ES2256265T3 - Vectores de parvovirus duplicados. - Google Patents

Vectores de parvovirus duplicados.

Info

Publication number
ES2256265T3
ES2256265T3 ES01948252T ES01948252T ES2256265T3 ES 2256265 T3 ES2256265 T3 ES 2256265T3 ES 01948252 T ES01948252 T ES 01948252T ES 01948252 T ES01948252 T ES 01948252T ES 2256265 T3 ES2256265 T3 ES 2256265T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
parvovirus
sequence
terminal
nucleic acid
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01948252T
Other languages
English (en)
Inventor
Richard Jude Samulski
Douglas M. Mccarty
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of North Carolina at Chapel Hill
Original Assignee
University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of North Carolina at Chapel Hill filed Critical University of North Carolina at Chapel Hill
Application granted granted Critical
Publication of ES2256265T3 publication Critical patent/ES2256265T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
  • Surface Acoustic Wave Elements And Circuit Networks Thereof (AREA)
  • Control Of Combustion (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Una partícula de parvovirus duplicado que comprende: una cápside de parvovirus un genoma de vector que comprende en la dirección 5¿ a 3¿: (i) una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 5¿; (ii) una primera secuencia de nucleótidos heterólogos; (iii) una secuencia de repetición terminal de parvovirus no resolubles; (iv) una secuencia de nucleótidos heterólogos separada que es en esencia completamente complementaria a dicha primera secuencia de nucleótidos heterólogos; y (v) una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 3¿; en la que dicho genoma de vector es capaz en condiciones apropiadas de apareamiento de bases intracadena entre las secuencias de nucleótidos heterólogos después de liberación desde la cápside de parvovirus.

Description

Vectores de parvovirus duplicados.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a reactivos para suministro de genes. Más en particular, la presente invención se refiere a vectores mejorados de suministro de genes basados en parvovirus.
Antecedentes de la invención
El virus adenoasociado (VAA) es un miembro dependiente auxiliar no patógeno de la familia de los parvovirus. Una de las características que identifican a este grupo es la encapsidación de un genoma de ADN monocatenario (ADNmc). En el caso de VAA, las cadenas separadas de polaridad positiva o negativa se empaquetan con igual frecuencia, y las dos son infecciosas. En cada extremo del genoma de ADNmc, una estructura de repetición terminal (RT) palindrómica se aparea por bases consigo misma en una configuración de horquilla. Esto sirve como cebador para polimerasa de ADN celular para sintetizar la cadena complementaria después de descubrirse en la célula hospedadora. Los virus adenoasociados requieren en general un virus auxiliar para una infección productiva. Aunque los adenovirus (Ad) sirven normalmente para este propósito, el tratamiento de células infectadas por VAA con irradiación UV o hidroxiurea (HU) permitirá también una replicación limitada.
Los vectores de suministro de VAA recombinante (VAAr) también empaquetan ADNmc de polaridad positiva o negativa, y deben basarse en factores de replicación celular para la síntesis de la cadena complementaria. Si bien inicialmente se esperaba que esta etapa se produjera espontáneamente, por vías de reparación o replicación de ADN celular, no parece que suceda así. Los primeros trabajos con vectores de VAAr revelaron que la capacidad de valorar la expresión de genes marcadores se potenciaba espectacularmente cuando se coinfectaban células con adenovirus, o se pretrataban temporalmente con agentes genotóxicos. Esta potenciación se correlacionaba con la formación de ADN dúplex a partir del ADN virión monocatenario (ADNv). Se ha observado una inducción similar de vectores de VAAr in vivo después de tratamiento con Ad, radiación ionizante o inhibidores de topoisomerasa. Sin embargo, el efecto era altamente variable entre tejidos y tipos de células diferentes. Más recientemente se ha sugerido que la rehibridación de ADNv complementario a partir de partículas de VAAr infectantes separadas puede ser una vía importante para la transducción de VAAr.
El requisito de síntesis de cadena complementaria, o recuperación, se considera hoy un factor limitante en la eficacia de los vectores de VAAr. La velocidad de transducción para VAAr en hígado de ratón se ha estimado en el 5% aproximadamente de hepatocitos después de infusión en la vena porta de 4,2 x 10^{10} partículas. Experimentos posteriores revelaron que el ADNv de VAAr había sido asimilado en los núcleos de prácticamente todos los hepatocitos hepáticos, y que el potencial de transducción de estos genomas podía recuperarse mediante coinfección con adenovirus. Esto es coherente con un informe anterior de hasta el 25% de hepatocitos de ratón transducidos por 10^{10} partículas de VAAr en presencia de un adenovirus infectante. La expresióna partir de VAAr en tejido hepático coincide con la formación de ADN dúplex y el ADNv parece perderse si no se convierte en dúplex en un plazo de 5 a 13 semanas. Experimentos adicionales sugieren que una subpoblación de hepatocitos de ratón es permisiva temporalmente para transducción de VAAr in vivo.
El documento WO 0.111.034 desvela una partícula de parvovirus duplicado. Fisher y col., Journal of Virology, enero de 1996, pág. 520-532, desvelan que la etapa de limitación de velocidad durante la transducción de células con VAAr es la conversión del genoma viral en una plantilla bicatenaria transcripcionalmente activa.
En consecuencia, la presente invención se refiere a la necesidad en la técnica de vectores mejorados de suministro de genes de parvovirus. En particular, la presente invención se refiere al requisito de síntesis de cadena complementaria mediante vectores de suministro de genes VAA convencionales.
Resumen de la invención
La naturaleza monocatenaria del genoma del VAA puede tener un impacto en la expresión de vectores de VAAr por encima de cualquier otra característica biológica. En vez de basarse en mecanismos celulares potencialmente variables para proporcionar una cadena complementaria para vectores de VAAr, se ha encontrado ahora que este problema puede sortearse mediante el empaquetamiento de ambas cadenas como una sola molécula de ADN. En los estudios descritos en la presente memoria descriptiva, se observó una eficiencia incrementada de transducción a partir de vectores duplicados con respecto a VAAr convencional en células HeLa (de 5 a 140 veces). Más importante es que, a diferencia de los vectores de VAA monocatenarios, los inhibidores de replicación de ADN no influyen en la transducción desde los vectores duplicados de la invención. Además, los vectores duplicados de parvovirus de la invención demostraron una aparición más rápida y un nivel superior de expresión transgénica que los vectores de VAAr en hepatocitos de ratón in vivo. Todos estos atributos biológicos apoyan la generación y caracterización de una nueva clase de vectores de parvovirus (que suministran ADN dúplex) que contribuye significativamente al desarrollo en curso de los sistemas de suministro de genes basados en parvovirus.
En conjunto, por las investigaciones descritas en la presente memoria descriptiva se ha construido y caracterizado un nuevo tipo de vector de parvovirus que transporta un genoma duplicado, lo que tiene como resultado el empaquetamiento conjunto de cadenas de polaridad positiva y negativa trabadas juntas en una sola molécula. En consecuencia, la presente invención proporciona una partícula de parvovirus que comprende una cápside de parvovirus (por ejemplo, una cápside de VAA) y un genoma de vector que codifica una secuencia de nucleótidos heterólogos, en la que el genoma de vector es autocomplementario, es decir, el genoma de vector es una repetición dimérica invertida. El genoma de vector tiene preferentemente aproximadamente el tamaño del genoma de parvovirus silvestre (por ejemplo, el genoma del VAA) correspondiente a la cápside de parvovirus en que se empaquetará y comprende una señal de empaquetamiento apropiada. La presente invención proporciona el genoma de vector descrito anteriormente y plantillas que codifican el mismo.
Como un aspecto más, la presente invención proporciona una partícula de parvovirus duplicado que comprende: una cápside de parvovirus y un genoma de vector que comprende en la dirección 5' a 3': (i) una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 5'; (ii) una primera secuencia de nucleótidos heterólogos; (iii) una secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble; (iv) una secuencia de nucleótidos heterólogos separada que es en esencia completamente complementaria con la primera secuencia de nucleótidos heterólogos; y (v) una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 3'; en la que el genoma de vector es capaz, en condiciones apropiadas de apareamiento, de bases intracadena entre las secuencias de nucleótidos heterólogos a partir de esta cápside de parvovirus. Se forma una secuencia bicatenaria por el apareamiento de bases entre las secuencias de nucleótidos heterólogos complementarias, que es un sustrato adecuado para la expresión génica (es decir, la transcripción y, opcionalmente, la traducción) o un sustrato para recombinación de hospedador (es decir, una plantilla de ADNbc) en una célula hospedadora sin la necesidad de una maquinaria de células hospedadoras para convertir el genoma de vector en una forma bicatenaria.
Las designaciones de 5' y 3' con respecto al genoma de vector (o plantillas para producir el mismo, véase más adelante) no indican ninguna dirección particular de transcripción desde la secuencia bicatenaria formada entre las dos secuencias heterólogas complementarias. La "cadena de codificación" puede estar en la mitad 5' o 3' del ADN virión. Los expertos en la materia comprenderán que el término "cadena de codificación" se está usando en su sentido más amplio para indicar la cadena que codifica el transcrito deseado, y abarca también secuencias no traducidas, incluyendo secuencias antisentido. Así, la transcripción puede iniciarse a partir del extremo 5' de la primera secuencia de nucleótidos heterólogos en la mitad 5' del genoma de vector, o a partir del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos heterólogos complementaria en la mitad 3' del genoma de vector.
Dicho de forma alternativa, en el ADNv bicatenario formado por apareamiento de bases intracadena, la transcripción puede iniciarse a partir del extremo abierto o a partir del extremo cerrado (es decir, del extremo más próximo a la RT no resoluble) de la estructura de horquilla.
Según esta forma de realización, la cápside de parvovirus es preferentemente una cápside de VAA. Se prefiere además que las secuencias de repetición terminal de parvovirus y/o secuencias de repetición terminal no resolubles sean secuencias de VAA.
En formas de realización particulares, la partícula de parvovirus duplicado comprende secuencias de control de expresión suficientes (por ejemplo, un promotor) para expresión de la secuencia bicatenaria formada por apareamiento de bases intracadena en el ADNv autocomplementario.
El genoma de vector puede expresar además dos o más transcritos a partir de la secuencia bicatenaria formada por apareamiento de bases intracadena.
Como un aspecto más, la presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que comprende una plantilla para producir un ADN virión, comprendiendo la plantilla una secuencia de nucleótidos heterólogos flanqueada por una secuencia de repetición terminal de parvovirus y una secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble.
Como un aspecto adicional más, la presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que comprende una plantilla dimérica para producir un ADN virión, comprendiendo la plantilla en la dirección 5' a 3': una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 5'; una primera secuencia de nucleótidos heterólogos; una secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble; una secuencia de nucleótidos heterólogos separada que es en esencia completamente complementaria a la primera secuencia de nucleótidos heterólogos; y una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 3'; en la que el ADN virión es capaz en condiciones apropiadas de apareamiento de bases intracadena de formar un ADNbc entre las secuencias de nucleótidos heterólogos después de liberación de la cápside de parvovirus.
Preferentemente, las secuencias de repetición terminal de parvovirus y/o las secuencias de repetición terminal no resolubles de parvovirus son secuencias de VAA.
La presente invención proporciona además procedimientos para producir los vectores de parvovirus duplicados de la invención.
Como un aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro para suministrar una secuencia de nucleótidos a una célula, que comprende: puesta en contacto de una célula con una partícula de parvovirus duplicado que comprende: una cápside de parvovirus y un genoma de vector que comprende: (i) secuencia de repetición terminal de parvovirus en 5'; (ii) una primera secuencia de nucleótidos heterólogos; (iii) una secuencia de repetición terminal de parvovirus en posición central; (iv) una secuencia de nucleótidos heterólogos separada que es en esencia completamente complementaria a la primera secuencia de nucleótidos heterólogos; (v) una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 3'; en la que el genoma de vector duplicado es capaz en condiciones apropiadas de apareamiento de bases intracadena entre las secuencias de nucleótidos heterólogos después de liberación desde la cápside de parvovirus.
Según esta forma de realización, la cápside de parvovirus es preferentemente una cápside de VAA, y el genoma de vector tiene aproximadamente el tamaño del genoma de VAA silvestre. Se prefiere además que las secuencias de repetición terminal de parvovirus sean secuencias de VAA. La célula puede ponerse en contacto con la partícula de parvovirus duplicada in vitro.
Estos y otros aspectos de la presente invención se describen en mayor detalle en la descripción de la invención que se expone a continuación.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Contenido en ADN virión de vectores duplicados y VAAr. El dibujo ilustra el contenido en ADN de los vectores usados en este estudio y la conformación predicha que adoptan en la liberación desde los viriones. Los transgenes expresados a partir del promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) son: proteína fluorescente verde (GFP), \beta-galactosidasa (LacZ), eritropoyetina de ratón (mEpo). La neomicin-fosfotransferasa (neo) se expresa a partir del promotor temprano SV40 (SV40). Se indica el tamaño en nucleótidos (nt) de cada molécula de ADN empaquetada. El dímero GFP autocomplementario o duplicado (VAAac) y los vectores de mEpo se pliegan en un dúplex de ADN completo con una copia adicional de la repetición terminal, mientras que los vectores de GFPneo, LacZ y mEpo\lambda requieren síntesis de ADN mediada por células de la cadena complementaria.
Figura 2. Fraccionamiento de vectores en gradientes de CsCl. Se extrajo ADN virión (ADNv) de vectores de VAAr de CMV-GFP fraccionado de gradiente de CsCl (Panel a), GFPneo (Panel b) y LacZ (Panel c). Se sometieron geles de agarosa alcalina del ADNv a transferencia Southern y se hibridó con un fragmento de ADN de CMV-GFP. Los marcadores del extremo izquierdo del panel a fueron las secuencias de vectores suprimidos de los plásmidos usados para generar los vectores virales (véanse los resultados). El número de copias de vectores de ADNmc de longitud unitaria por molécula se indica mediante 1x, 2x y 4x. Los vectores virales usados en los experimentos representados en las Fig. 3 y 4 fueron de las fracciones a-11 o a-10 para CMV-GFP (según se indica en las leyendas de las figuras), la fracción b-13 para GFPneo y la fracción c-12 para LacZ.
Figura 3. Eficiencia de transducción de vectores de VAAr duplicados frente a los convencionales en ausencia y presencia de adenovirus coinfectantes. Se compararon las eficiencias de los tres vectores fraccionados de CsCl (Fig. 1) en células HeLa que se dividen rápidamente infectadas con fracción 11 de VAAac-GFP (0,5 partículas por célula), fracción 13 de VAAr-GFPneo (2 partículas por célula) o fracción 12 VAAr-LacZ (0,5 partículas por célula). Se cuantificó la transducción a las 24 horas después de infección mediante recuento de células GFP positivas usando microscopia de fluorescencia, o por fijación de las células y tinción X-Gal. Se representó gráficamente la eficiencia de transducción con respecto al número de partículas físicas por unidad de transducción, según se determina por el número de células de valoración positiva para expresión de GFP o LacZ. Las barras de color gris oscuro indican la eficiencia de transducción en presencia de coinfección Ad a 5 ufp por célula.
Figura 4. Transducción con vectores duplicados y convencionales de VAAr en presencia de inhibidor de síntesis de ADN. (Panel a). Se trataron cultivos de células HeLa a confluencia del 30% con las concentraciones indicadas de hidroxiurea 24 h antes de infectarlos con 3,8 x 10^{6} partículas del VAAac-GFP, \blacklozenge, (Fig. 2a, fracción 10), el monómero homólogo, \medbullet (Fig. 2, Panel a, fracción 14) o VAAr-GFPneo, \blacktriangle (Fig. 2, panel b, fracción 13). Se mantuvo el tratamiento HU hasta que se sometió a ensayo la transducción 24 h después de infección. Cada punto de datos se calculó a partir de la media del número de células GFP positivas en 10 campos aleatorios independientemente del número total de células, que fue variable debido al efecto de la hidroxiurea en la división celular. (Panel b). Se usó el mismo procedimiento para evaluar la transducción en presencia de las concentraciones de afidicolina indicadas. Sólo se comparó el monómero duplicado y homólogo (fracciones 10 y 14).
Figura 5. Transducción in vivo de tejido hepático de ratón con vectores duplicados o monocatenarios de VAAr. Se infundieron ratones Balb-c ByJ de diez semanas de vida con 2 x 10^{10} partículas de VAAac-CMV-mEpo, \blacklozenge, (n = 4), o VAAr-CMV-mEpo\lambda monocatenario de longitud completa, \blacktriangle, (n = 5), en 200 \mul de solución salina normal por inyección en la vena porta. Se infundió un grupo de ratones de control con solución salina normal, \square, (n = 4), y se flebotomizó un solo ratón, o, en los mismos intervalos de 7 días sin cirugía previa. Se usó el hematocrito sanguíneo como medida funcional de expresión de mEpo.
La Figura 6 es una representación de una plantilla preferida para producir los vectores duplicados de parvovirus de la invención.
La Figura 7 muestra un gradiente de densidad de CsCl del vector mutante Hpa-srt de VAAr-CMV-GFP.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá a continuación con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestran formas de realización preferidas de la invención.
Salvo que se defina de otra manera, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que se entiende habitualmente entre los expertos en la materia a la que pertenece esta invención. La terminología usada en la descripción de la invención en la presente memoria descriptiva tiene como finalidad sólo describir formas de realización particulares y no pretende ser limitativa de la invención. Según se usa en la descripción de la invención y las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" pretenden incluir asimismo las formas en plural, salvo cuando el contexto indica claramente lo contrario.
Las secuencias de nucleótidos se presentan en la presente memoria descriptiva mediante una sola cadena, en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha, salvo que se indique específicamente lo contrario. Los nucleótidos y aminoácidos se representan en la presente memoria descriptiva de la manera recomendada por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB, o (para aminoácidos) mediante el código de una letra, o el código de tres letras, ambos de acuerdo con la disposición 37 CFR \NAK1.822 y el uso establecido. Véase, por ejemplo, Patentin User Manual, 99-102 (Nov. 1990) (Oficina de Patentes y Marcas de los EE.UU.)
Salvo cuando se indique lo contrario, pueden usarse los procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia para la construcción de constructos de VAAr y parvovirus recombinantes, vectores de empaquetamiento que expresan las secuencias rep y/o cap de parvovirus, así como células de empaquetamiento transfectadas de forma transitoria y estable. Dichas técnicas son conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); F. M. Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. y, John Wiley& Sons, Inc., Nueva York).
Los parvovirus son virus animales de ADN relativamente pequeños y contienen un genoma de ADN lineal monocatenario. El término "parvovirus" según se usa en la presente memoria descriptiva abarca la familia Parvoviridae, incluyendo parvovirus y dependovirus de replicación autónoma. Los parvovirus autónomos incluyen miembros de los géneros Parvovirus, Erythrovirus, Densovirus, Iteravirus y Contravirus. Los parvovirus autónomos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, virus diminuto de ratón, parvovirus bovino, parvovirus canino, parvovirus del pollo, virus de panleucopenia felina, parvovirus felino, parvovirus del ganso y virus B19. Otros parvovirus autónomos son conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Bernard N. Fields y col., Virology, volumen 2, capítulo 69 (3ª ed., Lippincott-Raven Publishers).
El género Dependovirus contiene los virus adenoasociados (VAA), incluyendo pero sin limitarse a, VAA tipo 1, VAA tipo 2, VAA tipo 3, VAA tipo 4, VAA tipo 5, VAA tipo 6, VAA aviar, VAA bovino, VAA canino, VAA equino y VAA ovino. Véase, por ejemplo, Bernard N. Fields y col., Virology, volumen 2, capítulo 69 (3ª ed., Lippincott-Raven Publishers).
Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "vector" o "vector de suministro de genes" puede referirse a una partícula de parvovirus (por ejemplo, VAA) que actúa como vehículo de suministro de genes, y que comprende ADNv (es decir, el genoma de vector) empaquetado en una cápside de parvovirus (por ejemplo, VAA). Alternativamente, en algunos contextos, el término "vector" puede usarse para referirse al genoma de vector/ADNv.
Una "secuencia de nucleótidos heterólogos" será normalmente una secuencia que no ocurre naturalmente en el virus. Alternativamente, una secuencia de nucleótidos heterólogos puede referirse a una secuencia viral que está situada en un entorno de ocurrencia no natural (por ejemplo, por asociación con un promotor con el que no se asocia naturalmente en el virus).
Según se usa en la presente memoria descriptiva, un "genoma de vector de parvovirus recombinante" es un genoma de parvovirus (es decir, ADNv) en el que se ha insertado una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un transgén) heterólogos (por ejemplo, extraños). Una "partícula de parvovirus recombinante" comprende un genoma de parvovirus recombinantedel vector empaquetado en la cápside de parvovirus.
Análogamente, un "genoma de vector de VAAr" es un genoma de VAA (es decir, ADNv) que comprende una secuencia de nucleótidos heterólogos. Los vectores de VAAr requieren sólo las 145 repeticiones terminales de bases en cis para generar virus. Todas las demás secuencias virales son prescindibles y pueden suministrarse en trans (Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97). Normalmente, el genoma de vector de VAAr sólo contendrá estas secuencias de repetición terminal (RT) mínimas, con lo que se eleva al máximo el tamaño del transgén que puede ser empaquetado eficazmente por el vector. Una "partícula de VAAr" comprende un genoma de vector de VAAr empaquetado en una cápside de VAA.
Las partículas de parvovirus de la invención pueden ser una partícula "híbrida" en la que las secuencias RT y la cápside viral son parvovirus diferentes. Preferentemente, las secuencias RT y cápsides virales son de serotipos diferentes de VAA (por ejemplo, según se describe en la publicación de patente internacional WO 00/28.004, Solicitud Provisional de EE.UU. nº 60/248.920; y en Chao y col., (2000) Molecular Therapy 2:619. Análogamente, el parvovirus puede tener una cápside "quimérica" (por ejemplo, que contiene secuencias de diferentes parvovirus, preferentemente diferentes serotipos de VAA) o una cápside "diana" (por ejemplo, un tropismo dirigido) según se describe en la publicación de patente internacional WO 00/28.004.
Preferentemente, la partícula de parvovirus duplicado de la invención tiene una cápside de VAA, que puede promoverse por una cápside quimérica o diana, según se describe anteriormente.
Las partículas de parvovirus "duplicado" y los genomas de vectores de la invención pueden referirse indistintamente en la presente memoria descriptiva como vectores "diméricos" o "autocomplementarios". Las partículas de parvovirus duplicado de la invención comprenden una cápside de parvovirus que contiene un ADN virión (ADNv). El ADNv es autocomplementario, de manera que puede formar una estructura en horquilla después de la liberación de la cápside viral. El ADNv duplicado aparece para proporcionar a la célula hospedadora un ADN bicatenario que puede expresarse (es decir, transcribirse y, opcionalmente, traducirse) por la célula hospedadora sin necesidad de una síntesis en la segunda cadena, según se requiere con vectores de parvovirus convencionales.
El genoma de vectores de parvovirus duplicado contiene preferentemente secuencias de empaquetamiento suficientes para encapsidación en la cápside de parvovirus seleccionada (por ejemplo, cápside de VAA).
Los expertos en la materia observarán que el ADNv duplicado puede no existir en forma bicatenaria en todas las condiciones, pero tiene la capacidad de hacerlo en condiciones que favorecen la hibridación de bases de nucleótidos complementarias. En consecuencia, el término "vector de parvovirus duplicado" no indica que el ADNv
esté necesariamente en forma duplicada o bicatenaria (por ejemplo, existe un apareamiento de bases entre las
cadenas autocomplementarias) dentro de la cápside de parvovirus. De hecho, un experto en la materia comprenderá que el ADNv probablemente no está en forma bicatenaria mientras se empaqueta en la cápside de parvo-
virus.
La expresión de una secuencia de nucleótidos heterólogos (según se describe a continuación) está preferentemente "potenciada" con respecto a los vectores de parvovirus duplicados de la invención en comparación con los vectores de parvovirus comparables (por ejemplo, VAAr). Preferentemente, la expresión génica puede detectarse a partir de parvovirus duplicado de forma sustancialmente más rápida que para el vector de parvovirus monomérico comparable. Por ejemplo, la expresión génica puede detectarse en menos de 2 semanas aproximadamente, preferentemente menos de una semana aproximadamente, más preferentemente menos de 72 horas aproximadamente, más preferentemente aún menos de 48 horas aproximadamente, y todavía más preferentemente menos de 24 horas aproximadamente después de la administración del vector de parvovirus duplicado. La expresión génica puede detectarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, por detección de transcripción, traducción, o actividad biológica o un efecto fenotípico resultante de la expresión de una secuencia de nucleótidos heterólogos (por ejemplo, tiempo de coagulación sanguínea).
Alternativamente, la expresión génica del vector de parvovirus duplicado puede "potenciarse" porque se detectan niveles superiores de expresión génica (según se define en el párrafo precedente) en comparación con el vector de parvovirus monomérico comparable (por ejemplo, vector de VAAr). Las comparaciones pueden hacerse en el nivel de expresión génica en el mismo punto después de administración de virus. Alternativamente, las comparaciones pueden hacerse entre el nivel máximo de expresión génica alcanzado con cada vector.
Los vectores de parvovirus duplicados de la invención pueden haber mejorado ventajosamente las proporciones de unidad de transducción (ut)/partícula en comparación con vectores de parvovirus convencionales. En consecuencia, la presente invención también abarca nuevas composiciones de vectores de parvovirus que tienen una proporción mejorada de ut/partícula con respecto a las composiciones de vectores de parvovirus convencionales (por ejemplo, vectores de VAAr). Preferentemente, la proporción ut/partícula es menor que 50:1 aproximadamente, menor que 20:1 aproximadamente, menor que 15:1 aproximadamente, menor que 10:1 aproximadamente, menor que 8:1 aproximadamente, menor que 7:1 aproximadamente, menor que aproximadamente 6:1 aproximadamente, menor que 5:1 aproximadamente, menor que 4:1 aproximadamente o inferior. No hay un límite inferior particular para la proporción de ut/partícula. Normalmente, la proporción de ut/partícula será mayor que 1:1, 2:1, 3:1 ó 4:1 aproxi-
madamente.
El término "plantilla" o "sustrato" se usa normalmente en la presente memoria descriptiva para referirse a una secuencia de polinucleótidos que puede replicarse para producir el ADNv de parvovirus duplicado de la invención. Para el fin de producción de vectores, la plantilla se integrará normalmente en una secuencia o constructo de nucleótidos mayor, incluyendo, pero sin limitarse a, un plásmido, un vector de ADN desnudo, cromosoma artificial bacteriano (BAC), cromosoma artificial de levadura (YAC) o un vector viral (por ejemplo, vectores de adenovirus, herpesvirus, virus de Epstein-Barr, VAA, baculovirales, retrovirales y similares). Alternativamente, la plantilla puede incorporarse de manera estable en el cromosoma de una célula de empaquetamiento.
Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "polipéptido" abarca péptidos y proteínas, salvo si se indica lo contrario.
Según se usa en la presente memoria descriptiva, "transducción" o "infección" de una célula por VAA significa que el VAA entra en la célula para establecer una infección latente o activa (es decir, lítica), respectivamente. Véase, por ejemplo, Bernard N. Fields y col., Virology, volumen 2, capítulo 69 (3ª ed., Lippincott-Raven Publishers). En formas de realización de la invención en las que se introduce un vector de VAAr en una célula con el fin de suministrar una secuencia de nucleótidos a la célula, se prefiere que el VAA se integre en el genoma y establezca una infección latente.
Vectores de parvovirus duplicados
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los vectores de parvovirus "duplicados" (según se describe anteriormente) pueden emplearse ventajosamente para suministro de genes. Además, las presentes investigaciones han demostrado que estos vectores de parvovirus duplicados pueden ser más eficaces que los vectores de VAA, por ejemplo, con proporciones mejoradas de transducción a partículas, expresión génica más rápida, un nivel superior de expresión génica y/o expresión transgénica más persistente. Los autores de la invención han demostrado además que los vectores de parvovirus duplicados de la invención pueden usarse para suministro de genes a células hospedadoras que son normalmente refractarias a la transducción de VAA. Así, estos vectores de parvovirus duplicados tienen un ámbito de hospedadores diferente (por ejemplo, más amplio) que los vectores de VAA.
Los vectores de parvovirus duplicados desvelados en la presente memoria descriptiva son polinucleótidos diméricos autocomplementarios (ac) (normalmente, ADN)empaquetados en una cápside viral, preferentemente una cápside de parvovirus, más preferentemente, una cápside de VAA. En algunos aspectos, el genoma viral que se empaqueta en la cápside es en esencia un producto intermedio de replicación "atrapado" que no puede resolverse para producir cadenas de ADN de parvovirus de polaridad positiva y negativa. En consecuencia, los vectores de parvovirus duplicados de la invención parecen sortear la necesidad de síntesis mediada por células hospedadoras de ADN complementario inherente a los vectores recombinantes (VAAr) convencionales, respondiendo por tanto a una de las limitaciones de los vectores de VAAr.
Este resultado se consigue permitiendo que el virus empaquete en esencia repeticiones diméricas invertidas de genoma de vectores de parvovirus monocatenario (por ejemplo, VAA) de manera que las dos cadenas, unidas en un extremo, estén contenidas en una sola cápside infecciosa. Tras la liberación de la cápside, las secuencias complementarias se rehibridan para formar ADN bicatenario transcripcionalmente activo dentro de la célula diana.
Los vectores de parvovirus duplicados desvelados en la presente memoria descriptiva son fundamentalmente diferentes de los vectores de parvovirus convencionales (por ejemplo, VAAr), y de los parvovirus progenitores (por ejemplo, VAA) en que el ADNv puede formar una estructura en horquilla bicatenaria debido a apareamiento de bases intracadena, y a que ambas cadenas de ADN están encapsidadas. Así, el vector de parvovirus duplicado es funcionalmente similar a vectores de virus de ADN bicatenarios más que al parvovirus del que se obtuvieron. Esta característica afronta una insuficiencia reconocida previamente de la transferencia génica mediada por VAAr, que es la propensión limitada de la célula diana deseada a sintetizar ADN complementario al genoma monocatenario encapsidado normalmente por los Parvoviridae.
La cápside viral puede proceder de cualquier parvovirus, ya sea un parvovirus autónomo o un dependovirus, según se describe anteriormente. Preferentemente, la cápside viral es una cápside de VAA (por ejemplo, cápside de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6). En general, se prefieren la cápside de VAA1, la cápside de VAA5 y la cápside de VAA3. La elección de la cápside de parvovirus puede basarse en una serie de consideraciones según se conoce en la técnica como, por ejemplo, el tipo de célula diana, el nivel de expresión deseado, la naturaleza de la secuencia de nucleótidos heterólogos que se va a expresar, cuestiones relativas a la producción viral, y similares. Por ejemplo, la cápside de VAA1 puede emplearse ventajosamente para células musculoesqueléticas, hepáticas y del sistema nervioso central (por ejemplo, encéfalo); VAA5 para células de las vías respiratorias y el pulmón; VAA3 para células de la médula ósea; y VAA4 para células particulares del encéfalo (por ejemplo, células anexables).
La partícula de parvovirus puede ser una partícula "híbrida" en la que las RT virales y la cápside viral provengan de parvovirus diferentes. Preferentemente, las RT virales y la cápside son de serotipos diferentes de VAA (por ejemplo, según se describe en la publicación de patente internacional WO 00/28.004, solicitud provisional de EE.UU. nº 60/248.920; y Chao y col., (2000) Molecular Therapy 2:619. Análogamente, el parvovirus puede tener una cápside "quimérica" (por ejemplo, que contenga secuencias de parvovirus diferentes) o una cápside "diana" (por ejemplo, un tropismo dirigido) según se describe en estas publicaciones.
Según se usa en la presente memoria descriptiva, un "partícula de parvovirus duplicado" abarca partículas de virus híbridas, quiméricas y diana. Preferentemente, la partícula de parvovirus duplicado tiene una cápside de VAA, que puede promoverse por una cápside quimérica o diana, según se describe anteriormente.
Un vector de parvovirus duplicado según la invención puede producirse por cualquier procedimiento adecuado. Preferentemente, la plantilla para producir el ADNv es una que da lugar preferentemente a un ADNv duplicado, más que monomérico (es decir, la mayoría del ADNv producido es duplicado) que tiene la capacidad de formar un ADNv bicatenario. Preferentemente, al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% aproximadamente o más de los productos de replicación de la plantilla son duplicados.
En una forma de realización particular, la plantilla es una molécula de ADN que comprende una o más secuencias de repetición terminal (RT). La plantilla comprende también una RT modificada que no puede resolverse (es decir, mellarse) por proteínas Rep de parvovirus. Durante la replicación, la incapacidad de la proteína Rep de resolver la RT modificada tendrá como resultado un producto intermedio estable con los dos "monómeros" unidos covalentemente por la RT no resoluble. Esta molécula "duplicada" puede empaquetarse en la cápside de parvovirus (VAA) para producir un nuevo vector de parvovirus duplicado.
Sin querer sostener ninguna teoría en particular de la invención, es probable que el genoma del virión esté contenido en una forma monocatenaria mientras se empaqueta en la cápside viral. Después de la liberación de la cápside durante la infección viral, parece que la molécula dimérica "se vuelve" o se híbrida para formar una molécula bicatenaria mediante apareamiento de bases intracadena, con la secuencia RT no resoluble formando una estructura de horquilla cerrada covalentemente en un extremo. Este ADNv bicatenario obvia la síntesis de segunda cadena mediada por células hospedadoras, para la que se ha postulado que es una etapa de limitación de velocidad en la transducción
de VAA.
En formas de realización preferidas, la plantilla comprende además una o varias secuencias de nucleótidos heterólogos (según se describe a continuación) para su empaquetamiento para suministro a una célula diana. Según esta forma de realización particular, la secuencia de nucleótidos heterólogos está situada entre las RT virales en cada extremo del sustrato. En formas de realización más preferidas, los genes cap de parvovirus (por ejemplo, VAA) y los genes rep de parvovirus (por ejemplo, VAA) se suprimen de la plantilla (y el ADNv producido de los mismos). Esta configuración eleva al máximo el tamaño de la secuencia o las secuencias de ácidos nucleicos heterólogos que pueden ser transportadas por la cápside de parvovirus.
En una forma de realización particular, la plantilla para producir los vectores de parvovirus duplicados de la invención contiene al menos una RT en los extremos 5' y 3', flanqueando a una secuencia de nucleótidos heterólogos de interés (según se describe a continuación). La RT en un extremo del sustrato es no resoluble, es decir, no puede resolverse (mellarse) mediante la proteína Rep. Durante la replicación, la incapacidad de la proteína Rep de resolver una de las RT tendrá como resultado un producto intermedio estable con los dos "monómeros" unidos covalentemente por la RT no funcional (es decir, no resoluble). La secuencia de nucleótidos heterólogos puede estar en cualquier orientación con respecto a la RT no resoluble.
El término "flanqueado" no pretende indicar que las secuencias sean necesariamente contiguas. Por ejemplo, en el ejemplo del párrafo anterior puede haber secuencias interpuestas entre la secuencia de nucleótidos heterólogos y la RT. Una secuencia que está "flanqueada" por otros dos elementos indica que un elemento está situado en 5' con respecto a la secuencia y el otro está situado en 3' con respecto a la secuencia; sin embargo, puede haber secuencias interpuestas entre ellos.
Según esta forma de realización, la plantilla para producir el ADNv de parvovirus duplicado de la invención tiene preferentemente la mitad aproximadamente del tamaño del genoma de parvovirus silvestre (por ejemplo, VAA) correspondiente a la cápside en la que se empaquetará el ADNv. Dicho de forma alternativa, la plantilla es preferentemente de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 55% wt, más preferentemente de aproximadamente el 45% a aproximadamente el 52% wt. Así, el ADNv duplicado producido a partir de esta plantilla tendrá preferentemente un tamaño total que es aproximadamente el tamaño del genoma de parvovirus silvestre (por ejemplo, VAA) correspondiente a la cápside en la que se empaquetará el ADNv, por ejemplo, de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 105% wt. En el caso de VAA, es bien conocido en la técnica que la cápside de VAA va en contra del empaquetamiento de ADNv que se desvía sustancialmente en tamaño del genoma de VAA wt. En el caso de una cápside de VAA, el ADNv duplicado es preferentemente de aproximadamente 5,2 kb de tamaño o inferior. En otras formas de realización, el ADNv duplicado es preferentemente mayor que aproximadamente 3,6, 3,8, 4,0, 4,2 ó 4,4 kb de longitud y/o menor que aproximadamente 5,4, 5,2, 5,0 ó 4,8 kb de longitud.
Dicho de forma alternativa, la secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogos será normalmente menor que aproximadamente 2,5 kb de longitud (más preferentemente menor que aproximadamente 2,4 kb, más preferentemente aún menor que aproximadamente 2,2 kb de longitud, todavía más preferentemente menor que aproximadamente 2,1 kb de longitud) para facilitar el empaquetamiento de la plantilla duplicado por la cápside de parvovirus (por ejemplo, VAA).
En otra forma de realización particular, la plantilla en sí está duplicada, es decir, es una molécula dimérica autocomplementaria. Según esta forma de realización, la plantilla comprende además una resoluble en cada extremo. La plantilla comprende además una RT no resoluble situada centralmente (según se describe anteriormente). En otras palabras, cada mitad de la plantilla a cada lado de la RT no resoluble tiene aproximadamente la misma longitud. Cada mitad de la plantilla (es decir, entre la RT resoluble y no resoluble) comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogos de interés. La secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogos de cada mitad de la molécula están flanqueadas por una RT resoluble y la RT no resoluble central.
Las secuencias de ambas mitades de la plantilla son sustancialmente complementarias (es decir, con complementariedad de secuencia de nucleótidos de aproximadamente al menos el 90%, 95%, 98%, 99% o más), de manera que los productos de replicación de la plantilla pueden formar moléculas bicatenarias debido al apareamiento de bases entre las secuencias complementarias. En otras palabras, la plantilla es en esencia una repetición invertida con dos mitades unidas por la RT no resoluble.
Preferentemente, la secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogos en cada mitad de la plantilla son en esencia completamente autocomplementarias (es decir, contienen un número insignificante de bases mal apareadas, o incluso ausencia de bases mal apareadas). También se prefiere que las dos mitades de la secuencia de nucleótidos sean en esencia completamente autocomplementarias.
Según esta forma de realización, la plantilla (y el ADNv producido por la misma) tiene preferentemente aproximadamente el mismo tamaño que el genoma wt encapsulado naturalmente por la cápside de parvovirus (por ejemplo, VAA), es decir, para facilitar el empaquetamiento eficaz en la cápside de parvovirus. Por ejemplo, en el caso de una cápside de VAA, la plantilla tiene preferentemente aproximadamente el tamaño del genoma de VAA wt. En formas de realización particulares, la plantilla tiene aproximadamente un tamaño de 5,2 kb o inferior. En otras formas de realización, la plantilla es preferentemente mayor que aproximadamente 3,6, 3,8, 4,0, 4,2 ó 4,4 kb de longitud y/o menor que aproximadamente 5,4, 5,2, 5,0 ó 4,8 kb de longitud. Como una declaración alternativa, la plantilla está preferentemente en el intervalo del 80% al 105% del genoma de parvovirus silvestre(por ejemplo, VAA).
La o las RT (resolubles y no resolubles) son preferentemente secuencias de VAA, prefiriéndose serotipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6. El término "repetición terminal" incluye secuencias sintéticas que actúan como una repetición terminal invertida de VAA, como la "secuencia en doble D", según se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.478.745 para Samulski y col. Las RT de VAA resolubles según la presente invención no necesitan tener una secuencia RT silvestre (por ejemplo, una secuencia silvestre puede alterarse por inserción, deleción, truncamiento o mutaciones de aminoácidos), siempre que la RT medie en las funciones deseadas como, por ejemplo, empaquetamiento de virus, integración y/o recuperación de provirus, y similares. Normalmente, pero no necesariamente, las RT son del mismo parvovirus, por ejemplo, ambas secuencias RT son de VAA2.
Los expertos en la materia observarán que la o las proteínas Rep virales usadas para producir los vectores duplicados de la invención se seleccionan considerando la fuente de las RT virales. Por ejemplo, la RT de VAA5 interacciona más eficazmente con la proteína Rep de VAA5.
Las secuencias genómicas de los diversos parvovirus autónomos y los diferentes serotipos de VAA, así como las secuencias de las RT, subunidades de cápsides y proteínas Rep son conocidas en la técnica. Dichas secuencias pueden encontrarse en la bibliografía o en bases de datos públicas como GenBank. Véase, por ejemplo, los números de acceso a GenBank NC 002077, NC 001863, NC 001862, NC 001829, NC 001729, NC 001701, NC 001510, NC 001401, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC 001358, NC 001540. Véase también, por ejemplo, Chiorini y col., (1999) J. Virology 73:1309; Xiao y col., (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu y col., (1996) Virology 221:208; publicaciones de patentes internacionales WO 00/28.061, WO 99/61.601, WO 98/11.244; y la patente de EE.UU. nº 6.156.303. Se proporciona una descripción temprana de las secuencias RT de VAA1, VAA2 y VAA3 RT en Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno-associated virus (VAA) DNA replication and integration," tesis doctoral, Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA.
La RT no resoluble puede producirse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, la inserción en la RT desplazará el sitio de mella (es decir, srt) y tiene como resultado una RT no resoluble. La designación de las diversas regiones o elementos de la RT son conocidos en la técnica. En la Figura 6 se proporciona una ilustración de las regiones de RT de VAA (véase también, Bernard, N. Fields y col., Virology, volumen 2, capítulo 69, Figura 5, 3ª ed., Lippincott Raven Publishers). La inserción se realiza preferentemente en la secuencia del sitio de resolución terminal (srt). Alternativamente, lainserción puede realizarse en un sitio entre el Elemento de Unión Rep_{ }(RBE) dentro del elemento A y el srt en el elemento D (véase Figura 6). La secuencia central del sitio srt de VAA se conoce en la técnica y ha sido descrita por Snyder y col. (1990) Cell 60:105; Snyder y col., (1993) J. Virology 67:6096; Brister y Muzyczka, (2000) J. Virology 74:7762; Brister y Muzyczka, (1999), J. Virology 73:9325. Por ejemplo, Brister y Muzyczka, (1999) J. Virology 73:9325 describen una secuencia srt central de 3'-CCGGT/TG-5' en el elemento D. Snyder y col., (1993) J. Virology 67:6096, identificaron la secuencia srt mínima como 3'-GGT/TGA-5', que se solapa sustancialmente con la secuencia identificada por Brister y Muzyczka.
Preferentemente, la inserción se encuentra en la región del sitio srt. La inserción puede ser de cualquier longitud adecuada que reduzca o elimine sustancialmente (por ejemplo, en el 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más) la resolución de la RT. Preferentemente, la inserción es al menos aproximadamente de 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20 ó 30 nucleótidos o más. No existen límites superiores particulares al tamaño de la secuencia insertada, siempre que se consigan niveles adecuados de replicación y empaquetamiento viral (por ejemplo, la inserción puede tener una longitud de 50, 100, 200 ó 500 nucleótidos o más).
En otra forma de realización preferida, la RT puede volverse no resoluble por deleción del sitio srt. Las deleciones pueden extenderse a 1, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 30 nucleótidos o más después del sitio srt, siempre que la plantilla conserve las funciones deseadas. Además del sitio srt, puede suprimirse parte o la totalidad del elemento D. Las deleciones pueden extenderse además al elemento A, si bien los expertos en la materia observarán que puede ser ventajoso conservar el RBE en el elemento A, por ejemplo, para facilitar un empaquetamiento eficaz. Las deleciones en el elemento A pueden ser de 2, 3, 4, 5, 8, 10 ó 15 nucleótidos de longitud o más, siempre que la RT no resoluble conserve cualesquiera otras funciones deseadas. Se prefiere además que parte o la totalidad de las secuencias de parvovirus (por ejemplo, AA1) que vayan más allá del elemento D fuera de la secuencia RT (por ejemplo, a la derecha del elemento D de la Figura 6) sean suprimidos para evitar la conversión génica para corregir la RT alterada.
Como una alternativa más, la secuencia en el sitio de mella puede estar mutada, de manera que la resolución por proteína Rep se reduzca o elimine sustancialmente. Por ejemplo, las bases A y/o C pueden sustituirse por bases G y/o T en el sitio de mella o en sus proximidades. Los efectos de las sustituciones en el sitio de resolución terminal en escisión Rep han sido descritos por Brister y Muzyczka, (1999) J. Virology 73:9325. Como una alternativa adicional, pueden usarse también sustituciones de nucleótidos en las regiones que rodean al sitio de mella, para las que se ha postulado que forman una estructura tallo-bucle, para reducir la escisión Rep en el sitio de resolución terminal (id.).
Los expertos en la materia observarán que las alteraciones en la RT no resoluble pueden seleccionarse de manera que mantengan las funciones deseadas, si existen, de la RT alterada (por ejemplo, empaquetamiento, reconocimiento Rep, integración específica del sitio y similares).
En formas de realización más preferidas, la RT será resistente al procedimiento de conversión génica según se describe por Samulski y col., (1983) Cell 33:135. La conversión génica en la RT no resoluble restaurará el sitio srt, que generará una RT resoluble y dará como resultado un aumento en la frecuencia de productos de replicación monomérica. La conversión génica tiene como resultado recombinación homóloga entre la RT resoluble y la RT alterada.
Una estrategia para reducir la conversión génica es producir virus usando una línea celular (preferentemente, mamífero) que es defectuosa para reparación de ADN, como se conoce en la técnica, ya que estas líneas celulares se deteriorarán en su capacidad para corregir las mutaciones introducidas en la plantilla viral.
Alternativamente, las plantillas que tienen una velocidad sustancialmente reducida de conversión génica pueden generarse introduciendo una región de no homología en la RT no resoluble. La no homología en la región que rodea al elemento srt entre la RT no resoluble y la RT inalterada en la plantilla reducirá o incluso eliminará sustancialmente la conversión génica.
Cualquier inserción o deleción adecuada puede introducirse en la RT no resoluble para generar una región de no homología, siempre que la conversión génica se reduzca o se elimine sustancialmente. Se prefieren las estrategias que emplean deleciones para crear no homología. Se prefiere además que la deleción no deteriore indebidamente la replicación y empaquetamiento de la plantilla. En el caso de una deleción, puede bastar la misma deleción para deteriorar la resolución del sitio srt, así como para reducir la conversión génica.
Como una alternativa más, la conversión génica puede reducirse por inserciones en la RT no resoluble o, alternativamente, en el elemento A entre el RBE y el sitio srt. La inserción es normalmente de al menos aproximadamente 3, 4,5, 6, 10, 15, 20 ó 30 nucleótidos o más nucleótidos de longitud. No existe límite superior particular para el tamaño de la secuencia insertada, que puede ser de hasta 50, 100, 200 ó 500 nucleótidos o más, si bien se prefiere que la inserción no deteriore indebidamente la replicación y empaquetamiento de la plantilla.
En formas de realización alternativas, la RT no resoluble puede ser una RT de ocurrencia natural (o una forma alterada de la misma) que es no resoluble en las condiciones usadas. Por ejemplo, la RT no resoluble puede no reconocerse por las proteínas Rep usadas para producir el ADNv desde la plantilla. Para ilustrarlo, la RT no resoluble puede ser una secuencia de parvovirus autónomos que no se reconoce por proteínas Rep de VAA. A modo de otro ejemplo ilustrativo, la RT resoluble y las proteínas Rep pueden ser de un serotipo de VAA (por ejemplo, VAA2), y la RT no resoluble será de otro serotipo de VAA (por ejemplo, VAA5) que no se reconoce por las proteínas Rep de VAA2.
Como una alternativa más, la secuencia no resoluble puede ser cualquier secuencia de repetición invertida que forme una estructura de horquilla y no pueda ser escindida por las proteínasRep. Como una alternativa más, puede usarse una plantilla de tamaño de medio genoma para producir una partícula de parvovirus que transporte un ADNv duplicado, producido a partir de una plantilla de tamaño de medio genoma, según se describe en los Ejemplos de la presente memoria descriptiva y por Hirata y Russell, (2000) J. Virology 74:4612. Este informe describe el empaquetamiento de monómeros apareados y productos intermedios RF transitorios cuando se redujeron los genomas de VAA a menos de la mitad del tamaño del genoma VAA wt (< 2,5kb). Estos investigadores encontraron que los genomas monoméricos eran el sustrato preferido para corrección génica por recombinación homóloga, y que los genomas duplicados funcionaban menos bien que los genomas monoméricos en este ensayo. Este informe no investigó ni sugirió el uso genomas duplicados como vectores para suministro de genes.
Preferentemente, según esta forma de realización, la plantilla tendrá aproximadamente la mitad del tamaño del ADNv que puede empaquetarse por la cápside de parvovirus. Por ejemplo, para una cápside de VAA, la plantilla es preferentemente de aproximadamente la mitad del genoma de VAA wt de longitud, según se describe anterior-
mente.
La plantilla (según se describe anteriormente) se replica para producir un genoma de vector duplicado (ADNv) de la invención, que es capaz de formar un ADN bicatenario en condiciones apropiadas. La molécula duplicada es sustancialmente autocomplementaria, de manera que es capaz de formar un ADN viral bicatenario (es decir, complementariedad de secuencia de nucleótidos del 90%, 95%, 98%, 99% o más). El apareamiento de bases entre bases de nucleótidos individuales o secuencias de polinucleótido es bien conocida en la técnica. Preferentemente, el ADN viral de parvovirus duplicado es en esencia completamente autocomplementario (es decir, contiene un número nulo o insignificante de bases mal apareadas). En particular, se prefiere que la secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogos (por ejemplo, las secuencias que serán transcritas por la célula) sean en esencia completamente autocomplemen-
tarias.
En general, los parvovirus duplicados pueden contener no complementariedad en la medida en que la expresión de la o las secuencias de nucleótidos heterólogos del vector de parvovirus duplicado sean más eficaces que las de un vector monomérico correspondiente.
Los parvovirus duplicados de la presente invención proporcionan la célula hospedadora con una molécula bicatenaria que afronta uno de los inconvenientes de los vectores de VAAr, es decir, la necesidad de que la célula hospedadora convierta el ADNv de VAAr monocatenario en un ADN bicatenario. La presencia de regiones sustanciales de no complementariedad en el ADN virión, en particular, dentro de la o las secuencias de nucleótidos heterólogos, será reconocida probablemente por la célula hospedadora, y dará como resultado mecanismos de reparación de ADN recuperados para corregir las bases mal apareadas, contrarrestando así las características ventajosas de los vectores de parvovirus duplicados; por ejemplo, los vectores de la invención reducen o eliminan la necesidad de que la célula hospedadora procese la plantilla viral.
Producción de vectores de parvovirus duplicados
En general, los procedimientos de producción de vectores de VAA son aplicables a la producción de los vectores de parvovirus duplicados de la invención; la principal diferencia entre los procedimientos es la estructura de la plantilla o sustrato que se empaquetará. Para producir un vector de parvovirus duplicado según la presente invención se usará una plantilla según se ha descrito anteriormente para producir el genoma viral encapsidado.
La plantilla descrita anteriormente es preferentemente un sustrato de ADN y puede proporcionarse en cualquier forma conocida en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, un plásmido, vector de ADN desnudo, cromosoma artificial bacteriano (BAC), cromosoma artificial de levadura (YAC) o un vector viral (por ejemplo, vectores de adenovirus, herpesvirus, virus de Epstein-Barr, VAA, baculoviral, retroviral y similares). Alternativamente, la plantilla puede incorporarse de manera estable en el genoma de una célula de empaquetamiento.
En una forma de realización particular, los vectores de parvovirus de la invención pueden transportar ADNv monomérico duplicado de medio genoma de tamaño según se describe en los Ejemplos en la presente memoria descriptiva. Este medio de proporcionar células con un ADN virión de parvovirus duplicado (por ejemplo, VAA) aprovecha el modo de replicación en horquilla rodante en el que se genera ADNv monomérico a partir de productos intermedios de repetición invertida dimérica (Cavalier-Smith y col., (1974) Nature 250:467;Straus y col.,(1976) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73:742). Cuando el genoma es suficientemente pequeño, las repeticiones diméricas invertidas en sí pueden encapsidarse en el virión. Este planteamiento generará una población mixta de moléculas monoméricas y diméricas. Los vectores de parvovirus duplicados pueden aislarse mediante técnicas conocidas como, por ejemplo, separación sobre un gradiente de densidad de cloruro de cesio.
Las partículas de parvovirus duplicado según la invención pueden producirse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, introduciendo la plantilla que se va a replicar y empaquetar en una célula de empaquetamiento o permisiva, tal como se entienden estos términos en la técnica (por ejemplo, una célula permisiva puede estar infectada o transducida por el virus; una célula de "empaquetamiento" es una célula transformada de manera estable que proporciona funciones de auxiliar).
En una forma de realización, se proporciona un procedimiento para producir una partícula de parvovirus duplicado, que comprende: suministro a una célula permisiva para replicación de parvovirus de (a) una secuencia de nucleótidos que codifica una plantilla para producir genoma de vector de la invención (según se ha descrito anteriormente en detalle); (b) secuencias de nucleótidos suficientes para empaquetar un genoma de vector; (c) secuencias de nucleótidos suficientes para empaquetar el genoma de vector en una cápside de parvovirus, en condiciones suficientes para replicación y empaquetamiento del genoma de vector en la cápside de parvovirus, por lo que se producen en la célula partículas de parvovirus duplicado que comprenden el genoma de vector encapsidado en la cápside de parvovirus. Preferentemente, las secuencias de replicación de parvovirus y/o de codificación de cápside son secuencias de VAA.
Puede emplearse cualquier procedimiento de introducción de la secuencia de nucleótidos que transporta la plantilla en un hospedador celular para replicación y empaquetamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, microinyección, liposomas catiónicos o aniónicos y liposomas en combinación con una señal de localización nuclear. En formas de realización en las que la plantilla se proporciona mediante un vector de virus, pueden usarse procedimientos estándar para producir infección viral.
Puede emplearse cualquier célula permisiva o de empaquetamiento conocida en la técnica para producir los vectores duplicados. Se prefieren células de mamífero. También se prefieren líneas celulares de empaquetamiento de transcomplementación que proporcionan funciones suprimidas de un virus auxiliar defectuoso para replicación como, por ejemplo, células 293 u otras células E1 de transcomplementación. Se prefieren también células de mamífero o líneas celulares que son defectuosas para reparación de ADN según se conoce en la técnica, ya que estas líneas celulares estarán deterioradas en su capacidad para corregir las mutaciones introducidas en la plantilla viral.
La plantilla puede contener parte o la totalidad de los genes cap y rep de parvovirus (por ejemplo, VAA). Preferentemente, sin embargo, se proporciona parte o la totalidad de las funciones cap y rep en trans mediante introducción de un vector(es) de empaquetamiento que codifica la cápside y/o las proteínas Rep en la célula. Con la máxima preferencia, la plantilla no codifica la cápside o las proteínas Rep. Alternativamente, se usa una línea celular de empaquetamiento que se transforma de manera estable para expresar los genes cap y/o rep (véase, por ejemplo, Gao y col., (1998) Human Gene Therapy 9:2353; Inoue y col., (1998) J. Virol. 72:7024; patente de EE.UU. nº 5.837.484; documento WO 98/27.207; patente de EE.UU. nº 5.658.785; WO 96/17.947).
Además, se proporcionan preferentemente funciones de virus auxiliar al vector para propagar nuevas partículas de virus. Tanto el adenovirus como el virus del herpes simple pueden servir como virus auxiliares para VAA. Véase, por ejemplo, Bernard N. Fields y col., Virology, volumen 2, capítulo 69 (3ª ed., Lippincott Raven Publishers). Los virus auxiliares ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, virus del herpes simple (VHS) varicela zoster, citomegalovirus y virus de Epstein-Barr. La multiplicidad de infección (MDI) y la duración de la infección dependerán del tipo de virus usado y de la línea celular de empaquetamiento empleada. Puede emplearse cualquier vector auxiliar adecuado. Preferentemente, el o los vectores auxiliares son un plásmido como, por ejemplo, según se describe por Xiao y col., (1998) J. Virology 72:2224. El vector puede introducirse en la célula de empaquetamiento mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, según se describe anteriormente.
En un procedimiento, los vectores de parvovirus duplicados de la invención pueden producirse mediante cotransfección de un vector rep/cap que codifica funciones de empaquetamiento de VAA y la plantilla que codifica el ADNv de VAA en células humanas infectadas con adenovirus (Samulski y col., (1989) J. Virology 63:3822). En condiciones optimizadas, este procedimiento puede producir hasta 10^{9} unidades infecciosas de partículas de virus por ml. Un inconveniente de este procedimiento es, sin embargo, que tiene como resultado la coproducción de adenovirus silvestre contaminante. Como se conocen varias proteínas de adenovirus (por ejemplo, fibra, hexon, etc.) para producir respuestas inmunitarias de linfocitos T citotóxicos (LTC) en seres humanos (Yang y Wilson, (1995) J. Immunol. 155:2564; Yang y col., (1995) J. Virology 69:2004; Yang y col., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:4407), esto representa un inconveniente importante cuando se usan estos preparados de VAAr (Monahan y col., (1998) Gene Therapy 5:40).
Las reservas de vectores libres de virus auxiliares contaminantes pueden obtenerse por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, los virus duplicados y virus auxiliares pueden diferenciarse fácilmente por su tamaño. Los virus duplicados pueden separarse asimismo de los virus auxiliares basándose en su afinidad por un sustrato de heparina(Zolotukhin y col. (1999) Gene Therapy 6:973). Preferentemente, los virus auxiliares defectuosos en replicación suprimidos se usan de manera que cualquier virus auxiliar contaminante no es competente para replicación. Como una alternativa más, puede emplearse una expresión de gen tardío carente de auxiliar de adenovirus, ya que sólo se requiere la expresión de gen temprano de adenovirus para mediar en el empaquetamiento del virus duplicado. En la técnica se conocen mutantes de adenovirus defectuosos para la expresión génica tardía (por ejemplo, los mutantes de adenovirus ts100K y ts149).
Un procedimiento preferido para proporcionar funciones auxiliares emplea un miniplásmido de adenovirus no infeccioso que transporta todos los genes auxiliares requeridos para producción de VAA eficaz (Ferrari y col., (1997) Nature Med. 3:1295; Xiao y col., (1998) J. Virology 72:2224). Las valoraciones de VAAr obtenidas con miniplásmidos de adenovirus son cuarenta veces superiores que las obtenidas con procedimientos convencionales de infección de adenovirus silvestre (Xiao y col., (1998) J. Virology 72:2224). Este planteamiento obvia la necesidad de realizar cotransfecciones con adenovirus (Holscher y col., (1994); J. Virology 68:7169; Clark y col., (1995) Hum. Gene Ther. 6:1329; Trempe y Yang, (1993), en Fifth Parvovirus Workshop, Crystal River, FL).
Se han descrito otros procedimientos para producir reservas de VAAr, incluyendo, pero sin limitarse a, procedimientos que dividen los genes rep y cap en casetes de expresión separadas para impedir la generación de VAA de replicación competente (véase, por ejemplo, Allen y col., (1997) J. Virol. 71:6816), procedimientos que emplean líneas celulares de empaquetamiento (véase, por ejemplo, Gao y col., (1998) Human Gene Therapy 9:2353;Inoue y col., (1998) J. Virol. 72:7024; patente de EE.UU. nº 5.837.484; documento WO 98/27.207; patente de EE.UU. nº 5.658.785; documento WO 96/17.947), y otros sistemas libres de virus auxiliares (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.945.335 para Colosi).
También pueden usarse herpesvirus como virus auxiliares en procedimientos de empaquetamiento de VAA. Los herpesvirus híbridos que codifican la o las proteínas Rep de VAA pueden facilitarse ventajosamente para más esquemas de producción de vectores de VAA escalables. Se ha descrito un vector de virus de herpes simples híbrido de tipo I (VHS-1) que expresa los genes rep y cap de VAA-2 (Conway y col., (1999) Gene Therapy 6:986 y documento WO 00/17.377.
En suma, la plantilla viral que se va a replicar y empaquetar, los genes cap de parvovirus, los genes rep de parvovirus apropiados y (preferentemente) funciones auxiliares se proporcionan a una célula (por ejemplo, una célula permisiva o de empaquetamiento) para producir partículas de parvovirus, que transportan el genoma duplicado (es decir, el genoma es capaz de formar un ADN de "respuesta" o autocomplementario después de desprotección viral). La expresión combinada de los genes rep y cap codificados por la plantilla y/o el o los vectores de empaquetamiento y/o la célula de empaquetamiento transformada de forma estable tiene como resultado la producción de una partícula de parvovirus en la que una cápside de parvovirus empaqueta un genoma de parvovirusduplicado según la invención. Se deja que las partículas de parvovirus duplicado se reúnan dentro de la célula, y entonces pueden recuperarse por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia.
Alternativamente, pueden usarse también planteamientos de empaquetamiento in vitro, según se conocen en la técnica, para producir la plantilla de ADNv dimérico según se describe en la presente memoria descriptiva. Para ilustrarlo, la secuencia de ADNv duplicado puede amplificarse en bacterias usando un fago M13 monocatenario. Las RT resolubles en cada extremo del ADNv transportado por el M13 se hibridarán para formar una secuencia bicatenaria, que puede escindirse con una enzima de restricción adecuada para escindir el ADNv dimérico de la estructura principal de M13. Como otra alternativa más, puede usarse PCR u otras técnicas de amplificación adecuadas para amplificar la secuencia de ADNv duplicado a partir de una plantilla autocomplementaria dimérica, según se ha descrito anteriormente.
Los reactivos y procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva pueden emplearse para producir reservas de alta valoración de los vectores de parvovirus de la invención, preferentemente en esencia a valoraciones silvestres. Se prefiere también que la reserva de parvovirus tenga una valoración de al menos aproximadamente 10^{5} unidades de transducción (ut)/ml, más preferentemente al menos aproximadamente 10^{6} ut/ml, más preferentemente al menos aproximadamente 10^{7} ut/ml, más preferentemente aún al menos aproximadamente 10^{8} ut/ml, más preferentemente aún al menos aproximadamente 10^{9} ut/ml, más preferentementetodavía al menos aproximadamente 10^{10} ut/ml, más preferentemente todavía al menos aproximadamente 10^{11} ut/ml, o más.
Dicho de forma alternativa, la reserva de parvovirus tiene preferentemente una valoración de al menos aproximadamente 1 ut/célula, más preferentemente de al menos aproximadamente 5 ut/célula, más preferentemente todavía de al menos aproximadamente 20 ut/célula, más preferentemente aún de al menos aproximadamente 50 ut/célula, más preferentemente todavía de al menos aproximadamente 100 ut/célula, más preferentemente todavía de al menos aproximadamente 250 ut/célula, con la máxima preferencia de al menos aproximadamente 500 ut/célula, o incluso más.
Además, los vectores de parvovirus duplicados de la invención pueden tener una proporción de unidad de transducción (ut) mejorada/partícula sobre vectores de parvovirus convencionales. Preferentemente, la proporción ut/partícula es menos de 50:1 aproximadamente, menos de 20:1 aproximadamente, menos de 15:1 aproximadamente, menos de 10:1 aproximadamente, menos de 8:1 aproximadamente, menos de 7:1 aproximadamente, menos de 6:1 aproximadamente, menos de 5:1 aproximadamente, menos de 4:1 aproximadamente,o inferior. No existe ningún limite inferior particular en la proporción ut/partícula. Normalmente, la proporción ut/partícula será mayor que aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1 ó 4:1.
Aplicaciones de la presente invención
Un aspecto más de la invención es un procedimiento de suministro de una secuencia de nucleótidos a una célula usando los vectores de parvovirus duplicados descritos en la presente memoria descriptiva. El vector puede suministrarse a una célula in vitro mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Alternativamente, el vector puede suministrarse a una célula ex vivo según se conoce en la técnica.
Los presentes procedimientos pueden emplearse ventajosamente para proporcionar transducción más eficaz de célula dianas que los vectores de VAA wt. Para ilustrarlo, los vectores de parvovirus duplicados pueden transducirse a una velocidad más alta que los vectores de VAA wt. Alternativamente, o adicionalmente, los vectores de parvovirus duplicados pueden proporcionar un inicio más rápido de la expresión transgénica, un nivel superior de expresión transgénica, y/o una persistencia más larga de expresión transgénica que los vectores de VAA.
Los vectores de parvovirus duplicados y procedimientos de la invención pueden encontrar uso además en procedimientos de administración de una secuencia de nucleótidos a una célula que es normalmente no permisiva para transducción por VAA, o se transduce sólo de forma ineficaz por VAA. Las células ilustrativas incluyen, pero no se limitan, células dendríticas, tipos particulares de célula cancerosa o tumoral, astrocitos y células madre de médula ósea. Por otra parte, los procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva pueden aplicarse ventajosamente con células de no replicación o de replicación lenta que apoyan de forma ineficaz la síntesis de VAA de segunda cadena, como las hepáticas, del sistema nervioso central (por ejemplo, el encéfalo), y poblaciones particulares de células de los músculos (por ejemplo, fibras de contracción rápida).
En consecuencia, los vectores de parvovirus duplicados desvelados en la presente memoria descriptiva pueden tener un intervalo diferenciado de células diana (por ejemplo, un intervalo más amplio de células diana) en comparación con los vectores de VAAr. Sin querer limitarse a ninguna teoría particular de la invención, parece que las células que son refractarias a transducción por VAAr pueden ser permisivas para los vectores de parvovirus duplicados de la invención, que proporcionan una molécula bicatenaria a la célula hospedadora. Así, la presente invención encuentra uso en el suministro de una secuencia de nucleótidos a una célula que es no permisiva para vectores de VAA convencionales o transduce sólo escasamente mediante vectores de VAAr, porque no puede dar soporte eficaz a la síntesis de segunda cadena del ADN viral.
Una de las características de los vectores de VAA wt es el período de latencia prolongado antes de que se observe un nivel elevado de expresión transgénica. Los vectores de parvovirus duplicados desvelados en la presente memoria descriptiva pueden proporcionar un sistema de suministro génico más rápido y agresivo que los vectores de VAA wt porque omiten la etapa de síntesis de cadena complementaria.
En consecuencia, los vectores de parvovirus duplicados de la invención encuentran uso en procedimientos de tratamiento del cáncer o tumores, por ejemplo, mediante suministro de agentes anticancerosos o antígenos del cáncer.
Los vectores de parvovirus duplicados pueden usarse también ventajosamente en el tratamiento de individuos con trastornos metabólicos (por ejemplo, deficiencia de la ornitin-transcarbamilasa). Dichos trastornos requieren normalmente un inicio relativamente rápido de expresión de un polipéptido terapéutico por el vector de suministro génico. Como una alternativa adicional, los vectores de la invención pueden administrarse para proporcionar agentes que mejoran la supervivencia a trasplantes (por ejemplo, superóxido-dismutasa) o combaten la sepsis.
Por otra parte, los autores de la invención han encontrado que las células dendríticas (CD), que son refractarias a vectores de VAA wt (Jooss y col., (1998) 72:4212), son permisivas para los vectores de parvovirus duplicados desvelados en la presente memoria descriptiva. En consecuencia, como un aspecto adicional más, la presente invención proporciona procedimientos de suministro de una secuencia de nucleótidos a CD, por ejemplo, para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos codifica un antígeno de un agente infeccioso o un antígeno del cáncer.
Como un aspecto adicional más, la presente invención puede emplearse para suministrar una secuencia de nucleótidos heterólogos en situaciones en que es deseable regular el nivel de expresión transgénica (por ejemplo, transgenes que codifican hormonas o factores de crecimiento, según se describe a continuación). El inicio más rápido de expresión transgénica por los vectores de parvovirus duplicados desvelados en la presente memoria descriptiva hace que los vehículos de suministro de genes sean más tratables para dichos regímenes de tratamiento que los vectores de VAAr.
Cualquier secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogos (según se define anteriormente) pueden suministrarse según la presente invención. Los ácidos nucleicos de interés incluyen ácidos nucleicosque codifican polipéptidos, preferentemente polipéptidos terapéuticos (por ejemplo, para usos médicos o veterinarios) o inmunogénicos (por ejemplo, para vacunas).
Un "polipéptido terapéutico" es un polipéptido que puede aliviar o reducir los síntomas que se producen por una ausencia o defecto en una proteína en una célula o sujeto. Alternativamente, un "polipéptido terapéutico" es aquel que en otro caso confiere un beneficio a un sujeto como, por ejemplo, efectos anticancerosos o mejora en la supervivencia a trasplantes.
Preferentemente, la secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogos tendrán una longitud de al menos 2,5 kb aproximadamente (más preferentemente menos de 2,4 kb aproximadamente, más preferentemente todavía menos de 2,2 kb aproximadamente, más preferentemente aún menos de 2,0kb aproximadamente de longitud) para facilitar el empaquetamiento de la plantilla duplicada por la cápside de parvovirus (por ejemplo, VAA). Las secuencias de nucleótidos ilustrativas codifican Factor IX, Factor X, enzimas lisosómicas (por ejemplo, hexosaminidasa A, asociada con enfermedad de Tay-Sachs, o iduronato-sulfatasa, asociada con síndrome de Hunter/MPS II), eritropoyetina, angiostatina, endostatina, superóxido-dismutasa, globina, leptina, catalasa, tirosin-hidroxilasa, así como citoquinas (por ejemplo, \alpha-interferón, \beta-interferón, \gamma-interferón-, interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-12, factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos, linfotoxina, y similares), factores y hormonas de crecimiento peptídico (por ejemplo, somatotropina, insulina, factores de crecimiento de tipo insulínico 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico 3 y 4, factor neurotrófico derivado del encéfalo, factor neurotrófico derivado de la glía, factor de crecimiento transformante \alpha y \beta, y similares); receptores (por ejemplo, receptor de factor de necrosis tumoral). En otras formas de realización ilustrativas, la secuencia de nucleótidos heterólogos codifica anticuerpos monoclonales, preferentemente un anticuerpo monoclonal monocatenario o un anticuerpo monoclonal dirigido contra un antígeno canceroso o tumoral (por ejemplo, HER2/neu, y según se describe a continuación). Otras secuencias de nucleótidos heterólogos ilustrativascodifican productos de genes suicidas (timidincinasa, citosindesaminasa, toxina de la difteria, citocromo P450, desoxicitidincinasa y factor de necrosis tumoral), proteínas que confieren resistencia a un fármaco usado en la terapia del cáncer y productos génicos supresores de tumores.
Como una alternativa más, la secuencia de ácidos nucleicos heterólogo puede codificar un polipéptidoindicador (por ejemplo, una enzima como proteína fluorescente verde, fosfatasa alcalina).
Alternativamente, en formas de realización particulares de la invención, el ácido nucleico de interés puede codificar un ácido nucleico antisentido, una ribozima (por ejemplo, según se describe en la patente de EE.UU. nº 5.877.022), ARN que efectúan trans-empalme mediado por empalmosoma (véase Puttaraju y col., (1999) Nature Biotech. 17:246; patente de EE.UU. nº 6.013.487; patente de EE.UU. nº 6.083.702); ARN de interferencia (ARNi) que median el silenciamiento génico (véase Sharp y col., (2000) Science 287:2431) u otros ARN no traducidos, como ARN "guía" (Gorman y col., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929, patente de EE.UU. nº 5.869.248 para Yuan y col.), y similares.
El vector de parvovirus puede codificar también una secuencia de nucleótidos heterólogos que comparte homología y se recombina con un locus en el cromosoma hospedador. Este planteamiento puede utilizarse para corregir un defecto genético en la célula hospedadora.
La presente invención puede usarse también para expresar polipéptido inmunogénico en un sujeto, por ejemplo, para vacunación. El ácido nucleico puede codificar cualquier inmunógeno de interés conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, inmunógenos del virus de inmunodeficiencia humana, virus de la influenza, proteínas gag, antígenos tumorales, antígenos cancerosos, antígenos bacterianos, antígenos virales, y similares.
El uso de parvovirus como vacunas es conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Miyamura y col., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:8507; patente de EE.UU. nº 5.916.563 para Young y col., 5.905.040 para Mazzara y col., patente de EE.UU. nº 5.882.652, patente de EE.UU. nº 5.863.541 para Samulski y col. El antígeno puede presentarse en la cápside de parvovirus. Alternativamente, el antígeno puede expresarse a partir de un ácido nucleico heterólogo introducido en un genoma de vector recombinante. Cualquier inmunógeno de interés puede proporcionarse mediante el vector de parvovirus. Los inmunógenos de interés son bien conocidos en la técnica se incluyen, pero no se limitan a, inmunógenos del virus de inmunodeficiencia humana, virus de la influenza, proteínas gag, antígenos tumorales, antígenos cancerosos, antígenos bacterianos, antígenos virales, y similares.
Un polipéptido inmunogénico, o inmunógeno, puede ser cualquier polipéptido adecuado para proteger al sujeto frente a una enfermedad, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades microbianas, bacterianas, de protozoos, parasitarias y virales. Por ejemplo, el inmunógeno puede ser un inmunógeno de ortomixovirus (por ejemplo, un inmunógeno del virus de la influenza, como proteína superficial de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza o gen de nucleoproteína del virus de la influenza, o un inmunógeno del virus de la influenza equina), o un inmunógeno de lentivirus (por ejemplo, un inmunógeno del virus de la anemia infecciosa equina, un inmunógeno del virus de inmunodeficiencia de los simios (VIS), o un inmunógeno del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), como la proteína GP160 de envoltura de VIH o VIS, las proteínas de matriz/cápside de VIH o VIS y los productos génicos gag, pol y en de VIH o VIS). El inmunógeno puede ser también un inmunógeno de adenovirus (por ejemplo, inmunógeno del virus de la fiebre de Lassa, como el gen de la proteína de nucleocápside del virus de la fiebre de Lassa y el gen de glucoproteína de la envoltura de la fiebre de Lassa), un inmunógeno de poxvirus (por ejemplo, vaccinia, como genes L1 o L8 de vaccinia), un inmunógeno de flavivirus (por ejemplo, un inmunógeno del virus de la fiebre amarilla o un inmunógeno del virus de la encefalitis japonesa), un inmunógeno de filovirus (por ejemplo, un inmunógeno del virus del Ébola o un inmunógeno del virus de Marburg, como genes NP y GP), un inmunógeno de bunyavirus (por ejemplo, virus RVFV, CCHF y SFS), o un inmunógeno de coronavirus (por ejemplo, un inmunógeno de coronavirus humano infeccioso, como la envoltura de coronavirus humano, gen de glucoproteína o un inmunógeno del virus de la gastroenteritis transmisible porcina, o un inmunógeno del virus de la bronquitis infecciosa aviar). El inmunógeno puede ser además un inmunógeno de la polio, un antígeno del herpes (por ejemplo, inmunógenos de CMV,EBV, VHS), inmunógeno de las paperas, inmunógeno del sarampión, inmunógeno de la rubeola, inmunógeno de la toxina de la difteria u otros inmunógenos de difteria, antígeno de tos ferina, inmunógeno de hepatitis (por ejemplo, hepatitis A o hepatitis B), o cualquier otro inmunógeno de vacuna conocido en la técnica.
Alternativamente, el inmunógeno puede ser cualquier tumor antígeno de célula tumoral o cancerosa. Preferentemente, el antígeno tumoral o canceroso se expresa en la superficie de la célula cancerosa. Se describen ejemplos de antígenos de células cancerosas o tumorales en S.A. Rosenberg, (1999) Immunity 10:281). Otros antígenos cancerosos y tumorales ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, producto génico BRCA1, producto génico BRCA2, gp100, tirosinasa, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, \beta-catenina, MUM-1, Caspasa-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, antígenos tumorales de melanoma (Kawakami y col., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515); Kawakami y col., (1994) J. Exp. Med., 180:347); Kawakami y col., (1994) Cancer Res. 54:3124), incluyendo MART-1 (Coulie y col., (1991) J. Exp. Med. 180:35), gp100 (Wick y col., (1988) J. Cutan. Pathol. 4:201) y antígeno MAGE, MAGE-1, MAGE-2 y MAGE-3 (Van der Bruggen y col., (1991) Science, 254:1643); CEA, TRP-1, TRP-2, P-15 y tirosinasa (Brichard y col., (1993) J. Exp. Med. 178:489); productos génicos HER-2/neu (Pat. de EE.UU. nº 4.968.603), CA 125, LK26, FB5 (endosialina); TAG72, AFP, CAL19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN (antígeno sialil-Tn), proteínas c-erbB-2, PSA, L-CanAg, receptor de estrógeno, globulina de grasa láctea, proteína supresora de tumores p53 (Levine (1993) Ann. Rev. Biochem.62:623); antígenos de mucina (publicación de patente internacional WO 90/05.142); telomerasas; proteínas de matriz nuclear; fosfatasa ácida prostática; antígenos de virus de papiloma; y antígenos asociados con los siguientes cánceres: melanomas, metástasis, adenocarcinoma, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de colon, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer ovárico, cáncer de cuello de útero, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de páncreas y otros (véase, por ejemplo, Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91).
Alternativamente, la secuencia de nucleótidos heterólogos puede codificar cualquier polipéptido que se produce de forma deseable en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, los vectores de la invención pueden introducirse en células cultivadas y aislarse de las mismas el producto génico expresado.
Los expertos en la materia comprenderán que la secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogos de interés puede asociarse operativamente con secuencias de control asociadas. Por ejemplo, el ácido nucleico heterólogo puede asociarse operativamente con elementos de control de expresión, como señales de control de transcripción/traducción, orígenes de replicación, señales de poliadenilación y sitios de entrada de ribosomas internos (IRES), promotores, potenciadores y similares.
Los expertos en la materia observarán que puede usarse una diversidad de elementos promotores/potenciadores dependiendo del nivel y de la expresión específica de tejido deseada. El promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible, dependiendo del patrón de expresión deseado. El promotor/potenciador puede ser nativo o extraño y puede ser una secuencia natural o sintética. Por extraño se entiende que la región de iniciación transcripcional no se encuentra en el hospedador silvestre en el que se introduce la región de iniciación transcripcional.
Los elementos promotores/potenciadores que son nativos de la célula diana o el sujeto que va a recibir tratamiento tienen la máxima preferencia. También se prefieren elementos promotores/potenciadores que son nativos de la secuencia de ácidos nucleicos heterólogos. El elemento promotor/potenciador se elige de maner que actuará en la o las células diana de interés. También se prefieren los elementos promotores/potenciadores de mamíferos. El elemento promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible.
Se prefieren elementos de control de expresión inducibles en aquellas aplicaciones en que sean deseables para proporcionar regulación en la expresión de la o las secuencias de ácidos nucleicos heterólogos. Los elementos promotores/potenciadores inducibles para suministro de genes son preferentemente elementos promotores/potenciadores específicos de tejidos, e incluyen elementos promotores/potenciadores específicos de músculos (incluyendo músculo cardíaco, esquelético y/o liso), específicos de tejido neural (incluyendo específicos del encéfalo), específicos de hígado, específicos de médula ósea, específicos pancreáticos, específicos del bazo, específicos retinianos y específicos del pulmón. Otros elementos promotores/potenciadores inducibles incluyen elementos inducibles por hormonas e inducibles por metales. Los elementos promotores/potenciadores inducibles ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, un elemento de activación/desactivación Tat, un promotor inducible de RU486, un promotor inducible de ecdisona, un promotor inducible de rapamicina y un promotor de metalotioneína.
En formas de realización de la invención en las que la o las secuencias de ácidos nucleicos heterólogos se transcribirán y a continuación se traducirán en las células diana, se requieren en general señales de iniciación específicas para una traducción eficaz de secuencias de codificación de proteínas insertadas. Estas secuencias de control traduccional exógenas, que pueden incluir el codón de iniciación ATG, y secuencias adyacentes, pueden tener una diversidad de orígenes, tanto naturales como sintéticos.
Como una ventaja adicional, los vectores de parvovirus duplicados de la invención pueden distinguirse de los vectores de VAAr en que la orientación de la secuencia de codificación con respecto a la RT resoluble es fija y puede controlarse. Así, por ejemplo, la orientación y expresión del transgén puede controlarse con respecto a los posibles elementos de control transcripcional dentro de la RT resoluble. Por otra parte, el control sobre la orientación del transgén con respecto la RT no resoluble puede proporcionar un nivel de control superior sobre los productos de recombinación entre los genomas de los vectores de coinfección. Si el extremo cerrado del genoma (es decir, cercano a la RT no resoluble) o el extremo abierto es un sustrato preferido para recombinación intermolecular, la orientación de la secuencia de codificación dentro del producto de recombinación puede predecirse y controlarse.
Finalmente, a diferencia de los vectores de VAAr, los vectores de parvovirus duplicados de la presente invención son uniformes en el hecho de que empaquetan las cadenas positiva y negativa de una sola molécula. Esta característica es deseable desde el punto de vista de la producción de un reactivo de calidad clínica consistente.
Tecnología de transferencia génica
Los procedimientos de la presente invención también proporcionaron medios para suministrar secuencias de nucleótidos heterólogos en una amplia gama de células, incluyendo células de división y de no división. La presente invención puede emplearse para suministrar una secuencia de nucleótidos de interés a una célula in vitro, por ejemplo, para producir un polipéptido in vitro o para terapia génica ex vivo. Las células, formulaciones farmacéuticas y procedimientos de la presente invención son útiles además en un procedimiento para suministrar una secuencia de nucleótidos a un sujeto necesitado de la misma, por ejemplo, para expresar un polipéptido inmunogénico o terapéutico. De esta manera, el polipéptido puede producirse así in vivo en el sujeto. El sujeto puede necesitar el polipéptido porque el sujeto tiene una deficiencia del polipéptido o debido a que la producción del polipéptido en el sujeto puede impartir algún efecto terapéutico, como se explica en detalle más adelante.
En general, la presente invención puede emplearse para suministrar cualquier ácido nucleico extraño con un efecto biológico para tratar o mejorar los síntomas asociados con cualquier trastorno relacionado con la expresión génica. Los estados de enfermedad ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: fibrosis quística (y otras enfermedades del pulmón), hemofilia A,hemofilia B, talasemia, anemia y otros trastornos sanguíneos, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia y otros trastornos neurológicos, cáncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (por ejemplo, Duchenne, Becker), enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosindesaminasa, enfermedades de almacenamiento del glucógeno y otros defectos metabólicos, enfermedades degenerativas retinianas(y otras enfermedades oculares), enfermedades de órganos sólidos (por ejemplo, encéfalo, hígado, riñón, corazón) y similares.
La transferencia génica tiene un uso potencial sustancial en la comprensión y el suministro de terapia para estados de enfermedad. Existe una serie de enfermedades hereditarias en las que se conocen y se han clonado genes defectuosos. En general, los estados de enfermedad anteriores se encuadran en dos clases: estados de deficiencia, normalmente de enzimas, que son generalmente hereditarios de modo recesivo, y estados desequilibrados, que pueden afectar a proteínas reguladoras o estructurales, y que son normalmente hereditarios de modo dominante. En enfermedades de estados de deficiencia, la transferencia génica podría usarse para llevar un gen normal a tejidos afectados en terapia de sustitución, así como para crear modelos animales para la enfermedad usando mutaciones antisentido. En estados de enfermedad por desequilibrio, la transferencia génica podría usarse para crear una enfermedad, un estado en un sistema modelo, que a continuación podría usarse en esfuerzos para contrarrestar el estado de enfermedad. Según se usa en la presente memoria descriptiva, un estado de enfermedad se trata mediante remedio parcial o completo de la deficiencia o desequilibrio que causa la enfermedad o la agrava. También es posible el uso de recombinación específica del sitio de secuencias de ácidos nucleicos para causar mutaciones o corregir defectos.
La presente invención puede emplearse también para proporcionar un ácido nucleico antisentido a una célula in vitro. La expresión del ácido nucleico antisentido en la célula diana disminuye la expresión de una proteína particular por la célula. Los ácidos nucleicos antisentido pueden administrarse a células in vitro para regular la fisiología celular, por ejemplo, para optimizar los sistemas de cultivo de células o tejidos.
Finalmente, la presente invención encuentra uso además en procedimientos de diagnóstico y detección selectiva, por los que un gen de interés se expresa de forma transitoria o estable en un sistema de cultivo celular, o alternativamente, un modelo de animal transgénico.
En general, la presente invención puede emplearse para suministrar cualquier ácido nucleico heterólogo a una célula in vitro, ex vivo o in vivo.
Sujetos, formulaciones farmacéuticas, vacunas y modos de administración
La presente invención encuentra uso en aplicaciones médicas y veterinarias. Los sujetos adecuados para procedimientos de suministro de genes ex vivo según se describe anteriormente incluyen tanto aves como mamíferos, siendo preferidos los mamíferos. El término "aves" según se usa en la presente memoria descriptiva incluye, pero no se limita a, pollos, patos, gansos, codornices, pavos y faisanes. El término "mamífero" según se usa en la presente memoria descriptiva incluye, pero no se limita a, seres humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc. Los más preferidos son los sujetos humanos. Los sujetos humanos incluyen neonatos, lactantes, jóvenes y adultos.
En formas de realización particulares, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una partícula de virus de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, vehículos, adyuvantes, diluyentes, etc. Para inyección, el vehículo será normalmente un líquido. En otros procedimientos de administración, el vehículo puede ser sólido o líquido. Para administración por inhalación, el vehículo será respirable, y estará preferentemente en forma de partículas sólidas o líquidas. Como medio de inyección se prefiere usar agua que contiene los aditivos para soluciones de inyección, como agentes estabilizantes, sales o soluciones salinas y/o tampones.
En general, un vehículo fisiológicamente aceptable es aquel que no es tóxico ni indebidamente perjudicial para las células. Los vehículos fisiológicamente aceptables ilustrativos incluyen solución estéril, solución estéril y agua sin pirógenos y solución salina de tampón de fosfato sin pirógenos. Los vehículos fisiológicamente aceptables incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables.
Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es indeseable desde un punto de vista biológico u otro, es decir, el material puede administrarse a un sujeto sin causar efectos biológicos indeseables. Así, dicha composición farmacéutica puede usarse, por ejemplo, en transfección de una célula ex vivo.
Normalmente, las vacunas de la presente invención comprenden una cantidad inmunogénica de partículas de virus infecciosos según se desvela en la presente memoria descriptiva en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una "cantidad inmunogénica" es una cantidad de las partículas de virus infecciosos que es suficiente para evocar una respuesta inmunitaria en el sujeto. Normalmente, es adecuada una cantidad de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{15} partículas de virus, preferentemente de aproximadamente 10^{4} a aproximadamente 10^{10}, y más preferentemente de aproximadamente 10^{4} a 10^{6} partículas de virus por dosis, dependiendo de la edad y la especie del sujeto sometido a tratamiento, y del inmunógeno contra el cual se desee la respuesta inmunitaria. Los sujetos e inmunógenos son según se ha descrito anteriormente.
La presente invención proporciona además un procedimiento in vitro para suministrar un ácido nucleico a una célula. Normalmente, para procedimientos in vitro, el virus puede introducirse en la célula por procedimientos estándar de transducción viral, como se conoce en la técnica. Preferentemente, las partículas de virus se añaden a las células en la multiplicidad de infección apropiada según procedimientos estándar de transducción apropiados para las células diana en particular. Las valoraciones de virus que se administrarán puede variar dependiendo del tipo de célula diana tipo y del vector de virus en particular, y pueden determinarse por los expertos en la materia sin una experimentación innecesaria.
Los vectores de virus recombinantes se administran preferentemente a la célula en una cantidad biológicamente eficaz. Una cantidad "biológicamente eficaz" del vector del virus es una cantidad que es suficiente para provocar infección (o transducción) y expresión de la secuencia de ácidos nucleicos heterólogos en la célula.
La célula que se va a administrar al vector del virus de la invención puede ser de cualquier tipo, incluyendo, pero sin limitarse a, células neurales (incluyendo células de los sistemas nerviosos central y periférico, en particular, células encefálicas), células pulmonares, células retinianas, células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales del tracto digestivo y respiratorio), células musculares, células dendríticas, células pancreáticas (incluyendo células de islotes), células hepáticas, células miocárdicas, células óseas (por ejemplo, células madre de la médula ósea), células madre hematopoyéticas, células esplénicas, queratinocitos, fibroblastos, células endoteliales, células prostáticas, células germinales y similares. Alternativamente, la célula puede ser cualquier célula progenitora. Como una alternativa más, la célula puede ser una célula madre (por ejemplo, célula madre neural, célula madre hepática). Como una alternativa adicional más, la célula puede ser una célula cancerosa o tumoral. Por otra parte, las células pueden ser de cualquier especie de origen, según se indica anteriormente.
En formas de realización particulares de la invención, las células se extraen de un sujeto, y el vector de parvovirus se introduce en él.
Las células adecuadas para terapia génica ex vivo son según se ha descrito anteriormente.
Las células transducidas con el vector de la invención están preferentemente en una "cantidad terapéuticamente eficaz" en combinación con un vehículo farmacéutico. Una cantidad "terapéuticamente eficaz" según se usa en la presente memoria descriptiva es una cantidad que proporciona expresión suficiente de la secuencia de nucleótidos heterólogos suministrada por el vector para proporcionar alguna mejora o beneficio al sujeto. Dicho de forma alternativa, una cantidad "terapéuticamente eficaz" es una cantidad que proporcionará cierto alivio, mitigación o disminución en al menos un síntoma clínico en el sujeto. Los expertos en la materia observarán que los efectos terapéuticos no necesitan ser completos o curativos, siempre que proporcionen cierto beneficio al sujeto.
En formas de realización alternativas, células que se han transducido con un vector según la invención pueden usarse para provocar una respuesta inmunogénica contra el polipéptido suministrado. Normalmente, se usa una cantidad de células que expresan una cantidad inmunogénica del polipéptido en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una "cantidad inmunogénica" es una cantidad del polipéptido expresado que es suficiente para evocar una respuesta inmunitaria activa. El grado de protección conferido por la respuesta inmunitaria activa no necesita ser completo o permanente, siempre que los beneficios de administrar el polipéptido inmunogénico superen cualquier desventaja del mismo.
Las dosificaciones de las células variarán según la edad, condición y especie del sujeto, el tipo de célula, el ácido nucleico que se expresará por la célula y similares. Normalmente se usarán por dosis al menos de 10^{2} aproximadamente a 10^{8} aproximadamente, preferentemente de 10^{3} aproximadamente a 10^{6} células aproximadamente. Preferentemente, las células se usarán en una "cantidad terapéuticamente eficaz".
Los modos ilustrativos de uso de vectores virales incluyen administración oral, rectal, transmucosa, tópica, transdérmica, por inhalación, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular e intraarticular), y similares, así como inyección directa en el tejido u órgano, alternativamente, inyecciones intratecales, intramusculares directas, intraventriculares, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares. Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de inyección, o como emulsiones. Alternativamente, puede usarse el virus en una forma local, en lugar de sistémica como, por ejemplo, en una formulación de depot o de liberación sostenida.
El vector de parvovirus puede usarse para transducir cualquier célula o tejido permisivo. Las células adecuadas para transducción por los vectores de parvovirus de la invención son como se ha descrito anteriormente.
En formas de realización preferidas particularmente, la secuencia de nucleótidos de interés se usa para transducir el hígado del sujeto. El uso del vector para administración al hígado puede conseguirse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, administración intravenosa, administración intraportal, administración intrabiliar, administración intraarterial e inyección directa en el parénquima hepático.
En otras formas de realización preferidas, las partículas de parvovirus de la invención se usan para administración intramuscular, más preferentemente por inyección intramuscular o por administración local (según se define anteriormente). Se prefiere también el suministro al encéfalo. En otras formas de realización preferidas, las partículas de parvovirus de la presente invención se administran a los pulmones.
Los vectores de parvovirus desvelados en la presente memoria descriptiva pueden administrarse a los pulmones de un sujeto por cualquier medio adecuado, pero se usan preferentemente por suspensión en aerosol de partículas respirables compuestas por los vectores de parvovirus de la invención, que el sujeto inhala. Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden los vectores de parvovirus de la invención pueden producirse por cualquier medio adecuado, como, por ejemplo, con un nebulizador de aerosol impulsado por presión o un nebulizador ultrasónico, como conocen los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.501.729. Los aerosoles de partículas sólidas que comprenden los vectores de virus de la invención pueden producirse análogamente con cualquier generador de aerosol de medicamento en partículas, mediante técnicas conocidas en la técnica farmacéutica.
Las dosificaciones de las partículas de parvovirus de la invención dependerán del modo de administración, la enfermedad o dolencia que se va a tratar, la dolencia del sujeto individual, el vector de virus particular y el gen que se va a suministrar, y puede determinarse de manera rutinaria. Las dosis ilustrativas para conseguir efectos terapéuticos son valoraciones de virus de al menos aproximadamente 10^{5}, 10^{6}, 10^{7}, 10^{8}, 10^{9}, 10^{10}, 10^{11}, 10^{12}, 10^{13}, 10^{14}, 10^{15} unidades de transducción o más, preferentemente aproximadamente de 10^{8} a 10^{13} unidades de transducción, más preferentemente todavía 10^{12} unidades de transducción.
En formas de realización particulares, las partículas de parvovirus de la invención se usan como parte de un procedimiento para tratar el cáncer o tumores mediante agentes anticancerosos (por ejemplo, citoquinas) o un antígeno tumoral o canceroso. La partícula de parvovirus puede administrarse a una célula in vitro o usando procedimientos ex vivo, según se describe en la presente memoria descriptiva y se conoce en la técnica.
El término "cáncer" tiene el significado que se comprende en la técnica, por ejemplo, un crecimiento incontrolado de tejido que tiene el potencial de extenderse a lugares distantes del cuerpo (es decir, de metastatizar). Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, leucemias, linfomas, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer ovárico, melanoma y similares. El término "tumor" se conoce también en la técnica, por ejemplo, como una masa anormal de células indiferenciadas dentro de un organismo multicelular. Los tumores pueden ser malignos o benignos.
Se han descrito anteriormente los antígenos cancerosos y tumorales según la presente invención. Con el término "tratamiento del cáncer" se pretende decir que la gravedad del cáncer se reduce o que el cáncer se elimina al menos parcialmente. Preferentemente, estos términos indican que se reducen las metástasis del cáncer o se eliminan al menos parcialmente. Se prefiere además que estos términos indiquen que el crecimiento de nódulos metastásicos (por ejemplo, después de extirpación quirúrgica de un tumor primario) se reduce o se elimina al menos parcialmente. Con el término "prevención de cáncer" se pretende decir que los procedimientos de la invención eliminan al menos parcialmente o reducen la incidencia o aparición de cáncer. Dicho de forma alternativa, los presentes procedimientos ralentizan, controlan, reducen la probabilidad o eventualidad o retardan la aparición de cáncer en el sujeto.
Análogamente, con el término "tratamiento de tumores" se pretende decir que la gravedad del tumor se reduce o el tumor se elimina al menos parcialmente. Preferentemente, estos términos pretenden significar que la metástasis del tumor se reduce o se elimina al menos parcialmente. Se prefiere también que estos términos indiquen que el crecimiento de nódulos metastásticos (por ejemplo, después de extirpación quirúrgica de un tumor primario) se reduce o se elimina al menos parcialmente. Con el término "prevención de tumores" se pretende decir que los procedimientos de la invención eliminan al menos parcialmente o reducen la incidencia o aparición de tumores. Dicho de forma alternativa, los presentes procedimientos ralentizan, controlan, reducen la probabilidad o eventualidad o retardan la aparición de tumores en el sujeto.
En otras formas de realización, pueden extraerse células de un sujeto con cáncer o un tumor y ponerse en contacto con las partículas de parvovirus de la invención. La célula modificada se usa a continuación en el tratamiento, con lo que se provoca una respuesta inmunitaria contra el antígeno canceroso o tumoral. Este procedimiento se emplea particularmente de forma ventajosa en sujetos inmunocomprometidos que no pueden montar una respuesta inmunitaria suficiente in vivo (es decir, no pueden producir anticuerpos potenciadores en cantidades suficientes).
En la técnica se conoce que las respuestas inmunitarias pueden potenciarse mediante citoquinas inmunomoduladoras (por ejemplo, \alpha-interferón, \beta-interferón, \gamma-interferón, \omega-interferón, \tau-interferón, interleuquina-1\alpha, interleuquina-1\beta, interleuquina-2, interleuquina-3, interleuquina-4, interleuquina-5, interleuquina-6, interleuquina-7, interleuquina-8, interleuquina-9, interleuquina-10, interleuquina-11, interleuquina-12, interleuquina-13, interleuquina-14, interleuquina-18, factor de crecimiento de células B, ligando CD40, factor de necrosis tumoral \alpha, factor de necrosis tumoral \beta, proteína 1 quimioatrayente de monocitos, factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos y linfotoxina). En consecuencia, en formas de realización particulares de la invención, se usan citoquinas inmunomoduladoras (preferentemente, citoquinas inductivas de CTL) en conjunción con los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva para producir una respuesta inmunitaria o proporcionar inmunoterapia.
Pueden usarse citoquinas exógenas o, alternativamente, puede usarse una secuencia de nucleótidos que codifica una citoquina usando un vector adecuado, y producirse la citoquina in vivo.
Habiendo ahora descrito la invención, se ilustrará la misma con referencia a ciertos ejemplos, que se incluyen en la presente memoria descriptiva únicamente con fines de ilustración y que no pretenden ser limitativos de la invención.
Ejemplo 1
Materiales y procedimientos
Plásmidos. Se construyeron plásmidos de VAAr que expresan proteína fluorescente verde (GFP) a partir del pT_{RB}UF-2 descrito previamente (un regalo de Nick Muzyczka). Primero, se sustituyó la secuencia de codificación de GFP humanizada por la GFP potenciada (eGFP) (Clonetech) para crear el plásmido, pTR-CMV-GFPneo. Este plásmido generó el vector de VAAr-GFPneo. En segundo lugar, se suprimió el fragmento SalI que contiene la región de codificación neo y el promotor SV40 para crear pTR-CMV-GFP. El vector de este plásmido se refirió como VAAr-GFP en este informe.
El plásmido, p43mEpo, un regalo de Barry Byme, contenía el gen de eritropoyetina de ratón bajo el control del promotor CMV y generó un replicón de VAAr (VAArmEpo) de menos de la mitad de la longitud del VAA wt. Se preparó una versión mayor de este constructo (pmEpo-\lambda) insertando el fragmento HindIII de 2,3 kb desde el fago \lambda en un sitio ClaI entre la señal de poliadenilación y la repetición terminal VAA corriente abajo. El vector de VAAr-LacZ se generó a partir de pDX11-LacZ, que se ha descrito en otras fuentes (McCown y col., (1996) Brain Research 713:99).
Vectores virales. Los vectores virales se generaron en células 293 (de 10^{8} a 10^{9} células por preparado) por cotransfección de 3 plásmidos que contenían: 1) el constructo de VAAr específico, 2) los genes rep y cap de VAA (pACG) o 3) los genes auxiliares esenciales de adenovirus (pXX-6; Xiao y col., (1998) J. Virology 72:2224). En post-transfección de 40 h, se rasparon las células en los medios y se lisaron mediante tres ciclos de congelación-descongelación. Se incubaron los lisados a 37°C con 2 mg/ml de ADNasa I hasta que se dispersó el residuo floculento. Se aclararon los lisados por centrifugado y se precipitó VAAr usando sulfato de amonio (Snyder y col., Production of recombinant virus adeno-associated vectors. En: Dracopoli y col., editores. Current Protocols in Human Genetics. Nueva York: John Wiley & Sons Ltd.: 1996. pág. 12.1.1-12.2.23). Se volvió a suspender el virus ppt. con 8 ml de Tris 10 mM de pH 8,0, MgCl_{2} 1 mM y se añadió cloruro de cesio para alcanzar una densidad final de 1,4 g/cm^{3} y un volumen final de 12,5 ml. Se centrifugó la solución durante 36 h a 38 krpm en un rotorSW41. Se recogieron las fracciones (0,75 ml) mediante punción con una aguja hipodérmica en la base de cada tubo y bombeo del líquido a un colector de fracciones. Se guardaron los vectores a 4°C en cloruro de cesio.
Se extrajo ADN virión (ADNv) a partir de 10 \mul de cada fracción por digestión en reacciones de 50 \mul que contenían 0,4 mg/ml de proteasa K, sarcosil al 1% y EDTA 10 mM a 50°C durante 1 hora, seguido de extracción con fenol/cloroformo. Se diluyeron las muestras 3 veces con agua y se precipitó con etanol para análisis por electroforesis de gel de agarosa alcalina e hibridación por transferencia Southern.
Células e infecciones. Se cultivaron células HeLa y HEK 293 en medio DMEM que contenía FBS al 10% y Pen/Strep. Se diluyeron las reservas de vectores virales en medios antes de añadirlos a cultivos subconfluentes y dejarlos en las células hasta que se observó transducción de GFP por microscopia de fluorescencia a las 24 horas después de infección.
Para expresión de eritropoyetina en hígados de ratón, se inyectaron directamente en las venas portas de ratones Balb-c ByJ de 10 semanas de vida (Jackson Laboratory) 200 ml de solución salina normal que contenía 2 x 10^{10} partículas físicas de VAAr convencional o virus duplicado (VAAac). Se recogieron las muestras de sangre mediante flebotomía retroorbital en el momento de la infección y en intervalos de 7 días para determinación de hematocrito.
Ejemplo 2
Generación de vectores duplicados
Se usó un constructo de plásmido de VAAr (pTR-CMV-GFP), con un tamaño de replicón de 2.299 nucleótidos, para generar una reserva de vectores virales (VAAr-GFP) mediante procedimientos convencionales. El tamaño predicho de la forma dimérica replicativa de este vector fue de 4.474 nucleótidos. (Fig. 1 ), que fue del 95,6% de la longitud del genoma de VAA wt. Los vectores virales se fraccionaron mediante centrifugado de gradiente isopícnico en CsCl y se analizó el contenido de ADNv de cada fracción en geles de agarosa alcalina (Fig. 2). Se usaron exploraciones con PhosphoImager para cuantificar las bandas específicas de ADNv de cada fracción. En condiciones de desnaturalización, el ADN dímero autocomplementario (Fig. 2, panel a, fracciones 10 a 13) se extendió aproximadamente al doble de longitud del genoma monomérico. El material hibridante de las fracciones 2 a 4 es ADN de forma replicativa no empaquetada que se sedimenta en el fondo del gradiente. Aunque se incluyó una etapa de ADNasa en la purificación del vector (véanse procedimientos), el tratamiento no pretendía ser exhaustivo y este material demostró ser sensible a la ADNasa en experimentos posteriores, mientras que el material de las fracciones l0 a 14 era resistente a la ADNasa (datos no mostrados). Los vectores que contenían principalmente genomas de ADN dimérico (fracciones 10 y 11) se designaron como virus duplicados o "autocomplementarios" (VAAac). La estructura de repetición invertida de estas moléculas se confirmó mediante digestión por enzimas de restricción (datos no mostrados).
Se generaron y purificaron en paralelo dos vectores adicionales de VAAr (Fig. 1), y se analizaron del mismo modo (Fig. 2, paneles b y c). El primero, VAAr-GFPneo, contenía un gen neo, además de GFP, y tenía una longitud de genoma replicante de 3.398 nucleótidos. Esto significaba el 72,6% del tamaño del genoma de VAA wt, y era demasiado grande para ser empaquetado como un dímero. El segundo era un constructo de VAAr-CMV-LacZ de 4.898 nucleótidos, que era ligeramente mayor (104,7%) que el tamaño del genoma de VAA wt, pero dentro del límite para un empaquetamiento eficaz (Dong y col., (1996) Human Gene Therapy 7:2101). El material hibridante de menor densidad y más alta movilidad de las fracciones 14 y 15 (Fig. 2, panel c) comprendía genomas que habían sufrido deleciones y estas fracciones no se usaron en experimentos posteriores.
Ejemplo 3
Transducción con vectores duplicados frente a monoméricos y efectos de coinfección de Ad
Se comparó la eficacia de transducción del VAAac-GFP (Fig. 2, panel a, fracción 11) con el monómero homólogo (fracción 13), así como los vectores GFPneo y LacZ (Fig. 2, paneles b y c, fracciones 13 y 12, respectivamente) en células HeLa infectadas a baja multiplicidad (Fig. 3). Se calcularon los números de partículas a partir de las señales específicas de PhosphoImager de ADNv de longitud completa en cada fracción en la transferencia Southern, después de corrección para número de copias de ADN monomérico frente a dimérico. Así, cada virus duplicado contiene dos copias del transgén como una sola molécula, en la orientación de repetición invertida, mientras que cada partícula monomérica contiene una copia monocatenaria.
El vector de VAAac-GFP (fracción 11), que contiene aproximadamente el 90% de virus dímero, produjo una proporción de 5,9:1 entre partículas físicas y unidades de transducción, confirmando así la predicción de alta eficacia de transducción. La fracción 13 del mismo gradiente, que contiene inversamente aproximadamente del 80 al 90% de virus monomérico, tenía una proporción de 24,6:1 entre partículas y unidades de transducción. Esta diferencia cuádruple en la eficacia representaba una diferencia mínima cuando se consideraba que la contaminación de dímeros en la fracción de monómeros tendría un impacto mayor en su potencial de transducción que lo que contribuiría el componente de monómeros a la fracción de dímeros. En contraste, los vectores de ADNmc monomérico GFPneo y LacZ tenían proporciones entre partículas y unidades de transducción de 125:1 y 828:1, respectivamente, comparable a eficacias comunicadas previamente para estos vectores (Fisher y col., (1996) J. Virology 70:520; Zolotukhin y col., (1999) Gene Therapy 6:973).
La eficacia de transducción de vectores de VAAr convencionales puede potenciarse enormemente (hasta 100 veces) por coinfección con Ad, o por tratamiento con agentes que deterioran el ADN u otros tipos de estrés celular. Esta potenciación se ha asociado con la transformación mediada por células del genoma de ADNmc en plantillas de transcripción de ADNbc activas. Como el vector duplicado contiene las dos cadenas complementarias empaquetadas en una sola molécula, se ha predicho que la transducción sería independiente de la potenciación por adenovirus. Tal era el caso sobre todo cuando se coinfectaban células HeLa con los vectores duplicados y 5 unidades infecciosas por célula de adenovirus (Fig. 3). El número de células GFP positivas en los cultivos infectados por virus duplicados se incrementó en sólo 1,6 veces, un efecto que podría atribuirse a los efectos transcripcionales de la infección por adenovirus en la actividad del promotor de CMV como se ha comunicado previamente (Clesham y col., (1998) Gene Therapy 5:174; Loser y col., (1998) J. Virology 72:180). La velocidad de transducción de vector monomérico aumentó 2,4 veces por coinfección con Ad, mientras que los vectores GFPneo y LacZ se indujeron 6,0 y 12,8 veces, respectivamente.
En suma, en células HeLa cultivadas, el vector duplicado tenía una eficacia de más de cuatro veces más que el vector homólogo que contenía sólo un genoma de ADNmc monomérico. Esta diferencia sería probablemente mayor si no fuera por la contaminación del 10 al 20%, aproximadamente, de fracciones de monómero con vectores de dímero. En consonancia con esta interpretación, el vector duplicado era 20 veces más eficaz que un vector de VAAr-GFPneo convencional y 140 veces más eficaz que un vector de VAAr-LacZ.
Ejemplo 4
Transducción con vectores duplicados en ausencia de síntesis de ADN de células hospedadoras
Como el ADNv de los vectores duplicados contenía las dos cadenas de ADN en una sola molécula, permitiendo una rehibridación eficaz después de desprotección, se predijo que estos vectores podrían obviar el papel de síntesis de ADN de células hospedadoras en transducción. Se comparó el vector de VAAac-GFP con el monómero homólogo, y el vector GFPneo, en células HeLa pretratadas con hidroxiurea (HU) 24 horas antes de infección para inhibir la síntesis de ADN de células hospedadoras. Se continuó con el tratamiento de hidroxiurea, sin interrupción, en las mismas concentraciones después de infección y se mantuvo en las células durante las 24 horas siguientes, hasta que se valoró la transducción GFP.
Se estimuló la transducción desde el VAAac-GFP hasta 1,9 veces en respuesta a las crecientes concentraciones de HU (Fig. 4). Esta estimulación, similar en magnitud a la observada con coinfección de Ad, estuvo afectada probablemente por una combinación de transactivación transcripcional del promotor CMV provocada por estrés celular, y por la acumulación de GFP en las células de no división. En contraste, la transducción a partir de la fracción del vector de monómero homólogo se estimuló en la mínima concentración de HU y se inhibió a concentraciones superiores. La actividad de transducción residual del vector monomérico a concentraciones de HU superiores, a un nivel aproximadamente 5 veces menor que el de la fracción de virus duplicado, es coherente con la contaminación del 10 al 20% de las fracciones de monómero con partículas que contienen dímero (Fig. 2, panel a). La transducción del vector de VAAr-GFPneo se inhibió más de 10 veces en las mismas condiciones. Se obtuvieron resultados idénticos por tratamiento con afidicolina, un inhibidor específico de polimerasa \alpha/\delta (Fig. 4, panel, b). Esto confirmó la hipótesis de que la transducción de vectores duplicados era independiente de la síntesis de ADN de células hospedadoras.
Ejemplo 5
Transducción de vectores duplicados in vivo
Se usó un indicador diferente para la comparación de la eficacia de VAAr monocatenario convencional in vivo. El constructo productor de dímero contenía sólo el gen de eritropoyetina de ratón (mEpo) transcrito desde el promotor CMV. El tamaño del elemento replicante de este vector mínimo fue de 2.248 nucleótidos. La forma dimérica de esta molécula, de 4.372 nucleótidos de longitud (Fig. 1), fue del 93% del tamaño del genoma de VAA wt, y se empaquetó fácilmente. Un segundo constructo contenía el transgén idéntico, con la adición de una secuencia heteróloga corriente abajo (fago \lambda) para llevar el tamaño del vector recombinante a 4.570 nucleótidos, o el 98% del tamaño del genoma de VAA wt. Los estudios previos han usado el ADN de fago lambda como relleno sin efectos nocivos en el vector (Muzyczka y col., (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97). Ambos vectores se purificaron por cromatografía de heparina-agarosa. El vector más pequeño se purificó además en un gradiente de CsCl para aislar ADN dimérico que contenía viriones (no mostrado). Se cuantificaron las dos pilas de vectores usando transferencias Southern a partir de geles de agarosa alcalina para determinar el número de ADN que contenía partículas. En este caso, aproximadamente el 25% de las partículas de la fracción dímera contenía dos genomas de monómero independientes. Como éstos no podían separarse del dímero verdadero por densidad, y dado que su comportamiento no se ha caracterizado, se contaron como partículas de dímero, con fines de comparación con el vector de longitud completa, de manera que el efecto de dímero sólo podía subestimarse, más que sobreestimarse.
Se administraron números iguales de partículas físicas de VAAr (2x 10^{10} por animal en 200 \mul de solución salina normal) a ratones por inyección en la vena porta. Se evaluó la expresión del gen mEpo observando los cambios en el hematocrito en intervalos de 7 días. Los ratones de control recibieron inyecciones salinas intraportales o no fueron operados, sino flebotomizados en intervalos de 7 días. Los ratones que recibieron los vectores duplicados respondieron con un rápido aumento en el hematocrito (Fig. 5), y con aumentos continuados en las siguientes dos semanas. Considerando el tiempo de latencia entre la expresión de eritropoyetina y la producción de glóbulos rojos, esto sugería que el vector duplicado se expresó en niveles altos en la primera semana. Los ratones que recibieron el vector de
ADNmc de longitud completa no muestran un aumento significativo en el hematocrito hasta 21 días después de inyección, y no alcanzaron niveles comparables a los animales tratados con vectores duplicados en el curso del experimento.
La infección de ratones con VAAac-mEpo lleva a una respuesta más rápida, y a un mayor aumento en el hematocrito, que el vector ADNmc de longitud completa que transporta el mismo gen. Estos resultados apoyan las observaciones de los autores de la invención en células cultivadas y es coherente con la visión de que los vectores diméricos son propensos a expresar el transgén inmediatamente después de la desprotección y la entrada en el núcleo. Los niveles de expresión superiores alcanzados en última instancia pueden reflejar la incapacidad de muchas células infectadas de formar ADNbc a partir de VAAr convencional y/o la pérdida/degradación de ADNvmc antes de la formación de dúplex (Miao y col., (1998) Nature Genetics 19:13).
Como hemos demostrado por pretratamiento de células con HU, la transducción con el vector de VAAac es independiente de la síntesis de ADN de células hospedadoras. La capacidad de transducir células en ausencia de síntesis de ADN representa un punto de partida fundamental en la biología de los vectores de VAAac a partir del virus progenitor, permitiéndole actuar en circunstancias en las que los vectores de VAAr convencionales fracasarían. Ciertos tipos de células son extremadamente ineficaces para transducción de VAAr, debido ostensiblemente a la incapacidad para sintetizar o remitir una cadena complementaria (Fisher y col., (1996) J. Virology 70:520; Alexander y col., (1996) Human Gene Therapy 7:841; Miao y col., (1998) Nature Genetics 19:13). El VAAac no sufre esta limitación y puede usarse con genes marcadores para determinar directamente si una célula es permisiva para transducción de VAAr en todas las demás etapas al margen de la síntesis de ADN.
Con independencia de la capacidad de la célula diana de formar la cadena complementaria de VAAr, está claro que estos reactivos proporcionan un sistema de suministro de VAA alternativo para genes que pueden requerir una aparición rápida. Aún es más importante el hecho de que los datos de los autores de la invención sugieren que los vectores de VAAac alcanzan niveles globales más altos de producto terapéutico cuando se administra un número idéntico de partículas. Así, los vectores de VAAac demostrarán su utilidad cuando se requiera una respuesta más oportuna, robusta o cuantitativa a la dosis de vector. El potencial para alcanzar niveles críticos de expresión transgénica a dosis mínima es importante también en cuanto a los requisitos de producción de vectores para ensayos clínicos y para reducir al mínimo la exposición del paciente al virus.
Ejemplo 6
Sustratos mejorados para producir vectores de parvovirus duplicados
Para perfeccionar la producción de reservas de vectores duplicados, y para eliminar las complicaciones de las poblaciones mixtas de genomas dúplex y de monómero, se creó un vector mutante que genera sólo genomas de dímeros (Figura 6). Este constructo tiene una mutación en una RT, de manera que se suprime la del sitio de mella Rep (srt), mientras que la otra RT es silvestre. El efecto es que la replicación en horquilla rodante se inicia en el extremo wt del genoma, avanza a través del extremo mutante sin resolución terminal, y a continuación retrocede por el genoma de nuevo para crear el dímero. El producto del extremo es un genoma autocomplementario con la RT mutante en el centro y las RT wt en cada extremo. La replicación y empaquetamiento de esta molécula tiene lugar a continuación de forma normal a partir de las RT wt, con la salvedad de que en cada vuelta se mantiene la estructura dimérica.
Se han generado reservas de vectores de VAAr-CMV-GFP-Hpa-srt y VAAr-CMV-mEpo-Hpa-srt usando este sustrato mutante y analizando los productos en gradientes de CsCl como anteriormente (Figura 7). Estos constructos producen aproximadamente el 90% de vectores duplicados. Esto permitirá rendimientos superiores del vector de parvovirus duplicado y el uso de purificación de yodixano/heparina para estos vectores sin la etapa adicional de purificación de gradiente de densidad de CsCl.
El constructo de plásmido usado para generar estos vectores contenía una deleción en la RT de 5', con respecto a la cadena de codificación del transgén expresado. Esta deleción incluye todo el elemento D y 3 pb del elemento A, extendiendo así el sitio de mella (Figura 6). Todas las secuencias de VAA entre el resto del elemento A y el transgén se suprimen. Se impide así la recombinación homóloga entre secuencias que flanquean la RT mutada y la RT wt, reduciendo así la posibilidad de conversión génica según describen Samulski y col., (1983) Cell 33:135. Esta deleción se construyó mediante corte en sitios de restricción únicos inmediatamente en 5' con respecto al transgén (KpnI) y dentro del gen Amp de las secuencias de plásmidos bacterianos (XmnI). El fragmento extraído, que contiene una RT, se sustituyó por un fragmento de un segundo plásmido de VAAr, que se ha cortado en el mismo sitio en el gen Amp, y en un sitio HapI sintético insertado previamente en el sitio BalI a la izquierda de la unión A/D.
En una forma de realización alternativa, se genera una plantilla para producir preferentemente vector duplicado con una RT de VAA en un extremo y se produce una RT de VAA modificada por inserción de una secuencia en la RT. En una forma de realización particular, se usa el plásmido de VAA wt psub201 para producir esta plantilla (Samulski y col., (1987) J. Virology 61:3096). Este constructo contiene un par único de sitios XbaI, así como sitios PvuII flanqueando a las RT virales. Dos productos intermedios de plásmidos de VAA obtenidos de psub201, Hpa7 y Hpa9 tienen un ligador HpaI único (CCAATTGG)insertado en el sitio BalI entre el nucleótido 121 y el 122 (Hpa9) y entre el 4.554 y el 4.555 (Hpa7) en la secuencia de RT del genoma de VAA, respectivamente (Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration"; tesis doctoral, Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA). La inserción de estos ligadores desplaza el sitio de mella de VAA wt hacia dentro alejándolo de la posición nativa, con el resultado de una incapacidad que ha de resolverse por la proteína Rep de VAA después de replicación.
Estos sustratos acumulan un producto intermedio dimérico hasta que tiene lugar la conversión génica. La digestión de Hpa7 o Hpa9 con enzima de restricción HPaI más digestión parcial con XbaI tiene como resultado una nueva RT que carece del sitio de mella de VAA wt, así como del elemento D (desde la izquierda para Hpa9 y desde la derecha para Hpa7). Este sustrato no es adecuado para conversión génica según describen Samulski y col., (1983) Cell 33:135, debido a la ausencia del elemento D, y continúa para acumular un producto intermedio de replicación dimérica después de infección viral. Cuando se parte de una molécula que tiene el tamaño de la mitad o menos del genoma de VAA wt, este producto intermedio se empaqueta preferentemente mediante cápsides de VAA. Estas moléculas son diméricas en forma (unidas covalentemente a través de la RT modificada), más específicamente, dado que son autocomplementarias, proporcionan una fuente única de vectores de parvovirus que transportan sustratos bicatenarios. Estas partículas de vectores sortean la etapa de limitación de velocidad requerida para todos los vectores de VAA usados en la actualidad, es decir, en la síntesis de segunda cadena (véase Ferrari y col. (1996) J. Virology 70:3227-34).
Ejemplo 7
Transducción de células dendríticas
Se ha postulado que las células dendríticas (CD) desempeñan papeles importantes en la presentación de antígenos y el inicio de varias respuestas inmunitarias dependientes de células T. Las CD han demostrado ser células de presentación de antígenos (CPA) más potentes que los macrófagos o monocitos. Por otra parte, se ha comunicado que las CD estimulan la proliferación de células T con una eficacia hasta diez veces superior que los monocitos (Guyre y col., (1997) Cáncer Immunol. Immunother. 45:146, 147 col. 2). En consecuencia, se han hecho numerosos esfuerzos para diseñar vectores para células dendríticas de manera que se produzca una respuesta inmunitaria más eficaz. Previamente se ha comunicado que las CD son refractarias a vectores de VAA (Jooss y col., (1998) J. Virology 72:4212).
Se obtuvieron las CD de dos pacientes humanos y se cultivaron in vitro. Se transdujeron las células de cada paciente con vector de VAAwt-GFP o pHpa7GFP (vector duplicado, descrito en el Ejemplo 1) a una MDI de 10. No se detectó expresión de GFP en células transducidas con VAAwt-GFP después de 7 días. En contraste, se observó expresión de GFP entre el 5 y el 15% de CD transducidas con vector pHpa7GFP dimérico.
Estos resultados sugieren que la etapa limitadora para transducción de VAA wt de CD se sitúa en el nivel de la capacidad de las células hospedadoras para medirla en la síntesis de la segunda cadena. Los vectores de parvovirus de la invención parecen obviar esta etapa al proporcionar la célula con un sustrato bicatenario. En consecuencia, los vectores de parvovirus diméricos de la invención tienen un tropismo (por ejemplo, más amplio) y un intervalo de células diana diferentes que los vectores de VAA wt.
Ejemplo 8
Administración in vivo de pHpa7GFP
Para evaluar el tropismo de los vectores duplicados in vivo, se administra a ratones por vía intramuscular (im) aproximadamente 1,5 x 10^{11} de los vectores de VAAwt-GFP o pHpa7GFP descritos en el Ejemplo 7. En varios momentos después de la administración (por ejemplo, 4, 8, 16, 32, 64 días, etc.), se sacrificaron ratones y se realizaron autopsias para determinar la expresión transgénica en varias células hospedadoras y tejidos. Se evaluaron también el inicio, la cinética y la persistencia de expresión y se compararon con los vectores bicatenarios y de VAA wt. Son de particular interés las células que son normalmente refractarias a los vectores de VAA wt, como las células madre de médula ósea, los astrocitos y las células epiteliales pulmonares. También son de interés células no replicantes o de replicación lenta que soportan de forma ineficaz la síntesis de VAA de la segunda cadena como células de músculos, hígado y del sistema nervioso central.

Claims (90)

1. Una partícula de parvovirus duplicado que comprende:
una cápside de parvovirus
un genoma de vector que comprende en la dirección 5' a 3':
(i)
una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 5';
(ii)
una primera secuencia de nucleótidos heterólogos;
(iii)
una secuencia de repetición terminal de parvovirus no resolubles;
(iv)
una secuencia de nucleótidos heterólogos separada que es en esencia completamente complementaria a dicha primera secuencia de nucleótidos heterólogos; y
(v)
una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 3';
en la que dicho genoma de vector es capaz en condiciones apropiadas de apareamiento de bases intracadena entre las secuencias de nucleótidos heterólogos después de liberación desde la cápside de parvovirus.
2. Una partícula de parvovirus duplicado que comprende:
una cápside de parvovirus
un genoma de vector que comprende en la dirección 5' a 3:
(i)
una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 5';
(ii)
una primera secuencia de nucleótidos heterólogos;
(iii)
una secuencia de repetición terminal de parvovirus no resolubles;
(iv)
una secuencia de nucleótidos heterólogos separada; y
(v)
una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 3';
en la que las secuencias de nucleótidos entre cada secuencia de repetición terminal y la secuencia de repetición terminal no resoluble son complementarias entre sí en al menos el 90%, y en la que además dicho genoma de vector es capaz en condiciones apropiadas de apareamiento de bases intracadena entre la secuencia de nucleótidos heterólogos después de liberación desde la cápside de parvovirus.
3. La partícula de parvovirus duplicado de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dichas secuencias de repetición terminal de parvovirus son secuencias de repetición terminal de virus adenoasociado (VAA).
4. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 3, en la que dichas secuencias de repetición terminal de VAA se seleccionan del grupo que consiste en secuencias de repetición terminal de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6.
5. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 4, en la que dichas secuencias de repetición terminal de VAA son secuencias de VAA2.
6. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble es una secuencia de repetición terminal de VAA no resoluble.
7. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el sitio de resolución terminal (srt) se suprime de la secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble.
8. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 7, en la que en esencia todos los elementos D se suprimen de dicha secuencia de repetición terminal no resoluble.
9. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 8, en la que la deleción en el elemento D de la secuencia de repetición terminal no resoluble se extiende por toda la unión A/D en el elemento A.
10. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble comprende una inserción en el elemento D.
11. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 10, en la que la inserción en el elemento D es en la secuencia del sitio de resolución terminal (srt).
12. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble comprende una o más sustituciones de bases de nucleótidos en la secuencia del sitio de resolución terminal (srt).
13. El parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble es una secuencia de repetición terminal de un serotipo de VAA que no se reconoce por proteínas Rep de VAA2 o es una secuencia de repetición terminal de un parvovirus autónomo que no se reconoce por proteínas Rep de VAA.
14. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el genoma de vector tiene aproximadamente el tamaño del genoma adenoasociado (VAA) silvestre.
15. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que se codifica un polipéptido por el genoma de vector.
16. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 15, en la que el polipéptido es un polipéptido terapéutico.
17. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 15, en la que el polipéptido es un polipéptido inmunogénico.
18. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 16, en la que el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en endostatina, angiostatina, superóxido-dismutasa, eritropoyetina, un anticuerpo monoclonal, Factor IX, Factor X, una enzima lisosómica que incluye hexosaminidasa A e iduronato-sulfatasa, globina, leptina, catalasa, tirosinhidroxilasa, una citoquina que incluye \alpha- interferón, \beta-interferón, interferón-\gamma, interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-12, factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos y linfotoxina, un factor u hormona de crecimiento peptídico que incluye somatotropina, insulina, factores de crecimiento de tipo insulínico 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico 3 y 4, factor neurotrófico derivado del encéfalo, factor neurotrófico derivado de la glía, factor de crecimiento transformante \alpha y \beta, un receptor que incluye receptor de factor de necrosis tumoral, un producto de genes suicidas que incluye timidincinasa, citosindesaminasa, toxina de la difteria, citocromo P450, desoxicitidincinasa y factor de necrosis tumoral, una proteína que confiere resistencia a un fármaco de terapia contra el cáncer y un producto génico supresor de tumor.
19. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 16, en la que el polipéptido es un antígeno canceroso o tumoral.
20. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 16, en la que el polipéptido es un antígeno bacteriano, antígeno viral, antígeno de protozoos o antígeno parasitario.
21. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el genoma de vector codifica un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un ARN que efectúa trans-empalme mediado por empalmosoma, un ARN de interferencia (ARNi), un ARN de guía.
22. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la que dicha cápside de parvovirus es una cápside de virus adenoasociado (VAA).
23. La partícula de parvovirus duplicado de la reivindicación 22, en la que dicha cápside de parvovirus se selecciona del grupo que consiste en una cápside de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6.
24. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que dicha cápside de parvovirus es una cápside de virus adenoasociado (VAA) y dichas secuencias de repetición terminal de parvovirus en 5' y 3' son secuencias de repetición terminal de VAA.
25. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en la que las secuencias de nucleótidos heterólogos duplicados formados por apareamiento de bases intracadena se asocian operativamente con un elemento promotor o potenciador.
26. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en la que la dirección de transcripción es hacia la secuencia de repetición terminal no resoluble.
27. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en la que la dirección de transcripción se aleja de la secuencia de repetición terminal no resoluble.
28. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en la que las secuencias de nucleótidos entre cada secuencia de repetición terminal y la secuencia de repetición terminal no resoluble son en esencia completamente complementarias entre sí.
29. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en la que la partícula de parvovirus duplicado es una partícula de parvovirus híbrida.
30. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en la que la partícula de parvovirus duplicado es una partícula de parvovirus quimérica.
31. La partícula de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en la que la partícula de parvovirus duplicado es una partícula de parvovirus diana.
32. Una formulación farmacéutica que comprende una pluralidad de las partículas de parvovirus duplicado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
33. Un ácido nucleico que comprende una plantilla para producir un ADN virión, comprendiendo la plantilla una secuencia de nucleótidos heterólogos flanqueada por una secuencia de repetición terminal de parvovirus y una secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble.
34. El ácido nucleico de la reivindicación 33, en el que dicha secuencia de repetición terminal de parvovirus es una secuencia de repetición terminal de virus adenoasociado (VAA).
35. El ácido nucleico de la reivindicación 34, en el que dicha secuencia de repetición terminal de VAA se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de repetición terminal de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6.
36. El ácido nucleico de la reivindicación 35, en el que dicha secuencia de repetición terminal de VAA es una secuencia de VAA2.
37. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en el que dicha secuencia de repetición terminal no resoluble es una secuencia de repetición terminal de VAA no resoluble.
38. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, en el que el sitio de resolución terminal (srt) se suprime de la secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble.
39. El ácido nucleico de la reivindicación 38, en el que en esencia todos los elementos D se suprimen de dicha secuencia de repetición terminal no resoluble.
40. El ácido nucleico de la reivindicación 39, en el que la deleción en el elemento D de la secuencia de repetición terminal no resoluble se extiende por la unión A/D en el elemento A.
41. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, en el que la secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble comprende una inserción en el elemento D.
42. El ácido nucleico de la reivindicación 41, en el que la inserción en el elemento D es en la secuencia del sitio de resolución terminal (srt).
43. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, en el que la secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble comprende una o más sustituciones de bases de nucleótidos en la secuencia del sitio de resolución terminal (srt).
44. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 43, en el que la secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble es una secuencia de repetición terminal de un serotipo de VAA que no se reconoce por proteínas Rep de VAA2 o una secuencia de repetición terminal de un parvovirus autónomo que no se reconoce por proteínas Rep de VAA.
45. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 44, en el que la plantilla tiene aproximadamente la mitad del tamaño del genoma del virus adenoasociado (VAA) silvestre.
46. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 45, en el que la secuencia de nucleótidos heterólogos o una secuencia complementaria de la misma es una secuencia de codificación para un polipéptido.
47. El ácido nucleico de la reivindicación 46, en el que el polipéptido es un polipéptido terapéutico.
48. El ácido nucleico de la reivindicación 46 en el que el polipéptido es un polipéptido inmunogénico.
49. El ácido nucleico de la reivindicación 47, en el que el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en endostatina, angiostatina, superóxido-dismutasa, eritropoyetina, un anticuerpo monoclonal, Factor IX, Factor X, una enzima lisosómica que incluye hexosaminidasa A e iduronato-sulfatasa, globina, leptina, catalasa, tirosinhidroxilasa, una citoquina que incluye \alpha-interferón, \beta-interferón, interferón-\gamma, interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-12, factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos y linfotoxina, un factor u hormona de crecimiento peptídico que incluye somatotropina, insulina, factores de crecimiento de tipo insulínico 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico 3 y 4, factor neurotrófico derivado del encéfalo, factor neurotrófico derivado de la glía, factor de crecimiento transformante \alpha y \beta, un receptor que incluye receptor de factor de necrosis tumoral, un producto de genes suicidas que incluye timidincinasa, citosindesaminasa, toxina de la difteria, citocromo P450, desoxicitidincinasa y factor de necrosis tumoral, una proteína que confiere resistencia a un fármaco de terapia contra el cáncer y un producto génico supresor de tumor.
50. El ácido nucleico de la reivindicación 47, en el que el polipéptido es un antígeno canceroso o tumoral.
51. El ácido nucleico de la reivindicación 47, en el que el polipéptido es un antígeno bacteriano, antígeno viral, antígeno de protozoos o antígeno parasitario.
52. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 45, en el que la secuencia de nucleótidos heterólogos o una secuencia complementaria de la misma codifica un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un ARN que efectúa trans-empalme mediado por empalmosomas, un ARN de interferencia (ARNi), un ARN de guía.
53. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 52, en el que el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, vector de ADN desnudo, cromosoma artificial bacteriano (BAC), cromosoma artificial de levadura (YAC) o un vector viral.
54. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 53, en el que el ácido nucleico se incorpora de manera estable en el cromosoma de una célula de mamífero.
55. Un ADN virión producido a partir del ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 54.
56. Un ácido nucleico que comprende una plantilla dimérica para producir un ADN virión, comprendiendo la plantilla en la dirección 5' a 3':
una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 5';
una primera secuencia de nucleótidos heterólogos;
una secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble;
una secuencia de nucleótidos heterólogos separada que es en esencia completamente complementaria a dicha primera secuencia de nucleótidos heterólogos; y
una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 3';
en el que dicho ADN virión es capaz en condiciones apropiadas de apareamiento de bases intracadena entre las secuencias de nucleótidos heterólogos después de liberación de la cápside de parvovirus.
57. Un ácido nucleico que comprende una plantilla dimérica para producir un ADN virión, comprendiendo la plantilla en la dirección 5' a 3':
una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 5';
una primera secuencia de nucleótidos heterólogos;
una secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble;
una secuencia de nucleótidos heterólogos separada; y
una secuencia de repetición terminal de parvovirus en 3';
en el que las secuencias de nucleótidos entre cada secuencia de repetición terminal y la secuencia de repetición terminal no resoluble son complementarias entre sí en al menos el 90%; y en la que además dicho genoma de vector es capaz en condiciones apropiadas de apareamiento de bases intracadena entre las secuencias de nucleótidos heterólogos después de liberación desde la cápside de parvovirus.
58. El ácido nucleico de la reivindicación 56 ó 57, en el que dichas secuencias de repetición terminal de parvovirus en 5' y 3' son secuencias de repetición terminal de virus adenoasociado (VAA).
59. El ácido nucleico de la reivindicación 58, en el que dichas secuencias de repetición terminal de VAA se seleccionan del grupo que consiste en secuencias de repetición terminal de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y VAA6.
60. La secuencia de nucleótidos de la reivindicación 59, en la que dichas secuencias de repetición terminal de VAA son secuencias de VAA2.
61. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56 a 60, en el que dicha secuencia de repetición terminal no resoluble es una secuencia de repetición terminal de VAA no resoluble.
62. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56 a 61, en el que el sitio de resolución terminal (srt) se suprime de la secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble.
63. El ácido nucleico de la reivindicación 62, en el que en esencia todos los elementos D se suprimen de dicha secuencia de repetición terminal no resoluble.
64. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56 a 63, en el que la secuencia de repetición terminal de parvovirus no resoluble es una secuencia de repetición terminal de un serotipo de VAA que no se reconoce por proteínas Rep de VAA2 o es una secuencia de repetición terminal de un parvovirus autónomo que no se reconoce por proteínas Rep de VAA.
65. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56 a 64, en el que la plantilla tiene aproximadamente el tamaño del genoma adenoasociado (VAA) silvestre.
66. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56 a 65, en el que la plantilla codifica un polipéptido.
67. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56 a 65, en el que la plantilla codifica un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un ARN que efectúa trans-empalme mediado por empalmosoma, un ARN de interferencia (ARNi), un ARN de guía.
68. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56 a 67, en el que el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, vector de ADN desnudo, cromosoma artificial bacteriano (BAC), cromosoma artificial de levadura (YAC) o un vector viral.
69. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56 a 67, en el que el ácido nucleico se incorpora de manera estable en el cromosoma de una célula de mamífero.
70. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56 a 69, en el que las secuencias de nucleótidos entre cada secuencia de repetición terminal y la secuencia de repetición terminal no resoluble son en esencia completamente complementarias entre sí.
71. Una célula cultivada que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 54.
72. Una célula cultivada que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56 a 70.
73. Un procedimiento para producir una partícula de parvovirus duplicado, que comprende el suministro de una célula permisiva para replicación de parvovirus:
(a)
un ácido nucleico que codifica una plantilla según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 54 o de las reivindicaciones 56 a 70;
(b)
secuencias de nucleótidos suficientes para replicación de la plantilla para producir un genoma de vector;
(c)
secuencias de nucleótidos suficientes para empaquetar el genoma de vector en una cápside de parvovirus,
en condiciones suficientes para replicación y empaquetamiento del genoma de vector en la cápside de parvovirus,
en el que las partículas de parvovirus duplicado que comprenden el genoma de vector encapsidado en la cápside de parvovirus se producen en la célula.
74. El procedimiento de la reivindicación 73, que comprende además la etapa de recoger las partículas de parvovirus duplicado.
75. El procedimiento de la reivindicación 74, que comprende además la etapa de lisado de la célula antes de recoger las partículas de parvovirus duplicado.
76. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 73 a 75, en el que las secuencias de codificación rep y cap de parvovirus son proporcionadas por uno o más vectores de empaquetamiento.
77. El procedimiento de la reivindicación 76, en el que las secuencias de codificación rep y cap de parvovirus son proporcionadas por un plásmido.
78. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 73 a 75, en el que las secuencias de codificación rep de parvovirus se integran de manera estable en la célula.
79. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 73 a 75 ó 78, en el que las secuencias de codificación cap de parvovirus se integran de manera estable en la célula.
80. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 73 a 79, en el que el ácido nucleico que comprende la plantilla es un plásmido.
81. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 73 a 79, en el que el ácido nucleico que comprende la plantilla es un vector viral, opcionalmente un vector del virus del herpes, un vector de adenovirus o un vector de baculovirus.
82. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 73 a 79, en el que el ácido nucleico que comprende la plantilla se integra de manera estable en el cromosoma de una célula de mamífero.
83. Un procedimiento in vitro de suministro de una secuencia de nucleótidos a una célula, que comprende la puesta en contacto de una célula con una partícula de parvovirus duplicado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 en condiciones suficientes para que la partícula de parvovirus duplicado entre en la célula.
84. El procedimiento de la reivindicación 83, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula cancerosa, célula tumoral, célula neural que incluye células del sistema nervioso periférico y el sistema nervioso central que incluyen células encefálicas, célula pulmonar, célula muscular, célula epitelial que incluye células del tracto intestinal y las vías respiratorias, célula hepática, célula dendrítica, célula ocular que incluye células retinianas, célula pancreática que incluye células de islotes, célula miocárdica, célula ósea que incluye células madre de la médula ósea, célula madre hematopoyética, célula esplénica, queratinocito, fibroblasto, célula endotelial, célula prostática, célula embrionaria, célula de progenitor, célula madre neural y célula madre hepática.
85. El uso de un parvovirus duplicado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 para la fabricación de un medicamento para su uso en el suministro de un ácido nucleico a una célula.
86. El uso de la reivindicación 85, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido.
87. El uso de la reivindicación 85, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un ARN que efectúa trans-empalme mediado por empalmosoma, un ARN de interferencia (ARNi), un ARN de guía.
88. El uso de la reivindicación 85 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en fibrosis quística u otra enfermedad del pulmón, hemofilia A, hemofilia B, talasemia, anemia u otro trastorno sanguíneo, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia u otro trastorno neurológico, cáncer, diabetes mellitus, distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne y distrofia muscular de Becker), enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosindesaminasa, una enfermedad de almacenamiento del glucógeno, deficiencia de ornitin-transcarbamilasa, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Hunter u otro defecto metabólico, una enfermedad degenerativa retiniana u otra enfermedad ocular.
89. El uso de la reivindicación 85 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer o tumores.
90. El uso de un parvovirus duplicado según cualquiera de las reivindicaciones 15, 17 ó 19 a 31 para la fabricación de un medicamento para el suministro de un polipéptido inmunogénico a una célula.
ES01948252T 2000-06-01 2001-05-31 Vectores de parvovirus duplicados. Expired - Lifetime ES2256265T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20860400P 2000-06-01 2000-06-01
US208604P 2000-06-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2256265T3 true ES2256265T3 (es) 2006-07-16

Family

ID=22775222

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01948252T Expired - Lifetime ES2256265T3 (es) 2000-06-01 2001-05-31 Vectores de parvovirus duplicados.
ES05076932.2T Expired - Lifetime ES2505700T3 (es) 2000-06-01 2001-05-31 Vectores de parvovirus duplicados

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05076932.2T Expired - Lifetime ES2505700T3 (es) 2000-06-01 2001-05-31 Vectores de parvovirus duplicados

Country Status (10)

Country Link
US (4) US7465583B2 (es)
EP (1) EP1290205B1 (es)
JP (1) JP4860886B2 (es)
AT (1) ATE318923T1 (es)
AU (2) AU6972301A (es)
CA (1) CA2410828C (es)
DE (1) DE60117550T2 (es)
ES (2) ES2256265T3 (es)
NZ (1) NZ522840A (es)
WO (1) WO2001092551A2 (es)

Families Citing this family (283)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2379166C (en) * 1999-08-09 2013-03-26 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms instrastrand base pairs
US8241622B2 (en) * 2001-07-13 2012-08-14 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors with intravector heterologous terminal palindromic sequences
WO2006036502A2 (en) * 2004-09-22 2006-04-06 St. Jude Children's Research Hospital Improved expression of factor ix in gene therapy vectors
BRPI0612761A2 (pt) * 2005-07-07 2010-11-30 Genzyme Corp vetores aav codificando superóxido dismutase
US7943374B2 (en) * 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
WO2007084773A2 (en) * 2006-01-20 2007-07-26 University Of North Carolina At Chapel Hill Enhanced production of infectious parvovirus vectors in insect cells
WO2008016391A2 (en) 2006-01-31 2008-02-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same
CA2638913A1 (en) 2006-02-10 2007-09-07 The University Of Cincinnati Phosphatase inhibitor protein-1 as a regulator of cardiac function
US7588772B2 (en) 2006-03-30 2009-09-15 Board Of Trustees Of The Leland Stamford Junior University AAV capsid library and AAV capsid proteins
JP2009534394A (ja) * 2006-04-21 2009-09-24 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 結合組織障害の治療
US20070280906A1 (en) * 2006-06-03 2007-12-06 Ognjen Petras Method to generate mirrored adenoassociated viral vectors
ES2535877T3 (es) 2006-06-19 2015-05-18 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Genes de Factor VIII y Factor IX modificados y vectores para la terapia génica
US20100111873A1 (en) 2007-02-20 2010-05-06 Russell Stephen J Treating cancer with viral nucleic acid
EP2019143A1 (en) * 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
CA2694091A1 (en) * 2007-10-01 2009-04-09 Alcon Research, Ltd. Self complementary aav-mediated delivery of interfering rna molecules to treat or prevent ocular disorders
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
CN101173294B (zh) * 2007-10-12 2011-01-26 中山大学 一种基因微链载体及其构建方法和应用
WO2010093784A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
US20120093775A1 (en) 2009-03-27 2012-04-19 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Methods and compositions for the treatment of cirrhosis and liver fibrosis
HRP20250897T1 (hr) 2009-05-02 2025-09-26 Genzyme Corporation Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
EP2266588A1 (en) 2009-06-04 2010-12-29 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Method for cancer therapy based on co-administration of a parovirus and a cytokine
EP2524037B1 (en) 2010-01-12 2018-05-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors
WO2011122950A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Monomeric duplex aav vectors
AU2011276328C1 (en) 2010-07-06 2016-01-21 Novartis Ag Norovirus derived immunogenic compositions and methods
WO2012109570A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Viral vectors with modified transduction profiles and methods of making and using the same
MX374963B (es) 2011-04-29 2025-03-06 Selecta Biosciences Inc Nanoportadores sintéticos tolerogénicos para reducir las respuestas de anticuerpos.
US9163259B2 (en) 2012-05-04 2015-10-20 Novartis Ag Viral vectors for the treatment of retinal dystrophy
EP2900686B1 (en) 2012-09-28 2020-06-10 The University of North Carolina At Chapel Hill Aav vectors targeted to oligodendrocytes
AU2013337354A1 (en) 2012-11-05 2015-05-21 Genzyme Corporation Compositions and methods for treating proteinopathies
TW201427989A (zh) 2012-12-18 2014-07-16 Novartis Ag 長效性蛋白質之組合物及方法
CN105188733B (zh) 2013-03-13 2020-05-08 建新公司 包含pdgf和vegf结合部分的融合蛋白及其使用方法
ES2667209T3 (es) 2013-03-14 2018-05-10 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Genes del receptor-1 de VEGF soluble modificado y vectores para terapia génica
ES2926774T3 (es) 2013-03-15 2022-10-28 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y composiciones para vectores AAV de doble unión de glicano
WO2014143932A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Synthetic adeno-associated virus inverted terminal repeats
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
CA2909706C (en) 2013-04-17 2023-02-14 Genzyme Corporation Use of an il17 inhibitor for treating and preventing macular degeneration
MX380973B (es) 2013-05-01 2025-03-12 Genzyme Corp Composiciones y metodos para tratar la atrofia muscular espinal.
BR122020023215B1 (pt) 2013-05-03 2022-11-22 Selecta Biosciences, Inc Composição e kit de nanocarreadores sintéticos tolerogênicos para reduzir ou prevenir anafilaxia em resposta a um antígeno não alergênico
LT3013855T (lt) 2013-06-24 2021-01-25 Xiao, Weidong Mutavusio viii faktoriaus kompozicijos ir metodai
HK1222673A1 (zh) * 2013-07-12 2017-07-07 The Children's Hospital Of Philadelphia Aav载体和用於抗aav(腺相关病毒)中和抗体的检测
ES2739288T3 (es) 2013-09-13 2020-01-30 California Inst Of Techn Recuperación selectiva
CN105745326A (zh) 2013-10-24 2016-07-06 优尼科Ip有限公司 用于基因治疗神经疾病的aav-5假型载体
BR112016017817A2 (pt) 2014-02-06 2017-10-10 Genzyme Corp composições e métodos para o tratamento e a prevenção de degeneração macular
PL3628334T3 (pl) 2014-03-21 2023-12-18 Genzyme Corporation Terapia genowa w retinopatii barwnikowej
WO2015164723A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
LT3137497T (lt) 2014-05-02 2021-07-26 Genzyme Corporation Aav vektoriai, skirti tinklainės ir cns genų terapijai
ES2833230T3 (es) 2014-05-13 2021-06-14 Univ Pennsylvania Composiciones que comprenden AVV que expresan construcciones y usos de doble anticuerpo del mismo
US11207424B2 (en) 2014-06-13 2021-12-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for increasing viral vector infectivity
EP3160990A2 (en) 2014-06-25 2017-05-03 Novartis AG Compositions and methods for long acting proteins
US20170327553A1 (en) 2014-06-25 2017-11-16 Novartis Ag Compositions and methods for long acting proteins
JP7242180B2 (ja) 2014-09-07 2023-03-20 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 抗ウイルス導入ベクター免疫応答を減弱化するための方法および組成物
WO2016037931A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Fundación Para La Investigación Médica Aplicada Nucleic acid constructs and expression vectors for gene therapy of acute porphyrias and other diseases
EP4012035B1 (en) 2014-09-16 2024-11-06 Genzyme Corporation Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma
PL4012035T3 (pl) 2014-09-16 2025-03-24 Genzyme Corporation Wektory wirusowe związane z adenowirusami do leczenia jaskry miocylinowej (myoc)
WO2016077687A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
EP4344741A3 (en) 2014-11-21 2024-08-28 The University of North Carolina at Chapel Hill Aav vectors targeted to the central nervous system
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
US10907176B2 (en) 2015-01-14 2021-02-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for targeted gene transfer
EA201791630A1 (ru) 2015-01-20 2018-04-30 Джензим Корпорейшн Аналитическое ультрацентрифугирование для определения характеристик рекомбинантных вирусных частиц
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
CN107530447A (zh) 2015-02-10 2018-01-02 建新公司 病毒颗粒至纹状体和皮质的增强递送
CR20170406A (es) 2015-02-10 2017-11-14 Genzyme Corp Arni variante
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
US10016514B2 (en) 2015-05-15 2018-07-10 New Hope Research Foundation Polynucleotides, vectors and methods for insertion and expression of transgenes
BR112017024514A2 (pt) 2015-05-16 2018-07-24 Genzyme Corporation edição genética de mutações intrônicas profundas
ES2865487T3 (es) 2015-09-28 2021-10-15 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y composiciones para vectores virales que evaden los anticuerpos
SG11201802408RA (en) 2015-11-05 2018-05-30 Bamboo Therapeutics Inc Modified friedreich ataxia genes and vectors for gene therapy
KR102787119B1 (ko) 2015-11-30 2025-03-27 듀크 유니버시티 유전자 편집에 의한 인간 디스트로핀 유전자의 교정을 위한 치료용 표적 및 사용 방법
KR102423442B1 (ko) * 2015-12-11 2022-07-20 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 아데노-관련 바이러스를 지시하기 위한 타겟팅 펩타이드
JP7406783B2 (ja) 2015-12-14 2023-12-28 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル パルボウイルスベクターの高められた送達のための改変キャプシドタンパク質
EP3411484B1 (en) 2016-02-05 2023-10-04 Emory University Injection of single-stranded or self-complementary adeno-associated virus 9 into the cerebrospinal fluid
WO2017139381A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 University Of Iowa Research Foundation Methods to produce chimeric adeno-associated virus/bocavirus parvovirus
CA3011943A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 The University Of North Carolina At Chapel Hill Aav-idua vector for treatment of mps i-associated blindness
CA3016985C (en) 2016-03-07 2023-07-04 University Of Iowa Research Foundation Aav-mediated expression using a synthetic promoter and enhancer
US20190127713A1 (en) 2016-04-13 2019-05-02 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
EP3443002A4 (en) 2016-04-14 2019-12-04 Bluebird Bio, Inc. SYSTEMS FOR RECOVERED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS
EP3449250B1 (en) 2016-04-28 2020-11-04 Indiana University Research & Technology Corporation Methods and compositions for resolving components of a virus preparation
WO2017205739A1 (en) 2016-05-26 2017-11-30 University Of Iowa Research Foundation cis AND trans REQUIREMENTS FOR TERMINAL RESOLUTION OF HUMAN BOCAVIRUS 1
CN109415730A (zh) 2016-06-13 2019-03-01 北卡罗来纳大学教堂山分校 优化的cln1基因和表达盒以及它们的应用
CA2971303C (en) 2016-06-21 2026-03-03 Bamboo Therapeutics, Inc. Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use
JP7490211B2 (ja) 2016-07-19 2024-05-27 デューク ユニバーシティ Ｃｐｆ１に基づくゲノム編集の治療適用
BR112019001344A2 (pt) 2016-07-26 2019-04-30 The University Of North Carolina At Chapel Hill tolerância imunológica mediada por vetor no olho
CA3033856A1 (en) 2016-08-15 2018-02-22 Genzyme Corporation Methods for detecting aav
MA45996A (fr) 2016-08-16 2021-06-02 Bluebird Bio Inc Variants d'endonucléase de homing du récepteur alpha de l'il-10, compositions et méthodes d'utilisation associées
IL315358A (en) 2016-08-18 2024-11-01 Univ California CRISPR-CAS genome engineering using a modular AAV delivery system
JP7165410B2 (ja) 2016-08-19 2022-11-04 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイティド 組換え自己相補的アデノ随伴ウイルスを使用して疾患を治療するための方法及び組成物
WO2018039333A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Bluebird Bio, Inc. Tim3 homing endonuclease variants, compositions, and methods of use
KR102451510B1 (ko) 2016-09-08 2022-10-07 2세븐티 바이오, 인코포레이티드 Pd-1 호밍 엔도뉴클레아제 변이체, 조성물 및 사용 방법
MA46543A (fr) 2016-10-17 2019-08-21 Bluebird Bio Inc Variants de l'endonucléase tgfbéta r2, compositions et procédés d'utilisation
MA46862A (fr) 2016-11-17 2019-09-25 Bluebird Bio Inc Convertisseur de signaux tgf béta
KR20190088561A (ko) 2016-12-07 2019-07-26 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1RA) cDNA
WO2018109207A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Uniqure Ip B.V. Immunoadsorption
MX2019008143A (es) 2017-01-07 2020-01-13 Selecta Biosciences Inc Dosificación sistemática de inmunosupresores acoplados a nanoportadores sintéticos.
US11142775B2 (en) 2017-01-13 2021-10-12 University Of Iowa Research Foundation Bocaparvovirus small noncoding RNA and uses thereof
EP3583203B1 (en) 2017-02-15 2023-11-01 2seventy bio, Inc. Donor repair templates multiplex genome editing
ES3036482T3 (en) 2017-03-11 2025-09-19 Cartesian Therapeutics Inc Methods and compositions related to combined treatment with anti-inflammatories and synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant
NZ756587A (en) 2017-03-15 2025-12-19 Univ North Carolina Chapel Hill Polyploid adeno-associated virus vectors and methods of making and using the same
KR20260047644A (ko) 2017-03-30 2026-04-08 더 유니버서티 어브 퀸슬랜드 키메라 분자 및 그의 용도
EP3612635A2 (en) * 2017-04-18 2020-02-26 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Methods for adeno-associated viral vector production
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
MA48797A (fr) 2017-05-25 2020-04-08 Bluebird Bio Inc Variants de l'endonucléase cblb , compositions et procédés d'utilisation
EP3687561A4 (en) 2017-09-01 2021-06-09 The Australian National University "immunoregulatory molecules and uses therefor"
WO2019060538A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 The Trustees Of Indiana University METHODS FOR LIPOPROTEIN RESOLUTION BY MASS SPECTROMETRY
CN111356763B (zh) 2017-09-22 2024-03-12 建新公司 变体RNAi
US11779654B2 (en) 2017-10-04 2023-10-10 2Seventy Bio, Inc. PCSK9 endonuclease variants, compositions, and methods of use
BR112020007157A2 (pt) 2017-10-13 2020-09-24 Selecta Biosciences, Inc. métodos e composições para a atenuação de respostas de igm antivetor de transferência viral
TW202413649A (zh) 2017-10-16 2024-04-01 美商航海家醫療公司 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療
RU2020118342A (ru) 2017-11-07 2021-12-08 Дзе Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл Оптимизированные гены aga и экспрессионные кластеры и их применение
EP3738137A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 The Trustees of Indiana University Electrostatic linear ion trap design for charge detection mass spectrometry
EP3740580A4 (en) 2018-01-19 2021-10-20 Duke University GENOME ENGINEERING WITH CRISPR-CAS SYSTEMS IN EUKARYONTS
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
US20190256867A1 (en) 2018-02-01 2019-08-22 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for restoring pah gene function and methods of use thereof
WO2019155833A1 (ja) * 2018-02-07 2019-08-15 学校法人日本医科大学 改良型アデノ随伴ウイルスベクター
KR20200120649A (ko) * 2018-02-14 2020-10-21 제너레이션 바이오 컴퍼니 비-바이러스 dna 벡터 및 항체 및 융합 단백질 생산을 위한 이의 용도
JP7244547B2 (ja) 2018-02-19 2023-03-22 ホモロジー・メディシンズ・インコーポレイテッド Ｆ８遺伝子機能を回復させるためのアデノ随伴ウイルス組成物及びその使用の方法
CN112384204B (zh) 2018-02-26 2023-03-14 安托瑞斯公司 致耐受性脂质体及其使用方法
EP3759218A4 (en) 2018-02-28 2021-12-08 The University of North Carolina at Chapel Hill PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR ANTIBODY ELIMINATING VIRUS VECTORS
EP3774852A1 (en) 2018-04-03 2021-02-17 Stridebio, Inc. Antibody-evading virus vectors
MX2020010465A (es) 2018-04-03 2021-01-08 Vectores de virus para direccionamiento a tejidos oftalmicos.
AU2019247748A1 (en) 2018-04-03 2020-10-08 Ginkgo Bioworks, Inc. Antibody-evading virus vectors
EP4391015A3 (en) 2018-06-04 2024-10-09 The Trustees of Indiana University Ion trap array for high throughput charge detection mass spectrometry
WO2019236143A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 The Trustees Of Indiana University Apparatus and method for calibrating or resetting a charge detector
WO2019236139A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 The Trustees Of Indiana University Interface for transporting ions from an atmospheric pressure environment to a low pressure environment
CA3100838A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 The Trustees Of Indiana University Charge detection mass spectrometry with real time analysis and signal optimization
AU2019287468B2 (en) 2018-06-12 2024-10-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Synthetic liver-tropic adeno-associated virus capsids and uses thereof
DK3806903T5 (da) 2018-06-14 2024-08-19 2Seventy Bio Inc Cd79a kimæriske antigenreceptorer
EP3810782A2 (en) 2018-06-22 2021-04-28 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Vectors for gene delivery that persist within cells
BR112020025268A2 (pt) 2018-06-28 2021-03-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Cassetes de expressão e genes cln5 otimizados e seu uso
WO2020018583A1 (en) 2018-07-16 2020-01-23 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions of otc constructs and vectors
CN112654370A (zh) 2018-07-16 2021-04-13 西莱克塔生物科技公司 Mma构建体和载体的方法和组合物
KR102931619B1 (ko) 2018-08-03 2026-02-26 젠자임 코포레이션 알파-시뉴클레인에 대한 변이형 RNAi
IL280300B2 (en) 2018-08-10 2025-06-01 Univ North Carolina Chapel Hill Optimized cln7 genes and expression cassettes and their use
JP7450945B2 (ja) 2018-08-30 2024-03-18 テナヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド ミオカルディンおよびａｓｃｌ１を用いた心細胞リプログラミング
CN113966399A (zh) 2018-09-26 2022-01-21 加州理工学院 用于靶向基因疗法的腺相关病毒组合物
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
WO2020072059A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 Bluebird Bio, Inc. Cblb endonuclease variants, compositions, and methods of use
AU2019357039B2 (en) 2018-10-12 2025-10-09 Genzyme Corporation Generation of improved human pah for treatment of severe PKU by liver-directed gene replacement therapy
AU2019360270B2 (en) 2018-10-18 2025-08-07 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for expressing factor IX.
JP7481755B2 (ja) * 2018-11-02 2024-05-13 ナイキジェン，リミテッド 組換えパルボウイルスベクターならびにその作製および使用方法
JP2022506066A (ja) 2018-11-05 2022-01-17 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル 最適化されたｆｉｇ４遺伝子および発現カセットならびにそれらの使用
CN113574632B (zh) 2018-11-20 2024-07-30 印地安纳大学理事会 用于单粒子质谱分析的轨道阱
WO2020112853A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Genascence Corporation Methods and compositions for treating osteoarthritis
EP4443473A3 (en) 2018-12-03 2025-01-01 The Trustees of Indiana University Apparatus for simultaneously analyzing multiple ions with an electrostatic linear ion trap
JP2022513750A (ja) 2018-12-10 2022-02-09 ２セブンティ バイオ インコーポレイテッド ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント
IL283724B1 (en) 2018-12-10 2026-02-01 Genetix Biotherapeutics Inc pdcd-1 homing endonuclease variants
KR20210104772A (ko) 2018-12-14 2021-08-25 블루버드 바이오, 인코포레이티드. 이량체화제로 조절된 면역수용체 복합체
WO2020132385A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Optimized galc genes and expression cassettes and their use
WO2020142714A1 (en) 2019-01-04 2020-07-09 Exonics Therapeutics, Inc. Aav expression cassette and aav vectors comprising the same
US20220154211A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
SG11202108044YA (en) 2019-02-25 2021-09-29 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
AR118465A1 (es) 2019-03-21 2021-10-06 Stridebio Inc Vectores de virus adenoasociados recombinantes
EP3947700A4 (en) 2019-04-01 2023-01-04 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
EP3959741A1 (en) 2019-04-23 2022-03-02 The Trustees of Indiana University Identification of sample subspecies based on particle charge behavior under structural change-inducing sample conditions
EP4169535A1 (en) 2019-04-26 2023-04-26 The University of North Carolina at Chapel Hill Methods and compositions for dual glycan binding aav2.5 vector
EP3962537A1 (en) 2019-04-28 2022-03-09 Selecta Biosciences, Inc. Methods for treatment of subjects with preexisting immunity to viral transfer vectors
WO2020223215A1 (en) 2019-04-29 2020-11-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Optimized sumf1 genes and expression cassettes and their use
US12465655B2 (en) 2019-05-22 2025-11-11 The University Of North Carolina At Chapel Hill UBE3A genes and expression cassettes and their use
CN114206396A (zh) 2019-05-28 2022-03-18 西莱克塔生物科技公司 用于减弱抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物
AU2020287627A1 (en) 2019-06-04 2021-11-18 Selecta Biosciences, Inc. Formulations and doses of PEGylated uricase
EP3990030A1 (en) 2019-06-27 2022-05-04 Pfizer Inc. Methods of treating duchenne muscular dystrophy using aav mini-dystrophin gene therapy
EP3997226A1 (en) 2019-07-11 2022-05-18 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
WO2021061650A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 The Trustees Of Indiana University Apparatus and method for pulsed mode charge detection mass spectrometry
US20240060989A1 (en) 2019-10-04 2024-02-22 Novartis Ag Methods for measuring cralbp activity
CN114728237B (zh) 2019-10-10 2026-02-24 印地安纳大学理事会 用于识别、选择和纯化粒子的系统和方法
US12611436B2 (en) 2019-10-17 2026-04-28 Sarepta Therapeutics, Inc. AAV transfer cassette
JP2022551739A (ja) 2019-10-17 2022-12-13 ストライドバイオ，インコーポレイテッド ニーマン・ピック病ｃ型の治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター
US12521451B2 (en) 2019-11-08 2026-01-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR and AAV strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
AU2020395113A1 (en) 2019-12-02 2022-06-09 Shape Therapeutics Inc. Therapeutic editing
EP4077643A4 (en) * 2019-12-17 2024-01-17 Nikegen Limited PARVOVIRUS VECTORS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
JP7690209B2 (ja) 2019-12-18 2025-06-10 ザ・トラスティーズ・オブ・インディアナ・ユニバーシティー 電荷測定装置を有する質量分析計
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
EP4100991B1 (en) 2020-02-03 2025-01-29 The Trustees of Indiana University A charge detection mass spectrometer and related method
US12605465B2 (en) 2020-03-23 2026-04-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill AAV-NAGLU vectors for treatment of mucopolysaccharidosis IIIB
KR20220167324A (ko) 2020-04-10 2022-12-20 솔라 바이오사이언시즈 엘엘씨 단백질 응집 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법
US20230111672A1 (en) * 2020-04-27 2023-04-13 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for production of recombinant adeno-associated virus
WO2021222168A2 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of tdp-43 proteinopathies
CA3177869A1 (en) 2020-05-05 2021-11-11 Duke University Cross-species compatible adeno-associated virus compositions and methods of use thereof
JP2023524577A (ja) 2020-05-05 2023-06-12 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 改変アデノ随伴ウイルス５カプシドおよびその使用
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
CA3183251A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of synucleinopathies
TW202216761A (zh) 2020-07-16 2022-05-01 瑞士商諾華公司 抗β細胞素抗體、其片段及多特異性結合分子
CA3186207A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Rachel BAILEY Optimized slc13a5 genes and expression cassettes and their use
BR112023001456A2 (pt) 2020-07-27 2023-04-11 Voyager Therapeutics Inc Composições e métodos para o tratamento de distúrbios neurológicos relacionados à deficiência de beta glicosilceramidase
WO2022026410A2 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Voyager Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease
AU2021328475A1 (en) 2020-08-19 2023-03-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus vectors for treatment of Rett syndrome
MX2023003805A (es) 2020-10-01 2023-04-12 Genzyme Corp Casete de expresion de pah humana para el tratamiento de la pku mediante terapia de reemplazo genico dirigida al higado.
CA3195177A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy disorders including limb girdle 2i (lgmd2i)
US11781156B2 (en) 2020-10-09 2023-10-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions
BR112023006305A2 (pt) 2020-10-09 2023-05-09 Tenaya Therapeutics Inc Métodos e composições de terapia gênica com placofilina-2
JP2023548632A (ja) 2020-10-26 2023-11-17 ソラ・バイオサイエンシズ・エルエルシー アルツハイマー病の処置のための組成物および方法
CN116490514A (zh) 2020-10-28 2023-07-25 北卡罗来纳-查佩尔山大学 用于双重聚糖结合aav2.5载体的方法和组合物
WO2022093769A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for dual glycan binding aav2.5 vector
AU2021375404A1 (en) 2020-11-03 2023-06-08 Pfizer Inc. Methods for purification of aav vectors by anion exchange chromatography
IL303959A (en) 2020-12-23 2023-08-01 Pfizer Methods for purification of aav vectors by affinity chromatography
WO2022150335A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Selecta Biosciences, Inc. Viral vector dosing protocols
TW202242124A (zh) 2021-01-14 2022-11-01 美商史崔德生物公司 靶向ｔ細胞之ａａｖ載體
US11760788B2 (en) 2021-03-02 2023-09-19 Pathways Neuro Pharma, Inc. Neuroreceptor compositions and methods of use
CN117460832A (zh) 2021-03-22 2024-01-26 建新公司 空aav衣壳和完整aav衣壳的尺寸排阻色谱分析
WO2022211791A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 AAVnerGene Inc. Modified plasma clotting factor viii and method of use thereof
US11795207B2 (en) 2021-03-30 2023-10-24 AAVnerGene Inc. Modified plasma clotting factor VIII and method of use thereof
WO2022221529A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Rational polyploid aav virions that cross the blood brain barrier and elicit reduced humoral response
IL307416A (en) 2021-04-27 2023-12-01 4D Molecular Therapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of eye disease related to the formation of blood vessels
WO2022269466A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Pfizer Inc. Production of adeno-associated virus vector in insect cells
AU2022299552A1 (en) 2021-06-25 2024-01-04 Oxford Biomedica (Us) Llc Adeno-associated virus packaging systems
JP2024525727A (ja) 2021-07-14 2024-07-12 ２セブンティ バイオ インコーポレイテッド 抗体由来の結合ドメインに融合した操作されたｔ細胞受容体
US20240252684A1 (en) 2021-07-30 2024-08-01 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
CA3227103A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Matthew P. GEMBERLING Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
US20230090654A1 (en) 2021-08-24 2023-03-23 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus formulations
CA3234720A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of p53-mediated cancers
WO2023060221A2 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of proteopathies
US20230141563A1 (en) 2021-10-12 2023-05-11 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses
WO2023064350A1 (en) 2021-10-12 2023-04-20 Selecta Biosciences, Inc. Viral vector dosing protocols
CA3234809A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Steven Goldman Isolated glial progenitor cells for use in the competition treatment of age-related white matter loss
WO2023077086A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Homology Medicines, Inc. Methods and compositions for the purification of adeno-associated virus
EP4426331A1 (en) 2021-11-02 2024-09-11 University of Rochester Tcf7l2 mediated remyelination in the brain
JP2024545594A (ja) 2021-11-14 2024-12-10 カーティザン セラピューティクス，インコーポレーテッド ウイルスベクターでの複数回投薬
US20250049955A1 (en) 2021-11-17 2025-02-13 Voyager Therapeutics, Inc. Compositons and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
WO2023114816A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Neurogene, Inc. Recombinant optimized galc constructs and methods for treating galc-associated disorders
WO2023114897A2 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Homology Medicines, Inc. Methods and compositions for the production of adeno-associated virus
WO2023139496A1 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Pfizer Inc. Gene therapy for gaucher disease
GB202201242D0 (en) 2022-01-31 2022-03-16 Univ Edinburgh Recombinant optimized mecp2 cassettes and methods for treating rett syndrome and related disorders
TW202342759A (zh) 2022-02-04 2023-11-01 美商史崔德生物公司 重組腺相關病毒載體及其使用方法
WO2023172624A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing
EP4504754A2 (en) 2022-04-04 2025-02-12 Vectory B.V. Recombinant aav capsid proteins
WO2023196862A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Genzyme Corporation Targeted gene therapy for dm-1 myotonic dystrophy
CA3255500A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. MULTI-PART RECEIVERS AND SIGNALING COMPLEXES
WO2023201207A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
AU2023253700A1 (en) 2022-04-12 2024-11-28 Genzyme Corporation Use of an irak4 modulator for gene therapy
JP2025513850A (ja) 2022-04-12 2025-04-30 ジェンザイム・コーポレーション 遺伝子治療のためのｉｒａｋ４モジュレーターの使用
JP2025512400A (ja) 2022-04-12 2025-04-17 ジェンザイム・コーポレーション 遺伝子治療剤に対する自然免疫原性のための樹状細胞アッセイ
GB202206336D0 (en) 2022-04-29 2022-06-15 Univ Edinburgh Recombinant therapeutic FMR1 constructs and methods of treating fragile X syndrome and related disorders
JP2025521111A (ja) 2022-05-16 2025-07-08 ジェンザイム・コーポレーション 異染性白質ジストロフィーを治療する方法
JP2025520227A (ja) 2022-05-26 2025-07-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド レンチウイルスベクターを維持するための組成物及びその使用
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders
EP4540270A2 (en) 2022-06-14 2025-04-23 Vectory B.V. Recombinant aav capsid proteins
CN119816514A (zh) 2022-06-20 2025-04-11 维克多瑞私人有限公司 降解子融合构建体
WO2024003687A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Pfizer Inc. Nucleic acids encoding acid alpha-glucosidase (gaa) and vectors for gene therapy
CA3261865A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. TARGETED TRANSCRIPTIONAL ACTIVATION COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS
CN120813689A (zh) 2022-08-11 2025-10-17 笛卡尔疗法股份有限公司 与免疫球蛋白蛋白酶及其融合体相关的组合物和方法
WO2024038365A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Pfizer Inc. Methods for purification of aav vectors by anion exchange chromatography
WO2024075012A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Pfizer Inc. Improved host cells for aav vector production
AU2023378899A1 (en) 2022-11-13 2025-06-26 Alexion Pharma International Operations Limited Gene therapy for frontotemporal dementia
WO2024124019A2 (en) 2022-12-07 2024-06-13 Ginkgo Bioworks, Inc. Aav vectors targeting hematopoietic stem cells
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
EP4658294A2 (en) 2023-02-02 2025-12-10 University of Rochester Competitive replacement of glial cells
AU2023427408A1 (en) 2023-02-02 2025-09-04 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
EP4688851A1 (en) 2023-03-27 2026-02-11 LAVA Therapeutics N.V. Nectin-4 binding agents and methods of use
US20240384271A1 (en) 2023-04-05 2024-11-21 Genzyme Corporation Targeted gene therapy for dm-1 myotonic dystrophy
WO2024215653A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Guide rnas, vectors, and virions for targeting mutations in the pln gene
WO2024215655A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective bag3 therapies
WO2024229164A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
KR20260021096A (ko) 2023-05-03 2026-02-12 보이저 테라퓨틱스, 인크. Cdkl5 결핍과 관련된 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2024229173A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to ataxin-2
WO2025012118A2 (en) 2023-07-07 2025-01-16 LAVA Therapeutics N.V. 5t4 binding agents and methods of use
WO2025038795A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
WO2025038802A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to ataxin-2
TW202523846A (zh) 2023-08-16 2025-06-16 美商航海家醫療公司 用於治療與共濟蛋白(frataxin)不足有關之疾病之組合物及方法
WO2025038805A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to glucosylceramidase beta 1 deficiency
WO2025038796A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to cdkl5 deficiency
AU2024332181A1 (en) 2023-08-31 2026-02-12 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid polypeptides and methods of use thereof
WO2025090427A1 (en) 2023-10-23 2025-05-01 University Of Rochester Glial-targeted relief of hyperexcitability in neurodegenerative diseases
US20250152744A1 (en) 2023-11-15 2025-05-15 Genzyme Corporation Methods of treating neurodegenerative disorders
US20250152747A1 (en) 2023-11-15 2025-05-15 Genzyme Corporation Methods of treating gaucher disease and gba-parkinson’s disease
WO2025122548A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to cdkl5 deficiency
WO2025122536A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
WO2025122532A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to ataxin-2
WO2025122530A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to glucosylceramidase beta 1 deficiency
WO2025122543A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to syntaxin-binding protein 1 deficiency
US20250197862A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Genzyme Corporation ARTIFICIAL microRNAs TARGETING TAU
WO2025137219A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
WO2025153530A1 (en) 2024-01-16 2025-07-24 Novo Nordisk A/S Albumin-targeted endonucleases, compositions, and methods of use
WO2025158385A1 (en) 2024-01-25 2025-07-31 Genzyme Corporation Pegylated il-2 for suppressing adaptive immune response to gene therapy
TW202547561A (zh) 2024-01-25 2025-12-16 美商健臻公司 基於ｆｕｓ向大腦遞送病毒顆粒之方法
WO2025160429A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting snca
WO2025160434A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting huntington's disease
WO2025235643A1 (en) 2024-05-08 2025-11-13 Genzyme Corporation Profiling of gene therapy agents
WO2025250454A1 (en) 2024-05-28 2025-12-04 University Of Rochester Adeno-associated viruses evolved to specifically target human glial progenitor cells in vivo
WO2025250909A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Muscle-tropic recombinant aav
WO2026017965A1 (en) 2024-07-19 2026-01-22 The University Court Of The University Of Edinburgh Recombinant therapeutic fxn constructs and methods of treating friedreich ataxia and related conditions
WO2026064428A2 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid polypeptides and methods of use thereof
WO2026064444A1 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid polypeptides and methods of use thereof
WO2026064442A2 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid polypeptides and methods of use thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869305A (en) 1992-12-04 1999-02-09 The University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
JP2001522244A (ja) 1997-04-24 2001-11-13 ユニバーシティ オブ ワシントン パルボウイルスベクターによる標的化した遺伝子改変
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
IL121676A0 (en) 1997-09-01 1998-02-22 Yeda Res & Dev Parvovirus vectors
WO2000024917A1 (en) 1998-10-28 2000-05-04 University Of Washington Targeted gene modification by parvoviral vectors
CA2309313A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Stimulation of the immune response by human dendritic cell manipulation
CA2379166C (en) * 1999-08-09 2013-03-26 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms instrastrand base pairs

Also Published As

Publication number Publication date
US20040029106A1 (en) 2004-02-12
JP2004500858A (ja) 2004-01-15
US8784799B2 (en) 2014-07-22
CA2410828C (en) 2012-01-24
CA2410828A1 (en) 2001-12-06
US20070110724A1 (en) 2007-05-17
ES2505700T3 (es) 2014-10-10
DE60117550T2 (de) 2006-12-07
AU2001269723B2 (en) 2006-06-29
JP4860886B2 (ja) 2012-01-25
EP1290205A2 (en) 2003-03-12
US8361457B2 (en) 2013-01-29
AU2001269723B9 (en) 2006-11-16
US7790154B2 (en) 2010-09-07
US20130252325A1 (en) 2013-09-26
US20100310516A1 (en) 2010-12-09
WO2001092551A2 (en) 2001-12-06
NZ522840A (en) 2004-12-24
US7465583B2 (en) 2008-12-16
AU6972301A (en) 2001-12-11
ATE318923T1 (de) 2006-03-15
DE60117550D1 (de) 2006-04-27
EP1290205B1 (en) 2006-03-01
WO2001092551A3 (en) 2002-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2256265T3 (es) Vectores de parvovirus duplicados.
Bulcha et al. Viral vector platforms within the gene therapy landscape
CN110770346B (zh) 多倍体腺相关病毒载体及其制备和使用方法
EP2940131B1 (en) Aav variant
JP5136766B2 (ja) キメラベクター
AU2001269723A1 (en) Duplexed parvovirus vectors
JP2021527405A (ja) 合成肝臓指向性アデノ随伴ウイルスカプシドおよびその使用
BR112019017839A2 (pt) vetor clade f de vírus adeno-associado (aav) e sua utilização
US20200316221A1 (en) Aav capsid designs
JP2021519099A (ja) 抗体を回避するウイルスベクター
KR20230034211A (ko) 변형된 아데노-관련 바이러스 5 캡시드 및 이의 용도
CN111876432B (zh) 一组肝靶向新型腺相关病毒的获得及其应用
AU2020329751A1 (en) AAV capsid variants for targeting human glioblastoma cells
JP2023515795A (ja) Ａａｖカプシド－プロモーター相互作用および細胞選択的遺伝子発現
Zhao et al. Hot topics in adeno-associated virus as a gene transfer vector
EP1626091B1 (en) Duplexed parvovirus vectors