ES2247795T3 - Compuestos calcioliticos. - Google Patents

Abstract

Un compuesto seleccionado del grupo constituido por: (R)-N-[2-hidroxi-3-(2-ciano-4-(2- carboetoxietil)fenoxi)propil]-1, 1-dimetil-2-(2- naftil)etilamina; (R)-N-[2-hidroxi-3-(2-ciano-4-(2- carboxietil)fenoxi)propil]-1, 1-dimetil-2-(2- naftil)etilamina; y sus sales y complejos farmacéuticamente aceptables.

Description

Compuestos calciolíticos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos compuestos calciolíticos, a composiciones farmacéuticas que contienen estos compuestos y a su uso como antagonistas de receptores de calcio.

En mamíferos, el Ca^{2+} está bajo control homeostático estricto y regula varios procesos tales como la coagulación de la sangre, la excitabilidad nerviosa y muscular y la formación ósea apropiada. El Ca^{2+} extracelular inhibe la secreción de la hormona paratiroidea ("PTH") de las células paratiroideas, inhibe la resorción ósea por los osteoclastos y estimula la secreción de calcitonina de células C. Las proteínas receptoras de calcio permiten que ciertas células especializadas respondan a cambios en la concentración de Ca^{2+} extracelular.

La PTH es el factor endocrino principal que regula la homeostasis del Ca^{2+} en la sangre y en los fluidos extracelulares. La PTH, mediante su acción sobre células óseas y renales, incrementa el nivel de Ca^{2+} en sangre. Este incremento en el Ca^{2+} extracelular actúa entonces como una señal de retroalimentación negativa, disminuyendo la secreción de PTH. La relación recíproca entre el Ca^{2+} extracelular y la secreción de PTH forma un mecanismo importante que mantiene la homeostasis del Ca^{2+} en el cuerpo.

El Ca^{2+} extracelular actúa directamente sobre las células paratiroideas para regular la secreción de PTH. Se ha confirmado la existencia de una proteína en la superficie de las células paratiroideas que detecta los cambios en el Ca^{2+} extracelular. Véase Brown y col., Nature 366:574, 1993. En las células paratiroideas, esta proteína, el receptor de calcio, actúa como un receptor para el Ca^{2+} extracelular, detecta cambios en la concentración iónica del Ca^{2+} extracelular, e inicia una respuesta celular funcional, la secreción de PTH.

El Ca^{2+} extracelular influye en diversas funciones celulares, examinadas en Nemeth y col., Cell Calcium 11:319, 1990. Por ejemplo, el Ca^{2+} extracelular desempeña un papel en las células parafoliculares (células C) y paratiroideas. Véase Nemeth, Cell Calcium 11:323, 1990. También se ha estudiado el papel del Ca^{2+} extracelular sobre los osteoclastos óseos. Véase Zaidi, Bioscience Reports 10:493, 1990.

Se conocen diversos compuestos que mimetizan los efectos del Ca^{2+} extracelular sobre una molécula receptora de calcio. Los calciolíticos son compuestos capaces de inhibir la actividad receptora de calcio, causando así un descenso en una o más actividades del receptor de calcio provocadas por el Ca^{2+} extracelular. El documento WO 97/37967 describe compuestos calciolíticos, el uso de compuestos calciolíticos para inhibir la actividad receptora de calcio y/o conseguir efectos beneficiosos en un paciente y técnicas que se pueden usar para obtener compuestos calciolíticos adicionales. Los calciolíticos son útiles como moléculas principales en el descubrimiento, desarrollo, diseño, modificación y/o construcción de moduladores del calcio útiles que son activos sobre los receptores de Ca^{2+}. Tales calciolíticos son útiles en el tratamiento de diversos estados de enfermedad caracterizados por niveles anormales de uno o más componentes, por ejemplo, polipéptidos tales como hormonas, enzimas o factores de crecimiento, cuya expresión y/o secreción está regulada o afectada por la actividad de uno o más receptores de Ca^{2+}. Los trastornos o enfermedades diana para los compuestos calciolíticos incluyen enfermedades que implican una homeostasis ósea y mineral anormal.

La homeostasis anormal del calcio está caracterizada por una o más de las siguientes actividades: un aumento o descenso anormal del calcio en suero; un aumento o descenso anormal en la excreción de calcio en orina; un aumento o descenso anormal en los niveles de calcio óseo (por ejemplo, valorada por medidas de densidad mineral ósea); una absorción anormal del calcio en la dieta; un aumento o descenso anormal en la producción y/o liberación de mensajeros que afectan a los niveles de calcio en suero tales como la PTH y la calcitonina; y un cambio anormal en la respuesta provocada por los mensajeros que afectan a los niveles de calcio en suero.

Así, los antagonistas del receptor de calcio ofrecen una aproximación única con respecto a la farmacoterapia de enfermedades asociadas a la homeostasis ósea o mineral anormal, tales como hipoparatiroidismo, osteosarcoma, enfermedad periodontal, curación de fracturas, artrosis, artritis reumatoide, enfermedad de Paget, hipercalcemia humoral asociada a tumores y curación de fracturas y osteoporosis.

Resumen de la invención

La presente invención comprende nuevos compuestos antagonistas del receptor de calcio y su uso como antagonistas del receptor de calcio en el tratamiento de una variedad de enfermedades asociadas a la homeostasis ósea o mineral anormal, incluyendo pero no limitado a hipoparatiroidismo, osteosarcoma, enfermedad periodontal, curación de fracturas, artrosis, artritis reumatoide, enfermedad de Paget, hipercalcemia humoral asociada a tumores y curación de fracturas y osteoporosis.

La presente invención además proporciona el uso de un compuesto de la invención en la fabricación de un medicamento para antagonizar receptores de calcio en un animal, incluyendo humanos, que comprende la administración a un animal en necesidad del mismo de una cantidad eficaz de un compuesto de la invención.

La presente invención además proporciona el uso de un compuesto de la invención en la fabricación de un medicamento para el incremento de los niveles paratiroideos en suero en un animal, incluyendo humanos, que comprende la administración a un animal en necesidad del mismo de una cantidad eficaz de un compuesto de la invención.

Descripción detallada de la invención

Los compuestos de la presente invención se seleccionan entre:

(R)-N-[2-hidroxi-3-(2-ciano-4-(2-carboetoxietil)fenoxi)propil]-1,1-dimetil-2-(2-naftil)etilamina;

(R)-N-[2-hidroxi-3-(2-ciano-4-(2-carboxietil)fenoxi)propil]-1,1-dimetil-2-(2-naftil)etilamina;

y sus sales y complejos farmacéuticamente aceptables.

Las sales farmacéuticamente aceptables son sales no tóxicas en las cantidades y concentraciones a las cuales son administradas.

Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición ácida tales como aquellas que contienen sulfato, clorhidrato, fumarato, maleato, fosfato, sulfamato, acetato, citrato, lactato, tartrato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluensulfonato, ciclohexilsulfamato y quinato. Una sal preferida es un clorhidrato. Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden obtener a partir de ácidos tales como ácido clorhídrico, ácido maléico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido sulfámico, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido ciclohexilsulfámico, ácido fumárico y ácido quínico.

Las sales farmacéuticamente aceptables también incluyen sales de adición básica tales como aquellas que contienen benzatina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina, procaína, aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio, amonio, alquilamina y cinc, cuando están presentes grupos funcionales ácidos, tales como ácido carboxílico o fenol.

La presente invención proporciona compuestos que se pueden preparar usando técnicas habituales. Una estrategia global para la preparación de compuestos preferidos descritos en el presente documento se puede llevar a cabo como se describe en esta sección. El ejemplo que sigue ilustra la síntesis de compuestos específicos. Usando los protocolos descritos en el presente documento como modelo, alguien con conocimientos ordinarios en la materia puede producir fácilmente otros compuestos de la presente invención.

Todos los reactivos y disolventes se obtuvieron de vendedores comerciales. Los materiales de partida (por ejemplo, aminas y epóxidos) se sintetizaron usando técnicas y procedimientos habituales.

\vskip1.000000\baselineskip

Esquema 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

\newpage

Esquema 2

2

Preparación general

Un procedimiento general usado para sintetizar muchos de los compuestos se puede llevar a cabo como se ha descrito en el Esquema 1: una disolución de alcohol arílico en acetona se trató con una base apropiada tal como K_{2}CO_{3}, se calentó durante 15 minutos, se añadió nosilato de R-glicidilo y se prosiguió con la reacción durante toda la noche para dar el glicidil éter correspondiente. En el caso de un alcohol alquílico (por ejemplo, Y_{3} es O-alquileno C_{1-4}), se usó una base más fuerte, por ejemplo NaH en DMF. Este procedimiento también se puede usar para alcoholes arílicos. Una disolución del glicidil éter sustituido y una amina en exceso (normalmente 1,1-dimetil-2-(4-metiloxifenil)-etilamina) en etanol puro, acetonitrilo, THF o cualquier otro disolvente similar en presencia de un catalizador adecuado tal como LiClO_{4} se agitó a temperatura de reflujo durante toda la noche. El producto se purificó por cromatografía de fase normal. Las sales clorhidrato se prepararon por tratamiento de la base libre correspondiente con HCl en fase gaseosa o en disolución en dioxano 4 M, o cualquier otro procedimiento habitual.

El Esquema 2 resume la síntesis general de (R)-N-[2-hidroxi-3-(2-ciano-4-(2-carboetoxietil)fenoxi)propil]-1,1-dimetil-2-(2-naftil)etilamina. La síntesis de los compuestos restantes de la invención se consigue mediante procedimientos análogos a los anteriores y a aquellos descritos en la Sección experimental.

Para usar un compuesto de la invención o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para el tratamiento de humanos y otros mamíferos, normalmente se formula como una composición farmacéutica de acuerdo con la práctica farmacéutica habitual.

Los compuestos calciolíticos se pueden administrar por diferentes vías incluyendo administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, oral, tópica (transdérmica), o transmucosa. Para la administración sistémica, se prefiere la administración por vía oral. Para la administración por vía oral, por ejemplo, los compuestos se pueden formular en formas de dosificación orales convencionales tales como cápsulas, comprimidos y preparaciones líquidas tales como jarabes, elixires y gotas concentradas.

Alternativamente, se puede usar la inyección (administración parenteral), por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para la inyección, los compuestos de la invención se formulan en disoluciones líquidas, preferentemente, en tampones o disoluciones fisiológicamente compatibles, tales como solución salina, solución de Hank, o solución de Ringer. Además, los compuestos se pueden formular en forma sólida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes de su uso. También se pueden producir formas liofilizadas.

La administración sistémica también puede ser por medio transmucosa o transdérmico. Para la administración por vía transmucosa o transdérmica, en las formulaciones se usan agentes penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear. Tales agentes penetrantes son conocidos de manera general en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración por vía transmucosa, sales biliares y derivados del ácido fusídico. Además, se pueden usar detergentes para facilitar la permeación. La administración por vía transmucosa, por ejemplo, puede ser mediante pulverizadores nasales, supositorios rectales, o supositorios vaginales.

Para la administración tópica, los compuestos de la invención se pueden formular en ungüentos, pomadas, geles, o cremas, como es conocido de manera general en la técnica.

Las cantidades de diversos compuestos calciolíticos que se van a administrar se pueden determinar mediante procedimientos habituales teniendo en cuenta factores tales como la CI_{50}, la CE_{50} del compuesto, la semi-vida biológica del compuesto, la edad, tamaño y peso del paciente y la enfermedad o trastorno asociado al paciente. La importancia de éstos y otros factores que deben considerarse es conocida por aquellos con conocimientos ordinarios en la materia.

Las cantidades administradas también dependen de las vías de administración y el grado de biodisponibilidad oral. Por ejemplo, para compuestos con una baja biodisponibilidad oral se tendrán que administrar dosis relativamente superiores.

Preferentemente la composición está en forma de dosificación unitaria. Para la aplicación por vía oral, por ejemplo, se puede administrar un comprimido, o una cápsula; para la aplicación por vía nasal, se puede administrar una dosis en aerosol medida; para la aplicación transdérmica, se puede administrar una formulación tópica o parche y para la administración transmucosa, se puede administrar un parche bucal. En cada caso, la dosificación es tal que al paciente se puede administrar una única dosis.

Cada unidad de dosificación para la administración por vía oral contiene convenientemente entre 0,01 y 500 mg/kg y preferentemente entre 0,1 y 50 mg/kg de un compuesto de la invención o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, calculado como base libre. La dosificación diaria para las vías parenteral, nasal, inhalación oral, transmucosa o transdérmica contiene convenientemente entre 0,01 y 100 mg/kg de un compuesto de la invención. Una formulación tópica contiene convenientemente entre el 0,01 y el 5,0% de un compuesto de la invención. El principio activo se puede administrar, por ejemplo, entre 1 y 6 veces al día, preferentemente una vez, suficiente para mostrar la actividad deseada, como es fácilmente evidente para alguien experto en la materia.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" de una enfermedad incluye, pero no está limitado a la prevención, retardo y profilaxis de la enfermedad.

Las enfermedades y trastornos que se podrían tratar o prevenir, en relación a las células afectadas, incluyen enfermedades o trastornos relacionados con los huesos y los minerales; hipoparatiroidismo; aquellos del sistema nervioso central tales como ataques, ictus, traumatismo craneoencefálico, lesiones de la espina dorsal, lesión de las células nerviosas inducida por hipoxia, tal como ocurre en parada cardiaca o en la dificultad respiratoria del neonato, epilepsia, enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson, demencia, tensión muscular, depresión, ansiedad, trastornos de pánico, trastorno obsesivo-compulsivo, trastorno de estrés postraumático, esquizofrenia, síndrome neuroléptico maligno y síndrome de Tourette; enfermedades que implican una reabsorción excesiva de agua por el riñón, tal como el síndrome de la secreción inadecuada de la ADH (SIADH), cirrosis, insuficiencia cardiaca congestiva, nefrosis; hipertensión; prevención y/o disminución de la toxicidad renal por antibióticos catiónicos (por ejemplo, antibióticos de aminoglicósido); trastornos de la motilidad del intestino tales como diarrea y colon espástico; enfermedades de úlceras gastrointestinales; enfermedades gastrointestinales con absorción excesiva de calcio tales como sarcoidosis; enfermedades autoinmunes y rechazo al trasplante de órganos; carcinoma de células escamosas; y pancreatitis.

En una forma de realización preferida de la presente invención, los presentes compuestos se usan para incrementar los niveles de hormona paratiroidea ("PTH") en suero. El incremento de los niveles de PTH en suero puede ser útil en el tratamiento de enfermedades tales como hipoparatiroidismo, osteosarcoma, enfermedad periodontal, fractura, artrosis, artritis reumatoide, enfermedad de Paget, hipercalcemia humoral, tumores y osteoporosis.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento de un paciente que comprende la administración al paciente de una cantidad de un presente compuesto suficiente para incrementar el nivel de PTH en suero. Preferentemente, el procedimiento se lleva a cabo administrando una cantidad de un compuesto eficaz para provocar un incremento en la duración y/o cantidad del nivel de PTH en suero suficiente para tener un efecto terapéutico.

En diversas formas de realización, el compuesto administrado a un paciente provoca un incremento en la PTH en suero que tiene una duración de hasta una hora, de aproximadamente una a aproximadamente veinticuatro horas, de aproximadamente una a aproximadamente doce horas, de aproximadamente una a aproximadamente seis horas, de aproximadamente una a aproximadamente cinco horas, de aproximadamente una a aproximadamente cuatro horas, de aproximadamente dos a aproximadamente cinco horas, de aproximadamente dos a aproximadamente cuatro horas, o de aproximadamente tres a aproximadamente seis horas.

En una forma de realización alternativa de la presente invención, el compuesto administrado a un paciente provoca un incremento en la PTH en suero que tiene una duración de más de veinticuatro horas aproximadamente, a condición de que se co-administre con un agente de anti-resorción.

En formas de realización adicionales diferentes, el compuesto administrado a un paciente provoca un incremento en la PTH en suero de hasta dos veces, de dos a cinco veces, de cinco a diez veces, y de al menos 10 veces, superior a la PTH en suero máxima del paciente. El nivel en suero máximo se mide con respecto a un paciente no tratado.

Las composiciones de los compuestos de la invención y sus sales farmacéuticamente aceptables que son activos cuando se administran oralmente se pueden formular como jarabes, comprimidos, cápsulas y caramelos. Una formulación en jarabe generalmente consistirá en una suspensión o disolución del compuesto o sal en un vehículo líquido, por ejemplo, etanol, aceite de cacahuete, aceite de oliva, glicerina o agua con un agente aromatizante o colorante. Cuando la composición está en forma de comprimido, se puede usar cualquier vehículo farmacéutico usado rutinariamente para la preparación de formulaciones sólidas. Los ejemplos de tales vehículos incluyen estearato de magnesio, terra alba, talco, gelatina, goma arábiga, ácido esteárico, fécula, lactosa y sacarosa. Cuando la composición está en forma de cápsula, es adecuada cualquier encapsulación rutinaria, por ejemplo usando los vehículos anteriormente mencionados en una cápsula de cubierta de gelatina dura. Cuando la composición está en forma de cápsula de cubierta de gelatina blanda se puede considerar cualquier vehículo farmacéutico usado rutinariamente para la preparación de dispersiones o suspensiones, por ejemplo gomas acuosas, celulosas, silicatos o aceites y se incorporan en una cápsula de cubierta de gelatina blanda.

Las composiciones parenterales típicas consisten en una disolución o suspensión de un compuesto o sal en un vehículo estéril acuoso o no acuoso que opcionalmente contiene un aceite parenteralmente aceptable, por ejemplo polietilenglicol, polivinilpirrolidona, lecitina, aceite de araquis o aceite de sésamo.

Las composiciones para inhalación típicas están en forma de disolución, suspensión o emulsión que se puede administrar como un polvo seco o en forma de aerosol usando un agente propulsor convencional tal como diclorodifluorometano o triclorofluorometano.

Una formulación en supositorio típica comprende un compuesto de la invención o una de sus sales farmacéuticamente aceptables que es activa cuando se administra por esta vía, con un agente aglutinante y/o lubricante, por ejemplo glicoles poliméricos, gelatinas, manteca de coco u otras ceras o grasas vegetales de bajo punto de fusión y sus análogos sintéticos.

Las formulaciones dérmicas y transdérmicas típicas comprenden un vehículo acuoso o no acuoso convencional, por ejemplo una crema, ungüento, loción o pasta o están en forma de apósito, parche o membrana medici-
nal.

Preferentemente la composición está en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo un comprimido, cápsula o dosis de aerosol medida, de manera que el paciente se puede administrar una única dosis.

No se esperan efectos toxicológicos inaceptables cuando los compuestos de la presente invención se administran de acuerdo con la presente invención.

La actividad biológica de los compuestos de la invención se demuestra mediante las siguientes pruebas:

(I) Ensayo del inhibidor del receptor de calcio

La actividad calciolítica se midió determinando la CI_{50} del compuesto de prueba bloqueando los incrementos de Ca^{2+} intracelular provocado por el Ca^{2+} extracelular en células HEK 293 4,0-7 que expresan de manera estable el receptor de calcio humano. Las células HEK 293 4,0-7 se construyeron como se describe por Rogers y col., J. Bone Miner. Res. 10, Suppl. 1:S483, 1995 (incorporada en el presente documento por referencia). Los incrementos de Ca^{2+} intracelular se provocaron incrementando el Ca^{2+} extracelular de 1 a 1,75 mM. El Ca^{2+} intracelular se midió usando fluo-3, un indicador fluorescente de calcio.

El procedimiento fue como sigue:

1.

Las células se mantuvieron en matraces T-150 en medios de selección (DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10% y 200 \mug/ml de higromicina B), en CO_{2}:aire 5%:95% a 37ºC y se crecieron hasta una confluencia del 90%.

2.

El medio se decantó y la monocapa de células se lavó dos veces con tampón fosfato salino (PBS) mantenido a 37ºC. Después del segundo lavado, se añadieron 6 ml de EDTA en PBS al 0,02% y se incubó durante 4 minutos a 37ºC. Después de la incubación, las células se dispersaron mediante agitación suave.

3.

Las células de 2 ó 3 matraces se reunieron y se sedimentaron (100 x g). El sedimento celular se resuspendió en 10-15 ml de SPF-PCB+ y se sedimentó de nuevo por centrifugación. Este lavado se hizo dos veces. El tampón para células paratiroideas exento de sulfato y fosfato (SPF-PCB) contiene Na-Hepes 20 mM, pH 7,4, NaCl 126 mM, KCl 5 mM y MgCl_{2} 1 mM. Se preparó el SPF-PCB y se almacenó a 4ºC. El día de su uso, el SPF-PCB se suplementó con 1 mg/ml de D-glucosa y CaCl_{2} 1 mM y a continuación se separó en dos fracciones. A una fracción se le añadió seroalbúmina bovina (BSA; fracción V, ICN) a 5 mg/ml (SPF-PCB+). Este tampón se usó para lavar, cargar y mantener las células. La fracción exenta de BSA se usó para diluir las células en la cubeta para las medidas de fluorescencia.

4.

El sedimento se resuspendió en 10 ml de SPF-PCB+ que contiene fluo-3 2,2 \muM (Molecular Probes) y se incubó a temperatura ambiente durante 35 minutos.

5.

Después del periodo de incubación, las células se sedimentaron por centrifugación. El sedimento resultante se lavó con SPF-PCB+. Después de este lavado, las células se resuspendieron en SPF-PCB+ a una densidad de 1-2 x 10^{6} células/ml.

6.

Para la lectura de las señales de fluorescencia, se diluyeron 300 \mul de la suspensión celular en 1,2 ml de tampón SPF que contiene CaCl_{2} 1 mM y 1 mg/ml de D-glucosa. Las medidas de fluorescencia se realizaron a 37ºC con agitación constante usando un espectrofluorímetro. Las longitudes de onda de excitación y emisión se midieron a 485 y 535 nm, respectivamente. Para calibrar las señales de fluorescencia, se añadió digitonina (5 mg/ml en etanol) para obtener la F_{máx} y la F_{\text{mín}} aparente se determinó añadiendo Tris-EGTA (Tris-Base 2,5 M, EGTA 0,3 M). La concentración de calcio intracelular se calculó usando la siguiente ecuación:

Calcio intracelular = (F-F_{\text{mín}}/F_{máx}) x K_{d}; en la que K_{d} = 400 nM.

7.

Para determinar la actividad calciolítica potencial de los compuestos de prueba, las células se incubaron con el compuesto de prueba (o el vehículo como control) durante 90 segundos antes de incrementar la concentración de Ca^{2+} de 1 a 2 mM. Los compuestos calciolíticos se detectaron por su capacidad para bloquear, de una manera dependiente de la concentración, los incrementos en la concentración de Ca^{2+} intracelular provocada por el Ca^{2+} extracelular.

En general, aquellos compuestos que tienen valores de CI_{50} inferiores en el Ensayo del inhibidor del receptor de calcio son compuestos más preferidos. Los compuestos que tienen una CI_{50} superior a 50 \muM se considera que son inactivos. Los compuestos preferidos son aquellos que tienen una CI_{50} de 10 \muM o inferior, los compuestos más preferidos tienen una CI_{50} de 1 \muM y los compuestos aún más preferidos tienen una CI_{50} de 0,1 \muM o inferior.

(II) Ensayo de unión al receptor de calcio

Las células HEK 293 4,0-7 transfectadas de manera estable con el receptor de calcio paratiroideo humano ("HuPCaR") se multiplicaron en matraces de cultivo de tejidos T180. La membrana plasmática se obtuvo por homogenización en politrón o se homogeneizó en un Dounce de cristal en tampón (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, EDTA 1 mM, MgCl_{2} 3 mM) en presencia de un cóctel inhibidor de protestas que contiene leupectina 1 \muM, pepstatina 0,04 \muM y PMSF 1 mM. La membrana alicuotada se criofracturó y se almacenó a -80ºC. El compuesto marcado con ^{3}H se radiomarcó para una actividad específica de 44 Ci/mmol y se alicuotó y se almacenó en nitrógeno líquido por estabilidad radioquímica.

Una mezcla de reacción típica contiene compuesto ^{3}H ((R,R)-N-4'-metoxi-t-3-3'-metil-1'-etilfenil-1-(1-naftil) etilamina) 2 nM, o compuesto ^{3}H (R)-N-[2-hidroxi-3-(3-cloro-2-cianofenoxi)propil]-1,1-dimetil-2-(4-metoxifenil)-etilamina, 4-10 \mug de membrana en tampón de homogenización que contiene gelatina al 0,1% y EtOH al 10% en un volumen de reacción de 0,5 ml. La incubación se realizó en 12 x 75 tubos de polietileno en un baño de agua en hielo. A cada tubo se añadió 25 \mul de la muestra de prueba en EtOH al 100%, seguido de 400 \mul de tampón de incubación frío y 25 \mul de compuesto ^{3}H 40 nM en EtOH al 100% para una concentración final de 2 nM. La reacción de unión se inició mediante la adición de 50 \mul de 80-200 \mug/ml de membrana de HEK 293 4,0-7 diluida en tampón de incubación y se dejó incubar a 4ºC durante 30 minutos. El tampón de lavado es Tris-HCl 50 mM que contiene PEI al 0,1%. La unión no específica se determinó mediante la adición de un exceso de 100 veces de ligando homólogo no marcado y generalmente es el 20% de la unión total. La reacción de unión se detuvo mediante filtración rápida sobre filtros GF/C pretratados con PEI al 1% usando un Brandel Harvestor. Los filtros se colocaron en el fluido de centelleo y la radiactividad se valoró por recuento de centelleo en líquidos.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitantes de las formas de realización de la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación de (R)-N-[2-hidroxi-3-(2-ciano-4-(2-carboetoxietil)fenoxi)propil]-1,1-dimetil-2-(2-naftil)etilamina (a) 3-(3-ciano-4-hidroxifenil)propionato de etilo

A 25,2 g (0,13 mol) 3-(4-hidroxifenil)propionato de etilo en 300 ml de tolueno seco se añadieron 12,4 ml (0,052 mol) de tri-n-butilamina en argón seguido de 1,5 ml (0,013 mol) de cloruro de estaño (IV). Después de agitar durante 10 minutos, se añadieron 8,6 g de paraformaldehído y la reacción se calentó a reflujo en argón durante 18 h.

La reacción se enfrió y se concentró hasta un aceite oscuro que se sometió a cromatografía súbita en columna en gel de sílice eluyendo con hexano:acetato de etilo 90:10 (v/v). Se obtuvieron 5,3 g de producto (18,6%). La elución posterior con hexano:acetato de etilo 70:30 (v/v) dio 12 g del material de partida.

A una disolución de 10 g (0,045 mol) del aldehído anterior en 200 ml de etanol puro se añadieron 6,1 g (0,06 mol) de trietilamina seguido de 3,48 g (0,05 mol) de clorhidrato de hidroxilamina. La reacción se agitó en argón a temperatura de reflujo durante 18 h. La reacción se concentró. El aceite residual se disolvió en acetato de etilo y se lavó con HCl 1 N. La fase del acetato de etilo se secó, se filtró y se concentró hasta un aceite que se trató con 100 ml de anhídrido acético y se calentó a reflujo en argón durante 30 minutos. La reacción se concentró. El aceite resultante se disolvió en acetato de etilo y se lavó con agua. La capa de acetato de etilo se secó, se filtró y se concentró hasta un aceite que se disolvió en 200 ml de etanol y se trató con una disolución de 9,54 g de carbonato sódico (0,09 mol) en 50 ml de agua. Después del agitar a temperatura ambiente durante 5 h la mezcla se neutralizó con HCl 3 N hasta pH 5 y se concentró. La mezcla resultante se extrajo con acetato de etilo. La disolución de acetato de etilo se secó, se filtró y se concentró hasta un aceite que solidificó en el almacenaje: 9,5 g (97%).

(b) 3-(3-ciano-4-(R)-glicidiloxifenil)propionato de etilo

Una disolución de 7,7 g (0,035 mol) de 3-(3-ciano-4-hidroxifenil)propionato de etilo y 9,1 g (0,035 mol) de 2-(R)-glicidil-3-nitrobencenosulfonato en 100 ml de acetona seca se trató con 7,6 g (0,055 mol) de carbonato potásico y se calentó a reflujo en argón durante 18 h. La reacción se enfrió y se filtró. El filtrado se concentró y se purificó por cromatografía súbita en columna de gel de sílice eluyendo con hexano:acetato de etilo 70:30 para dar 6 g (62%) del epóxido.

(c) (R)-N-[2-hidroxi-3-(2-ciano-4-(2-carboetoxietil)fenoxi)propil]-1,1-dimetil-2-(2-naftil)etilamina

Una disolución de 2,69 g (0,098 mol) del epóxido y 1,95 g de la amina (0,098 mol) se calentó a reflujo en 75 ml de etanol en argón durante 18 h. La reacción se concentró y el residuo se purificó por cromatografía súbita en columna de gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno:metanol 95:5 (v/v) para dar 4,0 g del producto deseado (86%).

Ejemplo 2 Preparación de la sal sódica de la (R)-N-[2-hidroxi-3-(2-ciano-4-(2-carboxietil)fenoxi)propil]-1,1-dimetil-2-(2-naftil)etilamina

A una disolución agitada de 100 mg del éster etílico (0,21 mmol) en 5 ml de etanol se añadió 1 ml de hidróxido sódico 1 N (1 mmol). La mezcla se agitó durante 4 h y a continuación se concentró, se diluyó con 0,5 ml de agua y el pH se ajustó a 4 aproximadamente con ácido clorhídrico 3 N. La mezcla se decantó y la goma residual se trató con 2 ml de ácido clorhídrico 1 N en metanol y se concentró. A continuación el residuo se concentró cuatro veces en etanol. El sólido resultante se trituró con éter, se filtró y se secó sobre vacío para dar 60 mg de un polvo blanco (64%). ES-MS, m/z 446,7 (M+H).

Ejemplo 3 Formulación en inhalador

Un compuesto de la invención (1 mg a 100 mg) se hizo aerosol a partir de un inhalador de dosis medida para administrar la cantidad de fármaco por uso deseada.

Ejemplo 4 Formulación en comprimido

Comprimidos/principios	Por comprimido
1. Principio activo (Cmp. de la invención)	40 mg
2. Fécula de maíz	20 mg
3. Ácido algínico	20 mg
4. Alginato sódico	20 mg
5. Estearato de Mg	13 mg

Procedimiento para la formulación en comprimidos

Los principios 1, 2, 3 y 4 se mezclan en un triturador/mezclador adecuado. Se añade agua suficiente a la mezcla de forma fraccionada, con la mezcla cuidadosa después de cada adición, hasta que la masa tiene una consistencia que permite su conversión a gránulos húmedos. La masa húmeda se convierte a gránulos pasándola a través de un granulador oscilante usando un filtro de red del Nº 8 (2,38 mm). A continuación los gránulos húmedos se secan en un horno a 140ºF (60ºC) hasta sequedad. Los gránulos secos se lubrican con el principio Nº 5 y los gránulos lubricados se comprimen en una prensa de comprimidos adecuada.

Ejemplo 5 Formulación parenteral

Se prepara una composición farmacéutica para la administración por vía parenteral disolviendo una cantidad apropiada de un compuesto de la invención en polietilenglicol con calentamiento. A continuación esta disolución se diluye con agua para inyecciones (hasta 100 ml). A continuación la disolución se esteriliza por filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 micrómetros y se sella en contenedores estériles.

Claims (7)

1. Un compuesto seleccionado del grupo constituido por:

(R)-N-[2-hidroxi-3-(2-ciano-4-(2-carboetoxietil)fenoxi)propil]-1,1-dimetil-2-(2-naftil)etilamina;

(R)-N-[2-hidroxi-3-(2-ciano-4-(2-carboxietil)fenoxi)propil]-1,1-dimetil-2-(2-naftil)etilamina;

y sus sales y complejos farmacéuticamente aceptables.

2. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por una homeostasis ósea o mineral anormal que comprende un compuesto según la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. El uso de un compuesto según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para antagonizar un receptor de calcio.

4. El uso de un compuesto según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por una homeostasis ósea o mineral anormal.

5. Un uso según la reivindicación 4 en el que la enfermedad o trastorno óseo o mineral se selecciona del grupo constituido por osteosarcoma, enfermedad periodontal, curación de fracturas, artrosis, artritis reumatoide, enfermedad de Paget, hipercalcemia humoral, tumores malignos y osteoporosis.

6. Un uso según la reivindicación 5 en el que la enfermedad o trastorno óseo o mineral es osteoporosis.

7. El uso de un compuesto según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para el incremento de los niveles paratiroideos en suero.