ES2252832T3 - Procedimientos de utilizacion de compuestos de lactona macrociclicos en calidad de agentes de inversion de la resistencia a los medicamentos polivalentes en celulas cancerosas y otras. - Google Patents
Procedimientos de utilizacion de compuestos de lactona macrociclicos en calidad de agentes de inversion de la resistencia a los medicamentos polivalentes en celulas cancerosas y otras.Info
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Abstract
La invención describe procedimientos para aumentar la toxicidad de un agente quimioterapéutico hidrófobo citostático contra células cancerígenas resistentes, que comprende administrar a un mamífero una cantidad eficaz de un agente de inversión de la resistencia a múltiples fármacos, en los que el agente de inversión de la resistencia a múltiples fármacos es un compuesto de lactona macrocíclico. Los ejemplos de compuestos de lactona macrocíclicos útiles en la presente invención incluyen, pero sin limitación, la serie LL-F28249{al}-{la}, los derivados 22-oxo o 23-imino de la misma, las avermectinas, los derivados 22,23-dihidro de las mismas y las milbemicinas. También se describen composiciones que comprenden los compuestos de lactona macrocíclicos y los agentes quimioterapéuticos.
Description
Procedimientos de utilización de compuestos de
lactona macrocíclicos en calidad de agentes de inversión de la
resistencia a los medicamentos polivalentes en células cancerosas y
otras.
Esta invención se refiere en general a la
utilización de agentes que revierten la resistencia a múltiples
fármacos, que son compuestos lactonas macrocíclicas, para la
fabricación de un medicamento para incrementar la actividad
biológica de agentes quimioterapéuticos y, más específicamente, para
incrementar la toxicidad de agentes quimioterapéuticos hidrofóbicos
citostáticos.
Se ha demostrado que la selección de células
tumorales con fármacos hidrofóbicos citostásicos tiene como
resultado el desarrollo de un fenotipo de resistencia a múltiples
fármacos (mdr) y la sobreexpresión de la glicoproteína P
(Pgp) (Gottesmen y col., Biochemistry of multidrug resistance
mediated by the multidrug transporter, Annu. Rev. Biochem.
62: 385-427, 1993; Endicott y col., The
biochemistry of
P-glycoprotein-mediated multidrug
resistance, Annu. Rev. Biochem. 58:
137-171, 1989). La Pgp es un miembro de la
superfamilia de transportadores de membrana ABC (casete de unión a
ATP) que incluye la proteína asociada con la resistencia a múltiples
fármacos MRP (Cole y col., Pharmacological characterization of
multidrug resistant MRP-transfected human tumor
cells, Cancer Res. 54: 5902-5910,
1994), el regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis
quística (CFTR) (Riordan y col., Amplification of
P-glycoprotein genes in
multidrug-resistant mammalian cell lines,
Nature 316: 817-819, 1995) y varias
proteínas de la membrana periplásmica bacteriana (Higgins, ABC
transporters: from microorganisms to man, Annu. Rev. Cell
Biol. 8: 67-113, 1992). Aunque se ha
demostrado que la Pgp produce resistencia a múltiples fármacos (MDR)
en células tumorales, su función en tejidos normales está menos
clara. La familia de genes Pgp en roedores y humanos consta de tres
clases (I, II y III) y de dos clases (I y III), respectivamente.
Además, aunque se ha demostrado que las clases I y II producen MDR,
la clase III de roedores y humanos no lo hace. Utilizando
recombinación homóloga se demostró que la Pgp de clase I está
implicada en el transporte de fármacos en tejidos normales, mientras
que la Pgp de clase III media el transporte de
fosfatidil-colina (Smit y col., Homozygous
disruption of the murine mdr2 P-glycoprotein
gene leads to a complete absence of phospholipid from bile and to
liver disease, Cell 75: 451-462,
1993) y puede ser "una flipasa" (Ruetz y col.,
Phosphatidyl-choline translocate - a physiological
role for the mrd2 gene, Cell
77:1071-1081, 1994).
Se han demostrado varios niveles de expresión de
Pgp en tumores de diferentes cánceres (Goldstein y col., Expression
of a multidrug resistance gene in human cancers, J. Natl. Cancer
Inst. 81: 116-124, 1989). Sin embargo, se
necesitan más estudios para determinar si cambios de los niveles de
Pgp en células tumorales son un pronóstico de MDR. Recientemente, se
demostró que la expresión de Pgp en sarcomas de niños y en
neuroblastomas se correlacionaba con una baja respuesta a la
quimioterapia y con la supervivencia de larga duración de los
pacientes (Chan y col., Multidrug resistance in pediatric
malignancies, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 9:
275-318, 1995; Chan y col.,
P-glycoprotein expression as a predictor of the
outcome of therapy for neuroblastoma, N. Engl. J. Med.
325: 1608-1614, 1991). Otros estudios
utilizando fármacos que revertían la MDR han implicado a la Pgp en
algunos cánceres MDR (Ford, MODULATORS OF MULTIDRUG RESISTANCE,
Preclinical Studies, Hematol. Oncol. Clin. North Am.
9: 337-361, 1995; Ozols, Clinical reversal of
drug resistance - foreword, Curr. Probl. Cancer 19:
69-123, 1995; Patel y col., Multidrug resistance in
cancer chemotherapy, Invest. New Drugs 12:
1-13, 1994). No obstante, queda por demostrar un
claro beneficio clínico de los fármacos que revierten la MDR. Los
primeros intentos para utilizar verapamilo como fármaco que revierte
la MDR han sido ensombrecidos por su elevada cardiotoxicidad (Dalton
y col., A phase III randomized study of oral verapamil as a
chemosensitizer to reverse drug resistance in patients with
refractory myeloma, Cancer 75:
815-820, 1995; Pennock y col., Systemic toxic
effects associated with high-dose verapamil
infusion and chemotherapy administration, J. Natl. Cancer
Inst. 83: 105-110, 1991). En células
linfoides tumorales (CEM), un estudio demostró una mayor retención
de ciclosporina A (CsA) en células parentales que carecían de Pgp
que en células MDR que expresaban Pgp, llevando a los autores a
creer que bloqueantes de Pgp podrían restaurar la retención de CsA
en las células CEM-MDR (Didier y col., Decreased
uptake of cyclosporin A by P-glycoprotein (Pgp)
expressing CEM leukemic cells and restoration of normal retention by
Pgp blockers, Anti-Cancer Drugs 6:
669-680, 1995). Aunque los resultados obtenidos con
ciclosporina A y el análogo no inmunosupresor
SDZ-PSC 833 han sido estimulantes, se observaron
también algunos efectos tóxicos cuando se utilizó ciclosporina A en
estudios clínicos (Warner y col., Phase I-II study
of vinblastine and oral cyclosporin A in metastatic renal cell
carcinoma, Am. J. Clin. Oncol. 18:
251-256, 1995; Murren y col., A phase II trial of
ciclosporin A in the treatment of refractory metastatic colorectal
cancer, Am. J. Clin. Oncol. 14:
208-210, 1991). Por tanto, la identificación de
fármacos que reviertan la MDR con baja toxicidad para el mamífero o
el humano sometido a quimioterapia, es una tarea fundamental para el
tratamiento clínico de los tumores MDR.
Previamente, se han utilizado ampliamente
compuestos lactonas macrocíclicas tales como los compuestos
LL-F28249, las milbemicinas y las avermectinas para
el tratamiento de parásitos nematodos y artrópodos. La familia de
compuestos LL-F28249 muy activos está formada por
agentes endectocidas naturales aislados del caldo de fermentación de
Streptomyces cyaneogriseus subespecie noncyanogenus.
La Patente de EE.UU. Nº 5.106.994 y su continuación, la Patente de
EE.UU. Nº 5.169.956, describen la preparación de los componentes
principales y secundarios,
LL-F28249\alpha-\lambda. La
familia de compuestos LL-F28249 incluye además los
derivados 23-oxo semisintéticos y los derivados
23-imino semisintéticos de
LL-F-28249\alpha-\lambda
que están mostrados en la Patente de EE.UU. Nº 4.916.154. La
moxidectina, conocida químicamente como
23-(O-metiloxima)-LL-F28249\alpha,
es una derivado 23-imino particularmente potente.
Otros ejemplos de derivados de LL-F28249 incluyen
23-(semicarbazona)-LL-F-28249\alpha
y
23-(tiosemicarbazona)-LL-F-28249\alpha.
Las milbemicinas, conocidas también como la serie
de antibióticos B-41, son lactonas macrocíclicas
existentes en la naturaleza aisladas del microorganismo
Streptomyces hygroscopicus subespecie aureolacrimosus.
La Patente de EE.UU. Nº 3.950.360 muestra la preparación de los
antibióticos macrólidos milbemicina_{\alpha 1-\alpha 10} y
milbemicina_{\beta 1-\beta 3}. Estos compuestos son referidos
también comúnmente como milbemicina A, milbemicina B, milbemicina D
o antibiótico B-41A1 o antibiótico B41A3.
Las avermectinas, conocidas también como la
familia de compuestos C-076, son lactonas
macrocíclicas existentes en la naturaleza producidas por el
microorganismo actinomiceto del suelo Streptomyces
avermitilis. La Patente de EE.UU. Nº 4.310.519 describe el
aislamiento y la preparación de los componentes principales A_{1a}
(por ejemplo, avermectina A_{1a}), A_{2a}, B_{1a} y B_{2a} y
de los componentes secundarios A_{1b} (por ejemplo, avermectina
A_{1b}), A_{2b}, B_{1b} y B_{2b}. La familia
C-076 incluye adicionalmente los derivados
semisintéticos tales como las
22,23-dihidroavermectinas descritas en la Patente de
EE.UU. Nº 4.199.569. Los derivados semisintéticos incluyen
ivermectina, abamectina, doramectina y eprinomectina.
Se ha demostrado, por ejemplo, que la ivermectina
(IVM), conocida químicamente como
22,23-dihidroavermectina B_{1} o
22,23-dihidro C-076 B_{1}, es un
antihelmíntico de gran eficacia y baja toxicidad (Campbell,
Ivermectin and Abamectin, Springer, N.Y., 1989). La IVM ha
sido utilizada con éxito oralmente, por inyección subcutánea o por
captación transdérmica para curar infecciones por nematodos en
animales, y ha sido también utilizada en humanos para tratar varios
tipos de infecciones, tales como oncocerciasis (ceguera de los
ríos). Aunque no se conoce completamente el mecanismo molecular de
los efectos antiparasitarios de IVM, se cree que la IVM se une con
alta afinidad a un canal de cloruro regulado por glutamato en los
nematodos (Cully y col., Cloning of an
avermectin-sensitive glutamate-gated
chloride channel from Caenorhabditis elegans, Nature
371: 707-711, 1994). En efecto, IVM es muy
selectiva para el canal de cloruro de invertebrados pero se une con
solamente una baja afinidad al canal de cloruro regulado por ácido
\gamma-aminobutírico (regulado por GABA) en el
cerebro de vertebrados (Cully y col., Solubilization and
characterization of a high affinity ivermectin binding site from
Caenorhabditis elegans, Mol. Pharmacol. 40:
326-332, 1991; Schaeffer y col., Avermectin binding
in Caenorhabditis elegans. A two-state model
for the avermectin binding site, Biochem. Pharmacol.
38: 2329-2338, 1989). La unión de IVM al
canal de cloruro regulado por glutamato en invertebrados, que es
esencialmente irreversible, mantiene abierto el canal de cloruro e
impide la despolarización de la membrana, dando lugar a la
parálisis del nematodo. La baja toxicidad para el huésped de IVM es
debida a la baja afinidad hacia el receptor del huésped y a la
compartimentalización del receptor en el cerebro. La IVM, que es muy
hidrofóbica, no atraviesa eficazmente la barrera hematoencefálica a
bajas concentraciones (Chiu y col., Absorption, tissue distribution,
and excression of tritium-labeled ivermectin in
cattle, sheep and rat, J. Agric. Food. Chem. 38:
2072-2078, 1990).
En un estudio utilizando ratones transgénicos que
tenían alterada su función de Pgp I por recombinación homóloga, se
incrementó notablemente la acumulación de IVM en el cerebro y en
otros órganos diferentes (Schinkel y col., Disruption of the mouse
mdr1a P-glycoprotein gene leads to a
deficiency in the blood-brain barrier and to
increased sensitivity to drugs, Cell 77:
491-502, 1994). Se observó que la ivermectina era
tóxica (toxicidad en el SNC) en los ratones desprovistos de la
glicoproteína P. Los resultados condujeron a los autores de ese
estudio a postular que la Pgp en tejidos normales mediaba el
transporte de IVM. Sin embargo, no se mostró ninguna evidencia
bioquímica directa que apoyara su conclusión. Además, estos
trabajadores no demostraron que la ivermectina era un agente que
revertía de la resistencia a múltiples fármacos. Se ha informado
también que la ivermectina era transportada activamente a través de
las membranas de células de riñón canino y que inhibidores de la
glicoproteína P, tales como verapamilo y ciclosporina A, inhibían
este transporte por estas células (Greenwald y col., "Mechanistic
Studies of Passive and Active Transport Processes in MDCK Cells:
Transport of Selected Anthelmintics", actas del 41st Annual
Meeting of the American Association of Veterinary Parasitologists,
20-23 de Julio de 1996, Louisville, KY).
Estudios adicionales que implicaban a la
ivermectina han demostrado una neurotoxicidad aguda en ratones
normales pretratados con SDZ-PSC 833, un bloqueante
de la Pgp de clase I codificada por el gen mdr que fue
desarrollado para revertir la resistencia de células tumorales a
múltiples fármacos (Didier y col., Decreased biotolerability for
ivermectin and ciclosporin A in mice exposed to potent
P-glycoprotein inhibitors, Int. J. Cancer
63: 263-267, 1995). Recientemente, se ha
sugerido que la ivermectina puede actuar como un sustrato y como un
inhibidor de la Pgp, pero el estudio no explicaba adecuadamente la
toxicidad de la ivermectina encontrada en los ratones tratados con
SDZ-PSC 833 (Didier y col., The abamectin derivative
ivermectin is a potent P-glycoprotein inhibitor,
Anti-Cancer Drugs 7:
745-751, 1996).
Pouliot y col. en Biochem. Pharmacol.
53(1): 17-25 (1997) informan de la
reversión experimental in vitro por ivermectina de la
resistencia a múltiples fármacos asociada con la glicoproteína P de
células de linfoma humano resistentes a vinblastina. El documento
informa además que la ivermectina potencia la toxicidad de la
vinblastina y de la doxorrubicina en células de linfoma humano
altamente resistentes a la vinblastina.
WO 96 01127 A describe métodos y composiciones
que comprenden fármacos antitumorales camptotecinas tales como
irinotecán y topotecán en combinación con agentes que disminuyen la
actividad de la glicoproteína P tales como ciclosporina A o
ivermectina.
WO 94 22846 A describe ciertos compuestos
heterocíclicos y su utilización como sensibilizadores de células
tumorales resistentes a múltiples fármacos a agentes anticancerosos
y como sensibilizadores de formas resistentes a múltiples fármacos
de malaria, tuberculosis, leishmania y disentería amebiana.
Se ha encontrado ahora que los endectocidas
lactonas macrocíclicas son sorprendentemente potentes agentes que
revierten la resistencia a múltiples fármacos y que son capaces de
incrementar la potencia de ciertos agentes quimioterapéuticos
contra tumores resistentes y otras células relacionadas. Se ha
encontrado también que un nuevo derivado de
LL-F28249 posee inesperadamente potentes propiedades
de reversión de la resistencia a múltiples fármacos que es útil para
vencer la resistencia a fármacos en células tumorales y otras
enfermedades.
Los antecedentes de la invención y su desviación
de la técnica serán descritos adicionalmente en la presente a
continuación con referencia a las figuras acompañantes, en las
cuales:
Las Figuras 1A y 1B muestran la acumulación de
ivermectina (IVM) y vinblastina (VLB) y su evacuación por células
cancerosas. Células sensibles a fármacos (CEM) y resistentes a
fármacos (CEM/VLB^{\text{1.0}}) son incubadas a 37ºC en
\alpha-MEM durante 0-60 minutos en
presencia de [^{3}H]-IVM 200 nM (Fig. 1A) o de
[^{3}H]-vinblastina 200 nM (Fig. 1B) solas o en
presencia de azida de sodio 10 mM. Las células son posteriormente
lavadas y la evacuación se lleva a cabo a 37ºC en
\alpha-MEM durante tiempos que varían de 0 a 30
minutos. Los valores de acumulación representan la media \pm DS
de tres experimentos.
Las Figuras 2A y 2B muestran la inhibición
competitiva de la captación de ivermectina y vinblastina. Células
sensibles a fármacos (CEM) y resistentes a fármacos
(CEM/VLB^{\text{1.0}}) son incubadas con
[^{3}H]-IVM 200 nM (Fig. 2A) o con
[^{3}H]-vinblastina 200 nM (Fig. 2B) en
\alpha-MEM durante 30 minutos a 37ºC en ausencia o
presencia de un exceso molar de 300 veces de ivermectina (Ivm),
vinblastina (Vlb), colchicina (Col), verapamilo (Vrp) o ciclosporina
A (CsA). Los valores de acumulación representan la media \pm DS de
tres experimentos.
La Figura 3 muestra la unión de saturación de
ivermectina a membranas plasmáticas de células resistentes. Las
membranas plasmáticas (20 \mug) son incubadas con concentraciones
crecientes (0-80 nM) de
[^{3}H]-IVM. La unión no específica es la mitad de
la unión total. Se utiliza una representación gráfica de Scatchard
para calcular de constante de disociación (K_{D}) y el valor de la
unión máxima (B_{máx}). Cada valor representa la media \pm
E.S.M. de tres experimentos.
Las Figuras 4A y 4B muestran la inhibición
competitiva de la unión de ivermectina y vinblastina a las membranas
de células sensibles a fármacos y resistentes a fármacos. Las
membranas plasmáticas (20 \mug) de células CEM o
CEM/VLB^{\text{1.0}} son incubadas con
[^{3}H]-IVM 20 nM (Fig. 4A) o con
[^{3}H]-VLB 20 nM (Fig. 4B) en ausencia o
presencia de un exceso molar de 300 veces de ivermectina (Ivm),
vinblastina (Vlb), colchicina (Col), verapamilo (Vrp) o ciclosporina
A (CsA). Los valores de la unión de los fármacos a las fracciones de
membrana están presentados como la media \pm DS de tres
experimentos.
Las Figuras 5A y 5B muestran la inhibición
competitiva del marcaje por fotoafinidad con
yodoaril-azidoprazosina (IAAP). En la Figura 5A,
células sensibles a fármacos (CEM) y resistentes a fármacos
(CEM/VLB^{\text{1.0}}) son marcadas por fotoafinidad con
[^{125}I]-IAAP 20 nM. Las células sensibles a
fármacos (Calle 1) y resistentes a fármacos (Calles
2-14) son incubadas en ausencia (Calles
1-2) o en presencia de un exceso molar de 1 vez
(Calles 5, 8, 11 y 14), de 10 veces (Calles 4, 7, 10 y 13) o de 100
veces (Calles 3, 6, 9 y 12) de IVM (Calles 3-5),
SDZ-PSC 833 (PSC 833; Calles 6-8),
ciclosporina A (CsA; Calles 9-11) o verapamilo (Vrp;
Calles 12-14). La Figura 5B muestra el porcentaje de
inhibición del fotomarcaje de Pgp con IAAP de la Figura 5A según se
determinó mediante barrido densitométrico de la banda de Pgp
fotomarcada. La señal de la Calle 2 (Pgp fotomarcada en células
CEM/VLB^{\text{1.0}} en ausencia de fármacos) es tomada como
control o 100%.
Las Figuras 6A y 6B muestran la modulación de la
resistencia a vinblastina (Fig. 6A) y de la resistencia a
doxorrubicina (Fig. 6B) por ivermectina, SDZ-PCS 833
(PSC 833), ciclosporina A y verapamilo. Células sensibles a fármacos
(CEM; 0,5 x 10^{4}) y resistentes a fármacos
(CEM/VLB^{\text{0.1}}; 1 x 10^{4}) son sembradas e incubadas
durante 24 horas. Se añade posteriormente vinblastina o
doxorrubicina (0 - 5 \mug/ml o 0 - 10 \mug/ml, respectivamente)
en ausencia y en presencia de IVM, SDZ-PSC 833 (PSC
833), ciclosporina A o verapamilo (0,1, 0,5 ó 2 \muM). Después de
96 horas de exposición, se calcula la viabilidad de CEM y
CEM/VLB^{\text{0.1}} midiendo la absorbancia a 450 nm. Cada punto
es la media (\pm DS) de tres experimentos independientes.
La Figura 7 muestra la inhibición competitiva del
marcaje por fotoafinidad con
yodoaril-azidoprazosina. Células sensibles a
fármacos (CEM) y resistentes a fármacos (CEM/VLB^{\text{1.0}}) son
marcadas por fotoafinidad con [^{125}I]-IAAP 20
nM. Las células sensibles a fármacos (Wt) y resistentes a fármacos
son incubadas en ausencia (Ctl) o en presencia de un exceso molar de
200 veces (L) o de 1000 veces (H) de ivermectina (Ivm), moxidectina
(Mox), ciclosporina A (CsA), vinblastina (Vlb), verapamilo (Vrp) y
colchicina (Col).
Las Figuras 8A y 8B muestran la inhibición
competitiva del marcaje por fotoafinidad con
yodoaril-azidoprazosina por diferentes análogos de
moxidectina. En la Figura 8A, células sensibles a fármacos (CEM) y
resistentes a fármacos (CEM/VLB^{\text{1.0}}) son marcadas por
fotoafinidad con [^{125}I]-IAAP 20 nM. Las células
son incubadas en ausencia (CEM/VLB^{\text{1.0}}) o en presencia de
un exceso molar de 10, 100 ó 1000 veces de
23-(tiosemicarbazona)-LL-F28249\alpha
(CL182415),
23-(O-metiloxima)-5-(fenoxiacetoxi)-LL-F28249\alpha
(CL182168) y de la mezcla isomérica de (E) y
(Z)-26-formil-(O-metiloxima)-LL-F28249\alpha
(CL182053). La Figura 8B muestra el análisis de barrido
densitométrico del autorradiograma.
La presente invención se refiere a la utilización
de agentes que revierten la resistencia a múltiples fármacos para la
fabricación de un medicamento para ser administrado a mamíferos que
padezcan de cáncer o de enfermedades relacionadas, con el fin de
incrementar la toxicidad de ciertos agentes quimioterapéuticos
contra células tumorales resistentes y otras células relacionadas.
Sorprendentemente, los agentes para revertir la resistencia a
múltiples fármacos comprenden compuestos lactonas macrocíclicas.
Deseablemente, los compuestos lactonas
macrocíclicas para ser utilizados en esta invención son aislados de
Streptomyces, tal como por ejemplo, los compuestos
LL-F28249 o derivados sintéticos de los mismos, las
milbemicinas o las avermectinas. Tales lactonas macrocíclicas
incluyen los compuestos
LL-F28249\alpha-\lambda, los
derivados 23-oxo o 23-imino de los
mismos, los 22,23-dihidro derivados de las
avermectinas y varios derivados de la milbemicina. Compuestos
lactonas macrocíclicas particularmente deseables son
LL-F28249\alpha,
23-(O-metiloxima)-LL-F28249\alpha,
23-(semicarbazona)-LL-F28249\alpha,
23-(tiosemicarbazona)-LL-F28249\alpha,
la mezcla isomérica de (E) y
(Z)-26-formil-(O-metiloxima)-LL-F28249\alpha,
milbemicina A y milbemicina D.
Los agentes quimioterapéuticos pueden incluir
fármacos quimioterapéuticos hidrofóbicos citostáticos tales como,
por ejemplo, vinblastina, vincristina, doxorrubicina, paclitaxel,
colchicina, actinomicina D y gramicidina D. Ha sido problemático en
la utilización de estos agentes quimioterapéuticos el hecho de que
se hayan desarrollado células tumorales resistentes durante los
últimos años. En particular, se ha observado resistencia en células
de linfoma humano, en células de cáncer de mama humano, en células
de cáncer de ovario humano y en células de cáncer de pulmón humano.
La presente composición será beneficiosa para combatir estos y otros
tejidos cancerosos similares.
Los compuestos son administrados a mamíferos
oralmente, parenteralmente, tópicamente (actividad local) o
transdérmicamente (actividad sistémica), dependiendo de la
biodisponibilidad del medicamento seleccionado por la vía de
administración deseada. La administración parenteral de medicamentos
incluye cualquier vía distinta de la oral, tal como, por ejemplo,
intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente,
intratraquealmente, intrarruminalmente, etc. Es obvio que los
agentes que revierten la MDR son administrados en relación con la
administración de los agentes quimioterapéuticos que encuentran
resistencia. Sin embargo, la administración de las lactonas
macrocíclicas puede realizarse antes o durante la quimioterapia. Si
el agente que revierte la MDR es administrado antes del fármaco
quimioterapéutico, el personal médico o veterinario puede determinar
fácilmente a partir de los niveles en sangre cuánto tiempo antes de
la quimioterapia puede ser administrado el agente que revierte la
MDR para que sea eficaz. Sin duda alguna, la dosificación
seleccionada y el estado de la enfermedad (por ejemplo, no
metastásica o local frente a metastásica o un grado avanzado de
cáncer) influyen sobre la pauta de administración. Típicamente, el
agente que revierte la MDR será administrado dentro de las 24 horas
posteriores al comienzo de la quimioterapia y, preferiblemente,
dentro de las 4 horas anteriores a, o simultáneamente con, la
administración del fármaco quimioterapéutico. Debido a la larga
semivida de muchos de los macrólidos, que varía entre 1 y 8 días
dependiendo de la especie, el agente que revierte la MDR puede ser
administrado incluso hasta 8 días antes del inicio de la
quimioterapia y ser todavía eficaz para incrementar la potencia del
agente quimioterapéutico.
En términos de dosificación, la cantidad adecuada
de los compuestos lactonas macrocíclicas que es eficaz para
incrementar la toxicidad del agente quimioterapéutico contra tumores
resistentes y otras células, variará típicamente dentro de un
amplio rango de cantidades a una variedad de concentraciones. La
naturaleza o el estado de la enfermedad y la selección del agente
quimioterapéutico influirán claramente sobre la dosis particular
del agente que revierte la MDR. Bajo ciertas circunstancias, los
macrólidos pueden ser administrados, por ejemplo, a la dosis de
0,001 mg aproximadamente a 10 mg por kg de peso corporal
aproximadamente y, preferiblemente, de 1 mg aproximadamente a 5 mg
por kg de peso corporal aproximadamente. Otras circunstancias pueden
justificar dosis por encima o por debajo de este nivel. Se contempla
que la selección de dosificaciones apropiadas del agente
quimioterapéutico y del agente que revierte la resistencia a
múltiples fármacos para conseguir la cantidad eficaz supresora del
tumor, puede ser valorada fácilmente mediante análisis rutinarios
conocidos por las personas que tienen experiencia habitual en las
técnicas médicas y veterinarias.
Para utilización en un tratamiento de
quimioterapia, los compuestos de la presente invención pueden ser
administrados oralmente en una forma de dosificación unidad tal como
una cápsula, un bolo o una tableta. Las cápsulas y los bolos
comprenden el ingrediente activo mezclado con un vehículo
transportador convencional tal como almidón, talco, estearato de
magnesio o fosfato dicálcico. Las formas de dosificación unidad
sólidas secas son preparadas mezclando íntimamente y uniformemente
el ingrediente activo con diluyentes adecuados finamente divididos,
con agentes de carga, agentes desintegrantes y/o aglutinantes tales
como almidón, lactosa, talco, estearato de magnesio y gomas
vegetales. Tales formulaciones de dosificación unidad pueden ser
variadas ampliamente con respecto a su peso y contenido total del
agente activo dependiendo de factores tales como el tipo y el peso
del mamífero que va a ser tratado, la gravedad del estado de
enfermedad y el tipo de tumor implicado.
Para animales, el compuesto activo puede ser
administrado en el alimento del animal dispersando íntimamente el
ingrediente activo en el pienso o utilizándolo como aderezo
superficial o en forma de pastillas que pueden ser añadidas
posteriormente al pienso terminado o añadidas opcionalmente de forma
separada. Las composiciones adecuadas incluyen premezclas con el
pienso o suplementos del mismo en los que el compuesto activo está
presente en cantidades relativamente grandes, donde dichas
premezclas con el pienso o suplementos del mismo son adecuados para
la alimentación directa del animal o para ser añadidos al pienso
directamente o después de una etapa intermedia de dilución o
mezclado.
Los vehículos o diluyentes típicos adecuados para
tales composiciones incluyen granos secos procedentes de la
destilación, harina de maíz, harina de cítricos, residuos de
fermentación, conchas de ostra trituradas, productos del trigo,
melazas, harina de mazorca de maíz, pienso molido de alubias
comestible, sémola de soja, piedra caliza triturada. Los compuestos
son dispersados íntimamente en todo el vehículo mediante métodos
tales como trituración, agitación, molido o agitación en un tambor.
Las composiciones que contienen de un 0,005% aproximadamente a un
2,0% aproximadamente, en peso, del compuesto activo son
particularmente adecuadas como premezclas con el
pienso.
pienso.
Los suplementos del pienso añadidos directamente
al animal contienen alrededor de un 0,0002% a un 0,3%, en peso, de
los compuestos activos. Tales suplementos son añadidos al alimento
del animal en una cantidad para proporcionar al pienso terminado la
concentración de compuesto activo deseada para el tratamiento del
tumor resistente o de otra enfermedad cancerosa. Aunque la
concentración deseada del compuesto variará dependiendo de una
variedad de factores tales como el compuesto particular empleado o
la gravedad del estado de enfermedad, los compuestos macrocíclicos
de esta invención son añadidos normalmente al alimento en
concentraciones del 0,00001% aproximadamente al 0,02%
aproximadamente.
Alternativamente, los ingredientes activos de la
invención pueden ser administrados a los mamíferos afectados
parenteralmente. Los compuestos macrocíclicos pueden ser disueltos,
dispersados o suspendidos en un vehículo transportador líquido no
tóxico, isotónico, estéril. El compuesto es mezclado con el vehículo
no tóxico farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un aceite
vegetal tal como aceite de cacahuete o aceite de algodón. Pueden
utilizarse también otros vehículos parenterales como propilén
glicol y glicerol. Una formulación parenteral que comprenda los
macrólidos y los agentes quimioterapéuticos puede ser liofilizada
con excipientes opcionales y reconstituida antes de la
administración utilizando un vehículo no tóxico farmacéuticamente
aceptable adecuado, tal como solución salina, glucosa en agua y agua
estériles.
En las formulaciones parenterales, los macrólidos
activos son típicamente disueltos o suspendidos en la formulación en
una cantidad suficiente para proporcionar de un 0,005%
aproximadamente a un 5,0% aproximadamente en peso del compuesto
activo en dicha formulación.
Oportunamente, los macrólidos pueden ser también
administrados a los mamíferos afectados por vía tópica o
transdérmica para conseguir un efecto local o sistémico. En
animales, los compuestos pueden ser aplicados como una poción
líquida. La poción es normalmente una solución, suspensión o
dispersión del compuesto activo, normalmente en agua, junto con un
agente de suspensión tal como bentonita y un agente humectante.
Generalmente, las pociones contienen también un agente
antiespumante. Las formulaciones de las pociones contienen
típicamente de un 0,001% aproximadamente a un 0,5% aproximadamente,
en peso, y preferiblemente de un 0,01% aproximadamente a un 0,1%
aproximadamente, en peso, del compuesto macrocíclico activo.
Adicionalmente, los compuestos macrocíclicos y
ciertos agentes quimioterapéuticos pueden ser administrados por
aplicación como un gel, loción, solución, crema o ungüento a la piel
humana o pueden ser vertidos sobre la piel o el pellejo de un animal
a través de una solución. Las formulaciones tópicas o transdérmicas
contienen el ingrediente activo en combinación con excipientes y
vehículos inactivos convencionales. La crema, por ejemplo, puede
utilizar vaselina líquida, vaselina blanca, propilén glicol, alcohol
estearílico, alcohol cetílico, lauril sulfato de sodio, tampón
fosfato de sodio, polisorbatos, parabenos, cera emulsionante,
copolímeros en bloque de
polioxietileno-polioxipropileno o agua purificada.
Los ungüentos pueden emplear, por ejemplo, vaselina, aceite mineral,
cera mineral o glicerina. Las soluciones tópicas pueden proporcionar
el ingrediente activo mezclado con propilén glicol, parabenos,
hidroxipropil celulosa, conservantes. Las formulaciones para ser
vertidas pueden estar constituidas por el ingrediente activo
disuelto en un solvente inerte adecuado tal como dimetilsulfóxido y
propilén glicol. Una formulación para ser vertida particularmente
útil comprende el ingrediente activo disuelto o disperso en un
solvente aromático, propionato de
PPG-2-miristil éter, polibuteno, un
agente antimicrobiano, un agente antioxidante y un aceite mineral o
vegetal no tóxico farmacéuticamente aceptable.
Esta invención tiene que ver con los hallazgos
inesperados de que compuestos lactonas macrocíclicas tales como
moxidectina y varios análogos de moxidectina son potentes fármacos
que se unen a la glicoproteína P y pueden revertir la resistencia a
múltiples fármacos (MDR) en células tumorales y en otras células.
Los resultados ya descritos por la técnica anterior ilustran que la
IVM, por ejemplo, es un sustrato de la bomba de evacuación de
fármacos de Pgp. Además, se ha demostrado que la IVM interacciona
con la Pgp y es un potente agente que revierte la MDR. A la vista
de su elevada afinidad por la glicoproteína P, la propiedad de
revertir la MDR y la seguridad inherente, los compuestos lactonas
macrocíclicas pueden desempeñar una función importante en la terapia
del cáncer y de otras enfermedades en las que la MDR puede ser
problemática. Aunque se ha demostrado que algunos análogos de
moxidectina son marginalmente activos como endectocidas, son
sorprendentemente agentes que revierten la MDR muy potentes. Esto
hace que sean útiles como agentes para revertir la MDR en la terapia
del cáncer o como agentes que revierten la resistencia a
endectocidas en nematodos y artrópodos.
En los ejemplos de referencia se muestra que la
IVM es un sustrato de la bomba de evacuación de fármacos de Pgp en
células mdr humanas. Los resultados ilustran que la
[^{3}H]-IVM se acumula en menor grado en las
células resistentes a fármacos que en las células sensibles a
fármacos. Además, los estudios de evacuación muestran que la
[^{3}H]-IVM es evacuada rápidamente de las células
resistentes y que este transporte es dependiente de energía. Estos
resultados son consistentes con un informe anterior que sugiere que
la IVM puede ser un sustrato de la Pgp, ya que la alteración del
gen de la Pgp murina I del genoma del ratón mediante recombinación
homóloga da lugar a la acumulación de IVM en el cerebro y en otros
tejidos que sobreexpresan intrínsecamente Pgp (Schinkel y col.,
Disruption of the mouse mdr1a P-glycoprotein
gene leads to a deficiency in the blood-brain
barrier and to increased sensitivity to drugs, Cell
77: 491-502, 1994). Aunque los resultados de
este estudio y de un estudio previo apoyan la idea de que la IVM es
transportada desde las células mdr, la IVM es transportada
menos eficazmente que la [^{3}H]-vinblastina. No
está clara la razón por la cual estos fármacos son transportados de
manera diferente desde las células mdr. Tales diferencias
pueden ser debidas a la elevada hidrofobicidad de la IVM en
comparación con la de la vinblastina (fraccionamiento en octanol
respecto a agua, IVM/vinblastina = 45). La IVM es poco soluble en
solución acuosa. Tiene tendencia a repartirse en el entorno
hidrofóbico ofrecido por la membrana celular, teniendo como
resultado una baja evacuación. Además, debido a su mayor afinidad
por la Pgp, la IVM puede poseer una constante de disociación más
lenta que la vinblastina (la K_{D} es 10,6 nM frente a
400-500 nM para la IVM y la vinblastina,
respectivamente) (Naito y col., ATP/Mg2+-dependent binding of
vincristine to the plasma membrane of
multidrug-resistant K562 cells, J. Biol.
Chem. 263: 11887-11891, 1988; Cornwell y
col., Certain calcium channel blockers bind specifically to
multidrug-resistant human KB carcinoma membrane
vesicles and inhibit drug binding to P-glycoprotein,
J. Biol. Chem. 262: 2166-2170, 1987).
Los resultados de la química ambiental de moxidectina que son
análogos a los de la IVM, tal como la demostración de una elevada
hidrofobicidad (coeficiente de reparto en n-octanol/agua,
K_{OW} = 58.300) así como una baja solubilidad en agua (0,51
mg/l), proporcionan un fundamento sólido de la actividad de la
moxidectina como agente que revierte la MDR.
Informes anteriores sobre las propiedades
fisicoquímicas de varios compuestos que se cree que revierten el
fenotipo mdr (Nogae y col., Analysis of structural features
of dihydropyridine analogs needed to reverse multidrug resistance
and to inhibit photoaffinity labelling of
P-glycoprotein, Biochem. Pharmacol.
38: 519-527, 1989; Pearce y col., Essential
features of the P-glycoprotein pharmacophore as
defined by a series of reserpine analogs that modulate multidrug
resistance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
5128-5132, 1989; Zamora y col.,
Physical-chemical properties shared by compounds
that modulate multidrug resistance in human leukemic cells,
Molec. Pharmacol. 33: 454-462, 1988)
han indicado que la lipofilicidad, ejemplificada por uno o más
anillos aromáticos planares y una carga catiónica, es común a la
mayoría de los agentes que revierten la MDR. Aunque estos restos
estructurales se encuentran en muchos agentes que revierten la MDR,
su función en la unión Pgp-fármaco y en el
transporte es actualmente desconocida. Utilizando detergentes no
iónicos, que revierten también el fenotipo mdr a
concentraciones no tóxicas, se ha demostrado previamente que es
posible que interacciones hidrofóbicas medien la unión de fármacos a
Pgp, mientras que la carga catiónica asociada con algunos agentes
lipofílicos que revierten la MDR puede ser importante en el
transporte de fármacos (Zordan-Nudo y col., Effects
of nonionic detergents on P-glycoprotein drug
binding and reversal of multidrug resistance, Cancer Res.
53: 5994-6000, 1993). Actualmente, se ha
demostrado que el coeficiente de fraccionamiento en octanol/agua de
la IVM es 3 y 9 veces mayor que el de la ciclosporina A y del
verapamilo, respectivamente. La moxidectina muestra también un
coeficiente de fraccionamiento en octanol/agua significativamente
mayor (K_{OW} = 58.300) que la ciclosporina y el verapamilo. Por
tanto, las diferencias observadas en el potencial de reversión con
los agentes que revierten la MDR con respecto a su hidrofobicidad
son consistentes con los hallazgos anteriores
(Zordan-Nudo y col., Effects of nonionic detergents
on P-glycoprotein drug binding and reversal of
multidrug resistance, Cancer Res. 53:
5994-6000, 1993; Nogae y col., Analysis of
structural features of dihydropyridine analogs needed to reverse
multidrug resistance and to inhibit photoaffinity labelling of
P-glycoprotein, Biochem. Pharmacol.
38: 519-527, 1989; Pearce y col., Essential
features of the P-glycoprotein pharmacophore as
defined by a series of reserpine analogs that modulate multidrug
resistance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
5128-5132, 1989; Zamora y col.,
Physical-chemical properties shared by compounds
that modulate multidrug resistance in human leukemic cells,
Molec. Pharmacol. 33: 454-462,
1988).
Actualmente no se conoce el mecanismo molecular
mediante el cual la Pgp media la evacuación de fármacos. Sin
embargo, utilizando análogos fotoactivos de los fármacos, se ha
demostrado ampliamente la unión directa entre Pgp y fármacos (Nare y
col., Characterization of rhodamine 123 binding to
P-glycoprotein in human
multidrug-resistant cells, Molec. Pharmacol.
45: 1145-1152, 1994; Foxwell y col.,
Identification of the multidrug resistance-related
P-glycoprotein as a Cyclosporine binding protein,
Molec. Pharmacol. 35: 543-546, 1989;
Greenberger, Major photoaffinity drug labelling sites for
iodoaryl-azidoprazosin in
P-glycoprotein are within, or immediately
C-terminal to, transmembrane domains 6 and 12, J.
Biol. Chem. 268: 11471-11475, 1993). Los
resultados de los ejemplos de referencia muestran que la IVM
interacciona directamente con Pgp, ya que excesos molares bajos de
IVM inhiben completamente el marcaje por fotoafinidad de Pgp con
IAAP. Además, se ha demostrado que fármacos (por ejemplo,
vinblastina o ciclosporina A) que interaccionan con Pgp potencian la
acumulación de IVM en células resistentes a fármacos e inhiben la
unión de [^{3}H]-IVM a membranas de células
resistentes a fármacos, pero no de células sensibles a fármacos. La
incapacidad del verapamilo para inhibir la unión de
[^{3}H]-IVM a las membranas plasmáticas no está
clara. Puede especularse que la IVM interacciona con secuencias
diferentes en la Pgp que el verapamilo. La inhibición competitiva de
la unión de [^{3}H]-vinblastina y
[^{3}H]-IVM a membranas de células resistentes
muestra que la IVM inhibe completamente la unión de
[^{3}H]-VLB, mientras que la vinblastina inhibe
sólo parcialmente la unión de [^{3}H]-IVM. La
ciclosporina A (CsA) es el único fármaco que inhibe totalmente la
unión de IVM a Pgp. Esto sugiere que estos dos fármacos
interaccionan con sitios de unión similares. Y lo que es más
interesante, la IVM es más eficaz que SDZ-PSC 833
para inhibir el marcaje por fotoafinidad de la Pgp con IAAP. La
CI_{50} de SDZ-PSC 833 es 1,2 veces menor que la
de la IVM para VLB (vinblastina) y DOXO (doxorrubicina); además, es
también inherentemente más tóxico para las células sensibles a
fármacos y resistentes a fármacos. Por tanto, es probable que parte
de la reversión de la MDR sea debida a la toxicidad sola del
SDZ-PSC 833. En contraste, la IVM es bien tolerada a
concentraciones plasmáticas superiores a 680 ng/ml. En los presentes
ejemplos de referencia se demuestra que una concentración de 0,5
\muM o equivalente a una concentración plasmática de 435 ng/ml, es
suficiente para revertir el 96% de la resistencia en células
CEM/VLB^{\text{0.1}}. Adicionalmente, la IVM posee una semivida
larga que varía entre 1 y 8 días, según la especie, y la velocidad
de transformación biológica es relativamente lenta (menos de un 50%
después de 14 días) (Chiu y col., Absorption, tissue distribution,
and excression of tritium-labeled ivermectin in
cattle, sheep and rat, J. Agric. Food. Chem. 38:
2072-2078, 1990). Como consecuencia, la IVM tiene
una ventaja inesperada respecto al SDZ-PSC 833 en
cuanto a la reversión del fenotipo mdr de tumores en
aplicación clínica.
La serie de compuestos de moxidectina
ejemplifican una alta afinidad de unión a la glicoproteína P,
indicando que los compuestos lactonas macrocíclicas pueden actuar
como agentes que revierten la resistencia a múltiples fármacos.
Además, varios análogos de moxidectina son agentes muy potentes que
revierten la resistencia a múltiples fármacos y pueden tener
aplicación en el tratamiento del cáncer y de otras circunstancias en
las que la resistencia a múltiples fármacos sea problemática. Estos
compuestos pueden ser utilizados terapéuticamente en cualquier
mamífero, incluyendo animales o humanos. Aunque es muy deseable
tratar el cáncer que afecta a mascotas tales como perros, gatos y
caballos, los compuestos encontrarán aplicación también en otros
animales de granja o de zoo. Además, su seguridad y su potencia
para revertir la resistencia a múltiples fármacos presentan ventajas
reales para la quimioterapia en humanos, en comparación con otros
agentes que revierten la resistencia a múltiples fármacos que
tienen efectos colaterales significativos.
Esta invención describe además un nuevo derivado
de la familia de macrólidos LL-F28249 que tiene
potentes propiedades para revertir la resistencia múltiples
fármacos. La nueva mezcla isomérica de (E) y
(Z)-26-formil-(O-metiloxima)-LL-F28249\alpha
tiene la estructura siguiente:
Generalmente, la mezcla isomérica de (E) y
(Z)-26-formil-(O-metiloxima)-LL-F28249\alpha
puede ser preparada a partir de
LL-F-28249\alpha. En primer lugar,
se prepara un bromuro alílico en la posición 27 y se convierte en el
derivado 26-formilo. Este aldehído se hace
reaccionar posteriormente con clorhidrato de metoxilamina para dar
el aldehído O-metiloxima. La secuencia de la
reacción se ilustra con mayor detalle según sigue: Como material de
partida, LL-F28249\alpha (30,3 g, 4,9 mmoles) es
disuelto en acetona (60 ml) y agua (15 ml). La solución es sumergida
en un baño de hielo. Se añade gota a gota
N-bromoacetamida (0,8558 g, 6,2 mmoles) en acetona
(60 ml) mientras la solución está bajo nitrógeno, agitando. Una vez
que se ha completado la adición, la solución es agitada durante 45
minutos adicionales. Posteriormente, la solución es diluida con
Et_{2}O (350 ml), lavada con salmuera (50 ml), secada sobre
sulfato de magnesio y filtrada para eliminar el solvente. El residuo
es sometido a cromatografía instantánea (SiO_{2}, utilizando
isopropanol 1,5% y CH_{2}Cl_{2} como eluyente antes de la
amortiguación).
Para convertir el bromuro alílico en el aldehído,
el bromuro alílico (0,234 g, 0,34 mmoles) es disuelto en DMSO (4 ml)
y AgBF_{4} (73,5 mg, 1,1 equivalentes, 0,38 mmoles). La solución
es agitada a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 7 horas.
Se añade gota a gota Et_{3}N (100 \mul). Después de agitar 15
minutos adicionales, la solución es diluida con 30 ml de agua más 20
ml de salmuera y extraída dos veces con Et_{2}O (30 ml cada vez).
Las capas etéreas combinadas son lavadas posteriormente con agua (10
ml), posteriormente con salmuera (5 ml), secadas sobre sulfato de
magnesio, filtradas y el solvente es eliminado. El residuo es
sometido a cromatografía instantánea (SiO_{2}, utilizando
isopropanol 2-3% y CH_{2}Cl_{2} como eluyente)
para dar 50 mg del producto aldehído recuperado de las fracciones
15-20 e identificado mediante ^{1}H RMN y ^{13}C
RMN.
El producto aldehído
LL-F28249\alpha (41,0 mg, 65 \mumoles) es
añadido a clorhidrato de metoxilamina (40 mg, 470 \mumoles, 7
equivalentes) y piridina (0,1 ml) en etanol (1 ml) y agitado bajo
nitrógeno a temperatura ambiente. Después de un tiempo de reacción
de 17 horas, la mezcla es diluida con tolueno y posteriormente
diluida con Et_{2}O (6 ml), lavada con agua (1 ml), posteriormente
con salmuera, secada sobre sulfato de magnesio, filtrada y el
solvente es eliminado. El residuo es sometido a cromatografía
instantánea (SiO_{2}, utilizando isopropanol 2% y
CH_{2}Cl_{2} como eluyente) para dar 29,8 mg del producto final,
la mezcla isomérica de (E) y
(Z)-26-formil-(O-metiloxima)-LL-F28249\alpha,
recuperado de la combinación de las fracciones 6-10
e identificado mediante ^{1}H RMN y ^{13}C RMN.
Los ejemplos siguientes demuestran ciertos
aspectos de la presente invención. Debe apreciarse que cuando se dan
condiciones de reacción típicas (por ejemplo, temperatura, tiempos
de reacción, etc.), pueden utilizarse también condiciones que estén
por encima y por debajo de estos rangos especificados, aunque es
generalmente menos conveniente. Los ejemplos se realizan a
temperatura ambiente (de 23ºC aproximadamente a 28ºC
aproximadamente) y a presión atmosférica. Todas las partes y los
porcentajes referidos en la presente son en peso y todas las
temperaturas están expresadas en grados centígrados, a no ser que se
especifique de otro modo.
Puede obtenerse una comprensión adicional de la
invención a partir de los ejemplos siguientes.
Sobre los materiales que son utilizados en la
ilustración de esta invención, IVM y [^{3}H]-IVM
son suministrados por American Cyanamid Company (Princeton, NJ,
EE.UU.). La ciclosporina A y su análogo no inmunosupresor
SDZ-PSC 833 son suministrados por Sandoz Inc. (East
Hanover, NJ). La vinblastina es obtenida de Aldrich Chemical Co.
(Milwaukee, WI), el verapamilo y la colchicina son de Sigma Chemical
Co. (St. Louis, MO) y la
[^{125}I]-yodoaril-azidoprazosina
(2200 Ci/mmol) es adquirida a DuPont New England Nuclear (Boston,
MA). Las células de linfoma humano sensibles a fármacos (CEM) (Beck,
Vinca alkaloid-resistant phenotype in cultured
human leukemic lymphoblasts, Cancer Treat. Rep. 67:
875-882, 1983) son suministradas por el St. Jude
Chindren's Research Hospital (Memphis, TN). La línea
CEM/VLB^{\text{1.0}} es establecida a partir de la línea
CEM/VLB^{\text{0.1}} y se obtiene del B.C. Cancer Research Centre
(Vancouver, B.C.). Todos los demás productos químicos utilizados son
del grado más elevado disponible.
Ejemplo de referencia
1
Células CEM y CEM/VLB^{\text{1.0}} son
cultivadas en Medio de Eagle Mínimo \alpha
(\alpha-MEM) mediante métodos convencionales (por
ejemplo, Beck, Vinca alkaloid-resistant phenotype in
cultured human leukemic lymphoblasts, Cancer Treat. Rep.
67: 875-882, 1983). Las células
CEM/VLB^{\text{1.0}} son resistentes a 1 \mug/ml de vinblastina
y expresan niveles elevados de Pgp en comparación con las células
sensibles (Zordan-Nudo y col., Effects of nonionic
detergents on P-glycoprotein drug binding and
reversal of multidrug resistance, Cancer Res. 53:
5994-6000, 1993). Las membranas plasmáticas son
preparadas utilizando un procedimiento de precipitación con calcio
esencialmente según está descrito por Lin y col.,
Biochemistry 26: 731-736, 1987.
Brevemente, las células CEM y CEM/VLB^{\text{1.0}} son lavadas
tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada
en hielo y resuspendidas en un tampón de lisis hipotónico (KCl 10
mM, MgCl_{2} 1,5 mM y Tris-HCl 10 mM, pH 7,4)
conteniendo inhibidores de proteasas (fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 2 mM, leupeptina y pepstatina 30 \muM). Las
células son homogeneizadas utilizando un homogeneizador de vidrio
Dounce y el lisado celular es centrifugado a baja velocidad (3000
g) para eliminar las células que no se han roto y los
núcleos. El sobrenadante resultante se lleva hasta una concentración
final de CaCl_{2} de 10 mM y se mezcla sobre hielo. Los agregados
de membranas inducidos por calcio son precipitados mediante
centrifugación al alta velocidad a 100.000 g durante 1 hora a
4ºC utilizando un rotor Beckman SW50. La pella enriquecida en
membranas plasmáticas es lavada con Tris-HCl 10 mM,
pH 7,4 y sacarosa 250 mM y almacenada a -80ºC hasta que se
necesite. La concentración de proteínas es medida mediante el método
de Bradford, A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein-dye binding, Anal. Biochem.
72: 248-254, 1976.
Ejemplo de referencia
2
Las células, cultivadas sin fármaco durante al
menos 1 semana, son recogidas en la fase de crecimiento exponencial
y se siembran alícuotas de 100 \mul en placas de 96 pocillos a 0,5
x 10^{4} para CEM y 1 x 10^{4} para CEM/VLB por pocillo. Las
células son incubadas durante 24 horas a 37ºC antes de la adición de
vinblastina más/menos los agentes que revierten la MDR. Las células
son cultivadas posteriormente durante 4 días y se añade el colorante
MTT (bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5
difenil tetrazolio) a una concentración final de 0,5 mg/ml. Las
placas son incubadas durante 4 horas a 37ºC y los cristales
coloreados formados de la sal de tetrazolio son solubilizados
mediante la adición de 50 \mul de TRITON X-100® al
10% (una mezcla de éteres de polioxietileno disponible
comercialmente en Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) en HCl 0,01
N y pipeteo repetitivo. Las placas de 96 pocillos son calentadas en
el horno microondas durante 1 minuto en la posición de mínima
potencia y se añaden 10 \mul de etanol para dispersar las burbujas
formadas durante el pipeteo. Las placas son leídas a 570 nm
utilizando un lector de placas de microvaloración de ELISA.
Ejemplo de referencia
3
Las células CEM y CEM/VLB^{\text{1.0}} (1 x
10^{6}) son lavadas 3 veces en \alpha-MEM e
incubadas en oscuridad durante 30 minutos a 25ºC en presencia de
[^{125}I]-aril-azidoprazosina
(IAAP) 20 nM con o sin un exceso molar de 1, 10 y 100 veces de IVM,
SDZ-PSC 833, ciclosporina A, vinblastina o
verapamilo. Las células se colocan sobre hielo durante 10 minutos y
se irradian con una fuente de UV de 254 nm (Stratagene UV
Crosslinker, Stratagene, La Jolla, CA). Las células son
centrifugadas a 500 g durante 5 minutos, se retira el
sobrenadante y se lisa la pella en Tris-HCl pH 7,4
conteniendo MgCl_{2} 5 mM y NP40 1%. Las proteína son separadas
mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
(SDS-PAGE) utilizando el sistema de tampones de
Fairbanks (Fairbanks y col., Electrophoretic analysis of major
polypeptides of the human erythrocyte membrane, Biochemistry
10: 2606-2617, 1971). Después de la
electroforesis, los geles son fijados en metanol 40% y ácido acético
10% durante al menos 1 hora. Los geles son secados y expuestos a
una película Kodak XAR durante 16 horas a -80ºC.
Ejemplo de referencia
4
Membranas plasmáticas de células CEM y
CEM/VLB^{\text{1.0}} (20 \mug) son preincubadas en Tris 10 mM pH
7,4 conteniendo sacarosa 250 mM (TS) durante 30 minutos a 37ºC en
presencia de un exceso molar de 300 veces de los fármacos no
marcados (IVM, ciclosporina A, vinblastina, verapamilo o
colchicina). Las células son incubadas posteriormente durante 30
minutos a 37ºC en presencia de [^{3}H]-IVM o
vinblastina 20 nM. La incubación es parada por la adición de 1 ml
de TS enfriado en hielo. Las membranas son lavadas dos veces con el
mismo volumen de TS y la pella de membranas es resuspendida en NaOH
1 M y neutralizada con el mismo volumen de HCl 1 M 4 horas más
tarde. La unión de los fármacos es evaluada mediante contaje de
centelleo líquido.
Ejemplo de referencia
5
Para el estudio de acumulación de los fármacos,
células CEM y CEM/VLB^{\text{1.0}} (1 x 10^{6}) son lavadas 3
veces en PBS que contenía 1 mg/ml de glucosa y preincubadas durante
30 minutos a 37ºC en presencia de un exceso molar de 300 veces de
los fármacos no marcados (IVM, ciclosporina A, vinblastina,
verapamilo o colchicina). Las células son incubadas posteriormente
durante 30 minutos a 37ºC en presencia de
[^{3}H]-IVM o
[^{3}H]-vinblastina 0,2 \muM en un volumen final
de 100 \mul. La incubación es parada por la adición de 1 ml de PBS
enfriado en hielo conteniendo IVM o vinblastina no marcadas 60
\muM. Las células son lavadas posteriormente dos veces con la
misma solución de parada y lisadas en 100 \mul de NaOH 1 M,
seguido por neutralización con el mismo volumen de HCl 1 M 4 horas
después.
Para el estudio de evacuación de los fármacos,
las células son preincubadas durante 30 minutos a 37ºC en presencia
de [^{3}H]-IVM o
[^{3}H]-vinblastina 2 \muM y azida de sodio 10
mM para inhibir la evacuación de los fármacos. Las células son
lavadas y resuspendidas en una solución de PBS que contiene 1 mg/ml
de glucosa a 37ºC. Se retiran muestras después de incubaciones de
0-30 minutos. Las células son lavadas en 10
volúmenes de PBS enfriado en hielo que contiene 2 \muM de fármaco
no marcado. La pella celular final es resuspendida en NaOH 1 M,
seguido por neutralización con el mismo volumen de HCl 1 M 4 horas
más tarde. La acumulación de los fármacos marcados es medida
mediante contaje de centelleo líquido.
Ejemplo de referencia
6
Los fármacos con solubilizados en octanol y
mezclados con un volumen igual de PBS y agitados potentemente en
vórtex. Después de 30 minutos de agitación, la mezcla es
centrifugada a 1000 g durante 5 minutos. Se separa la fase
superior (octanol) de la fase inferior (PBS) utilizando una pipeta
Pasteur. Se determina la cantidad de fármaco en ambas fases midiendo
la absorbancia UV. En algunos casos, después del reparto, los
fármacos son separados mediante cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC) para incrementar la sensibilidad de la
detección.
La demostración de que la alteración del gen de
la Pgp de clase I en ratones mediante recombinación homóloga tiene
como resultado la acumulación de IVM en el cerebro y en otros
tejidos positivos para Pgp, nos lleva a experimentar y examinar
adicionalmente la posibilidad de que la Pgp transporte directamente
IVM. En la presente, las Figuras 1A y 1B muestran la acumulación y
la evacuación de [^{3}]-IVM o
[^{3}H]-VLB en células sensibles a fármacos (CEM)
y resistentes a fármacos (CEB/VLB^{\text{1.0}}). La captación
inicial de [^{3}H]-IVM y la acumulación en el
estado estacionario son menores en las células
CEM/VLB^{\text{1.0}} que en las células CEM (Fig. 1A). Resultados
similares se obtienen con [^{3}H]-VLB, un
sustrato conocido de la Pgp (Fig. 1B). La acumulación de
[^{3}H]-IVM en células resistentes es mucho mayor
que la acumulación de [^{3}H]-VLB. Además, los
resultados de las Figuras 1A y 1B muestran que la acumulación de
[^{3}H]-VLB y [^{3}H]-IVM es
dependiente de energía, ya que la adición del inhibidor metabólico
(azida de sodio 10 mM) a las células CEM/VLB^{\text{1.0}}
incrementa la acumulación de ambos fármacos hasta el mismo nivel que
el de las células CEM sensibles a los fármacos. Los resultados de
las Figuras 1A y 1B muestran también la evacuación de
[^{3}H]-IVM y [^{3}H]-VLB de las
células CEM y CEM/VLB^{\text{1.0}}. La evacuación de
[^{3}H]-IVM de las células CEM/VLB^{\text{1.0}}
es mucho más lenta que la de [^{3}H]-VLB. En
efecto, un 40% de [^{3}H]-IVM permanece en las
células resistentes a los fármacos después de 30 minutos de
incubación. Tomados en conjunto, estos estudios muestran que la IVM
es transportada desde las células resistentes a fármacos de una
manera dependiente de energía.
Con el fin de determinar si la acumulación de IVM
en células CEM/VLB está modulada por fármacos asociados a Pgp, se
midieron los niveles de [^{3}H]-IVM en células CEM
y CEM/VLB^{\text{1.0}} en ausencia y en presencia de un exceso
molar de 300 veces de IVM, VLB, colchicina, verapamilo o
ciclosporina A (Fig. 2A). La Figura 1A revela niveles mayores de
acumulación de [^{3}H]-IVM en las células
sensibles en comparación con las células resistentes. Sin embrago,
la presencia de IVM, ciclosporina A o verapamilo no marcados
incrementa la acumulación de [^{3}H]-IVM hasta el
mismo grado que el encontrado en las células CEM, mientras que la
vinblastina y la colchicina no tienen efecto (Fig. 2A). Se
observaron también resultados similares cuando se midió la
acumulación de [^{3}H]-VLB en presencia de los
fármacos anteriores. Ciclosporina A e IVM en un exceso molar de 300
veces, restauran ambas completamente la acumulación de
[^{3}H]-VLB en células CEM/VLB^{\text{1.0}}
(Fig. 2B). Y lo que es más interesante, la presencia de un exceso de
IVM tiene como resultado una disminución consistente de la
acumulación de [^{3}H]-VLB en células sensibles
(Fig. 2B). Esta disminución de la acumulación de
[^{3}H]-VLB en las células CEM en presencia de
IVM, no es debida a muerte celular ya que la IVM no es tóxica para
las células durante la duración del experimento, según se determinó
mediante tinción con Azul Trypan.
Con el fin de determinar si la IVM interacciona
específicamente y de forma saturable con las membranas de células
resistentes a fármacos, se midió la unión de
[^{3}H]-IVM a lo largo de un rango amplio de
concentraciones. Los resultados de la Figura 3 muestran que la unión
de IVM a las membranas de células CEM/VLB^{\text{1.0}} es
específica y saturable. La Transformación de Scatchard proporciona
una única curva de regresión que proporciona una K_{D} aparente
de 10,6 nM y un valor de B_{máx} de 19,87 pmoles/mg,
respectivamente. Para investigar adicionalmente la naturaleza de las
interacciones de la IVM con las células MDR, se midió la unión de
[^{3}H]-IVM a membranas de CEM o
CEM/VLB^{\text{1.0}} en ausencia y en presencia de fármacos y se
comparó con la de [^{3}H]-VLB. Las Figuras 4A y 4B
muestran que la [^{3}H]-IVM se une en mayor grado
a las membranas de CEM/VLB^{\text{1.0}} que a las membranas de las
células CEM. La presencia de un exceso de IVM y de ciclosporina A
inhibe completamente la unión de [^{3}H]-IVM a
las membranas de células CEM/VLB^{\text{1.0}}, pero no tiene
efecto sobre su unión a las membranas de CEM (Fig. 4A). De manera
similar, un exceso molar de vinblastina inhibe también la unión de
[^{3}H]-IVM a membranas de CEM/VLB^{\text{1.0}},
pero en menor grado que la IVM o la ciclosporina A no marcadas. Y lo
que es más interesante, el verapamilo o la colchicina no tienen
efecto sobre la unión de [^{3}H]-IVM. Los
resultados de la unión de [^{3}H]-VLB a membranas
de CEM y CEM/VLB^{\text{1.0}} en ausencia y en presencia de
fármacos, son similares a los obtenidos con
[^{3}H]-IVM pero con algunas diferencias. Por
ejemplo, aunque [^{3}H]-VLB se une más a las
membranas de CEM/VLB^{\text{1.0}} que a las membranas de CEM, se
observa mucha menos unión con membranas procedentes de células CEM
(Fig. 4B). Además, el verapamilo, pero no la colchicina, inhibe
también la unión de [^{3}H]-VLB a las membranas de
CEM/VLB^{\text{1.0}} (Fig. 4B). Tomados en conjunto, estos
resultados muestran niveles más elevados de unión de
[^{3}H]-IVM a las membranas de células resistentes
y que esta unión es inhibida por fármacos que interaccionan
directamente con la Pgp.
Se ha demostrado previamente que el ligando del
receptor \alpha_{1} -adrenérgico,
yodoaril-azidoprazosina (IAAP), fotomarca
específicamente Pgp (Greenberger y col., Photoaffinity probes for
the \alpha1-adrenergic receptor and the calcium
channel bind to a common domain in P-glycoprotein,
J. Biol. Chem. 265: 4394-4401, 1990).
Se ha sugerido también que es probable que los fármacos que inhiben
el marcaje por fotoafinidad de la Pgp con IAAP interaccionen
directamente con la Pgp y compitan por su(s) sitio(s)
de unión a los fármacos (Pearce y col., Essential features of the
P-glycoprotein pharmacophore as defined by a series
of reserpine analogs that modulate multidrug resistance, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86: 5128-5132,
1989). Por tanto, para determinar si la IVM interacciona
directamente con la Pgp, membranas de células CEM o
CEM/VLB^{\text{1.0}} son fotomarcadas con IAAP 20 nM en presencia
de un exceso molar de 1, 10 y 100 veces de IVM y otros fármacos
asociados a la Pgp (Figs. 5A y 5B). Los resultados de la Figura 5A
muestran una proteína fotomarcada de 170 kDa en las membranas de las
células resistentes pero no en las membranas de las células
sensibles a fármacos (Calles 2 y 1, respectivamente). La presencia
de un exceso molar de 100 veces de IVM y de SDZ-PSC
833 inhibe completamente el fotomarcaje de Pgp con IAAP (Calles 3 y
6). Un exceso molar similar de ciclosporina A o de verapamilo es
menos eficaz (Calles 9 y 12). Y lo que es más interesante, IVM en un
exceso molar de 10 veces es más eficaz que SDZ-PSC
833 para inhibir el fotomarcaje de Pgp con IAAP (Calles 4 y 7).
Dados los resultados anteriores y la baja
toxicidad para el huésped de la IVM, se determinó posteriormente si
la IVM potenciaba la toxicidad de la vinblastina o de la
doxorrubicina (DOXO) en células de linfoma humano muy resistentes a
fármacos. Por tanto, células CEM o CEM/VLB^{\text{0.1}} son
incubadas con concentraciones crecientes de vinblastina o de
doxorrubicina en ausencia o presencia de IVM,
SDZ-PSC 833, ciclosporina A o verapamilo (0, 0,1,
0,5 ó 2 \muM). La potenciación de la toxicidad de los fármacos por
IVM y por otros agentes que revierten la MDR es determinada mediante
el ensayo de citotoxicidad MTT (Figs. 6A y 6B). Los valores de la
CI_{50} de la vinblastina o de la doxorrubicina para CEM y
CEM/VLB^{\text{0.1}} son 3,5 ng/ml y 500 ng/ml o 25 ng/ml y 1100
ng/ml, respectivamente. La presencia de IVM, ciclosporina A y
verapamilo solos no tiene un efecto significativo sobre la
viabilidad de las células CEM o CEM/VLB^{\text{0.1}} (Figs. 6A y
6B). SDZ-PSC 833, un potente agente que revierte la
MDR (Watanabe y col., Comparative study on reversal efficacy of
SDZ-PSC 833, cyclosporin A and verapamil on
multidrug resistance in vitro and in vivo, Acta
Oncol. 34: 235-241, 1995), a 2 \muM es
tóxico para las células CEM y para las células
CEM/VLB^{\text{0.1}} (Figs. 6A y 6B). La Tabla 1 muestra la
CI_{50} de vinblastina o doxorrubicina para las células
CEM/VLB^{\text{0.1}} en presencia de concentraciones crecientes de
IVM, SDZ-PSC 833, ciclosporina A y verapamilo. Una
comparación entre la IVM y los demás agentes que revierten la MDR
(por ejemplo, verapamilo, ciclosporina A y SDZ-PSC
833) muestra que la IVM a 2 \muM es aproximadamente 9 veces mejor
y aproximadamente 4 veces mejor que el verapamilo y la ciclosporina
A para potenciar la toxicidad de la vinblastina o de la
doxorrubicina (Fig. 6A, Fig. 6B y Tabla 1). El
SDZ-PSC 833 es aproximadamente 1,2 veces mejor que
la IVM para potenciar la toxicidad de la vinblastina o de la
doxorrubicina. Sin embargo, el SDZ-PSC 833 solo es
mucho más tóxico para las células CEM y CEM/VLB^{\text{0.1}}
(Figs. 6A y 6B).
| Concentración | CI_{50}* | ||
| Agente de Reversión | (\muM) | (ng/ml) | Coeficiente de modulación\dagger |
| Vinblastina sola | 500,0 \pm 22,0 | ||
| Ivermectina | 0,1 | 310,0 \pm 17,0 | 1,6 \pm 0,09 |
| 0,5 | 16,0 \pm 1,1 | 31,2 \pm 2,15 | |
| 2,0 | 3,4 \pm 0,6 | 147,0 \pm 25,90 | |
| SDZ-PSC 833 | 0,1 | 165,0 \pm 12,0 | 3,0 \pm 0,22 |
| 0,5 | 9,0 \pm 0,7 | 55,0 \pm 4,28 | |
| 2,0 | 2,8 \pm 0,1 | 178,0 \pm 6,35 | |
| Ciclosporina A | 0,1 | 500,0 \pm 16,0 | N.A. |
| 0,5 | 300,0 \pm 14,0 | 1,7 \pm 0,08 | |
| 2,0 | 13,0 \pm 0,9 | 38,5 \pm 2,67 | |
| Verapamilo | 0,1 | 500,0 \pm 16,0 | N.A. |
| 0,5 | 350,0 \pm 16,0 | 1,4 \pm 0,06 | |
| 2,0 | 30,0 \pm 2,2 | 16,7 \pm 1,22 | |
| Doxorrubicina sola | 1100,0 \pm 43,0 | ||
| Ivermectina | 0,1 | 164,0 \pm 5,0 | 6,7 \pm 0,20 |
| 0,5 | 34,0 \pm 1,5 | 32,4 \pm 1,43 | |
| 2,0 | 24,0 \pm 2,0 | 45,8 \pm 3,84 | |
| SDZ-PSC 833 | 0,1 | 80,0 \pm 3,6 | 13,8 \pm 0,62 |
| 0,5 | 29,0 \pm 2,1 | 38,0 \pm 2,75 | |
| 2,0 | 18,0 \pm 1,2 | 61,1 \pm 4,07 | |
| Ciclosporina A | 0,1 | 930,0 \pm 41,0 | 1,2 \pm 0,05 |
| 0,5 | 410,0 \pm 19,0 | 2,7 \pm 0,12 | |
| 2,0 | 35,0 \pm 1,5 | 31,0 \pm 1,33 | |
| Verapamilo | 0,1 | 1100,0 \pm 58,0 | 1,1 \pm 0,06 |
| 0,5 | 664,0 \pm 43,0 | 1,7 \pm 0,11 | |
| 2,0 | 153,0 \pm 11,0 | 7,2 \pm 0,52 | |
| * \begin{minipage}[t]{150mm} Se obtiene una concentración de fármaco CI_{50} a partir de las Figuras 6A y 6B y representa el 50% de inhibición de la formación de colorante MTT. Cada valor es la media \pm DS (desviación estándar) de al menos tres determinaciones. \end{minipage} | |||
| \dagger \begin{minipage}[t]{150mm} El coeficiente de modulación se calcula a partir de la CI_{50} para el fármaco solo (vinblastina o doxorrubicina) frente a la CI_{50} en presencia del agente modulador. N.A. = no aplicable. \end{minipage} |
Con el fin de analizar adicionalmente el efecto
de la IVM como un agente que revierte la MDR, se evaluó la
hidrofobicidad de la IVM utilizando el coeficiente de
fraccionamiento en octanol/agua y comparándolo con el de otros
fármacos asociados a Pgp o con el de otros agentes que revierten la
MDR. Los resultados de la Tabla 2 muestran que los coeficientes de
fraccionamiento en octanol/agua para colchicina, vinblastina,
verapamilo, ciclosporina A e IVM, son 14, 30, 145, 518 y 1358,
respectivamente. Cuando estos últimos coeficientes son comparados
con respecto a la capacidad de los fármacos para inhibir la unión,
el transporte, o para revertir la MDR de células
CEM/VLB^{\text{1.0}} (Tabla 2), puede observarse una fuerte
correlación entre la hidrofobicidad y estos parámetros. Sin embargo,
se observan algunas excepciones. Por ejemplo, el verapamilo que es
más hidrofóbico que la vinblastina, es mejor inhibidor del
transporte de fármacos, aunque el fotomarcaje y la unión son
inhibidos preferencialmente por la vinblastina.
\newpage
Además del ejemplo anterior de ivermectina como
agente que revierte la resistencia a múltiples fármacos, otros
ejemplos de compuestos lactonas macrocíclicas, tales como
moxidectina y diferentes análogos de moxidectina, como agentes que
revierten la resistencia a múltiples fármacos son ilustrados en la
presente.
La interacción de la moxidectina con la
glicoproteína P es comparada con la de una variedad de otros
fármacos que se unen a la glicoproteína P y con la de un fármaco que
no se une a glicoproteína P (colchicina). Estos experimentos son
realizados utilizando marcaje por fotoafinidad con
[^{125}I]-aril-azidoprazosina
(IAAP). Aunque la moxidectina tiene la capacidad de desplazar el
marcaje por fotoafinidad de la glicoproteína P con IAAP en
comparación con el control, se ha encontrado que la ivermectina
desplaza más potentemente el marcaje por fotoafinidad de la
glicoproteína P con IAAP que la moxidectina (Fig. 7).
Se ha determinado también la capacidad de varios
derivados de moxidectina para desplazar el marcaje por fotoafinidad
con IAAP. La capacidad para bloquear la unión de la glicoproteína P
a azidoprazosina pone en evidencia su probable actividad como
agentes que revierten la resistencia a múltiples fármacos. Se
realizaron experimentos de fotomarcaje con 5 análogos diferentes de
moxidectina (Figs. 8A y 8B). Los análogos de moxidectina parecen
poseer una fuerte afinidad por la glicoproteína P y ser buenos
agentes que revierten la MDR. Todos los análogos de moxidectina
analizados son muy hidrofóbicos y se ha encontrado que interaccionan
con la glicoproteína P. Con la excepción de
23-(O-metiloxima)-5-(fenoxiacetoxi)-LL-F28249\alpha,
son todos más eficaces para desplazar la IAAP que la moxidectina.
Este compuesto,
23-(O-metiloxima)-5-(fenoxiacetoxi)-LL-F28249\alpha,
tiene un anillo de benceno que parece presentar una limitación por
tamaño a la unión con la glicoproteína P. Aunque una alta afinidad
por la glicoproteína P puede ser útil para revertir la resistencia a
múltiples fármacos en células cancerosas, puede ser deseable una
baja afinidad por la glicoproteína P en otras células si la
resistencia está asociada con la evacuación desde la célula dirigida
por la glicoproteína P.
Se ha encontrado que ambos análogos cargados
23-(tiosemicarbazona)-LL-F28249\alpha
y
23-(semicarbazona)-LL-F28249\alpha
son mejores inhibidores del fotomarcaje con IAAP que la
moxidectina, mostrando un desplazamiento de un 15 a un 20% mayor en
comparación con la moxidectina al nivel inhibidor de un exceso molar
de 1000 veces. Un excelente inhibidor del fotomarcaje es la mezcla
isomérica de (E) y
(Z)-26-formil-(O-metiloxima)-LL-F-28249\alpha,
que muestra de un 30% a un 40% de incremento del desplazamiento, en
comparación con la moxidectina, a una concentración del inhibidor
de un exceso molar de 1000 veces. Los resultados indican que esta
molécula posee potentes propiedades de reversión de la resistencia a
múltiples fármacos.
En lo precedente, se ha proporcionado una
descripción detallada de realizaciones particulares de la presente
invención.
Declaración Concerniente a Descripciones No
Perjudiciales: Una descripción de cierta materia objeto de esta
solicitud fue publicada en Biochemical Pharmacology, Vol. 53,
pp. 17-25, 1997.
Claims (7)
1. Utilización de un compuesto lactona
macrocíclica seleccionado del grupo que consta de
LL-F28249\alpha-\lambda, un
derivado 23-oxo de
LL-F28249\alpha-\lambda, un
derivado 23-imino de
LL-F28249\alpha-\lambda, una
avermectina y una milbemicina para la preparación de un medicamento
para ser administrado en conexión con la administración de un agente
quimioterapéutico hidrofóbico citostático, en una cantidad eficaz
para incrementar la toxicidad del agente quimioterapéutico contra
una célula tumoral resistente en un mamífero.
2. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada porque el agente
quimioterapéutico es seleccionado del grupo que consta de
vinblastina, vincristina, doxorrubicina, paclitaxel, colchicina,
actinomicina D y gramicidina D.
3. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizada porque la célula tumoral
resistente es seleccionada del grupo que consta de una célula de
linfoma humano, una célula de cáncer de mama humano, una célula de
cáncer de ovario humano y una célula de cáncer de pulmón humano.
4. La utilización de un compuesto lactona
macrocíclica para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de una célula tumoral resistente en un mamífero en
combinación con un agente quimioterapéutico hidrofóbico citostático,
caracterizada porque el compuesto lactona macrocíclica es
seleccionado del grupo que consta de
LL-F28249\alpha-\lambda, un
derivado 23-oxo de
LL-F28249\alpha-\lambda, un
derivado 23-imino de
LL-F28249\alpha-\lambda, una
avermectina y una milbemicina en una cantidad supresora del
tumor.
5. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizada porque el agente
quimioterapéutico es seleccionado del grupo que consta de
vinblastina, vincristina, doxorrubicina, paclitaxel, colchicina,
actinomicina D y gramicidina D.
6. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizada porque la célula tumoral
resistente es seleccionada del grupo que consta de una célula de
linfoma humano, una célula de cáncer de mama humano, una célula de
cáncer de ovario humano y una célula de cáncer de pulmón humano.
7. Una composición para tratar una célula tumoral
resistente en un mamífero, donde la mejora comprende una cantidad
supresora de un tumor de un compuesto lactona macrocíclica en
combinación con un agente quimioterapéutico hidrofóbico citostático
y un vehículo no tóxico farmacéuticamente aceptable, que se
caracteriza porque el compuesto lactona macrocíclica es
seleccionado del grupo que consta de
LL-F28249\alpha-\lambda, un
derivado 23-oxo de
LL-F28249\alpha-\lambda, un
derivado 23-imino de
LL-F28249\alpha-\lambda, una
avermectina y una milbemicina.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4516197P | 1997-04-30 | 1997-04-30 | |
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