis se basó en síntomas clínicos, características endoscópicas de inflamación inespecífica aguda y signos histológicos de un infiltrado celular inflamatorio. Usando estos criterios, cinco pacientes presentaban reservoritis y nueve no (controles).
Las muestras fecales de trece pacientes operados para la construcción de un reservorio con anastomosis ileoanal (AIA) se recogieron en un plazo máximo de 14 días tras la intervención. Se midió la actividad proteolítica en las heces de 31 niños sanos de 4 meses a 7 años de edad.
Actividad proteolítica/animales de laboratorio
Se estudiaron las heces de 4 ratas convencionales (Wistar) y 4 ratas sin gérmenes (Wag/Rij). Se estudiaron los contenidos del tracto intestinal de 2 ratas convencionales y 2 ratas sin gérmenes. Se recogieron las muestras de heces de 20 perros colectomizados, sabuesos de raza pura (Harlan). Se estudiaron tres grupos con ileostomía. En diez perros, se construyó una ileostomía estándar de Brooke mediante colectomía subtotal. En cinco perros, se creó un reservorio ileal sin válvulas (bolsa) mediante anastomosis iso-antiperistáltica de un lado a otro. Tras un periodo de recuperación de 2 semanas, se inició un calendario de periodos crecientes de oclusión, salvo en 5 perros. El tiempo de oclusión máximo tolerable fue de 2,5-3 h para el grupo de ileostomía y de 4-7 h para el grupo con el reservorio. En cinco perros se construyó una ileostomía de contención (bolsa de Kock), que se vació 2-5 veces cada 24 horas mediante cateterización.
Actividad proteolítica/muestras fecales y contenidos intestinales
Las heces se congelaron y almacenaron a -20ºC dentro de las 3 h del tránsito. Estudios preliminares mostraron la ausencia de cambios en la actividad proteolítica durante al menos 4 meses de almacenamiento. Las muestras de 1 g se transfirieron a 24 vol de tampón fosfato 0,1M a pH 7,6 y se homogeneizaron ("Stomacher"; Lab blender 400). Las partículas grandes se eliminaron de los homogeneizados mediante filtración en gasa (Utermohlen, replegada en 2 capas); estas muestras se denominan a continuación "homogeneizados fecales".
Inmediatamente después de sacrificar a las ratas se retiró el intestino y se preparó. El intestino delgado se dividió en 4 partes de igual longitud y los contenidos de cada parte se lavaron cuidadosamente con tampón fosfato 0,1M (pH 7,2). Las muestras de ciego y colon se trataron del mismo modo que las heces.
Actividad proteolítica/macrófagos
Macrófagos peritoneales de ratón (RAW) se cultivaron in vitro en 200 ml de DMEM con SBF al 5% y glutamina 4 mM y se estimularon con 200 U de medio con TNF\alphamol. Tras 18 horas se recopilaron las células, se centrifugaron y se resuspendieron en 2 ml de tampón fosfato 0,1M a pH 7,6. El numero total de células fue de aproximadamente 3.10^{8} por ml. Las células se rompieron mediante congelación repetida y las muestras se usaron para ensayos con proteasas.
Actividad proteolítica/ensayo enzimático
La actividad proteolítica se determinó en los homogeneizados fecales en las diluciones adecuadas (hasta por 250) en tampón fosfato 0,1M (pH 7,6). Se añadió penicilina (0,1% p/v) para impedir el crecimiento bacteriano. En las pruebas de inhibición más recientes no se usó penicilina. Se incubaron muestras de 0,1 ml con 0,1 ml de azocaseína al 1% (p/v) (Sigma) en tampón fosfato a 37ºC durante 1 h. La reacción se detuvo mediante la adición de 0,2 ml de ácido tricloroacético (TCA) al 10% (p/v); tras 10 minutos a temperatura ambiente se eliminaron la azocaseína no hidrolizada, las bacterias y otras partículas mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos. A continuación se transfieren 0,1 ml del sobrenadante limpio a 0,1 ml de NaOH 1N en microplacas de 24 pocillos de fondo plano. A los ensayos en blanco se añadió azocaseína tras la incubación y adición de TCA. La absorción de las muestras se midió a 450 nm y se comparó con las curvas estándar obtenidas a partir de soluciones de azocaseína. La actividad proteolítica se expresó en miligramos de azocaseína hidrolizada durante 1 hora por gramo de peso seco o húmedo de muestra, Cada muestra diluida se probó para otra hidrólisis del sustrato distante a la enzimática tras calentamiento a 80ºC durante 10 minutos. La hidrólisis espontánea del sustrato se probó mediante incubación del sustrato con
tampón.
Se usó N-succinil-L-alanil-L-prolil-L-leucina-p-nitroanilida (Sigma) como sustrato para estimar la actividad elastasa leucocitaria humana purificada (Sigma) y elastasa de macrófagos de ratón. Se incubaron muestras de 0,1 ml con 0,1 ml de sustrato (0,1% p/v) en tampón fosfato 0,1M a pH 7,6 en una placa de microtitulación de pocillos de fondo plano. Tras 30 ó 60 minutos, se detuvo la reacción mediante la adición de 70 \mul de ácido acético al 30% y se midió la absorción a 400 nm. Se definió una unidad de enzima como la cantidad que liberó 1 \muml de p-nitroanilida por minuto a 37ºC.
Actividad proteolítica/efecto del pH
Para comprobar el efecto del pH sobre la actividad proteolítica se diluyeron las muestras fecales en ácido cítrico-tampón fosfato (Na_{2}HPO_{4} 0,1M/2H_{2}O, ácido cítrico 0,1M/H_{2}O) pH 5,2, 5,8, 6,8 y 7,6. Además, las soluciones del sustrato se prepararon en los tampones adecuados.
Preparación de proteínas de patata sin lectina
Proteínas de patata crudas o relativamente puras se diluyeron en PBS. A las proteínas de patata se añadieron eritrocitos humanos (sin enfermedad) (endoconcentración del 3% de ery), se mezclaron cuidadosamente durante 1 min, se centrifugaron durante 2 min a 1500 rpm. Los sobrenadantes se mezclaron de nuevo con los eritrocitos. Esto se repitió 5 veces hasta que no se encontró hemaglutinación en una prueba de hemaglutinación. El valor recíproco de la dilución más elevada de la proteína de patata que mostró hemaglutinación clara se definió como el título de hemaglutinación. El título de hemaglutinación disminuyó desde 25.600 a 25-1 por ejemplo. Tras la liofilización, la actividad inhibidora del producto sin lectinas se comparó con la fracción proteica original. No se encontró pérdida de actividad inhibidora cuando se probó en muestras fecales con una actividad proteolítica elevada y en soluciones de proteasa purificadas (tripsina, \alpha-quimotripsina y elastasa, endoconcentración 1%).
Además se obtienen proteínas de patata sin lectinas mediante el uso de, por ejemplo, quitooligo-agarosa (Seikagaku).
Las lectinas de proteínas de patata también se inactiva, no mediante su eliminación de la solución proteica sino mediante la unión a residuos solubles de hidratos de carbono, tales como, por ejemplo, N-acetoquitooligosacáridos de quitina hidrolizada y glicoproteínas del estómago o el intestino. Las lectinas todavía se encuentran en el producto, pero sí han perdido su sitio activo.
Actividad proteolítica/inhibidores de la proteasa
Se usaron los siguientes inhibidores:
-
Trasylol (Aprotinina) (Bayer) no diluido.
-
Ovomucoide () 1% (p/v) en tampón fosfato 0,1M pH 7,6
-
Suero bovino fetal (SBF) () no diluido
-
Inhibidor de tripsina II- de soja (STI) (T-9003; Sigma) 1% (p/v) en tampón fosfato 0,1M pH 7,6
-
Norit A (supra USP, 951191), B (prueba EUR, A6910), E (supra USP, 940260), PRSH, Carbomix, comprimidos
-
Polvo Premium (Hollister)
-
El zumo de patata (ZP) de "Bintjes" se preparó del siguiente modo. Después de pelarlas y lavarlas, las patatas se cortaron en trozos, se filtraron a través de malla cambric con la adición de ácido ascórbico al 0,2%. El zumo se centrifugó a 27.500 rcf durante 30 minutos a 4ºC, se filtró con papel y se centrifugó de nuevo. Los sobrenadantes de color amarillo claro se filtraron a través de un filtro de 0,45 micrómetros y se liofilizaron. Este producto bruto era estéril (controlado con placas de agar sangre) y contenía alrededor de un 25% de proteína. De 200 ml de zumo derivaron diez gramos de polvo de ZP.
En general, los inhibidores de la proteasa que están presentes en las patatas, por ejemplo, se pueden recuperar moliendo las patatas, eliminando el almidón y otros sólidos y, por ejemplo, liofilizando el zumo.
La pureza de la preparación del inhibidor de proteasa se puede mejorar mediante la eliminación del material no proteináceo y/o los péptidos de bajo peso molecular y/o los aminoácidos presentes en el zumo de patata mediante, por ejemplo, centrifugación, microfiltración, ultrafiltración, diafiltración o electrodiálisis. Además, la proteína se puede recuperar de forma selectiva en una forma relativamente cruda de la matriz del zumo de patata. Esto se puede conseguir mediante, por ejemplo, ultrafiltración, precipitación isoeléctrica, (co)floculación con polielectrolitos y cualquier ayuda para la floculación, coprecipitación con otras proteínas, precipitación de proteínas con sal (sobresalado) o mediante el cambio de la calidad del disolvente, por ejemplo, mediante la adición de acetona, metanol, etanol o alcohol isopropílico, mediante precipitación isoelétrica y fraccionamiento térmico y otras técnicas conocidas para cualquier experto en la técnica. Dado que los inhibidores de la proteasa en el zumo de patata son relativamente termoestables, un tratamiento térmico moderado conduce a la desnaturalización y coagulación de las proteínas menos estables. Posteriormente, la proteína coagulada puede eliminarse mediante técnicas tan sencillas como, por ejemplo, centrifugación. Aunque se pierde algo de actividad inhibidora de proteasas, la pureza de los inhibidores de proteasa restantes aumenta. Más purificación es posible mediante ultrafiltración o sobresalado de los inhibidores de la proteasa y posterior eliminación de la sal y otros componentes no deseados mediante ultra y diafiltración. Como alternativa, el aislamiento de varios inhibidores de la proteasa es posible mediante cromatografía por afinidad, bien directamente a partir de la matriz de zumo de patata bruto o después de la purificación
previa.
En la mayoría de los experimentos el inhibidor se añadió a las heces (diluido a 1:25 en tampón), se mezcló durante 5-15 minutos y se añadió al sustrato; se añadió polvo de ZP a las heces sin diluir (1:1) y después de mezclar se diluyó (1:25) con tampón. En cada experimento se probaron controles (heces esterilizadas, inhibidores esterilizados, soluciones tampón).
Actividad proteolítica/enzimas purificadas
En los experimentos de inhibición se analizaron las siguientes enzimas:
-
Tripsina pancreática bovina (Serva)
-
\alpha-quimotripsina pancreática bovina (Merck, Sigma)
-
Elastasa pancreática bovina (Sigma)
-
Papaína (Sigma)
-
Pronasa (Sigma)
(también se analizaron la carboxipeptidasa y la leucinaminopeptidasa, pero no hidrolizaron la azocaseína)
Todas las enzimas se usaron en una concentración del 0,2% (p/v) en tampón.
Actividad proteolítica/pruebas cutáneas
Las pruebas cutáneas se realizaron en la parte ventral del antebrazo. Se analizaron las siguientes soluciones: 1. sobrenadante de heces de un paciente con un reservorio ilíaco con una actividad proteolítica elevada; 2. El mismo sobrenadante, pero esterilizado; 3. sobrenadante con 0,25% de STI (p/v) y 4. 0,25% de STI en tampón. Doscientos \mul de cada solución se introdujeron en cambric plegado en la piel y se cubrieron con plástico y tiritas adhesivas. El tiempo total de la incubación fue de 7 h, pero después de 3 y 5 h a cada uno de los parches de prueba de añadieron 100 \mul para impedir la deshidratación.
Inhibición de la actividad proteolítica fecal por los productos del zumo de patata Euro 1, Euro 2 y Euro 3
Euro 1 es polvo de ZP bruto, Euro 2 y Euro 3 son más puros.
Materiales y procedimientos Muestras fecales
Se usaron heces de 1 paciente con una ileostomía, 1 paciente con una bolsa funcionando bien, 1 paciente 14 días después de una colectomía y la construcción de una bolsa, 2 bebés de 4 meses de edad.
Las heces se usaron sin diluir, a excepción de las de los bebés, que se diluyeron 1:1 en tampón fosfato a pH 7,6 y se centrifugaron durante 10 minutos a 10.000 g.
EURO
Los EURO se usaron en diluciones 1:5, 1:10. 1:25, 1:50 y 1:100 en tampón fosfato a pH 7,6.
Las heces y los EURO se mezclaron a una proporción 1:1 durante 10 minutos, a continuación la mezcla se diluyó en tampón fosfato a pH 7,6 a 1:12,5.
En ambas diluciones la actividad proteolítica se midió con azocaseína como sustrato.
Pruebas cutáneas
Se colocaron cámaras de pruebas con parches (van der Bend) de 10 x 10 mm, llenar de 50 \mul de una solución de prueba en la piel de la parte superior del dorso de 2 sujetos sanos y se fijaron con esparadrapo adhesivo Fixomull Stretch; la distancia entre ellos fue de 15 mm. Una serie de 4 cámaras de prueba se colocó desde la parte craneal a la cauda, una segunda serie se colocó desde la parte caudal a la craneal.
Las soluciones de prueba tenían la siguiente composición:
A.
elastasa, tripsina y \alpha-quimotripsina, concentración final de cada una de las enzimas 1% (mezcla de enzimas) en solución e sobrenadante fecal esterilizado procedente de un paciente con ileostomía (FS)
B.
FS
C.
Euro 2 (concentración final 5%) en solución en FS con mezcla de enzimas.
D.
Euro 2 en FS.
Después de 24 horas se retiraron las cámaras de prueba y la piel se lavó con agua corriente. Los puntos se inspeccionaron en busca de eritema y dermatitis después de 1, 2, 4, 6 y 24 horas.
Se llevó a cabo una prueba cutánea comparable con la fracción con proteína de patata más purificada (EURO 3), concentración final 1%. Una quinta cámara cutánea se colocó para controlar la dermatitis de contacto: E. (proteína de patata en agua destilada). Se analizaron doce sujetos sanos.
Pruebas de alergia
Tipo 4 (dermatitis de contacto): 31 pacientes del departamento de dermatología (AZR) se analizaron con la proteína de patata relativamente purificada (Euro 3) según protocolos estándar.
Tipo 1 (mediada por IgE); pruebas de punción cutánea: se analizaron 10 pacientes del departamento de alergia (AZR) con alergia alimentaria y 1 paciente con una alergia grave a la proteína de patata.
Resultados 1. Actividad proteolítica en heces
La actividad proteolítica en heces de sujetos sanos era baja. Sin embargo, la Tabla 1 muestra que los pacientes con EC, los pacientes con ileostomía y los pacientes con una bolsa (con y sin reservoritis) poseen una actividad proteolítica elevada.
TABLA 1 Actividad proteolítica en heces de sujetos sanos y pacientes 
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad proteolítica Peso seco de heces mg/g
Mediana (intervalo) Mediana (intervalo)
Sujetos sanos 17,9* (7,5-44,0) 313 (164-403)
Pacientes con EC
\hskip0,2cm -sin resecciones 47,9 (19,1-192,0) 216 (128-228)
\hskip0,2cm -resecciones 228,7 (130,6-356,6) 134 (84-175)
Pacientes con ileostomía 336 (89-972) 88 (69-120)
Pacientes con una bolsa
\hskip0,2cm -sin reservoritis \hskip0,3cm14** (5,5-23,5) 83 (57-103)
\hskip0,2cm -reservoritis 14 (7,1-17,3) 52 (30-110)
Pacientes con AIA 53 (18-105) ND (<30)
\bullet\hskip0,3cm * azocaseína hidrolizada, mg/h/g de heces secas
\bullet\hskip0,3cm ** azocaseína hidrolizada, mg/h/g de heces húmedas
En muestras fecales de animales de laboratorio se encontraron resultados comparables. Las heces de perros y ratas normales tenían una actividad proteolítica muy baja. Se encontró que la actividad proteolítica elevada en la salida de la ileostomía y en bolsas sin válvulas de perros a pesar de la oclusión; sin embargo, las bolsas de contención mostraron una normalización completa en relación con la actividad proteolítica (y varios otros parámetros que no se comentan en este contexto). En contraste con las ratas sin gérmenes, en el colon de animales convencionales la actividad proteolítica está muy disminuida, lo que sugiere un papel de la flora colónica en la inactivación (y/o degradación) de las proteasas digestivas. En lactantes, la actividad proteolítica varía con la edad. Una estimación de la actividad proteolítica en heces de lactantes y niños sanos muestra en lactantes (n= 10, 4-12 meses) una actividad muy elevada, en niños (n= 9, 1-2 años) menor, aunque todavía una actividad elevada, y en niños (n= 12, 2-8 años) disminución de la
actividad.
En otro experimento, de nuevo se descubrió que la actividad proteolítica en heces de 31 niños disminuía con la edad, en niños de 4 meses (n= 4): 191 mg de azocaseína hidrolizada/h/g de heces, en niños de 6 meses (n= 2): 109 mg en un niño de 8 meses (n= 1): 118 mg, en niños de 11 meses (n= 3): 105 mg, en niños de 16 meses (n= 3): 73 mg, en niños de 24 meses (n= 6): 34 mg, en niños de 3 años (n= 5): 24 mg, en niños de 5 años (n= 3): 3 mg, en niños de 7 años (n= 4): 14 mg.
2. Inhibición de la actividad proteolítica pH
La Figura 3 muestra que la dependencia del pH de la actividad proteolítica era similar en cada una de las muestras analizadas. A pH 6,8 y 7,6, las actividades fueron, respectivamente, tres y cuatro veces mayores que a pH 5,2 (p< 0,001 para ambas comparaciones). Esto significa que a pH 5,2, la actividad proteolítica se inhibe en un 75%.
STI
La siguiente tabla (Tabla 2) muestra los resultados de los primeros experimento de los inventores con inhibidores de la proteasa. Las condiciones de los ensayos fueron diferentes, pero Trasylol, ovomucoide y SBF tenían efectos sobre la actividad proteolítica que eran menos prometedores o (conflictivos) que el STI. En una concentración de 1% (p/v), la inhibición fue más del 80%.
TABLA 2 Inhibición de la actividad proteolítica en pacientes y perros
% de inhibición de la actividad proteolítica
Pacientes con EC* Perro con ileostomía Perro con bolsa
n= 4 n= 1* n= 3º n= 1\dagger n= 2^{+} n= 1**
ovomucoide 68 93 84 52
trasylol 54 56 16
STI 1% (0,25, 0,5, 0,75%) 93 84 (63, 61, 45)
SBF 94 0
Ovomucoide + trasylol 51
ovo+tras+STI 76
ovo+STI 70
Norit A 50
\bullet\hskip0,3cm* inhibidor añadido a las heces diluido a 1:2000; incubado 20 h con sustrato
\bullet\hskip0,3cmº inhibidor añadido a las heces diluido a 1:100; incubado 2 h
\bullet\hskip0,3cm\dagger inhibidor añadido a las heces sin diluir (3+1), mezclado durante 2 h, después diluido a 1:100
\bullet\hskip0,3cm+ norit heces sin diluir (4 + 1), mezclado durante 2 h (0 13 min), después diluido a 1:100
\bullet\hskip0,3cm** 2 g de heces + 0,5 ml de trasylol; mezclado durante 15 minutos, después diluido.
Norit
Se analizaron varias clases de norit con heces de pacientes con bolsas con una actividad proteolítica elevada para obtener calidades de adsorción óptimas, para usarse como inhibidor de la proteasa en fluido de lavado de pacientes con AIA tras su intervención. En este experimento también se analizó polvo Premium. La tabla 3 muestra que las capacidades de adsorción de norit PRSH y norit E para las proteasas eran extremadamente fuertes.
TABLA 3 Efecto de norit sobre la actividad proteolítica en heces
% inhibición de la actividad proteolítica *
Carbomix 0
Norit A (Serva) 83
Norit A 83
Norit B 0
Norit E 97
Norit PRSH 100
Norit en comprimidos 58
Polvo Premium 17
\bullet\hskip0,3cm * \begin{minipage}[t]{145mm} heces de 7 pacientes se diluyeron a 1:25 con tampón con norit al 5%; antes de la adición de sustrato, la mezcla se centrifugó (norit puede también adsorber el sustrato); los valores son las medianas.\end{minipage}
La inhibición de la actividad proteolítica por norit se confirmó usando placas con leche desgrasada; la caseína en el agar se hidroliza mediante proteasas y se observa clarificación tras el tratamiento con ATA.
Norit PRSH se analizó a concentraciones diferentes a pH 5,2 y 7,6.
TABLA 4 Efecto de Norit PRSH sobre la actividad proteolítica en heces
% inhibición de la actividad proteolítica
pH 5,2 pH 7,2
Norit PRSH 1% 76 36
\hskip1,8cm 2% 95 92
\hskip2cm 3-5% 100 100
Zumo de patata (ZP)
El ZP de preparó inicialmente y se analizó como fluido; después se preparó un producto liofilizado. La concentración final inicial de l polvo ZP en las suspensiones fecales fue del 17%. La tabla 5 muestra la inhibición de la actividad proteolítica fecal por el ZP y el polvo de ZP.
TABLA 5 Efecto del ZP sobre la actividad proteolítica de las heces
% inhibición de la actividad proteolítica
Número de pacientes 4* 4º 7\dagger 7+
ZP
\hskip0,2cm- sin diluir 93 (50)
\hskip0,2cm- diluido a 1:5 90
\hskip0,2cm- diluido a 1:10 51
\hskip0,2cm- diluido a 1:25 23
Polvo de ZP
\hskip0,2cm- 17% (p/v) 88 97
\hskip0,2cm- 10% 78 90
\hskip0,2cm- 5% 53 74
\hskip0,2cm- 2% 20 44
\bullet\hskip0,3cm* heces diluidas a 1:12,5 en tampón, después mezcladas con ZP (1+1)
\bullet\hskip0,3cmº heces y ZP a 1:1 mezclados durante 15 min, centrifugados, diluidos a 1:25
\bullet\hskip0,3cm\dagger \begin{minipage}[t]{140mm}heces y polvo ZP (1 g en 2 ml de tampón) a 1:1; esto da una concentración final de 17%; no más diluciones para el ensayo\end{minipage}
\bullet\hskip0,3cm+ mismo experimento que en \dagger, pero la mezcla se diluyó a 1:25 para el ensayo
El calentamiento del polvo ZP en una solución de 1 g en 4 ml de tampón (concentración final en heces del 5%) sí disminuyó las capacidades inhibidoras del siguiente modo:
ZP si calentar: inhibición del 65% de la actividad proteolítica
30 min a 55ºC: 64%
30 min a 80ºC: 47%
30 min a 90ºC: 24%
30 min a 100ºC: 14%
El efecto de los inhibidores de la proteasa sobre la actividad de enzimas puras se muestra en la Tabla 6. El polvo ZP es un inhibidor muy potente de varias enzimas pancreáticas, papaína y pronasa.
TABLA 6 Efecto de los inhibidores de la proteasa sobre las enzimas puras 
\vskip1.000000\baselineskip
% inhibición de la actividad proteolítica
Tripsina Quimotripsina Elastasa Pronasa Papaína
STI (0.125%) 99 99 15
\hskip0,2cm-STI-A 100 80 50 0 0
\hskip0,2cm- STI-B 100 100 60 0 0
\hskip0,2cm- STI-C 100 100 55 0 0
Trasylol (sin dil.) 95 95 10
ZP* 100 100 100 38 83
ZP (30 min a 80ºC)
\hskip0,2cm- 1:5 100
\hskip0,2cm- 1:10 100 100 97
\hskip0,2cm- 1:30 95
\hskip0,2cm- 1:40 94
\hskip0,2cm- 1:50 91
\hskip0,2cm- 1:75 90
\hskip0,2cm- 1:100 99
- 1:1000 54
\bullet\hskip0,3cm * 1 g de polvo ZP se mezcló con 2 ml y con 4 ml de tampón.
Análisis de los inhibidores de tripsina de soja
ST-A: STI tipo I-S Sigma T 9003
ST-B: STI tipo II-S Sigma T 9128
ST-C: Inhibidor Bowman-Birke Sigma T 9777
La concentración de la enzima fue del 0,02%, la concentración del inhibidor (concentración final) fue del 0,125%.
Las posibles interacciones del inhibidor ZP con el sustrato se analizaron mediante el uso de concentraciones diferentes de azocaseína en el mismo experimento. No se encontraron interacciones:
TABLA 7 
\vskip1.000000\baselineskip
% Inhibición de la elastasa: actividad 80,02%)
Azocaseína al 1% Azocaseína al 2%
ZP diluido:
\hskip0,2cm- 1:50 100 100
\hskip0,2cm- 1:100 97 95
\hskip0,2cm- 1:500 87 75
\hskip0,2cm- 1:1000 65 66
\hskip0,2cm- 1:2000 44 51
Pruebas cutáneas
Tras la eliminación de las almohadillas y vendas cambric, la piel se limpió cuidadosamente con agua corriente y se determinó inmediatamente y después de 1-18 horas. No se observó ninguna reacción con heces esterilizadas (2) ni con STI en tampón (4), aunque sí se pudieron observar enrojecimiento moderado, pápulas y algunas vesículas en la localización 1 (sobrenadante fecal). La localización 3 (sobrenadante fecal con STI) mostró un ligero enrojecimiento que desapareció en 0 minutos.
El efecto del zumo de patata o de los inhibidores derivados del mismo también se analizó in vitro y en una prueba cutánea. Los resultados se muestran en las figuras 1-6. Es posible inactivar el 90-100% de la actividad proteolítica total, los extractos de patata, tales como el zumo de patata o los inhibidores derivados del mismo son capaces de inactivar las proteasas fecales y esto previene la inflamación.
En la prueba cutánea, se mostró que el ZP y sus diversas fracciones purificadas eran muy eficaces cuando se aplicaron para tratar y prevenir una inflamación. Aunque el sobrenadante fecal esterilizado de un paciente con ileostomía provocó una inflamación en la piel y una dermatitis grave (enrojecimiento, edema, vesículas, dolor) cuando se añadieron enzimas proteolíticas, no se observó ninguna inflamación cuando se añadió inhibidor de zumo de patata en ninguno de los casos. Por ejemplo, ungüentos, tales como cremas o geles, cuando se mezclan con un inhibidor de ZP son capaces de inhibir o prevenir la dermatitis loca.
Además, no se observaron reacciones alérgicas ni adversas contra el producto de zumo de patata.
Inhibición de las proteasas de macrófago
El TNF-\alpha estimuló la producción de enzimas proteolíticas por macrófagos de ratón. La adición de proteínas de patata purificadas (EURO 3) inhibió la actividad de las proteasas del tipo elastasa en un 70%.
Actividad de la elastasa en mU
Macrófagos (6.10^{8} células) 26,5
Macrófagos (6.10^{8} células) + EURO 3 (1%) 8,0
Estos resultados muestran que la actividad de elastasa leucocitaria humana (purificada) se reduce por la acción de los inhibidores de la proteasa de patata.
Análisis
Además, estos experimentos muestran que los pacientes con inflamaciones y/p resecciones intestinales del colon o del íleon, y también en lactantes y en niños de hasta 2 años de edad presentan una actividad proteolítica fecal elevada. Estas enzimas son de origen pancreático, del borde en cepillo, microbiano y/o celular (granulocitos, macrófagos). Estas enzimas alteran la capa muscular protectora del intestino, Así como la piel de la zona perineal.
Las proteína de patata tanto crudas como purificadas (inhibidores de la proteasa) inhiben la actividad de las proteasas fecales (Azocaseína en hidrólisis) y la actividad de la elastasa de macrófagos (N-succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-leucin-p-nitroanilida). El ZP (crudo o purificado) también inhibe las enzimas pancreáticas purificadas, tripsina, quimotripsina y elastasa.
En una prueba cutánea, se desarrolló dermatitis en 24 h usando proteasas pancreáticas purificadas disueltas en sobrenadantes fecales esterilizados. Esta prueba es microbiológicamente segura, pero los efectos adicionales de los compuestos fecales, tales como los ácidos biliares, están intactos. La dermatitis se impidió por completo mediante la adición de inhibidores de la proteasa de patata crudos o purificados para analizar la solución.
Probablemente no sea inteligente usar sobrenadantes fecales de nuevo (por razones de seguridad), pero una mezcla de las 3 enzimas purificadas en las concentraciones adecuadas tiene el mismo efecto. La azocaseína es un sustrato que se hidroliza por la acción de varias enzimas hidrolíticas, aunque también se pueden analizar sustratos específicos enzimáticos. El STI es sólo uno de los inhibidores de la soja, que inhibe la tripsina y la quimotripsina, pero no la elastasa.
Figuras
Figura 1: Inhibición de la actividad proteolítica fecal por los productos del zumo de patata.
Se usaron heces de 1 paciente con una bolsa funcionando bien.
Las heces se usaron sin diluir.
Se usaron EURO a unas diluciones de 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 y 1:100 en tampón fosfato a pH 7,6.
Las heces y el EURO se mezclaron a 1:1 durante 10 minutos, después la mezcla se diluyó en tampón fosfato a pH 7,6 a 1:12,5.
En ambas diluciones la actividad proteolítica se midió con azocaseína como sustrato.
Figura 2: Inhibición de la actividad proteolítica fecal por los productos del zumo de patata.
Se usaron heces de 1 paciente con una ileostomía.
Las heces se usaron sin diluir.
Se usaron EURO a unas diluciones de 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 y 1:100 en tampón fosfato a pH 7,6.
Las heces y el EURO se mezclaron a 1:1 durante 10 minutos, después la mezcla se diluyó en tampón fosfato a pH 7,6 a 1:12,5.
En ambas diluciones la actividad proteolítica se midió con azocaseína como sustrato.
Figura 3: Inhibición de la actividad proteolítica fecal por los productos del zumo de patata.
Se usaron heces de 1 paciente 14 días después de una colectomía.
Las heces se usaron sin diluir.
Se usaron EURO a unas diluciones de 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 y 1:100 en tampón fosfato a pH 7,6.
Las heces y el EURO se mezclaron a 1:1 durante 10 minutos, después la mezcla se diluyó en tampón fosfato a pH 7,6 a 1:12,5.
En ambas diluciones la actividad proteolítica se midió con azocaseína como sustrato.
Figura 4 y Figura 5: Inhibición de la actividad proteolítica fecal por los productos del zumo de patata.
Se usaron heces de 2 bebés de 4 meses de edad.
Las heces se usaron diluidas a 1:1 en tampón fosfato a pH 7,6 y se centrifugaron a 10 minutos a 10.000 g.
Se usaron EURO a unas diluciones de 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 y 1:100 en tampón fosfato a pH 7,6.
Las heces y el EURO se mezclaron a 1:1 durante 10 minutos, después la mezcla se diluyó en tampón fosfato a pH 7,6 a 1:12,5.
En ambas diluciones la actividad proteolítica se midió con azocaseína como sustrato.
Figura 6: Se colocaron cámaras de pruebas con parches (van der Bend) de 10 x 10 mm, llenas de 50 \mul de una solución de prueba en la piel de la parte superior del dorso de 2 sujetos sanos y se fijaron con esparadrapo adhesivo Fixomull Stretch; la distancia entre ellos fue de 15 mm. Una serie de 4 cámaras de prueba se colocó desde la parte craneal a la cauda, una segunda serie se colocó desde la parte caudal a la craneal.
Las soluciones de prueba tenían la siguiente composición:
A.
elastasa, tripsina y \alpha-quimotripsina, concentración final de cada una de las enzimas 1% (mezcla de enzimas) en solución e sobrenadante fecal esterilizado procedente de un paciente con ileostomía (FS)
B.
FS
C.
Euro 2 (concentración final 5%) en solución en FS con mezcla de enzimas.
D.
Euro 2 en FS
Después de 24 horas, se retiraron las cámaras de prueba y la piel se lavó con agua corriente, Los puntos se inspeccionaron en busca de dermatitis y eritema después de 1, 2, 4, 6 y 24 horas
Figura 7: La misma prueba en parche que se ha descrito en la figura 6, pero la fracción de los inhibidores crudos se reemplazó con la fracción más purificada (EURO 3). E. EURO 3 en agua destilada.

Claims (12)

1. Uso de un inhibidor derivado de tubérculo o raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreática y de granulocitos para preparar una composición farmacéutica para reducir o prevenir la inflamación causada por las heces.
2. Uso de un inhibidor derivado de tubérculo o raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreática y de granulocitos para preparar una composición farmacéutica para reducir o prevenir la inflamación, en la que dicha inflamación es una inflamación intestinal perineal, perianal o periestomal.
3. Uso de un inhibidor derivado de tubérculo o raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreática y de granulocitos para preparar una composición para la atención personal para reducir o prevenir una inflamación causada por heces o una inflamación intestinal perineal, perianal o periestomal.
4. Uso de un inhibidor derivado de tubérculo o raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreática y de granulocitos para preparar un pañal.
5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha actividad proteolítica es fecal.
6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho inhibidor es un derivado de patata.
7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho inhibidor es capaz de inhibir la papaína y/o la pronasa.
8. Zumo de patata para usar como medicamento.
9. Una composición para la atención personal, que comprende una mezcla concentrada de inhibidores de la proteasa derivados de tubérculo o raíz de patata.
10. Un pañal que comprende zumo de patata.
11. Una composición para la atención personal para reducir o prevenir una inflamación causada por heces o una inflamación intestinal perineal, perianal o periestomal, en la que dicha composición comprende zumo de patata.
12. Un pañal que comprende un inhibidor derivado de tubérculo o raíz de actividad proteolítica de proteasa pancreático o de granulocitos.
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