ES2252017T3 - Utilizacion de vectores virales y de moleculas cargadas en terapia genica. - Google Patents

Abstract

Utilización de un vector de ácido nucleico para la preparación de una composición farmacéutica destinada a introducir un vector de ácido nucleico en una célula viva, en la que dicho vector es un vector viral de la familia Herpesviridae, y dicho vector se introduce en dicha célula mediante un método que comprende poner en contacto dicha célula con dicho vector y, antes, durante o después de poner en contacto dicha célula con dicho vector, poner en contacto dicha célula con un medio líquido que comprende un compuesto que, en dicho medio, está cargado, no es citotóxico y es capaz de facilitar la adquisición del vector por la célula, en la que dicha célula se encuentra en un mamífero.

Description

Utilización de vectores virales y de moléculas cargadas en terapia génica.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de vectores virales y moléculas cargadas en la terapia génica.

El músculo esquelético es un lugar de implantación ideal para el tratamiento de las miopatías primarias o para las enfermedades que necesitan la producción de proteínas circulantes, debido a que está muy vascularizado y es un excelente órgano secretor, con muchos lugares accesibles (Blau, et al., New Eng. J. Med. 333(23):1554-1556 (1995); van Deutekom et al., Neuromuscular Disorders 8(3-4):135-148 (1998); Howell et al., Human Gene Therapy 9(5):629-934 (1998); Isaka et al., Nature Med. 2(4):418-423 (1996); Pauly et al., Gene Therapy 5(4):473-480 (1998); Bohl et al., Human Gene Therapy 8(2):195-204 (1997), Takeda, Nippon Rinsho-Japanese J. Clin. Med. 55(12):3114-3119 (1997), Tsurumi et al., Circulation 96(9 Suppl.): II-382-8 (1997)). Además, la naturaleza postmitótica y la longevidad de las fibras musculares permite la expresión estable de los genes transferidos, incluso si no se encuentran integrados en el ADN cromosómico (Svensson et al., Mol. Med. Today 2(4):166-172 (1996), van Deutekom et al., Mol. Med. Today 4(5):214-220 (1998)). Además, niveles de expresión elevados en un número relativamente pequeño de fibras musculares pueden ser adecuados para el tratamiento de desórdenes metabólicos adquiridos o heredados, o para inducir una respuesta inmune suficiente para la vacunación (Davis et al., Human Mol. Gen. 2(11):1847-1851 (1993)).

Los métodos y composiciones para la introducción de un transgén en una multiplicidad de tejidos de mamíferos son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, la patente US nº 5.827.703 da a conocer un método para introducir un transgén aislado (opcionalmente con una secuencia reguladora pero sin secuencias del plásmido) en las células huésped. La patente US nº 5.728.399 se refiere a un método para la introducción de polinucleótidos en células utilizando polilisina, en la que el polinucleótido que se va a administrar puede codificar una proteína viral. La patente US nº 5.827.707 describe métodos para producir cápsulas de un volumen mínimo que contienen retrovirus. Finalmente, Arcasoy et al., (Gene Ther. 1997 enero; 4(1):32-38) y Kaplan et al., (Hum. Gene Ther. 1 julio 1998; 9(10):1469-1479) dan a conocer la utilización de vectores de adenovirus recombinantes para la administración de múltiples genes terapéuticos, en la que se utilizan policationes similares a la poli-L-lisina para incrementar la transducción de las células.

Sin embargo, la transferencia de genes a los músculo esqueléticos ha sido dificultada en parte debido a la incapacidad de la generación de vectores actual para infectar un número significativo de células (Acsadi et al., Nature 352(6338):815-818 (1991); Karpati et al., Muscle & Nerve 16(11):1141-1153; Smith et al., Nature Genetics 5(4):397-402 (1993); Acsadi et al., Human Mol. Gen. 3(4):579-584 (1994); Yang et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 91(10):4407-4411 (1994); Dai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(5):1401-1405 (1995); Huard et al., Exp. & Mol. Path. 62(2):131-143 (1995); Mulligan, Science 260(5110):926-932 (1993)). Aunque los virus adenoasociados (AAV) infectan las células musculares con efectividad e inducen una expresión génica sostenida, su capacidad para administrar y regular genes grandes es limitada. En lo que se refiere a los virus con ADN grande, tales como los virus del Herpes Simplex (HSV) y los adenovirus, las fibras musculares muestran una pérdida de susceptibilidad a la infección dependiente de la maduración (Acsadi et al., Human Mol. Gen. 3(4):579-584 (1994); Huard et al., Human Gene Therapy 8(4):439-452 (1997); Feero et al., Human Gene Therapy 8(4):371-380 (1997); Huard et al., Neuromuscular Disorders 7(5):299-313 (1997); Huard et al., J. Virol. 70(11):8117-8123 (1996); Huard et al., Gene Therapy 2(6):385-392 (1995); Inui et al., Brain & Dev. 18(5):357-361 (1996); Ragot et al., Nature 361(6413):647-650 (1993); Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(7):2581-2584 (1992); Vincent et al., Nature Genetics 5(2):130-134 (1993)). Los estudios anteriores de la infección por HSV en los roedores demuestran que la pérdida de infectividad puede ser debida a, por lo menos en parte, el desarrollo de la lámina basal durante la maduración, que puede bloquear los eventos iniciales en la infección por HSV [Huard et al., J. Virol. 70(11):8117-8123 (1996)].

El cáncer es otra enfermedad para la que se han ensayado muchas terapias. Un área de investigación intensa en el campo del cáncer es la terapia génica. La terapia génica del cáncer adolece de muchos de los mismos problemas que las terapias génicas musculares descritas anteriormente. Por ejemplo, los vectores actuales no se pueden administrar con precisión a un número suficientemente grande de células para reducir el crecimiento tumoral e incrementar la sobrevivencia del paciente.

Para iniciar la infección, el HSV se une a los glicosaminoglicanos de la superficie celular, tales como el sulfato de heparano y el sulfato de dermatano (Spear et al., Adv. Exp. Med. & Biol. 313:341-353 (1992); Shieh et al., 116(5):1273-1281 (1992); Fuller et al., J. Viro. 66(8):5002-5012 (1992); Gruenheid et al., J. Virol.67(1):93-100 (1993); Herold et al., J. Gen. Virol. 75(6):1211-1222 (1994); Banfield et al., Virology 208(2):531-539; Williams et al., J. Virol. 71(2):1375-1380 (1997)] que estabilizan el virus de tal modo que puede interactuar con las proteínas receptoras secundarias necesarias para la entrada en las células huésped [Terry-Allison et al., J. Virol. 72(7):5802-5810 (1998); Geraghty et al., Science 280(5369):1618-1620 (1998); Montgomery et al., Cell 87(3):427-436 (1996).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona la utilización de vectores de ácidos nucleicos para la preparación de composiciones farmacéuticas para la introducción de vectores (por ejemplo, vectores virales tales como los vectores de HSV) en células por administración simultánea de los vectores con una molécula cargada (por ejemplo, un polisacárido cargado, tal como un glicosaminoglicano o un análogo del mismo). La composición farmacéutica se puede utilizar para introducir genes en las células para utilización como terapia génica o vacuna.

En consecuencia, la presente invención da a conocer la utilización de vectores de ácidos nucleicos para la preparación de composiciones farmacéuticas para la introducción de un vector de ácido nucleico en una célula viva, en la que dicho vector es un vector viral de la familia Herpesviridae, y dicho vector se introduce en dicha célula mediante un método que comprende poner en contacto dicha célula con el vector y antes, durante o después de dicho poner en contacto poner en contacto la célula con un medio líquido que comprende un compuesto que, en el medio, está cargado, no es citotóxico y es capaz de facilitar la adquisición del vector en la célula, en el que la célula está en un mamífero, por ejemplo, un paciente humano. Los vectores que se pueden utilizar en la presente invención utilizan glicosaminoglicanos como receptores o coreceptores para entrar en las células. Se utilizan vectores virales de la familia Herpesviridae (por ejemplo, HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, CBV, HHV6 y HHV7). Preferentemente, los vectores están atenuados y más adelante se proporcionan ejemplos de vectores virales atenuados que se pueden utilizar en la presente invención.

Las moléculas portadoras de carga positiva o negativa, que se pueden utilizar en a presente invención incluyen los polisacáridos cargados, tales como los glicosaminoglicanos y los análogos de los mismos, polilisina, aciclodextrina y dietilaminoetano (DEAE). Los ejemplos de glicosaminoglicanos y análogos de glicosaminoglicanos que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, por ejemplo, el sulfato de dextrano, sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de condroitina, y sulfato de queratina. Una molécula cargada adicional que se puede utilizar en la presente invención es el polietilenglicol. Tal como se discute más adelante, las moléculas cargadas se pueden administrar antes de o concurrentemente con, los vectores en los métodos de la presente invención.

Las células que se pueden utilizar en la presente invención incluyen las células musculares maduras, células de retina y células cancerosas.

Las enfermedades y los estados para los que se pueden utilizar las composiciones farmacéuticas incluyen el cáncer, las miopatías primarias y las condiciones y enfermedades que se pueden tratar mediante la producción de productos terapéuticos en la circulación. Los ejemplos específicos de tales condiciones y enfermedades, así como también los genes que se pueden incluir en los vectores para efectuar su tratamiento, tales como los genes que codifican polipéptidos (por ejemplo, factores de crecimiento, enzimas, polipéptidos antiantiogénicos y polipéptidos que promocionan la muerte celular), hormonas, antígenos de vacunas, moléculas antisentido y ribozimas se describen más adelante. Además, los vectores y moléculas cargadas se pueden administrar al sujeto localmente o sistémicamente.

La presente invención proporciona muchas ventajas. Por ejemplo, los glicosaminoglicanos y los análogos de los glicosaminoglicanos, tales como el sulfato de dextrano, no son destructivos, no son tóxicos y limitan la dispersión de los vectores virales a otros lugares en el tejido. Por consiguiente, las utilizaciones de la presente invención representan una estrategia para la expresión dirigida de los genes en los vectores HSV en las células deseadas o tejidos por inyección directa. Además, el HSV es atractivo como vector para la administración de genes, debido a que su gran tamaño permite la administración de múltiples genes grandes a la vez y se puede hacer relativamente no tóxico [Huard et al., Neuromuscular Disorders 7(5):299-313 (1997); Glorioso et al., Annual Rev. Microbiol. 49:675-710 (1995)]. Además, el HSV se puede hacer crecer hasta títulos elevados, puede infectar células quiescentes con eficacia [Lim et al., Biotechniques 20(3):460-469 (1996)] y se puede controlar mediante la acción de fármacos antivirales, tales como acyclovir, que inactiva la replicación de los virus [Evrard et al., Cell Biol. & Toxic. 12(4-6):345-350 (1996); Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(8:)3525-3529 (1996); Hasegawa et al., Am. J. Resp. Cell & Mol. Biol. 8(6):655-661 (1993)]. Los vectores HSV no replicantes también son relativamente no tóxicos y por consiguiente pueden contribuir a la disminución de la inmunogenicidad de la expresión de proteínas extrañas en los tejidos. Finalmente, tal como se indicó anteriormente, el músculo esquelético es un lugar ideal para el tratamiento de las miopatías y otras enfermedades, ya que está muy vascularizado y es un excelente órgano secretor, con muchos lugares de acceso.

Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y los dibujos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una fotografía de inmunofluorescencia del HSV ICP4 que muestra los núcleos infectados de miofibras maduras. Se procesaron miofibras infectadas con G207 para inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo anti-ICP4 de ratón (a) G207 solamente, miofibra madura; (b) G207 solamente, miofibra inmadura; (c) G207 solamente; (d) G207 + 0,33 mg/ml colagenasa tipo IV; (e) G207 + 3 \mug/ml de sulfato de dextrano; (f) G207 + 10 \mug/ml sulfato de dextrano; (g) G207 + 2 U/ml de condroitina ABC liasa; (h) G207 + 4 U/ml de condroitina ABC liasa. Aumentos de a, b, c, e-g x 20; h x 40; d x 60. Las imágenes se capturaron mediante microscopía confocal: c - g.

La Figura 2 es una gráfica que muestra HPLC de intercambio aniónico de glicosaminoglicanos asociados a células derivados de miofibras pertenecientes a diferentes grupos de edades. Las miofibras se marcaron con [^{35}S] sulfato durante 24 horas. Se eliminó el medio y se lavaron las monocapas extensamente para eliminar cualquier traza del medio de las células. Se aislaron los glicosaminoglicanos y se fraccionaron por HPLC. HS, posición de elución de heparina; CS, posición de elución del sulfato de condroitina. Los rombos abiertos, miofibras aisladas de ratones de 8 días de edad; rombos cerrados, miofibras aisladas de ratones de 2 meses de edad. La línea de puntos representa el gradiente de sal utilizado para la elución.

La Figura 3 es una fotografía mostrando los resultados de la inyección in vivo de músculo esquelético inmaduro con G207. Se realizaron secciones de criostato del músculo TA de ratón inmaduro a los 3 días post-inyección de HSV y se tiñeron histoquímicamente para detectar \beta-galactosidasa. La transferencia génica se realizó mediante infección intramuscular de G207 (1 x 10^{6} unidades formadoras de placa (pfu)) en un volumen de 50 \mul (a) y (b) G207 solamente. Aumento: a x 10; b x 40.

La Figura 4 es una fotografía que muestra la infección de músculo esquelético maduro con G207- \beta-galactosidasa transferencia génica a músculo esquelético de ratones adultos. G207 (1 x 10^{6} pfu) y los tratamientos propuestos se inyectaron simultáneamente en el tibialis anterior de ratones balb/c de 2 meses de edad, en un volumen total de infección de 50 \mul. Las secciones congeladas se cortaron y tiñeron para detectar actividad \beta-galactosidasa, (a) y (b) solamente G207; (c) y (d) G207 + 0,33 mg/ml de colagenasa tipo IV; (e) y (f) G207 + 10 \mug/ml de sulfato de dextrano; (g) y (h) G207 + 2 U/ml condroitina ABC liasa. Aumentos: a, c, e, g x 20; b, d, f, h x 40.

La Figura 5 es un conjunto de fotografías que muestran que el HSV alcanza los tejidos tumorales después de una administración sistémica. El HSV se administró a los ratones por la vena de la cola, alcanzando un tumor distante en el flanco (imagen izquierda), o locorregionalmente a través de la vena porta, alcanzando un tumor hepático (panel derecho). El tejido tumoral se tiñó para \beta-galactosidasa para detectar células infectadas con HSV.

La Figura 6 es un esquema mostrando la inyección de HSV marcado en un ratón (panel derecho) y un gráfico de la administración de partículas virales a múltiples tejidos de ratones con tumores en los flancos. Los ratones fueron inyectados con 1 x 10^{7} pfu de NV1020 marcada con ^{35}S metionina. Dos horas más tarde, los animales se sacrificaron y sus tejidos se midieron para determinar la presencia de partículas virales.

La Figura 7 es una gráfica mostrando el efecto de la administración sistémica de NV1020 (HSV) sobre la sobrevivencia de ratones en modelos metastáticos de cáncer de hígado CT-26. A los ratones con nódulos tumorales en el hígado se les suministró sistemáticamente 1 x 10^{7} pfu de NV1020 o PBS (control). EL porcentaje de ratones sobrevivientes se midió a lo largo del tiempo.

La Figura 8 es una gráfica que muestra el efecto de la administración intratumoral o sistémica de NV1020 o NV1020 más F1 (sulfato de dextrano) sobre la eficacia antitumoral en un modelo CT-26 de tumor en el flaco. A los ratones con tumores en el flanco se les administró NV1020 intratumoralmente (IT) o sistémicamente [IV; con o sin F1 (sulfato de dextrano)] a través de la vena de la cola. A continuación se valoraron las velocidades de crecimiento de los tumores.

La Figura 9 es una gráfica que muestra el efecto de la dosis de sulfato de dextrano (DexS) sobre la eficacia antitumoral. A los ratones con tumores en los flancos se les administró una dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 10 \mug/ml de sulfato de dextrano, 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de sulfato de dextrano, 1 x 10^{7} pfu NV1020 más 500 \mug/ml de sulfato de dextrano o PBS más 100 µg/ml de sulfato de dextrano (control), el día 0, día 2 y día 4. Se valoraron las velocidades de crecimiento de los tumores.

La Figura 10 es una gráfica que ilustra el efecto de múltiples dosificaciones de HSV más sulfato de dextrano (DexS) sobre la eficacia antitumoral en un modelo de tumor en el flanco CT-26. A los ratones con tumores en los flancos se les administró una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020, una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020 pfu más 100 \mug/ml de sulfato de dextrano, tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 µg/ml de sulfato de dextrano o PBS (control). Se valoraron las velocidades de crecimiento de los tumores.

La Figura 11 es una gráfica que muestra el efecto de múltiples dosis de NV1020 más sulfato de dextrano (DexS) sobre la sobrevivencia de los ratones en un modelo de tumor en el flanco CT-26. A los ratones con tumores en los flancos se les administró una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020 una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de sulfato de dextrano, tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de sulfato de dextrano, o PBS (control). Se midió la sobrevivencia de los ratones a lo largo del tiempo.

La Figura 12 es una gráfica que muestra el efecto del sulfato de dextrano (DexS) sobre la eficacia antitumoral en un modelo metastático a hígado CT-26. A los ratones con tumores metastatizados se les administró 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano (100 \mug/ml), PBS solamente (control) o PBS más sulfato de dextrano (100 \mug/ml) (control). El número de nódulos tumorales se valoró 13 días más tarde.

La Figura 13 es una gráfica que ilustra el efecto de dextrano y acyclovir sobre la eficacia antitumoral en un modelo de tumor en el flanco CT-26. A los ratones con tumores en el flanco se les administró una dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano (F1; 100 µg/ml) NV1020 más sulfato de dextrano solamente (F2), 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano y acyclovir (F3; 2 mg/ml) o PBS más sulfato de dextrano (100 \mug/ml) (control) el día 0, el día 2 y el día 4. Se valoraron las velocidades de crecimiento de los tumores.

La Figura 14 es una gráfica que muestra el efecto de G207 más sulfato de dextrano (DexS) sobre la eficacia antitumoral. A los ratones con tumores en los flancos se les administró una dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7} pfu de G207, 1 x 10^{7} pfu de G207 más sulfato de dextrano (100 \mug/ml) o PBS (control) en el día 0, día 2, y día 4. A continuación se midieron las velocidades crecimiento tumoral.

La Figura 15 es un conjunto de fotografías que muestran el efecto del sulfato de dextrano (DexS) sobre la morfología de CT-26 y el crecimiento celular in vitro. No se añadió compuesto (panel A), sulfato de dextrano (100 \mug/ml; panel B) a células CT-26 en cultivo. Una vez transcurridas 48 horas, se examinó el número de células y su morfología.

La Figura 16 es una gráfica que muestra el efecto del sulfato de dextrano (DexS) y acyclovir (ACV) sobre el crecimiento en cultivo de CT-26. A las células CT-26 cultivadas in vitro se les administró sulfato de dextrano (100 \mug/ml), acyclovir (2 mg/ml), tanto sulfato de dextrano como acyclovir, o no se las trató. Se midió la proliferación celular a lo largo del tiempo.

La Figura 17 es un conjunto de fotografías que muestra el efecto del sulfato de dextrano sobre la degeneración periférica de los tumores de los flancos. A los ratones se les administró 1 x 10^{7} pfu de NV1020 (panel A) o 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano (F1) (panel B). A continuación se recuperó el tumor y se preparó para el análisis histoquímico para valorar la necrosis del tumor.

La Figura 18 es una gráfica que muestra el efecto del sulfato de dextrano (DexS) sobre la biodisponibilidad del virus in vivo. Se administró 1 x 10^{7} pfu de NV1020 o 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano por la vena de la cola a los ratones. Se sacrificaron a continuación grupos de ratones a diferentes puntos temporales. Se extrajeron muestras de sangre y se analizó el suero para detectar virus infecciosos.

La Figura 19 es una gráfica que demuestra el efecto del sulfato de dextrano (DexS) sobre la distribución in vivo de NV1020 en múltiples tejidos. A ratones con tumores en los flancos se les administró por la vena de la cola 1 x 10^{7} pfu de NV1020 marcado radioactivamente (^{35}S) o 1 x 10^{7} pfu de NV1020 marcado radioactivamente (^{35}S) más sulfato de dextrano (100 \mug/ml). Una vez transcurridas 2 horas o 12 horas, se sacrificaron los animales, se recogieron múltiples órganos, se homogeneizaron y se valoró la distribución de NV1020 (^{35}S).

Descripción detallada

La invención proporciona la utilización de vectores de ácido nucleico para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas a introducir vectores (por ejemplo vectores virales, tales como vectores HSV) en las células, por ejemplo, células de músculo esquelético maduro o células tumorales, mediante la administración conjunta de vectores virales con moléculas cargadas, tales como polisacáridos cargados, por ejemplo glicosaminoglicanos o análogos de los mismos. La composición farmacéutica se puede utilizar para introducir genes en las células in vivo con el propósito de, por ejemplo, terapia génica o vacunación.

Los vectores que se pueden utilizar en la presente invención utilizan glicosaminoglicanos como receptores o coreceptores para entrar en las células. Se utilizan los vectores virales de la familia Herpes Viridae (por ejemplo HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6, HHV-7 y HHV-8).

En algunos casos, es deseable que los vectores virales utilizados en la presente invención estén atenuados o mutados de modo que no se repliquen en, o maten, las células en las que se han introducido, mediante por ejemplo la inducción de la lisis celular o la apoptosis de las células. En otros casos, por ejemplo, en la terapia génica de los tumores, es beneficioso que los vectores se puedan replicar en una célula y matarla. Se conoce una multiplicidad de virus mutantes apropiados que tiene tales características y se pueden adaptar fácilmente para la utilización en la presente invención por los expertos en la materia. Por ejemplo, en el caso de HSV, el vector de Geller (patente US nº 5.501.979; WO 90/09441; American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, ATCC Numero de Acceso 40544), Breakfield (EP 453,242-A1), Speck (WO 96/04395), Preston et al., (WO 96/04394), DeLuca (patente US nº 5.658.724), y Martuza (patente US nº 5.585.096) se pueden adaptar con el fin de utilizarlos en los métodos de la presente invención. Los ejemplos específicos de mutantes de HSV mutantes que se pueden utilizar en la presente invención incluyen NV1020 (descrito más adelante), G207 (Yazaki et al., Cancer Res. 55(21):4752-4756 (1995), HF (ATCC VR-260), MacIntyre (ATCC VR-539), MP (ATCC VR-735); HSV-2 cepa G (ATCC VR-724) y MS (ATCC VR-540); así como también mutantes con mutaciones en uno o más de los siguientes genes: los genes inmediatamente tempranos ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 e ICP47 (la patente US nº 5.658.724); genes necesarios para la replicación viral, UL9, UL5, UL42, ADN pol e ICP8; el gen \gamma34,5; el gen de la ribonucleótido reductasa; el gen VP16 (es decir, Vmw65, WO 91/02788; WO 96/04395; WO 96/04394) y los genes gH, gL, gD o gB (WO 92/05263, WO 94/21807, WO 94/03207).

Las moléculas cargadas que se pueden utilizar en la presente invención incluyen los polisacáridos cargados, tales como los glicosaminoglicanos y los análogos de los mismos, polilisina, aciclodextrina y dietilaminoetano (DEAE). Los ejemplos de glicosaminoglicanos y análogos de los glicosaminoglicanos que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, por ejemplo, el sulfato de dextrano, sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de condroitina y el sulfato de queratina. La molécula cargada adicional que se pueden utilizar en la presente invención es el polietilenglicol. Tal como se discute más adelante, la molécula cargada se puede administrar antes de, o a la vez que, el vector en las utilizaciones de la presente invención.

Las enfermedades que se pueden tratar con la utilización de la presente invención incluyen el cáncer, las miopatías primarias así como también las enfermedades que se pueden tratar con la producción de proteínas circulantes. Por consiguiente, los vectores en las utilizaciones de la presente invención pueden incluir uno o más genes que codifican uno o más productos génicos terapéuticos, tales como un polipéptido, por ejemplo, un factor de crecimiento, un enzima, un polipéptido que promociona la muerte celular, un polipéptido antiangiogénico o una proteína inmunomoduladora, una hormona, una molécula de ARN antisentido o una ribozima (ver más adelante), la expresión del cual aliviará o evitará los síntomas de una enfermedad o estado. Por el contrario, el gen puede codificar el antígeno de una vacuna y las utilizaciones de la presente invención, por consiguiente, se pueden utilizar para inducir una respuesta terapéutica profiláctica o inmune, por ejemplo, a un patógeno indeseable o tipo celular, tal como una célula tumoral.

Los ejemplos específicos de las enfermedades que se pueden tratar utilizando la presente invención (así como los correspondientes genes para incluir en los vectores para tratar las condiciones) son las siguientes: restenosis [\beta-ARKct, Iaccarino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(7):3945-3950 (1999)]; receptor del factor de crecimiento fibroblástico [Yukawa et al., Atherosclerosis 141(1):125-132 (1998)]; parálisis laringea y atrofia muscular, mediante la amplificación del brote de neuronas y la reinnervación muscular [factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1), Shiotani et al., Archives Otolaryngology 125(5):555-56O (1999)]; mucopolisacaridosis tipo VII [\beta-glucuronidasa, Daly et al., Human Gene Therapy 10(1):85-94 (1999)]; distrofias musculares del cinturón lumbar 2C-F [\delta-sarcoglicano, Greelish et al., Nature Medicine 5(4):439-443 (1999)]; enfermedades fibróticas, tales como la glomerulonefritis y la glomeruloesclerosis [quimera del factor de crecimiento transformante-\beta tipo II receptor IgG Fc, (Isaka et al., Kidney Intl. 55(2):740-741 (1999)]; mucopolisacaridosis tipo VI [N-acetilgalactosamina 4-sulfatasa, Yogalingam et al., DNA & Cell Biol. 18(3):187-195 (1999)]; enfermedades de las motoneuronas [neurotrofina-3 y otros factores neurotroficos, tales como CNTF, BDNF e IGF-1, (Haase et al., J. Neuro. Sci. 160(Suppl.1):S97-105 (1998)]; hipertensión [antisentido al receptor tipo I de la angiotensina tipo II, (Gelband et al., Hypertension 33(1):360-365 (1999)]; aterosclerosis e hipercolesterolemia [apolipoproteína AI y lecitin-colesterol acetiltransferasa, (Fan et al., Gene Therapy 5(10):1434-1440 (1998)]; inducción de una respuesta aloinmune [donante de MHC clase I, (Zhai et al., Transplant Immunology 6(3):169-175 (1998)]; hemofilia [Factor VIII, Factor IX, (Herzog et al., Nature Medicine 5(1):56-63 (1999); Herzog et al., Cur. Opin. Hemat. 5(5):321-326 (1998)]; pérdida de la función de músculos esqueléticos con el envejecimiento [IGF-1 (Barton-Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(26):15603-15607 (1998)]; deficiencias de enzimas hepáticos [fenilalanin hidroxilasa, (Harding et al., Gene Therapy 5(5):677-683 (1998)]; diabetes mellitus no dependiente de insulina [GLUT4 (Galuska et al., Adv. Exp. Med. & Biol. 441:73-85 (1998)]; enfermedad del almacenamiento del glicógeno [Alfa-glucosidasa ácida, (Nicolino et al., Human Mol. Gen,. 7(11):1695-1702 (1998)]; distrofia muscular [distrofina, (Baranov et al., Genetika 34(7):876-882 (1998)]; utrofina, [Rafael et al., Nature Genetics 19(1):79-82 (1998)]; supresión de tumores y metástasis, adyuvantes de vacunas, defensa contra patógenos [Interleucina-12, (Lee et al., Human Gene Therapy 9(4):457-465 (1998)] e isquemia aguda de los miembros (factor de crecimiento vascular endotelial [Tsurumi et al., Circulation 96(Suppl.9):II-382-8 (1997)]. Los productos terapéuticos adicionales que se pueden producir utilizando la presente invención incluyen, por ejemplo, hormona de crecimiento, eritropoietina, insulina, proteínas inmunomoduladoras, proteínas antiangiogénicas, citocinas y polipéptidos implicados en la muerte celular.

Tal como se indicó anteriormente, el producto terapéutico codificado por un gen en un vector utilizado en la presente invención también puede ser una molécula de ARN, tal como una molécula de ARN antisentido que, mediante interacciones de hibridación, se puede utilizar para bloquear la expresión del ARNm de un patógeno celular. Por el contrario, la molécula de ARN puede ser una ribozima (p. ej. una ribozima a base de cabeza de martillo o pinza) diseñada para reparar un ARN celular defectuoso o para destruir un ARN indeseable, celular o codificado por un patógeno (ver, por ejemplo Sullenger, Chem. Biol. 2(5):249-253 (1995); Czubayko et al., Gene Ther. 4(9):943-949 (1997); Rossi, Ciba Found. Symp. 209:195-204 (1997); James et al., Blood 91(2):371-382 (1998); Sullenger, Cytokines Mol. Ther. 2(3):201-205 (1996); Hampel, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 58:1-39 (1998); Curcio et al., Pharmacol. Ther. 74(3):317-332 (1997).

Los genes se pueden insertar en los vectores utilizados en la presente invención utilizando métodos estándar [ver, p. ej. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, New York, NY, (1998)]. Los genes se pueden insertar de modo que se encuentren bajo el control de las secuencias reguladoras del vector. Por el contrario, los genes se pueden insertar como parte de un casete de expresión que incluye elementos reguladores, tales como promotores o amplificadores. Los elementos reguladores adecuados se pueden seleccionar por un experto en la materia, en base a, por ejemplo, la especificidad tisular deseada y el nivel de expresión. Por ejemplo, se puede utilizar un promotor específico de tejido o tipo celular (p. ej., específico para músculo o un tejido en el cual se produce un tumor) para limitar la expresión del producto de un gen a un tejido o a un tipo celular específico. Además de utilizar promotores específicos de tejido, la administración local del vector y/o la molécula cargada se puede utilizar para lograr expresión localizada.

Los ejemplos de promotores de no tejido específicos que se pueden utilizar en la presente invención incluyen el promotor temprano del Citomegalovirus (CMV) (patente US nº 4.168.062) y el promotor del virus del sarcoma de Rous [Norton et al., Molec. Cell Biol. 5:281 (1985)]. También se pueden utilizar los promotores del HSV, tales como el HSV-1 IE y el IE 4/5, Un ejemplo de promotor específico de tejido que se puede utilizar en la presente invención es el promotor de la desmina, que es específico para las células musculares [Li et al., Gene 78:243 (1989); Li et al., J.Biol. Chem. 256:6562 (1991)]. En la materia se conocen otros promotores específicos de músculo y se pueden adaptar fácilmente para su utilización en la presente invención.

Los vectores y moléculas cargadas se pueden administrar a un paciente (por ejemplo a un paciente humano) según la utilización de la presente invención mediante, por ejemplo, inyección directa en el tejido, por ejemplo, un músculo o tejido en el que se encuentra un tumor, o mediante métodos quirúrgicos. Por el contrario, la administración de tanto uno como el otro de los agentes puede ser parenteral, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intradérmica o por vía intraepidérmica, o a través de una superficie de mucosa, por ejemplo, una superficie ocular, intranasal, pulmonar, oral, intestinal, rectal, vaginal o del tracto urinario.

En la presente invención se puede utilizar cualquiera de entre múltiples formulaciones bien conocidas para introducir vectores en las células de los mamíferos (ver, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª edición), Ed., A. Gennaro (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA). Por ejemplo, los vectores se pueden utilizar en forma simple, libre de cualquier acondicionamiento o vehículo de administración. Los vectores (así como también las moléculas cargadas) se pueden simplemente diluir en una solución fisiológicamente aceptable, tal como disolución salina estéril o disolución salina tamponada estéril, con o sin un vehículo.

La cantidad de vector que se debe administrar depende, por ejemplo, del objetivo específico que se desea lograr, la fuerza de cualquier promotor que se utilice en el vector, el estado del mamífero objeto de la administración (por ejemplo, el peso, edad y salud en general del mamífero), la forma de administración y el tipo de formulación. En general, a los seres humanos adultos se les administra una dosis terapéuticamente o profilácticamente efectiva de, por ejemplo, entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 1 mg, preferentemente, de entre aproximadamente 10 \mug y aproximadamente 800 \mug.

La cantidad de molécula cargada que se debe administrar la puede determinar un experto en la materia, y puede estar entre, por ejemplo, aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 100 \mug/ml, pero preferentemente, es inferior a 10 \mug/ml. La administración de tanto el vector como la molécula cargada se puede lograr en una única dosis o a intervalos repetidos. También, la molécula cargada se puede administrar a la vez que o antes que (por ejemplo, hasta cinco horas, tal como tres horas) el vector.

Las utilizaciones de la presente invención se basan en el descubrimiento, que se describe más adelante, de que la síntesis de los glicosaminoglicanos está negativamente regulada durante la maduración del músculo esquelético murino. Ello podría explicar la pérdida de infectividad del HSV con la maduración del músculo esquelético murino, debido a que el sulfato de heparano actúa como un coreceptor para la unión del HSV a las células [Montgomery et al., Cell 87(3):427-436 (1995); Geraghty et al., Science 280(5369):1618-1620 (1998); Whitbeck et al., J. Virol. 71(8):6083-6093 (1997)]. Para ensayar si los receptores secundarios del HSV estaban presentes, se trataron miofibras con múltiples enzimas, que incluyeron colagenasa tipo IV y condroitina ABC liasa. Los dos tratamientos incrementaron la infección por HSV, lo que sugiere que los receptores del virus estaban presentes, pero no fácilmente accesibles al virus en la miofibra intacta. Sorprendentemente, también descubrimos que la infectividad del HSV-1, pero no la del HSV tipo 2 (HSV-2), se podía restablecer mediante la exposición de las miofibras a pequeñas concentraciones de sulfato de dextrano, un análogo del glicosaminoglicano. Se ha demostrado anteriormente que el sulfato de dextrano promociona la infección por HSV-1, pero no la de HSV-2 en ausencia de sulfato de heparano. Ello apoya la hipótesis de que la falta de sulfato de heparano accesible es responsable de la resistencia de las miofibras maduras a la infección por HSV-1. En conjunto, dichos resultados demuestran que la lámina basal no constituye una barrera absoluta para la infección y que el sulfato de dextrano se puede utilizar como un coreceptor sustituto para la dirección no destructiva del HSV-1 al músculo esquelético maduro. Estos descubrimientos, que se describen más adelante en más detalle, amplían considerablemente la utilidad del HSV como vector en la terapia génica para el tratamiento de enfermedades heredadas y adquiridas.

También se ha descubierto que la infección de las células tumorales por el HSV se incrementa mediante la administración simultánea de una molécula cargada, por ejemplo, glicosaminoglicano o un análogo del glicosaminoglicano. Tales resultados, descritos más adelante en mayor detalle, refuerzan la utilización del HSV como vector para la terapia génica en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades de la proliferación celular u otros desórdenes.

Resultados Las miofibras maduras son refractarias a la infección

Se ha demostrado anteriormente que los vectores de HSV infectan las fibras musculares de los recién nacidos in vitro, pero no las aisladas de animales más viejos [Huard, et al., Human Gene Therapy 8(4):439-452 (1997); Feero et al., Human Gene Therapy 8(4):371-380 (1997); Huard et al., Neuromuscular Disorders 7(5):299-313 (1997); Huard et al., J. Virol. 70(11):8117-8123 (1996)]. Para investigar la razones subyacentes de la pérdida de infección dependiente de la maduración, se establecieron cultivos de fibras musculares únicas y se expusieron a G207, que es un vector HSV-1 atenuado deficiente en replicación que expresa \beta-galactosidasa después de la infección [Yazaki et al., Cancer Res. 55(21):4752-4756 (1995); Mineta et al., Nature Med. 1(9):938-943 (1995)]. En tales ensayos, las miofibras de recién nacidos fueron completamente susceptibles a la infección, mientras que solamente el 6% de las miofibras maduras se infectaron con esta concentración de virus (Tabla 1 y Figura 1, a y b). Por consiguiente, dichos resultados fueron consistentes con estudios previos que demostraron una pérdida de susceptibilidad al HSV dependiente de la maduración [Feero et al., Human Gene Therapy 8(4):371-380 (1997); Huard et al., J. Virol. 70(11):8117-8123
(1996)].

TABLA 1

Número de miofibras aisladas de músculo EDL de ratón maduro que expresan lac Z después
de la inoculación con G207 y los tratamientos propuestos
Tratamiento	Número total de fibras	% positivo
G207 solamente	88	6
0,02 mg/ml colagenasa tipo IV	68	7
0,20 mg/ml colagenasa tipo IV	81	31
0,33 mg/ml colagenasa tipo IV	77	97
0,66 mg/ml colagenasa tipo IV	67	0*
0,3 \mug/ml sulfato de dextrano	78	6
3,0 \mug/ml sulfato de dextrano	75	7
10 \mug/ml sulfato de dextrano	82	99
2 U/ml condroitina ABC liasa	49	100
4 U/ml condroitina ABC liasa	44	30
6 U/ml condroitina ABC liasa	43	0
1 a 6 U/ml heparitinasa	39	0
PEG	33	6
* 0,66 mg/ml colagenasa tipo IV fueron tóxicos para las miofibras aisladas.

Estrategias para rescatar la infectividad del músculo esquelético adulto

Los estudios anteriores sugirieron que la formación de la lámina basal durante la maduración puede actuar como una barrera física contra la infección por HSV, evitando de este modo la interacción del virus con los receptores necesarios para la infectividad. Para probar esto, se expusieron miofibras aisladas a G207 después de tratarlas con colagenasa tipo IV, que libera péptidos del colágeno degradando de este modo la lámina basal (Fig. 1). La inmunofluorescencia indirecta de la proteína nuclear de HSV, ICP4, reveló que la destrucción parcial de la lámina basal de este modo estimula la infección por HSV (Fig. 1d). El efecto fue dependiente de la concentración de tal modo que un incremento en la colagenasa tipo IV se correlaciona con un incremento en la infección por HSV. A una concentración de 0,66 mg/ml se produjo toxicidad tal como indica la hipercontracción de las miofibras durante el período de 30 minutos previo a la incubación (Tabla 1). En una segunda estrategia, se ensayó la capacidad para incrementar la susceptibilidad a la infección por HSV de la condroitina ABC liasa, que degrada un amplio rango de partes de sulfato de condroitina (Fig. 1, g y h). Dicho tratamiento incrementó considerablemente la infección, mientras que el tratamiento con heparitinasa no lo hizo (Tabla 1). Por consiguiente, la destrucción parcial de la lámina basal con enzimas específicos permitió la unión y la entrada del HSV en la fibra de músculo maduro, lo que sugiere que los receptores secundarios del virus estaban presentes pero no accesibles en el contexto de la miofibra madura.

Análisis de los glicosaminoglicanos de la superficie celular

El HSV infecta las células uniéndose a las partes semejantes a sulfato de heparano en la superficie de la célula, seguido de la interacción con receptores proteicos secundarios [Spear et al., Adv. Exp. Med. & Biol. 313:341-353 (1992); Gruenheid et al., J. Virol. 67(1):93-100 (1993); Geraghty et al., Science 280(5369):1618-1620 (1998); Montgomery et al., Cell 87(3):427-436 (1996)]. Aunque no es estrictamente necesario, el sulfato de heparano en la superficie celular incrementa la eficacia de la infección por HSV por dos órdenes de magnitud en la mayoría de las células ensayadas [Banfield et al., J. Virol. 69(9):3290-3298 (1995)]. Para investigar si la expresión de glicosaminoglicanos estaba alterada en las fibras de los adultos en comparación con las de los recién nacidos, se aislaron glicosaminoglicanos radiomarcados de cultivos de fibras musculares y se analizaron mediante HPLC por intercambio de aniones (Figura 2). Las fibras musculares de los recién nacidos expresaron cantidades significativas de sulfato de heparano y glicosaminoglicanos de sulfato de condroitina. Por el contrario, la síntesis de glicosaminoglicanos estuvo significativamente reducida en las miofibras de los adultos durante el marcaje en estado estable y el sulfato de heparano residual sintetizado estuvo relativamente menos sulfatado en comparación con las miofibras de los recién nacidos (Fig. 2).

El sulfato de dextrano restablece la infección por HSV en las miofibras maduras

Los datos hasta ahora indican que uno o más de los componentes de la lámina basal presentes en las miofibras maduras inhibieron la infección por HSV. Además, la biosíntesis de sulfato de heparano se redujo en comparación con las miofibras inmaduras, lo que podría dar cuenta de toda o parte de la pérdida de susceptibilidad a la infección por HSV. Con anterioridad se ha demostrado que las células desprovistas de biosíntesis de sulfato de heparano se pueden infectar por HSV-1, pero no por HSV-2, si se añade a las células una pequeña concentración de sulfato de dextrano antes de o durante la infección [Dyer et al., J. Virol. 71(1):191-198 (1997)]. Por el contrario, el sulfato de dextrano es un inhibidor potente de la infección por HSV si las células diana expresan cantidades significativas de sulfato de heparano. Cuando se añadió sulfato de dextrano a las miofibras maduras en cultivo, se incrementó significativamente la infección por HSV-1 (Fig. 1, e y f y Tabla 1). Además, dicho efecto fue específico para el HSV-1, lo que es consistente con la hipótesis de que la falta de infección de las miofibras maduras fue debida, por lo menos en parte, a la falta de unidades de sulfato de heparano accesibles en la superficie de la célula (Tabla 2).

TABLA 2 Estimulación por sulfato de dextrano de miofibras maduras con G207 (HSV-1) comparado con L1BR1 (HSV-2)

Tratamiento	virus	Expresión de \beta-galactosidasa
Sin tratamiento	G207	Negativo
	L1BR1	Negativo
10 \mug/ml sulfato de dextrano	G207	positivo
	L1BR1	Negativo

Para determinar si existía una barrera adicional en la fusión posterior a la unión del HSV con la membrana plasmática, se expusieron miofibras maduras aisladas al agente fusiogénico polietilenglicol (PEG) antes del estímulo con G207. La fusión inducida por PEG no alteró la infectividad de las miofibras adultas, lo que sugiere que la barrera a la infección por HSV tiene lugar al nivel de la unión con el virus (Tabla 1).

Infección del músculo esquelético

Para establecer que las miofibras maduras eran susceptibles a la infección por G207 in vivo, se inyectaron 10^{6} unidades formadoras de placas (pfu) directamente en el músculo tibialis anterior (TA) de un ratón balb/c de 8 días de edad. Se extrajeron los músculos inyectados tres días después de la inyección, se seccionaron y analizaron histoquímicamente para detectar la expresión de \beta-galactosidasa (Fig. 3). Se detectaron niveles elevados de expresión del transgén en las zonas inyectadas. También se encontraron miofibras infectadas con HSV lejos del lugar de inyección, lo que sugiere que hubo una considerable dispersión del vector.

Para comprobar si los tres tratamientos que amplifican la infección in vitro funcionaban en el animal adulto, se inyectaron ratones con 1 x 10^{6} pfu de G207 en el músculo tibialis anterior (TA) junto con condroitin ABC liasa, colagenase tipo IV o sulfato de dextrano. En todos los casos los resultados in vivo fueron consistentes con las observaciones in Vitro (Fig. 4, Tabla 3). Interesantemente, el sulfato de dextrano se pudo administrar una hora antes que el virus sin pérdida de función, una observación también hecha in vitro [Dyer et al., J. Virol. 71(1):191-198 (1997)]. Además, la infección no quedó limitada a las miofibras en regeneración, que se identificaron por su núcleo centralmente localizado. En conjunto, estos resultados demuestran que la barrera a la infección por HSV en el músculo esquelético adulto es debida, por lo menos en parte, a la ausencia relativa de receptores de HSV necesarios para una infección eficaz.

TABLA 3 Número de fibras que expresan Lac-Z en el músculo TA de ratón maduro a continuación de la transferencia génica mediante inyección conjunta intramuscular del tratamiento con G207

Tratamiento	Número de fibras azules
G207 solamente	0
3 \mug/ml de sulfato de dextrano	76
10 \mug/ml de sulfato de dextrano	149
0,18 mg/ml colagenasa tipo IV	0

TABLA 3 (continuación)

Tratamiento	Número de fibras azules
0,33 mg/ml colagenasa tipo IV	77
2 U/ml condroitina ABC liasa	302
4 U/ml condroitina ABC liasa	226

Toxicidad de HSV después de la administración sistémica

La toxicidad del HSV in ratones administrados con NV1020 sistémicamente se valoró primero. A los ratones se les administraron múltiples dosis de NV1020 por una vía intraesplénica, por la vena porta o por la vena de la cola. Se valoraron la mortalidad y la morbidez cada día durante 28 días (Tabla 4). Los presentes estudios demuestran que se pueden administrar 1 x 10^{7} pfu a través de múltiples vías sin toxicidad observable. Tal dosis sin efecto es equivalente a aproximadamente 3,5 x 10^{10} pfu para humanos.

TABLA 4 Toxicidad de HSV después de la administración vascular

Ratón	Virus	Dosis (pfu)	vía	Morbidez	Mortalidad
C57B6	NV1020	5E7	Intraesplénica	+++	50%
Balb/C	NV1020	5E7	Intraesplénica	+++	100%
Balb/C	NV1020	1E7	Intraesplénica	+	0%
Balb/C	NV1020	3E7	Intraesplénica	+++	>50%*
Balb/C	NV1020	1E8	Vena porta	+++	100%**
Balb/C	NV1020	3E7	Vena de la cola	-	0%
Balb/C	NV1020	3X1E7	Vena de la cola	-	0%
* el % de mortalidad depende del método de purificación de los virus
** no observado si los ratones tienen >12 semanas.

La administración sistémica de HSV produce la infección del tejido tumoral

El HSV también se puede administrar a tejidos tumorales como agente antitumoral. Por ejemplo, se administró HSV a los ratones, por la vena de la cola (G47\Delta-BAC, un derivado de G207 con ICP47 eliminado y un elemento de cromosoma bacteriano artificial (BAC) insertado en el locus de la timidita kinasa), o locorregionalmente (G207), por la vena porta, alcanzando un tumor distante en el flanco o un tumor en el hígado, respectivamente. El virus infectó las células tumorales con éxito en cada uno de los modelos (Fig. 5). La destrucción de las células del tumor inducida por el virus se puede seguir mediante la necrosis del tumor, que resulta en un crecimiento retardado del tumor y regresión.

Administración de partículas virales a diversos tejidos después de la administración sistémica

Se determinó el número estimado de partículas virales que alcanza un tumor después de la administración sistemática. A los ratones con tumores en los flancos se les inyectaron, por la vena de la cola 1 x 10^{7} pfu de NV1020 marcadas con ^{35}S metionina. El NV1020 es un vector recombinante competente en la replicación que contiene solamente una copia de \gamma34,5 y una deleción en las repeticiones terminales de tal modo que impide la reorganización de los segmentos del genoma. Después de 2 horas, se sacrificaron los animales y se cosecharon sus tejidos y se midieron para determinar la presencia de partículas virales (midiendo el marcador radioactivo). Los resultados de estos estudios indican que se encontraron aproximadamente entre 10^{3} y 10^{4} partículas virales en el hígado y se localizaron aproximadamente entre 10^{4} y 10^{5} partículas virales en el tejido del tumor (Fig. 6).

La administración sistémica de NV1020 incrementa significativamente la sobrevivencia en el modelo CT-26 de cáncer de hígado metastático

También se utilizó NV1020 para examinar el efecto de la administración de este vector viral a ratones en un modelo de cáncer metastásico. En tal modelo, se generaron nódulos de tumor en el hígado de los ratones después de una inyección intraesplénica de células de cancerosas CT-26. Veinticuatro horas después de la inyección de células se inyectaron los ratones, por la vena de la cola, con 1 x 10^{7} pfu de NV1020. Se siguieron los ratones cuidadosamente y se valoraron para determinar la sobrevivencia a lo largo del tiempo (Fig. 7). Los animales moribundos se sacrificaron apropiadamente. La sobrevivencia incrementó desde el 25% hasta el 75% mediante la administración de NV1020, en comparación con los animales control.

La administración intratumoral o sistémica de NV1020 produce eficacia antitumoral en el modelo CT-26 de tumor en el flanco

También se examinaron diferentes modos de administración para determinar la eficacia de la administración sistémica de HSV sobre el crecimiento del tumor. Se establecieron tumores en los flancos de los ratones mediante inyección subcutánea de células cancerosas CT-26. A continuación se administró a los ratones 1 x 10^{7} pfu de NV1020 intratumoralmente o sistémicamente por la vena de la cola. A continuación se valoró la velocidad de crecimiento de los tumores mediante la medición de los volúmenes de los tumores bisemanalmente (Fig. 8).

Los resultados de dicho estudio indican que la administración intratumoral de NV1020 es tan eficaz como la administración sistémica por la vena de la cola (no hubo diferencia estadística). Las dos vías de administración retardaron significativamente la velocidad de crecimiento tumoral, produciendo una reducción de aproximadamente el 50% en el volumen de los tumores. Tales resultados demuestran que aunque los virus se administran típicamente por inyección intratumoral en modelos de tumor (debido a que se considera que la administración sistémica del virus no resultaría en la llegada de suficientes pfu al tumor como para ser eficaz) otras rutas de administración también son efectivas.

También se investigó la adición de análogo de glicosaminoglicano a la terapia de vector viral para el tratamiento de los tumores. El sulfato de dextrano es un análogo del glicosaminoglicano que se utiliza en situaciones de investigación para bloquear la infección viral de las células diana mediante la interferencia con la unión del virus a las células. En una situación clínica, se utiliza en la perfusión local de fármacos después de cirugía. El sulfato de dextrano también se ha publicado que es un amplificador del volumen. Más recientemente, el sulfato de dextrano se ha ensayado como agente antiviral para el HIV.

El modelo CT-26 de tumor en el flanco se utilizó otra vez para determinar el efecto de una combinación de HSV y análogo de sulfato de dextrano sobre el crecimiento de los tumores. Se administró una combinación de 1 x 107 pfu de NV1020 y sulfato de dextrano (100 µg/ml) por la vena de la cola de ratones con tumores en los flancos y se valoró el volumen de los tumores a lo largo del tiempo. El NV1020 más sulfato de dextrano disminuyó el volumen de los tumores así como también lo hizo el NV1020 solamente (Fig. 8).

La eficacia antitumoral incrementa con la dosis administrada de sulfato de dextrano

El efecto de la concentración de moléculas cargadas administradas con el HSV sobre el crecimiento de los tumores también se valoró. A los ratones con tumores en los flancos se les administraron dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020; 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 10 µg/ml de sulfato de dextrano; 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de sulfato de dextrano (100 \mug/ml); 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 500 \mug/ml de sulfato de dextrano o PBS más 100 µg/ml de sulfato de dextrano (control) el día 0, el día 2 y el día 4. A continuación se valoró la velocidad de crecimiento de los tumores (Fig. 9). Tales estudios revelaron que el sulfato de dextrano incrementó la terapia viral en un modo dependiente de la dosis, siendo las concentraciones mayores de sulfato de dextrano administradas a la vez con NV1020 más eficaces que las concentraciones inferiores.

Las dosis múltiples incrementan la eficacia antitumoral en un modelo de tumor en el flanco CT-26

El efecto de dosis múltiples de HSV más sulfato de dextrano sobre el crecimiento de los tumores también se valoró. A los ratones con tumores en los flancos se les administraron tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020, una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020, tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de sulfato de dextrano (F1) o PBS (control). A continuación se determinaron las velocidades de crecimiento tumoral (Fig. 10).

Los resultados de tal estudio demostraron que el crecimiento tumoral fue inferior cuando se inyectaron simultáneamente 100 \mug/ml de sulfato de dextrano con NV1020. Además, la eficacia antitumoral incremento cuando se administraron tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020 en comparación a cuando se administró una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020.

Las dosis múltiples de NV1020 con sulfato de dextrano incrementan la sobrevivencia en un modelo de tumor en el flanco CT-26

Muchas publicaciones de eficacia antitumoral no producen un incremento correspondiente en la sobrevivencia del sujeto. Para determinar si la eficacia antitumoral corresponde a un incremento en la sobrevivencia de los animales tratados con HSV o HSV más sulfato de dextrano, a los ratones con tumores en los flancos se les administró una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020, una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de sulfato de dextrano, tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de sulfato de dextrano, o PBS (control). A continuación se midió la sobrevivencia de los ratones a lo largo del tiempo (Fig. 11). Estos resultados demuestran que el NV1020, administrado en dosis múltiples junto con el sulfato de dextrano, incrementa la sobrevivencia de los ratones. Estos resultados corresponden a la eficacia antitumoral del NV1020 más sulfato de dextrano descrita anteriormente. Con un tratamiento de este tipo, se pueden producir curaciones.

El sulfato de dextrano incrementa la eficacia en un modelo de metástasis hepática CT-26

También se valoró la eficacia de los cambios en la formulación en un modelo de metástasis hepática CT-26. A los ratones con tumores metastatizados se les administraron 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano (100 \mug/ml), PBS solamente (control), o PBS más sulfato de dextrano (100 \mug/ml) (control). A continuación se valoró el número de nódulos tumorales 13 días después del tratamiento (Fig. 12). El tratamiento con cada una de las tres formulaciones produjo una disminución de la cuenta de nódulos en comparación con los controles. Estos resultados establecen que el protocolo de tratamiento no solamente es efectivo en el caso de tumores únicos, grandes, establecidos en los flancos, sino también en el caso de enfermedad microscópica.

El dextrano y el acyclovir también incrementan la eficacia antitumoral en un modelo de tumor CT-26

Para examinar las funciones de la sulfatación del sulfato de dextrano y la replicación del HSV en la eficacia antitumoral de las formulaciones de HSV más sulfato de dextrano, se añadieron dextrano y acyclovir a las formulaciones. La molécula dextrano ha sido utilizada en la clínica como un amplificador del volumen y en la perfusión local de los tejidos después de la cirugía. También existen publicaciones sobre la utilización del dextrano en la terapia cardiovascular de rutina en el Japón. El acyclovir, es un fármaco clínicamente aprobado, utilizado con el fin de evitar la replicación y por consiguiente inhibe la dispersión del HSV. Es un terminador de cadena obligatorio activado mediante la timidina quinasa viral.

A los ratones con tumores en los flancos se les administraron 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano (100 \mug/ml), 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más solamente dextrano, 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano (100 µg/ml) y acyclovir (2 mg/ml) o PBS más sulfato de dextrano (100 \mug/ml). A continuación se valoraron las velocidades de crecimiento de los tumores, bisemanalmente (Fig. 13). El componente de sulfato del sulfato de dextrano no pareció afectar a su modo de incrementar la eficacia antitumoral, ya que la inyección simultánea de HSV con dextrano solamente produjo una eficacia antitumoral comparable. Tampoco la replicación de los virus parece ser necesaria para la eficacia antitumoral o para la sobrevivencia de los animales, ya que la combinación HSV, sulfato de dextrano y acyclovir redujo el crecimiento de los tumores.

El sulfato de dextrano incrementa la eficacia antitumoral de G207

También se ensayó la eficacia antitumoral de otro vector de HSV recombinante, G207, una cepa diferente de NV1020 con las dos copias de \gamma34,5 eliminadas y la ribonucleótido reductasa eliminada mediante la inserción del gen de la \beta-galactosidasa. A los ratones con tumores en los flancos se les administraron 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7} pfu de G207, 1 x 10^{7} pfu de G207 más sulfato de dextrano (100 \mug/ml), o PBS más sulfato de dextrano (100 \mug/ml) (control) el día 0, día 2 y día 4. A continuación se midieron las velocidades de crecimiento tumoral (Fig. 14). El sulfato de dextrano incrementó la eficacia antitumoral del G207, indicando que otras cepas de vectores de HSV tienen valor terapéutico y la eficacia antitumoral del HSV-1 no depende de \gamma34,5. Estos descubrimientos también sugieren que también se podrán utilizar terapéuticamente otros vectores de la generación actual.

El sulfato de dextrano altera la morfología de CT-26 in vitro, pero no el crecimiento celular

Para entender mejor los efectos in vivo del sulfato de dextrano o del dextrano en combinación con HSV, los efectos del sulfato de dextrano sobre la morfología celular y la proliferación celular se evaluaron en un modelo de cultivo celular. Se trataron células CT-26 con 100 \mug/ml de sulfato de dextrano o se dejaron sin tratar. Transcurridas 48 horas, se examinaron el número de células y su morfología (Fig. 15). In vitro, el sulfato de dextrano añadido al medio de cultivo celular no retardó el crecimiento de las células CT-26. El tratamiento de las células con sulfato de dextrano, sin embargo, sí cambió la morfología de las células. En presencia, de sulfato de dextrano, las células CT-26 parecen más dispersas uniformemente sobre los platos de cultivo (Panel B) en comparación con la apariencia "apiñada" de las células CT-26 en ausencia de sulfato de dextrano (Panel A). Tales resultados sugieren un cambio en la expresión génica como posible explicación de la profunda eficacia antitumoral observada in vivo.

El sulfato de dextrano y el acyclovir no afectan crecimiento de CT-26 en cultivo

También se examinó el efecto del sulfato de dextrano, acyclovir o una combinación de los dos, dextrano y acyclovir, sobre el crecimiento celular in vitro. Se administró a los cultivos de células CT-26 sulfato de dextrano (100 \mug/ml), acyclovir (2 mg/ml), los dos, sulfato de dextrano y acyclovir o se los dejó sin tratamiento (control). Se contaron las células CT-26 a múltiples tiempos después de la adición de cada formulación. Transcurridas 72 horas desde la exposición a las formulaciones, el crecimiento de las células (número de células/ml) no cambió significativamente con la exposición a sulfato de dextrano, acyclovir o a la combinación de las dos formulaciones, en comparación con las células no tratadas (Fig. 16). Tales resultados indican que estas formulaciones no alteran el crecimiento celular in vitro.

El sulfato de dextrano incrementa la degeneración periférica de los tumores

A continuación se examinó el efecto de la inyección conjunta de HSV y sulfato de dextrano sobre la degeneración tumoral. A los ratones con tumores en los flancos se les administró NV1020 o NV1020 más sulfato de dextrano (F1) por la vena de la cola. A continuación se extrajeron los tumores, se congelaron y seccionaron para análisis histoquímica (Fig.17). La degeneración periférica de los tumores fue mucho mayor cuando se administró sulfato de dextrano junto con NV1020 (panel B; áreas mostradas en gris claro), que cuando NV1020 se administró solo (panel A). Ello indica que la necrosis tumoral no está limitada a las células anóxicas en el centro del tumor, sino que también tiene lugar en las células en crecimiento y división situadas en el margen donde se encuentran localizados los vasos sanguíneos que alimentan al tumor.

El sulfato de dextrano incrementa la biodisponibilidad del virus in vivo

Debido a que se sabe que los virus son inactivados rápidamente por los componentes presentes en la sangre, que incluyen los del sistema inmune (factores de complemento, anticuerpos), se examinó el efecto del sulfato de dextrano en la biodisponibilidad del virus in vivo. Se administró a los ratones 1 x 10^{7} pfu de NV1020 o 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano (100 µg/ml) por la vena de la cola. A continuación se sacrificaron grupos de ratones a diferentes tiempos. Se extrajeron muestras de sangre mediante punción cardiaca y se analizó el suero para determinar durante cuanto tiempo el virus era infeccioso in vivo (Fig. 18). Cuando se administró sulfato de dextrano junto con NV1020, el tiempo de circulación de virus infeccioso se incrementó por un factor de 3. Dicho tiempo es suficiente para permitir que el virus activo alcance el tumor para ejercer la eficacia antitumoral. En consecuencia, un tiempo de circulación de virus infeccioso más prolongado resulta en una administración neta superior de vector terapéutico.

El sulfato de dextrano altera la distribución in vivo de NV1020 de tal modo que más virus alcanza al tumor

Además, se determinó el efecto del sulfato de dextrano sobre la distribución del NV1020 en los tejidos in vivo. Se administró por la vena de la cola a ratones con tumores en los flancos 1 x 10^{7} pfu de NV1020 marcado radioactivamente con [^{35}S] NV1020 o 1 x 10^{7} pfu de NV1020 marcado radioactivamente con [^{35}S] con sulfato de dextrano (100 \mug/ml). A las 2 horas o a las 12 horas, se cosecharon múltiples órganos, incluidos el hígado, bazo, riñones, pulmones y corazón, así como también el tumor, se homogeneizaron y se ensayaron para determinar la carga viral mediante contaje de centelleo (Fig 19). A lo largo del tiempo, el sulfato de dextrano incrementó la cantidad de virus encontrado en el tumor y decreció la cantidad de virus encontrado en el hígado.

El sulfato de dextrano reduce la expresión del gen del factor de la angiopoiesis

También se completaron los estudios de expresión génica en las células CT-26 tratadas con sulfato de dextrano. Se trataron células CT-26 en cultivo con sulfato de dextrano durante 1 hora, o se dejaron sin tratar. A continuación se extrajo ARN de las células. A continuación se midió la expresión de múltiples genes diferentes y se compararon los niveles de expresión entre las células tratadas con sulfato de dextrano y las no tratadas. Los resultados de tales estudios se sumarizan en la Tabla 5. Disminuyó notablemente la expresión de múltiples genes que codifican proteínas implicadas en la angiopoiesis.

TABLA 5 Análisis de colecciones de genes

Gen	Función	Cambio
Flk-1	Angiogénesis	\downarrow
VEGF-\beta	Angiogénesis	\downarrow
Endotelina tipo R	Angiogénesis	\downarrow
MMP-8	Proteasa	\downarrow\downarrow\downarrow
TNF-\alpha	Superfamilia TNF	\downarrow
TRAIL-R1	Superfamilia TNF	\downarrow\downarrow\downarrow
OX-40L	Superfamilia TNF	\uparrow
IL-18	Citoquina	\downarrow\downarrow\downarrow
Efrina \beta4	Receptor de efrina	\downarrow\downarrow\downarrow
CD-6	Superficie celular	\uparrow
\alpha-tubulina	Mantenimiento	\leftrightarrow

Materiales y métodos Materiales

El sulfato de dextrano de peso molecular 500.000 se obtuvo de Pharmacia (nº de catálogo 17-0340-01). La condroitina ABC liasa se obtuvo de Seikagaku Corporation (nº de catálogo 100330). La heparitinasa se obtuvo de Seikagaku Corporation (nº de catálogo 100703). La colagenasa tipo IV se obtuvo de Sigma (nº de catálogo C 1889). Todos los reactivos para el cultivo de tejidos (Gibco) y las placas (Nunc) se obtuvieron de Canadian Life Technologies (Burlington, Ontario, Canada).

Cepas virales

Los recombinantes NV1020, HSV-1, G207 (NeuroVir Inc.) y HSV-2, L1BR1 [Asano et al., J. Gen. Virol. 80(1):51-58 (1999); Nishiyama et al., Virology 190(1):256-268 (1992)] se prepararon en células Vero. El vector recombinante HSV, NV1020, un vector competente para la replicación contiene solamente una copia de \gamma34,5 y se han eliminado las repeticiones terminales de modo que impide la reorganización de segmentos genómicos. El G207 contiene un gen de \beta-galactosidasa insertado, en marco de lectura, en el gen de la ribonucleótido reductasa. Como tal, este virus recombinante es incapaz de replicarse en células que no se dividen (p. ej. células musculares). El L1BR1 contiene el gen de la \beta-galactosidasa insertado en el gen de la proteína quinasa US3. El virus se concentró mediante centrifugación a través de un cojín de sucrosa del 30%, se suspendió en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum (Sartorius), utilizando métodos estándar. El título final de virus infeccioso utilizado en todos los experimentos fue de 1 x 10^{8} pfu/ml.

Cultivo de fibras musculares primarias

Los ratones Balb/c se criaron en los animalarios institucionales de la University of British Columbia. Se designaron dos grupos de edad como "recién nacidos" y "adultos". Los ratones "recién nacidos" tuvieron entre 7 y 10 días de edad. Los ratones "adultos" tuvieron entre 6 y 12 semanas de edad.

Se prepararon miofibras aisladas únicas a partir del músculo extensor digitorum longus (EDL). Las miofibras se disociaron mediante disgregación enzimática en 0,2% colagenasa tipo 1 (Sigma), seguido de una trituración suave. Las miofibras aisladas se sembraron en múltiples placas de 24 pocillos recubiertas de 1 mg/ml de Matrigel (Collaborative Biomedical Products). A los pocillos se añadió medio de cultivo que consistió en 10% suero equino y 10% FBS en DMEM. A continuación se incubaron las placas durante 18 horas a 37ºC, momento en el que las miofibras viables se infectaron con G207.

Infección de las miofibras

Las miofibras se infectaron añadiendo G207 (10^{6} pfu) en medio de cultivo (10% FBS en DMEM) directamente a los pocillos. La duración de la incubación fue de durante la noche (aproximadamente 18 horas), aunque una infección durante una hora en DMEM fue suficiente para producir una infección reproducible. Transcurrida la incubación, las miofibras se fijaron durante 15 minutos en 1,25% glutaraldehido y se tiñeron con sustrato para 2% X-gal (1 mM MgCl_{2}, 5 mM K_{4}Fe(CN)_{6}/K_{3}Fe(CN)_{6} en PBS) (Canadian Life Technologies) durante 4 horas a 37ºC.

Inmunofluorescencia indirecta

Se sembraron miofibras aisladas en portaobjetos de vidrio y se infectaron con G207 tal como se describió anteriormente. A continuación se fijaron en 1,25% glutaraldehido en PBS durante 15 minutos, se lavaron dos veces con PBS, seguido de una incubación de 15 minutos en disolución bloqueante [PBS con 1% albúmina de suero bovino (Boehringer Mannheim)]. A continuación del bloqueo, las miofibras se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100/PBS durante 5 minutos y se incubaron con un anticuerpo de ratón anti-ICP4 a una dilución de 1:2000 durante 1 hora. Las miofibras se lavaron con tres cambios de PBS, a continuación se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado a Texas-Red (Jackson Immunochemicals) diluido 1:200 en PBS-1% BSA durante 30 minutos. A continuación las miofibras se lavaron con PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio. La tinción inmunofluorescente se observó utilizando un microscopio confocal de epifluorescencia BioRad MRC 600. Las imágenes confocales se reprodujeron utilizando la versión 1.60 de NIH Image y se coloraron utilizando Adobe Photoshop Versión 4.0 (Adobe System Inc.). Se realizaron experimentos control estándar, que incluyen la incubación con el anticuerpo secundario solamente y con células infectadas simuladamente. Todas las fijaciones e incubaciones con anticuerpo se realizaron a RT.

Ensayos de tratamiento in vitro

Los ensayos de estimulación con sulfato de dextrano, colagenasa tipo IV, condroitina ABC liasa y heparitinasa se realizaron en miofibras adultas sembradas en placas de 24 pocillos. Las miofibras se pretrataron con múltiples concentraciones de sulfato de dextrano, colagenasa tipo IV, condroitina ABC liasa o heparitinasa en DMEN durante 30 minutos antes de la infección. A continuación de un período de absorción durante la noche (aproximadamente 18 horas) a 37ºC, se extrajo el inóculo. Las miofibras se fijaron durante 15 minutos en 1,25% glutaraldehído y se tiñeron con sustrato para X-gal al 2% durante 4 horas a 37ºC. Para todos los estudios in vitro, se ensayó un mínimo de 40 miofibras por grupo de tratamiento, a menos que de otro modo se especifique. La fusión inducida por PEG se realizó según los métodos descritos anteriormente [Meyer et al., J. Gen. Virol. 79(8):1983-1987 (1998)].

Análisis de glicosaminoglicanos

El marcaje bioquímico de glicosaminoglicanos se realizó mediante una modificación de un proceso descrito anteriormente [Bame et al., J. Biol. Chem. 264:8059-8065 (1989)]. En breve, los glicosaminoglicanos se marcaron radioactivamente mediante incubación de las células durante 24 horas con [^{35}S] sulfato (libre de vehículo, aproximadamente 43 Ci/mg, ICN) por ml en DMEM/10% FBS/10% suero equino modificado par que contenga 10 \muM de sulfato. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y se disolvieron con 1 ml de 0,1 N NaOH a RT durante 15 minutos. Se extrajeron las muestras para la determinación de proteína. Los extractos se ajustaron a un pH de 5,5 mediante la adición de ácido acético concentrado y se trataron con proteasa (Sigma; 2 mg/ml) en 0,32 M NaCl 40 mM acetato sódico, pH 5,5, que contuvo sulfato de condroitina de cartílago de tiburón (2 mg/ml) como vehículo, a 40ºC durante 12 horas. En algunos experimentos, partes del material radioactivo se trataron durante 12 horas a 40ºC con 10 mU de condroitina ABC liasa (Sigma) o con 0,5 U de heparitinasa (Sigma). Los productos radioactivos se cuantificaron mediante cromatografía en DEAE-Sephacel (Pharmacia) mediante enlace en 50 mM NaCl seguido de elución con 1 M NaCl. Para el análisis por cromatografía líquida a presión elevada (HPLC), las muestras de glicosaminoglicanos se desalaron mediante precipitación con etanol. A continuación de una centrifugación, los precipitados de etanol se suspendieron en 20 mM Tris (pH 7,4) y se fraccionaron mediante HPLC de intercambio aniónico, utilizando una columna TSK DEAE-35W (15 por 75 mm; Beckman Instruments). Los proteoglicanos se eluyeron de la columna mediante la utilización de un gradiente lineal de NaCl de 50 a 700 mM formado en 10 mM KH_{2}PO_{4} (pH 6,0). Todos los tampones contuvieron 0,2% de Zwittergent 3- 12 (Calbiochem). Los glicosaminoglicanos en los picos se identificaron mediante la digestión de las muestras con los enzimas relevantes antes de la cromatografía.

Modelo de tumo en el flanco

Se anestesiaron los ratones utilizando ketamina (70 mg/kg) y Xylacina (10 mg/kg). Se inyectaron células CT-26 (5 x 10^{4} células resuspendidas en 100 \mul PBS) subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón, utilizando una aguja de 26-gauge. Las células formaron un tumor al que se permitió crecer hasta un tamaño de aproximadamente entre 100 y 150 mm^{3}. A continuación se iniciaron las inyecciones para las terapias deseadas. Generalmente los volúmenes de los tumores se midieron bisemanalmente. Los animales se sacrificaron una vez que los volúmenes de los tumores alcanzaron 1.500 mm^{3}.

Modelo de cáncer metastático

El modelo de cáncer metastático ha sido descrito por Lafreniere y Rosemberg [J. Natl.Cancer Inst. 76(2):309-22 (1986)].

Administración intramuscular de vector HSV recombinante

Ratones recién nacidos y adultos bajo anestesia (Ketamina/Rhompun Intraperitonealmente) fueron inyectados percutáneamente en el músculo tibialis anterior (TA) a una profundidad aproximada de 2,0 mm utilizando una jeringa Hamilton. Para los ensayos in vivo que implican la inyección conjunta de disoluciones para el tratamiento y un inóculo viral, sulfato de dextrano, colagenasa tipo IV o condroitina ABC liasa se diluyeron hasta la concentración adecuada (tal como se identifica en los estudios in vitro) con G207 en un volumen de inyección de 50 \mul (para ratones adultos) o 25 \mul (para ratones recién nacidos). Los músculos control se inyectaron con G207 solamente. Para valorar la infección de las miofibras, se extrajeron 3 días postinyección para su sección y análisis histológico. Para cualquiera de los métodos, un mínimo de 4 animales recibió tratamientos idénticos y comprendieron un grupo experimental.

Administración del vector HSV recombinante por la vena de la cola

La administración por la vena de la cola de la terapia deseada se realizó utilizando técnicas conocidas comúnmente en la materia.

Sección de los tejidos

Los músculos inyectados y control o el tejido tumoral se congelaron rápidamente. El músculo o el tejido tumoral se seccionó, produciendo secciones transversales seriadas a través de tejido. Las secciones transversales (10 \mum) se cortaron en un criostato y se tiñeron con X-gal y/o hematoxilina y eosina. Las secciones se retuvieron a intervalos regulares (aproximadamente cada 120 \mum). Para la histología, las criosecciones se recogieron sobre portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina.

Análisis histológico

La detección histológica de las células que expresan \beta-galactosidasa en las criocondiciones se realizó utilizando X-gal. Dicho compuesto produce un producto de reacción azul en las células que expresan un nivel elevado de \beta-galactosidasa. Las secciones primero se fijaron por inmersión de los portaobjetos en 4% paraformaldehido en 100 mM NaP, pH 7,2, durante 5 minutos. Los portaobjetos se lavaron tres veces durante 5 minutos en PBS. A continuación las secciones se tiñeron con X-gal (Sigma) a una concentración de 1 mg/ml en 5 mM K_{3}Fe(CN)_{6}, 5 mM K_{4}Fe(CN)_{6}, 2 mM MgCl_{2} en PBS durante 12 horas. Los portaobjetos se montaron utilizando un medio acuoso de montaje (Promount) y se examinaron al microscopio para detectar la presencia de miofibras marcadas con \beta-galactosidasa ("azules"). El número total de fibras que expresan lac-z en un músculo se determinó a partir de la sección con el máximo número de fibras azules y esto fue invariablemente en el lugar de implantación.

Por el contrario, las células infectadas con HSV se detectaron utilizando procedimientos inmunohistoquímicos estándar y un anticuerpo que reconoce el antígeno HSV.

Determinación de la biodisponibilidad de virus in vivo

El suero de la sangre obtenida de los animales infectados con NV1020 se aplicó a células en cultivo. La duración del tiempo durante el cual el virus fue capaz de infectar las células se determinó tal como se describió anteriormente.

Claims (20)

1. Utilización de un vector de ácido nucleico para la preparación de una composición farmacéutica destinada a introducir un vector de ácido nucleico en una célula viva, en la que dicho vector es un vector viral de la familia Herpesviridae, y dicho vector se introduce en dicha célula mediante un método que comprende poner en contacto dicha célula con dicho vector y, antes, durante o después de poner en contacto dicha célula con dicho vector, poner en contacto dicha célula con un medio líquido que comprende un compuesto que, en dicho medio, está cargado, no es citotóxico y es capaz de facilitar la adquisición del vector por la célula, en la que dicha célula se encuentra en un mamífero.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho mamífero es un paciente humano.

3. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho vector comprende un gen que codifica un polipéptido, una hormona, un antígeno de vacuna, una molécula antisentido o una ribozima.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que dicho polipéptido está seleccionado de entre el grupo constituido por factores de crecimiento, enzimas, polipéptidos antiangiogénicos y polipéptidos que promueven la muerte celular.

5. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho vector se selecciona de entre el grupo constituido por HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6, HHV-7 y HHV-8.

6. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho vector está atenuado.

7. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha molécula cargada esta seleccionada de entre el grupo constituido por polisacáridos cargados, polilisina, aciclodextrina, dietilaminoetano y polietilenglicol.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que dicho polisacárido cargado es un glicosaminoglicano.

9. Utilización según la reivindicación 7, en la que dicho polisacárido cargado es un análogo de glicosaminoglicano.

10. Utilización según la reivindicación 8, en la que dicho glicosaminoglicano está seleccionado de entre el grupo constituido por sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de condroitina y sulfato de queratina.

11. Utilización según la reivindicación 9, en la que dicho análogo de glicosaminoglicano es sulfato de dextrano.

12. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha molécula cargada se administra a dicha célula antes de la administración de dicho vector a dicha célula.

13. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha molécula cargada se administra a dicha célula concurrentemente con la administración de dicho vector a dicha célula.

14. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha célula es una célula de músculo maduro.

15. Utilización según la reivindicación 2, en la que dicha célula es una célula cancerosa.

16. Utilización según la reivindicación 15, en la que dicho paciente tiene cáncer.

17. Utilización según la reivindicación 14, en la que dicha célula muscular se encuentra en un paciente con una miopatía primaria.

18. Utilización según la reivindicación 2, en la que dicho paciente tiene una enfermedad que se puede tratar mediante la producción de un producto terapéutico para la secreción en la circulación de dicho sujeto.

19. Utilización según la reivindicación 2, en la que dichos vector y molécula cargada se administran localmente.

20. Utilización según la reivindicación 2, en la que dichos vector y molécula cargada se administran sistémicamente.