ES2252747T3 - Peptidos de los vih-1 y vih-2 para la inhibicion de los eventos asociados con la fusion a la membrana, incluida la transmision del vih. - Google Patents

Peptidos de los vih-1 y vih-2 para la inhibicion de los eventos asociados con la fusion a la membrana, incluida la transmision del vih.

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ES2252747T3 ES95943483T ES95943483T ES2252747T3 ES 2252747 T3 ES2252747 T3 ES 2252747T3 ES 95943483 T ES95943483 T ES 95943483T ES 95943483 T ES95943483 T ES 95943483T ES 2252747 T3 ES2252747 T3 ES 2252747T3
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hiv
virus
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Dani P. Bolognesi
Thomas J. Matthews
Cart T. Wild
Shawn O'lin Barney
Dennis M. Lambert
Stephen R. Petteway, Jr.
Alphonse J. Langlois
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Trimeris Inc
Duke University
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Trimeris Inc
Duke University
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION, SE REFIERE A PEPTIDOS, QUE PRESENTAN UNA POTENTE ACTIVIDAD ANTI-RETROVIRAL. DICHOS PEPTIDOS, COMPRENDEN EL PEPTIDO DP178 (SEQ ID:1), CORRESPONDIENTE A LOS AMINOACIDOS 638 A 673, DE LA PROTEINA GP41 DE HIV-1{SUB,LAI}, Y FRAGMENTOS, ANALOGOS Y HOMOLOGOS DE DP178. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO, A LAS UTILIZACIONES DE DICHOS PEPTIDOS, COMO INHIBIDORES DE LA TRANSMISION RETROVIRAL A CELULAS SANAS EN HUMANOS Y NO HUMANOS, ESPECIALMENTE DE HIV.

Description

Péptidos de los VIH-1 y VIH-2 para la inhibición de los eventos asociados con la fusión a la membrana, incluida la trasmisión del VIH.
1. Introducción
La presente invención se relaciona, primero, con DP178 (SEQ. ID NO.: 1), un péptido correspondiente a los aminoácidos 638 a 673 de la proteína transmembrana VIH-1_{LAI} (TM) gp41, y a porciones o análogos de DP178 (SEQ. ID. NO: 1), que exhiben capacidad de fusión antimembrana, actividad antiviral, tal como la capacidad para inhibir la trasmisión del VIH a células CD-4^{+} no infectadas, o una capacidad para modular procesos intracelulares que involucran estructuras de péptidos en doble espiral. Además, la invención se relaciona con el uso de DP178 (SEQ. ID. NO: 1) y porciones y/o análogos de DP178 como compuestos antifusogénicos o antivirales, o como inhibidores de eventos intracelulares que involucran estructuras de péptidos en doble espiral. La presente invención se relaciona también con análogos de péptidos del DP107 (SEQ. ID. NO: 25), un péptido correspondiente a los aminoácidos 558 a 595 de la proteína transmembrana VIH-1_{LAI} (TM) gp41, que tiene secuencias de aminoácidos presentes en otros virus, tales como virus en envoltura, y/o otros organismos, y demás relacionados con los usos de tales péptidos. Estos péptidos exhiben capacidad de fusión antimembrana, actividad antiviral, o la capacidad para modular procesos intracelulares que involucran estructuras de péptidos en doble espiral. La presente invención se relaciona además con métodos para identificar compuestos que rompen la interacción entre DP178 y DP107, y/o entre péptidos como DP178 y como DP107. Además, la invención se relaciona con el uso de los péptidos de la invención como agentes de diagnostico. Por ejemplo, un péptido DP178 puede ser usado como un diagnostico específico para un subtipo de VIH. La invención se demuestra, primero, por medio de un Ejemplo en donde DP178 (SEQ. ID. NO: 1), y un péptido cuya secuencia es homóloga a la de DP178, han mostrado ser cada uno potentes inhibidores no citotóxicos de la transferencia de VIH-1 a células CD-4^{+} no infectadas. La invención se demuestra además por medio de Ejemplos en donde los péptidos que tienen motivo estructural y/o aminoácido similar al de DP107 y DP178, se identifican en una variedad de organismos virales y no virales, y en ejemplos en donde se demuestra que un número de tales péptidos identificados derivados de varios sistemas virales diferentes, exhiben actividad antiviral.
2. Antecedentes de la invención 2.1 Eventos de fusión de membrana
La fusión de membrana es un proceso biológico celular omnipresente (para una revisión, ver White, J.M., 1992, Science 258:917-924). Los eventos de fusión que median en las funciones domésticas celulares, tales como la endocitosis, la secreción constitutiva, y el reciclado de los componentes de la membrana, ocurre continuamente en todas las células eucariotas.
Eventos adicionales de fusión ocurren en células especializadas. En forma intracelular, por ejemplo, los eventos de fusión están involucrados en tales procesos como ocurre en la exocitosis regulada de hormonas, enzimas y neurotransmisores. Intracelularmente, tales eventos de fusión se parecen en forma prominente en, por ejemplo, la fusión esperma-óvulo y la fisión mioblástica.
Los eventos de fusión están también asociados con estados de enfermedad. Por ejemplo, los eventos de fusión están involucrados en la formación de células gigantes durante las reacciones inflamatorias, la entrada de todos los virus en envoltura dentro de las células, y, en el caso del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), por ejemplo, son responsables por la fusión célula-célula inducida en forma viral, que conduce a la muerte de la célula.
2.2 El virus de inmunodeficiencia humana (VIH)
El virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ha sido considerado como la causa primaria de la lenta enfermedad degenerativa del sistema inmune llamada síndrome adquirido de inmunodeficiencia (SIDA) (Barre-Sinoussi, F. y colaboradores, 1983, Science 220:868-870; Gallo, R. y colaboradores, 1984, Science 224:500-503). Existen al menos dos tipos distintos de VIH: VIH-1 (Barre-Sinoussi, F. y colaboradores, 1983, Science 220:868-870; Gallo R. y colaboradores, 1984, Science 224:500-503) y VIH-2 (Clavel, F. y colaboradores, 1986, Science 233:343-346; Guyader, M. y colaboradores, 1987, Nature 326:662-669). Además, existe una gran cantidad de heterogeneidad genética dentro de las poblaciones de cada uno de estos tipos. La infección de los linfocitos T CD-4^{+} humanos con un virus de VIH conduce a la depleción del tipo celular y eventualmente a infecciones oportunistas, disfunciones neurológicas, crecimiento neoplásico, y finalmente a la muerte.
El VIH es un miembro de la familia de lentivirus de los retrovirus (Teich, N. y colaboradores, 1984, RNA Tumor Viruses, Weiss, R. y colaboradores, eds., CSH-Press, pgs. 949-956). Los retrovirus son pequeños virus en envoltura que contienen un genoma diploide de ARN de cadena sencilla, y se replica a través de un ADN intermediario producido por medio de una transcriptasa reversa codificada en forma viral, una ADN polimerasa dependiente de ARN (Varmus, H., 1988, Science 240:1427-1439). Otros retrovirus incluyen, por ejemplo, virus oncogénicos tales como los virus de leucemia de células T humanas (HTLV-I,- II,-III), y virus de leucemia felina.
\newpage
La partícula viral de VIH consiste de un núcleo viral, compuesto de proteínas de cápside, que contienen al genoma ARN viral y aquellas enzimas requeridas para los eventos de replicación temprana. La proteína miristilada de Gag forma una cubierta viral exterior alrededor del núcleo viral, que está a su vez rodeado por una membrana lipídica que lo envuelve, derivada de la membrana celular infectada. Las glicoproteínas de la superficie que envuelven al VIH se sintetizan como una proteína precursora única de 160 Kd que es escindida por una proteasa celular durante la gemación viral en dos glicoproteínas, gp41 y gp120. gp41 es una proteína transmembrana y gp120 es una proteína extracelular que permanece asociada en forma no covalente con gp41, posiblemente en forma trimérica o multimérica (Hammarskjold, M. y Rekosh, D., 1989, Biochem. Biophys. Acta 989:269-280).
El VIH se dirige a las células CD-4^{+} debido a que la proteína de la superficie de la célula CD-4 actúa como el receptor celular para el virus VIH-1(Dalgleish, A. y colaboradores, 1984, Nature 312:763-767; Klatzmann y colaboradores, 1984, Nature 312:767-768; Maddon y colaboradores, 1986, Cell 47:333-348). La entrada del virus en las células depende del enlazamiento de las gp120 a las moléculas receptoras celulares de CD-4^{+} (McDougal, J.S. y colaboradores, 1986, Science 231:382-385; Maddon, P.J. y colaboradores, 1986, Cell 47:333-348) y explica por lo tanto el tropismo del VIH para las células CD-4^{+}, mientras que gp41 ancla al complejo envuelto de glicoproteína en la membrana viral.
2.3 Tratamiento del VIH
La infección por VIH es pandémica y las enfermedades asociadas con el VIH representan un problema de salud de primer orden en el mundo. Aunque se hacen considerables esfuerzos para el diseño exitoso de terapias efectivas, actualmente no existen drogas curativas antiretrovirales contra el SIDA. En los intentos por desarrollar tales drogas, se han considerado diferentes etapas del ciclo de vida del VIH como objetivos para intervención terapéutica (Mitsuya, H. y colaboradores, 1991, FASEB J. 5:2369-2381). Por ejemplo, la transcriptasa reversa viralmente codificada ha sido uno de los focos de desarrollo de drogas. Se han desarrollado una multitud de drogas dirigidas a la transcriptasa reversa incluidos los análogos de 2',3'-dideoxinucleósido tales como AZT, ddI, ddC, y d4T, que han demostrado ser activas contra el VIH (Mitsuya, H. y colaboradores, 1991, Science 249:1533-1544). A pesar de ser benéficos, estos análogos de nucleósido no son curativos, probablemente debido a la rápida aparición de mutantes del VIH resistentes a la droga (Lander, B. y colaboradores, 1989, Science 243:1731-1734). Además, las drogas a menudo exhiben efectos secundarios tóxicos, tales como la supresión de la médula ósea, vómito, y anormalidades en la función hepática.
Se han hecho intentos para desarrollar drogas que puedan inhibir la entrada de virus en la célula, la primera etapa de infección del VIH. Aquí, el foco ha estado hasta ahora sobre CD4, el receptor superficial celular párale VIH. CD4 soluble recombinante, por ejemplo, ha mostrado que inhibe la infección de las células T CD-4^{+} por parte de algunas cepas de VIH-1 (Smith, D.H. y colaboradores, 1987, Science 238:1704-1707). Ciertos VIH-1 primarios aislados, sin embargo, son relativamente menos sensibles a la inhibición por parte de CD-4 (Daar, E. y colaboradores, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6574-6579). Además, los ensayos clínicos con CD-4 soluble recombinante han producido resultados no concluyentes (Schooley, R. y colaboradores, 1990, Ann. Int. Med. 112:247-253; Kahn, J.O. y colaboradores, 1990, Ann. Int. Med. 112:254-261; Yarchoan, R. y colaboradores, 1989, Proc. Vth Int. Conf. on AIDS, p. 564, MCP 137).
Las últimas etapas de replicación del VIH, que involucran el procesamiento crucial secundario específico del virus de ciertas proteínas virales, han sido sugeridas también como posibles objetivos de las drogas anti VIH. El procesamiento de la última etapa depende de la actividad de la proteasa viral, y se están desarrollando drogas que inhiben esta proteasa (Erickson, J., 1990, Science 249:527-533). El éxito clínico de estas drogas candidatas está aún en duda.
También se está prestando atención al desarrollo de vacunas para el tratamiento de la infección del VIH. Las proteínas en envoltura del VIH-1 (gp160, gp120, gp41) han mostrado ser los antígenos principales para los anticuerpos anti VIH presentes en los pacientes con SIDA (Barin, y colaboradores, 1985, Science 228:1094-1096). Hasta ahora, por lo tanto, estas proteínas parecen ser los candidatos más prometedores para actuar como antígenos para el desarrollo de una vacuna anti VIH. Para este fin, diferentes grupos han empezado a utilizar diferentes porciones de gp160, gp120, y/o gp41 como objetivos inmunogénicos para el sistema huésped inmune. Ver por ejemplo, Ivanoff, L. y colaboradores, patente estadounidense No. 5,141,867; Saith, G. Y colaboradores, WO 92/22,654; Shafferman, A., WO 91/09,872; Formoso, C. y colaboradores, WO 90/07, 119. Los resultados clínicos concernientes a estas vacunas candidatas, sin embargo, aún permanecen lejanos en el futuro.
Wild y colaboradores, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pgs. 10537-10541, Nov. 1992) describen un péptido sintético que contiene los residuos aminoácidos 558-595 de la glicoproteína gp160 de la envoltura del virus de inmunodeficiencia humana tipo I cepa LAI. Este péptido bloquea eficientemente los procesos de fusión célula-célula mediados por el virus, así como la infección de las células mononucleares sanguíneas periféricas por medio tanto de los aislados prototípicos como primarios de VIH-1. Wild y colaboradores, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, pgs. 12676- 12680, Dic. 1994) ilustra una correlación entre los efectos desestabilizantes de las sustituciones de aminoácidos sobre las estructuras en doble espiral en el modelo de péptido del VIH-1, y el fenotipo del virus que ingresa. Wild y colaboradores, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91 pgs. 9770-9774, Oct. 1994) describe un péptido sintético correspondiente al residuo 643-678 del VIH-1_{LAI} aislado, como un potente agente antiviral, y que bloquea la etapa primaria del ciclo de vida del virus antes de la transcripción reversa.
\newpage
La patente estadounidense número 5,464,933 (fecha de prioridad, 7 de junio de 1993, fecha de publicación 7 de noviembre de 1995) se relaciona con péptidos que exhiben una potente actividad antirretroviral. Estos péptidos corresponden a los aminoácidos 638 a 673 de la proteína gp41 del VIH-1_{LAI}. WO 94/28920 (fecha de prioridad 7 de junio de 1993, fecha de publicación 22 de diciembre de 1994) se relaciona con péptidos que exhiben una potente actividad antirretroviral. Estos péptidos corresponden a los aminoácidos 638 a 673 de la proteína gp41 del VIH- 1_{LAI}. WO 96/40191 (fecha de prioridad 7 de junio de 1995, fecha de publicación 19 de diciembre de 1996) describe nuevas combinaciones antivirales para el tratamiento o la prevención de infecciones virales, en particular, VIH, empleando a los inhibidores de fusión viral DP-178 o DP-107, en combinación con al menos otro agente terapéutico antiviral.
Por lo tanto, aunque se está dirigiendo un gran esfuerzo al diseño y al ensayo de drogas antirretrovirales, se necesita aún un tratamiento no tóxico verdaderamente efectivo.
3. Resumen de la invención
La presente invención se relaciona, primero, con un péptido aislado de VIH-1 o VIH-2 que tienen la formula:
1
2
un péptido aislado del virus sincitial respiratorio que tiene la formula:
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
un péptido aislado de influenza A que tiene la formula:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
un péptido aislado del virus Epstein-Barr que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
un péptido aislado del virus del sarampión que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\newpage
un péptido aislado del virus de la hepatitis B que tiene la fórmula:
8
en el cual los residuos de aminoácidos se presentan por medio del código de una sola letra, X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo, un grupo hidrófobo, o un grupo portador macromolecular, y Z comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo T-butoxicarbonilo o un grupo portador macromolecular.
La presente invención también se relaciona con el uso de los péptidos anteriores para la elaboración de medicamentos para el tratamiento del Virus de Inmunodeficiencia Humana tipo 1 o tipo 2, del Virus Sincitial Respiratorio, Influenza Tipo A, virus Epstein-Barr, virus de sarampión y de Hepatitis B.
DP178 (SEQ ID: 1) es un péptido sintético de 36-aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 638 a 673 de la proteína transmembrana (TM) gp41 del LAT de VIH-1 aislado (VIH-1_{LAI}), que exhibe una potente actividad anti VIH-1. Como se evidencia por medio del Ejemplo presentado más abajo, en la Sección 6, la actividad antiviral del DP178 (SEQ ID: 1) es tan alta que, con base en el peso, ningún otro agente conocido anti VIH es efectivo en concentraciones tan bajas como aquellas a las cuales el DP178 (SEQ ID: 1) exhibe sus efectos inhibidores.
Las porciones y análogos de DP178 también muestran actividad antiviral, y muestran una capacidad de fusión antimembrana, o una capacidad para modular procesos intracelulares que involucran estructuras de péptido en doble espiral. El término "análogo de DP178" se refiere a un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia del péptido DP178 presente dentro de la proteína gp41 del VIH-1_{LAI}, pero encontrado en virus y/o en organismos diferentes al VIH-1_{LAI}. Tales péptidos análogos de DP178 pueden, por lo tanto, corresponder a las secuencias de aminoácidos como la del DP178 presente en otros virus, tales como, por ejemplo, los virus en envoltura, tales como los retrovirus diferentes al VIH-1_{LAI}, así como a los virus que no están en envoltura. Además, tales péptidos análogos de DP178 pueden corresponder también a las secuencias de aminoácidos como las del DP178 presentes en organismos no virales.
DP107 es un péptido correspondiente a los aminoácidos 558-595 de la proteína transmembrana (TM) del VIH-1_{LAI}, gp41. El término "análogo de DP107" como se lo utiliza aquí, se refiere a un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia del péptido DP107 presente dentro de la proteína gp41 del VIH-1_{LAI}, pero encontrada en virus y organismos diferentes al VIH-1_{LAI}. Tales péptidos análogos de DP107 pueden, por lo tanto, corresponder a las secuencias de aminoácidos como la del DP107 presente en otros virus, tal como, por ejemplo, virus en envoltura, tal como los retrovirus diferentes del VIH-1_{LAI}, así como los virus sin envoltura. Además, tales péptidos análogos de DP107 pueden corresponder también a las secuencias de aminoácidos como las del DP107 presentes en organismos no virales.
Los péptidos de la invención pueden, por ejemplo, exhibir actividad antifusogénica, actividad antiviral, y/o pueden tener la capacidad para modular procesos intracelulares que involucran estructuras de péptidos en doble espiral. Con respecto a la actividad antiviral de los péptidos de la invención, tal actividad antiviral incluye, pero no se limita a la inhibición de la transmisión del VIH a células CD-4^{+} no infectadas. Adicionalmente, la capacidad antifusogénica, la actividad antiviral o la actividad moduladora intracelular de los péptidos de la invención requiere simplemente de la presencia de los péptidos de la invención, y, específicamente, no requiere de la estimulación de una respuesta inmune del huésped dirigida contra tales péptidos.
Los péptidos de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, como inhibidores de los eventos asociados a la fusión de la membrana, tales como, por ejemplo, la inhibición de la transmisión retroviral humana y no humana, especialmente VIH, a células no infectadas. Se contempla además que los péptidos de la invención puedan ser utilizados como moduladores de eventos intracelulares que involucran estructuras de péptidos en doble espiral.
Los péptidos de la invención pueden, alternativamente, ser utilizados para identificar compuestos que pueden exhibir por sí mismos actividad moduladora antifusogénica, antiviral, o intracelular. Los usos adicionales incluyen, por ejemplo, el uso de los péptidos de la invención como herramientas de diagnóstico específicas para el tipo y/o subtipo viral o de organismo.
Los términos "antifusogénico" y "fusión antimembrana", como se los utiliza aquí, se refieren a la capacidad del agente para inhibir o reducir el nivel de los eventos de fusión de la membrana entre dos o más fracciones relacionadas con el nivel de fusión de la membrana que ocurre entre dichas fracciones en ausencia del péptido. Las fracciones pueden ser, por ejemplo, membranas celulares o estructuras virales, tales como envolturas virales o pili. El término "antiviral", como se lo usa aquí, se refiere a la capacidad de los compuestos para inhibir la infección viral de las células, a través de, por ejemplo, fusión célula-célula o infección por virus libre. Tal infección pueden involucrar la fusión de la membrana, como ocurre en el caso de los virus en envoltura, o algunos otros eventos de fusión que involucran una estructura viral y una estructura celular (por ejemplo, como la fusión de un pilus viral y de una membrana bacterial durante conjugación bacterial).
Se contempla también que los péptidos de la invención pueden exhibir la capacidad para modular eventos intracelulares que involucran estructuras de péptidos en doble espiral. "Modular", como se lo utiliza aquí, se refiere a un efecto estimulador o inhibidor sobre el proceso intracelular de interés relacionado con el nivel o la actividad de tal proceso, en ausencia de un péptido de la invención.
Se demuestran más abajo modalidades de la invención en donde se muestra que una concentración extremadamente baja de DP178 (SEQ ID: 1), y concentraciones muy bajas de un homólogo de DP178 (SEQ ID: 3) son potentes inhibidores de la fusión célula-célula CD-4^{+} mediada por VIH-1 (esto es, formación sincitial) e infección de células CD-4^{+} por medio de células libres de virus. Además, se muestra que DP178 (SEQ ID: 1) no es tóxico para las células, aún en concentraciones 3 log más altas que la concentración inhibidora de DP-178 (SEQ ID: 1).
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente de que se requiere de las interacciones entre sí de los dominios de DP107 y DP178, del complejo no covalente de la proteína gp41 del VIH, para la infectividad normal del virus. Este descubrimiento está descrito en el Ejemplo presentado, más abajo, en la Sección 8. La invención, por lo tanto, se relaciona además con métodos para identificar compuestos antifusogénicos, incluidos los antivirales, que rompen la interacción entre DP107 y DP178, y/o entre péptidos como DP107 y DP178.
3.1 Definiciones
Los péptidos se definen aquí como compuestos orgánicos que comprenden dos o más aminoácidos unidos covalentemente por medio de enlaces peptídicos. Los péptidos pueden denominarse con respecto al número de aminoácidos constituyentes, esto es, un dipéptido contiene dos residuos de aminoácido, un tripéptido contiene tres, etc. Los péptidos que contienen diez o menos aminoácidos pueden denominarse como oligopéptidos, mientras que aquellos con más de diez residuos de aminoácido son polipéptidos. Tales péptidos pueden incluir también cualquiera de las modificaciones y grupos amino y carboxi adicionales como se describe aquí.
Las secuencias de péptidos definidas aquí se representan por medio de símbolos de una letra para residuos de aminoácidos como sigue:
A
(alanina)
R
(arginina)
N
(asparagina)
D
(ácido aspártico)
C
(cisteína)
Q
(glutamina)
E
(ácido glutámico)
G
(glicina)
H
(histidina)
I
(isoleucina)
L
(leucina)
K
(lisina)
M
(metionina)
F
(fenilalanina)
P
(prolina)
S
(serina)
T
(treonina)
W
(triptófano)
Y
(tirosina)
V
(valina)
La descripción siguiente se relaciona con los diferentes péptidos identificados en términos de los motivos de búsqueda descritos aquí antes. Las secuencias de aminoácidos de la presente invención están todos abarcados por el motivo de búsqueda ALLMOTI5. Las secuencias de aminoácidos abarcadas por todos los otros motivos de búsqueda y no por el motivo de búsqueda ALLMOTI5, se excluyen de la presente invención. También, las secuencias de aminoácidos abarcadas por ALLMOTI5 y que no están dentro del alcance de las reivindicaciones presentes, están excluidas.
4. Breve descripción de las figuras
Figura 1. Secuencia de aminoácidos de DP178 (SEQ ID: 1) derivada de VIH_{LAI}; homólogos de DP178 derivados de VIH-1_{SF2} (DP-185; SEQ ID: 3), VIH-1_{RF} (SEQ ID: 4), y VIH-1_{MN} (SEQ ID: 5); homólogos de DP178 derivados de las secuencias de aminoácidos de dos VIH-2 aislados prototípicos, principalmente, VIH-2_{rod} (SEQ ID: 6) y VIH-2_{NIHZ} (SEQ ID: 7); péptidos de control: DP-180 (SEQ ID: 2), un péptido que incorpora los residuos de aminoácidos de DP178 en una secuencia embrollada; DP-118 (SEQ ID: 10) no relacionada con DP178, que inhibe la infección por el virus de células libres de VIH-1; DP-125 (SEQ ID: 8), no relacionadas con DP178, también inhiben la infección por células libres de virus de VIH-1; DP-116 (SEQ ID: 9), no relacionado con DP178, es negativo para la inhibición de la infección con VIH-1 cuando se los prueba utilizando un ensayo de infección con células libres de virus. A través de la figura se utiliza el código de una letra para los aminoácidos.
Figura 2. Inhibición de la infección con células libres de virus de VIH-1 por medio de péptidos sintéticos. IC_{50} se refiere a la concentración de péptido que inhibe la producción de RT de las células infectadas en un 50%, comparado con el control no tratado. Control: el nivel de RT producido por cultivos de células no tratadas infectadas con el mismo nivel de virus que los cultivos tratados.
Figura 3. Inhibición de la infección con células libres de virus de VIH-1 y VIH-2 por medio del péptido sintético DP178 (SEQ. ID: 1). IC_{50}: concentración de péptido que inhibe la producción de RT en un 50%, comparado con el control no tratado. Control: el nivel de RT producido por cultivos de células no tratadas infectadas con el mismo nivel de virus que los cultivos tratados.
Figuras 4A-4B. Ensayos de Inhibición de Fusión. Figura 4A: DP178 (SEQ. ID: 1), inhibición de la formación sincitial iniciada por el VIH-1 prototípico aislado; los datos representan el número sincitial inducido por virus por célula. Figura 4B: DP-180 (SEQ. ID: 2) representa un péptido de control embrollado; DP-185 (SEQ. ID: 3) representa un homólogo de DP178 derivado del VIH-1_{SF2} aislado; Control, se refiere al número sincitial producido en ausencia del péptido.
Figura 5. Ensayo de inhibición de fusión: VIH-1 vs. VIH-2. Los datos representan el número sincitial inducido por virus por pozo. ND: no hecho.
Figura 6. Estudio de citotoxicidad de DP178 (SEQ. ID: 1) y DP-116 (SEQ. ID: 9) sobre células CEM. Se muestran los datos de proliferación de células.
Figura 7. Representación esquemática de VIH-gp41 y las proteínas de fusión gp41 de proteína enlazada a maltosa (MBP). DP107 y DP178 son péptidos sintéticos basados en las dos hélices putativas de gp41. La letra P en las cajas de DP107 denotan una mutación de Ile por Pro en el aminoácido número 578. Los residuos de aminoácidos se numeran de acuerdo con Meyers y colaboradores, "Human Retroviruses and AIDS", 1991, Theoret. Biol. and Biophys. Group, Los Alamos Natl. Lab., Los Alamos, NM. Las proteínas se describen más completamente, más abajo, en la Sección 8.1.1.
Figura 8. Un punto de mutación alerta la conformación y la actividad anti VIH de M41.
Figura 9. Anulación de la actividad anti VIH de DP178. Se llevaron a cabo ensayos de fusión celular en presencia de DP178 10 nM y de diferentes concentraciones de M41\Delta178 o M41P\Delta178.
Figura 10. Enlazamiento de DP178 a la leucina de cierre de gp41 analizada por medio de FAb-D ELISA.
Figuras 11A-B. Modelos para una transición estructural en la proteína TM del VIH-1. Se proponen dos modelos que indican una transición estructural desde un oligómero nativo hasta un estado fusogénico después de un evento disparador (posiblemente el enlazamiento de gp120 a CD4). Los rasgos comunes de ambos modelos incluyen (1) el estado nativo se mantiene junto por medio de interacciones no covalentes proteína-proteína para formar al heterodímero de gp120/41 y otras interacciones, principalmente a pesar de los sitios interactivos de gp41, para formar homooligómeros sobre la superficie del virus de los complejos gp120/41; (2) la protección del péptido fusogénico hidrofóbico en el N-terminal (F) en el estado nativo; y (3) el dominio de la leucina de cierre (DP107) existe como un homooligómero en doble espiral solamente en el estado fusogénico. Las principales diferencias en los dos modelos incluyen el estado estructural (nativo o fusogénico) en el cual los dominios de DP107 y DP178 se complejan uno con el otro. En el primer modelo (Figura 11A) esta interacción ocurre en el estado nativo y en el segundo (Figura 11B), ocurre durante el estado fusogénico. Cuando se dispara, se genera el complejo de fusión en el modelo descrito en (A) a través de la formación de interacciones en doble espiral en los dominios homólogos de DP107 resultando en una \alpha-hélice extendida. Esta conformación cambia las posiciones del péptido de fusión para interacción con la membrana celular. En el segundo modelo (Figura 11B), el complejo fusogénico se estabiliza por medio de la asociación del dominio de DP178 con la doble espiral de DP107.
Figura 12. Diseño del motivo utilizando una posicionamiento de repetición en la septena de aminoácidos de espirales dobles conocidas.
Figura 13. Diseño de motivo utilizando un posicionamiento propuesto de repetición de septena de aminoácidos de DP107 y DP108.
Figura 14. Diseño de motivo híbrido del cruzamiento de GCN4 y DP107.
Figura 15. Diseño de motivo híbrido del cruzamiento de GCN4 y DP178.
Figura 16. Diseño ilustrativo de motivo híbrido 107x178x4, del cruzamiento de DP107 y DP178. Se encontró que este motivo era el más consistente para la identificación de regiones relevantes de péptidos como el DP107 y el DO178.
Figura 17. Diseño de motivo híbrido del cruzamiento de GCN4, DP107 y DP178.
Figura 18. Diseño de motivo híbrido ALLMOTI5 del cruzamiento de GCN4, DP107, DP178, c-Fos c-Jun, c-Myc. y Flu Loop 36.
Figura 19. Motivos ilustrativos PLZIP diseñados para identificar a los motivos de cierre N-terminales prolina-leucina.
Figura 20. Resultados de búsqueda para proteína gp41 en envoltura del VIH-1 (BRU aislado). Designaciones del motivo de búsqueda de secuencia: Espadas (\ding{171}): 107x178x4; Corazones (\varheartsuit) ALLMOTI1; Bastos (\ding{168}): PLZIP; Diamantes (\blacklozenge): región transmembrana (los dominios putativos transmembrana se identificaron utilizando un programa PC/Gene diseñado para la búsqueda de tales regiones de péptido). Asterisco (*): método Lupas. Las secuencias de aminoácidos identificadas para cada motivo se ponen entre paréntesis por medio de los caracteres respectivos. Las secuencias representativas escogidas con base en las búsquedas de 107x178x4 están subrayadas y en negrilla. Las secuencias de DP107 y DP178 están marcadas y con subrayado doble y en itálica.
Figura 21. Resultados de búsqueda para la glicoproteína F1 de fusión de la cepa A2 del virus sincitial respiratorio humano (RSV). Las designaciones de los motivos de búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 22. Resultados de búsqueda para la proteína gp41 de la envoltura del virus de inmunodeficiencia de simio (SIV) (AGM3 aislado). Las designaciones de los motivos de búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 23. Resultados de búsqueda para la glicoproteína 1 de fusión del virus de moquillo (cepa Onderstepoort). Las designaciones de los motivos de búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 24. Resultados de búsqueda para la glicoproteína F1 de fusión del virus de la enfermedad de newcastle (cepa Australia-Victoria/32). Las designaciones de los motivos de búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 25. Resultados de búsqueda para la glicoproteína F1 de fusión del virus de parainfluenza 3 humana (cepa NIH 47885). Las designaciones de los motivos de búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 26. Resultados de búsqueda para el precursor HA2 de hemaglutinina del virus de influenza A (cepa A/AICHI/2/68). Las designaciones de los motivos de búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figuras 27A-D. Datos de dicroísmo circular y del péptido antiviral del Virus Sincitial Respiratorio (RSV). Figura 27A-B: Péptidos derivados de la región como la F2 DP178/DP107. Datos antiviral y CD. Figura 27C-D: Péptidos derivados de la región como la F1 DP107. Datos del péptido y CD.
La actividad antiviral (AV) se representa por medio de los siguientes símbolos cualitativos:
\bullet
"-", actividad antiviral negativa;
\bullet
"+/-", la actividad antiviral es mayor que 100 \mug/ml;
\bullet
"+", la actividad antiviral está entre 50-100 \mug/ml;
\bullet
"++", la actividad antiviral está entre 20-50 \mug/ml;
\bullet
"+++", la actividad antiviral está entre 1-20 \mug/ml;
\bullet
"++++", actividad antiviral <1 \mug/ml.
Los datos CD, que se refieren al nivel de helicidad se representan por medio de los siguientes símbolos cualitativos:
\bullet
"-", sin helicidad;
\bullet
"+", 25-50% de helicidad;
\bullet
"++", 50- 75% de helicidad;
\bullet
"+++" 75-100% de helicidad.
IC_{50} se refiere a la concentración de péptido necesaria para producir solamente un 50% del número o sincitial relativo a los cultivos de control infectados que no contienen péptido. Los valores de IC_{50} fueron obtenidos utilizando solamente péptidos purificados.
\newpage
Figuras 28A-B. Región como la DP107(F1) del Virus Sincitial Respiratorio. Datos del péptido antiviral y CD. Los símbolos antivirales, símbolos CD, e IC_{50} son como en la Figura 27A-D. Los valores de IC_{50} fueron obtenidos utilizando únicamente péptidos purificados.
Figuras 29A-B. Péptidos derivados de la región como la HPIV3 F1 DP107. Datos del péptido antiviral y CD. Los símbolos antivirales, símbolos CD, e IC_{50} son como en la Figura 27A-D. Se utilizaron péptidos purificados para obtener los valores de IC_{50}, excepto en donde los valores están marcados con un asterisco (*), en cuyo caso, los valores de IC_{50} fueron obtenidos utilizando una preparación de péptido crudo.
Figuras 30A-B. Péptidos derivados de la región como la HPIV3 F1 DP178. Datos del péptido antiviral y CD. Los símbolos antivirales, símbolos CD, e IC_{50} son como en la Figura 27A-D. Se utilizaron péptidos purificados para obtener los valores de IC_{50}, excepto en donde los valores están marcados con un asterisco (*), en cuyo caso, los valores de IC_{50} fueron obtenidos utilizando una preparación de péptido crudo.
Figura 31. Resultados de la búsqueda del motivo para el virus de inmunodeficiencia de simio (VIS) aislado de MM251, en envoltura de poliproteína gp41. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 32. Resultados de la búsqueda del motivo para el Virus de Epstein-Barr (Cepa B95-8), precursor de glicoproteína gp110 (designada gp115). BALF4. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 33. Resultados de la búsqueda del motivo para el Virus de Epstein-Barr (Cepa B95-8), proteína trans-activadora BZLF1 (designada EB1 o Zebra). Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20. Adicionalmente, "@" se refiere al bien conocido dominio de enlazamiento de ADN, y "+" se refiere al bien conocido dominio de dimerización, como lo definen Flemington y Speck (Flemington, E. and Speck, S.H., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9459-9463).
Figura 34. Resultados de la búsqueda del motivo para el virus de sarampión (cepa Edmonston), glicoproteína de fusión F1. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 35. Resultados de la búsqueda del motivo para el Virus de Hepatitis B (Subtipo-AYW), precursor S principal del antígeno de superficie. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 36. Resultados de la búsqueda del motivo para el virus de mono Mason-Pfizer de simio, en envoltura de proteína (TM) gp20. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 37. Resultados de la búsqueda del motivo para la proteína fimbrial (Pilin) de Psudomonas aerginosa,. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 38. Resultados de la búsqueda del motivo para la proteína fimbrial (Pilin) de Neisseria gonorrhoeae. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 39. Resultados de la búsqueda del motivo para la proteína fimbrial de Hemophilus influenzae. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 40. Resultados de la búsqueda del motivo para Staphylococcus aureus, toxina-1 del síndrome de choque tóxico. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 41. Resultados de la búsqueda del motivo para la enterotoxina Tipo E de Staphylococcus aureus. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 42 Resultados de la búsqueda del motivo para la enterotoxina A de Staphylococcus aureus. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 43. Resultados de la búsqueda del motivo para Escherichia coli, enterotoxina A lábil al calor. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 44. Resultados de la búsqueda del motivo para la proto-oncoproteína c-fos humana. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 45. Resultados de la búsqueda del motivo para la proteína P70 autoantígeno de lupus KU humana. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
Figura 46. Resultados de la búsqueda del motivo para proteína 10 de dedo de zinc humana. Las designaciones de la búsqueda de secuencia son como en la Figura 20.
\newpage
Figura 47. Datos antiviral y CD de una región como la DP178 de la proteína de fusión del virus de Sarampión (MeV). Los símbolos antivirales, símbolos CD, e IC_{50} son como en las Figuras 27A-D. Los valores de IC_{50} se obtuvieron utilizando péptidos purificados.
Figura 48. Datos antivirales de una región como la DP178 de la proteína TM (fusión) del virus de inmunodeficiencia de simio (VIS). Los símbolos antivirales son como en las Figuras 27A-D "NT" no se probaron.
Figuras 49A-C. Datos antivirales del péptido derivado de DP178. Los péptidos enlistados aquí se derivaron de la región que rodea a la región DP178 aislada del VIH-1 BRU (por ejemplo, residuos de aminoácido 615-717 de gp41).
En los casos donde los péptidos contenían mutaciones puntuales en DP178, los residuos de aminoácidos mutados se muestran con un fondo sombreado. En los casos en los cuales el péptido de prueba ha tenido un grupo amino y/o carboxi terminal añadido o removido (aparte de los grupos estándar de bloqueo amido y acetilo encontrados sobre tales péptidos), tales modificaciones están indicadas. Figura 49A: La columna inmediatamente a la derecha del nombre del péptido de prueba indica el tamaño de éste y señalan si el péptido se deriva de un péptido con un aminoácido que "avanza" a través de la región DP178. La siguiente columna a la derecha indica si el péptido de prueba contiene una mutación puntual, mientras que la columna a su derecha indica si ciertos residuos de aminoácidos han sido añadidos a, o removidos de la secuencia de aminoácidos derivada de DP178. Figura 49B: La columna inmediatamente a la derecha del nombre del péptido de prueba indica si el péptido representa un truncamiento de DP178, y la siguiente columna a la derecha señala si el péptido contiene una mutación puntual, y la columna a su derecha indica si el péptido contiene aminoácidos que han sido añadidos a, o removidos de la secuencia de DP178 en sí misma. Figura 49C: La columna inmediatamente a la derecha del nombre del péptido de prueba indica si este péptido contiene una mutación puntual, mientras que la columna a su derecha indica si los residuos de aminoácidos han sido añadidos a, o removidos de la secuencia de DP178 en sí misma. IC_{50} es como se define en las Figuras 27A-D, y los valores de IC_{50} se obtuvieron utilizando péptidos purificados excepto donde está marcado con un asterisco (*), en cuyo caso el IC_{50} se obtuvo utilizando una preparación de péptido crudo.
Figura 50. Datos del péptido antiviral de la región truncada de DP107 y DP107 gp41. IC_{50} como se define en las Figuras 27A-D, y los valores de IC_{50} se obtuvieron utilizando péptidos purificados excepto donde está marcado con un asterisco (*), en cuyo caso el IC_{50} se obtuvo utilizando una preparación de péptido crudo.
Figuras 51A-B. El péptido de la región del análogo de DP178/DP107 de la Cepa B95-8 BZLF1 del virus Epstein-Barr avanza y la movilidad electroforética cambia los resultados del ensayo. Los péptidos (T-423 a T-446, Figura 51A; T-447 a T-461, Figura 51B) representan un residuo aminoácido que "avanza" a través de la región de la proteína EBV Zebra desde el residuo aminoácido 173 hasta el 246.
El residuo aminoácido dentro de esta región que corresponde al primer residuo aminoácido de cada péptido se enlista a la izquierda de cada péptido, mientras que el residuo aminoácido dentro de esta región que corresponde al último residuo aminoácido de cada péptido se enlista a la derecha de cada péptido. La longitud de cada péptido de prueba se enlista al extremo derecho de cada línea, bajo el encabezado "Res".
"ACT" se refiere a la capacidad del péptido de prueba para inhibir el enlazamiento de Zebra a su elemento de respuesta. "+" se refiere a una anulación visible, pero incompleta, del complejo homodímero elemento de respuesta/Zebra; "+++" se refiere a una anulación completa del complejo; y "-" representa una falta de ruptura del complejo.
Figuras 52A-B. El péptido y la región análoga de DP178/DP107 de la proteína S precursora del antígeno principal de superficie del subtipo AYW del virus de la Hepatitis B, avanzan. 52A describe el Dominio I (residuos de aminoácidos 174-220 de la proteína S), que contiene una región análoga potencial de DP178/DP107. Además, se enlistan los péptidos que representan un péptido de un aminoácido que "avanza" a través del dominio I. 52B describe el Dominio II (residuos de aminoácidos 233-291 de la proteína S), que contiene una segunda región análoga potencial de DP178/DP107. Además, se enlistan los péptidos que representan un péptido de un aminoácido que "avanza" a través del dominio II.
5. Descripción detallada de la invención
Se describen aquí los péptidos que pueden exhibir actividad antifusogénica, capacidad antiviral, y/o la capacidad para modular procesos intracelulares que involucran estructuras de péptidos en doble espiral. Los péptidos descritos incluyen, primero, DP178 (SEQ. ID NO: 1), un péptido de 36 aminoácidos derivado de gp41 y fragmentos y análogos de DP178.
Además, los péptidos de la invención descritos aquí incluyen péptidos que son análogos de DP107. DP107 (SEQ. ID. NO: 25) es un péptido de 38 aminoácidos que corresponde a los residuos 558 a 595 de la proteína transmembrana (TM) gp41 del VIH-1_{LAI}. Tales análogos de DP107 pueden exhibir capacidad antifusogénica, actividad antiviral, o una capacidad para modular los procesos intracelulares que involucran estructuras en doble espiral.
También se describen aquí los usos antifusogénico, antiviral, modulador intracelular, y de diagnóstico de los péptidos de la invención. Además, se describen los procedimientos para el uso de los péptidos de la invención para la identificación de compuestos que exhiben actividad antifusogénica, antiviral o de modulación intracelular.
En la medida en que no se limita a ninguna teoría de operación, se propone el siguiente modelo para explicar la potente actividad anti VIH de DP178, con base, en parte, en los experimentos descritos en los Ejemplos, infra. En la proteína del VIH, gp41, DP178 corresponde a una región putativa de \alpha-hélice localizada en el extremo C-terminal del ectodominio de gp41, y parece que se asocia con un sitio distal sobre gp41 cuya estructura interactiva está influenciada por el motivo de cierre de leucina, una estructura en doble espiral, mencionada como DP107. La asociación de estos dos dominios puede reflejar un enlazamiento molecular o "broche molecular" íntimamente involucrado en el proceso de fusión. Es de interés que las mutaciones en el motivo C-terminal de la \alpha-hélice de gp41 (esto es, el dominio de DP178) tiendan a mejorar la capacidad de fusión de gp41, mientras que las mutaciones en la región de cierre de leucina (esto es, el dominio de DP107), disminuyen o eliminan la capacidad de fusión de la proteína viral. Puede ser que el motivo del cierre de leucina este involucrado en la fusión de la membrana mientras que el motivo C-terminal de la \alpha-hélice sirve como un seguro molecular para regular la disponibilidad del cierre de leucina durante la fusión de la membrana inducida por el virus.
Con base en lo anterior, se proponen dos modelos de fusión de membrana mediada por gp41 que se muestra esquemáticamente en las Figuras 11A-B. La razón para proponer dos modelos es que la naturaleza temporal de la interacción entre las regiones definidas por DP107 y DP178 no pueden, todavía, ser señalada con precisión. Cada modelo prevé dos conformaciones para gp41 - una en un estado "nativo", como puede ser encontrado sobre un virión de soporte. La otra en un estado "fusogénico" para reflejar los cambios conformacionales que se dispararon después del enlazamiento de gp120 a CD4 y justo antes de la fusión con la membrana de la célula objetivo. La fuerte afinidad de enlazamiento entre gp120 y CD4 puede representar realmente el disparador para el proceso de fusión, obviando la necesidad de un cambio de pH como ocurre para los virus que se fusionan con vesículas intracelulares. Las dos características principales de ambos modelos son: (1) las secuencias de cierre de leucina (DP107), en cada cadena de envoltura oligomérica se mantienen a parte en el estado nativo y solo se les permite el acceso uno al otro en el estado fusogénico para formar las espirales dobles extremadamente estables, y (2) la asociación de los sitios de DP178 y de DP107 como se presentan el gp41, ocurren ya sea en el estado nativo o en el estado fusogénico. La Figura 11A describe
la interacción de DP178/DP107 en el estado nativo como un broche molecular. Por otro lado, si se asume que la forma más estable de la envoltura se presenta en el estado fusogénico, puede considerarse el modelo de la Figura 11B.
Cuando se sintetizan como péptidos, tanto DP107 como DP178 son potentes inhibidores de la infección y de la fusión del VIH, probablemente en virtud de su capacidad para formar complejos con gp41 viral e interfieren con su proceso fusogénico; por ejemplo, durante la transición estructural de la proteína viral desde la estructura nativa hasta el estado fusogénico, los péptidos DP178 y DP107 pueden tener acceso a sus respectivos sitios de enlazamiento sobre el gp41 viral, y ejercer una influencia de ruptura.
Como se muestra el los Ejemplos, infra, una proteína recombinante truncada gp41 correspondiente al ectodominio de gp41 que contiene tanto los dominios de DP107 como de DP178 (excluyendo al péptido de fusión, a la región transmembrana y al dominio citoplasmático de gp41) no inhibió la fusión inducida por VIH-1. Sin embargo, cuando se introdujo una mutación sencilla para romper la estructura en doble espiral del dominio de DP107 - una mutación que resulta en la pérdida total de actividad biológica de los péptidos DP107 - la proteína recombinante inactiva se transformó en un inhibidor activo de la fusión inducida por VIH-1. Esta transformación puede ser el resultado de la liberación del potente dominio de DP178 de un broche molecular con el cierre de leucina, dominio de DP107.
Para claridad de la discusión, la invención será descrita primero para los inhibidores del péptido DP178 del VIH. Sin embargo, los principios pueden aplicarse en forma análoga a otros virus, tanto en envoltura como sin ella, y a otros organismos no virales.
5.1. Péptidos DP178 y como el DP178
El péptido DP178 (SEQ. ID: 1) de la invención corresponde a los residuos aminoácidos 638 a 673 de la proteína transmembrana gp41 del VIH-1_{LAI} aislado, y tiene la secuencia de 36 aminoácidos (leída desde el amino terminal hasta el carboxi terminal):
NH_{2}-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH (SEQ ID: 1)
Además de las 36 unidades de la longitud completa de DP178 (SEQ. ID: 1), los péptidos de la invención pueden incluir truncamientos del péptido DP178 (SEQ. ID: 1) que exhibe actividad antifusogénica, actividad antiviral y/o la capacidad de modular procesos intracelulares que involucren estructuras de péptidos en doble espiral. Los truncamientos de los péptidos DP178 (SEQ. ID: 1) pueden comprender péptidos entre 3 y 36 residuos de aminoácidos (esto es, péptidos en un rango de tamaño desde un tripéptido hasta un polipéptido de 36 unidades), como se muestra en las Tablas I y IA, más abajo. Las secuencias del péptido en estas Tablas se enlistan desde el amino terminal (a la izquierda) hasta el carboxi terminal (a la derecha). "X" puede representa un grupo amino (-NH_{2}) y "Z" puede representar un grupo carboxilo (-COOH). Alternativamente, "X" puede representar un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobencilo, dansilo, o T-butoxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-flourenilmetoxicarbonilo (FMOC); o un grupo macromolecular unido en forma covalente, que incluye pero no se limita a los grupos de un conjugado de ácido graso-lípido, polietilén glicol, carbohidrato o péptido. Además, "Z" puede representar un grupo amido; un grupo T-butoxicarbonilo; o un grupo macromolecular unido en forma covalente, que incluye pero no se limita a grupos de un conjugado de ácido graso-lípido, polietilén glicol, carbohidrato o péptido. Un grupo macromolecular preferido "X" o "Z" es un grupo péptido.
TABLA 1 Carboxi truncamientos de DP178 (SEQ. ID: 1)
9
Se utiliza un código de una letra para el aminoácido.
Adicionalmente,
"X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrofóbico, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-flourenilmetoxicarbonilo (FMOC); un grupo macromolecular portador que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo macromolecular portador que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
TABLA IA Amino truncamientos de DP178 (SEQ. ID: 1)
10
Se utiliza un código de una letra para el aminoácido.
Adicionalmente,
"X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrofóbico, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-flourenilmetoxicarbonilo (FMOC); un grupo macromolecular portador que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo macromolecular portador que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
Los péptidos de la invención también incluyen péptidos como el DP178. "Como el DP178" como se lo utiliza aquí, se refiere, primero, a DP178 y truncamientos de DP178 que contienen uno o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de aminoácidos. Los péptidos de la invención como el DP178 pueden exhibir actividad antifusogénica o antiviral, o pueden exhibir la capacidad de modular los procesos intracelulares que involucran péptidos en doble espiral. Además, tales péptidos como el DP178 pueden poseer características adicionales convenientes, tales como, por ejemplo una mayor biodisponibilidad, y/o estabilidad, o un reconocimiento inmune reducido del huésped.
Las proteínas en la envoltura de VIH-1 y VIH-2 son estructuralmente distintas, pero existe una sorprendente conservación de aminoácidos dentro de las regiones correspondientes de DP178 de los VIH-1 y VIH-2. La conservación de aminoácidos es de naturaleza periódica, sugiriendo alguna concentración de la estructura y/o de la función. Por lo tanto, una clase posible de sustituciones de aminoácidos incluiría aquellos cambios de aminoácidos que se predice que estabilizan la estructura de los péptidos DP178 de la invención. Utilizando las secuencias DP178 y del análogo de DP178 descritas aquí, la persona capacitada puede recopilar fácilmente las secuencias del consenso de DP178 y determinar a partir de ellas, los residuos conservados de aminoácidos que representarían las sustituciones preferidas de aminoácidos.
Las sustituciones de aminoácido pueden ser de naturaleza conservada o no conservada. Las sustituciones conservadas de aminoácidos consisten en el reemplazo de uno o más aminoácidos de la secuencia del péptido DP178 (SEQ. ID: 1) con aminoácidos de carga, tamaño, y/o características de hidrofobicidad similares, tales como, por ejemplo, la sustitución del aminoácido ácido glutámico (E) por el ácido aspártico (D). Las sustituciones no conservadas consisten en el reemplazo de uno o más aminoácidos de la secuencia del péptido DP178 (SEQ. ID: 1) con aminoácidos de carga, tamaño, y/o características de hidrofobicidad disímiles, tales como, por ejemplo, la sustitución del aminoácido ácido glutámico (E) por el valina (V).
Las inserciones de aminoácidos pueden consistir de residuos sencillos de aminoácidos o extensiones de residuos. Las inserciones pueden hacerse en el extremo carboxi o amino terminal de los péptidos DP178 o DP178 truncado, así como en una posición interna del péptido. Tales inserciones estarán generalmente en el rango de 2 a 15 aminoácidos de longitud. Se contempla que las inserciones hechas ya sea en el carboxi terminal o en el amino terminal del péptido de interés, puedan ser de un rango de tamaño mayor, preferiblemente desde alrededor de 2 hasta alrededor de 50 aminoácidos.
Las inserciones preferidas amino o carboxi terminales son de péptidos en el rango desde alrededor de 2 hasta alrededor de 50 residuos de aminoácidos de longitud, que corresponden a las regiones de la proteína gp41 ya sea en las posiciones amino o carboxi de la secuencia real de aminoácidos de DP178 gp41, respectivamente. Así, una inserción preferida de aminoácidos amino terminal o carboxi terminal contendría secuencias de aminoácidos de gp41 encontradas en forma inmediata a la posiciones amino o carboxi de la región DP178 de la proteína gp41.
Las supresiones de DP178 (SEQ. ID: 1) o de los truncamientos de DP178 se encuentran también dentro del alcance de la invención. Tales supresiones consisten de la remoción de uno o más aminoácidos de la secuencia de DP178 o de un péptido como el DP178, con la longitud límite inferior de la secuencia del péptido resultante entre 4 a 6 aminoácidos. Tales supresiones pueden involucrar una porción discreta única contigua o mayor que las secuencias del péptido.
Los análogos de DP178 se describen además más abajo, en la Sección 5.3.
5.1. Péptidos DP107 y como el DP107
Además, los péptidos de la invención incluyen péptidos que tiene secuencias de aminoácidos que corresponden a los análogos de DP107. DP107 es un péptido de 38 aminoácidos que exhibe una potente actividad antiviral, y corresponde a los residuos 558 a 595 de la proteína transmembrana (TM) gp41 del VIH-1_{LAI}, como se muestra aquí:
NH_{2}-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ-COOH (SEQ ID: 25)
Además de las 38 unidades de la longitud completa de DP107 (SEQ. ID: 25), los péptidos de la invención pueden incluir truncamientos del péptido DP107 (SEQ. ID: 25) que exhibe actividad antifusogénica, actividad antiviral y/o la capacidad de modular procesos intracelulares que involucren estructuras de péptidos en doble espiral. Los truncamientos de los péptidos DP107 (SEQ. ID: 25) pueden comprender péptidos entre 3 y 38 residuos de aminoácidos (esto es, péptidos en un rango de tamaño desde un tripéptido hasta un polipéptido de 38 unidades), como se muestra en las Tablas II y IIA, más abajo. Las secuencias del péptido en estas Tablas se enlistan desde el amino terminal (a la izquierda) hasta el carboxi terminal (a la derecha). "X" puede representa un grupo amino (-NH_{2}) y "Z" puede representar un grupo carboxilo (-COOH). Alternativamente, "X" puede representar un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobencilo, dansilo, o T-butoxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-flourenilmetoxicarbonilo (FMOC); o un grupo macromolecular unido en forma covalente, que incluye pero no se limita a los grupos de un conjugado de ácido graso-lípido, polietilén glicol, carbohidrato o péptido. Además, "Z" puede representar un grupo amido; un grupo T-butoxicarbonilo; o un grupo macromolecular unido en forma covalente, que incluye pero no se limita a grupos de un conjugado de ácido graso-lípido, polietilén glicol, carbohidrato o péptido. Un grupo macromolecular preferido "X" o "Z" es un grupo péptido.
TABLA II carboxi truncamientos de DP107 (SEQ. ID: 25)
11
Se utiliza un código de una letra para el aminoácido.
Adicionalmente,
"X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrofóbico, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-flourenilmetoxicarbonilo (FMOC); un grupo macromolecular portador que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo macromolecular portador que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
TABLA IIA Amino truncamientos de DP178 (SEQ. ID: 25)
12
Se utiliza un código de una letra para el aminoácido.
Adicionalmente,
"X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrofóbico, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-flourenilmetoxicarbonilo (FMOC); un grupo macromolecular portador que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo macromolecular portador que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
Los péptidos de la invención también incluyen péptidos como el DP107. "Como el DP107" como se lo utiliza aquí, se refiere, primero, a DP107 y truncamientos de DP107 que contienen uno o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de aminoácidos. Los péptidos de la invención como el DP107 pueden exhibir actividad antifusogénica o antiviral, o pueden exhibir la capacidad de modular los procesos intracelulares que involucran péptidos en doble espiral. Además, tales péptidos como el DP107 pueden poseer características adicionales convenientes, tales como, por ejemplo una mayor biodisponibilidad, y/o estabilidad, o un reconocimiento inmune reducido del huésped.
Las proteínas en la envoltura de VIH-1 y VIH-2 son estructuralmente distintas, pero existe una sorprendente conservación de aminoácidos dentro de las regiones correspondientes de DP107 de los VIH-1 y VIH-2. La conservación de aminoácidos es de naturaleza periódica, sugiriendo alguna concentración de la estructura y/o de la función. Por lo tanto, una clase posible de sustituciones de aminoácidos incluiría aquellos cambios de aminoácidos que se predice que estabilizan la estructura de los péptidos DP107 de la invención. Utilizando las secuencias DP107 y del análogo de DP107 descritas aquí, la persona capacitada puede recopilar fácilmente las secuencias del consenso de DP107 y determinar a partir de ellas, los residuos conservados de aminoácidos que representarían las sustituciones preferidas de aminoácidos.
Las sustituciones de aminoácido pueden ser de naturaleza conservada o no conservada. Las sustituciones conservadas de aminoácidos consisten en el reemplazo de uno o más aminoácidos de la secuencia del péptido DP107 (SEQ. ID: 25) con aminoácidos de carga, tamaño, y/o características de hidrofobicidad similares, tales como, por ejemplo, la sustitución del aminoácido ácido glutámico (E) por el ácido aspártico (D). Las sustituciones no conservadas consisten en el reemplazo de uno o más aminoácidos de la secuencia del péptido DP107 (SEQ. ID: 25) con aminoácidos de carga, tamaño, y/o características de hidrofobicidad disímiles, tales como, por ejemplo, la sustitución del aminoácido ácido glutámico (E) por el valina (V).
Las inserciones de aminoácidos pueden consistir de residuos sencillos de aminoácidos o extensiones de residuos. Las inserciones pueden hacerse en el extremo carboxi o amino terminal de los péptidos DP107 o DP107 truncado, así como en una posición interna del péptido. Tales inserciones estarán generalmente en el rango de 2 a 15 aminoácidos de longitud. Se contempla que las inserciones hechas ya sea en el carboxi terminal o en el amino terminal del péptido de interés, puedan ser de un rango de tamaño mayor, preferiblemente desde alrededor de 2 hasta alrededor de 50 aminoácidos.
Las inserciones preferidas amino o carboxi terminales son de péptidos en el rango desde alrededor de 2 hasta alrededor de 50 residuos de aminoácidos de longitud, que corresponden a las regiones de la proteína gp41 ya sea en las posiciones amino o carboxi de la secuencia real de aminoácidos de DP107 gp41, respectivamente. Así, una inserción preferida de aminoácidos amino terminal o carboxi terminal contendría secuencias de aminoácidos de gp41 encontradas en forma inmediata a la posiciones amino o carboxi de la región DP107 de la proteína gp41.
Las supresiones de DP107 (SEQ. ID: 25) o de los truncamientos de DP178 se encuentran también dentro del alcance de la invención. Tales supresiones consisten de la remoción de uno o más aminoácidos de la secuencia de DP107 o de un péptido como el DP107, con la longitud límite inferior de la secuencia del péptido resultante entre 4 a 6 aminoácidos. Tales supresiones pueden involucrar una porción discreta única contigua o mayor que las secuencias del péptido.
Para propósitos de ilustración solamente, la estrategia de búsqueda que fue empleada para identificar a los péptidos de la presente invención se describe completamente, más abajo, en el Ejemplo presentado en la Sección 9. Mientras que esta estrategia de búsqueda se basa, en parte, sobre un motivo aminoácido primario deducido de DP107 y DP178, no se basa solamente en la búsqueda de homologías primarias de secuencia de aminoácidos, como tal homologías de secuencia de proteína existen dentro, pero no entre los grupos principales de virus. Por ejemplo, la homología primaria de secuencia de aminoácidos es alta dentro de la proteína TM de diferentes cepas de VIH-1, o dentro de la proteína TM de diferentes aislados de virus de inmunodeficiencia de simio (VIS). La homología primaria de la secuencia de aminoácidos entre VIH-1 y VIS, sin embargo, es lo suficientemente baja como para no ser útil. No es posible, por lo tanto, encontrar regiones de péptidos similares a DP107 o DP178 dentro de otros virus, o dentro de organismos no virales, ya sea estructuralmente, o bien, con base en la homología primaria de secuencia, solamente.
Además, mientras que sería potencialmente útil identificar arreglos primarios de secuencia de aminoácidos con base en, por ejemplo, las características fisicoquímicas de diferentes clases de aminoácidos, en vez de basarse en los aminoácidos específicos por sí mismos, tales estrategias de búsqueda, han probado ser hasta ahora inadecuadas. Por ejemplo, un algoritmo de computador diseñado por Lupas y colaboradores para identificar la propensión en doble espiral de las regiones dentro de las proteínas (Lupas, A., y colaboradores, 1991 Science 252:1162.1164), es inadecuado para identificar regiones de proteína análogas de DP107 o DP178.
Específicamente, el análisis de gp160 del VIH-1 (que contiene tanto gp120 como gp41) utilizando el algoritmo de Lupas, no identifica la región en doble espiral dentro de DP107. Sin embargo, identifica una región dentro de DP178 iniciando en ocho aminoácidos del N-terminal del comienzo de DP178 y terminando en ocho aminoácidos del C-terminal. El péptido DP107 ha mostrado experimentalmente que forma una doble espiral estable. Una búsqueda basada en el algoritmo de búsqueda de Lupas, por lo tanto, no habría identificado a la región en doble espiral de DP107. A la inversa, el algoritmo de Lupas identificó a la región de DP178 como un motivo potencial en doble espiral. Sin embargo, el péptido derivado de la región de DP178 falló en formar una doble espiral en solución.
Una posible explicación de la incapacidad del algoritmo de búsqueda de Lupas para identificar en forma precisa secuencias de doble espiral dentro del VIH-1 TM, es que el algoritmo de Lupas se basa en la estructura de doble espiral de las proteínas que no son estructural o funcionalmente similares a las proteínas TM de los virus, de los péptidos antivirales (por ejemplo, DP107 y DP178) que son un objetivo de esta invención.
La estrategia de búsqueda por computador de la invención, como se demuestra en los Ejemplos presentados más adelante, en las Secciones 9 a 16, y 19 a 25, identifica en forma exitosa las regiones de proteínas similares a DP107 o DP178. Esta estrategia de búsqueda fue diseñada para ser utilizada con un paquete de base de datos de secuencia comercialmente disponible, preferiblemente PC/Gene.
Se diseñaron una serie de motivos de búsqueda, los motivos 107x178x4, ALLMOTI5 y PLZIP, y se modificaron genéticamente para fluctuar estrechamente en estricta tolerancia, como se discute en esta Sección y en la Sección 9. Las secuencias identificadas a través de tales motivos de búsqueda, tales como aquellos enlistados en las tablas V-XIV, más abajo, que exhiben potencialmente actividad antifusogénica, tal como la actividad antiviral, adicionalmente pueden ser útiles en la identificación de compuestos antifusogénicos, tale como compuestos antivirales, y se pretende que estén dentro del alcance de la invención.
Las secuencias en doble espiral se piensa que consisten de repeticiones de septenas de aminoácidos. Por facilidad de la descripción, las posiciones de los aminoácidos dentro de las repeticiones de septenas se mencionan como A hasta G, siendo la primera posición A, la segunda B, etc. Los motivos utilizados aquí para identificar secuencias como DP107 y como DP178, están diseñados para buscar específicamente y para identificar a tales repeticiones de septenas. En las descripciones de cada uno de los motivos descritos, más abajo, los aminoácidos incluidos entre paréntesis angulares, esto es, [], designan a los únicos residuos de aminoácidos que son aceptables en la posición dada, mientras que los aminoácidos incluidos entre corchetes, esto es, {}, designan a los únicos aminoácidos que son inaceptables en una posición dada de la septena. Cuando un juego de aminoácidos entre paréntesis angulares o entre corchetes está seguido por un número entre paréntesis, esto es, (), se refiere al número de posiciones subsiguientes de aminoácidos para las cuales se mantiene el juego designado de aminoácidos, por ejemplo, un (2) significa "para las dos posiciones siguientes de aminoácidos en la septena".
Los ALLMOTI5 se escriben como sigue:
\bullet
{CDGHP}-{CFP}(2)-{CDGHP}-{CFP}(3)-
\bullet
{CDGHP}- {CFP}(2)-{CDGHP}-{CFP}(3)-
\bullet
{CDGHP}-{CFP}(2)-{CDGHP}-{CFP}(3)-
\bullet
{CDGHP}-{CFP}(2)-{CDGHP}-{CFP}(3)-
\bullet
{CDGHP}-{CFP}(2)- {CDGHP}-{CFP}(3)-
La traducción de este motivo, se leería: ``en la primera posición (A) de la septena, cualquier residuo aminoácido excepto C, D, G, H, o P es aceptable, en las siguientes dos posiciones de aminoácidos (B, C), cualquier residuo aminoácido excepto C, F, o P es aceptable, en la cuarta posición de la septena (D), cualquier residuo aminoácido excepto C, posición (D) en la septena, cualquier residuo aminoácido excepto C, D, G, H, o P es aceptable, en las tres siguientes posiciones de aminoácidos (E, F, G), cualquier residuo aminoácido excepto C, F, o P es aceptable. Este motivo se diseña para la búsqueda de cinco repeticiones consecutivas en la septena (por lo tanto la repetición de la primera línea cinco veces), lo que significa que busca los péptidos de un tamaño de 35 unidades. También puede diseñarse para buscar de 28 unidades, repitiendo solamente el motivo inicial cuatro veces. Con respecto al motivo ALLMOTI5, se prefiere una búsqueda de 35 unidades. Aquellas secuencias virales (no bacteriófagas) identificadas a través de tal motivo ALLMOTI5 se enlistan en la Tabla V, más abajo, al final de esta Sección. En aquellas instancias en donde un gen único exhibe más de una secuencia reconocida por medio del motivo de búsqueda ALLMOTI5, el número de residuos de aminoácidos de estas secuencias se enlista bajo el "Área 2", "Área 3", etc. Esta convención se usa para cada una de las Tablas enlistadas, más abajo, al final de la Sección.
El motivo 107x178x4 se escribe como sigue:
\bullet
[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP}(2)-[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP}(3)-
\bullet
[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP}(2)-[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP}(3)-
\bullet
[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP}(2)-[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP}(3)-
\bullet
[EFIKLNQSTVWY] -{CFMP}(2)-[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP}(3)-
La traducción de este motivo, se leería: ``en la primera posición (A) de la septena, solamente el residuo aminoácido E, F, I, K, L, N, Q, S, T, V, W, o Y es aceptable, en las siguientes dos posiciones de aminoácidos (B, C), cualquier residuo aminoácido excepto C, F, M o P es aceptable, en la cuarta posición (D), solamente el residuo aminoácido E, F, I, K, L, N, Q, S, T, V, W, o Y es aceptable, en las tres siguientes posiciones de aminoácidos (E, F, G), cualquier residuo aminoácido excepto C, F, M o P es aceptable. Este motivo se diseña para la búsqueda de cuatro repeticiones consecutivas en la septena (por lo tanto la repetición de la primera línea cuatro veces), lo que significa que busca los péptidos de un tamaño de 28 unidades. También puede diseñarse para buscar de 35 unidades, repitiendo el motivo inicial cinco veces. Con respecto al motivo 107x178x4, se prefiere una búsqueda de 28 unidades.
Aquellas secuencias virales (no bacteriófagas) identificadas a través de tal motivo 107x178x4 se enlistan en la Tabla VI, más abajo, al final de esta Sección.
El motivo de búsqueda 107x178x4 fue utilizado también para identificar las secuencias de proteína de procariotas no virales, como se enlistan en la Tabla VIII, más abajo, al final de la Sección. Además, este motivo de búsqueda fue utilizado para revelar un número de proteínas humanas. Los resultados de esta búsqueda 107x178x4 de proteína humana se enlistan en la Tabla IX, más abajo, al final de esta Sección.
Las series de motivos PLZIP son como se enlistan en la Figura 19. Estos motivos están diseñados para identificar a septenas como las de doble espiral de leucina de cierre, en donde al menos un residuo de prolina está presente a alguna distancia predefinida N-terminal de la repetición. Estos motivos PLZIP encuentran regiones de proteínas con similitudes a la DP178 del VIH-1 generalmente localizada justo N-terminal del ancla transmembrana. Estos motivos pueden ser traducidos de acuerdo con la misma convención descrita antes. Cada línea descrita en la Figura 19 representa un único motivo de búsqueda completa. "X" en estos motivos se refiere a cualquier residuo aminoácido. En los ejemplos en donde un motivo contiene dos números dentro de paréntesis, esto se refiere a un número variable de residuos de aminoácidos. Por ejemplo, X (1, 12) se traduce como "el siguiente a los doce residuos aminoácidos, inclusive, puede ser cualquier aminoácido".
Las Tablas X a XIV, más abajo, al final de esta Sección, enlistan las secuencias identificadas a través de las búsquedas conducidas con tales motivos PLZIP. Específicamente, la Tabla X enlista secuencias virales identificadas a través de los motivos d búsqueda PCTLZIP, P1CTLZIP y P2CTLZIP, la Tabla XI enlista secuencias virales identificadas a través de los motivos de búsqueda P3CTLZIP, P4CTLZIP, P5CTLZIP y P6CTLZIP, la Tabla XII enlista secuencias virales identificadas a través de los motivos de búsqueda P7CTLZIP, P8CTLZIP y P9CTLZIP, la Tabla XIII enlista secuencias virales identificadas a través de los motivos de búsqueda P12CTLZIP y la Tabla XIV enlista secuencias virales identificadas a través de los motivos de búsqueda P23CTLZIP.
Los Ejemplos presentados en las Secciones 17, 18, 26 y 27 más abajo, demuestran que las secuencias virales identificadas a través de las búsquedas de motivos descritas aquí, identifican características antivirales sustanciales. Específicamente, el Ejemplo presentado en la Sección 17 describe péptidos con actividad de virus sincitial antirespiratorio, el Ejemplo presentado en la Sección 18 describe péptidos con actividad de virus antiparainfluenza, el Ejemplo presentado en la Sección 26 describe péptidos con actividad de virus antisarampión y el Ejemplo presentado en la Sección 27 describe péptidos con antisímica, pueden incluir cualquiera de los grupos aminoterminales adicionales como se describió antes para grupos "X", y puede incluir también a cualquiera de los grupos carboxiterminales como se describió antes para los grupos "Z".
Adicionalmente, los truncamientos de los péptidos identificados DP107 y DP178 se encuentran entre los péptidos de la invención. Además, tales análogos de DP107 y DP178 y los truncamientos análogos de DP107/DP178 pueden exhibir una o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de aminoácidos. Las sustituciones, inserciones y supresiones de aminoácidos del análogo de DP178, son como se describen, más arriba, para péptidos como el DP178 en la Sección 5.1. Las sustituciones, inserciones y supresiones de aminoácidos del análogo de DP107, son como se describen, más arriba, para péptidos como el DP107 en la Sección 5.2.
Las Tablas XV a XXII, más adelante, presentan ejemplos representativos de tales truncamientos de DP107/DP178. Específicamente, la Tabla XV presenta truncamientos carboxi análogos de DP107 de la región F1 del Virus Sincitial Respiratorio, la Tabla XVI presenta truncamientos amino análogos de DP107 de la región F1 del Virus Sincitial Respiratorio, la Tabla XVII presenta truncamientos carboxi análogos de DP178 de la región F1 del Virus Sincitial Respiratorio, la Tabla XVIII presenta truncamientos amino análogos de DP178 de la región F1 del Virus Sincitial Respiratorio, la Tabla XIX presenta truncamientos carboxi análogos de DP178 de la región F1 del Virus de Parainfluenza Humana 3, la Tabla XX presenta truncamientos amino análogos de DP178 de la región F1 del Virus de Parainfluenza Humana 3, la Tabla XXI presenta truncamientos carboxi análogos de DP107 de la región F1 del Virus de Parainfluenza Humana 3, y la Tabla XXII presenta truncamientos amino análogos de DP107 de la región F1 del Virus de Parainfluenza Humana 3. Además, la Tabla XXIII, más adelante, presenta análogos de DP107/DP178 y truncamientos análogos que exhiben actividad antiviral sustancial. Estos péptidos antivirales se agrupan de acuerdo al virus específico que ellos inhiben, incluido el virus sincitial respiratorio, el virus de parainfluenza humana 3, el virus de inmunodeficiencia simia y el virus del sarampión.
TABLA V
Resumen de los resultados de búsqueda de ALLMOTI5 Para todas las proteínas virales (no bacteriófagas)
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68 
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TABLA VI
Resumen de los resultados de búsqueda de 107 x 178 x 4 Para todas las proteínas virales (no bacteriofagas) Solamente para propósitos ilustrativos
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TABLA VII
Resumen de resultados de búsqueda de 107 x 178 x 4 Solamente para propósitos de ilustración
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TABLA VIII
Resumen de los resultados de búsqueda de 107 x 178 x 4 Para todas las proteínas procarioticas virales Solamente para propósitos ilustrativos
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TABLA IX
Resumen de resultados de búsqueda de 107 x 178 x 4 Para todas las proteínas humanas Solamente para propósitos ilustrativos
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TABLA X
Resumen de resultados de búsqueda para los motivos PCTLZIP P1CTLZIP, y P2CTLZIP Solamente para propósitos ilustrativos
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TABLA IX
Resumen de resultados de búsqueda para los motivos P4CTLZIP, P5CTLZIP, y P6CTLZIP Solamente para propósitos ilustrativos
193
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195
196 
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TABLA XII
Resumen de los resultados de búsqueda de los motivos P7CTLZIP, P8CTLZIP y P9CTLZIP Solamente para propósitos ilustrativos
197
198
199 
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TABLA XIII
Resumen de los resultados de búsqueda para el motivo P12LZIPC Solamente para propósitos ilustrativos
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TABLA XIV
Resumen de los resultados de búsqueda Para los motivos P23TLZIPC Solamente para propósitos ilustrativos
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TABLA XV Carboxi truncamientos del análogo de la región F2 de DP107 del virus sincitial respiratorio
271
Se utiliza el código de una letra para los aminoácidos.
Adicionalmente,
\newpage
"X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
TABLA XVI Amino truncamientos del análogo de la región F2 de DP178/DP107 del virus sincitial respiratorio
272
Se utiliza el código de una letra para los aminoácidos.
Adicionalmente, "X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
TABLA XVII Carboxi truncamientos del análogo de la región F1 de DP178 del virus sincitial respiratorio
273
Se utiliza el código de una letra para los aminoácidos.
Adicionalmente, "X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
TABLA XVIII Amino truncamientos del análogo de la región F1 de DP178 del virus sincitial respiratorio
274
Se utiliza el código de una letra para los aminoácidos.
Adicionalmente, "X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
TABLA XIX Carboxi truncamientos del análogo de la región F1 de DP178 del virus 3 de parainfluenza humana
275
Se utiliza el código de una letra para los aminoácidos.
Adicionalmente, "X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
TABLA XX Amino truncamientos del análogo de la región F1 de DP178 del virus 3 de parainfluenza humana
276
Se utiliza el código de una letra para los aminoácidos.
Adicionalmente, "X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
TABLA XXI Carboxi truncamientos del análogo de la región F1 de DP107 del virus 3 de parainfluenza humana
277
Se utiliza el código de una letra para los aminoácidos.
Adicionalmente, "X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
TABLA XXII Amino truncamientos del análogo de la región F1 de DP107 del virus 3 de parainfluenza humana
278
Se utiliza el código de una letra para los aminoácidos.
Adicionalmente, "X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
\newpage
TABLA XXIII
Peptidos antivirales representativos del análogo de DP107/DP178 Péptidos del virus sincitial antirespiratorio
279 
\newpage
Péptidos del virus 3 de parainfluenza antihumana
280
Péptidos del virus de inmunodeficiencia antisimia
281 
\newpage
Péptidos del virus antisarampión
282
Se utiliza el código de una letra para los aminoácidos.
Adicionalmente, "X" puede representar un grupo amino, un grupo hidrófobo, que incluye pero no se limita a carbobenzoxilo, dansilo, o T-butiloxicarbonilo; un grupo acetilo; un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC); un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
"Z" puede representar un grupo carboxilo; un grupo amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo portador macromolecular que incluye pero no se limita a conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, o carbohidratos.
5.4 Síntesis de péptidos
Los péptidos de la invención pueden ser sintetizados o preparados por medio d técnicas bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N.Y., que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los péptidos cortos, por ejemplo, pueden sintetizarse sobre un soporte sólido o en solución. Los péptidos más largos pueden hacerse utilizando técnicas de ADN recombinante. Aquí, las secuencias de nucleótido que codifican a los péptidos de la invención pueden sintetizarse, y/o clonarse, y expresarse de acuerdo con técnicas bien conocidas por aquellos ordinariamente entrenados en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY.
Los péptidos de la invención pueden alternativamente sintetizarse detal forma que una o más de las uniones que enlazan los residuos de aminoácidos de los péptidos sean enlaces no peptídicos. Estos enlaces no peptídicos alternativos pueden formarse usando reacciones bien conocidas por aquellos entrenados en el arte, y pueden incluir, pero no limitarse a uniones imino, éster, hidracida, semicarbazida, y azo, para mencionar solo unas pocas. En aún otra modalidad de la invención, los péptidos que comprenden a las secuencias anteriormente descritas pueden sintetizarse con grupos químicos adicionales presentes en sus amino y/o carboxi terminales, de tal forma que, por ejemplo, la estabilidad, la biodisponibilidad, y/o la actividad inhibitoria de los péptidos se mejora. Por ejemplo, los grupos hidrófobos tales como los grupos carbobenzoxilo, dansilo, o t-butiloxicarbonilo, pueden añadirse a los terminales amino de los péptidos. Igualmente, pueden ubicarse un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo a los terminales amino de los péptidos. (Ver "X" en las Tablas I a IV, más arriba). Adicionalmente, pueden añadirse al grupo carboxi terminal de los péptidos el grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo, o un grupo amido. (Ver "Z" en las Tablas I a IV, más arriba).
Además, los péptidos de la invención pueden sintetizarse de tal manera que su configuración estérica se altere. Por ejemplo, puede utilizarse el isómero D de uno o más de los residuos aminoácidos del péptido, en vez del isómero L usual.
Aún más, al menos uno de los residuos aminoácidos de los péptidos de la invención puede sustituirse por uno de los bien conocidos residuos aminoácidos que se presenta en forma no natural. Alteraciones como estas pueden servir para incrementar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la acción inhibitoria de los péptidos de la invención.
Cualquiera de los péptidos descritos anteriormente puede, adicionalmente, tener un grupo macromolecular portador unido covalentemente a sus terminales amino y/o carboxi. Tales grupos macromoleculares portadores pueden incluir, por ejemplo, conjugados de ácido graso-lípido, polietilén glicol, carbohidratos o péptidos adicionales. "X", en las tablas I a IV, más arriba, pueden representar por lo tanto adicionalmente a cualquiera de los grupos macromoleculares portadores anteriores unidos covalentemente al amino terminal de un péptido, con un grupo peptídico adicional como el preferido. Igualmente, "Z", en las Tablas I a IV, puede adicionalmente representar a cualquiera de los grupos macromoleculares portadores descritos más arriba.
5.5. Ensayos para la actividad de fusión antimembrana
Se describen aquí los métodos para la capacidad de un compuesto, tal como los péptidos de la invención, para inhibir los eventos de fusión de membrana. Específicamente, los ensayos para los eventos de fusión celular se describen en la Sección 5.5.1, más adelante, y los ensayos para la actividad antiviral se describen en la Sección 5.5.2, más adelante.
5.5.1 Ensayos para los eventos de fusión celular
Los ensayos para los eventos de fusión celular son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica, y pueden ser utilizados, por ejemplo, junto con los péptidos de la invención para probar las capacidades antifusogénicas de los péptidos.
Los ensayos de fusión celular se llevan a cabo generalmente in vitro. Tales ensayos pueden comprender el cultivo de células que, en ausencia de cualquier tratamiento sufrirían un nivel observable de formación sincitial. Por ejemplo, las células no infectadas pueden incubarse en presencia de células infectadas crónicamente con un virus que induce fusión celular. Tales virus pueden incluir, pero no limitarse a, VIH, VIS, o virus sincitial respiratorio.
Párale ensayo, se incuban las células en presencia de un péptido para ser ensayado. Para cada péptido, puede probarse un rango de concentraciones de péptido. Este rango debe incluir un cultivo de control en donde no se ha añadido péptido.
Se utilizan condiciones estándar bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica para cultivar las células. Después de la incubación durante un período apropiado (24 horas a 37ºC, por ejemplo) se examina el cultivo al microscopio para detectar la presencia de células multinucleadas gigantes, como una indicación de fusión celular y de formación sincitial. Pueden utilizarse colorantes conocidos, tales como el cristal violeta, para facilitar la visualización de la formación sincitial.
5.5.2 Ensayos para actividad antiviral
La actividad antiviral exhibida por los péptidos de la invención pueden medirse, por ejemplo, por medio de ensayos fácilmente realizados in vitro, tales como descritos más adelante, que pueden analizar la capacidad de los péptidos para inhibir la formación de sincitios, o su capacidad para inhibir la infección con células libres de virus. Utilizando estos ensayos, pueden determinarse parámetros tales como la actividad antiviral relativa de los péptidos, que se exhibe contra una cepa dada de virus y/o la actividad inhibidora específica de la cepa del péptido.
Puede utilizarse un ensayo de fusión celular para probar la capacidad de los péptidos para inhibir la formación de sincitios in vitro inducidos por virus, tal como la inducida por VIH. Un ensayo así puede comprender el cultivo de células infectadas en presencia de células infectadas en forma crónica con un virus de inducción sincitial y un péptido para ser ensayado. Para cada péptido, puede ensayarse un rango de concentraciones de péptido. Este rango debe incluir un cultivo de control en donde no se ha añadido un péptido. Se utilizan condiciones estándar para el cultivo, bien conocidas por aquellos normalmente entrenados en la técnica. Después de la incubación durante un período apropiado (24 horas a 37ºC, por ejemplo), se examina el cultivo al microscopio por la presencia de células gigantes multinucleadas, que son indicativas de fusión celular y de formación de sincitios. Pueden utilizarse colorantes bien conocidos, tal como el colorante cristal violeta, para facilitar la visualización sincitial. Tomando como ejemplo al VIH, tal ensayo comprendería células CD-4^{+} (tal como células Molt o CEM, por ejemplo) cultivadas en presencia de células infectadas crónicamente con VIH y un péptido que va a ser ensayado.
Pueden ensayarse también otras características bien conocidas de infección viral para probar las capacidades antivirales del péptido. Tomando nuevamente al VIH como ejemplo, puede utilizarse un ensayo de transcriptasa reversa (RT) para analizar la capacidad de los péptidos para inhibir la infección de las células CD-4^{+} por medio de células libres de VIH. Tal ensayo puede comprender el cultivo de una concentración apropiada de virus (esto es, TCID_{50}) y de células CD-4^{+} en presencia del péptido que va a ser analizado. Se utilizan condiciones de cultivo, bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica. Como anteriormente, puede utilizarse un rango de concentraciones de péptido, además de un cultivo de control en donde no se ha añadido péptido. Después de la incubación durante un período apropiado (por ejemplo, 7 días) del cultivo, se prepara un sobrenadante libre de células, utilizando procedimientos estándar, y se ensaya la presencia de actividad de RT como una medida de infección exitosa. La actividad de RT puede ser analizada utilizando técnicas estándar tales como aquellas descritas, por ejemplo, por Goff y colaboradores (Goff, S. y colaboradores, 1981, J. Virol. 38:239-248) y/o Willey y colaboradores (Willey, R. y colaboradores, 1988, J. Virol. 62:139-147). Estas referencias se incorporan aquí por referencia, en su totalidad.
Pueden utilizarse métodos estándar que son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica, para ensayar la actividad no retroviral. Ver, por ejemplo, Pringle y colaboradores. (Pringle, C.R. y colaboradores, 1985, J. Medical Virology 17:377-386) para una discusión de las técnicas de ensayo de la actividad del virus sincitial respiratorio y del virus de parainfluenza. Además, ver, por ejemplo, "Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W.K. y colaboradores, eds., Appleton & Lange, Norwalk, CT, 19th ed., para una revisión general de tales técnicas. Estas referencias se incorporan aquí por referencia, en su totalidad. Además, los Ejemplos presentados más adelante, en las Secciones 17, 18, 26 y 27 proveen cada uno ensayos adicionales para la prueba de capacidad antiviral del compuesto.
Los ensayos in vivo pueden utilizarse para probar, por ejemplo, la actividad antiviral de los péptidos de la invención. Para probar la actividad anti-VIH, por ejemplo, puede utilizarse el modelo in vivo descrito en Barnett y colaboradores. (Barnett, S.W. y colaboradores, 1994, Science 266:642-646). Adicionalmente, puede ensayarse in vivo la actividad anti-RSV, por medio de modelos de ratón bien conocidos. Por ejemplo, puede administrarse RSV en forma intranasal a ratones de diferentes cepas consanguíneas. El virus se replica en los pulmones de todas las cepas, pero los títulos más altos se obtienen en ratones P/N, C57L/N y DBA/2N. La infección de ratones BALB/c produce una bronquitis asintomática caracterizada por infiltrados linfocíticos y títulos de virus pulmonares de 10^{4} a 10^{5} pfu/g de tejido de pulmón (Taylor, G. Y colaboradores, 1984, Infect. Immun. 43:649-655).
Los modelos de la rata del algodón de RSV, también son bien conocidos. El virus se replica hasta un título alto en la nariz y en los pulmones de la rata del algodón, pero produce si acaso, pocos signos de inflamación.
5.6 Usos de los péptidos de la invención
Los péptidos de la invención pueden utilizarse como compuestos antifusogénicos o antivirales, o como compuestos que modulan los procesos intracelulares que involucran estructuras de péptidos en doble espiral. Además, tales péptidos pueden ser utilizados para identificar agentes que exhiben actividad moduladora antifusogénica, antiviral o intracelular. Aún más, los péptidos de la invención pueden utilizarse como herramientas de diagnóstico específicas para el organismo o el tipo/subtipo viral.
La capacidad antifusogénica de los péptidos de la invención, puede utilizarse adicionalmente para inhibir o tratar/mejorar los síntomas causados por los procesos que involucran eventos de fusión de membrana. Tales eventos pueden incluir, por ejemplo, transmisión de virus a través de fusión célula-célula, intercambio anormal del neurotransmisor a través de fusión celular, y fusión esperma-óvulo. Además, los péptidos de la invención pueden ser utilizados para inhibir que virus libres, tales como el retroviral, particularmente VIH, la trasmisión a células no infectadas donde tal infección viral involucra eventos de fusión a membrana, o involucra la fusión de una estructura viral con una membrana celular. Entre los desordenes intracelulares que involucran estructuras de péptidos en doble espiral que pueden ser mejorados por los péptidos de la invención, se encuentran los desordenes que involucra, por ejemplo, toxinas bacteriales.
Con respecto a la actividad antiviral, los virus cuya trasmisión puede inhibirse por medio de los péptidos de la invención incluyen, pero no se limitan a todas las cepas de los virus enlistados más atrás, en las Tablas V a VII, y IX a XIV.
Estos virus incluyen, por ejemplo, retrovirus humanos, particularmente VIH-1 y VIH-2 y a los virus de T-linfocito humano (VTLH-I y II). Los retrovirus no humanos cuya transmisión puede inhibirse por medio de los péptidos de la invención incluyen, pero no se limitan al virus de la leucosis bovina, el sarcoma felino y los virus de la leucemia, inmunodeficiencia de simio, virus de sarcoma y de leucemia, y virus del progreso de neumonía en ovejas.
Los virus no retrovirales cuya trasmisión puede ser inhibida por los péptidos de la invención incluyen, pero no se limitan al virus sincitial respiratorio humano, al virus del moquillo, virus de la enfermedad de newcastle, virus de parainfluenza humana, virus de influenza, virus del sarampión, virus de Epstein-Barr, virus de hepatitis B, y virus de simio Mason-Pfizer.
Los virus sin envoltura cuya transmisión puede inhibirse por medio de los péptidos de la invención incluyen, pero no se limitan a picornavirus tales como los virus de la polio, virus de hepatitis A, enterovirus, ecovirus y virus Coxsackie, grupo de los papovavirus tales como el virus de papiloma, parvovirus, adenovirus y reovirus.
Como se discute con más detalle más adelante, en la Sección 5.5.1 y en el Ejemplo presentado, más adelante, en la Sección 8, los péptidos DP107 y DP178 y los péptidos análogos de DP107 y DP178 de interacciones no covalentes proteína-proteína que se requieren para la actividad normal del virus. Así, los péptidos de la invención pueden utilizarse también como componentes en los ensayos para la identificación de los compuestos que interfieren con tales interacciones proteína-proteína y pueden, por lo tanto, actuar como agentes antivirales. Estos ensayos se discuten, más adelante, en las secciones 5.5.1.
Como se demuestra en el Ejemplo presentado más abajo en la Sección 6, la actividad antiviral de los péptidos de la invención puede mostrar una especificidad pronunciada de tipo y subtipo, esto es, péptidos específicos pueden ser efectivos para inhibir la actividad solamente de virus específicos. Esta característica de la invención presenta muchas ventajas. Una de tales ventajas, por ejemplo, cae en el campo de los diagnósticos, en donde uno puede usar la especificidad antiviral del péptido de la invención para determinar la identidad de un aislado viral. Con respecto al VIH, uno puede determinar fácilmente si un aislado viral consiste de una cepa de VIH-1 o VIH-2. Por ejemplo, las células no infectadas CD-4^{+} pueden ser coinfectadas con un aislado que ha sido identificado como conteniendo al péptido DP178 (SEQ. ID: 1) del VIH, después de lo cual puede ensayarse la actividad retroviral de sobrenadantes de células, utilizando, por ejemplo, las técnicas descritas más arriba en la Sección 5.2. Aquellos aislados cuya actividad retroviral está completamente o casi completamente inhibida, contienen VIH-1. Aquellos aislados cuya actividad viral está inalterada o solamente reducida en una pequeña cantidad, puede considerarse que no contienen VIH-1. Tal aislado puede ser tratado entonces con uno o más de los otros péptidos DP178 de la invención, y seguidamente ser analizada su actividad viral con el propósito de determinar la identificación del aislado viral. Los análogos de DP107 y DP178 de la invención, pueden utilizarse también en una capacidad de diagnóstico específica para el tipo y subtipo de virus u organismo en el cual se encuentra la secuencia específica del péptido. Puede utilizarse un procedimiento de diagnóstico como el descrito, más arriba, para DP178, junto con el análogo de interés de DP107/DP178.
5.5.1. Ensayos de muestreo
Como se demuestra en el Ejemplo presentado en la Sección 8, más adelante, porciones de DP107 y DP178 de la proteína TM gp41 forman interacciones no covalentes proteína-proteína. Como se demuestra también, el mantenimiento de tales interacciones es necesario para una infectividad viral normal. Así, los compuestos que enlazan a DP107, a DP178, y/o que actúan para romper las interacciones normales proteína-proteína de DP107/DP178, pueden actuar como agentes moduladores antifusogénicos, antivirales o celulares. Más abajo se describen los ensayos para la identificación de tales compuestos. Obsérvese que, mientras, para facilidad y claridad de la discusión, los péptidos DP107 y DP178 serán utilizados como componentes de los ensayos descritos, pero debe entenderse que cualquiera de los péptidos análogos de DP107 o DP178 descritos más arriba, en las Secciones 5.1 a 5.3, pueden ser utilizados también como parte de esos muestreos para los compuestos.
Los compuestos que pueden ser probados por su capacidad para enlazar a DP107, DP178, y/o para romper las interacciones DP107/DP178, y que por lo tanto, representan potencialmente compuestos moduladores antifusogénicos, antivirales o intracelulares, incluyen, pero no se limitan a, péptidos elaborados con aminoácidos de configuraciones D- y/o L- (en, por ejemplo, la forma de genotecas aleatorias de péptidos; ver Lam, K. S. y colaboradores, 1991, Nature 354: 82-84), fosfopéptidos (en, por ejemplo, la forma de genotecas dirigidas de fosfopéptidos aleatorias, o parcialmente degeneradas; ver, por ejemplo, Songyang, Z. y colaboradores, 1993, Cell 72: 767-778), anticuerpos y moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas. Compuestos sintéticos, productos naturales, y otras fuentes de materiales potencialmente efectivos, pueden ser muestreados en una variedad de formas, como se describe en esta
Sección.
Los compuestos, anticuerpos, u otras moléculas identificadas pueden probarse, por ejemplo por su capacidad para inhibir la fusión celular o la actividad viral, utilizando, por ejemplo, ensayos tales como aquellos descritos más arriba, en la Sección 5.5.
Entre los péptidos que pueden probarse se encuentran los péptidos que comprenden los dominios de DP107 y/o DP178, y los péptidos que comprenden los dominios de DP107 y/o DP178 que tienen una o más mutaciones dentro de uno o ambos dominios, tales como el péptido M41-P descritos más adelante, en el Ejemplo presentado en la Sección 8, que contiene una mutación de isoleucina por prolina dentro de la secuencia de DP178.
Una modalidad de tales métodos de muestreo es un método para identificar un compuesto que va a ser analizado por su capacidad antiviral, que comprende:
\bullet
(a) exponer al menos un compuesto a un péptido que comprende un péptido DP107 durante un tiempo suficiente para permitir el enlazamiento del compuesto al péptido DP107;
\bullet
(b) remover los compuestos no enlazados; y
\bullet
(c) determinar la presencia del compuesto enlazado al péptido DP107 identificando así a un agente para ser analizado por su capacidad antiviral.
Una segunda modalidad de tales métodos de muestreo es un método para identificar un compuesto que va a ser analizado por su capacidad antiviral, que comprende:
\bullet
(a) exponer al menos un compuesto a un péptido que comprende un péptido DP178 durante un tiempo suficiente para permitir el enlazamiento del compuesto al péptido DP178;
\bullet
(b) remover los compuestos no enlazados; y
\bullet
(c) determinar la presencia del compuesto enlazado al péptido DP178 identificando así a un agente para ser analizado por su capacidad antiviral.
Un método que utiliza estos tipos de aproximaciones que pueden ser seguidas en el aislamiento de tales compuestos de enlazamiento con DP107 o con DP178, es un ensayo que incluiría ya sea la unión del péptido DP107 o del péptido DP178 a una matriz sólida tal como, por ejemplo, agarosa o perlas plásticas, pozos en placa de microtitulación, cajas Petri, o membranas compuestas de, por ejemplo, nylon o nitrocelulosa. En tal sistema de ensayo ya sea la proteína DP107 o la DP178, pueden ser ancladas sobre una superficie sólida y el compuesto, o sustancia de prueba, que no está anclada, se marca, ya sea directa o indirectamente. En la práctica, las placas de microtitulación se utilizan convenientemente. El componente anclado puede ser inmovilizado por medio de uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente puede estar acompañada simplemente por un recubrimiento de la superficie sólida con una solución de la proteína y secado.
\newpage
Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, específico para la proteína, puede ser utilizado para anclar la proteína a la superficie sólida. Las superficies pueden prepararse por anticipado y almacenarse.
Con el propósito de conducir el ensayo, se añade el compuesto marcado a la superficie recubierta que contiene al péptido anclado DP107 o DP178. Después de que se completa la reacción, se remueven los componentes que no reaccionaron (por ejemplo, por medio de lavado) bajo condiciones tales que cualquier complejo formado permanecerá inmovilizado sobre la superficie sólida. La detección de los complejos anclados sobre la superficie sólida puede lograrse en una variedad de formas. Donde el compuesto es premarcado, la detección de la marca inmovilizada sobre la superficie indica que complejos se formaron. Donde el componente marcado no esta premarcado, puede utilizarse una marca indirecta para detectar los complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado específico para el compuesto (el anticuerpo a su vez, puede ser directamente marcado o indirectamente marcado con un anticuerpo anti-Ig marcado).
Alternativamente, tal ensayo puede conducirse en fase líquida, los productos de reacción ser separados de los componentes que no reaccionaron, y los complejos ser detectados; por ejemplo, utilizando un anticuerpo inmovilizado específico para DP107 o DP178, cualquiera que sea el apropiado para el ensayo dado, o un anticuerpo ab específico para el compuesto, esto es, la sustancia de prueba, con el propósito de anclar cualquier complejo formado en solución, y un anticuerpo marcado específico para el otro miembro de complejo, para detectar a los complejos anclados.
Utilizando procedimientos como este, pueden muestrearse simultáneamente un gran número de tipos de moléculas para la capacidad de enlazamiento de DP107 o DP178, y por lo tanto su actividad antiviral potencial.
Además, los compuestos pueden ser muestreados por su capacidad para inhibir la formación de, o alternativamente la ruptura de los complejos DP107/DP178. Tales compuestos pueden ser entonces analizados por su capacidad moduladora antifusogénica, antiviral o intracelular. Para facilidad de la descripción, DP107 y DP178 serán llamados "parejas de enlazamiento". Los compuestos que rompen tales interacciones pueden exhibir actividad antiviral. Tales compuestos pueden incluir, pero no se limitan a moléculas tales como anticuerpos, péptidos y similares descritos anteriormente.
El principio básico para los sistemas de ensayo utilizados para identificar compuestos que interfieren con la interacción entre los péptidos DP107 y DP178, involucran la preparación de una mezcla de reacción que contiene péptidos bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir a los dos péptidos, interactuar y entrelazarse, formando así un complejo. Con el propósito de ensayar con compuesto por su actividad de rompimiento, la reacción se conduce en presencia y en ausencia del compuesto de prueba, esto es, el compuesto de prueba puede ser inicialmente incluido en la mezcla de reacción, o ser añadido en un momento posterior a la adición de uno de los miembros de la pareja de enlazamiento; los controles se incuban sin el compuesto de prueba o con un placebo. Se detecta la formación de cualquier complejo entre las parejas de enlazamiento. La formación de un complejo en la reacción de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene al compuesto de prueba, indica que el compuesto interfiere con la interacción de los péptidos DP107 y DP178.
El ensayo para los compuestos que interfieren con la interacción de las parejas de enlazamiento puede conducirse en un formato heterogéneo u homogéneo. Los ensayos heterogéneos involucran el anclaje de uno de los miembros de la pareja de enlazamiento sobre una fase sólida y detectar los complejos anclados sobre la fase sólida al final de la reacción. En ensayos homogéneos, la reacción completa se lleva a cabo en una fase líquida. En cualquiera de las dos aproximaciones, el orden de la adición de los reactivos puede variarse para obtener diferente información acerca de los compuestos que están siendo analizados. Por ejemplo, los compuestos de prueba que interfieren con la interacción entre las parejas de enlazamiento, por ejemplo, por competición, pueden ser identificados conduciendo la reacción en presencia de la sustancia de prueba; esto es, por adición de la sustancia de prueba a la mezcla de reacción, antes o simultáneamente con las parejas de enlazamiento. Por otro lado, los compuestos de prueba que rompen los compuestos preformados, por ejemplo, los compuestos con constantes de enlazamiento mayores que desplazan a uno de los miembros de la pareja de enlazamiento del complejo, pueden ser analizados por medio de la adición del compuesto de prueba a la mezcla de reacción después de que los complejos se han formado. Los diferentes formatos se describen brevemente más abajo.
En un sistema de ensayo heterogéneo, uno de los miembros de la pareja de enlazamiento, por ejemplo, el péptido DP107 o el péptido PD178, se ancla sobre una superficie sólida y su pareja de enlazamiento, que no está anclada, se marca, ya sea directa o indirectamente. En la práctica, las placas de microtitulación se utilizan convenientemente. Las especies ancladas pueden inmovilizarse por medio de uniones no covalentes o covalentes. La unión no covalente puede ser lograda simplemente por el recubrimiento de la superficie sólida con una solución de la proteína y secado. Alternativamente, un anticuerpo específico inmovilizado por la proteína puede ser utilizado para anclar la proteína a la superficie sólida. Las superficies pueden prepararse por adelantado y almacenarse.
Con el propósito de conducir el ensayo, el miembro de la pareja de enlazamiento de la especie inmovilizada se añade a la superficie recubierta, con o sin el compuesto de prueba. Después que se completa la reacción, se remueven los componentes que no reaccionaron (por ejemplo, por medio de lavado)y los complejos formados permanecerán inmovilizados sobre la superficie sólida. La detección de los complejos anclados sobre la superficie sólida puede lograrse de muchas maneras. Donde el miembro de la pareja de enlazamiento fue premarcado, la detección de la marca inmovilizada sobre la superficie indica que complejos se formaron. En donde el miembro de la pareja de enlazamiento no se marca previamente, puede utilizarse una marca indirecta para detectar a los complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, utilizando un anticuerpo específico marcado para el miembro de la pareja de enlazamiento (el anticuerpo, a su vez, puede ser directa o indirectamente marcado con un anticuerpo anti-Ig marcado). Dependiendo del orden de adición de los componentes de la reacción, los compuestos de prueba que inhiben la formación del complejo o que rompen a los complejos formados previamente, pueden detectarse.
Alternativamente, la reacción puede conducirse en una fase líquida en presencia o en ausencia del compuesto de prueba, los productos de reacción ser separados de los componentes que no reaccionaron, y los complejos ser detectados; por ejemplo, utilizando un anticuerpo específico inmovilizado por uno de los miembros de la pareja de enlazamiento para anclar a cualquier complejo formado en solución, y un anticuerpo específico marcado por el otro miembro de la pareja de enlazamiento para detectar a los complejos anclados. Nuevamente, dependiendo del orden de adición de los reactivos a la fase líquida, pueden identificarse los compuestos de prueba que inhiben al complejos o que rompen a los complejos formados previamente.
En una modalidad alternativa de la invención, puede utilizarse un ensayo homogéneo. En esta aproximación, se prepara un complejo formado previamente de los péptidos DP107 y DP178 en el cual uno de los miembros de la pareja de enlazamiento se marca, pero la señal generada por la marca se apaga debido a la formación de complejo (ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.109.496 de Rubenstein que utiliza esta aproximación para los inmunoensayos). La adición de una sustancia de prueba que compite con, y que desplaza a uno de los miembros de la pareja de enlazamiento del complejo previamente formado, resultará en la generación de una señal de fondo anterior. De esta forma, pueden identificarse las sustancias de prueba que rompen la interacción proteína-proteína de DP107/DP178.
En un ensayo de muestreo alternativo, los compuestos de prueba pueden ensayarse por su capacidad para romper una interacción DP178/DP107, como se midió inmunométricamente utilizando un anticuerpo específicamente reactivo para un complejo DP107/DP178 (esto es, un anticuerpo que no reconoce ni a DP107 ni a DP178 en forma individual). Tal ensayo actúa como un ensayo de competición, y se basa en técnicas bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica.
El anterior ensayo de competición puede describirse, a manera de ejemplo, y no a manera de limitación, por medio del uso de los péptidos DP178 y M41\Delta178 y por medio del ensayo de los compuestos de prueba para el rompimiento de los complejos formados por medio de estos dos péptidos por visualización inmunométrica de los complejos DP178/M41\Delta178 a través de Fab recombinante humano, Fab-d, como se describe más abajo, en el Ejemplo presentado en la Sección 8. M41\Delta178 es una proteína de fusión de enlazamiento de maltosa que contiene una región gp41 que tiene su dominio DP178 suprimido, y que se describe más abajo, en el Ejemplo presentado en la Sección
8.
Utilizando un ensayo así, puede inmovilizarse a M41\Delta178 sobre soportes sólidos tales como pozos de microtitulación. Pueden añadirse entonces una serie de diluciones del compuesto de prueba a cada pozo que contiene M41\Delta178 en presencia de una concentración constante del péptido DP178. Después de incubación, por ejemplo, a temperatura ambiente por una hora, se remueven de los pozos DP178 no enlazado y el compuesto de prueba, y se incuban entonces los pozos con anticuerpo Fab-d específico para DP178/M41\Delta178.
Después de incubación y el lavado, se remueve de las placas el Fab-d no enlazado y el Fab-d enlazado se cuantifica. Un control no inhibidor también debe ser conducido. Los compuestos de prueba que muestran capacidad para romper la formación del complejo DP178/M41\Delta178 se identifican por medio de su concentración que depende de la disminución en el nivel de enlazamiento de Fab-d.
Una variación de tal ensayo puede utilizarse para realizar un ensayo rápido de enlazamiento de alto rendimiento que es capaz de medir directamente el enlazamiento de DP178 a M41\Delta178 para la determinación de las constantes de enlazamiento del ligando de constantes inhibitorias para los competidores del enlazamiento de DP178.
Tal ensayo toma ventaja del radioligando aceptado y de los principios de enlazamiento del receptor. (Ver, por ejemplo, Yamamura, H.I. y colaboradores, 1985, "Neurotransmitter Receptor Binding", 2nd ed., Raven Press, NY). Como antes, se inmoviliza M41\Delta178 sobre un soporte sólido tal como un pozo de microtitulación. El enlazamiento de DP178 a M41\Delta178 se cuantifica entonces midiendo la fracción de DP178 que se enlaza como ^{125}I-DP178 y se calcula la cantidad total enlazada utilizando un valor para la actividad específica (dpm/\mug de péptido)determinado para cada preparación marcada de DP178. El enlazamiento específico a M41\Delta178 se define como la diferencia del enlazamiento de la preparación marcada DP178 en los pozos de microtitulación (totales) y el enlazamiento en pozos idénticos que contienen, además, exceso de DP178 no marcado (no específicos).
5.5 Formulaciones farmacéuticas, dosificaciones y modos de administración
Los péptidos de la invención pueden administrarse utilizando técnicas bien conocidas por aquellos conocedores de la técnica. Preferiblemente, se formulan agentes y se administran sistémicamente. Las técnicas para formulación y administración pueden encontrase en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA. Las vías adecuadas pueden incluir la administración oral, rectal, transmucosal, o intestinal; el suministro parenteral que incluye inyecciónes intramuscular, subcutánea, intramedular, así como, inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, o intraocular, por mencionar solo unas pocas. Para inyección, los agentes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en búferes fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hanks, la solución de Ringer, o un buffer fisiológico salino. Para tal administración transmucosal, se utilizan fluidos penetrantes apropiados de la barrera que va a ser permeada en la formulación. Tales fluidos penetrantes son bien conocidos en la técnica.
En ejemplos en donde se prefiere la administración intracelular de los péptidos de la invención u otros agentes inhibidores, pueden utilizarse técnicas bien conocidas por aquellos entrenados en el arte. Por ejemplo, tales agentes pueden encapsularse en liposomas, y luego administrarse como se describió antes. Los liposomas son bicapas esféricas de lípido con interior acuoso. Todas las moléculas presentes en una solución acuosa al momento de formarse el liposoma, se incorporan dentro del interior acuoso. Los contenidos liposomales están ambos protegidos del microambiente externo y, debido a que los liposomas se fusionan con las membranas celulares, son suministrados en forma efectiva dentro del citoplasma celular. Adicionalmente, debido a su hidrofobicidad, cuando deben administrarse pequeñas moléculas, puede lograrse una administración intracelular directa.
Las secuencias de nucleotidos que codifican a los péptidos de la invención que deben ser administrados en forma intracelular, pueden expresarse en las células de interés, utilizando técnicas bien conocidas por aquellos entrenados en la materia. Por ejemplo, los vectores de expresión derivados de virus tales como los retrovirus, los virus vaccinia, los virus adenoasociados, los virus del herpes, o los virus del papiloma bovino, pueden ser utilizados para el suministro y la expresión de tales secuencias de nucleotidos dentro de la población de células objetivo. Los métodos para la construcción de tales vectores y las construcciones de expresión son bien conocidos. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, y Ausubel y colaboradores, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.
Con respecto al VIH, pueden utilizarse los péptidos de la invención, particularmente DP107 y DP178, como terapéuticos en el tratamiento del SIDA. Además, los péptidos pueden utilizarse como medidas profilácticas en individuos previamente no infectados después de exposición aguda a un virus de VIH. Ejemplos de tales usos profilácticos de los péptidos pueden incluir, pero no se limitan a, la prevención de la transmisión de virus desde la madre al infante, y otros escenarios donde existe la probabilidad de transmisión del VIH, tales como, por ejemplo, accidentes en escenarios para el cuidados de la salud en donde los trabajadores están expuestos a productos con sangre que contienen VIH. El uso exitoso de tales tratamientos no cuenta con la generación de una respuesta inmune del huésped dirigida contra tales péptidos.
Las dosis efectivas de los péptidos de la invención que deben administrarse, pueden determinarse a través de procedimientos bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica que manejan parámetros tales como la vida media biológica, la biodisponibilidad y la biotoxicidad. Dado los datos que se presentan más abajo en la Sección 6, DP178, por ejemplo, puede resultar eficiente in vivo a las dosis requeridas para lograr niveles de circulación aproximadamente alrededor de 1 hasta 10 ng por ml de péptido.
Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad del compuesto suficiente para resultar en una mejoría de los síntomas o en una prolongación de la supervivencia en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos puede determinarse por medio de procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD_{50} (la dosis letal para 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción LD_{50}/ED_{50}. Se prefieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos con cultivos de células y los estudios en animales, pueden ser utilizados para la formulación de un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos cae principalmente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen a la ED_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos con cultivos celulares. Una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un rango de concentración circulante el plasma que incluye al IC_{50} (por ejemplo, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición media máxima del evento fusogénico, tal como una inhibición media máxima de infección viral relativa a la cantidad del evento en ausencia del compuesto de prueba) como se determina en el cultivo celular. Tal información puede utilizarse para determinar en forma más precisa las dosis útiles en humanos. Los nivel en plasma pueden medirse, por ejemplo, por medio de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
Los péptidos de la invención pueden cumplir con el papel de una vacuna profiláctica, en donde el huésped eleva los anticuerpos contra los péptidos de la invención, que luego sirven para neutralizar a los virus VIH inhibiendo por ejemplo una infección adicional por VIH.
La administración de los péptidos de la invención como una vacuna profiláctica, por lo tanto, comprendería la administración a un huésped de una concentración efectiva de péptidos para elevar una respuesta inmune que sea suficiente para neutralizar al VIH, inhibiendo por ejemplo la capacidad del VIH para infectar células. La concentración exacta dependerá del péptido específico que va a ser administrado, pero puede determinarse por medio del uso de técnicas estándar que son bien conocidas por aquellos ordinariamente entrenados en la técnica, para analizar el desarrollo de una respuesta inmune. Los péptidos que van a ser utilizados como vacunas se administras usualmente en forma intramuscular.
Los péptidos pueden formularse con un adyuvante adecuado con el propósito de mejorar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes pueden incluir, pero no se limitan a geles minerales tales como el hidróxido de aluminio; sustancias superficialmente activas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones; otros péptidos; emulsiones en aceite; y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como el BCG y Corynebacterium parvum. Pueden utilizarse muchos métodos para introducir las formulaciones de la vacuna descritas aquí. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a vía oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, e intranasal.
Alternativamente, una concentración efectiva de anticuerpos policlonales o monoclonales elevada contra los péptidos de la invención, puede ser administrada a un huésped para que las células no infectadas se infectaran por VIH. La concentración exacta de tales anticuerpos variará de acuerdo a cada preparación específica de anticuerpo, pero puede determinarse usando técnicas estándar bien conocidas por aquellos ordinariamente entrenados en la técnica. La administración de los anticuerpos puede lograrse usando una variedad de técnicas, incluidas, pero no limitadas a aquellas descritas en esta sección.
Para todos aquellos tratamientos descritos antes, la formulación exacta, la vía de administración y la dosificación, pueden ser escogidas por un médico particular en vista de la condición del paciente. (Ver, por ejemplo, Fingl y colaboradores, 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1, pág. 1).
Debe observarse que el médico encargado sabría como y cuando terminar, interrumpir, o ajustar la administración debido a la toxicidad, o a las disfunciones orgánicas. Recíprocamente, el médico que atiende sabría también ajustar el tratamiento a niveles mayores, si la respuesta clínica no fuera la adecuada (evitando la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el manejo del desorden oncogénico de interés, variará con la severidad de la condición que va a ser tratada, y con la vía de administración. La dosis y quizás la frecuencia de la dosis, variará también de acuerdo con la edad, el peso corporal, y la respuesta del paciente en particular. Puede utilizarse un programa comparable a aquel discutido anteriormente en medicina veterinaria.
El uso de portadores farmacéuticamente aceptable para formular los compuestos revelados aquí para la práctica de la invención dentro de dosificaciones adecuadas para administración sistémica, se encuentra dentro del alcance de la invención. Con una escogencia apropiada del portador y una práctica de fabricación adecuada, las composiciones de la presente invención, en particular, aquellas formuladas como soluciones, pueden administrarse en forma parenteral, tal como por medio de una inyección intravenosa. Los compuestos pueden formularse fácilmente utilizando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el arte, en dosis adecuadas para administración oral. Tales portadores permiten que los compuestos de la invención sean formulados como tabletas, píldoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y similares, para digestión oral por parte de un paciente que va a ser tratado.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para ser usadas en la presente invención, incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito pretendido. La determinación de las cantidades efectivas está también dentro de las capacidades de aquellos entrenados en la técnica, especialmente en vista de los detalles revelados que se suministran aquí.
Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener portadores adecuados farmacéuticamente aceptables que incluyen excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos dentro de las preparaciones que pueden ser utilizadas farmacéuticamente. Las preparaciones formuladas para administración oral pueden estar en la forma de tabletas, grageas, cápsulas o soluciones.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse en una forma que es por sí misma conocida, por ejemplo, por medio de procesos de mezcla convencional, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, entrampamiento, o liofilización.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en una forma soluble en agua. Adicionalmente, la suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyecciones aceitosas apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como el aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácido graso, tales como el oleato de etilo, o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyecciones acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como la carboximetil celulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente la suspensión puede contener también estabilizadores adecuados o agentes que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse por medio de la combinación de los compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y el procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azucares, incluidas lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, fécula de maíz, fécula de trigo, fécula de arroz, fécula de patata, gelatina, goma adragante, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes de desintegración, tales como la polivinil pirrolidona entrecruzada, agar, o ácido algínico o una sal de los mismos tal como el alginato de sodio.
Los núcleos de grageas se suministran con recubrimientos adecuados. Para este propósito, pueden utilizarse soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol, polietilén glicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes orgánicos adecuados o mezcla de solventes. Pueden añadirse materias colorantes o pigmentos a las tabletas o a los recubrimientos de las grageas para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden utilizarse en forma oral incluyen cápsulas del tipo push-fit hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de tipo push-fit pueden contener a los ingredientes activos en mezcla con rellenos tales como lactosa, aglomerantes tales como las féculas, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o propilén glicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizadores.
6. Ejemplo
DP178 (SEQ. ID: 1) es un potente inhibidor de la infección del VIH-1
En este ejemplo, DP178 (SEQ. ID: 1) muestra ser un potente inhibidor de la fusión célula-célula CD-4^{+} mediada por el VIH-1 y de la infección de las células libres de virus. En el ensayo de fusión, este péptido bloquea completamente la formación de sincitios inducidos por virus a concentraciones entre 1-10 ng/ml. En el ensayo de infectividad, la concentración de inhibidor es un poco más alta, bloqueando la infección a 90 ng/ml. Se muestra además que DP178 (SEQ. ID: 1) muestra que la actividad antiviral de DP178 (SEQ. ID: 1) es altamente específica para VIH-1. Adicionalmente, se encontró también un péptido sintético, DP185 (SEQ. ID: 3), que representa un homólogo de DP178 derivado de VIH-1 que bloquea la formación de sincitios mediada por VIH-1.
6.1 Materiales y métodos 6.1.1 Síntesis de péptidos
Los péptidos se sintetizaron utilizando química Fast Moc sobre un sintetizador de péptidos Modelo 431A de Applied Biosystems. Generalmente, a menos que se diga otra cosa, los péptidos contenían terminales carboxi aminados y terminales amino acetilados. Los péptidos aminados se prepararon utilizando resina de Rink (Advanced Chemtech) mientras que los péptidos que contenían terminales carboxilo libres se sintetizaron sobre resina Wang (p-alcoxi-bencil-alcohol) (Bachem). Primero, los residuos se acoplaron en forma doble a la resina apropiada y posteriormente, los residuos se acoplaron en forma sencilla. Cada etapa de acoplamiento fue seguida por bloqueo con anhídrido acético. Los péptidos se escindieron de la resina por medio de tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) (10 ml), H_{2}O (0,5 ml), tioanisol (0,5 ml), etanoditiol (0,25 ml), y fenol cristalino (0,75 g). La purificación se llevó a cabo por medio de HPLC en fase reversa. Aproximadamente se cromatografiaron muestras de 50 mg de péptido crudo sobre una columna C 18 Delta Pak de Waters (19 mm x 30 cm, esférica de 15 \mu) con un gradiente lineal; H_{2}O/acetonitrilo, TFA al 0,1%. Los péptidos liofilizados se almacenaron desecados y las soluciones de los péptidos se prepararon en agua aproximadamente de 1 mg/ml. La espectrometría de masas por electrospray produjo los siguientes resultados: DP178 (SEQ ID: 1):4491.87 (calculado 4491.94); DP-180 (SEQ ID: 2): 4491.45 (calculado 4491.94); DP-185 (SEQ ID: 3): no se hizo (calculado 4546.97).
6.1.2. Virus
El virus VIH-l_{LAI} se obtuvo de R. Gallo (Popovic, M. y colaboradores, 1984, Science 224:497-508) y se propagó en células CEM cultivadas en RPMI 1640 que contenía suero fetal de ternera al 10%. Se pasó el sobrenadante de las células CEM infectadas a través de un filtro de 0.2 \mum, y se estimó el título infeccioso estimado en un ensayo de microinfectividad utilizando la línea celular AA5 para soportar la replicación del virus. Para este propósito se añadieron 25 \mul de virus serial diluido a 75 \mul de células AA5 a una concentración de 2 x 10^{5}/ml en una placa de microtitulación de 96 pozos. Cada dilución del virus se analizó por triplicado. Las células se cultivaron durante ocho días por medio de la adición de medio fresco cada día de por medio. En el día 8 después de la infección, las muestras sobrenadates se analizaron por la replicación del virus como se evidencia por medio de la actividad de la transcriptasa reversa liberada por el sobrenadante. Se calculó TCID_{50} de acuerdo con la formula de Reed y Muench (Reed, L.J. y colaboradores, 1938, Am. J. Hyg. 27:493-497). El título de las cepas de VIH-1_{LAI} y VIH-1_{MN} utilizadas para estos estudios, que se midieron sobre la línea celular AA5 fue aproximadamente de 1,4 x 10^{6} y 3,8 x 10^{4} TCID_{50}/ml, respectivamente.
6.1.3. Ensayo de fusión celular
Se incubaron aproximadamente 7 x 10^{4} células Molt con 1 x 10^{4} células CEM infectadas en forma crónica con el virus VIH-1_{LAI} en placas de 96 pozos (mitad del área de las placas en racimo; Costar, Cambridge, MA) en un volumen final de 100 \mul de medio de cultivo como se describió previamente (Matthews, T. J. y colaboradores, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5424-5428). Se añadieron inhibidores del péptido en un volumen de 10 \mul, y se incubaron las mezclas de las células durante 24 horas a 37ºC. En ese momento, se estimaron las células gigantes multinucleadas por medio del examen microscópico con una magnificación 40x que permitió la visualización del pozo completo en un campo único.
6.1.4. Ensayo de infección con células libres de virus
Se incubaron péptidos sintéticos a 37ºC ya sea con 247 TCID_{50} (para el experimento descrito en la Figura 2), o con 62 TCID_{50} (para el experimento descrito en la Figura 3) unidades del virus VIH-1_{LAI} o con 25 TCID_{50} unidades de VIH-2_{NIHZ} y células CEM CD4^{+} con concentraciones de péptido de 0, 0.04, 0.4, 4.0, y 40 \mug/ml durante 7 días. La actividad resultante de la transcriptasa reversa (RT) en recuentos por minuto, se determinó utilizando el ensayo descrito más abajo, en la Sección 6.1.5. Ver, Reed, L.J. y colaboradores, 1938, Am. J. Hyg. 27:493-497 para una explicación de los cálculos de TCID_{50}.
6.1.5. Ensayo de la transcriptasa reversa
El ensayo de la transcriptasa microreversa (RT) fue adaptado de Goff y colaboradores (Goff, S. y colaboradores, 1981, J. Virol. 38:239-248) y Willey y colaboradores (Willey, R. y colaboradores, 1988, J. Virol. 62:139-147). Los sobrenadantes de los cultivos de virus/células se ajustan al 1% con Triton-X100. Se añadieron 10 \mul de muestra de sobrenadante a 50 \mul de cóctel de RT en una placa de microtitulación de 96 pozos con fondo en U, y se incubaron las muestras a 37ºC durante 90 min. El cóctel de RT contenía KCl 75 mM, ditiotreitol 2 mM, MgCl_{2} 5 mM, 5 \mug/ml de poli A (Pharmacia, cat. No. 27-4110-01), 0.25 unidades/ml de oligo dT (Pharmacia, cat. No. 27-7858-01), NP40 al 0.05%, Tris-HCl 50 mM, pH 7.8, dTTP no radioactivo 0.5 \muM, y 10 \muCi/ml de ^{32}P-dTTP (Amersham, cat. No. PB.10167).
Después del período de incubación, se aplicaron 40 \mul de la mezcla de reacción a una membrana Schleicher y Schuell (S+S) NA45 (o papel DE81) saturada en buffer 2 x SSC (NaCl 0.3 M y citrato de sodio 0.003 M), sostenida en un Minicolector de S+S sobre una hoja de papel filtro GB003 (S+S), al cual se ha aplicado un vacío parcial. Cada pozo del minicolector se lavó cuatro veces con 200 \mul 2xSSC, con vacío completo. La membrana fue removida del minicolector y lavada 2 o más veces en una placa pirex con un exceso de 2xSSC. Finalmente, se secó la membrana sobre papel absorbente, se colocó sobre papel Whatman #3, cubierta con una envoltura Saran, y expuesta a una película durante la noche a -70ºC.
6.2 Resultados 6.2.1 Inhibición del péptido de formación de sincitios
El muestreo inicial de actividad antiviral de la capacidad de los péptidos analizados para bloquear la formación de un sincitio inducido por un cocultivo durante la noche de células Molt4 no infectadas con células CEM infectadas en forma crónica con VIH-1. Los resultados de varios de esos experimentos se presentan aquí. En el primero de esos experimentos, se probaron las concentraciones del péptido serial DP178 (SEQ. ID: 1) entre 10 \mug/ml y 12,5 ng/ml para el bloqueo del proceso de fusión celular. Para estos experimentos, se cocultivaron durante la noche células CEM infectadas crónicamente ya sea con virus VIH-1_{LAI}, VIH-1_{MN}, VIH-1_{RF}, o VIH-1_{SF2} con células Molt 4 no infectadas. Los resultados muestran (Figura 4) que DP178 (SEQ. ID: 1) produjo una protección completa contra cada uno de los aislados de VIH-1 más debajo de la concentración más baja utilizada de DP178 (SEQ. ID: 1). Para la inhibición de VIH_{LAI}, la concentración más baja probada fue de 12,5 ng/ml; para todos los otros virus VIH-1, la concentración más baja utilizada de DP178 (SEQ. ID: 1) en este estudio fue de 100 ng/ml. Un segundo péptido, DP180 (SEQ. ID: 2), que contenía los mismos residuos de aminoácidos que DP178 (SEQ. ID: 1) pero dispuestos en un orden aleatorio, no exhibieron evidencia de actividad antifusogénica aún a una concentración alta de 40 \mug/ml (Figura 4). Estas observaciones indican que el efecto inhibitorio de DP178 (SEQ. ID: 1) es específico de una secuencia primaria y no está relacionado con interacciones péptido/proteína no específicas. El punto final real (esto es, la concentración inhibitoria efectiva más baja) de la acción inhibitoria de DP178, está dentro del rango de 1-10 ng/ml.
La siguiente serie de experimentos involucraron la preparación y el ensayo de un homólogo de DP178 (SEQ. ID: 1) por su capacidad para inhibir la formación de sincitios inducidos por VIH-1. Como se muestra en la Figura 1, la secuencia de DP-185 (SEQ. ID: 3) es ligeramente diferente de la de DP178 (SEQ. ID: 1) en que su secuencia primaria es tomada del aislado de VIH-1_{SF2} y contiene varias diferencias de aminoácidos relacionadas con DP178 (SEQ. ID: 1) cerca del N terminal. Como se muestra en la Figura 4, DP-185 (SEQ. ID: 3), exhibe actividad inhibitoria aún a 312,5 ng/ml, la concentración más baja analizada.
La siguiente serie de experimentos involucró una comparación de la actividad inhibitoria de DP178 (SEQ. ID: 1) de VIH-1 y VIH-2. Como se muestra en la Figura 5, DP178 (SEQ. ID: 1) bloqueó la formación de sincitios mediados por VIH-1 a concentraciones de péptidos por debajo de 1 ng/ml. DP178 (SEQ. ID: 1) falló, sin embargo, en bloquear la formación de sincitios mediada por VIH-2 a concentraciones tan altas como 10 \mug/ml. Esta sorprendente selectividad 4 log de DP178 (SEQ. ID: 1) como inhibidor de la fusión celular mediada por VIH-1, demuestra una especificidad inesperada de VIH-1 en la acción de DP178 (SEQ. ID: 1). La inhibición de DP178 (SEQ. ID: 1) de la fusión celular mediada por VIH-1, pero la incapacidad del péptido para inhibir la fusión celular mediada por VIH-2 en el mismo tipo de célula a las concentraciones ensayadas proporciona una evidencia más del alto grado de selectividad asociado con la acción antiviral de DP178 (SEQ. ID: 1).
6.2.2 Inhibición peptídica de infección por células libres de virus
DP178 (SEQ. ID: 1) fue luego analizado por su capacidad para bloquear la infección de células CEM CD-4^{+} por células libres del virus VIH-1. Los resultados, mostrados en la Figura 2, son de un experimento en el cual se ensayó DP178 (SEQ. ID: 1) por su capacidad para bloquear la infección de las células CEM por medio de un aislado de VIH-1_{LAI}. En el experimento se indujeron tres péptidos de control, DP-116 (SEQ. ID: 9), DP-125 (SEQ. ID: 8), y DP-118 (SEQ. ID: 10). DP-116 (SEQ. ID: 9) representa a un péptido que se mostró previamente que era inactivo utilizando este ensayo, y DP-125 (SEQ ID: 8; Wild, C. y colaboradores, 1992, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89:10,537) y DP-118 (SEQ ID: 10) so péptidos que han mostrado previamente ser activos en este ensayo. Cada concentración (0, 0.04, 0.4, 4, y 40 \mug/ml) de péptido fue incubada con 247 TCID_{50} unidades de virus de VIH-1_{LAI} y células CEM. Después de 7 días de cultivo, el sobrenadante libre de células se ensayó por la presencia de actividad RT como una medida de infección exitosa. Los resultado mostrados en la Figura 2, demuestran que DP178 (SEQ ID: 1) inhibió el proceso de infección de novo mediado por el aislado viral de VIH-1 a concentraciones tan bajas como 90 ng/ml (IC_{50} = 90 ng/ml). En contraste, los dos péptidos de control positivo, DP-125 (SEQ: ID: 8) y DP-118 (SEQ ID: 10), tuvieron concentraciones de IC_{50} 60 veces superiores, de aproximadamente 5 \mug/ml.
En un experimento separado, la acción inhibitoria de VIH-1 y VIH-2 de DP 178 (SEQ. ID: 1) se probó con células CEM y se utilizaron ya sea VIH-1_{LAI} o VIH-2_{NIHZ}. Se utilizaron 62 TCID_{50} VIH-1_{LAI} o 25 GCID_{50} VIH-2_{NIHZ} en estos experimentos, y se incubaron durante 7 días. Como puede observarse en la Figura 3, DP178 (SEQ. ID: 1) inhibió la infección con VIH-1 con un IC_{50} aproximadamente de 31 ng/ml. En contraste, DP 178 (SEQ. ID: 1) exhibió un IC_{50} mucho más alto para VIH-2_{NIHZ}, haciendo así a DP 178 (SEQ. ID: 1), dos log más potente como inhibidor de VIH-1 que como inhibidor de VIH-2. Este hallazgo es consistente con los resultados de los ensayos de inhibición de fusión descritos más arriba, en la Sección 6.2.1., y soportan además un significativo nivel de selectividad (esto es, para VIH-1 sobre VIH-2).
7. Ejemplo
El inhibidor de VIH-1, DP178 (SEQ. ID: 1) Es no citotóxico
En este Ejemplo, el péptido inhibidor sintético de 36 aminoácidos DP178 (SEQ. ID: 1) muestra ser no citotóxico para las células en cultivo, aún a las concentraciones de péptido más altas analizadas (40 \mug/ml).
7.1 Materiales y métodos
Proliferación celular y ensayo de toxicidad: aproximadamente 3,8 x 10^{5} células CEM para cada concentración de péptido fueron incubadas durante 3 días a 37ºC en frascos T25. Los péptidos analizados fueron DP178 (SEQ. ID: 1) y DP-116 (SEQ. ID: 9), como se describe en la Figura 1. Los péptidos fueron sintetizados como se describe más arriba en la Sección 6.1. Las concentraciones utilizadas de cada péptido fueron 0, 2,5, 10, y 40 \mug/ml. El recuento de células se hizo a los tiempos de incubación de 0, 24, 48, y 72 horas.
7.2 Resultados
Si el potente inhibidor de VIH-1, DP178 (SEQ. ID: 1) exhibió algún efecto citotóxico, fue evaluado ensayando los efectos del péptido sobre la proliferación y la viabilidad de las células en el cultivo. Las células CEM fueron incubadas en presencia de diferentes concentraciones de DP178 (SEQ. ID: 1), y DP-116 (SEQ. ID: 9), un péptido que previamente mostró ser ineficiente como inhibidor de VIH (Wild, C. y colaboradores, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10,537-10,541). Adicionalmente, las células fueron incubadas en ausencia de cualquier péptido.
Los resultados del estudio de citotoxicidad demostraron que DP178 (SEQ. ID: 1) no exhibe efectos citotóxicos sobre las células en cultivo. Como puede observarse más abajo, en la Tabla XXIV, aún la proliferación y las características de viabilidad de las células cultivadas durante 3 días en presencia de las concentraciones más altas de DP178 (SEQ. ID: 1) analizadas (40 \mug/ml) no difieren significativamente del DP-116 (SEQ. ID: 9) o de los controles sin péptido. Los datos de proliferación celular se representan también en forma de gráficos en la Figura 6. Como se demostró en el Ejemplo de Trabajo presentado más arriba en la Sección 6, DP178 (SEQ. ID: 1) inhibe completamente la formación de sincitios mediados por VIH-1 a las concentraciones de péptidos entre 1 y 10 ng/ml, e inhibe completamente la infección viral de células libres a concentraciones de al menos 90 ng/ml. Por lo tanto, este estudio demuestra que aún con concentraciones de péptido superiores a 3 log por encima de la dosis inhibitoria de VIH, DP178 (SEQ. ID: 1) no exhibe efectos citotóxicos.
TABLA XXIV
% de Viabilidad a los tiempos (horas)
Péptido Concentración de Péptido \mul/ml 0 24 48 72
DP178 (SEQ. ID: 1) 40 98 97 95 97
10 98 97 98 98
2.5 98 93 96 96
DP116 (SEQ. ID: 9) 40 98 95 98 97
10 98 95 93 98
2.5 98 96 98 99
Sin Péptido 0 98 97 99 98
8. Ejemplo
La interacción de DP178 y DP107
Las formas recombinantes solubles de gp41 usadas en el ejemplo descrito más abajo, proveen evidencia de que el péptido DP178 se asocia con un sitio distal sobre gp41 cuya estructura interactiva es influenciada por el motivo de cierre de leucina DP107. Una única mutación rompe la estructura de doble espiral del dominio de cierre de leucina transformando la proteína gp41 recombinante soluble de un inhibidor inactivo a uno activo de fusión de VIH-1. Esta transformación puede resultar de la liberación del potente dominio de DP178 de un broche molecular con el cierre determinante de leucina, DP107. Los resultados también indican que la actividad anti-VIH de diferentes derivados de gp41 (péptidos y proteínas recombinantes) puede ser debida a su capacidad para formar complejos con gp41 viral, e interfiere con su proceso fusogénico.
8.1. Materiales y métodos 8.1.1. Construcciones de proteínas de fusión y mutantes GP41
La construcción de proteínas de fusión y de mutantes mostrada en la Figura 7 se logró como sigue: la secuencia de ADN correspondiente al dominio extracelular de gp41 (540-686) se clonó dentro del sitio Xmn I del vector de expresión may-p2 (New England Biolab) para dar M41. La secuencia de gp41 se amplificó a partir de pgtat (Malim y colaboradores, 1988, Nature 355:181-183) por medio del uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el iniciador secuencia arriba 5'-ATGACGCTGACGGTACAGGCC-3' (iniciador A) y el iniciador secuencia abajo
5'-TGACTAAGCTTAATACCACAGCCAATTTGTTAT-3' (iniciador B). M41-P se construyó por medio del uso del kit de mutagénesis in vitro del Gen T7 de United States Biochemicals (USB) siguiendo las instrucciones dadas por el proveedor. El iniciador mutagénico (5'-GGAGCTGCTTGGGGCCCCAGAC-3') introduce una mutación de Ile por Pro en M41 en la posición 578. M41\Delta107, de la cual se ha suprimido la región DP-107, se hizo utilizando un iniciador mutagénico de supresión 5'- CCAAATCCCCAGGAGCTGCTCGAGCTGCACTATACCAGAC-3' (iniciador C) siguiendo el protocolo de USB de mutagénesis del Gen T7. M41\Delta178, de la cual se ha suprimido la región DP-178, se hizo por medio de la clonación del fragmento de ADN correspondiente a los aminoácidos 540-642 de gp41 dentro del sitio Xmn I de pMal-p2. El iniciador A y 5'-ATAGCTTCTAGATTAATTGTTAATTTCTCTGTCCC-3' (iniciador D) fueron utilizados en la PCR con el molde pgtat para generar los fragmentos insertados de ADN. M41-P se usó como el molde con los iniciadores A y D en la PCR para generar M41-P\Delta178. Todas las secuencias insertadas y los residuos mutados se revisaron por medio del análisis de la enzima de restricción y se confirmó por medio de la secuenciación del ADN.
8.1.2. Purificación y caracterización de las proteínas de fusión
Las proteínas de fusión se purificaron de acuerdo con el protocolo descrito en el catálogo del fabricante de los sistemas de purificación y de fusión de proteínas de New England Biolabs (NEB). Las proteínas de fusión (10 ng) se analizaron por medio de electroforesis sobre geles de poliacrilamida SDS al 8%. Los análisis de Western se realizaron como lo describen Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Ch. 18, pgs. 64-75. Se usó un suero positivo para VIH-1 diluido 1000 veces, o un Fab humano derivado del repertorio de clonación que fue utilizado para reaccionar con las proteínas de fusión. El segundo anticuerpo fue un Fab antihumano de cabra conjugado con HRP. Se usó un sistema de detección ECL de Western (Amersham) para detectar el anticuerpo enlazado. Un protocolo detallado para este sistema de detección fue proveído por el fabricante. Se utilizaron marcadores de peso molecular Rainbow (Amersham) para estimular el tamaño de las proteínas de fusión.
8.1.3 Ensayos de fusión celular para actividad anti-VIH
Los ensayos de fusión celular se llevaron a cabo como se describió previamente (Matthews y colaboradores, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5424-5481). Las células CEM (7 x 10^{4}) se incubaron con células CEM infectadas crónicamente con VIH-1_{IIIB} (10^{4}) en placas de media área de fondo plano de 96 pozos (Costar) en 100 \mul de medio de cultivo. Se incubaron el péptido y las proteínas de fusión a diferentes concentraciones en 10 \mul de medio de cultivo con las mezclas celulares a 37ºC durante 24 horas. Se estimaron los sincitios multinucleados por medio de un examen microscópico. Tanto M41 como M41-P no mostraron citotoxicidad a las concentraciones analizadas y mostradas en la Figura 8.
La inhibición de la actividad de fusión célula-célula inducida por VIH-1 se llevó a cabo en presencia de DP178 10 nM y diferentes concentraciones de M41\Delta178 o M41-P\Delta178 como se indica en la Figura 9. No se observaron sincitios en presencia de DP178 10 nM. No se añadió péptido o proteína de fusión en las muestras de control.
8.1.4 Análisis por elisa del enlazamiento de DP178 al motivo de cierre de leucina de GP41
La secuencia de aminoácidos utilizada de DP178 es:
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF. Para el inmunoensayo enlazado a enzima (ELISA), se recubrieron M41\Delta178 o M41-P\Delta178 (5 \mug/ml) en NaHCO_{3} 0.1 M, pH 8,6, sobre placas de ELISA Linbro de 96 pozos (Flow Lab, Inc.) durante la noche. Cada pozo fue lavado tres veces con agua destilada y luego bloqueado con albúmina de suero bovino al 3% (BSA) durante 2 horas. Después del bloqueo, se añadieron los péptidos con BSA al 0.5% en TBST (Tris-HCl 40 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0.05%) a las placas de ELISA y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con TBST, se añadió Fab-d a una concentración de 10 ng/ml con BSA al 0.5% en TBST. Las placas se lavaron tres veces con TBST después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió antisuero Fab antihumano de cabra conjugada con peroxidasa de rábano silvestre (HRP) a una dilución de 2000 veces en TBST con BSA la 0.5% a cada pozo, y se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos. Las placas se lavaron entonces cuatro veces con TBST. Se añadieron el sustrato de peroxidasa o-fenilén diamina (2.5 mg/ml) y H_{2}O_{2} al 0.15% para desarrollar el color. La reacción se detuvo con un volumen equivalente de H_{2}SO_{4} 4,5 N después de incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. La densidad óptica de la mezcla de reacción detenida se midió con un lector de microplacas (Molecular Design) a 490 nM. Los resultados de muestran en la Figura 10.
8.2 Resultados 8.2.1 La expresión y caracterización del ectodominio de gp41
Como un paso hacia la comprensión de los papeles de las dos regiones helicoidales en la estructura y la función de gp41, se expresó el ectodominio de gp41 como una proteína de fusión de enlazamiento de maltosa (M41) (Figura 7). La secuencia del péptido fusogénico en el N terminal de gp41 fue omitida de esta proteína recombinante y sus derivados para mejorar la solubilidad. La proteína de enlazamiento de la maltosa facilitó la purificación de las proteínas de fusión bajo condiciones relativamente suaves, no desnaturalizantes. Debido a que gp41 recombinante soluble en M41 no se glicosiló, las diferentes regiones faltantes de la proteína transmembrana (esto es, el péptido de fusión la extensión de membrana, y los dominios citoplasmáticos), y se expresó en ausencia de gp120, no se esperaba que reflejara precisamente la estructura de gp41 nativo sobre los viriones de VIH-1. Sin embargo, M41 purificado, doblado en una forma que preservó ciertos epítopos discontinuos como se evidencia por la reactividad con los anticuerpos monoclonales humanos, 98-6, 126-6, y 50-69, mostró previamente que se enlaza a epítopos conformacionales sobre gp41 nativo expresado en células eucariotas (Xu y colaboradores, 1991, J. Virol. 65:4832-4838; Chen, 1994, J. Virol. 68:2002-2010). Por lo tanto, al menos ciertas regiones de gp41 nativo definidas por medio de estos anticuerpos parecen reproducirse en la proteína recombinante de fusión M41. Además, M41 reaccionó con un Fab recombinante humano (Fab-d) que reconoce a un epítopo conformacional sobre gp41 y se enlaza a los viriones de VIH-1 así como a las células infectadas por VIH-1, pero no a células no infectadas como las analizadas por medio de FACS. La supresión de ambos motivos hélice, esto es, DP107 o DP178, de la proteína de fusión M41 eliminó la reactividad con Fab-d. Estos resultados indican que ambas regiones helicoidales, separadas por 60 aminoácidos en la secuencia primaria, son requeridas para mantener al epítopo de Fab-d.
8.2.2 Actividad anti-VIH del ectodominio recombinante de GP41
La proteína de fusión M41 de tipo silvestre fue analizada por su actividad anti-VIH-1. Como se explicó, supra, los péptidos sintéticos correspondientes al cierre de leucina (DP107) y a la hélice putativa C-terminal (DP178) muestra una potente actividad anti-VIH. A pesar de la inclusión de estas dos regiones, la proteína recombinante M41 no afectó la fusión de la membrana inducida por VIH-1 en concentraciones tan altas como 50 \muM (Tabla XXV, más abajo).
TABLA XXV
La ruptura del cierre de leucina de GP41 libera al motivo anti-VIH
DP107 DP178 M41 M41-P M41-P\Delta178
Fusión celular (IC_{90}) 1 \muM 1 nM >50 \muM 83 nM >50 \muM
Enlazamiento de Fab-D (k_{D}) - - 3,5 x 10^{-9} 2,5 x 10^{-8} -
Infectividad del VIH (IC_{90}) 1 \muM 80 nM > 16 \muM 66 nM > 8 \muM
1 \begin{minipage}[t]{150mm} Las constantes de afinidad del enlazamiento de Fab-d a las proteínas de fusión, se determinaron utilizando un protocolo descrito por B. Friguet y colaboradores, 1985, J. Immunol. Method. 77:305-319.\end{minipage}
- = No hay enlazamiento detectable de Fab-d a las proteínas de fusión.
\begin{minipage}[t]{155mm} Ensayos de Infectividad Antiviral. 20 \mu l de un depósito de virus diluido en forma serial se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente con 20 \mu l de la concentración indicada de proteína de fusión recombinante en un RPMI 1640 que contenía suero fetal bovino al 10% y antibióticos en una placa de microtitulación de 96 pozos. Se añadieron 20 \mu l de células CEM4 a 6 x 10^{5} células/ml a cada pozo, y se incubaron los cultivos a 37^{o}C en una incubadora humificada de CO_{2}. Las células fueron cultivadas durante 9 días por medio de la adición de medio fresco cada 2 ó 3 días. En los días 5, 7 y 9 posteriores a la infección, se ensayaron las muestras sobrenadantes por la actividad de la transcriptasa reversa (RT), como se describe más abajo, para monitorear la replicación viral. La dosis infecciosa del 50% del cultivo de tejido (TCID_{50}) se calculó para cada condición de acuerdo a la fórmula de Reed \amp{1} Muench, 1937, Am. J. Hyg. 27:493-497. La actividad RT se determinó por medio de una modificación de los métodos publicados de Goff y colaboradores, 1981, J. Virol. 38:239-248 y Willey y colaboradores, 1988, J. Virol. 62:139-147 como se describe en Chen y colaboradores, 1993, AIDS Res. Human Retroviruses 9:1079-1086.\end{minipage}
Sorprendentemente, una sustitución única de aminoácido, prolina en vez de isoleucina en la mitad del motivo de cierre de leucina, produjo una proteína de fusión (M41-P) que no exhibió actividad antiviral (Tabla XXV y Figura 8). Como se observa en la Tabla XXV, M41-P bloqueó la formación de sincitios en un 90% aproximadamente a una concentración de 85 nM y neutralizó la infección por VIH-1_{IIIB} en un 90% aproximadamente a una concentración de 70 nM. La actividad anti-VIH-1 de M41-P pareció ser mediada por la secuencia helicoidal C-terminal ya que la supresión de esa región de M41-P produjo una proteína de fusión inactiva, M41-P\Delta178 (Tabla XXV). Esta interpretación estuvo reforzada por experimentos que demostraron que una proteína de fusión troncada que carece de la secuencia de DP178, M41\Delta178, anuló la potente actividad antifusión del péptido DP178 en una forma dependiente de la concentración (Figura 9). La misma proteína fusión troncada que contenía a la mutación de prolina que rompe el cierre de leucina, M41-P\Delta178, no fue activa en experimentos de competición similares (Figura 9). Los resultados indican que el péptido DP178 se asocia con un segundo sitio sobre gp41 cuya estructura interactiva es dependiente de una secuencia de cierre de leucina de tipo silvestre. Una interacción similar puede ocurrir dentro de la proteína de fusión de tipo silvestre, M41, y actúa para formar una broche intramolecular que secuestra la región DP178 haciéndola no disponible para actividad antiviral.
Una asociación específica entre estos dos dominios también es indicada por otros estudios de Fab-d monoclonal humano. Por ejemplo, Fab-d falló en enlazar ya sea al péptido DP178 o a la proteína de fusión M41\Delta178, pero su epítopo fue reconstituido simplemente mezclando estos dos reactivos juntos (Figura 10). Nuevamente, la mutación de la prolina en el domino de cierre de leucina de la proteína de fusión, M41-P\Delta178, falló en reconstituir al epítopo en experimentos de mezcla similares.
9. Ejemplo
Método para identificación asistida por computador de secuencias como las de DP107 y DP178
Un número de secuencias conocidas en doble espiral ha sido bien descrita en la literatura, y contiene el posicionamiento repetido de septenas para cada aminoácido. La nomenclatura en doble espiral marca cada uno de los siete aminoácidos de una septena de repetición de A hasta G, con los aminoácidos A y D tendiendo a ser posiciones hidrófobas. Los aminoácidos E y G tienden a estar cargados. Estas cuatro posiciones (A, D, E, y G) forman la estructura de columna vertebral amfifática de una hélice alfa monomérica. Las columnas vertebrales de dos o más hélices amfifáticas interactúan una con la otra para formar estructuras en doble espiral di, tri, tetraméricas, etc. Con el propósito de comenzar a diseñar motivos de búsqueda por computador, se escogieron una serie de espirales dobles bien caracterizadas que incluyen al factor de transcripción de levadura GCN4, el bucle 36 de la hemaglutinina del Virus de la Influenza, y los protooncogenes humanos c-Myc, c-Fos, y c-Jun. Para cada secuencia de péptido, se determinó una estricta homología para las posiciones A y D, y una lista de los aminoácidos que podrían ser excluidos para las posiciones B, C, E, F, y G (ya que ellas no son observadas en estas posiciones). Los motivos fueron confeccionados para las secuencias de DP107 y DP178, deduciendo las posibilidades más probables para el posicionamiento de la septena de los aminoácidos de VIH-1 Bru DP-107, que se sabe que tiene una estructura en doble espiral, y VIH-1 Bru DP178 que no esta definida estructuralmente aún. El análisis de cada una de las secuencias está contenido en la Figura 12. Por ejemplo, el motivo para GCN4 fue diseñado como sigue:
\bullet
1. Los únicos aminoácidos encontrados (usando códigos estándar para los aminoácidos de una sola letra) en las posiciones A o D de GCN4 fueron [LMNV].
\bullet
2. Todos los aminoácidos fueron encontrados en las posiciones B, C, E, F, y G excepto {CFGIMPTW}.
\bullet
3. El motivo PESEARCH por lo tanto, sería escrito como sigue:
\circ
[LMNV]-{CFGIMPTW}(2)-[LMNV] -{CFGIMPTW}(3)-
\circ
[LMNV]-{CFGIMPTW}(2)-[LMNV]-{CFGIMPTW}(3)-
\circ
[LMNV]-{CFGIMPTW}(2)-[LMNV]-{CFGIMPTW}(3)-
\circ
[LMNV]-{CFGIMPTW} (2)-[LMNV]-{CFGIMPTW}(3)
Traduciendo o leyendo el motivo: "en la primera posición A debe ocurrir ya sea L, M, N o V; en las posiciones B y C (las siguientes dos posiciones) aceptan todo excepto C, F, G, I, M, P, T o W; en la posición D debe ocurrir ya sea L, M, N o V; en las posiciones E, F y G (las siguientes 3 posiciones) aceptan todo excepto C, F, G, I, M, P, T o W". Esta presentación está contenida cuatro veces en un motivo de 28 unidades, y cinco veces en un motivo de 35 unidades. La clave básica del motivo sería entonces: [LMNV] {CFGIMPTW}. Las claves del motivo para el pozo restante que describen las secuencias en doble espiral se resumen en la Figura 12.
El diseño del motivo para DP107 y DP178 fue ligeramente diferente que las secuencias para el modelo de 28 unidades descritas más arriba debido al hecho de que las posiciones de repetición de septenas no están definidas, y los péptidos son ambos más largos de 28 residuos. La Figura 13 ilustra diferentes alineamientos de secuencias posibles tanto para DP107 como para DP178 e incluye también diseños de motivos basados en péptidos de 28 unidades de longitud, 35 unidades de longitud y longitud completa. Obsérvese que solo se presentan pequeñas diferencias en los motivos en la medida en que los péptidos se alargan. Generalmente, el alargamiento del péptido base resulta en un motivo menos restrictivo. Esto es muy útil en la ampliación de posibilidades para la identificación de secuencias primarias de aminoácidos como las de DP107 o DP178 mencionadas en este documento como "aciertos".
Además de elaborar motivos altamente específicos para cada tipo de secuencia de péptido que es buscada, también es posible elaborar motivos "híbridos". Estos motivos se elaboran por medio de "cruzamiento" de dos o más motivos muy restrictivos para hacer un nuevo algoritmo de búsqueda que encontrará no solamente ambas secuencias de motivos "origen", sino también cualquier secuencia de péptido que tenga similitud con una, la otra, o ambos "orígenes". Por ejemplo, en la Figura 14, la secuencia "origen" de GCN4 se cruza con cada uno de los motivos "origen" posibles de DP-107. Ahora el motivo híbrido debe contener a todos los aminoácidos encontrados en las posiciones A y D de ambos orígenes, y excluyen a todos los aminoácidos no encontrados en cualquier origen en las otras posiciones. El híbrido resultante del cruzamiento de GCN4 o [LMNV] {CFGIMPTW} y DP107 (28 unidades con la primera L en la posición D) o [ILQT] {CDFIMPST}, es [ILMNQTV] {CFIMPT}. Obsérvese ahora que solamente existen dos motivos híbridos básicos que cubren ambas posibilidades de estructuras, así como todas las longitudes de péptidos de la molécula origen DP-107. La Figura 15 representa las "hibridaciones" de GCN4 con DP-178. La Figura 16 representa las "hibridaciones" de DP107 y DP178. Es importante tener en mente que los motivos representados, tanto de origen como híbridos, son claves de motivo y no la descripción del motivo de longitud completa necesario para hacer realmente la búsqueda por computador.
Las hibridaciones pueden realizarse sobre cualquier combinación de dos o más motivos. La Figura 17 resume diferentes hibridaciones de tres motivos que incluyen a GCN4, DP107 (ambas estructuras) y a DP178 (también ambas estructuras). Obsérvese que los motivos resultantes se hacen ahora mucho más similares unos con otros. En realidad, el primero y el tercer motivos híbridos son realmente subconjuntos del segundo y del cuarto motivos híbridos, respectivamente. Esto significa que el primero y el tercer motivos híbridos son ligeramente más restrictivos que el segundo y el cuarto. Debe observase también que solamente con cambios menores en estos cuatro motivos, o hibridación de los mismos, podría obtenerse un único motivo que encontraría a todas las secuencias. Sin embargo, debe recordarse que también se reduce la restricción. Finalmente, el espectro más amplio y el motivo híbrido menos restrictivo se describen en la Figura 18 que resume la hibridación de GCN4, DP107 (ambas estructuras), DP178 (ambas estructuras), c-Fos, c-Jun, c-Myc, y el bucle 36 de Flu.
Se diseñó un conjunto especial de motivos con base en el hecho de que DP-178 se localiza únicamente aproximadamente diez aminoácidos secuencia arriba de la región de extensión transmembrana de gp41 y justamente C-terminal a una prolina que separa a DP107 y DP178. Se ha postulado que DP178 puede ser una hélice amfifática cuando está asociada a la membrana, y que la prolina puede ayudar en la iniciación de la formación de la hélice. Se observó la misma disposición en el Virus Sincitial Respiratorio; sin embargo, la región como la de DP178 en este virus también tenía un cierre de leucina justo C-terminal a la prolina. Por lo tanto, los motivos de cierre de leucina-prolina N-terminal se diseñaron para analizar si cualquiera de los otros virus podría contener este mismo patrón. Los motivos se resumen en la Figura 19.
La base de datos de proteínas PC/Gene contiene 5879 secuencias de aminoácidos virales (archivo de genoteca PVIRUSES; CD-ROM versión 11.0). De éstas, 1092 son secuencias virales envueltas o glicoproteínas (archivo de genoteca PVIRUSE1). Las Tablas V a XIV contiene listas de nombres de secuencia de proteína y ubicaciones de acierto de motivo para todos los motivos buscados.
10. Ejemplo
Identificación asistida por computador de secuencias de DP107 y como de DP178 en virus de inmunodeficiencia humana
La Figura 20 representa resultados de búsqueda para gp41 aislado de VIH-1 BRU (secuencias de proteínas PC/Gene PENV_HV1BR). Obsérvese que el motivo híbrido que cruza a DP-107 y DP-178 (llamado 107 x 178 x 4; el mismo motivo que el encontrado en la Figura 16 encontró tres aciertos que incluyen a los aminoácidos 550-599, 636-688, y 796-823. Estas áreas incluyen a DP-107 más 8 aminoácidos N-terminal y 4 aminoácidos C-terminal; DP178 más siete aminoácidos N-terminal y diez aminoácidos C-terminal; y un área dentro de la región transmembrana (citoplasmática). La Figura 20 también contiene los resultados obtenidos de la búsqueda con el motivo llamado ALLMOTI5, para el cual la clave se encuentra en la Figura 17 ({CDGHP}{CFP}x5). Este motivo también encontró tres aciertos que incluyen a DP107 (aminoácidos 510-599), DP178 (615-717), y una región citoplasmática (772-841). Estos aciertos se superponen a los aciertos encontrados por el motivo 107x178x4 con secuencias adicionales considerables sobre ambos amino y carboxi terminales. No es sorprendente que 107x178x4 sea un subconjunto del motivo híbrido ALLMOTI5. En forma muy importante, aunque la restricción de ALLMOTI5 es considerablemente menor que la de 107x178x4, aún identifica selectivamente a las regiones DP107 y DP178 de gp41 mostrando que contienen secuencias para los péptidos inhibitorios de VIH-1. Los resultados de estas dos búsquedas de motivo se resumen en la Tabla V bajo el nombre de secuencia de proteína de PC/Gene, PENV HV1BR. Los motivos de cierre prolina-leucina también dieron diferentes éxitos en VIH-1 BRU que incluyen a 503-525 que está muy en el C-terminal de gp120, justo secuencia arriba del sitio de escisión (P7LZIPC y P12LZIPC); y 735-768 en el dominio citoplasmático de gp41 (P23LZIPC). Estos resultados se encuentran en las Tablas VIII, IX, y X bajo en mismo nombre de secuencia que se mencionó antes. Obsérvese que solamente el área de VIH-1 BRU que se predice a través del algoritmo de Lupas que contiene una región en doble espiral, es de los aminoácidos 635-670. Este comienza ocho aminoácidos N-terminal del inicio y termina ocho aminoácidos N-terminal del extremo de DP178. A pesar del hecho de que es una doble espiral conocida, no se predice que DP107 contenga una región en doble espiral utilizando el método de Lupas.
11. Ejemplo
Identificación asistida por computador de secuencias como las de DP107 y DP178 en virus sincitial respiratorio humano
La Figura 21 representa los resultados de búsqueda para la fusión de la glicoproteína F1 al Virus Sincitial Respiratorio Humano (RSV; Cepa A2) (nombre de la secuencia de proteína PC/Gene, PVGLF_HRSVA). El motivo 107x178x4 encuentra tres aciertos que incluyen a los aminoácidos 152-202, 213-243 y 488-515. La disposición de estos aciertos es similar a aquella que se encuentra en VIH-1 excepto porque los motivos encuentran dos regiones con similitudes para DP-178, una justamente secuencia debajo de la que sería llamada la región DP107 o los aminoácidos 213-243, y una justamente secuencia arriba de la región transmembrana (también similar a DP178) o los aminoácidos 488-515. El motivo ALLMOTI5 también encuentra tres áreas que incluyen a los aminoácidos 116-202, 267-302, y 506-549. Los motivos de cierre prolina-leucina también dieron diferentes aciertos que incluyen a los aminoácidos 205-221 y 265-287 (P1LZIPC 265-280, P12LZIPC), y 484-513 (P7LZIPC y P12LZIPC 484-506, P23LZIPC). Obsérvese que los motivos PLZIP también identifican regiones que comparten similitudes de ubicación con DP-178 de VIH-1.
12. Ejemplo
Identificación asistida por computador de secuencias como las de DP107 y DP178 en virus de inmunodeficiencia de simio
Los aciertos de motivo para el Virus de Inmunodeficiencia Simia gp41 (AGM3 aislado; nombre de la secuencia de proteína PC/Gene, PENV_SIVAG) se muestran en la Figura 22. El motivo 107x178x4 encuentra tres aciertos que incluyen a los aminoácidos 566-593, 597-624 y 703-730. Los primeros dos aciertos tiene únicamente tres aminoácidos entre ellos y probablemente podrían estar combinados dentro de un acierto de 566-624 que representaría un acierto como el de DP107. Los aminoácidos 703 a 730 representarían entonces un acierto como el de DP178. El motivo ALLMOTI5 también encuentra tres aciertos que incluyen a los aminoácidos 556-628, (como el de DP107), 651-699 (como el de DP178), y 808-852 que representa a la región de extensión transmembrana. SIV también tiene una región de 655-692 con una alta propensión a formar una doble espiral como la predicha por el algoritmo de Lupas. Tanto los motivos 107x178x4 como ALLMOTI5 encuentran la misma región. SIV no tiene ningún acierto de motivo PLZIP en gp41.
\newpage
La identificación de los análogos de DP178/DP107 para un segundo SIV aislado (MM251) se demuestra en el Ejemplo presentado más abajo, en la Sección 19.
13. Ejemplo
Identificación asistida por computador de secuencias como las de DP107 y DP178 en el virus de moquillo
La fusión de la glicoproteína F1 al Virus de Moquillo (cepa Onderstepoort) (nombre de la secuencia de proteína PC/Gene, PVGLF_CDVO) tiene regiones similares a la del VSR Humano que se predice que es como el DP107 y el de DP178 (Figura 23).El motivo 107x178x4 resalta un área justo C-terminal al péptido de fusión en los aminoácidos 252-293. Los aminoácidos 252-286 también se predice que son de doble espiral utilizando el algoritmo de Lupas. Casi 100 aminoácidos C-terminal a la primera región es un área como la de DP178 en los residuos 340-367. ALLMOTI5 resalta tres áreas de interés que incluyen: a los aminoácidos 228-297, que se superponen completamente tanto a la predicción de Lupas como al acierto de 107x178x4 como de DP107; los residuos 340-381, que se superponen al segundo acierto de 107x178x4; y los aminoácidos 568-602, que son como los de DP178 en que se localizan justo N-terminal a la región transmembrana. También se superpone a otra región (residuos 570-602) predicha por el método de Lupas por tener una propensión alta para formar una doble espiral. Diferentes motivos PLZIP identificaron exitosamente áreas de interés que incluyen a P6 y P12LZIPC que resaltan a los residuos 336-357 y 336-361, respectivamente; P1 y P12LZIPC que encuentran a los residuos 398-414; y P12 y P23LZIPC que encuentran a los residuos 562-589 y 562-592, respectivamente.
14. Ejemplo
Identificación asistida por computador de secuencias como las de DP107 y DP178 en el virus de la enfermedad de Newcastle
La Figura 24 muestra los aciertos de motivo encontrados en el Virus de la Enfermedad de Newcastle (cepa Australia-Victoria/32; nombre de la secuencia de proteína PC/Gene, PVGLF_NDVA). El motivo 107x178x4 encuentra dos áreas que incluyen un acierto como el de DP107 en los aminoácidos 151-178 y un acierto como el de DP178 en los residuos 426-512. ALLMOTI5 encuentra tres áreas que incluyen a los residuos 117-182, 231-272, y 426-512. Los aciertos de 426-512 incluyen una región que es predicha por el método de Lupas por tener una alta propensión a una doble espiral (460-503). Los motivos PLZIP identifican solamente una región de interés en los aminoácidos 273-289 (P1 y 12LZIPc).
15. Ejemplo
Identificación asistida por computador de secuencias como las de DP107 y DP178 en el virus de Parainfluenza humana
Ambos motivos 107x178x4 y ALLMOTI5 exhiben aciertos como los de DP107 en la misma región, 115-182 y 117-182, respectivamente, del Virus de Parainfluenza Humana (cepa NIH 47885; nombre de la secuencia de proteína PC/Gene, PVGLF_p13H4); (Figura 25). Además, los dos motivos tienen un acierto como el de DP178 justo ligeramente C-terminal a los aminoácidos 207-241. Ambos motivos tienen también aciertos como los de DP178 en las cercanías de la región transmembrana que incluyen a los aminoácidos 457-497 y 462-512, respectivamente. Diferentes aciertos del motivo PLZIP se ha observado también que incluyen a 283-303 (P5LZIPC), 283-310 (P12LZIPC), 453-474 (P6LZIPC), y 453-481 (P23LZIPC). El algoritmo de Lupas predice que los aminoácidos 122-176 pueden tener una propensión a formar una doble espiral.
16. Ejemplo
Identificación asistida por computador de secuencias como las de DP107 y DP178 del virus de Influenza A
La Figura 26 ilustra la predicción de Lupas de una espiral doble en el Virus de Influenza A (cepa A/Aichi/2/68) en los residuos 379-436, así como los aciertos de motivo para 107x178x4 en los aminoácidos 387-453, y para ALLMOTI5 en los residuos 380-456. Se mostró por parte de Carr y Kim que los residuos 383-471 (38-125 de HA2) son una doble espiral extendida cuando están bajo pH ácido (Carr y Kim, 1993, Cell 73:823-832). El logaritmo de Lupas predice una doble espiral en los residuos 379-436. Los tres métodos predice exitosamente a la región que muestra tener realmente una estructura en doble espiral; sin embargo, ALLMOTI5 predice la porción más grande de la extensión del residuo 88.
17. Ejemplo
Análogos potenciales de DP178/DP107 del virus sincitial respiratorio: caracterización CD y antiviral
En el Ejemplo presentado aquí, los péptidos del virus sincitial respiratorio (RSV) identificados por medio de la utilización de los motivos de búsqueda asistidos por computador descritos en los Ejemplos presentados en las Secciones 9 y 11 más arriba, fueron analizados por su actividad anti-RSV. Adicionalmente, se condujeron sobre los péptidos, análisis estructurales por dicroísmo circular (CD), como se discute más adelante. Se demuestra que varios de los péptidos identificados exhiben una potente capacidad antiviral. Adicionalmente se muestra que varios de estos péptidos exhiben un carácter helicoidal sustancial.
17.1 Materiales y métodos
Análisis estructurales: Los espectros de CD se midieron en un buffer de fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0, aproximadamente en concentraciones 10 mM, utilizando una celda con un paso óptico de 1 cm sobre un espectrofotómetro Jobin/Yvon Autodichrograph Mark V CD. Se determinaron las concentraciones de los péptidos a partir de A_{280} utilizando el método de Edlehoch (1967, Biochemistry 6:1948).
Ensayos de actividad antiviral anti-RSV: Los ensayos utilizados aquí probaron la capacidad de los péptidos para romper la capacidad de las células Hep2 infectadas en forma aguda con RSV (esto es células que están infectadas con una multiplicidad de infecciones superiores a 2) para fusionarse y causar una formación sincitial sobre una monocapa no infectada de una línea no infectada de células Hep-2. Se determinó que entre menor el nivel de fusión observado, mayor la actividad antiviral del péptido.
Las monocapas confluentes no infectadas de células Hep-2 crecieron en pozos de microtitulación en EMEM al 3% (Eagle Minumum Essential Médium con o sin L-glutamina [Bio Wehittaker Cat. No. 12-125F], con suero bovino fetal [FBS]; que había sido inactivado por calor durante 30 min a 56ºC; Bio Whittaker Cat. No. 14-501F) suplementados al 3%, antibióticos (penicilina/estreptomicina; Bio Whittaker Cat. No. 17-602E) añadidos al 1%, y glutamina añadida al 1%.
Para preparar células Hep2 por adición a células no infectadas, se lavaron los cultivos de células Hep2 infectadas en forma aguda con DPBS (Solución Salina de Buffer de Fosfato de Dulbecco, con o sin calcio o magnesio; Bio Whittaker Cat. No. 17-512F) y se removieron las monocapas de células con Verseno (1:5000; Gibco Life Technologies Cat. No. 15040-017). Las células fueron giradas durante 10 min y resuspendidas en FBS al 3%. El recuento de células se realizó utilizando un hemacitómetro. Se añadieron las células persistentes a las células Hep-2 no infectadas.
El ensayo antiviral se condujo primero por medio de la remoción de todo el medio de los pozos que contenían células Hep-2 no infectadas, luego se les añadieron péptidos (a las diluciones descritas más adelante) en EMEM al 3%, y 100 células Hep2 infectadas con RSV agudo por pozo. Se incubaron entonces los pozos a 37ºC durante 48 horas.
Después de la incubación, se revisaron las células en los pozos de control por los centro de fusión, se removió el medio de los pozos, seguido por la adición a cada pozo, ya sea de un colorante Cristal Violeta o XTT. Con respecto al Cristal Violeta, se añadieron aproximadamente 50 \mul de Coloración de Cristal Violeta al 0,25% en metanol a cada pozo. Se enjuagaron los pozos inmediatamente, para remover el exceso de coloración, y se permitió que se secaran. Se hizo un recuento entonces del número de sincitios por pozo, utilizando un microscopio de disección.
Con respecto a XTT (sal inerte de 2,3-bis[2-Metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolio-5-carboxianilida), se añadieron 50 \mul de XTT (1 mg/ml en RPMI tamponado con HEPES 100 mM, pH 7,2-7,4, más DMSO al 5%) a cada pozo. Se midió el OD_{450/690} (después de medir el blanco contra el medio de crecimiento sin células o reactivos, y contra los reactivos) de acuerdo con procedimientos estándar.
Péptidos: Los péptidos caracterizados en el estudio y presentados aquí fueron:
\bullet
1) péptidos T-142 a T-155 y T-575, como se muestra en la Figura 27A, y los péptidos T-22 a T-27, T-68, T-334 y T-371 a T-375 y T- 575, como se muestra en la Figura 27B;
\bullet
2) péptidos T-120 a T-141 y T-576, como se muestra en la Figura 27B, y péptidos T-12, T-13, T-15, T-19, T-28 a T-30, T-66, T-69, T-70 y T- 576, como se muestra en la Figura 27D; y
\bullet
3) péptidos T-67 y T-104 a T-119 y T-384, como se muestra en la Figura 28A, y péptidos T-71, T-613 a T-617, T-662 a T-676 y T-730, como se muestra en la Figura 28B.
Los péptidos del grupo 1 representan porciones de la proteína RSV F2 de una región como la de DP178/107. Los péptidos del grupo 2 representan porciones de la proteína RSV F1 de una región como la de DP107. Los péptidos del grupo 3 representan porciones de la proteína RSV F1 de una región como la de DP178.
Cada péptido fue analizado en un rango de dos diluciones seriales desde 100 \mug/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml. Para cada uno de los ensayos, se utilizó también un pozo que no contenía péptido. Los datos de IC_{50} para cada péptido representan el promedio de diferentes experimentos conducidos utilizando a ese péptido.
17.2 Resultados
Los datos resumidos en las Figuras 27A-B y 28A-B representan la información antiviral y estructural obtenida a partir de los péptidos derivados de la región F2 como de DP178/DP107 del RSV F2 (Figuras 27A-B), la región como la de DP-107 de RSV F1 (Figuras 27C-D) y la región F2 como la de DP178 de RSV (Figuras 28A-B).
Como se muestra en las Figuras 27A-D un número de los péptidos como los de DP178/DP107 de RSV exhibió un nivel detectable de actividad antiviral. Los péptidos de la región F2 como los de DP178/DP107 de RSV (Figuras 27A-B), por ejemplo, los péptidos purificados T-142 a T-145 y T-334, exhibieron niveles detectables de actividad antiviral, como se evidenció por sus valores de IC_{50}. Además un número de péptidos como los de DP107 de RSV F1 (Figuras 27C-D) exhibieron un nivel medible de actividad antiviral como péptidos purificados, que incluyen, por ejemplo, a los péptidos T-124 a T-127, T-131, T-135 y T-137 a T-139, como se demuestra por sus bajos valores de IC_{50}. Además, los análisis de CD ( Figuras 27A, 27C) revelan que muchos de los péptidos exhiben algún nivel detectable de estructura helicoidal.
Los resultados resumidos en las Figuras 28A-B demuestran que un número de los péptidos purificados como los de DP178, exhiben un rango de potente actividad antiviral. Estos péptidos incluyen a, por ejemplo, T-67, T-104, T-105 y T-107 a T-119, como se enlista en la Figura 28A, y T-665 a T-669 y T-671 a T-673, como se enlista en la Figura 28B. Además, algunos de los péptidos como los de DP178, exhibieron algún nivel de helicidad.
Por lo tanto, las búsquedas asistidas por computador descritas anteriormente aquí, identificaron exitosamente dominios de péptidos virales que representan compuestos antivirales anti-RSV altamente promisorios.
18. Ejemplo
Análogos potenciales de DP178/DP107 del virus de parainfluenza humana tipo 3: Caracterización CD y antiviral
En el Ejemplo presentado aquí, los péptidos del virus de parainfluenza humana tipo 3 identificados por medio de la utilización de los motivos de búsqueda asistidos por computador descritos en los Ejemplos presentados en las Secciones 9 y 15 más arriba, fueron analizados por su actividad anti-HPIV3. Adicionalmente, se condujeron sobre los péptidos, análisis estructurales por dicroísmo circular (CD), como se discute más adelante. Se demuestra que varios de los péptidos identificados exhiben una potente capacidad antiviral. Adicionalmente se muestra que varios de estos péptidos exhiben un carácter helicoidal sustancial.
18.1 Materiales y métodos
Análisis estructurales: Los análisis estructurales consistieron en estudios de dicroísmo circular (CD). Los espectros de CD se midieron en un buffer de fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0, aproximadamente en concentraciones 10 mM, utilizando una celda con un paso óptico de 1 cm sobre un espectrofotómetro Jobin/Yvon Autodichrograph Mark V CD. Se determinaron las concentraciones de los péptidos a partir de A_{280} utilizando el método de Edlehoch (1967, Biochemistry 6:1948).
Ensayos de actividad antiviral anti-HPIV3: Los ensayos utilizados aquí probaron la capacidad de los péptidos para romper la capacidad de las células Hep2 infectadas en forma crónica con HPIV3 para fusionarse y causar una formación sincitial sobre una monocapa de una línea no infectada de células CV-1W. Entre más potente el menor nivel de fusión observado, mayor la actividad antiviral del péptido.
Las monocapas confluentes no infectadas de células CV-1W crecieron en pozos de microtitulación en EMEM al 3% (Eagle Minumum Essential Médium con o sin L-glutamina [Bio Whittaker Cat. No. 12-125F], con suero bovino fetal [FBS]; que había sido inactivado por calor durante 30 min a 56ºC; Bio Whittaker Cat. No. 14-501F) suplementados al 3%, antibióticos/antimicóticos (Gibco BRL Life Technologies; Cat. No. 15040-017) añadidos al 1%, y glutamina añadida al 1%.
Para preparar células Hep2 por adición a células no infectadas, se lavaron los cultivos de células Hep2 infectadas en forma crónica con DPBS (Solución Salina de Buffer de Fosfato de Dulbecco, con o sin calcio o magnesio; Bio Whittaker Cat. No. 17-512F) y se removieron las monocapas de células con Verseno (1:5000; Gibco Life Technologies Cat. No. 15040-017). Las células fueron giradas durante 10 min y resuspendidas en FBS al 3%. El recuento de células se realizó utilizando un hemacitómetro. Se añadieron las células persistentes a las células CV-1W no infectadas.
El ensayo antiviral se condujo primero por medio de la remoción de todo el medio de los pozos que contenían células CV-1W no infectadas, luego se les añadieron péptidos (a las diluciones descritas más adelante) en EMEM al 3%, y 500 células Hep2 infectadas con HPIV3 en forma crónica por pozo. Se incubaron entonces los pozos a 37ºC durante 24 horas.
En el día dos, después de que las células en los pozos de control fueron revisadas por sus centros de fusión, se removió el medio de los pozos, seguido por la adición a cada pozo, de aproximadamente 50 \mul de Coloración de Cristal Violeta al 0,25% en metanol. Se enjuagaron los pozos inmediatamente, para remover el exceso de coloración, y se permitió que se secaran. Se hizo un recuento entonces del número de sincitios por pozo, utilizando un microscopio de disección.
Alternativamente, en vez del análisis con Cristal Violeta, las células fueron analizadas con XTT, como se describe más abajo, en la Sección 17.1.
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Péptidos: Los péptidos caracterizados en el estudio y presentados aquí fueron:
\bullet
1) Los péptidos 157 a 188, como se muestra en la Figura 29A, y los péptidos T-38 a T-40, T-42 a T-46 y T-582, como se muestra en la Figura 29B. Estos péptidos se derivan de la región de DP107 de la proteína de fusión HPIV3 F1 (representada por HPF3 107, como se muestra en la Figura 29A); y
\bullet
2) Los péptidos 189 a 210, como se muestra en la Figura 30A, y T-269, T-626, T-383 y T-577 a T-579, como se muestra en la Figura 30B. Estos péptidos se derivan principalmente de la región de DP178 de la proteína de fusión HPIV3 F1 (representada por HPF3 178, como se muestra en la Figura 30A). El péptido T-626 contiene dos residuos aminoácidos mutados (representados por un fondo sombreado). Adicionalmente, el péptido T-577 representa a los aminoácidos F1 65-100, T-578 representa a los aminoácidos F1 207-242 y T-579 representa a los aminoácidos F1 273- 309.
Cada péptido fue analizado en un rango de dos diluciones seriales desde 500 \mug/ml hasta aproximadamente 500 ng/ml. Para cada uno de los ensayos, se utilizó también un pozo que no contenía péptido.
18.2 Resultados
Los datos resumidos en las Figuras 29A-B y 30A-B representan la información antiviral y estructural obtenida a partir de los péptidos derivados de la región como la de DP107 de la proteína de fusión HPIV3 (Figuras 29A-B), y la región como la de DP178 de la proteína de fusión HPIV3 (Figuras 30A-B).
Como se muestra en las Figuras 29A-B un número de los péptidos como los de DP107 de HPIV3 exhibieron potentes niveles de actividad antiviral. Estos péptidos incluyen por ejemplo, los péptidos T-40, T-172 a T-175, T-178, T-184 y T-185
Los resultados resumidos en las Figuras 30A-B demuestran que un número de los péptidos como los de DP178 ensayados, exhiben un rango de actividad antiviral. Estos péptidos incluyen a, por ejemplo, los péptidos 194 a 211, como se evidencia por sus bajos valores de IC_{50}. En realidad los péptidos 201 a 205 exhiben valores de IC_{50} en el rango de los nanogramos/ml. Además, muchos de los péptidos como los de DP178, exhibieron algún nivel de helicidad.
Por lo tanto, las búsquedas asistidas por computador descritas anteriormente aquí, han identificado exitosamente dominios de péptidos virales que representan compuestos antivirales anti-HPIV3 altamente promisorios.
19. Ejemplo
Identificación asistida por computador de análogos de DP178/DP107 en virus de inmunodeficiencia simia
La Figura 31 representa resultados de búsqueda para MM251 aislado de SIV (secuencia de proteína PC/Gene, PENV_SIVM2). Ambos motivos de búsqueda, 107x178x4 y ALLMOTI5 identificaron dos regiones similares a DP107 y/o DP178.
Las regiones del péptido encontradas por 107x178x4 se localizaron en los residuos aminoácidos 156-215 y 277-289. Las regiones del péptido encontradas por ALLMOTI5 se localizaron en los residuos aminoácidos 156-219 y 245-286. Ambos motivos, por lo tanto, identifican regiones similares.
En forma interesante, la primera región del péptido del SIV (esto es, desde el residuo aminoácido 156 aproximadamente hasta el residuo aminoácido 219) se correlaciona con una región de DP107, mientras que la segunda región identificada (esto es, aproximadamente desde el residuo aminoácido 245 aproximadamente hasta el residuo aminoácido 289) se correlaciona con la región de DP178 del VIH. En realidad, un alineamiento de MM251 aislado de SIV y BRU aislado de VIH, seguido por una selección del mejor péptido que empareje para DP107 y DP178 del VIH, revela que el mejor emparejamiento se encuentra dentro de las regiones del péptido identificadas por los motivos de búsqueda 107x178x4 y ALLMOTI5.
Debe observarse que el programa de Lupas predice una región potencial en doble espiral en los residuos aminoácidos 242-282. Esto es similar a la observación en el VIH en el programa de Lupas predice que la doble espiral está en la región DP178 en vez de en la región de DP107. Es posible, por lo tanto, que el SIV pueda ser similar al VIH en que puede contener una estructura en doble espiral en la región de DP107, a pesar de que tal estructura esté perdida para el algoritmo de Lupas. Igualmente, puede ser que la región correspondiente a un análogo DP178 en SIV pueda exhibir una estructura no definida, a pesar de la predicción del programa de Lupas de una estructura en doble
espiral.
20. Ejemplo
Identificación asistida por computador de análogos de DP178/DP107 en el virus de Epstein-Barr
Los resultados presentados aquí, describen la identificación de análogos de DP178/DP107 dentro de dos diferentes proteínas del Virus de Epstein-Barr. Epstein-Barr es un virus de herpes humano que es el agente causante, por ejemplo de infecciones como la mononucleosis (IM), y está asociado también con carcinomas nasofaringeos (NPC), el linfoma de Burkitt y otras enfermedades. El virus existe predominantemente en forma latente, y se activa por medio de una variedad de estímulos.
La Figura 32 describe los resultados del motivo de búsqueda del precursor gp110 de la glicoproteína del Virus de Epstein-Barr (Cepa B95-8; secuencia de proteína PC/Gene®, PENV_SIVM2). El motivo 107x178x4 identificó dos regiones de interés, especialmente las regiones cubiertas por los residuos aminoácidos 95-122 y 631-658. Una región PZIP fue identificada en el residuo aminoácido 732-752 que es más probablemente una región citoplasmática de la proteína. El algoritmo de Lupas predice una estructura en doble espiral para los aminoácidos 657-684. No se identificaron regiones ALLMOTI5.
La Figura 33 describe los resultados del motivo de búsqueda para la proteína trans-activadora (BZLF1) Zebra (o EB1) del virus de Epstein-Barr identificado anteriormente. Esta proteína es un factor de transcripción que representa la mediador primario de reactivación viral. Es un miembro de la familia b-ZIP de factores de transcripción y comparte una homología significativa con el enlazamiento básico de ADN y los dominios de dimerización de los oncogenes celulares c-fos y C/EBP. La proteína Zebra funciona como un homodímero.
Los resultados de búsqueda demuestran que la proteína Zebra exhibe una región única que es predicha por ser similar a la de DP107 o a la de DP178, y se encuentra entre el enlazamiento conocido de ADN y las regiones de dimerización de la proteína. Específicamente, esta región se localiza en los residuos aminoácidos 193-220, como se muestra en la Figura 33. El programa de Lupas predijo regiones sin doble espiral.
21. Ejemplo
Identificación asistida por computador de análogos de DP178/DP107 en el virus del sarampión
La Figura 34 ilustra los resultados de búsqueda de motivo para la proteína de fusión F1 del virus del sarampión, cepa Edmonston (secuencia de proteína PC Gene®, PVGLF_MEASE), que identifica exitosamente a los análogos de DP178/ DP107.
El motivo 107x178x4 identifica una región única en los residuos aminoácidos 116-184, 228-269 y 452-500. Se encontraron tres regiones que contenían residuos de prolina seguidos por una secuencia como la del cierre de leucina comenzando en los residuos de prolina 214, 286 y 451.
El programa de Lupas identificó dos regiones que predijo que tenían potencial para una estructura en doble espiral, que incluye los residuos aminoácidos 141-172 y 444-483.
22. Ejemplo
Identificación asistida por computador de análogos de DP178/DP107 en el virus de Hepatitis B
La Figura 35 describe los resultados de una búsqueda de motivo PZIP conducida sobre el subtipo AYW del virus de la Hepatitis B. Se identificaron dos regiones de interés dentro de la superficie principal de la proteína S precursora del antígeno. La primera cae justo C-terminal al péptido de fusión propuesto de la superficie principal del antígeno (Hbs) que se encuentra en los residuos aminoácidos 174-191. La segunda región se localiza en el residuo aminoácido 233-267. El programa de Lupas predice regiones de repetición sin doble espiral.
Con el propósito de probar la potencial actividad antiviral anti-HBV de estas regiones análogas de DP178/DP107, se sintetizan los péptidos derivados del área alrededor de las regiones análogas, como se muestra en las Figuras 52A-B. Estos péptidos representan a un péptido de aminoácidos que se "desplazan" a través de las regiones análogas putativas de DP178/DP107. Los péptidos se sintetizan de acuerdo con la química estándar f-Moc sobre resinas Rinkamide MBHA para proveer un bloqueo carboxi terminal (Chang, C.D. y Meinhofer, J., 1978, Int. J. Pept. Protein Res. 11:246-249; Fields, G.B. y Noble, R.L., 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214). Después de la síntesis completa se bloquea el amino terminal del péptido a través de acetilación automatizada, y se escinde el péptido con ácido trifluoroacético (TFA) y los depuradores apropiados (King, D.S. y colaboradores, 1990, Int. J. Pept. Res. 36:255-266). Después de la escisión, el péptido se precipita con éter y se seca al vacío durante 24 horas.
La actividad anti-HBV de los péptidos se analizan utilizando ensayos estándar para determinar la concentración requerida del péptido de prueba para causar una disminución aceptable (por ejemplo 90%) en la cantidad de progenie viral formada por las células expuestas a un inóculo viral HBV. Los péptidos antivirales candidatos se caracterizan además en sistemas modelo tales como un cultivo de tejido en un manguito de madera y en sistemas animales, antes de probarlo sobre humanos.
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23. Ejemplo
Identificación asistida por computador de análogos de DP178/DP107 en los virus de mono Mason-Pfizer de Simio
Los resultados descritos aquí ilustran los resultados de los motivos de búsqueda conducidos sobre el virus de mono Mason-Pfizer de Simio. Los motivos revelan análogos de DP178/DP107 dentro de la proteína GP20 de la envoltura (TM), como se muestra en la Figura 36.
Los motivos 107x178x4 identifican una región en los residuos aminoácidos 422-470. El ALLMOTI5 encuentra una región en los residuos aminoácidos 408-474. El programa de Lupas predice una estructura en doble espiral en los aminoácidos 424-459.
24. Ejemplo
Identificación asistida por computador de análogos de DP178/DP107 en proteínas bacteriales
Los resultados presentados aquí demuestran la identificación de los análogos de DP178/DP107 correspondientes a las secuencias presentes en las proteínas de una variedad de especies bacteriales.
La Figura 37 describe los resultados del motivo de búsqueda para la proteína tuboabdominal de Pseudomonas aeruginosa (Pilin). Se identificaron dos región por medio de los motivos 107x178x4 y ALLMOTI5. Se identificaron las regiones localizadas en los residuos aminoácidos 30-67 y 80-144 por medio del motivo 107x178x4. Se identificaron las regiones en los residuos aminoácidos 30-68 y 80-125 por medio del ALLMOTI5.
La Figura 38 describe los resultados del motivo de búsqueda para la proteína tuboabdominal de Pseudomonas gonorrhoeae (Pilin). Se identificó una región única por medio de ambos motivos 107x178x4 y ALLMOTI5. Se identificó la región localizada en los residuos aminoácidos 66-97 por medio del motivo 107x178x4. Se identificaron las regiones localizadas en los residuos aminoácidos 66-125 por medio del motivo de búsqueda ALLMOTI5. Se predijeron regiones sin doble espiral por medio del programa de Lupas.
La Figura 39 describe los resultados del motivo de búsqueda para la proteína tuboabdominal de Hemophilus Influenza (Pilin). Se identificó una región única por medio de ambos motivos 107x178x4 y ALLMOTI5. Se identificó la región localizada en los residuos aminoácidos 102-129 por medio del motivo 107x178x4. Se identificaron las regiones localizadas en los residuos aminoácidos 102-148 por medio del motivo de búsqueda ALLMOTI5. Se predijeron regiones sin doble espiral por medio del programa de Lupas.
La Figura 40 describe los resultado del motivo de búsqueda para la proteína tuboabdominal de Hemophilus Influenza (Pilin) del síndrome de choque tóxico del Staphylococcus aureus. Se identificó una región única por medio de ambos motivos 107x178x4 y ALLMOTI5. Se identificó la región localizada en los residuos aminoácidos 102-129 por medio del motivo 107x178x4. Se identificaron las regiones localizadas en los residuos aminoácidos 102-148 por medio del motivo de búsqueda ALLMOTI5. Se predijeron regiones sin doble espiral por medio del programa de Lupas.
La Figura 41 resume los resultados de la búsqueda del motivo conducida sobre la proteína tipo E de la enterotoxina de Staphylococcus aureus. Estos resultados demuestran la identificación exitosa de los análogos de DP178/DP107 que corresponden a las secuencias de péptido dentro de esta proteína como se describe más abajo.
El motivo ALLMOTI5 identificó una región en los residuos aminoácidos 22-27. El motivo 107x178x4 identifico dos regiones, con la primera en los residuos aminoácidos 26-69 y la segunda en 88-115. Una búsqueda de motivo P12LZIPC identificó dos regiones, en los residuos aminoácidos 163-181 y 230-250.
El programa de Lupas predijo una región con una alta propensión para enrollarse a los residuos aminoácidos 25-54. Esta secuencia está contenida completamente dentro de la primera región identificada por ambos motivos ALLMOTI5 y 107x178x4.
La Figura 42 describe los resultado del motivo de búsqueda conducidos sobre una segunda toxina de Staphylococcus aureus, la enterotoxina A. Se identificaron dos regiones por medio del motivo ALLMOTI5, en los residuos aminoácidos 22-70 y en los residuos aminoácidos 164-205. El motivo 107x178x4 encontró dos regiones, la primera en los residuos aminoácidos 26-69 y la segunda en los residuos aminoácidos 165-192. Una búsqueda de motivo P23LZIPC reveló una región en los residuos aminoácidos 216-250. Se predijeron regiones sin doble espiral por medio del programa de Lupas.
La Figura 43 muestra los resultados del motivo de búsqueda conducidos sobre la proteína de la endotoxina A lábil al calor de la E. coli, demostrando que la identificación de los análogos de DP178/DP107 corresponden a los péptidos localizados dentro de esta proteína. Se identificaron 2 regiones por medio del motivo ALLMOTI5, con la primera residiendo en los residuos aminoácidos 55-115, y la segunda residiendo en los residuos aminoácidos 216-254. El motivo 107x178x4 identificó una región única en los residuos aminoácidos 78-105. Se predijeron regiones sin doble espiral por medio del programa de Lupas.
25. Ejemplo
Identificación asistida por computador de análogos de DP178/DP107 dentro de diferentes proteínas humanas
Los resultados presentados aquí demuestran que la identificación de los análogos de DP178/DP107 correspondientes a las secuencias del péptido presente dentro de varias proteínas humanas diferentes.
La Figura 44 ilustra los resultados del motivo de búsqueda conducidos sobre la oncoproteína humana c-fos. El motivo ALLMOTI5 identificó a una región única en los residuos aminoácidos 155-193. El motivo 107x178x4 identificó una región en los residuos aminoácidos 162-193. El programa de Lupas predijo una región en los residuos aminoácidos 148-201 que tiene una estructura en doble espiral.
La Figura 45 ilustra los resultados del motivo de búsqueda conducidos sobre la proteína P70 autoantígeno de KU de lupus humano. El motivo ALLMOTI5 identificó una región única en los residuos aminoácidos 229-280. El motivo 107x178x4 identificó una región en los residuos aminoácidos 235-292. El programa de Lupas predijo una región en los residuos aminoácidos 232-267 que tiene una estructura en doble espiral.
La Figura 46 ilustra los resultados del motivo de búsqueda conducidos sobre la proteína 10 del dedo humano de zinc. El motivo ALLMOTI5 identificó a una región única en los residuos aminoácidos 29-81. El motivo 107x178x4 identificó una región en los residuos aminoácidos 29-56. Una búsqueda de motivo P23LZIPC encontró una región única en los residuos aminoácidos 420-457. El programa de Lupas predijo regiones sin doble espiral.
26. Ejemplo
Análogos potenciales de DP178/DP107 del virus de sarampión: caracterización CD y antiviral
En el Ejemplo presentado aquí, los péptidos como los de DP178 del virus del sarampión (MeV) identificados por medio de la utilización de los motivos de búsqueda asistidos por computador descritos en los Ejemplos presentados en las Secciones 9 y 21 más arriba, fueron analizados por su actividad anti-MeV. Adicionalmente, se condujeron sobre los péptidos, análisis estructurales por dicroísmo circular (CD), como se discute más adelante. Se demuestra que varios de los péptidos identificados exhiben una potente capacidad antiviral. Adicionalmente se muestra que ninguno de estos péptidos exhiben un carácter helicoidal sustancial.
26.1 Materiales y métodos
Análisis estructurales: Los espectros de CD se midieron en un buffer de fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0, aproximadamente en concentraciones 10 mM, utilizando una celda con un paso óptico de 1 cm sobre un espectrofotómetro Jobin/Yvon Autodichrograph Mark V CD. Se determinaron las concentraciones de los péptidos a partir de A_{280} utilizando el método de Edlehoch (1967, Biochemistry 6:1948).
Ensayos de reducción sincitial de la actividad antiviral anti-MeV: Los ensayos utilizados aquí probaron la capacidad de los péptidos para romper la capacidad de las células Vero infectadas en forma aguda con MeV (esto es células que se infectan con una multiplicidad de infección de 2-3) para fusionarse y causar una formación sincitial sobre una monocapa de una línea no infectada de células Vero. Entre más potente el péptido, menor el nivel de fusión observado, mayor la actividad antiviral del péptido.
Las monocapas confluentes no infectadas de células Vero crecieron en pozos de microtitulación en FBS EMEM al 10% (Eagle Minumum Essential Médium con o sin L-glutamina [Bio Whittaker Cat. No. 12-125F], con suero bovino fetal [FBS]; que había sido inactivado por calor durante 30 min a 56ºC; Bio Whittaker Cat. No. 14-501F) suplementado al 10%, antibióticos/antimicóticos (Bio Whittaker Cat. No. 17-602E) añadidos al 1%, y glutamina añadida al 1%.
Para preparar células infectadas Vero por adición a las células no infectadas, se lavaron los cultivos de células Vero infectadas en forma aguda con HBSS (Bio Whittaker Cat. No. 10-543F) y se removieron las monocapas de células con Verseno con tripsina (Bio Whittaker Cat. No. 17-161E). Una vez desechadas las células, añadido medio, se dispersó cualquier grupo remanente de células, y se llevó a cabo el recuento celular por medio de hemacitómetro.
El ensayo antiviral se condujo primero por medio de la remoción de todo el medio de los pozos que contenían células Vero no infectadas, luego se añadieron péptidos (a las diluciones descritas más adelante) en FBS EMEM al 10%, y 50-100 células Vero infectadas con MeV en forma aguda por pozo. Se incubaron entonces los pozos a 37ºC durante un máximo de 18 horas.
En el día dos, después de que las células en los pozos de control fueron revisadas por sus centros de fusión, se removió el medio de los pozos, seguido por la adición a cada pozo, de aproximadamente 50 \mul de Coloración de Cristal Violeta al 0,25% en metanol. Se enjuagaron los pozos dos veces inmediatamente con agua, para remover el exceso de coloración, y se permitió que se secaran. Se hizo un recuento entonces del número de sincitios por pozo, utilizando un microscopio de disección.
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Ensayo de reducción de placa de la actividad antiviral anti-MeV: Los ensayos utilizados aquí probaron la capacidad de los péptidos para romper la capacidad de MeV para infectar a las células Vero no infectadas permisivas, conduciendo a la fusión de las células infectadas con las células ni infectadas para producir sincitios. Entre menor el nivel observado de formación sincitial, mayor la actividad antiviral del péptido.
Las monocapas de las células Vero no infectadas crecieron como se describió más arriba.
El ensayo antiviral se condujo primero por medio de la remoción de todo el medio de los pozos que contenían células Vero no infectadas, luego se añadieron péptidos (a las diluciones descritas más adelante) en FBS EMEM al 10%, y un depósito de virus MeV a una concentración final de 30 unidades formadoras de placa (PFU) por pozo. Se incubaron entonces los pozos a 37ºC durante un mínimo de 36 horas y un máximo de 48 horas.
En el día dos, después de que las células en los pozos de control fueron revisadas por sus centros de fusión, se removió el medio de los pozos, seguido por la adición a cada pozo, de aproximadamente 50 \mul de Coloración de Cristal Violeta al 0,25% en metanol. Se enjuagaron los pozos dos veces inmediatamente con agua, para remover el exceso de coloración, y se permitió que se secaran. Se hizo un recuento entonces del número de sincitios por pozo, utilizando un microscopio de disección.
Péptidos: Los péptidos caracterizados en el estudio presentado aquí fueron los péptidos T-252A0 a T-256A0, T-257B1/C1, y T-258B1 a T-265B0, y T-266A0 a T-268A0, como se muestra en la Figura 47. Estos péptido representan un desplazamiento a través de la región como la de DP178 de la proteína de fusión de MeV.
Cada péptido fue analizado en un rango de dos diluciones seriales desde 100 \mug/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml. Para cada uno de los ensayos, se utilizó también un pozo que no contenía péptido.
26.2 Resultados
Los datos resumidos en las Figuras 47 representan la información antiviral y estructural obtenida a partir de los "péptidos que se desplazan" a través de la región como la de DP178 de la proteína de fusión de MeV.
Como se muestra en las Figuras 47, los péptidos como los de DP178 de MeV exhibieron un rango de actividad antiviral como péptidos crudos. Varios de estos péptidos fueron escogidos para purificación y caracterización antiviral adicional. Se determinaron los valores de IC_{50} para tales péptidos, como se muestra en la Figura 47, y estaban en el rango desde 1,35 \mug/ml (T-257B1/C1) hasta 0,072 \mug/ml (T-265B1). Ninguno de los péptidos como los de DP178 mostró, por medio de análisis de CD, un nivel detectable de helicidad.
Por lo tanto, las búsquedas asistidas por computador descritas anteriormente aquí, como por ejemplo, el Ejemplo presentado en la Sección 9, por ejemplo, identificó exitosamente los dominios del péptido viral que representan a los compuestos antivirales anti-MeV altamente promisorios.
27. Ejemplo
Análogos potenciales de DP178/DP107 de SIV: Caracterización Antiviral
En el Ejemplo presentado aquí, los péptidos como los de DP178 del virus de inmunodeficiencia simia (SIV) identificados por medio de la utilización de motivos de búsqueda asistidos por computador descritos en los Ejemplos presentados en las Secciones 9, 12 y 19 más arriba, fueron analizados por su actividad anti-SIV. Se demuestra que varios de los péptidos identificados exhiben una potente capacidad antiviral.
27.1 Materiales y métodos
Ensayos antivirales anti-SIV: Los ensayos utilizados aquí fueron como los reportados por Langolis y colaboradores (Langolis, A. J., y colaboradores, 1991, AIDS Research and Human Retroviruses 7:713-720).
Péptidos: Los péptidos caracterizados en el estudio presentado aquí fueron los péptidos T-391 a T-400, como se muestra en la Figura 48. Estos péptidos representan un desplazamiento a través de la región como la de DP178 de la proteína TM SIV.
Cada péptido fue analizado en un rango de dos diluciones seriales desde 100 \mug/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml. Para cada uno de los ensayos, se utilizó también un pozo que no contenía péptido.
27.2 Resultados
Los datos resumidos en las Figuras 48 representan la información antiviral obtenida a partir de los "péptidos que se desplazan" a través de la región como la de DP178 de la proteína TM SIV.
Como se muestra en las Figuras 48, se probaron los péptidos T-391 a T-400 y exhibieron una potente actividad antiviral como péptidos crudos.
Por lo tanto, las búsquedas asistidas por computador descritas anteriormente aquí, como por ejemplo, el Ejemplo presentado en la Sección 9, por ejemplo, identificó exitosamente los dominios del péptido viral que representan a los compuestos antivirales anti-SIV altamente promisorios.
28. Ejemplo
Actividad antiviral de los truncamientos y las mutaciones del péptido DP107 y el péptido DP178
El Ejemplo presentado en esta Sección representa un estudio de la actividad antiviral de los truncamiento y las mutaciones de DP107 y DP178. Se demuestra que varios de estos péptidos modificados DP107 y DP178, exhiben una actividad antiviral sustancial.
28.1 Materiales y métodos
Ensayos anti-VIH: Los ensayos antivirales realizados fueron como aquellos descritos anteriormente en la Sección 6.1. Los ensayos utilizaron aislados de VIH-1/IIIb y/o VIH-2 NIHZ. Se utilizaron péptidos purificados a menos que se observe lo contrario en las Figuras 49A-C.
Péptidos: Los péptidos caracterizados en el ensayo presentado aquí fueron:
\bullet
1) Las Figuras 49A-C presentan péptidos derivados de la región circundante y contienen la región de DP178 del aislado del VIH-1 BRU. Específicamente, esta región se extiende desde el residuo aminoácido 615 de gp41 hasta el residuo aminoácido 717. Los péptidos enlistados contienen los truncamientos de esta región y/o las mutaciones que varían desde la secuencia de aminoácidos de la secuencia de DP178. Además, ciertos péptidos han tenido grupos amino y/o carboxiterminales ya sea añadidos o removidos, como se indica en las figuras; y
\bullet
2) La Figura 50 presenta péptidos que representan truncamientos de DP107 y/o de la región de gp41 que rodea a la secuencia de aminoácidos de DP107 del aislado del VIH-1 BRU. Ciertos péptidos están desbloqueados o biotinilados, como se indica en le figura. Los péptidos bloqueados contenían un acilo N-terminal y un amido N-terminal.
28.2 Resultados
Se obtuvieron los datos antivirales anti-VIH con el grupo 1 de los péptidos derivados de DP178 enlistados en las Figuras 49A-C. Los resultados mostrados del péptido de longitud completa no mutante DP178 (a que se hace referencia en las Figuras 49A-C como T20) son para 4 ng/ml.
En la Figura 49A, un número de truncamientos de DP178 exhibieron un alto nivel de actividad antiviral, como se evidencia por sus bajos valores de IC_{50}. Estos incluyen, por ejemplo, a los péptidos de prueba T-50, T-624, T-636 a T-641, T-645 a T-650, T-652 a T-654 y T-656. T-50 representa un péptido de prueba que contiene una mutación puntual, como la indicada por medio del fondo sombreado del residuo. Los péptidos de prueba derivado de VIH-1 exhibieron una actividad antiviral específica de una cepa distinta, en la cual ninguno de los péptidos analizados sobre el aislado de VIH-2 NIHZ demostró una apreciable actividad antiviral anti VIH-2.
Entre los péptidos enlistados en la Figura 49B, están los péptidos de prueba que representan a las mitades amino (T-4) y carboxi (T-3) terminales de DP178 que fueron ensayados. El péptido amino terminal no fue activo (IC_{50} > 400 \mug/ml) mientras que el péptido carboxi terminal mostró una potente actividad antiviral (IC_{50} = 3 \mug/ml). Un número de péptidos adicionales de prueba exhibió también un alto nivel de actividad antiviral.
Estos incluyen, por ejemplo T-61/T-102, T-217 a T-221, T-235, T-381, T-677, T- 377, T-590, T-378, T-591, T-271 a T-272, T-611, T-222 a T-223 y T- 60/T-224. Ciertos péptidos antivirales contienen mutaciones puntuales y/o adiciones de residuos aminoácidos que varían de la secuencia de aminoácidos de DP178.
En la Figura 49C, se introdujeron mutaciones puntuales y/o modificaciones amino y/o carboxi terminales dentro de la secuencia de aminoácidos de DP178 en sí misma. Como se muestra en la figura, la mayoría de los péptidos de prueba enlistados, exhiben una potente actividad antiviral.
Los truncamientos del péptido DP107 (a que se hace referencia en la Figura 50 como T21) fueron producidos y analizados también como se muestra en la Figura 50. La Figura 50 también presenta datos relacionados con los péptidos bloqueados y no bloqueados que contienen residuos aminoácidos adicionales de la región de gp41 en la cual reside la secuencia de DP107. La mayoría de estos péptidos mostraron actividad antiviral, como se evidenció por medio de sus bajos valores de IC_{50}.
Por lo tanto, los resultados presentados en esta Sección demuestran que no solamente los péptidos de longitud completa DP107 y DP178, exhiben una potente actividad antiviral, sino que las versiones truncadas y/o mutantes de estos péptidos pueden poseer también un carácter antiviral sustancial.
29. Ejemplo
Análogos potenciales de DP178/DP107 de Epstein-Barr: Caracterización antiviral
En el Ejemplo presentado aquí, los péptidos derivados de la región análoga de DP-178/DP107 de Epstein-Barr (EBV) de la proteína Zebra identificada más arriba en el Ejemplo presentado en las Secciones 20, se describen y analizan por su actividad anti-EBV. Se demuestra que entre estos péptidos existen algunos que exhiben una potente actividad antiviral.
29.1 Materiales y métodos
Ensayos Electroforéticos de Cambio de Movilidad (EMSA): en resumen, una proteína Zebra de EBV se sintetizó utilizando una transcripción in vitro de SP6 ARN polimerasa y sistemas de traducción in vitro de germen de trigo (Promega Corporation recommendations; Butler, E.T. y Chamberlain, M.J., 1984, J. Biol. Chem. 257:5772; Pelham, H.R.B. y Jackson, R.J., 1976, Eur. J. Biochem. 67:247). La proteína Zebra traducida in vitro fue preincubada entonces con cantidades crecientes de péptido hasta 250 ng/ml antes de la adición de 10.000 hasta 20.000 c.p.m. de un fragmento de ADN del elemento de respuesta de Zebra marcado con ^{32}P. Después de 20 minutos de incubación en presencia del elemento de respuesta, se analizó la reacción sobre un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 4%, seguido por una autoradiografía, utilizando procedimientos estándar de cambio de gel. La capacidad del péptido de prueba para prevenir el enlazamiento de ADN homodímero de Zebra fue ensayado por medio de la capacidad del péptido para abolir el retardamiento de la migración del gel del elemento de respuesta característico de una molécula de ácido nucleico enlazado a una proteína.
Péptidos: Los péptidos caracterizados en este estudio representan a los péptidos que se desplazan a través de la región que contiene, y está flanqueada a ambos lados por, la región análoga de DP178/DP107 identificada en el Ejemplo presentado en la Sección 20 más arriba y mostrada como se muestra en la Figura 33. Específicamente, el péptido se desplaza cubriendo la región desde el residuo aminoácido 173 hasta el residuo aminoácido 246 de la proteína Zebra de EBV.
Cada uno de los péptidos ensayados se analizó en un rango de concentraciones, con 150 ng/ml siendo la concentración más baja a la cual cualquiera de los péptidos ejerció un efecto inhibitorio.
29.2 Resultados
El factor de transcripción de la proteína Zebra de EBV contiene una región análoga de DP178/DP107, como se demostró en el Ejemplo presentado más arriba, en la Sección 20. Esta proteína parece ser el factor primario responsable por la capacidad de reactivación del virus. Un método por medio del cual la función de enlazamiento de ADN del virus Zebra puede ser abolido, puede representar por lo tanto una técnica antiviral efectiva. Con el propósito de identificar péptidos potenciales de DP178/DP107 anti-EBV, por lo tanto a los péptidos derivados de la región identificada en la Sección 20 más arriba fueron ensayados por su capacidad para inhibir el enlazamiento de ADN de la proteína Zebra.
La capacidad de los péptidos de prueba para inhibir el enlazamiento de ADN de la proteína Zebra, fue ensayada a través de los ensayos EMSA descritos más arriba, en la Sección 28.1. Los datos resumidos en las Figuras 51A-B presentan los resultados de los ensayos EMSA de los péptidos de prueba de EBV enlistados. Estos péptidos representan un aminoácido "que se desplaza" a través de la región que contiene, y esta flanqueada por ambos lados, por la región análoga de DP178/DP107 identificada en el Ejemplo presentado en la Sección 20, más arriba, y mostrada como se muestra en la Figura 33. Como se muestra en las Figuras 51A-B, la región de la cual se derivan estos péptidos va desde el residuo aminoácido 173 de la proteína Zebra de EBV hasta el residuo aminoácido 246. Un cierto número de los péptidos analizados que fue ensayado, exhibió una capacidad para inhibir el enlazamiento de ADN homodímero de la proteína Zebra, incluyendo a 439, 441, 444 y 445.
Aquellos péptidos que exhibieron una capacidad para inhibir el enlazamiento de ADN de la proteína Zebra representan a los compuestos potenciales antivirales anti-EBV cuya capacidad para inhibir la infección de EBV puede ser caracterizada adicionalmente.

Claims (12)

1. Un péptido aislado de VIH-1 o VIH-2 que tiene la fórmula:
283
en el cual:
los residuos de aminoácidos se presentan por medio del código de una sola letra;
X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo, un grupo hidrófobo, o un grupo portador macromolecular;
y Z comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo T-butoxicarbonilo o un grupo portador macromolecular.
2. Un péptido aislado del virus sincitial respiratorio que tiene la fórmula:
284
en el cual:
los residuos de aminoácidos se presentan por medio del código de una sola letra;
X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo, un grupo hidrófobo, o un grupo portador macromolecular; y
Z comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo T-butoxicarbonilo o un grupo portador macromolecular.
3. Un péptido aislado de influenza A que tiene la fórmula:
285
en el cual:
los residuos de aminoácidos se presentan por medio del código de una sola letra;
X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo, un grupo hidrófobo, o un grupo portador macromolecular; y
Z comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo T-butoxicarbonilo o un grupo portador macromolecular.
\newpage
4. Un péptido aislado del virus de Epstein-Barr que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
286 
\vskip1.000000\baselineskip
en el cual:
los residuos de aminoácidos se presentan por medio del código de una sola letra;
X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo, un grupo hidrófobo, o un grupo portador macromolecular; y
Z comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo T-butoxicarbonilo o un grupo portador macromolecular.
5. Un péptido aislado del virus de sarampión que tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
287 
\vskip1.000000\baselineskip
en el cual:
los residuos de aminoácidos se presentan por medio del código de una sola letra;
X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo, un grupo hidrófobo, o un grupo portador macromolecular; y
Z comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo T-butoxicarbonilo o un grupo portador macromolecular.
\newpage
6. Un péptido aislado del virus de hepatitis B que tiene la fórmula:
288 
\vskip1.000000\baselineskip
en el cual:
los residuos de aminoácidos se presentan por medio del código de una sola letra;
X comprende un grupo amino, un grupo acetilo, un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo, un grupo hidrófobo, o un grupo portador macromolecular; y
Z comprende un grupo carboxilo, un grupo amido, un grupo T-butoxicarbonilo o un grupo portador macromolecular.
7. El uso de un péptido como el reivindicado en la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del Virus de Inmunodeficiencia Humana tipo 1 o tipo 2.
8. El uso de un péptido como el reivindicado en la reivindicación 2, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del Virus Sincitial Respiratorio.
9. El uso de un péptido como el reivindicado en la reivindicación 3, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del Influenza tipo A.
10. El uso de un péptido como el reivindicado en la reivindicación 4, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del virus de Epstein-Barr.
11. El uso de un péptido como el reivindicado en la reivindicación 5, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del sarampión.
12. El uso de un péptido como el reivindicado en la reivindicación 6, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del virus de Hepatitis B.
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