ES2252017T3 - Utilizacion de vectores virales y de moleculas cargadas en terapia genica. - Google Patents
Utilizacion de vectores virales y de moleculas cargadas en terapia genica.Info
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Abstract
Utilización de un vector de ácido nucleico para la preparación de una composición farmacéutica destinada a introducir un vector de ácido nucleico en una célula viva, en la que dicho vector es un vector viral de la familia Herpesviridae, y dicho vector se introduce en dicha célula mediante un método que comprende poner en contacto dicha célula con dicho vector y, antes, durante o después de poner en contacto dicha célula con dicho vector, poner en contacto dicha célula con un medio líquido que comprende un compuesto que, en dicho medio, está cargado, no es citotóxico y es capaz de facilitar la adquisición del vector por la célula, en la que dicha célula se encuentra en un mamífero.
Description
Utilización de vectores virales y de moléculas
cargadas en terapia génica.
La presente invención se refiere a la utilización
de vectores virales y moléculas cargadas en la terapia génica.
El músculo esquelético es un lugar de
implantación ideal para el tratamiento de las miopatías primarias o
para las enfermedades que necesitan la producción de proteínas
circulantes, debido a que está muy vascularizado y es un excelente
órgano secretor, con muchos lugares accesibles (Blau, et al.,
New Eng. J. Med. 333(23):1554-1556
(1995); van Deutekom et al., Neuromuscular Disorders
8(3-4):135-148 (1998);
Howell et al., Human Gene Therapy
9(5):629-934 (1998); Isaka et al.,
Nature Med. 2(4):418-423 (1996); Pauly
et al., Gene Therapy 5(4):473-480
(1998); Bohl et al., Human Gene Therapy
8(2):195-204 (1997), Takeda, Nippon
Rinsho-Japanese J. Clin. Med.
55(12):3114-3119 (1997), Tsurumi et
al., Circulation 96(9 Suppl.): II-382-8
(1997)). Además, la naturaleza postmitótica y la longevidad de las
fibras musculares permite la expresión estable de los genes
transferidos, incluso si no se encuentran integrados en el ADN
cromosómico (Svensson et al., Mol. Med. Today
2(4):166-172 (1996), van Deutekom et
al., Mol. Med. Today 4(5):214-220
(1998)). Además, niveles de expresión elevados en un número
relativamente pequeño de fibras musculares pueden ser adecuados para
el tratamiento de desórdenes metabólicos adquiridos o heredados, o
para inducir una respuesta inmune suficiente para la vacunación
(Davis et al., Human Mol. Gen.
2(11):1847-1851 (1993)).
Los métodos y composiciones para la introducción
de un transgén en una multiplicidad de tejidos de mamíferos son
bien conocidos en la materia. Por ejemplo, la patente US nº
5.827.703 da a conocer un método para introducir un transgén
aislado (opcionalmente con una secuencia reguladora pero sin
secuencias del plásmido) en las células huésped. La patente US nº
5.728.399 se refiere a un método para la introducción de
polinucleótidos en células utilizando polilisina, en la que el
polinucleótido que se va a administrar puede codificar una proteína
viral. La patente US nº 5.827.707 describe métodos para producir
cápsulas de un volumen mínimo que contienen retrovirus. Finalmente,
Arcasoy et al., (Gene Ther. 1997 enero;
4(1):32-38) y Kaplan et al., (Hum.
Gene Ther. 1 julio 1998; 9(10):1469-1479)
dan a conocer la utilización de vectores de adenovirus
recombinantes para la administración de múltiples genes
terapéuticos, en la que se utilizan policationes similares a la
poli-L-lisina para incrementar la
transducción de las células.
Sin embargo, la transferencia de genes a los
músculo esqueléticos ha sido dificultada en parte debido a la
incapacidad de la generación de vectores actual para infectar un
número significativo de células (Acsadi et al., Nature
352(6338):815-818 (1991); Karpati et
al., Muscle & Nerve 16(11):1141-1153;
Smith et al., Nature Genetics
5(4):397-402 (1993); Acsadi et al.,
Human Mol. Gen. 3(4):579-584 (1994);
Yang et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA
91(10):4407-4411 (1994); Dai et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92(5):1401-1405 (1995); Huard et al.,
Exp. & Mol. Path. 62(2):131-143
(1995); Mulligan, Science
260(5110):926-932 (1993)). Aunque los
virus adenoasociados (AAV) infectan las células musculares con
efectividad e inducen una expresión génica sostenida, su capacidad
para administrar y regular genes grandes es limitada. En lo que se
refiere a los virus con ADN grande, tales como los virus del Herpes
Simplex (HSV) y los adenovirus, las fibras musculares muestran una
pérdida de susceptibilidad a la infección dependiente de la
maduración (Acsadi et al., Human Mol. Gen.
3(4):579-584 (1994); Huard et al.,
Human Gene Therapy 8(4):439-452 (1997);
Feero et al., Human Gene Therapy
8(4):371-380 (1997); Huard et al.,
Neuromuscular Disorders 7(5):299-313
(1997); Huard et al., J. Virol.
70(11):8117-8123 (1996); Huard et al.,
Gene Therapy 2(6):385-392 (1995); Inui
et al., Brain & Dev. 18(5):357-361
(1996); Ragot et al., Nature
361(6413):647-650 (1993); Quantin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89(7):2581-2584 (1992); Vincent et
al., Nature Genetics 5(2):130-134
(1993)). Los estudios anteriores de la infección por HSV en los
roedores demuestran que la pérdida de infectividad puede ser debida
a, por lo menos en parte, el desarrollo de la lámina basal durante
la maduración, que puede bloquear los eventos iniciales en la
infección por HSV [Huard et al., J. Virol.
70(11):8117-8123 (1996)].
El cáncer es otra enfermedad para la que se han
ensayado muchas terapias. Un área de investigación intensa en el
campo del cáncer es la terapia génica. La terapia génica del cáncer
adolece de muchos de los mismos problemas que las terapias génicas
musculares descritas anteriormente. Por ejemplo, los vectores
actuales no se pueden administrar con precisión a un número
suficientemente grande de células para reducir el crecimiento
tumoral e incrementar la sobrevivencia del paciente.
Para iniciar la infección, el HSV se une a los
glicosaminoglicanos de la superficie celular, tales como el sulfato
de heparano y el sulfato de dermatano (Spear et al., Adv. Exp.
Med. & Biol. 313:341-353 (1992); Shieh et
al., 116(5):1273-1281 (1992); Fuller
et al., J. Viro. 66(8):5002-5012
(1992); Gruenheid et al., J.
Virol.67(1):93-100 (1993); Herold et
al., J. Gen. Virol. 75(6):1211-1222
(1994); Banfield et al., Virology
208(2):531-539; Williams et al., J.
Virol. 71(2):1375-1380 (1997)] que
estabilizan el virus de tal modo que puede interactuar con las
proteínas receptoras secundarias necesarias para la entrada en las
células huésped [Terry-Allison et al., J. Virol.
72(7):5802-5810 (1998); Geraghty et
al., Science 280(5369):1618-1620 (1998);
Montgomery et al., Cell 87(3):427-436
(1996).
La presente invención proporciona la utilización
de vectores de ácidos nucleicos para la preparación de
composiciones farmacéuticas para la introducción de vectores (por
ejemplo, vectores virales tales como los vectores de HSV) en
células por administración simultánea de los vectores con una
molécula cargada (por ejemplo, un polisacárido cargado, tal como un
glicosaminoglicano o un análogo del mismo). La composición
farmacéutica se puede utilizar para introducir genes en las células
para utilización como terapia génica o vacuna.
En consecuencia, la presente invención da a
conocer la utilización de vectores de ácidos nucleicos para la
preparación de composiciones farmacéuticas para la introducción de
un vector de ácido nucleico en una célula viva, en la que dicho
vector es un vector viral de la familia Herpesviridae, y
dicho vector se introduce en dicha célula mediante un método que
comprende poner en contacto dicha célula con el vector y antes,
durante o después de dicho poner en contacto poner en contacto la
célula con un medio líquido que comprende un compuesto que, en el
medio, está cargado, no es citotóxico y es capaz de facilitar la
adquisición del vector en la célula, en el que la célula está en un
mamífero, por ejemplo, un paciente humano. Los vectores que se
pueden utilizar en la presente invención utilizan
glicosaminoglicanos como receptores o coreceptores para entrar en
las células. Se utilizan vectores virales de la familia
Herpesviridae (por ejemplo, HSV-1,
HSV-2, VZV, CMV, CBV, HHV6 y HHV7).
Preferentemente, los vectores están atenuados y más adelante se
proporcionan ejemplos de vectores virales atenuados que se pueden
utilizar en la presente invención.
Las moléculas portadoras de carga positiva o
negativa, que se pueden utilizar en a presente invención incluyen
los polisacáridos cargados, tales como los glicosaminoglicanos y
los análogos de los mismos, polilisina, aciclodextrina y
dietilaminoetano (DEAE). Los ejemplos de glicosaminoglicanos y
análogos de glicosaminoglicanos que se pueden utilizar en la
presente invención incluyen, por ejemplo, el sulfato de dextrano,
sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de condroitina,
y sulfato de queratina. Una molécula cargada adicional que se puede
utilizar en la presente invención es el polietilenglicol. Tal como
se discute más adelante, las moléculas cargadas se pueden
administrar antes de o concurrentemente con, los vectores en los
métodos de la presente invención.
Las células que se pueden utilizar en la presente
invención incluyen las células musculares maduras, células de
retina y células cancerosas.
Las enfermedades y los estados para los que se
pueden utilizar las composiciones farmacéuticas incluyen el cáncer,
las miopatías primarias y las condiciones y enfermedades que se
pueden tratar mediante la producción de productos terapéuticos en
la circulación. Los ejemplos específicos de tales condiciones y
enfermedades, así como también los genes que se pueden incluir en
los vectores para efectuar su tratamiento, tales como los genes que
codifican polipéptidos (por ejemplo, factores de crecimiento,
enzimas, polipéptidos antiantiogénicos y polipéptidos que
promocionan la muerte celular), hormonas, antígenos de vacunas,
moléculas antisentido y ribozimas se describen más adelante. Además,
los vectores y moléculas cargadas se pueden administrar al sujeto
localmente o sistémicamente.
La presente invención proporciona muchas
ventajas. Por ejemplo, los glicosaminoglicanos y los análogos de
los glicosaminoglicanos, tales como el sulfato de dextrano, no son
destructivos, no son tóxicos y limitan la dispersión de los
vectores virales a otros lugares en el tejido. Por consiguiente, las
utilizaciones de la presente invención representan una estrategia
para la expresión dirigida de los genes en los vectores HSV en las
células deseadas o tejidos por inyección directa. Además, el HSV es
atractivo como vector para la administración de genes, debido a que
su gran tamaño permite la administración de múltiples genes grandes
a la vez y se puede hacer relativamente no tóxico [Huard et al.,
Neuromuscular Disorders 7(5):299-313
(1997); Glorioso et al., Annual Rev. Microbiol.
49:675-710 (1995)]. Además, el HSV se puede
hacer crecer hasta títulos elevados, puede infectar células
quiescentes con eficacia [Lim et al., Biotechniques
20(3):460-469 (1996)] y se puede
controlar mediante la acción de fármacos antivirales, tales como
acyclovir, que inactiva la replicación de los virus [Evrard et
al., Cell Biol. & Toxic.
12(4-6):345-350 (1996);
Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93(8:)3525-3529 (1996); Hasegawa et
al., Am. J. Resp. Cell & Mol. Biol.
8(6):655-661 (1993)]. Los vectores HSV no
replicantes también son relativamente no tóxicos y por consiguiente
pueden contribuir a la disminución de la inmunogenicidad de la
expresión de proteínas extrañas en los tejidos. Finalmente, tal
como se indicó anteriormente, el músculo esquelético es un lugar
ideal para el tratamiento de las miopatías y otras enfermedades, ya
que está muy vascularizado y es un excelente órgano secretor, con
muchos lugares de acceso.
Otras características y ventajas de la presente
invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y
los dibujos.
La Figura 1 es una fotografía de
inmunofluorescencia del HSV ICP4 que muestra los núcleos infectados
de miofibras maduras. Se procesaron miofibras infectadas con G207
para inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo
anti-ICP4 de ratón (a) G207 solamente, miofibra
madura; (b) G207 solamente, miofibra inmadura; (c) G207 solamente;
(d) G207 + 0,33 mg/ml colagenasa tipo IV; (e) G207 + 3 \mug/ml de
sulfato de dextrano; (f) G207 + 10 \mug/ml sulfato de dextrano;
(g) G207 + 2 U/ml de condroitina ABC liasa; (h) G207 + 4 U/ml de
condroitina ABC liasa. Aumentos de a, b, c, e-g x
20; h x 40; d x 60. Las imágenes se capturaron mediante microscopía
confocal: c - g.
La Figura 2 es una gráfica que muestra HPLC de
intercambio aniónico de glicosaminoglicanos asociados a células
derivados de miofibras pertenecientes a diferentes grupos de
edades. Las miofibras se marcaron con [^{35}S] sulfato durante 24
horas. Se eliminó el medio y se lavaron las monocapas extensamente
para eliminar cualquier traza del medio de las células. Se aislaron
los glicosaminoglicanos y se fraccionaron por HPLC. HS, posición de
elución de heparina; CS, posición de elución del sulfato de
condroitina. Los rombos abiertos, miofibras aisladas de ratones de
8 días de edad; rombos cerrados, miofibras aisladas de ratones de 2
meses de edad. La línea de puntos representa el gradiente de sal
utilizado para la elución.
La Figura 3 es una fotografía mostrando los
resultados de la inyección in vivo de músculo esquelético
inmaduro con G207. Se realizaron secciones de criostato del músculo
TA de ratón inmaduro a los 3 días post-inyección de
HSV y se tiñeron histoquímicamente para detectar
\beta-galactosidasa. La transferencia génica se
realizó mediante infección intramuscular de G207 (1 x 10^{6}
unidades formadoras de placa (pfu)) en un volumen de 50 \mul (a) y
(b) G207 solamente. Aumento: a x 10; b x 40.
La Figura 4 es una fotografía que muestra la
infección de músculo esquelético maduro con G207-
\beta-galactosidasa transferencia génica a músculo
esquelético de ratones adultos. G207 (1 x 10^{6} pfu) y los
tratamientos propuestos se inyectaron simultáneamente en el
tibialis anterior de ratones balb/c de 2 meses de edad, en un
volumen total de infección de 50 \mul. Las secciones congeladas
se cortaron y tiñeron para detectar actividad
\beta-galactosidasa, (a) y (b) solamente G207; (c)
y (d) G207 + 0,33 mg/ml de colagenasa tipo IV; (e) y (f) G207 + 10
\mug/ml de sulfato de dextrano; (g) y (h) G207 + 2 U/ml
condroitina ABC liasa. Aumentos: a, c, e, g x 20; b, d, f, h x
40.
La Figura 5 es un conjunto de fotografías que
muestran que el HSV alcanza los tejidos tumorales después de una
administración sistémica. El HSV se administró a los ratones por la
vena de la cola, alcanzando un tumor distante en el flanco (imagen
izquierda), o locorregionalmente a través de la vena porta,
alcanzando un tumor hepático (panel derecho). El tejido tumoral se
tiñó para \beta-galactosidasa para detectar
células infectadas con HSV.
La Figura 6 es un esquema mostrando la inyección
de HSV marcado en un ratón (panel derecho) y un gráfico de la
administración de partículas virales a múltiples tejidos de ratones
con tumores en los flancos. Los ratones fueron inyectados con 1 x
10^{7} pfu de NV1020 marcada con ^{35}S metionina. Dos horas
más tarde, los animales se sacrificaron y sus tejidos se midieron
para determinar la presencia de partículas virales.
La Figura 7 es una gráfica mostrando el efecto de
la administración sistémica de NV1020 (HSV) sobre la sobrevivencia
de ratones en modelos metastáticos de cáncer de hígado
CT-26. A los ratones con nódulos tumorales en el
hígado se les suministró sistemáticamente 1 x 10^{7} pfu de
NV1020 o PBS (control). EL porcentaje de ratones sobrevivientes se
midió a lo largo del tiempo.
La Figura 8 es una gráfica que muestra el efecto
de la administración intratumoral o sistémica de NV1020 o NV1020
más F1 (sulfato de dextrano) sobre la eficacia antitumoral en un
modelo CT-26 de tumor en el flaco. A los ratones
con tumores en el flanco se les administró NV1020 intratumoralmente
(IT) o sistémicamente [IV; con o sin F1 (sulfato de dextrano)] a
través de la vena de la cola. A continuación se valoraron las
velocidades de crecimiento de los tumores.
La Figura 9 es una gráfica que muestra el efecto
de la dosis de sulfato de dextrano (DexS) sobre la eficacia
antitumoral. A los ratones con tumores en los flancos se les
administró una dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7}
pfu de NV1020 más 10 \mug/ml de sulfato de dextrano, 1 x 10^{7}
pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de sulfato de dextrano, 1 x
10^{7} pfu NV1020 más 500 \mug/ml de sulfato de dextrano o PBS
más 100 µg/ml de sulfato de dextrano (control), el día 0, día 2 y
día 4. Se valoraron las velocidades de crecimiento de los
tumores.
La Figura 10 es una gráfica que ilustra el efecto
de múltiples dosificaciones de HSV más sulfato de dextrano (DexS)
sobre la eficacia antitumoral en un modelo de tumor en el flanco
CT-26. A los ratones con tumores en los flancos se
les administró una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020, una dosis
de 3 x 10^{7} pfu de NV1020 pfu más 100 \mug/ml de sulfato de
dextrano, tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 µg/ml de
sulfato de dextrano o PBS (control). Se valoraron las velocidades
de crecimiento de los tumores.
La Figura 11 es una gráfica que muestra el efecto
de múltiples dosis de NV1020 más sulfato de dextrano (DexS) sobre
la sobrevivencia de los ratones en un modelo de tumor en el flanco
CT-26. A los ratones con tumores en los flancos se
les administró una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020 una dosis de
3 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de sulfato de
dextrano, tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100
\mug/ml de sulfato de dextrano, o PBS (control). Se midió la
sobrevivencia de los ratones a lo largo del tiempo.
La Figura 12 es una gráfica que muestra el efecto
del sulfato de dextrano (DexS) sobre la eficacia antitumoral en un
modelo metastático a hígado CT-26. A los ratones
con tumores metastatizados se les administró 1 x 10^{7} pfu de
NV1020, 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano (100
\mug/ml), PBS solamente (control) o PBS más sulfato de dextrano
(100 \mug/ml) (control). El número de nódulos tumorales se valoró
13 días más tarde.
La Figura 13 es una gráfica que ilustra el efecto
de dextrano y acyclovir sobre la eficacia antitumoral en un modelo
de tumor en el flanco CT-26. A los ratones con
tumores en el flanco se les administró una dosis de 1 x 10^{7} pfu
de NV1020, 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano (F1;
100 µg/ml) NV1020 más sulfato de dextrano solamente (F2), 1 x
10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano y acyclovir (F3; 2
mg/ml) o PBS más sulfato de dextrano (100 \mug/ml) (control) el
día 0, el día 2 y el día 4. Se valoraron las velocidades de
crecimiento de los tumores.
La Figura 14 es una gráfica que muestra el efecto
de G207 más sulfato de dextrano (DexS) sobre la eficacia
antitumoral. A los ratones con tumores en los flancos se les
administró una dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7}
pfu de G207, 1 x 10^{7} pfu de G207 más sulfato de dextrano (100
\mug/ml) o PBS (control) en el día 0, día 2, y día 4. A
continuación se midieron las velocidades crecimiento tumoral.
La Figura 15 es un conjunto de fotografías que
muestran el efecto del sulfato de dextrano (DexS) sobre la
morfología de CT-26 y el crecimiento celular in
vitro. No se añadió compuesto (panel A), sulfato de dextrano
(100 \mug/ml; panel B) a células CT-26 en
cultivo. Una vez transcurridas 48 horas, se examinó el número de
células y su morfología.
La Figura 16 es una gráfica que muestra el efecto
del sulfato de dextrano (DexS) y acyclovir (ACV) sobre el
crecimiento en cultivo de CT-26. A las células
CT-26 cultivadas in vitro se les administró
sulfato de dextrano (100 \mug/ml), acyclovir (2 mg/ml), tanto
sulfato de dextrano como acyclovir, o no se las trató. Se midió la
proliferación celular a lo largo del tiempo.
La Figura 17 es un conjunto de fotografías que
muestra el efecto del sulfato de dextrano sobre la degeneración
periférica de los tumores de los flancos. A los ratones se les
administró 1 x 10^{7} pfu de NV1020 (panel A) o 1 x 10^{7} pfu
de NV1020 más sulfato de dextrano (F1) (panel B). A continuación se
recuperó el tumor y se preparó para el análisis histoquímico para
valorar la necrosis del tumor.
La Figura 18 es una gráfica que muestra el efecto
del sulfato de dextrano (DexS) sobre la biodisponibilidad del virus
in vivo. Se administró 1 x 10^{7} pfu de NV1020 o 1 x
10^{7} pfu de NV1020 más sulfato de dextrano por la vena de la
cola a los ratones. Se sacrificaron a continuación grupos de ratones
a diferentes puntos temporales. Se extrajeron muestras de sangre y
se analizó el suero para detectar virus infecciosos.
La Figura 19 es una gráfica que demuestra el
efecto del sulfato de dextrano (DexS) sobre la distribución in
vivo de NV1020 en múltiples tejidos. A ratones con tumores en
los flancos se les administró por la vena de la cola 1 x 10^{7}
pfu de NV1020 marcado radioactivamente (^{35}S) o 1 x 10^{7} pfu
de NV1020 marcado radioactivamente (^{35}S) más sulfato de
dextrano (100 \mug/ml). Una vez transcurridas 2 horas o 12 horas,
se sacrificaron los animales, se recogieron múltiples órganos, se
homogeneizaron y se valoró la distribución de NV1020
(^{35}S).
La invención proporciona la utilización de
vectores de ácido nucleico para la preparación de composiciones
farmacéuticas destinadas a introducir vectores (por ejemplo
vectores virales, tales como vectores HSV) en las células, por
ejemplo, células de músculo esquelético maduro o células tumorales,
mediante la administración conjunta de vectores virales con
moléculas cargadas, tales como polisacáridos cargados, por ejemplo
glicosaminoglicanos o análogos de los mismos. La composición
farmacéutica se puede utilizar para introducir genes en las células
in vivo con el propósito de, por ejemplo, terapia génica o
vacunación.
Los vectores que se pueden utilizar en la
presente invención utilizan glicosaminoglicanos como receptores o
coreceptores para entrar en las células. Se utilizan los vectores
virales de la familia Herpes Viridae (por ejemplo
HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV,
HHV-6, HHV-7 y
HHV-8).
En algunos casos, es deseable que los vectores
virales utilizados en la presente invención estén atenuados o
mutados de modo que no se repliquen en, o maten, las células en las
que se han introducido, mediante por ejemplo la inducción de la
lisis celular o la apoptosis de las células. En otros casos, por
ejemplo, en la terapia génica de los tumores, es beneficioso que
los vectores se puedan replicar en una célula y matarla. Se conoce
una multiplicidad de virus mutantes apropiados que tiene tales
características y se pueden adaptar fácilmente para la utilización
en la presente invención por los expertos en la materia. Por
ejemplo, en el caso de HSV, el vector de Geller (patente US nº
5.501.979; WO 90/09441; American Type Culture Collection (ATCC),
Rockville, Maryland, ATCC Numero de Acceso 40544), Breakfield (EP
453,242-A1), Speck (WO 96/04395), Preston et
al., (WO 96/04394), DeLuca (patente US nº 5.658.724), y Martuza
(patente US nº 5.585.096) se pueden adaptar con el fin de
utilizarlos en los métodos de la presente invención. Los ejemplos
específicos de mutantes de HSV mutantes que se pueden utilizar en
la presente invención incluyen NV1020 (descrito más adelante), G207
(Yazaki et al., Cancer Res.
55(21):4752-4756 (1995), HF (ATCC
VR-260), MacIntyre (ATCC VR-539), MP
(ATCC VR-735); HSV-2 cepa G (ATCC
VR-724) y MS (ATCC VR-540); así como
también mutantes con mutaciones en uno o más de los siguientes
genes: los genes inmediatamente tempranos ICP0, ICP4, ICP22, ICP27
e ICP47 (la patente US nº 5.658.724); genes necesarios para la
replicación viral, UL9, UL5, UL42, ADN pol e ICP8; el gen
\gamma34,5; el gen de la ribonucleótido reductasa; el gen VP16
(es decir, Vmw65, WO 91/02788; WO 96/04395; WO 96/04394) y los
genes gH, gL, gD o gB (WO 92/05263, WO 94/21807, WO 94/03207).
Las moléculas cargadas que se pueden utilizar en
la presente invención incluyen los polisacáridos cargados, tales
como los glicosaminoglicanos y los análogos de los mismos,
polilisina, aciclodextrina y dietilaminoetano (DEAE). Los ejemplos
de glicosaminoglicanos y análogos de los glicosaminoglicanos que se
pueden utilizar en la presente invención incluyen, por ejemplo, el
sulfato de dextrano, sulfato de dermatano, sulfato de heparano,
sulfato de condroitina y el sulfato de queratina. La molécula
cargada adicional que se pueden utilizar en la presente invención
es el polietilenglicol. Tal como se discute más adelante, la
molécula cargada se puede administrar antes de, o a la vez que, el
vector en las utilizaciones de la presente invención.
Las enfermedades que se pueden tratar con la
utilización de la presente invención incluyen el cáncer, las
miopatías primarias así como también las enfermedades que se pueden
tratar con la producción de proteínas circulantes. Por
consiguiente, los vectores en las utilizaciones de la presente
invención pueden incluir uno o más genes que codifican uno o más
productos génicos terapéuticos, tales como un polipéptido, por
ejemplo, un factor de crecimiento, un enzima, un polipéptido que
promociona la muerte celular, un polipéptido antiangiogénico o una
proteína inmunomoduladora, una hormona, una molécula de ARN
antisentido o una ribozima (ver más adelante), la expresión del cual
aliviará o evitará los síntomas de una enfermedad o estado. Por el
contrario, el gen puede codificar el antígeno de una vacuna y las
utilizaciones de la presente invención, por consiguiente, se pueden
utilizar para inducir una respuesta terapéutica profiláctica o
inmune, por ejemplo, a un patógeno indeseable o tipo celular, tal
como una célula tumoral.
Los ejemplos específicos de las enfermedades que
se pueden tratar utilizando la presente invención (así como los
correspondientes genes para incluir en los vectores para tratar las
condiciones) son las siguientes: restenosis
[\beta-ARKct, Iaccarino et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 96(7):3945-3950 (1999)];
receptor del factor de crecimiento fibroblástico [Yukawa et al.,
Atherosclerosis 141(1):125-132 (1998)];
parálisis laringea y atrofia muscular, mediante la amplificación
del brote de neuronas y la reinnervación muscular [factor de
crecimiento similar a la insulina-1
(IGF-1), Shiotani et al., Archives
Otolaryngology 125(5):555-56O (1999)];
mucopolisacaridosis tipo VII
[\beta-glucuronidasa, Daly et al., Human Gene
Therapy 10(1):85-94 (1999)]; distrofias
musculares del cinturón lumbar 2C-F
[\delta-sarcoglicano, Greelish et al., Nature
Medicine 5(4):439-443 (1999)];
enfermedades fibróticas, tales como la glomerulonefritis y la
glomeruloesclerosis [quimera del factor de crecimiento
transformante-\beta tipo II receptor IgG Fc,
(Isaka et al., Kidney Intl.
55(2):740-741 (1999)];
mucopolisacaridosis tipo VI [N-acetilgalactosamina
4-sulfatasa, Yogalingam et al., DNA & Cell
Biol. 18(3):187-195 (1999)];
enfermedades de las motoneuronas [neurotrofina-3 y
otros factores neurotroficos, tales como CNTF, BDNF e
IGF-1, (Haase et al., J. Neuro. Sci.
160(Suppl.1):S97-105 (1998)];
hipertensión [antisentido al receptor tipo I de la angiotensina
tipo II, (Gelband et al., Hypertension
33(1):360-365 (1999)]; aterosclerosis e
hipercolesterolemia [apolipoproteína AI y
lecitin-colesterol acetiltransferasa, (Fan et
al., Gene Therapy 5(10):1434-1440
(1998)]; inducción de una respuesta aloinmune [donante de MHC clase
I, (Zhai et al., Transplant Immunology
6(3):169-175 (1998)]; hemofilia [Factor
VIII, Factor IX, (Herzog et al., Nature Medicine
5(1):56-63 (1999); Herzog et al.,
Cur. Opin. Hemat. 5(5):321-326 (1998)];
pérdida de la función de músculos esqueléticos con el
envejecimiento [IGF-1 (Barton-Davis
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95(26):15603-15607 (1998)]; deficiencias
de enzimas hepáticos [fenilalanin hidroxilasa, (Harding et al.,
Gene Therapy 5(5):677-683 (1998)];
diabetes mellitus no dependiente de insulina [GLUT4 (Galuska et
al., Adv. Exp. Med. & Biol. 441:73-85
(1998)]; enfermedad del almacenamiento del glicógeno
[Alfa-glucosidasa ácida, (Nicolino et al., Human
Mol. Gen,. 7(11):1695-1702 (1998)];
distrofia muscular [distrofina, (Baranov et al., Genetika
34(7):876-882 (1998)]; utrofina, [Rafael
et al., Nature Genetics 19(1):79-82
(1998)]; supresión de tumores y metástasis, adyuvantes de vacunas,
defensa contra patógenos [Interleucina-12, (Lee
et al., Human Gene Therapy
9(4):457-465 (1998)] e isquemia aguda de
los miembros (factor de crecimiento vascular endotelial [Tsurumi
et al., Circulation
96(Suppl.9):II-382-8
(1997)]. Los productos terapéuticos adicionales que se pueden
producir utilizando la presente invención incluyen, por ejemplo,
hormona de crecimiento, eritropoietina, insulina, proteínas
inmunomoduladoras, proteínas antiangiogénicas, citocinas y
polipéptidos implicados en la muerte celular.
Tal como se indicó anteriormente, el producto
terapéutico codificado por un gen en un vector utilizado en la
presente invención también puede ser una molécula de ARN, tal como
una molécula de ARN antisentido que, mediante interacciones de
hibridación, se puede utilizar para bloquear la expresión del ARNm
de un patógeno celular. Por el contrario, la molécula de ARN puede
ser una ribozima (p. ej. una ribozima a base de cabeza de martillo
o pinza) diseñada para reparar un ARN celular defectuoso o para
destruir un ARN indeseable, celular o codificado por un patógeno
(ver, por ejemplo Sullenger, Chem. Biol.
2(5):249-253 (1995); Czubayko et al.,
Gene Ther. 4(9):943-949 (1997); Rossi,
Ciba Found. Symp. 209:195-204 (1997); James
et al., Blood 91(2):371-382 (1998);
Sullenger, Cytokines Mol. Ther.
2(3):201-205 (1996); Hampel, Prog.
Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 58:1-39 (1998);
Curcio et al., Pharmacol. Ther.
74(3):317-332 (1997).
Los genes se pueden insertar en los vectores
utilizados en la presente invención utilizando métodos estándar
[ver, p. ej. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, John Willey & Sons, New York, NY, (1998)]. Los
genes se pueden insertar de modo que se encuentren bajo el control
de las secuencias reguladoras del vector. Por el contrario, los
genes se pueden insertar como parte de un casete de expresión que
incluye elementos reguladores, tales como promotores o
amplificadores. Los elementos reguladores adecuados se pueden
seleccionar por un experto en la materia, en base a, por ejemplo, la
especificidad tisular deseada y el nivel de expresión. Por ejemplo,
se puede utilizar un promotor específico de tejido o tipo celular
(p. ej., específico para músculo o un tejido en el cual se produce
un tumor) para limitar la expresión del producto de un gen a un
tejido o a un tipo celular específico. Además de utilizar
promotores específicos de tejido, la administración local del
vector y/o la molécula cargada se puede utilizar para lograr
expresión localizada.
Los ejemplos de promotores de no tejido
específicos que se pueden utilizar en la presente invención
incluyen el promotor temprano del Citomegalovirus (CMV) (patente US
nº 4.168.062) y el promotor del virus del sarcoma de Rous [Norton
et al., Molec. Cell Biol. 5:281 (1985)]. También se pueden
utilizar los promotores del HSV, tales como el
HSV-1 IE y el IE 4/5, Un ejemplo de promotor
específico de tejido que se puede utilizar en la presente invención
es el promotor de la desmina, que es específico para las células
musculares [Li et al., Gene 78:243 (1989); Li et al.,
J.Biol. Chem. 256:6562 (1991)]. En la materia se conocen otros
promotores específicos de músculo y se pueden adaptar fácilmente
para su utilización en la presente invención.
Los vectores y moléculas cargadas se pueden
administrar a un paciente (por ejemplo a un paciente humano) según
la utilización de la presente invención mediante, por ejemplo,
inyección directa en el tejido, por ejemplo, un músculo o tejido en
el que se encuentra un tumor, o mediante métodos quirúrgicos. Por el
contrario, la administración de tanto uno como el otro de los
agentes puede ser parenteral, intravenosa, subcutánea,
intraperitoneal, intradérmica o por vía intraepidérmica, o a través
de una superficie de mucosa, por ejemplo, una superficie ocular,
intranasal, pulmonar, oral, intestinal, rectal, vaginal o del
tracto urinario.
En la presente invención se puede utilizar
cualquiera de entre múltiples formulaciones bien conocidas para
introducir vectores en las células de los mamíferos (ver, por
ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª edición),
Ed., A. Gennaro (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA). Por
ejemplo, los vectores se pueden utilizar en forma simple, libre de
cualquier acondicionamiento o vehículo de administración. Los
vectores (así como también las moléculas cargadas) se pueden
simplemente diluir en una solución fisiológicamente aceptable, tal
como disolución salina estéril o disolución salina tamponada
estéril, con o sin un vehículo.
La cantidad de vector que se debe administrar
depende, por ejemplo, del objetivo específico que se desea lograr,
la fuerza de cualquier promotor que se utilice en el vector, el
estado del mamífero objeto de la administración (por ejemplo, el
peso, edad y salud en general del mamífero), la forma de
administración y el tipo de formulación. En general, a los seres
humanos adultos se les administra una dosis terapéuticamente o
profilácticamente efectiva de, por ejemplo, entre aproximadamente 1
ng y aproximadamente 1 mg, preferentemente, de entre
aproximadamente 10 \mug y aproximadamente 800 \mug.
La cantidad de molécula cargada que se debe
administrar la puede determinar un experto en la materia, y puede
estar entre, por ejemplo, aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente
100 \mug/ml, pero preferentemente, es inferior a 10 \mug/ml. La
administración de tanto el vector como la molécula cargada se puede
lograr en una única dosis o a intervalos repetidos. También, la
molécula cargada se puede administrar a la vez que o antes que (por
ejemplo, hasta cinco horas, tal como tres horas) el vector.
Las utilizaciones de la presente invención se
basan en el descubrimiento, que se describe más adelante, de que la
síntesis de los glicosaminoglicanos está negativamente regulada
durante la maduración del músculo esquelético murino. Ello podría
explicar la pérdida de infectividad del HSV con la maduración del
músculo esquelético murino, debido a que el sulfato de heparano
actúa como un coreceptor para la unión del HSV a las células
[Montgomery et al., Cell
87(3):427-436 (1995); Geraghty et al.,
Science 280(5369):1618-1620 (1998);
Whitbeck et al., J. Virol.
71(8):6083-6093 (1997)]. Para ensayar si
los receptores secundarios del HSV estaban presentes, se trataron
miofibras con múltiples enzimas, que incluyeron colagenasa tipo IV
y condroitina ABC liasa. Los dos tratamientos incrementaron la
infección por HSV, lo que sugiere que los receptores del virus
estaban presentes, pero no fácilmente accesibles al virus en la
miofibra intacta. Sorprendentemente, también descubrimos que la
infectividad del HSV-1, pero no la del HSV tipo 2
(HSV-2), se podía restablecer mediante la
exposición de las miofibras a pequeñas concentraciones de sulfato de
dextrano, un análogo del glicosaminoglicano. Se ha demostrado
anteriormente que el sulfato de dextrano promociona la infección
por HSV-1, pero no la de HSV-2 en
ausencia de sulfato de heparano. Ello apoya la hipótesis de que la
falta de sulfato de heparano accesible es responsable de la
resistencia de las miofibras maduras a la infección por
HSV-1. En conjunto, dichos resultados demuestran que
la lámina basal no constituye una barrera absoluta para la
infección y que el sulfato de dextrano se puede utilizar como un
coreceptor sustituto para la dirección no destructiva del
HSV-1 al músculo esquelético maduro. Estos
descubrimientos, que se describen más adelante en más detalle,
amplían considerablemente la utilidad del HSV como vector en la
terapia génica para el tratamiento de enfermedades heredadas y
adquiridas.
También se ha descubierto que la infección de las
células tumorales por el HSV se incrementa mediante la
administración simultánea de una molécula cargada, por ejemplo,
glicosaminoglicano o un análogo del glicosaminoglicano. Tales
resultados, descritos más adelante en mayor detalle, refuerzan la
utilización del HSV como vector para la terapia génica en el
tratamiento del cáncer y otras enfermedades de la proliferación
celular u otros desórdenes.
Se ha demostrado anteriormente que los vectores
de HSV infectan las fibras musculares de los recién nacidos in
vitro, pero no las aisladas de animales más viejos [Huard,
et al., Human Gene Therapy
8(4):439-452 (1997); Feero et al.,
Human Gene Therapy 8(4):371-380 (1997);
Huard et al., Neuromuscular Disorders
7(5):299-313 (1997); Huard et al., J.
Virol. 70(11):8117-8123 (1996)]. Para
investigar la razones subyacentes de la pérdida de infección
dependiente de la maduración, se establecieron cultivos de fibras
musculares únicas y se expusieron a G207, que es un vector
HSV-1 atenuado deficiente en replicación que
expresa \beta-galactosidasa después de la
infección [Yazaki et al., Cancer Res.
55(21):4752-4756 (1995); Mineta et
al., Nature Med. 1(9):938-943 (1995)]. En
tales ensayos, las miofibras de recién nacidos fueron completamente
susceptibles a la infección, mientras que solamente el 6% de las
miofibras maduras se infectaron con esta concentración de virus
(Tabla 1 y Figura 1, a y b). Por consiguiente, dichos resultados
fueron consistentes con estudios previos que demostraron una pérdida
de susceptibilidad al HSV dependiente de la maduración [Feero et
al., Human Gene Therapy 8(4):371-380
(1997); Huard et al., J. Virol.
70(11):8117-8123
(1996)].
(1996)].
| Número de miofibras aisladas de músculo EDL de ratón maduro que expresan lac Z después | ||
| de la inoculación con G207 y los tratamientos propuestos | ||
| Tratamiento | Número total de fibras | % positivo |
| G207 solamente | 88 | 6 |
| 0,02 mg/ml colagenasa tipo IV | 68 | 7 |
| 0,20 mg/ml colagenasa tipo IV | 81 | 31 |
| 0,33 mg/ml colagenasa tipo IV | 77 | 97 |
| 0,66 mg/ml colagenasa tipo IV | 67 | 0* |
| 0,3 \mug/ml sulfato de dextrano | 78 | 6 |
| 3,0 \mug/ml sulfato de dextrano | 75 | 7 |
| 10 \mug/ml sulfato de dextrano | 82 | 99 |
| 2 U/ml condroitina ABC liasa | 49 | 100 |
| 4 U/ml condroitina ABC liasa | 44 | 30 |
| 6 U/ml condroitina ABC liasa | 43 | 0 |
| 1 a 6 U/ml heparitinasa | 39 | 0 |
| PEG | 33 | 6 |
| * 0,66 mg/ml colagenasa tipo IV fueron tóxicos para las miofibras aisladas. |
Los estudios anteriores sugirieron que la
formación de la lámina basal durante la maduración puede actuar
como una barrera física contra la infección por HSV, evitando de
este modo la interacción del virus con los receptores necesarios
para la infectividad. Para probar esto, se expusieron miofibras
aisladas a G207 después de tratarlas con colagenasa tipo IV, que
libera péptidos del colágeno degradando de este modo la lámina
basal (Fig. 1). La inmunofluorescencia indirecta de la proteína
nuclear de HSV, ICP4, reveló que la destrucción parcial de la
lámina basal de este modo estimula la infección por HSV (Fig. 1d).
El efecto fue dependiente de la concentración de tal modo que un
incremento en la colagenasa tipo IV se correlaciona con un
incremento en la infección por HSV. A una concentración de 0,66
mg/ml se produjo toxicidad tal como indica la hipercontracción de
las miofibras durante el período de 30 minutos previo a la
incubación (Tabla 1). En una segunda estrategia, se ensayó la
capacidad para incrementar la susceptibilidad a la infección por
HSV de la condroitina ABC liasa, que degrada un amplio rango de
partes de sulfato de condroitina (Fig. 1, g y h). Dicho tratamiento
incrementó considerablemente la infección, mientras que el
tratamiento con heparitinasa no lo hizo (Tabla 1). Por consiguiente,
la destrucción parcial de la lámina basal con enzimas específicos
permitió la unión y la entrada del HSV en la fibra de músculo
maduro, lo que sugiere que los receptores secundarios del virus
estaban presentes pero no accesibles en el contexto de la miofibra
madura.
El HSV infecta las células uniéndose a las partes
semejantes a sulfato de heparano en la superficie de la célula,
seguido de la interacción con receptores proteicos secundarios
[Spear et al., Adv. Exp. Med. & Biol.
313:341-353 (1992); Gruenheid et al., J.
Virol. 67(1):93-100 (1993); Geraghty
et al., Science 280(5369):1618-1620
(1998); Montgomery et al., Cell
87(3):427-436 (1996)]. Aunque no es
estrictamente necesario, el sulfato de heparano en la superficie
celular incrementa la eficacia de la infección por HSV por dos
órdenes de magnitud en la mayoría de las células ensayadas [Banfield
et al., J. Virol. 69(9):3290-3298
(1995)]. Para investigar si la expresión de glicosaminoglicanos
estaba alterada en las fibras de los adultos en comparación con las
de los recién nacidos, se aislaron glicosaminoglicanos radiomarcados
de cultivos de fibras musculares y se analizaron mediante HPLC por
intercambio de aniones (Figura 2). Las fibras musculares de los
recién nacidos expresaron cantidades significativas de sulfato de
heparano y glicosaminoglicanos de sulfato de condroitina. Por el
contrario, la síntesis de glicosaminoglicanos estuvo
significativamente reducida en las miofibras de los adultos durante
el marcaje en estado estable y el sulfato de heparano residual
sintetizado estuvo relativamente menos sulfatado en comparación con
las miofibras de los recién nacidos (Fig. 2).
Los datos hasta ahora indican que uno o más de
los componentes de la lámina basal presentes en las miofibras
maduras inhibieron la infección por HSV. Además, la biosíntesis de
sulfato de heparano se redujo en comparación con las miofibras
inmaduras, lo que podría dar cuenta de toda o parte de la pérdida de
susceptibilidad a la infección por HSV. Con anterioridad se ha
demostrado que las células desprovistas de biosíntesis de sulfato
de heparano se pueden infectar por HSV-1, pero no
por HSV-2, si se añade a las células una pequeña
concentración de sulfato de dextrano antes de o durante la infección
[Dyer et al., J. Virol. 71(1):191-198
(1997)]. Por el contrario, el sulfato de dextrano es un inhibidor
potente de la infección por HSV si las células diana expresan
cantidades significativas de sulfato de heparano. Cuando se añadió
sulfato de dextrano a las miofibras maduras en cultivo, se
incrementó significativamente la infección por
HSV-1 (Fig. 1, e y f y Tabla 1). Además, dicho
efecto fue específico para el HSV-1, lo que es
consistente con la hipótesis de que la falta de infección de las
miofibras maduras fue debida, por lo menos en parte, a la falta de
unidades de sulfato de heparano accesibles en la superficie de la
célula (Tabla 2).
| Tratamiento | virus | Expresión de \beta-galactosidasa |
| Sin tratamiento | G207 | Negativo |
| L1BR1 | Negativo | |
| 10 \mug/ml sulfato de dextrano | G207 | positivo |
| L1BR1 | Negativo |
Para determinar si existía una barrera adicional
en la fusión posterior a la unión del HSV con la membrana
plasmática, se expusieron miofibras maduras aisladas al agente
fusiogénico polietilenglicol (PEG) antes del estímulo con G207. La
fusión inducida por PEG no alteró la infectividad de las miofibras
adultas, lo que sugiere que la barrera a la infección por HSV tiene
lugar al nivel de la unión con el virus (Tabla 1).
Para establecer que las miofibras maduras eran
susceptibles a la infección por G207 in vivo, se inyectaron
10^{6} unidades formadoras de placas (pfu) directamente en el
músculo tibialis anterior (TA) de un ratón balb/c de 8 días de
edad. Se extrajeron los músculos inyectados tres días después de la
inyección, se seccionaron y analizaron histoquímicamente para
detectar la expresión de \beta-galactosidasa
(Fig. 3). Se detectaron niveles elevados de expresión del transgén
en las zonas inyectadas. También se encontraron miofibras
infectadas con HSV lejos del lugar de inyección, lo que sugiere que
hubo una considerable dispersión del vector.
Para comprobar si los tres tratamientos que
amplifican la infección in vitro funcionaban en el animal
adulto, se inyectaron ratones con 1 x 10^{6} pfu de G207 en el
músculo tibialis anterior (TA) junto con condroitin ABC liasa,
colagenase tipo IV o sulfato de dextrano. En todos los casos los
resultados in vivo fueron consistentes con las observaciones
in Vitro (Fig. 4, Tabla 3). Interesantemente, el sulfato de
dextrano se pudo administrar una hora antes que el virus sin
pérdida de función, una observación también hecha in vitro
[Dyer et al., J. Virol. 71(1):191-198
(1997)]. Además, la infección no quedó limitada a las miofibras en
regeneración, que se identificaron por su núcleo centralmente
localizado. En conjunto, estos resultados demuestran que la barrera
a la infección por HSV en el músculo esquelético adulto es debida,
por lo menos en parte, a la ausencia relativa de receptores de HSV
necesarios para una infección eficaz.
| Tratamiento | Número de fibras azules |
| G207 solamente | 0 |
| 3 \mug/ml de sulfato de dextrano | 76 |
| 10 \mug/ml de sulfato de dextrano | 149 |
| 0,18 mg/ml colagenasa tipo IV | 0 |
| Tratamiento | Número de fibras azules |
| 0,33 mg/ml colagenasa tipo IV | 77 |
| 2 U/ml condroitina ABC liasa | 302 |
| 4 U/ml condroitina ABC liasa | 226 |
La toxicidad del HSV in ratones administrados con
NV1020 sistémicamente se valoró primero. A los ratones se les
administraron múltiples dosis de NV1020 por una vía intraesplénica,
por la vena porta o por la vena de la cola. Se valoraron la
mortalidad y la morbidez cada día durante 28 días (Tabla 4). Los
presentes estudios demuestran que se pueden administrar 1 x
10^{7} pfu a través de múltiples vías sin toxicidad observable.
Tal dosis sin efecto es equivalente a aproximadamente 3,5 x
10^{10} pfu para humanos.
| Ratón | Virus | Dosis (pfu) | vía | Morbidez | Mortalidad |
| C57B6 | NV1020 | 5E7 | Intraesplénica | +++ | 50% |
| Balb/C | NV1020 | 5E7 | Intraesplénica | +++ | 100% |
| Balb/C | NV1020 | 1E7 | Intraesplénica | + | 0% |
| Balb/C | NV1020 | 3E7 | Intraesplénica | +++ | >50%* |
| Balb/C | NV1020 | 1E8 | Vena porta | +++ | 100%** |
| Balb/C | NV1020 | 3E7 | Vena de la cola | - | 0% |
| Balb/C | NV1020 | 3X1E7 | Vena de la cola | - | 0% |
| * el % de mortalidad depende del método de purificación de los virus | |||||
| ** no observado si los ratones tienen >12 semanas. |
El HSV también se puede administrar a tejidos
tumorales como agente antitumoral. Por ejemplo, se administró HSV a
los ratones, por la vena de la cola
(G47\Delta-BAC, un derivado de G207 con ICP47
eliminado y un elemento de cromosoma bacteriano artificial (BAC)
insertado en el locus de la timidita kinasa), o locorregionalmente
(G207), por la vena porta, alcanzando un tumor distante en el
flanco o un tumor en el hígado, respectivamente. El virus infectó
las células tumorales con éxito en cada uno de los modelos (Fig. 5).
La destrucción de las células del tumor inducida por el virus se
puede seguir mediante la necrosis del tumor, que resulta en un
crecimiento retardado del tumor y regresión.
Se determinó el número estimado de partículas
virales que alcanza un tumor después de la administración
sistemática. A los ratones con tumores en los flancos se les
inyectaron, por la vena de la cola 1 x 10^{7} pfu de NV1020
marcadas con ^{35}S metionina. El NV1020 es un vector recombinante
competente en la replicación que contiene solamente una copia de
\gamma34,5 y una deleción en las repeticiones terminales de tal
modo que impide la reorganización de los segmentos del genoma.
Después de 2 horas, se sacrificaron los animales y se cosecharon
sus tejidos y se midieron para determinar la presencia de
partículas virales (midiendo el marcador radioactivo). Los
resultados de estos estudios indican que se encontraron
aproximadamente entre 10^{3} y 10^{4} partículas virales en el
hígado y se localizaron aproximadamente entre 10^{4} y 10^{5}
partículas virales en el tejido del tumor (Fig. 6).
También se utilizó NV1020 para examinar el efecto
de la administración de este vector viral a ratones en un modelo de
cáncer metastásico. En tal modelo, se generaron nódulos de tumor en
el hígado de los ratones después de una inyección intraesplénica de
células de cancerosas CT-26. Veinticuatro horas
después de la inyección de células se inyectaron los ratones, por
la vena de la cola, con 1 x 10^{7} pfu de NV1020. Se siguieron
los ratones cuidadosamente y se valoraron para determinar la
sobrevivencia a lo largo del tiempo (Fig. 7). Los animales
moribundos se sacrificaron apropiadamente. La sobrevivencia
incrementó desde el 25% hasta el 75% mediante la administración de
NV1020, en comparación con los animales control.
También se examinaron diferentes modos de
administración para determinar la eficacia de la administración
sistémica de HSV sobre el crecimiento del tumor. Se establecieron
tumores en los flancos de los ratones mediante inyección subcutánea
de células cancerosas CT-26. A continuación se
administró a los ratones 1 x 10^{7} pfu de NV1020
intratumoralmente o sistémicamente por la vena de la cola. A
continuación se valoró la velocidad de crecimiento de los tumores
mediante la medición de los volúmenes de los tumores bisemanalmente
(Fig. 8).
Los resultados de dicho estudio indican que la
administración intratumoral de NV1020 es tan eficaz como la
administración sistémica por la vena de la cola (no hubo diferencia
estadística). Las dos vías de administración retardaron
significativamente la velocidad de crecimiento tumoral, produciendo
una reducción de aproximadamente el 50% en el volumen de los
tumores. Tales resultados demuestran que aunque los virus se
administran típicamente por inyección intratumoral en modelos de
tumor (debido a que se considera que la administración sistémica
del virus no resultaría en la llegada de suficientes pfu al tumor
como para ser eficaz) otras rutas de administración también son
efectivas.
También se investigó la adición de análogo de
glicosaminoglicano a la terapia de vector viral para el tratamiento
de los tumores. El sulfato de dextrano es un análogo del
glicosaminoglicano que se utiliza en situaciones de investigación
para bloquear la infección viral de las células diana mediante la
interferencia con la unión del virus a las células. En una
situación clínica, se utiliza en la perfusión local de fármacos
después de cirugía. El sulfato de dextrano también se ha publicado
que es un amplificador del volumen. Más recientemente, el sulfato
de dextrano se ha ensayado como agente antiviral para el HIV.
El modelo CT-26 de tumor en el
flanco se utilizó otra vez para determinar el efecto de una
combinación de HSV y análogo de sulfato de dextrano sobre el
crecimiento de los tumores. Se administró una combinación de 1 x 107
pfu de NV1020 y sulfato de dextrano (100 µg/ml) por la vena de la
cola de ratones con tumores en los flancos y se valoró el volumen
de los tumores a lo largo del tiempo. El NV1020 más sulfato de
dextrano disminuyó el volumen de los tumores así como también lo
hizo el NV1020 solamente (Fig. 8).
El efecto de la concentración de moléculas
cargadas administradas con el HSV sobre el crecimiento de los
tumores también se valoró. A los ratones con tumores en los flancos
se les administraron dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020; 1 x
10^{7} pfu de NV1020 más 10 µg/ml de sulfato de dextrano; 1 x
10^{7} pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de sulfato de dextrano
(100 \mug/ml); 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 500 \mug/ml de
sulfato de dextrano o PBS más 100 µg/ml de sulfato de dextrano
(control) el día 0, el día 2 y el día 4. A continuación se valoró
la velocidad de crecimiento de los tumores (Fig. 9). Tales estudios
revelaron que el sulfato de dextrano incrementó la terapia viral en
un modo dependiente de la dosis, siendo las concentraciones mayores
de sulfato de dextrano administradas a la vez con NV1020 más
eficaces que las concentraciones inferiores.
El efecto de dosis múltiples de HSV más sulfato
de dextrano sobre el crecimiento de los tumores también se valoró.
A los ratones con tumores en los flancos se les administraron tres
dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020, una dosis de 3 x 10^{7} pfu
de NV1020, tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100
\mug/ml de sulfato de dextrano (F1) o PBS (control). A
continuación se determinaron las velocidades de crecimiento tumoral
(Fig. 10).
Los resultados de tal estudio demostraron que el
crecimiento tumoral fue inferior cuando se inyectaron
simultáneamente 100 \mug/ml de sulfato de dextrano con NV1020.
Además, la eficacia antitumoral incremento cuando se administraron
tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020 en comparación a cuando se
administró una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020.
Muchas publicaciones de eficacia antitumoral no
producen un incremento correspondiente en la sobrevivencia del
sujeto. Para determinar si la eficacia antitumoral corresponde a un
incremento en la sobrevivencia de los animales tratados con HSV o
HSV más sulfato de dextrano, a los ratones con tumores en los
flancos se les administró una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020,
una dosis de 3 x 10^{7} pfu de NV1020 más 100 \mug/ml de
sulfato de dextrano, tres dosis de 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más
100 \mug/ml de sulfato de dextrano, o PBS (control). A
continuación se midió la sobrevivencia de los ratones a lo largo
del tiempo (Fig. 11). Estos resultados demuestran que el NV1020,
administrado en dosis múltiples junto con el sulfato de dextrano,
incrementa la sobrevivencia de los ratones. Estos resultados
corresponden a la eficacia antitumoral del NV1020 más sulfato de
dextrano descrita anteriormente. Con un tratamiento de este tipo,
se pueden producir curaciones.
También se valoró la eficacia de los cambios en
la formulación en un modelo de metástasis hepática
CT-26. A los ratones con tumores metastatizados se
les administraron 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7} pfu de
NV1020 más sulfato de dextrano (100 \mug/ml), PBS solamente
(control), o PBS más sulfato de dextrano (100 \mug/ml) (control).
A continuación se valoró el número de nódulos tumorales 13 días
después del tratamiento (Fig. 12). El tratamiento con cada una de
las tres formulaciones produjo una disminución de la cuenta de
nódulos en comparación con los controles. Estos resultados
establecen que el protocolo de tratamiento no solamente es efectivo
en el caso de tumores únicos, grandes, establecidos en los flancos,
sino también en el caso de enfermedad microscópica.
Para examinar las funciones de la sulfatación del
sulfato de dextrano y la replicación del HSV en la eficacia
antitumoral de las formulaciones de HSV más sulfato de dextrano, se
añadieron dextrano y acyclovir a las formulaciones. La molécula
dextrano ha sido utilizada en la clínica como un amplificador del
volumen y en la perfusión local de los tejidos después de la
cirugía. También existen publicaciones sobre la utilización del
dextrano en la terapia cardiovascular de rutina en el Japón. El
acyclovir, es un fármaco clínicamente aprobado, utilizado con el
fin de evitar la replicación y por consiguiente inhibe la
dispersión del HSV. Es un terminador de cadena obligatorio activado
mediante la timidina quinasa viral.
A los ratones con tumores en los flancos se les
administraron 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x 10^{7} pfu de
NV1020 más sulfato de dextrano (100 \mug/ml), 1 x 10^{7} pfu de
NV1020 más solamente dextrano, 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más
sulfato de dextrano (100 µg/ml) y acyclovir (2 mg/ml) o PBS más
sulfato de dextrano (100 \mug/ml). A continuación se valoraron
las velocidades de crecimiento de los tumores, bisemanalmente (Fig.
13). El componente de sulfato del sulfato de dextrano no pareció
afectar a su modo de incrementar la eficacia antitumoral, ya que la
inyección simultánea de HSV con dextrano solamente produjo una
eficacia antitumoral comparable. Tampoco la replicación de los virus
parece ser necesaria para la eficacia antitumoral o para la
sobrevivencia de los animales, ya que la combinación HSV, sulfato
de dextrano y acyclovir redujo el crecimiento de los tumores.
También se ensayó la eficacia antitumoral de otro
vector de HSV recombinante, G207, una cepa diferente de NV1020 con
las dos copias de \gamma34,5 eliminadas y la ribonucleótido
reductasa eliminada mediante la inserción del gen de la
\beta-galactosidasa. A los ratones con tumores en
los flancos se les administraron 1 x 10^{7} pfu de NV1020, 1 x
10^{7} pfu de G207, 1 x 10^{7} pfu de G207 más sulfato de
dextrano (100 \mug/ml), o PBS más sulfato de dextrano (100
\mug/ml) (control) el día 0, día 2 y día 4. A continuación se
midieron las velocidades de crecimiento tumoral (Fig. 14). El
sulfato de dextrano incrementó la eficacia antitumoral del G207,
indicando que otras cepas de vectores de HSV tienen valor
terapéutico y la eficacia antitumoral del HSV-1 no
depende de \gamma34,5. Estos descubrimientos también sugieren que
también se podrán utilizar terapéuticamente otros vectores de la
generación actual.
Para entender mejor los efectos in vivo
del sulfato de dextrano o del dextrano en combinación con HSV, los
efectos del sulfato de dextrano sobre la morfología celular y la
proliferación celular se evaluaron en un modelo de cultivo celular.
Se trataron células CT-26 con 100 \mug/ml de
sulfato de dextrano o se dejaron sin tratar. Transcurridas 48
horas, se examinaron el número de células y su morfología (Fig.
15). In vitro, el sulfato de dextrano añadido al medio de
cultivo celular no retardó el crecimiento de las células
CT-26. El tratamiento de las células con sulfato de
dextrano, sin embargo, sí cambió la morfología de las células. En
presencia, de sulfato de dextrano, las células
CT-26 parecen más dispersas uniformemente sobre los
platos de cultivo (Panel B) en comparación con la apariencia
"apiñada" de las células CT-26 en ausencia de
sulfato de dextrano (Panel A). Tales resultados sugieren un cambio
en la expresión génica como posible explicación de la profunda
eficacia antitumoral observada in vivo.
También se examinó el efecto del sulfato de
dextrano, acyclovir o una combinación de los dos, dextrano y
acyclovir, sobre el crecimiento celular in vitro. Se
administró a los cultivos de células CT-26 sulfato
de dextrano (100 \mug/ml), acyclovir (2 mg/ml), los dos, sulfato
de dextrano y acyclovir o se los dejó sin tratamiento (control). Se
contaron las células CT-26 a múltiples tiempos
después de la adición de cada formulación. Transcurridas 72 horas
desde la exposición a las formulaciones, el crecimiento de las
células (número de células/ml) no cambió significativamente con la
exposición a sulfato de dextrano, acyclovir o a la combinación de
las dos formulaciones, en comparación con las células no tratadas
(Fig. 16). Tales resultados indican que estas formulaciones no
alteran el crecimiento celular in vitro.
A continuación se examinó el efecto de la
inyección conjunta de HSV y sulfato de dextrano sobre la
degeneración tumoral. A los ratones con tumores en los flancos se
les administró NV1020 o NV1020 más sulfato de dextrano (F1) por la
vena de la cola. A continuación se extrajeron los tumores, se
congelaron y seccionaron para análisis histoquímica (Fig.17). La
degeneración periférica de los tumores fue mucho mayor cuando se
administró sulfato de dextrano junto con NV1020 (panel B; áreas
mostradas en gris claro), que cuando NV1020 se administró solo
(panel A). Ello indica que la necrosis tumoral no está limitada a
las células anóxicas en el centro del tumor, sino que también tiene
lugar en las células en crecimiento y división situadas en el
margen donde se encuentran localizados los vasos sanguíneos que
alimentan al tumor.
Debido a que se sabe que los virus son
inactivados rápidamente por los componentes presentes en la sangre,
que incluyen los del sistema inmune (factores de complemento,
anticuerpos), se examinó el efecto del sulfato de dextrano en la
biodisponibilidad del virus in vivo. Se administró a los
ratones 1 x 10^{7} pfu de NV1020 o 1 x 10^{7} pfu de NV1020 más
sulfato de dextrano (100 µg/ml) por la vena de la cola. A
continuación se sacrificaron grupos de ratones a diferentes
tiempos. Se extrajeron muestras de sangre mediante punción cardiaca
y se analizó el suero para determinar durante cuanto tiempo el
virus era infeccioso in vivo (Fig. 18). Cuando se administró
sulfato de dextrano junto con NV1020, el tiempo de circulación de
virus infeccioso se incrementó por un factor de 3. Dicho tiempo es
suficiente para permitir que el virus activo alcance el tumor para
ejercer la eficacia antitumoral. En consecuencia, un tiempo de
circulación de virus infeccioso más prolongado resulta en una
administración neta superior de vector terapéutico.
Además, se determinó el efecto del sulfato de
dextrano sobre la distribución del NV1020 en los tejidos in
vivo. Se administró por la vena de la cola a ratones con
tumores en los flancos 1 x 10^{7} pfu de NV1020 marcado
radioactivamente con [^{35}S] NV1020 o 1 x 10^{7} pfu de NV1020
marcado radioactivamente con [^{35}S] con sulfato de dextrano
(100 \mug/ml). A las 2 horas o a las 12 horas, se cosecharon
múltiples órganos, incluidos el hígado, bazo, riñones, pulmones y
corazón, así como también el tumor, se homogeneizaron y se
ensayaron para determinar la carga viral mediante contaje de
centelleo (Fig 19). A lo largo del tiempo, el sulfato de dextrano
incrementó la cantidad de virus encontrado en el tumor y decreció
la cantidad de virus encontrado en el hígado.
También se completaron los estudios de expresión
génica en las células CT-26 tratadas con sulfato de
dextrano. Se trataron células CT-26 en cultivo con
sulfato de dextrano durante 1 hora, o se dejaron sin tratar. A
continuación se extrajo ARN de las células. A continuación se midió
la expresión de múltiples genes diferentes y se compararon los
niveles de expresión entre las células tratadas con sulfato de
dextrano y las no tratadas. Los resultados de tales estudios se
sumarizan en la Tabla 5. Disminuyó notablemente la expresión de
múltiples genes que codifican proteínas implicadas en la
angiopoiesis.
| Gen | Función | Cambio |
| Flk-1 | Angiogénesis | \downarrow |
| VEGF-\beta | Angiogénesis | \downarrow |
| Endotelina tipo R | Angiogénesis | \downarrow |
| MMP-8 | Proteasa | \downarrow\downarrow\downarrow |
| TNF-\alpha | Superfamilia TNF | \downarrow |
| TRAIL-R1 | Superfamilia TNF | \downarrow\downarrow\downarrow |
| OX-40L | Superfamilia TNF | \uparrow |
| IL-18 | Citoquina | \downarrow\downarrow\downarrow |
| Efrina \beta4 | Receptor de efrina | \downarrow\downarrow\downarrow |
| CD-6 | Superficie celular | \uparrow |
| \alpha-tubulina | Mantenimiento | \leftrightarrow |
El sulfato de dextrano de peso molecular 500.000
se obtuvo de Pharmacia (nº de catálogo
17-0340-01). La condroitina ABC
liasa se obtuvo de Seikagaku Corporation (nº de catálogo 100330).
La heparitinasa se obtuvo de Seikagaku Corporation (nº de catálogo
100703). La colagenasa tipo IV se obtuvo de Sigma (nº de catálogo C
1889). Todos los reactivos para el cultivo de tejidos (Gibco) y las
placas (Nunc) se obtuvieron de Canadian Life Technologies
(Burlington, Ontario, Canada).
Los recombinantes NV1020, HSV-1,
G207 (NeuroVir Inc.) y HSV-2, L1BR1 [Asano et
al., J. Gen. Virol. 80(1):51-58 (1999);
Nishiyama et al., Virology
190(1):256-268 (1992)] se prepararon en
células Vero. El vector recombinante HSV, NV1020, un vector
competente para la replicación contiene solamente una copia de
\gamma34,5 y se han eliminado las repeticiones terminales de modo
que impide la reorganización de segmentos genómicos. El G207
contiene un gen de \beta-galactosidasa insertado,
en marco de lectura, en el gen de la ribonucleótido reductasa. Como
tal, este virus recombinante es incapaz de replicarse en células
que no se dividen (p. ej. células musculares). El L1BR1 contiene el
gen de la \beta-galactosidasa insertado en el gen
de la proteína quinasa US3. El virus se concentró mediante
centrifugación a través de un cojín de sucrosa del 30%, se
suspendió en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y se
filtró a través de un filtro de 0,45 \mum (Sartorius), utilizando
métodos estándar. El título final de virus infeccioso utilizado en
todos los experimentos fue de 1 x 10^{8} pfu/ml.
Los ratones Balb/c se criaron en los animalarios
institucionales de la University of British Columbia. Se
designaron dos grupos de edad como "recién nacidos" y
"adultos". Los ratones "recién nacidos" tuvieron entre 7 y
10 días de edad. Los ratones "adultos" tuvieron entre 6 y 12
semanas de edad.
Se prepararon miofibras aisladas únicas a partir
del músculo extensor digitorum longus (EDL). Las miofibras
se disociaron mediante disgregación enzimática en 0,2% colagenasa
tipo 1 (Sigma), seguido de una trituración suave. Las miofibras
aisladas se sembraron en múltiples placas de 24 pocillos
recubiertas de 1 mg/ml de Matrigel (Collaborative Biomedical
Products). A los pocillos se añadió medio de cultivo que consistió
en 10% suero equino y 10% FBS en DMEM. A continuación se incubaron
las placas durante 18 horas a 37ºC, momento en el que las miofibras
viables se infectaron con G207.
Las miofibras se infectaron añadiendo G207
(10^{6} pfu) en medio de cultivo (10% FBS en DMEM) directamente a
los pocillos. La duración de la incubación fue de durante la noche
(aproximadamente 18 horas), aunque una infección durante una hora
en DMEM fue suficiente para producir una infección reproducible.
Transcurrida la incubación, las miofibras se fijaron durante 15
minutos en 1,25% glutaraldehido y se tiñeron con sustrato para 2%
X-gal (1 mM MgCl_{2}, 5 mM
K_{4}Fe(CN)_{6}/K_{3}Fe(CN)_{6}
en PBS) (Canadian Life Technologies) durante 4 horas a 37ºC.
Se sembraron miofibras aisladas en portaobjetos
de vidrio y se infectaron con G207 tal como se describió
anteriormente. A continuación se fijaron en 1,25% glutaraldehido en
PBS durante 15 minutos, se lavaron dos veces con PBS, seguido de
una incubación de 15 minutos en disolución bloqueante [PBS con 1%
albúmina de suero bovino (Boehringer Mannheim)]. A continuación del
bloqueo, las miofibras se permeabilizaron con 0,1% Triton
X-100/PBS durante 5 minutos y se incubaron con un
anticuerpo de ratón anti-ICP4 a una dilución de
1:2000 durante 1 hora. Las miofibras se lavaron con tres cambios de
PBS, a continuación se incubaron con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de ratón conjugado a
Texas-Red (Jackson Immunochemicals) diluido 1:200
en PBS-1% BSA durante 30 minutos. A continuación
las miofibras se lavaron con PBS y se montaron en portaobjetos de
vidrio. La tinción inmunofluorescente se observó utilizando un
microscopio confocal de epifluorescencia BioRad MRC 600. Las
imágenes confocales se reprodujeron utilizando la versión 1.60 de
NIH Image y se coloraron utilizando Adobe Photoshop Versión 4.0
(Adobe System Inc.). Se realizaron experimentos control estándar,
que incluyen la incubación con el anticuerpo secundario solamente y
con células infectadas simuladamente. Todas las fijaciones e
incubaciones con anticuerpo se realizaron a RT.
Los ensayos de estimulación con sulfato de
dextrano, colagenasa tipo IV, condroitina ABC liasa y heparitinasa
se realizaron en miofibras adultas sembradas en placas de 24
pocillos. Las miofibras se pretrataron con múltiples
concentraciones de sulfato de dextrano, colagenasa tipo IV,
condroitina ABC liasa o heparitinasa en DMEN durante 30 minutos
antes de la infección. A continuación de un período de absorción
durante la noche (aproximadamente 18 horas) a 37ºC, se extrajo el
inóculo. Las miofibras se fijaron durante 15 minutos en 1,25%
glutaraldehído y se tiñeron con sustrato para X-gal
al 2% durante 4 horas a 37ºC. Para todos los estudios in
vitro, se ensayó un mínimo de 40 miofibras por grupo de
tratamiento, a menos que de otro modo se especifique. La fusión
inducida por PEG se realizó según los métodos descritos
anteriormente [Meyer et al., J. Gen. Virol.
79(8):1983-1987 (1998)].
El marcaje bioquímico de glicosaminoglicanos se
realizó mediante una modificación de un proceso descrito
anteriormente [Bame et al., J. Biol. Chem.
264:8059-8065 (1989)]. En breve, los
glicosaminoglicanos se marcaron radioactivamente mediante
incubación de las células durante 24 horas con [^{35}S] sulfato
(libre de vehículo, aproximadamente 43 Ci/mg, ICN) por ml en
DMEM/10% FBS/10% suero equino modificado par que contenga 10 \muM
de sulfato. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y se
disolvieron con 1 ml de 0,1 N NaOH a RT durante 15 minutos. Se
extrajeron las muestras para la determinación de proteína. Los
extractos se ajustaron a un pH de 5,5 mediante la adición de ácido
acético concentrado y se trataron con proteasa (Sigma; 2 mg/ml) en
0,32 M NaCl 40 mM acetato sódico, pH 5,5, que contuvo sulfato de
condroitina de cartílago de tiburón (2 mg/ml) como vehículo, a 40ºC
durante 12 horas. En algunos experimentos, partes del material
radioactivo se trataron durante 12 horas a 40ºC con 10 mU de
condroitina ABC liasa (Sigma) o con 0,5 U de heparitinasa (Sigma).
Los productos radioactivos se cuantificaron mediante cromatografía
en DEAE-Sephacel (Pharmacia) mediante enlace en 50
mM NaCl seguido de elución con 1 M NaCl. Para el análisis por
cromatografía líquida a presión elevada (HPLC), las muestras de
glicosaminoglicanos se desalaron mediante precipitación con etanol.
A continuación de una centrifugación, los precipitados de etanol se
suspendieron en 20 mM Tris (pH 7,4) y se fraccionaron mediante HPLC
de intercambio aniónico, utilizando una columna TSK
DEAE-35W (15 por 75 mm; Beckman Instruments). Los
proteoglicanos se eluyeron de la columna mediante la utilización de
un gradiente lineal de NaCl de 50 a 700 mM formado en 10 mM
KH_{2}PO_{4} (pH 6,0). Todos los tampones contuvieron 0,2% de
Zwittergent 3- 12 (Calbiochem). Los glicosaminoglicanos en los picos
se identificaron mediante la digestión de las muestras con los
enzimas relevantes antes de la cromatografía.
Se anestesiaron los ratones utilizando ketamina
(70 mg/kg) y Xylacina (10 mg/kg). Se inyectaron células
CT-26 (5 x 10^{4} células resuspendidas en 100
\mul PBS) subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón,
utilizando una aguja de 26-gauge. Las células
formaron un tumor al que se permitió crecer hasta un tamaño de
aproximadamente entre 100 y 150 mm^{3}. A continuación se
iniciaron las inyecciones para las terapias deseadas. Generalmente
los volúmenes de los tumores se midieron bisemanalmente. Los
animales se sacrificaron una vez que los volúmenes de los tumores
alcanzaron 1.500 mm^{3}.
El modelo de cáncer metastático ha sido descrito
por Lafreniere y Rosemberg [J. Natl.Cancer Inst.
76(2):309-22 (1986)].
Ratones recién nacidos y adultos bajo anestesia
(Ketamina/Rhompun Intraperitonealmente) fueron inyectados
percutáneamente en el músculo tibialis anterior (TA) a una
profundidad aproximada de 2,0 mm utilizando una jeringa Hamilton.
Para los ensayos in vivo que implican la inyección conjunta
de disoluciones para el tratamiento y un inóculo viral, sulfato de
dextrano, colagenasa tipo IV o condroitina ABC liasa se diluyeron
hasta la concentración adecuada (tal como se identifica en los
estudios in vitro) con G207 en un volumen de inyección de 50
\mul (para ratones adultos) o 25 \mul (para ratones recién
nacidos). Los músculos control se inyectaron con G207 solamente.
Para valorar la infección de las miofibras, se extrajeron 3 días
postinyección para su sección y análisis histológico. Para
cualquiera de los métodos, un mínimo de 4 animales recibió
tratamientos idénticos y comprendieron un grupo experimental.
La administración por la vena de la cola de la
terapia deseada se realizó utilizando técnicas conocidas comúnmente
en la materia.
Los músculos inyectados y control o el tejido
tumoral se congelaron rápidamente. El músculo o el tejido tumoral
se seccionó, produciendo secciones transversales seriadas a través
de tejido. Las secciones transversales (10 \mum) se cortaron en
un criostato y se tiñeron con X-gal y/o hematoxilina
y eosina. Las secciones se retuvieron a intervalos regulares
(aproximadamente cada 120 \mum). Para la histología, las
criosecciones se recogieron sobre portaobjetos de vidrio
recubiertos de gelatina.
La detección histológica de las células que
expresan \beta-galactosidasa en las
criocondiciones se realizó utilizando X-gal. Dicho
compuesto produce un producto de reacción azul en las células que
expresan un nivel elevado de \beta-galactosidasa.
Las secciones primero se fijaron por inmersión de los portaobjetos
en 4% paraformaldehido en 100 mM NaP, pH 7,2, durante 5 minutos.
Los portaobjetos se lavaron tres veces durante 5 minutos en PBS. A
continuación las secciones se tiñeron con X-gal
(Sigma) a una concentración de 1 mg/ml en 5 mM
K_{3}Fe(CN)_{6}, 5 mM
K_{4}Fe(CN)_{6}, 2 mM MgCl_{2} en PBS durante
12 horas. Los portaobjetos se montaron utilizando un medio acuoso de
montaje (Promount) y se examinaron al microscopio para detectar la
presencia de miofibras marcadas con
\beta-galactosidasa ("azules"). El número
total de fibras que expresan lac-z en un músculo se
determinó a partir de la sección con el máximo número de fibras
azules y esto fue invariablemente en el lugar de implantación.
Por el contrario, las células infectadas con HSV
se detectaron utilizando procedimientos inmunohistoquímicos
estándar y un anticuerpo que reconoce el antígeno HSV.
El suero de la sangre obtenida de los animales
infectados con NV1020 se aplicó a células en cultivo. La duración
del tiempo durante el cual el virus fue capaz de infectar las
células se determinó tal como se describió anteriormente.
Claims (20)
1. Utilización de un vector de ácido nucleico
para la preparación de una composición farmacéutica destinada a
introducir un vector de ácido nucleico en una célula viva, en la
que dicho vector es un vector viral de la familia
Herpesviridae, y dicho vector se introduce en dicha célula
mediante un método que comprende poner en contacto dicha célula con
dicho vector y, antes, durante o después de poner en contacto dicha
célula con dicho vector, poner en contacto dicha célula con un
medio líquido que comprende un compuesto que, en dicho medio, está
cargado, no es citotóxico y es capaz de facilitar la adquisición
del vector por la célula, en la que dicha célula se encuentra en un
mamífero.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho mamífero es un paciente humano.
3. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho vector comprende un gen que codifica un polipéptido, una
hormona, un antígeno de vacuna, una molécula antisentido o una
ribozima.
4. Utilización según la reivindicación 3, en la
que dicho polipéptido está seleccionado de entre el grupo
constituido por factores de crecimiento, enzimas, polipéptidos
antiangiogénicos y polipéptidos que promueven la muerte celular.
5. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho vector se selecciona de entre el grupo constituido por
HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV,
HHV-6, HHV-7 y
HHV-8.
6. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho vector está atenuado.
7. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicha molécula cargada esta seleccionada de entre el grupo
constituido por polisacáridos cargados, polilisina, aciclodextrina,
dietilaminoetano y polietilenglicol.
8. Utilización según la reivindicación 7, en la
que dicho polisacárido cargado es un glicosaminoglicano.
9. Utilización según la reivindicación 7, en la
que dicho polisacárido cargado es un análogo de
glicosaminoglicano.
10. Utilización según la reivindicación 8, en la
que dicho glicosaminoglicano está seleccionado de entre el grupo
constituido por sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato
de condroitina y sulfato de queratina.
11. Utilización según la reivindicación 9, en la
que dicho análogo de glicosaminoglicano es sulfato de dextrano.
12. Utilización según la reivindicación 1, en
la que dicha molécula cargada se administra a dicha célula antes de
la administración de dicho vector a dicha célula.
13. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicha molécula cargada se administra a dicha célula
concurrentemente con la administración de dicho vector a dicha
célula.
14. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicha célula es una célula de músculo maduro.
15. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicha célula es una célula cancerosa.
16. Utilización según la reivindicación 15, en la
que dicho paciente tiene cáncer.
17. Utilización según la reivindicación 14, en la
que dicha célula muscular se encuentra en un paciente con una
miopatía primaria.
18. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicho paciente tiene una enfermedad que se puede tratar
mediante la producción de un producto terapéutico para la secreción
en la circulación de dicho sujeto.
19. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dichos vector y molécula cargada se administran localmente.
20. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dichos vector y molécula cargada se administran
sistémicamente.
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