ES2253371T3

ES2253371T3 - Procedimiento para la preparacion y la purificacion de maitansinoides que contienen tiol.

Info

Publication number: ES2253371T3
Application number: ES01926594T
Authority: ES
Inventors: Ravi Vankeepuram Jagannatha Chari; Wayne Charles Widdison
Original assignee: Immunogen Inc
Current assignee: Immunogen Inc
Priority date: 2000-08-18
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2021-04-26
Also published as: USRE39151E1; CA2373554A1; CA2678754C; DE60116113T2; JP2004506738A; US6333410B1; EP1313738B1; CA2373554C; CA2678754A1; HK1056357A1; DK1313738T3; DE60116113D1; JP4922535B2; AU763107B2; EP1313738A1; ATE313545T1; AU5311801A; EP1313738A4; WO2002016368A1

Abstract

Procedimiento para la preparación de un maitansinoide que contiene tiol que comprende las etapas siguientes: (1) llevar a cabo una hidrólisis reductora de un éster C-3 maitansinoide con un agente reductor seleccionado de entre el grupo constituido por hidruro de trimetoxialuminio litio (LiAl(OMe)3H), hidruro de trietoxialuminio litio (LiAl(OEt)3H) e hidruro de tripropoxialuminio litio (LiAl(OPr)3H), para proporcionar un maitansinol; (2) purificar el maitansinol para eliminar los productos secundarios cuando estén presentes; (3) esterificar el maitansinol purificado con un ácido carboxílico para proporcionar una mezcla de reacción de un éster L- y D-aminoacilo de maitansinol; (4) separar el éster L-aminoacilo de maitansinol de la mezcla de reacción en (3); (5) reducir el éster L-aminoacilo de maitansinol para proporcionar un maitansinoide que contiene un tiol; y (6) purificar el maitansinoide que contiene tiol.

Description

Procedimiento para la preparación y la purificación de maitansinoides que contienen tiol.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación y purificación de agentes citotóxicos. Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación y purificación de agentes citotóxicos que comprenden maitansinoides que contienen tiol. Estos agentes citotóxicos se pueden utilizar como agentes terapéuticos uniéndolos a un agente de unión celular, mediante el grupo tiol, y administrándolos a continuación a una población celular específica de una manera objetiva.

Antecedentes de la invención

En los últimos años, han aparecido una miríada de informes para tratar de responder al objetivo específico de células tumorales con conjugados fármaco-anticuerpo monoclonal (R.V.J. Chari., 31 Adv. Drug Deliv. Res., 89-104 (1998); G.A. Pietersz y K. Krauer, 2 J. Drug Targeting 183-215 (1994); Sela et al., en Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel, ed.1987); Ghose et al., en Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al., en Antibody mediated delivery systems 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al., en Antibody mediated delivery systems 25-53 (J. Rodwell, ed.1988); Bumol et al., en Antibody mediated delivery system 55-79 (J. Rodwell, ed.1988). Los fármacos citotóxicos tales como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalán, mitomicina C y clorambucilo se han conjugado con una diversidad de anticuerpos monoclonales de murino. En algunos casos, las moléculas de fármaco se unieron a moléculas de anticuerpos mediante una molécula vehículo intermediaria tal como la albúmina de suero (Garnett et al., 46 Cancer Res. 2407-2412 (1986); Ohkawa et al., 23 Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1986); Endo et al., 47 Cancer Res. 1076-1080 (1980)), dextrán (Hurwitz et al., 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980); Manabi et al., 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985); Dillman et al., 46 Cancer Res. 4886-4891 (1986); Shoval et al., 85 Proc. Natl.Acad . Sci. 8276-8280 (1988)), o ácido poliglutámico (Tsukada et al., 73 J. Natl. Canc. Inst. 721-729 (1984); Kato et al., 27 J. Med. Chem. 1602-1607 (1984); Tsukada et al., 52 Br. J. Cancer 111-116 (1985)).

Se ha utilizado un amplio conjunto de tecnologías de unión para la preparación de tales inmunoconjugados y se han investigado tanto ligantes escindibles como no escindibles. En la mayoría de los casos, el potencial citotóxico completo de los fármacos solo se pudo observar, sin embargo, si las moléculas de fármaco podían liberarse de los conjugados en forma no modificada en un sitio objetivo.

Uno de los ligantes escindibles que se ha utilizado para la preparación de conjugados fármaco-anticuerpo es un ligante lábil a los ácidos basado en ácido cis-aconítico que aprovecha el entorno ácido de diferentes compartimentos intracelulares tales como los endosomas que se encuentran durante la endocitosis mediada por receptor y los lisosomas. Shen y Riser introdujeron este procedimiento para la preparación de conjugados de daunorrubicina con vehículos macromoleculares (102 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1048-1054 (1981)). Yang y Reisfeld utilizaron la misma técnica para conjugar daunorrubicina con un anticuerpo de antimelanoma (80 J. Natl. Canc. Inst. 1154-1159 (1988)). Dillman et al., utilizaron asimismo un ligante lábil a los ácidos de manera similar para preparar conjugados de daunorrubicina con un anticuerpo celular anti-T (48 Cancer Res. 6097-6102 (1988)). Trail et al., unieron daunorrubicina a los anticuerpos vía un enlace de hidrazona lábil a los ácidos (52 Cancer Res. 5693-5700 (1992)).

Una aproximación alternativa, explorada por Trouet et al., involucraba la unión de daunorrubicina a un anticuerpo vía un brazo espaciador de péptido (79 Proc. Natl. Acad. Sci. 626-629 (1982)). Esto se llevó a cabo bajo la premisa de que el fármaco libre podía liberarse de tal conjugado mediante la acción de peptidasas lisosomiales.

En los ensayos de citotoxicidad in vitro, sin embargo, se ha revelado que los conjugados anticuerpo-fármaco consiguieron raramente la misma potencia de citotoxicidad que los fármacos libres no conjugados. Esto sugirió que los mecanismos por los cuales las moléculas de fármaco se liberan de los anticuerpos son muy ineficientes. En el área de las inmunotoxinas, se mostró que los conjugados formados vía puentes de disulfuro entre anticuerpos monoclonales y toxinas de proteína activas catalíticamente que eran más citotóxicos que los conjugados que contienen otros ligantes. Ver, Lambert et al., 260 J. Biol.Chem. 12035-12041 (1985); Lambert et al., en Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie et al., 48 Cancer Res. 2610-2617 (1988). Esto se atribuyó a una concentración intracelular elevada de glutatión que contribuye a la eficacia de escisión del enlace disulfuro entre una molécula de anticuerpo y una toxina. A pesar de esto, existen sólo pocos ejemplos publicados de la utilización de puentes de disulfuro para la preparación de conjugados entre fármacos y macromoléculas. Shen et al., describió la conversión de metotrexato en un derivado de mercaptoetilamida seguido de una conjugación con poli-D-lisina vía un enlace disulfuro (260 J. Biol. Chem. 10905-10908 (1985)). Un informe reciente describió la preparación de un conjugado del fármaco caliqueamicina tóxico que contenía trisulfuro con un anticuerpo (L. M. Hinman et al., 53 Cancer Res. 3336-3342 (1993); E. L. Sievers et al., 93 Blood 3678-3684 (1999).

Una razón para la falta de conjugados fármaco-anticuerpo unidos por disulfuro es la no disponibilidad de fármacos citotóxicos que posean una mitad que contenga un átomo de azufre que se pueda utilizar fácilmente para unir el fármaco a un anticuerpo vía un puente de disulfuro. Además, la modificación química de fármacos existentes es difícil sin la disminución de su potencial citotóxico.

Otra desventaja muy importante con los conjugados anticuerpo-fármaco existentes es su incapacidad para administrar una concentración suficiente de fármaco al sitio objetivo a causa de un número limitado de antígenos objetivo y de la citotoxicidad relativamente moderada de fármacos cancerostáticos como metotrexato, daunorrubicina y vincristina. Por ejemplo, se evaluó un conjugado de anticuerpo de doxorrubicina en pruebas clínicas humanas y se descubrió que era ineficaz (Tolcher et al., 17 J. Clinical Oncol. 478-484 (1999)). Para conseguir una citotoxicidad significativa, se hace necesaria la unión de un gran número de moléculas de fármaco bien directamente a un anticuerpo o bien mediante una molécula vehículo polimérica. Sin embargo, tales anticuerpos modificados profundamente muestran a menudo uniones con el antígeno objetivo dañadas y se depuran rápidamente de la corriente sanguínea in vivo.

Los maitansinoides son fármacos elevadamente citotóxicos. La maitansina se aisló por primera vez por Kupchan et al., del arbusto de África del este Maytenus serrata y demostró ser de 100 a 1000 veces más citotóxica que los agentes quimioterapéuticos de cáncer convencionales tales como metotrexato, daunorrubicina y vincristina (patente US nº 3.896.111). Posteriormente se descubrió que algunos microbios producen asimismo maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres C-3 de maitansinol (patente US nº 4.151.042). Se han publicado asimismo los ésteres C-3 sintéticos de maitansinol y los análogos de maitansinol (Kupchan et al., 21 J. Med. Chem. 31-37 (1978); Higashide et al., 270 Nature 721-722 (1977); Kawai et al., 32 Chem. Pharm. Bull. 3441-3451 (1984)). Ejemplos de análogos de maitansinol a partir de los cuales se han preparado los ésteres C-3 incluyen maitansinol con modificaciones del anillo aromático (p. ej. descloro) o en el C-9, C-14 (p. ej., grupo hidroximetilado), C-15, C-18, C-20 y C-4,5.

Los ésteres C-3 que aparecen en la naturaleza y los sintéticos se pueden clasificar en dos grupos:

(a): ésteres C-3 con ácidos carboxílicos simples (patentes US nº 4.248.870; nº 4.265.814; nº 4.308.268; nº 4.308.269; nº 4.309.428; nº 4.317.821; nº 4.322.348; nº 4.331.598), y

(b): ésteres C-3 con derivados de N-metil-L-alanina (patentes US nº 4.137.230; nº 4.260.608; nº 5.208.020; nº 5.416.064; y 12 Chem. Pharm. Bull. 3441 (1984)).

Se descubrió que los ésteres del grupo (b) eran más citotóxicos que los ésteres del grupo (a).

La maitansina es un inhibidor mitótico. Se ha publicado que el tratamiento de las células L1210 in vivo resulta en un 67% de las células acumuladas en la mitosis. Las células de control sin tratar se publicaron para demostrar un índice mitótico que está en un intervalo de entre 3,2 y 5,8% (Sieber et al., 43 Comparative Leukemia Research 1975, Bibl. Haemat. 495-500 (1976)). Los experimentos con huevos de erizo marino y huevos de almeja han sugerido que la maitansina inhibe la mitosis interfiriendo con la formación de microtúbulos mediante la inhibición de la polimerización de la proteína de microtúbulo, tubulina (Remillard et al., 189 Science 1002-1005 (1975)).

Se ha descubierto que las suspensiones de células leucémicas de murina P388, L1210 y LY5178 in vitro se inhiben mediante la maitansina a dosis de 10^{-3} a 10^{-1} microgramos/ml, siendo la línea P388 la más sensible. La maitansina ha demostrado asimismo ser una inhibidora activa del crecimiento in vitro de las células de carcinoma nasofaringeal humano. Se describió que la línea de leucemia linfoblástica aguda humana C.E.M. se inhibía con concentraciones tan bajas como 10^{-7} microgramos/ml (Wolpert-DeFillippes et al., 24 Biochem. Pharmacol. 1735-1738
(1975)).

La maitansina ha demostrado asimismo ser activa in vivo. El crecimiento tumoral en el sistema de leucemia linfocítico P388 demostró que se inhibía más de 50 a 100 veces el intervalo de dosificación lo que sugirió un índice terapéutico elevado; se pudo demostrar asimismo la actividad inhibidora significativa con el sistema de leucemia de ratón L1210, el sistema de carcinoma de pulmón Lewis humano y el sistema de melanocarcinoma B-16 humano. (Kupchan, 33 Ped. Proc. 2288-2295 (1974)).

Debido a que los maitansinoides son elevadamente citotóxicos, se esperaba que fuesen de utilidad en el tratamiento de muchas enfermedades como el cáncer. Esta expectativa todavía no se ha cumplido. Las pruebas clínicas con maitansina no fueron favorables debido a un número de efectos secundarios (Issel et al., 5 Can. Trtmnt. Rev. 199-207 (1978)). Los efectos adversos al sistema nervioso central y los síntomas gastrointestinales fueron responsables de que algunos pacientes rehusaran la terapia adicional (Issel en 204) y resultó que la maitansina se asoció con la neuropatía periférica que se podría acumular (Issel en 207).

Sin embargo, se han descrito las formas de maitansinoide que son elevadamente citotóxicas, pero que se pueden utilizar eficazmente en el tratamiento de muchas enfermedades (patentes US nº 5.208.020 y nº 5.416.064; Chari et al., 52 Cancer Res. 127-131 (1992); Liu et al., 93 Proc. Natl. Acad. Sci 8618-8623 (1996)).

Una desventaja adicional de la utilización terapéutica de los maitansinoides, de interés en la presente memoria, es que el procedimiento para la preparación y purificación de maitansinoides que contienen tiol implica diferentes etapas cromatográficas ineficientes que son engorrosas, no son escalables fácilmente y resultan sólo en rendimientos moderados.

Las patentes US nº 5.208.020 y nº 5.416.064 describen que un maitansinoide que contiene un tiol se puede producir en primer lugar la conversión de maitansinoide que contiene un grupo éster en el maitansinol, esterificando a continuación el maitansinoide que resulta con derivados de N-metil-L-alanina o N-metil-L-cisteína para proporcionar maitansinoides que contienen disulfuro, seguido de una escisión del grupo disulfuro con ditiotreitol a los maitansinoides que contienen tiol. Sin embargo, este procedimiento implica distintas etapas ineficaces que son engorrosas y resultan sólo en rendimientos moderados.

Más específicamente, en primer lugar se derivó el maitansinol de maitansina o de otros ésteres de maitansinol por reducción, tal como con hidruro de aluminio y litio. (Kupchan, S. M. et al., 21 J. Med. Chem. 31-37 (1978); patente US nº 4.360.462). Es posible asimismo aislar el maitansinol del microorganismo Nocardia (ver Higashide et al., patente US nº 4.151.042). En un ejemplo específico, se describió en la patente US nº 4.162.940 la conversión de ansamitocina P-3 en maitansinol mediante hidrólisis reductora con hidruro de aluminio y litio en tetrahidrofurano a
-5ºC. Sin embargo, la reacción con hidruro de aluminio y litio resulta en la formación de diversos productos secundarios que se pueden eliminar solo mediante una cuidadosa cromatografía de capa fina preparativa sobre gel de sílice. De este modo, este procedimiento no está disponible para su utilización a escala industrial.

La etapa siguiente en el procedimiento es la conversión de maitansinol a diferentes derivados de éster utilizando derivados de N-metil-L-alanina o N-metil-L-cisteína, y agentes adecuados tales como diciclohexilcarbodiimida (DCC) y cantidades catalíticas de cloruro de zinc (ver patente US nº 4.137.230; Kawai et al., 32 Chem. Pharm. Bull. 3441-3951 (1984); patente US nº 4.260.609). Los dos productos diastereoisoméricos contienen las cadenas laterales de D- y L-aminoacilo, como hace una porción pequeña de maitansinol sin reaccionar. Mientras el maitansinol sin reaccionar se separa fácilmente de sus ésteres mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice, los ésteres de maitansinoide diastereoisomérico son raramente separables. En el procedimiento descrito anteriormente (Kupchan, S. M. 21 J. Med. Chem. 31-37 (1978); patente US nº 4.360.462), se obtiene el éster L-aminoacilo deseado después de la purificación sobre dos columnas de gel de sílice seguida de una purificación adicional mediante purificación con cromatografía de capa fina preparativa sobre gel de sílice. De este modo, este procedimiento no está asimismo disponible para su utilización a escala industrial.

La última etapa en el procedimiento, la reducción de maitansinoides que contienen disulfuro al maitansinoide que contiene tiol correspondiente, se consigue mediante tratamiento con ditiotreitol (DTT), purificación mediante HPLC utilizando una columna C-18 y eluyendo con un gradiente lineal de 55% a 80% de acetonitrilo en H_{2}O. Sin embargo, esta etapa resulta en bajos rendimientos y no está asimismo disponible para su utilización a escala industrial. Los maitansinoides que contienen tiol no son muy solubles en la mezcla de disolventes etanol/agua utilizada en la reacción. Además, la purificación mediante HPLC en una columna C-18 de fase inversa utilizando acetonitrilo/agua como fase móvil resulta en una recuperación pobre y puede resultar en la dimerización de algún
producto.

En consecuencia, es enormemente necesario un procedimiento mejorado para la preparación y purificación de maitansinoides que contienen tiol, que reduzca la complejidad del procedimiento, permita el escalado e incremente el rendimiento.

Sumario de la invención

De este modo, el objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento mejorado para la preparación y purificación de maitansinoides que contienen tiol que reduce la complejidad del procedimiento, permite el escalado y mejora el rendimiento.

Se han conseguido este y otros objetivos proporcionando un procedimiento mejorado para la preparación y purificación de maitansinoides que contienen tiol.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de un maitansinoide que contiene tiol que comprende las etapas de:

(1): llevar a cabo una hidrólisis reductora de un éster C-3 de maitansinoide con un agente reductor seleccionado de entre el grupo constituido por hidruro de trimetoxialuminio litio (LiAl(OMe_{3})H), hidruro de trietoxialuminio litio (LiAl(OEt)_{3}H), hidruro de tripropoxialuminio litio (LiAl(OPr)_{3}H), hidruro de sodio y trimetoxialuminio (NaAl(OMe)_{3}H), hidruro de trietoxialuminio sodio (NaAl(OEt)_{3}H) e hidruro de tripropoxialuminio sodio (NaAl(OPr)_{3}H), para proporcionar un maitansinol;

(2): purificar el maitansinol para eliminar los productos secundarios cuando estén presentes;

(3): esterificar el maitansinol purificado con un ácido carboxílico para proporcionar una mezcla de reacción de un éster L- y D-aminoacilo de maitansinol;

(4): separar el éster L-aminoacilo de maitansinol de la mezcla de reacción en (3);

(5): reducir el éster L-aminoacilo de maitansinol para proporcionar un maitansinoide que contiene tiol; y

(6): purificar el maitansinoide que contiene tiol.

Preferentemente, el agente reductor en (1) es hidruro de trimetoxialuminio litio.

Preferentemente asimismo, el agente reductor en (1) se utiliza en una concentración de aproximadamente 5 a 100 equivalentes por mol del éster C-3 de maitansinoide. Más preferentemente, el agente reductor en (1) se utiliza en una concentración de aproximadamente 7,5 a 30 equivalentes por mol del éster C-3 del maitansinoide. Más preferentemente, el agente reductor en (1) se utiliza en una concentración de aproximadamente 10 a 20 equivalentes por mol del éster C-3 del maitansinoide.

Preferentemente, la hidrólisis reductora en (1) se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente -80ºC a 0ºC. Más preferentemente, la hidrólisis reductora en (1) se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente -45ºC a -27,5ºC. Más preferentemente, la hidrólisis reductora en (1) se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente -35ºC a -30ºC.

Preferentemente, el agente reductor en (1) se añade durante un periodo de aproximadamente 5 a 40 minutos. Más preferentemente, el agente reductor en (1) se añade durante un periodo de aproximadamente 7 a 20 minutos. Más preferentemente, el agente reductor en (1) se añade durante un periodo de aproximadamente 8 a 12 minutos.

Preferentemente, el maitansinol se purifica en (2) mediante cromatografía. Más preferentemente, el maitansinol se purifica en (2) mediante cromatografía en la que la cromatografía es cromatografía de columna de gel de sílice, cromatografía de capa fina preparativa sobre gel de sílice o cromatografía de columna de HPLC de sílice unida a ciano. Más preferentemente, el maitansinol se purifica en (2) mediante cromatografía en la que la cromatografía es cromatografía de columna de gel de sílice.

Preferentemente, la purificación en (2) se lleva a cabo a temperatura ambiente.

Preferentemente, el maitansinol en (2) se purifica hasta una pureza de aproximadamente 95%.

Preferentemente, el ácido carboxílico en (3) se selecciona de entre el grupo constituido por N-metil-N-metilditio-
acetil-L-alanina, N-metil-N-(3-metilditiopropanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(3-metilditiobutanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(4-metilditiobutanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(5-metilditiopentanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(3-fenilditiopropanoíl)-L-
alanina, N-metil-N-[3-(4-nitrofenilditio)-propanoíl]-L-alanina, N-acetil-N-metil-metil-ditiocisteína y N-acetil-N-metil-metilditiohomocisteína. Más preferentemente, el ácido carboxílico en (3) es N-metil-N-(3-metilditiopropanoíl)-L-alanina.

Preferentemente, la esterificación en (3) se lleva a cabo a temperatura ambiente.

Preferentemente, la esterificación en (3) comprende adicionalmente la utilización de diciclohexilcarbodiimida y cloruro de zinc.

Preferentemente, la separación en (4) se lleva a cabo pasando la mezcla de reacción a través de una columna de HPLC de sílice unida a ciano.

Preferentemente, la separación en (4) se lleva a cabo aproximadamente a 25ºC.

Preferentemente, la reducción en (5) utiliza ditiotreitol como agente reductor.

Preferentemente, la reducción en (5) se lleva a cabo en una mezcla de acetato de etilo-metanol-tampón acuoso que es capaz de mantener las sales de tampón, ditiotreitol, maitansinoides no reducidos y maitansinoides reducidos en solución. Más preferentemente, la mezcla de acetato de etilo-metanol-tampón acuoso es 1:1,5:1, v/v/v, acetato de etilo: metanol: tampón acuoso.

Preferentemente, la concentración de maitansinoide que contiene tiol es tal que el maitansinoide que contiene tiol permanece soluble en acetato de etilo-metanol-tampón acuoso. Preferentemente, la concentración del maitansinoide que contiene tiol es aproximadamente 4 g/l.

Preferentemente, la reducción en (5) se lleva a cabo en una atmósfera libre de oxígeno.

Preferentemente, la reducción en (5) se lleva a cabo a aproximadamente 25ºC.

Preferentemente, la purificación del maitansinoide que contiene tiol en (6) se lleva a cabo mediante cromatografía. Más preferentemente, la cromatografía se lleva a cabo mediante columna de HPLC de ciano. Más preferentemente, la cromatografía se lleva a cabo mediante columna de HPLC unida a ciano equilibrada y eluída con un disolvente orgánico. Preferentemente, el disolvente orgánico es una mezcla de hexano: 2-propanol:acetato de etilo, más preferentemente el disolvente es una mezcla de hexano:2-propanol:acetato de etilo 78,0:5,5:16,5, v/v/v.

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Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la reducción de ansamitocinas 1a-e para proporcionar maitansinol (2).

La Fig. 2a muestra la conversión de los ácidos \omega-mercaptocarboxílicos 3a-e a los respectivos derivados metilditio 4a-e.

La Fig. 2b muestra la conversión del ácido \omega-mercaptocarboxílico 3b a los respectivos derivados arilditio 5a-b.

La Fig. 2c muestra la conversión de los derivados metilditio 4a-e y de los derivados arilditio 5a-b a derivados de N-metil-L-alanina 6a-g que contienen un grupo disulfuro.

La Fig. 3a muestra la conversión de N-metilcisteína y N-metilhomocisteína (7a-b) a los derivados de disulfuro respectivos 8a-b.

La Fig. 3b muestra la acilación de los derivados de disulfuro 8a-b a los derivados de N-metil-L-cisteína 9a-b que contienen un grupo disulfuro.

La Fig. 4 muestra la esterificación de maitansinol (2) con los derivados de N-metil-L-alanina 6a-g que contienen un grupo disulfuro para proporcionar los esteroisómeros de maitansinoide que contienen disulfuro 10, a partir de los cuales se separan los isómeros L por medio de cromatografía para proporcionar los isómeros L de maitansinoide que contienen disulfuro 10a-g, los cuales a su vez se reducen para proporcionar los maitansinoides que contienen tiol 11a-g.

La Fig. 5 muestra la esterificación de maitansinol (2) con los derivados de N-metil-L-cisteína 9a-b que contienen un grupo disulfuro para proporcionar los esteroisómeros de maitansinoide que contienen disulfuro 12, a partir de los cuales se separan los isómeros L por medio de cromatografía para proporcionar los isómeros L de maitansinoide que contienen disulfuro 12a-b, los cuales a su vez se reducen para proporcionar los maitansinoides que contienen tiol 13a-b.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en la síntesis de derivados de maitansinoide que contienen tiol que retienen una citotoxicidad elevada y que se pueden unir eficazmente a los agentes de unión celulares. Esta técnica revela que los procedimientos existentes para producir los maitansinoides que contienen tiol son complejos, no escalables y producen un rendimiento de producto bajo. La presente invención supera estos problemas describiendo un procedimiento nuevo para producir maitansinoides que contienen tiol que reduce la complejidad del procedimiento, permite el escalado y mejora el rendimiento de producto.

De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento nuevo para la producción de maitansinoides que contienen tiol, agentes útiles para la eliminación de células enfermas o anormales que se van a destruir o lisar, tales como células tumorales (particularmente células de tumores sólidas), células infectadas de virus, células infectadas de microorganismos, células infectadas de parásitos, células autoinmunes (células que producen autoanticuerpos), células activadas (las implicadas en el rechazo de transplante o transplante versus enfermedades del huésped), o cualquier otro tipo de células enfermas o anormales, mientras muestran un mínimo de efectos secundarios.

Estos maitansinoides que contienen tiol se pueden unir químicamente a un agente de unión celular mientras se mantiene una citotoxicidad elevada en la forma unida o en la forma liberada o en ambos casos. La citotoxicidad elevada se define como que muestra una toxicidad que posee un IC_{50} -la concentración inhibidora de una sustancia tóxica que deja una fracción superviviente de 0,5- de aproximadamente 10^{-8} M o menos cuando se mide in vitro con células KB tras 24 h del tiempo de exposición al fármaco.

La eficacia de los compuestos de la presente invención como agentes terapéuticos depende de la selección cuidadosa de un agente de unión celular apropiado. Los agentes de unión celular pueden ser de cualquier clase conocida actualmente, o que lleguen a conocerse e incluyen péptidos y no péptidos. Por lo general, estos pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales), linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina), o cualquier otra molécula de unión celular o sustancia.

Maitansinoides adecuados

Existen un número de descripciones que muestran la producción de maitansinoides y derivados de maitansinoides que se pueden utilizar como un agente citotóxico. Ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maitansinol y análogos de maitansinol. Ejemplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen los que poseen un anillo aromático modificado y los que poseen modificaciones en otras posiciones.

Ejemplos específicos de análogos adecuados de maitansinol que poseen un anillo aromático modificado, y el procedimiento para su producción, incluyen:

(1): C-19-descloro (patente US nº 4.256.746) (preparado mediante reducción con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P-2);

(2): C-20-hidroxi (o C-20-desmetil +/-C-19-descloro (patentes US nº 4.361.650 y nº 4.307.016) (preparado mediante desmetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces o descloración utilizando LAH); y

(3): C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-descloro (patente US nº 4.294.757) (preparado mediante acilación utilizando cloruros de acilo).

Ejemplos específicos de análogos de maitansinol adecuados que poseen modificaciones de otras posiciones incluyen:

(1): C-9-SH (patente US nº 4.424.219) (preparado mediante la reacción de maitansinol con H_{2}S o P_{2}S_{5});

(2): C-14-alcoximetil (desmetoxi/CH_{2}OR) (patente US nº 4.331.598);

(3): C-14-hidroximetil o aciloximetil (CH_{2}OH o CH_{2}OAc) (patente US nº 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia);

(4): C-15-hidroxi/aciloxi (patente US nº 4.364.866) (preparado mediante la conversión de maitansinol mediante Streptomyces);

(5): C-15-metoxi (patente US nº 4.313.946 y nº 4.315.929) (aislado a partir de Trewia nudiflora);

(6): C-18-N-desmetil (patente US nº 4.362.663 y nº 4.322.348) (preparado a partir de la desmetilación de maitansinol mediante Streptomyces); y

(7): 4,5-deoxi (patente US nº 4.371.533) (preparado mediante reducción de maitansinol con tricloruro de titanio/LAH).

Para unir el maitansinoide al agente de unión celular, se utiliza un grupo ligante.

Los grupos ligantes adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos hábiles a los ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a la peptidasa y grupos lábiles a la estearasa. Los grupos disulfuro y los grupos tioéter son los preferidos.

Según la presente invención el grupo ligante, es parte de una mitad química que se une covalentemente al maitansinoide mediante los procedimientos descritos. En una forma de realización preferida, la mitad química se une covalentemente al maitansinoide vía una unión éster.

Se espera que sean útiles muchas posiciones de maitansinoides como la posición ligante, dependiendo del tipo de unión. Por ejemplo, para formar una unión éster, se espera que sean útiles la posición C-3 que posee un grupo hidroxilo, la posición C-14 que está modificada con hidroximetilo, la posición C-15 que está modificada con hidroxi y la posición C-20 que posee un grupo hidroxilo. Sin embargo, se prefiere la posición C-3 y se prefiere especialmente la posición C-3 de maitansinol.

Asimismo preferidos son el éster C-3 de maitansinol que contiene N-metil-L-alanina y un éster C-3 de maitansinol que contiene N-metil-L-cisteína o sus análogos.

La presente invención describe un procedimiento para la preparación y purificación de un maitansinoide que contiene tiol que coloca el grupo ligante en el C-3 de maitansinol.

Etapa 1

Síntesis de maitansinol (2) a partir de un maitansinoide que contiene un éster

La primera etapa en la preparación y purificación de maitansinoides que contienen tiol implica la hidrólisis reductora de un éster C-3 de maitansinoide a maitansinol (2).

A): Se disuelve un éster C-3 de maitansinoide en un disolvente anhidro, a continuación se coloca bajo una atmósfera de gas inerte y se enfría.

Preferentemente, el éster C-3 de maitansinoide es maitansina o ansamitocina P-3 (1c). Se puede asimismo utilizar cualquier ansamitocina (1a-e), tal como las ansamitocinas P-4, P-3, P-2 y P-1 (descritas en Asai et al., Tetrahedron 1079-1085 (1979): patente US nº 4.450.234; Hatano et al., 48 Agric. Biol. Chem. 1721-1729 (1984)), más preferentemente la ansamitocina P-3 (1c). La maitansina se puede obtener según se describe en Kupchan et al., 42 J. Org. Chem. 2349-2357 (1977). La preparación microbiológica de ansamitocina P-3 (1c) se describe en la patente US nº 4.450.234 y en Hatano et al., 48 Agric. Biol. Chem. 1721-1729 (1984).

Preferentemente, el disolvente anhidro es tetrahidrofurano (THF), éter de 2-metoxietilo, dioxano o éter de dietilo, aunque se pueden utilizar otros disolventes. Más preferentemente, el disolvente anhidro es tetrahidrofurano. Preferentemente, se utilizan de 20 a 30 ml de disolvente anhidro por gramo de éster, más preferentemente 25 ml/g. Preferentemente, el gas inerte es argón, nitrógeno o helio, aunque se pueden utilizar otros gases. Más preferentemente, el gas inerte es argón. Preferentemente, la solución se mantiene entre aproximadamente 0 y -80ºC, más preferentemente entre aproximadamente -30 y -50ºC, más preferentemente entre aproximadamente -35 y -45ºC, en un baño seco de hielo y acetona.

B): se enfría asimismo un agente reductor, y a continuación se transfiere a una solución enfriada del éster C-3 del maitansinoide. La reacción se mantiene bajo una atmósfera de gas inerte, a una temperatura baja, agitándose.

Preferentemente, el agente reductor es hidruro de trimetoxialuminio litio (LiAl(OMe)_{3}H), hidruro de trietoxialuminio litio (LiAl(OEt)_{3}H), hidruro de tripropoxialuminio litio (LiAl(OPr)_{3}H), hidruro de sodio y trimetoxialuminio (NaAl(OMe)_{3}H), hidruro de trietoxialuminio sodio (NaAl(OEt)_{3}H) o hidruro de tripropoxialuminio sodio (NaAl
(OPr)_{3}H). Más preferentemente, el agente reductor es hidruro de trimetoxialuminio litio (LiAl(OMe)_{3}H). Preferentemente, el agente reductor se enfría de aproximadamente -30 a -40ºC en un baño seco de hielo y acetona. Preferentemente, el agente reductor enfriado se transfiere a una solución enfriada del éster C-3 del maitansinoide vía una cánula. Preferentemente, el gas inerte es argón, nitrógeno o helio, aunque se pueden utilizar otros gases. Más preferentemente, el gas inerte es argón.

Preferentemente, el agente reductor se utiliza en una concentración de aproximadamente 5 a 100 equivalentes por mol del éster C-3 del maitansinoide, más preferentemente de aproximadamente 7,5 a 30 equivalentes por mol, más preferentemente de aproximadamente 10 a 20 equivalentes por mol. Un experto ordinario en la materia entenderá que la utilización de agente reductor en cantidades mayores de aproximadamente 100 equivalentes por mol del éster C-3 de maitansinoide puede resultar en productos secundarios no deseados. Preferentemente, el agente reductor se añade a la solución enfriada del éster C-3 de maitansinoide durante un periodo de tiempo que está en el intervalo de aproximadamente 5 a 40 minutos, más preferentemente de aproximadamente 7 a 20 minutos, más preferentemente de aproximadamente 8 a 12 minutos. Preferentemente, la reacción se mantiene bajo una atmósfera de gas inerte en un intervalo de temperatura de aproximadamente -25ºC a -80ºC, más preferentemente de aproximadamente -27ºC a -45ºC, más preferentemente de aproximadamente -30ºC a -35ºC. Preferentemente, la reacción se agita entre aproximadamente 30 min y tres horas, más preferentemente durante aproximadamente tres horas.

Un experto en la materia entenderá que la cantidad de agente reductor utilizado, la temperatura mantenida durante la reacción, la duración del periodo de tiempo durante el cual se añade el agente reductor y el tiempo de reacción son cada uno dependientes del otro. Por ejemplo, cuanto más baja sea la cantidad de agente reductor, más largo será el tiempo de reacción. Similarmente, cuanto más baja sea la temperatura, más grande será el exceso de agente reductor requerido y más largo será el tiempo requerido para acabar la reacción. Además, cuanto más lenta sea la velocidad a la que se añade el agente reductor, más largo será el tiempo de reacción requerido para acabar la reacción.

C): La reacción se enfría, se extrae, se seca y se filtra. El disolvente se evapora bajo presión reducida para proporcionar maitansinol crudo.

Preferentemente, la reacción se enfría mediante la adición de solución saturada de cloruro de sodio, agua o solución de cloruro de amonio, más preferentemente mediante la adición de solución saturada de cloruro de sodio. Preferentemente, la reacción se enfría utilizando entre aproximadamente 20 y 40 ml de la solución por gramo de éster de maitansinoide utilizado. Preferentemente, la reacción se extrae con acetato de etilo, diclorometano, tolueno, cloroformo o éter, más preferentemente con acetato de etilo. Preferentemente, la reacción se extrae a una velocidad de entre aproximadamente 4 x 80 y 4 x 200 ml/g del éster de maitansinoide utilizado. Preferentemente, los extractos de acetato de etilo combinados se secan sobre sulfato de sodio o sulfato de magnesio, más preferentemente sulfato de sodio y se filtran.

D): El maitansinol crudo (2) se puede purificar, si se requiere, mediante cromatografía.

En una forma de realización preferida, el maitansinol crudo (2) se puede purificar disolviéndolo en un volumen mínimo de acetato de etilo, diclorometano, éter, cloroformo o tolueno, más preferentemente acetato de etilo, y purificarlo vía cromatografía de columna de gel de sílice utilizando diclorometano, cloroformo, acetato de etilo o tolueno, más preferentemente diclorometano. Preferentemente, el maitansinol (2) se eluye con una etapa de gradiente que se inicia con diclorometano o acetato de etilo, o una mezcla de diclorometano:acetato de etilo:alcohol, cloroformo:acetato de etilo o tolueno:acetato de etilo, preferentemente 77:23:0, v/v/v, diclorometano:acetato de etilo:alcohol. La concentración de alcohol se incrementa lentamente desde 0 a aproximadamente 20%, preferentemente de 0 a aproximadamente 10%. Las fracciones que contienen el producto deseado se agrupan y se evaporan bajo presión reducida para proporcionar maitansinol puro (2) como un sólido blanco. La purificación se puede llevar a cabo a temperatura ambiente, Preferentemente, la purificación se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 20ºC a 25ºC. Preferentemente, el alcohol es metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-, iso-, sec- o terc-butanol, más preferentemente metanol.

En otra forma de realización preferida, el maitansinol crudo (2) se puede purificar utilizando una columna de HPLC de sílice unida a ciano que eluye en fase normal, utilizando disolventes orgánicos en la fase móvil. El maitansinol crudo (2) se disuelve en acetato de etilo, acetato de etilo:isopropanol:hexano (fase móvil) o en acetato de etilo-isopropanol, preferentemente acetato de etilo, inyectado en la columna, y se recoge el pico apropiado. Preferentemente la columna de HPLC de ciano que se utiliza para la separación es una que posee grupos cianopropilo y cianodiisopropilo unidos de forma estable al esqueleto de sílice. Tales columnas están disponibles bajo las denominaciones comerciales Diazem™, Zorbax™, Monochrom™, y Kromasil™, por nombrar unas pocas. Preferentemente, el disolvente orgánico utilizado en la fase móvil es hexano:2-propanol:diclorometano:acetato de etilo. Preferentemente, la concentración de cada constituyente del disolvente orgánico está en el intervalo de 65-75:2-4:15-20:5-10, v/v/v, respectivamente. Más preferentemente, la concentración de cada elemento del disolvente orgánico es 72:3:18:7, v/v/v/v.

Preferentemente, el maitansinol (2) purificado mediante este procedimiento es por lo menos 90% puro, más preferentemente por lo menos 95% puro. Un experto ordinario en la materia entenderá que si el maitansinol (2) de menos del 90% de pureza se utiliza en las etapas siguientes, se pueden requerir etapas de purificación adicional.

Un experto en la materia entenderá que la reacción de reducción puede proporcionar pequeñas cantidades de productos secundarios no deseados, además del maitansinol (2). De este modo, se puede requerir la purificación para eliminar los contaminantes. Sin embargo, si no se generan los productos secundarios, tales como los que establecen los tiempos, temperaturas, y cantidades exactos, no se requiere a continuación la etapa de purificación.

Etapa 2

Síntesis de ésteres de maitansinol (2) que poseen un grupo ligante

El maitansinol (2) de la Etapa 1 se esterifica a continuación con derivados de N-metil-L-alanina que contienen disulfuros 6a-g o derivados de N-metil-L-cisteína 9a-b, en presencia de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y cloruro de zinc, para proporcionar ésteres L- y D-aminoacilo de maitansinol 10a-g y 12a-b, que contienen un grupo ligante disulfuro. A continuación se separan los estereoisómeros y se recoge el éster L-aminoacilo. Ya que la reacción de esterificación resulta en alguna epimerización en el centro quiral de los derivados de aminoácidos 6a-g y 9a-b, un experto en la materia entenderá que las versiones racémicas de 6a-g y 9a-b (es decir, una mezcla D y L) se pueden utilizar en la Etapa 2, en lugar de los estereoisómeros.

A): En una forma de realización, los derivados de N-metil-L-alanina 6a-g que contienen un grupo disulfuro se producen mediante la conversión de ácidos \omega-mercaptocarboxílicos 3a-e de longitudes de cadena diferentes en su respectivo metilditio, p. ej., 4a-e (en el que n = 1 a 4, incluyendo alifáticos ramificados y cíclicos), o arilditio, p. ej., 5a-b, derivados mediante la reacción con metanotiosulfonato de metilo o disulfuros de arilo, tales como disulfuro de difenilo y disulfuros de difenilo sustituidos en el anillo y disulfuros heterocíclicos, tales como 2,2'-ditiopiridina. Estos ácidos carboxílicos se hacen reaccionar a continuación con N-metil-L-alanina para formar los derivados de N-metil-L-alanina deseados que contienen un grupo disulfuro 6a-g que se condensarán con maitansinol (2) para formar maitansinoides que contienen grupos ligantes de disulfuro 10a-g.

Se puede preparar N-metil-L-alanina según se describe en la literatura (ver, Fu, S. J. & Birnbaum, S. M., 75 J. Amer. Chem. Soc. 918 (1953)), o se puede obtener comercialmente (Sigma Chemical Company).

Preferentemente, los derivados de N-metil-L-alanina que contienen un grupo disulfuro son N-metil-N-metilditio-
acetil-L-alanina, N-metil-N-(3-metilditiopropanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(4-metilditiobutanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(3-metilditiobutanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(5-metilditiopentanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(3-fenilditiopropanoíl)-L-
alanina y N-metil-N-[3-(4-nitrofenilditio)-propanoíl]-L-alanina.

B): En otra forma de realización, la N-metil-L-cisteína (7a) o N-metil-L-homocisteína (7b) se puede convertir a los derivados de disulfuro respectivos 8a-b (n = 1 y 2, respectivamente), que a continuación se acilan para proporcionar los derivados de N-metil-L-cisteína o N-metil-L-homocisteína deseados que contienen un grupo disulfuro 9a-b (n = 1 y 2 respectivamente). Estos derivados que contienen sulfuro 9a-b condensarán con maitansinol (2) para formar maitansinoides que contienen grupos ligantes disulfuro 12a-b.

La N-metil-L-cisteína se puede preparar según se describe en Undheim y Eidem, 23 Acta Chem. Scand. 3129-3133 (1970).

Preferentemente, los derivados de N-metil-L-cisteína que contienen un grupo disulfuro son N-acetil-N-metil-metilditiocisteína (9a) y N-acetil-N-metil-metilditiohomocisteína (9b).

C): Se esterifica el maitansinol (2) con un derivado de N-metil-L-alanina o de N-metil-L-cisteína que contiene un grupo disulfuro (6a-g y 9a-b) preparando en primer lugar una solución de derivado que contiene disulfuro. Esta solución se agita bajo una atmósfera de gas inerte, y se trata secuencialmente con soluciones de (a) DCC o EDC (hidrocloruro de [3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida), preferentemente DCC, (b) ZnCl_{2} y (c) maitansinol. La mezcla se agita hasta que se acaba la reacción. Después de que la reacción se acabe, se filtra y se evapora el filtrado bajo presión reducida proporcionando una mezcla de los ésteres L- y D-aminoacilo 10 y 12 de maitansinol.

Como se ha indicado anteriormente, ya que la reacción de esterificación resulta en alguna epimerización en el centro quiral de los derivados de aminoácido 6a-g y 9a-b, un experto en la materia entenderá que las versiones racémicas de 6a-g y 9a-b (es decir, una mezcla D y L) se pueden utilizar en lugar de los estereoisómeros.

Preferentemente, el derivado de N-metil-L-alanina o el derivado de N-metil-L-cisteína que contiene un grupo disulfuro es N-metil-N-(metilditiopropanoíl)-L-alanina (6b) y N-acetil-N-metil-metilditiocisteína (9a), respectivamente. Preferentemente, la solución del derivado que contiene disulfuro comprende el cloruro de metileno seco, tetrahidrofurano, o éter, preferentemente cloruro de metileno seco, utilizando entre aproximadamente 10 y 50 ml/gramo de maitansinol, preferentemente 20 ml/gramo. Preferentemente, el gas inerte es argón, nitrógeno o helio, aunque se pueden utilizar otros gases. Más preferentemente, el gas inerte es argón.

Preferentemente, el DCC o EDC está en cloruro de metileno, tetrahidrofurano o éter, preferentemente cloruro de metileno, utilizando aproximadamente de 10 a 15 ml por gramo de DCC o de EDC, preferentemente 12 ml/g. Preferentemente, la solución de DCC o de EDC se añade a una velocidad de aproximadamente 5 a 7 moles/mol de maitansinol. Preferentemente, ZnCl_{2} es aproximadamente 1 M, y se utiliza entre aproximadamente 1,2 a 1,5 moles/mol de maitansinol, preferentemente 1,25 moles, en éter o cloruro de metileno, preferentemente éter. Preferentemente, el maitansinol está en cloruro de metileno, tetrahidrofurano o éter, más preferentemente cloruro de metileno, utilizando aproximadamente de 10 a 120 ml de disolvente por gramo de maitansinol, preferentemente 100 ml/g. La mezcla de reacción se agita entre 4 y 30ºC, preferentemente a temperatura ambiente, durante 1 a 24 horas, preferentemente tres horas. Un experto ordinario en la materia entenderá que la duración del tiempo en el que la reacción requiere agitación depende de la temperatura, resultando un tiempo de reacción más largo con temperaturas inferiores.

D): La separación de los ésteres L- y D-aminoacilo de maitansinol 10a-g y 12a-b se lleva a cabo vía una columna de HPLC de sílice unida a ciano que eluye en fase normal, utilizando disolventes orgánicos en la fase móvil. Se inyecta en la columna una solución de la mezcla de ésteres L- y D-aminoacilo de maitansinol, disuelta en acetato de etilo o en hexano:2-propanol:acetato de etilo. La fase móvil se puede ajustar para obtener una separación en los tiempos de retención de los dos isómeros que exceda los 10 minutos.

Alternativamente, la separación se puede llevar a cabo utilizando cromatografía de gel de sílice, pero el procedimiento no se convierte a escala industrial de forma fácil. La separación se puede llevar a cabo a través de otros, menos deseables, medios tales como HPLC que utiliza columnas quirales o columnas de sílice.

Preferentemente, las columnas de HPLC de ciano que se utilizan para la separación son las que poseen grupos cianopropilo y cianodiisopropilo unidos de forma estable al esqueleto de sílice. Tales columnas están disponibles bajo las denominaciones comerciales de Diazem™, Zorbax™, Monochrom™ y Kromasil™, entre otras. Preferentemente, el disolvente orgánico utilizado en la fase móvil es hexano:2-propanol:acetato de etilo. Preferentemente, el rendimiento de la separación es superior a aproximadamente 90% y el producto es por lo menos aproximadamente 95% puro, más preferentemente, ópticamente puro. Bajo las condiciones mencionadas anteriormente, el isómero L deseado posee un tiempo de retención de aproximadamente 36 a 46 min, preferentemente 42 min, mientras el isómero D eluye de aproximadamente 50 a 60 minutos, preferentemente 56 min. Preferentemente, la esterificación se lleva a cabo a aproximadamente 25ºC.

Etapa 3

Síntesis de maitansinoide que contiene tiol 11a-g y 13a-b

Para obtener los maitansinoides que contienen tiol 11a-g y 13a-b, los ésteres L-aminoacilo de maitansinol obtenidos a partir de la Etapa 2 se disuelven en una solución que comprende un disolvente y un alcohol. Esta mezcla se agita bajo una atmósfera de gas inerte y se trata con una solución de ditiotreitol o ditioeritritol, en un tampón, y que contiene ácido etilendiamintetraacético (EDTA). El progreso de la reacción se puede monitorizar mediante HPLC y se completa generalmente en 3 h, aunque se pueda variar entre 1 y 24 h. La reacción acabada se trata con una solución tampón que contiene EDTA y se extrae a continuación. Las fases orgánicas se combinan, se lavan y se secan. La evaporación del disolvente deja un residuo de maitansinoide que contiene tiol crudo 11a-g y 13a-b, que se puede purificar utilizando una columna de HPLC de sílice unida a ciano. Las fracciones que contienen el producto se pueden evaporar para proporcionar maitansinoide puro que contiene tiol como un sólido blanco.

Preferentemente, el disolvente en el que se disuelven los ésteres L-aminoacilo de maitansinol obtenidos en la Etapa 2 es acetato de etilo, diclorometano o éter, más preferentemente acetato de etilo, utilizando aproximadamente de 60 a 80 ml de disolvente por gramo de maitansinoide, preferentemente 72 ml/g. Preferentemente, el alcohol en que se disuelven los ésteres L-aminoacilo de maitansinol obtenidos en la Etapa 2 es metanol o etanol, más preferentemente metanol, utilizando aproximadamente de 90 a 120 ml de alcohol por gramo de maitansinoide, preferentemente 108 ml/g. Preferentemente, la reacción entre ésteres L-aminoacilo de maitansinol y ditiotreitol está en una mezcla de acetato de etilo:metanol:tampón acuoso que es capaz de mantener las sales tampón, ditiotreitol y maitansinoides (formas reducidas y no reducidas) en solución. Más preferentemente, la reacción entre ésteres L-aminoacilo de maitansinol y ditiotreitol está en una mezcla de 1:5:1 de acetato de etilo:metanol:tampón acuoso.

Preferentemente, la concentración de ésteres L-aminoacilo de maitansinol utilizados en la Etapa 3 es menor de aproximadamente 4 g/l de forma que los ésteres L-aminoacilo de maitansinol permanecen solubilizados.

Preferentemente, la reacción de reducción se lleva a cabo en una atmósfera libre de oxígeno. Preferentemente, el gas inerte es argón, nitrógeno o helio, aunque se puedan utilizar otros gases. Más preferentemente, el gas inerte es argón.

Preferentemente, la reacción de reducción se lleva a cabo entre 4 y 30ºC, más preferentemente a temperatura ambiente. Un experto en la materia entenderá que la reacción se puede llevar a cabo a temperaturas inferiores, sin embargo, el tiempo requerido para acabar la reacción aumenta.

Preferentemente, la solución que contiene los ésteres L-aminoacilo de maitansinol se trata con ditiotreitol, ditioeritritol o un reactivo de fosfina tal como tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), más preferentemente ditiotreitol, utilizando aproximadamente de 2 a 3 moles de agente reductor por mol de maitansinoide, preferentemente 2,5 moles/mol, en tampón de fosfato de potasio, tampón de fosfato de sodio o tampón de trietanolamina, preferentemente tampón de fosfato de potasio, el tampón a una concentración de entre aproximadamente 20 y 100 mM, preferentemente 50 mM, utilizando de 60 a 80 ml del tampón DTT por gramo de maitansinoide, preferentemente 72 ml/g, y que contiene aproximadamente 1 a 10 mM, preferentemente 2 mM de ácido etilendiamintetraacético (EDTA).

Preferentemente, la reacción acabada se trata con una solución de tampón de fosfato de potasio 0,2 M, tampón de fosfato de sodio o tampón de trietanolamina, más preferentemente tampón de fosfato de potasio, utilizando aproximadamente de 120 a 160 ml de tampón por gramo de maitansinoide, preferentemente 144 ml/g y que contiene aproximadamente 1 a 10 mM, preferentemente 2 mM de EDTA. Preferentemente, la extracción se lleva a cabo con acetato de etilo, diclorometano, o éter, más preferentemente acetato de etilo, utilizando de 200 a 500 ml por gramo de maitansinoide, preferentemente 300 ml/g, repetida tres veces. Preferentemente, las fases orgánicas combinadas se lavan con una solución saturada de cloruro de sodio, agua o una solución saturada de cloruro de amonio, más preferentemente una solución saturada de cloruro de sodio, utilizando de 40 a 100 ml por gramo de maitansinoide, preferentemente 50 ml/g y a continuación se seca sobre sulfato de sodio o sulfato de magnesio, preferentemente sulfato de sodio.

Preferentemente, las columnas de HPLC de ciano que se utilizan para la separación son las que poseen grupos cianopropilo y grupos cianodiisopropilo unidos de forma estable al esqueleto de sílice. Tales columnas están disponibles bajo las denominaciones comerciales de Diazem™, Zorbax™, Monochrom™ y Kromasil™, por nombrar unas pocas. Más preferentemente, se utiliza una columna CN preparativa Diazem (250 mm x 50 mm, tamaño de partícula de 10 micrones). Preferentemente, el disolvente orgánico utilizado en la fase móvil es hexano:2-propanol:acetato de etilo. Más preferentemente, el disolvente orgánico utilizado en la fase móvil es una mezcla de hexano:2-propanol:acetato de etilo 70,0:5,5:16,5 (v/v/v). Preferentemente, la velocidad de flujo es 150 ml/min. Preferentemente, el rendimiento de la separación es superior al 75%, y el producto es por lo menos aproximadamente 90% puro, más preferentemente, por lo menos aproximadamente 95% puro. Preferentemente, los maitansinoides que contienen tiol deseados 11a-d y 13a-b poseen un tiempo de retención de 16 min, dentro de un intervalo de aproximadamente 14 a 18
min.

Los ejemplos específicos de N-metil-L-alanina que contienen derivados de maitansinoide descritos en la presente invención se representan por las fórmulas (I)-(IV):

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

en la que: Z representa H o SR, en la que R representa un grupo metilo, alquilo lineal, alquilo ramificado, alquilo cíclico, arilo simple o sustituido o heterociclo; / representa un entero de 1 a 10; y may representa un maitansinoide.

2

en la que: R_{1} y R_{2}, que puede ser la misma o diferente, representa H, CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; Z representa H o SR, en la que R representa un grupo metilo, alquilo lineal, alquilo ramificado, alquilo cíclico, arilo simple o sustituido o heterociclo; m representa 0, 1, 2 ó 3; y may representa un maitansinoide.

3

en la que: Z representa H o SR, en la que R representa un grupo metilo, alquilo lineal, alquilo ramificado, alquilo cíclico, arilo simple o sustituido o heterociclo; p representa un entero de 3 a 8; y may representa un maitansinoide.

4

en la que: Z representa H o SR, en la que R representa un grupo metilo, alquilo lineal, alquilo ramificado, alquilo cíclico, arilo simple o sustituido o heterociclo; q representa un entero de 1 a 10; Y representa Cl o H; y X representa H o CH_{3}.

Ejemplos específicos de derivados de maitansinoide que contienen N-metil-L-cisteína útiles en la presente invención se representan por las fórmulas (V) y (VI):

5

en la que: Z representa H o SR, en la que R representa un grupo metilo, alquilo lineal, alquilo ramificado, alquilo cíclico, arilo simple o sustituido o heterociclo; o representa 1 ó 2; q representa 0 o un entero de 1 a 10; y may representa un maitansinoide.

6

en la que: Z representa H o SR, en la que R representa un grupo metilo, alquilo lineal, alquilo ramificado, alquilo cíclico, arilo simple o sustituido o heterociclo; o representa 1 ó 2; q representa 0 o un entero de 1 a 10; Y representa Cl o H; y X representa H o CH_{3}.

Ejemplos de alquilos lineales incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo.

Ejemplos de alquilos ramificados incluyen isopropilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, isopentilo y 1-etilpropilo.

Ejemplos de alquilos cíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.

Ejemplos de arilos simples incluyen fenilo y naftilo.

Ejemplos de arilos sustituidos incluyen arilos tales como los descritos anteriormente sustituidos con grupos alquilos, con halógenos, tales como Cl, Br, F, grupos nitro, grupos amino, grupos ácido sulfónico, grupos ácido carboxílico, grupos hidroxi y grupos alcoxi.

Ejemplos de heterociclos son compuestos en los que los heteroátomos se seleccionan de entre el grupo que comprende O, N y S, e incluyen pirrolilo, piridilo, furilo y tiofeno.

Definiciones

Según se ha utilizado en la presente memoria, los términos "temperatura de habitación" y "temperatura ambiente" significan temperatura ambiental o temperatura no controlada. El término "pureza óptica" significa que la pureza excede un 98%. Cuando se especifican los intervalos en la presente memoria, p. ej., temperatura, tiempo, concentración, etc. el intervalo incluye todos los valores específicos dentro del intervalo, además de subintervalos que están dentro del intervalo general. Cuando los valores se señalan que son "aproximadamente" un valor específico, o un intervalo de valores, se entiende que se incluyen en estos valores además las variaciones estadísticamente insignificantes.

Ejemplos

La presente invención se ilustrará ahora haciendo referencia a los ejemplos no limitativos. A menos que se especifique lo contrario, todos los porcentajes, proporciones, partes, etc., están expresados en peso.

Ejemplo 1 Síntesis de derivados de maitansinoide que contienen tiol

Los puntos de fusión se determinaron en un aparato de punto de fusión electrotérmico. Los espectros de la resonancia magnética de protón (^{1}H RMN) se obtuvieron en un espectrómetro de Varian™ EM360 a 60 MHz o en un aparato Brucker™ AM300 a 300 MHz. Los cambios químicos se describen en valores \delta relativos a un estándar de tetrametilsilano interno (TMS). Los espectros UV se grabaron en un espectrofotómetro Perkin Elmer™ \lambda4A. Las rotaciones ópticas se determinaron utilizando un polarímetro de Perkin Elmer™ modelo 241. Se utilizó para un análisis de HPLC y purificación un instrumento equipado con longitud de onda o detector UV de ordenación de diodos Rainin™ HP, Hewlett Packard™ o Hitachi™ y una columna C-18 Radialpack Waters™ o una columna ciano Diazem™ o una columna ciano Kromasil™. Los análisis elementales se llevaron a cabo en Atlantic Microlabs, Atlanta, Ga.

El ácido 2-mercaptoacético (3a), el ácido mercaptopropanoico (3b) y el ácido 4-mercaptobutanoico (3c) están disponibles comercialmente.

Ácido 5-mercaptopentanoico (3d). El ácido 5-mercaptopentanoico (3d) se preparó mediante una modificación de un procedimiento de la literatura (Khim et al., 37 J. Org . Chem. 2714-2720 (1972)). Se añadió tiourea (0,761 g, 0,01 mol) a una solución agitada de ácido 5-bromopentanoico (1,80 g, 0,01 mol) en etanol absoluto (25 ml) y se hizo reflujo a la mezcla de reacción durante 6 horas. A continuación se añadió una solución de NaOH acuoso al 50% (20 ml) y se hizo el reflujo de la mezcla durante dos horas adicionales. A continuación la mezcla se diluyó con agua (100 ml), se acidificó (HCl acuoso) y se extrajo con acetato de etilo (4 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron a presión reducida. El residuo se cromatografió sobre gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno/acetato de etilo para dar 0,885 g (66%) de un líquido incoloro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,3 (1H, t), 1,6 (4H, m), 2,4 (4H, m), 11,5 (1H, s).

Ácido 3-mercaptobutanoico (3e). Se añadió una solución de \beta-butirolactona disponible comercialmente (3,0 g, 35,0 mmol) en tetrahidrofurano (20 ml) a diisopropiletilamina (10,0 g, 77,5 mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo una atmósfera de argón y se trató con ácido tioacético (3,0 g, 39,0 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El disolvente se evaporó a continuación y el producto se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice, eluyendo con etilo:hexano (3:1, v/v) que contenía 3% de ácido acético. El derivado de tioacetato de 3e se obtuvo como un aceite incoloro (2,0 g, 35% rendimiento). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,5 (3H, d), 2,3 (3H, s), 2,8 (2H, d), 4,0 (1H, m) y 11,3 (1H, s). El tioacetato se convirtió en el tiol 3e por hidrólisis básica. Una solución de tioacetato (1,5 g, 9,3 mmol) en metanol (6 ml) se trató con una solución de hidróxido de sodio en agua 3,3 M (10 ml). La reacción se agitó bajo una atmósfera de argón. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y se juzgó completo en 3 h. La mezcla de reacción se acidificó mediante la adición de ácido clorhídrico 1 M (40 ml) y se extrajo con acetato de etilo (70 ml). El extracto orgánico se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó bajo presión reducida para dar ácido 3-mercaptobutanoico (3e), que se utilizó para la síntesis de 4e sin purificación adicional.

Ácido metilditioacético (4a). Se añadió metanotiosulfonato de metilo (4,52 g, 0,036 mol) en etanol absoluto (40 ml) a una solución agitada de ácido mercaptoacético (3a) (3,0 g, 0,0326 mmol) en agua (100 ml), enfriada en un baño con hielo. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó toda la noche. La mezcla de reacción se diluyó a continuación con NaCl acuoso, saturado (300 ml) y se extrajo con éter de dietilo (3 x 100 ml). La fase orgánica combinada se lavó con cloruro de sodio saturado (100 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se filtró. El filtrado se evaporó bajo presión reducida y el residuo se destiló al vacío para proporcionar 4a como un aceite incoloro (2,90 g, 64% de rendimiento) p.eb._{1 mm} = 100ºC. ^{1}H RMN: \delta 2,4 (3H, s), 3,5 (3H, s), 10,2 (1H, s).

Ácido 3-metilditiopropanoico (4b). Se añadió metanotiosulfonato de metilo (6,54 g, 0,052 mol) en etanol absoluto (75 ml) a una solución agitada de ácido 3-mercaptopropanoico (3b) (5,00 g, 0,047 mol) en agua (150 ml), enfriada en un baño con hielo. La mezcla de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó a continuación con NaCl acuoso, saturado (400 ml) y se extrajo con éter (3 x 150 ml). Los extractos de éter combinados se lavaron con NaCl saturado, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron. El residuo se destiló para proporcionar un líquido incoloro (6,47 g, 90% de rendimiento) p.eb._{1,0} = 105ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,3 (3H, s), 2,8 (4H, m), 11,2 (1H, s).

Ácido 4-metilditiobutanoico (4c). Se añadió una solución de ditiotreitol (0,647 g, 4,20 mmol) en H_{2}O (20 ml) a una solución agitada de bis-(3-carboxipropil)-disulfuro (1,00 g, 4,20 mmol) en metanol (20 ml). A continuación se añadió una solución de NaOH 10 M (0,842 ml, 8,42 mmol) y se dejó la mezcla agitando a temperatura ambiente durante toda la noche para efectuar la reducción completa. Se añadió el metanotiosulfonato de metilo (1,17 g, 9,24 mmol) y se dejó agitando la mezcla de reacción durante otras tres horas. La mezcla se diluyó a continuación con NaCl acuoso, saturado (150 ml), se acidificó (HCl acuoso) y se extrajo con éter de etilo (3 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaCl saturado, se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se concentraron y el concentrado se cromatografió sobre gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno/acetato de etilo para dar 0,867 g (56%) de un líquido claro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,1 (2H, m), 2,4 (3H, s), 2,4 (2H, m), 2,7 (2H, m), 11,1 (1H, s).

Ácido 5-metilditiopentanoico (4d). Se añadió una solución de metanotiosulfonato de metilo (0,517 g, 4,10 mmol) en etanol absoluto (5 ml) a una solución agitada de ácido 5-mercaptopentanoico (3d) (0,500 g, 3,73 mmol) en agua (20 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla se diluyó a continuación con NaCl saturado, acuoso (100 ml) y se extrajo con éter de etilo (3 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaCl saturado, se secaron (Na_{2}SO_{4}), se evaporaron bajo presión educida y el concentrado se cromatografió sobre sílice eluyendo con cloruro de metileno/acetato de etilo para dar 0,602 g (90%) de cristales blancos: p.f. 42-44ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,7(4H, m), 2,4 (3H, s), 2,4 (2H, m), 2,7 (2H, m), 11,1 (1H, s).

Ácido 3-metilditiobutanoico (4e). Una solución de 3e (1,1 g, 9,3 mmol) en acetato de etilo (10 ml) se trató secuencialmente con diisopropiletilamina (3,4 g, 27 mmol) y con una solución de metanotiosulfonato de metilo (1,5 g, 12,0 mmol) en etanol absoluto (8 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo argón durante 3 h. A continuación el disolvente se evaporó y el residuo se trató con ácido clorhídrico 3 M (15 ml) y se extrajo con acetato de etilo (40 ml). La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo:hexano (3:1, v/v) que contenía 3% de ácido acético. El producto 4e se obtuvo como un aceite incoloro (0,61 g, 40% de rendimiento). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,4 (3H, d), 2,3 (3H, s), 2,8 (2H, d), 3,9 (1H, m) y 11,5 (1H, s).

Ácido 3-fenilditiopropanoico (5a). Se añadió una solución de ácido 3-mercaptopropanoico (3b) (0,49 g, 4,6 mmol) en éter (5 ml) a una solución agitada de disulfuro de difenilo (3,0 g, 13,8 mmol) en una mezcla de éter (10 ml) y metanol (20 ml) bajo una atmósfera de nitrógeno, a temperatura ambiente, seguida de una solución de NaOH 10 M (0,46 ml, 4,6 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas, a continuación se destilaron los disolventes bajo presión reducida. El producto se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice eluyendo con acetato de etilo/hexano. El producto se obtuvo como un sólido blanco (0,56 g, 56,6%), p.f. 57-59ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}, TMS): \delta 2,6-3,0 (4H, m), 7,1-7,6 (5H, m), 10,6 (1H, s).

Ácido 3-(4-nitrofenilditio)-propanoico (5b). Se añadió ácido 3-mercaptopropanoico (3b) (0,688 g, 6,49 mmol) a una solución agitada de bis-(4-nitrofenil)-disulfuro (3,00 g, 9,73 mmol) disuelto en una mezcla de THF (200 ml) y metanol (50 ml). A continuación se añadió una gota de una solución de NaOH 10 M a la mezcla y la reacción se agitó durante una hora. La mezcla de reacción se diluyó a continuación con NaCl saturado (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 75 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se evaporaron a presión reducida y el producto se cromatografió sobre gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno/acetato de etilo para proporcionar 0,885 g (53%) de un sólido amarillo claro; p.f. 98-100ºC. 1H RMN (CDCOCD_{3}): \delta 2,8 (2H, m), 3,1 (2H, m), 7,8 (2H, d), 8,2 (2H, d).

N-metil-N-metilditioacetoíl-L-alanina (6a). Se añadió una solución de ácido metilditioacético (Singh et al., 104 Anal. Biochem. 51-58 (1980) (4a) (1,66 g, 12,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (20 ml) a 0ºC a una solución agitada de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (2,99 g, 15,6 mmol) y trietilamina (1,58 g, 15,6 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (40 ml). Se añadió una solución de 4-dimetilaminopiridina (0,073 g, 0,60 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (2 ml) y la mezcla se agitó durante 45 min. a 0ºC. A continuación se añadió una mezcla de N-metil-L-alanina (0,619 g, 6,00 mmol) y trietilamina (0,607 g, 6,00 mmol) en DMF seca (30 ml) y la mezcla se agitó a 0ºC durante dos horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml), se agitó durante otros treinta minutos, se acidificó a continuación (HCl acuoso) y se extrajo con acetato de etilo (4 x 75 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron diversas veces con agua, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporaron bajo presión reducida. El residuo se cromatografió sobre gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno:acetato de etilo para proporcionar 0,25 g (19%) de un aceite amarillo pálido. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,4 (3H, d), 2,4 (3H, s), 2,9, 3,0 (total 3H, 2s), 3,6 (2H, s), 4,7, 5,2 (total 1H, 2q), 9,8 (1H, s).

N-metil-N-(3-metilditiopropanoíl)-L-alanina (6b). Se añadió cloroformiato de isobutilo (0,897 g, 6,57 mmol) y trietilamina (0,665 g, 6,57 mmol) a una solución agitada de ácido 3-metilditiopropanoico (4b) (1,00 g, 6,57 mmol) en THF seco (20 ml) a -10ºC bajo argón y la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos. Se añadió una mezcla de N-metil-L-alanina (0,677 g, 6,57 mmol) y trietilamina (1,33 g, 13,14 mmol) en agua (10 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. A continuación la mezcla se diluyó con agua (50 ml), se acidificó (HCl acuoso) y se extrajo con acetato de etilo (4 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se evaporó el disolvente bajo presión reducida y se cromatografió el residuo sobre gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno/acetato de etilo para proporcionar 0,556 g (34%) de cristales blancos: p.f. 98-100ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,3 (3H, d), 2,2 (3H, s), 2,7 (4H, m), 4,5 (1H, q), 10,7 (1H, s). Anál. calculado para C_{8} H_{15} NO_{3}S_{2}: C, 40,49; H, 6,37; N, 5,90; peso mol. 237,33. Encontrado C, 40,42; H, 6,41; N, 5,93.

N-metil-N-(4-metilditiobutanoíl)-L-alanina (6c). Se añadió cloroformiato de isobutilo (0,164 g, 1,20 mmol) y trietilamina (0,121 g, 1,20 mmol) a una solución agitada de ácido 4-metilditiobutanoico (4c) (0,200 g, 1,20 mmol) en THF seco (10 ml) a -20ºC bajo argón y la mezcla se agitó durante veinte minutos. A continuación se añadió una mezcla de N-metil-L-alanina (0,124 g, 1,20 mmol) y trietilamina (0,243 g, 2,40 mmol) en agua (5 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante cinco horas. La mezcla de reacción se trató a continuación según se ha descrito anteriormente para 6b proporcionando el compuesto del título como cristales blancos (0,135 g, 44%): p.f. 92-93ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,4 (3H, d), 2,0 (2H, m), 2,3 (3H, s), 2,7 (4H, m), 2,9 (3H, s), 5,1 (1H, q), 10,5 (1H, s).

N-metil-N-(5-metilditiopentanoíl)-L-alanina (6d). Se añadió cloroformiato de isobutilo (0,153 g, 1,12 mmol) y trietilamina (0,113 g, 1,12 mmol) a una solución agitada de ácido 5-metilditiopentanoico (4d) (0,202 g, 1,12 mmol) en THF seco (15 ml) a -40ºC bajo argón y la mezcla de reacción se agitó durante 20 minutos a -10ºC. A continuación se añadió una solución de N-metil-L-alanina (0,116 g, 1,12 mmol) y trietilamina (0,227 g, 2,24 mmol) en agua (5 ml) y la mezcla se agitó a 0ºC durante cinco horas. La mezcla de reacción se trató a continuación según se ha descrito anteriormente para 6b proporcionando el compuesto del título como cristales blancos (0,196 g, 66%): p.f. 84ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,4 (3H, d), 1,8 (4H, m), 2,4 (3H, s), 2,7 (4H, m), 3,0 (3H, s), 5,2 (1H, q), 10,7 (1H,
s).

N-metil-N-(3-fenilditiopropanoíl)-L-alanina (6e). Se agitó vigorosamente bajo una atmósfera de nitrógeno una solución de ácido 3-fenilditiopropanoico (5a) (1,8 g, 8,4 mmol) en THF seco y se enfrió a -15ºC. Se añadieron cloroformiato de isobutilo (1,2 ml, 9,25 mmol) y trietilamina (1,29 ml, 9,25 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a esta temperatura durante diez minutos. A continuación se añadió una solución de N-metil-L-alanina (0,87 g, 8,4 mmol) y trietilamina (1,29 ml, 9,25 mmol) en agua (10 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante quince minutos a -15ºC y a continuación se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante un periodo adicional de 2,5 horas. Se añadió HCl 1 M (10 ml) y se extrajo la mezcla de reacción con acetato de etilo (4 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se evaporaron bajo presión reducida. La mezcla cruda se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice eluyendo con acetato de etilo/hexano que contenía 2% de ácido acético para proporcionar un sólido blanco 6e (1,5 g, 60%); p.f. 96-97ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): \delta 1,4 (2H, d), 2,7-3,0 (7H, m), 5,2 (1H, q), 7,2-7,6 (5H, m).

N-metil-N-[3-(4-nitrofenilditio)-propanoíl]-L-alanina (6f). Se añadieron cloroformiato de isobutilo (0,053 g, 0,386 mmol) y trietilamina (0,039 g, 0,38 mmol) a una solución agitada de ácido 3-(4-nitrofenilditio)-propanoico (5b) (0,100 g, 0,386 mmol) en THF seco (10 ml) a -40ºC bajo argón y la reacción se agitó a 0ºC durante una hora. A continuación se añadió una solución acuosa de N-metil-L-alanina (5 ml) (0,040 g, 0,386 mmol) y trietilamina (0,039 g, 0,386 mmol) y la mezcla se agitó a 0ºC durante cinco horas. La mezcla se diluyó con agua (50 ml), se acidificó (HCl acuoso) y se extrajo con éter de etilo (3 x 25 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó el disolvente bajo presión reducida. El residuo se cromatografió sobre gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno/acetato de etilo para proporcionar 0,048 g (36%) de cristales amarillos: p.f. 74-77ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,4 (3H, d), 2,6-3,4 (4H, m), 2,9 (3H, s), 5,1 (1H, q), 7,6-8,3 (4H, 2d).

N-metil-N-(3-metilditiobutanoíl)-L-alanina (6g). Se enfrió a -20ºC una solución de 4e (3,52 g, 21,2 mmol) en tetrahidrofurano (20 ml) y se agitó bajo un atmósfera de argón. A continuación se añadieron cloroformiato de isobutilo (3,48 ml, 21,2 mmol) y trietilamina (3,7 ml, 25,4 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -20ºC durante 15 min. Se añadió una solución de N-metil-L-alanina (2,74 g, 26,6 mmol) en agua (5 ml) y trietilamina (7,4 ml, 50,8 mmol) y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml) y se acidificó hasta pH de 2 mediante la adición de HCl 1 M. El producto se extrajo con acetato de etilo (5 x 50 ml). La fase orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice eluyendo con acetato de etilo:hexano (1:1, v/v) para proporcionar 6g puro como un sólido blanco (0,69 g, 12% de rendimiento). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,3 (3H, d), 1,5 (3H, d), 2,41 (3H, s), 2,8 (2H, m), 3,0 (3H, s), 3,5 (1H, m) y 5,3 (1H, m).

Metilditio-N-metilcisteína (8a). Se agitó a temperatura ambiente, bajo una atmósfera de argón, una solución de N-metilcisteína (7a) (Undhein, K.,& Eidem, A., 23 Acta Chem. Scandinavica 3129-3133 (1970)) (1,5 g, 11,1 mmol) en H_{2}O (20 ml) y se trató con una solución de metanotiosulfonato de metilo (3,0 ml, 29,2 mmol) en etanol (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a esta temperatura durante dos horas y se diluyó a continuación con H_{2}O (100 ml) y se lavó con éter (4 x 40 ml). La fase acuosa se acidificó hasta pH 2 y se pasó a través de una columna Amberlita IRA-93 (forma –OH). La columna se lavó con agua y el eluyente se recogió y se evaporó a sequedad bajo presión reducida para proporcionar un sólido blanco (1,2 g, 60%), p.f. 194-195ºC. 1H RMN (D_{2}O, estándar ext. TMS): \delta 2,2 (3H, s), 2,5 (3H, s), 3,2 (2H, d), 3,71 (1H, q).

Metilditio-N-metilhomocisteína (8b). Un experto ordinario en la materia entendería como preparar metilditio-N-metilhomocisteína (8b) basándose en el procedimiento para preparar metilditio-N-metilcisteína (8a).

N-metilhomocisteína (7b) se puede preparar mediante el procedimento descrito anteriormente para N-metilcisteína (Undhein, K.,& Eidem, A., 23 Acta Chem. Scandinavica 3129-3133 (1970)).

N-acetil-N-metil-metilditiocisteína (9a). Se añadieron con agitación, bajo una atmósfera de N_{2}, cloroformiato de isobutilo (0,57 ml, 4,4 mmol) y trietilamina (0,61 ml, 4,4 mmol) a una solución de ácido acético glacial (0,25 ml, 4,4 mmol) en THF (4 ml), a -20ºC. La mezcla de reacción se agitó a esta temperatura durante 20 minutos y a continuación se trató con una solución de metilditio-N-metilcisteína (8a) (0,4 g, 2,2 mmol) y trietilamina (0,45 ml, 3,3 mmol) en H_{2}O y se dejó agitando durante toda la noche. A continuación la mezcla se diluyó con agua (25 ml) y se acidificó hasta pH 2 con HCl y se extrajo con acetato de etilo (4 x 50 ml). La fase orgánica combinada se secó con sulfato de sodio y se evaporó el disolvente bajo presión reducida para proporcionar el producto como un sólido amarillo pálido (0,2 g, 55%), p.f.137-138ºC. 1H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,1 (3H, s), 2,3 (3H, s), 3,0 (3H, s), 3,2 (2H, d) y 4,8 (1H, q).

N-acetil-N-metil-metilditiohomocisteína (9b). Un experto ordinario en la materia entenderá como preparar N-acetil-N-metil-metilditiohomocisteína (8b) basándose en el procedimiento para la preparación de N-acetil-N-metil-metilditiocisteína (9a).

Etapa 1

Reducción de ansamitocina P-3 (1c) a maitansinol

Se convirtió ansamitocina P-3 (1c) a maitansinol (2) mediante hidrólisis reductora. Se disolvió ansamitocina P-3 (1c) (3,2 g, 5,0 mmol) en THF anhidro (80 ml) y se colocó la solución bajo una atmósfera de argón y se enfrió en un baño de hielo seco y acetona a -40ºC.

Se añadió una solución de hidruro de litio y aluminio (75 mmol, 75 ml de una solución 1,0 M en THF) en un matraz separado. Se colocó la solución bajo una atmósfera de argón y se enfrió a -40ºC. Se añadió gota a gota utilizando un embudo de adición una solución de metanol anhidro (9,1 ml, 225 mmol) en THF (40 ml). La temperatura se mantuvo entre -30 y -40ºC, y, después de que se acabase la adición, la mezcla de reacción se agitó durante un periodo adicional de 10 min. La solución que resultó de hidruro de trimetoxialuminio litio (LiAlH(OMe)_{3}H) se transfirió vía cánula durante 10 min. a la solución enfriada de ansamitocina P-3 (1c). La temperatura de reacción se mantuvo entre -30 y -35ºC bajo argón y se agitó durante 1 h. La reacción se enfrió mediante la adición de una solución saturada de cloruro de sodio (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (4 x 400 ml). Los extractos combinados de acetato de etilo se secaron sobre sulfato de sodio y se filtraron. El disolvente se evaporó bajo presión reducida para proporcionar maitansinol crudo (2).

El producto crudo se disolvió en acetato de etilo y se cargó en una columna de gel de sílice empaquetada en diclorometano. La columna se eluyó con un gradiente de etapas empezando por una mezcla de diclorometano:acetato de etilo:metanol (77:23:0), v/v/v) e incrementando lentamente la concentración de metanol de 0% a 10%. Las fracciones que contienen el producto deseado se agruparon y se evaporaron a presión reducida para proporcionar maitansinol puro (71% de rendimiento) como sólido blanco.

El maitansinol se purificó adicionalmente mediante HPLC como sigue. Se equilibró una columna de HPLC preparativa de ciano Kromasil™ (250 mm x 50 mm, tamaño de partícula 10 micras) en una mezcla de hexano:2-propanol:diclorometano:acetato de etilo (72:3:18:7, v/v/v) con una velocidad de flujo de 150 ml/min. Se inyectó en la columna una solución de maitansinol. Bajo estas condiciones, el maitansinol posee un tiempo de retención de 22 min y una pureza de >98%.

Etapa 2

Esterificación de maitansinol (2) con N-metil-N-metilditioacetoíl-L-alanina (6a)

Se agitó bajo una atmósfera de argón una solución de N-metil-N-metilditioacetoíl-L-alanina (6a) (4,2 mg, 0,017 mmol) en diclorometano (0,1 ml) y se trató secuencialmente con una solución de maitansinol (2 mg, 0,0035 mmol) en diclorometano (0,2 ml), DCC (4,4 mg) en diclorometano (0,2 ml) y cloruro de zinc 1 M (0,0035 mmol) en éter. La reacción se agitó durante 75 min. A continuación la mezcla de reacción se filtró y se evaporó el disolvente. El residuo se purificó mediante TLC preparativa sobre gel de sílice, utilizando 6% de metanol en cloroformo para proporcionar el éster de L-maitansinoide 10a deseado.

El compuesto del título 10a se puede purificar más eficazmente utilizando una columna de HPLC de ciano Diazem™ (250 mm x 10 mm, tamaño de partícula 10 micras) equilibrada con una mezcla de hexano:2-propanol:acetato de etilo (17:2:6, v/v/v) a una velocidad de flujo de 4,7 ml/min. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) isómero L-aminoacilo (10a): \delta 80,90 (3H, s), 1,3 (6H, d,d), 1,46-1,52 (1H, m), 1,60 (3H, s), 2,30 (1H, d), 2,50 (3H, s), 2,7 (1H, dd), 2,90 (1H, m), 3,15 (3H, s), 3,28 (3H, s), 3,3 (1H, d), 3,35 (3H, s), 3,50 (1H, m), 3,65 (2H, d), 3,77 (1H, d), 4,02 (3H, s), 4,30 (1H, t), 4,82 (1H, dd), 5,15 (1H, q, J = 7 Hz), 5,90 (1H, dd), 6,25 (1H, s), 6,47 (1H, dd), 6,60 (1H, d), 6,75 (1H, d), 6,85 (1H, d).

Esterificación de maitansinol (2) con N-metil-N-(3-metilditiopropanoíl)-L-alanina (6b)

Se agitó bajo una atmósfera de argón una solución de N-metil-N-(3-metilditio-propanoíl)-L-alanina (6b) (5,0 g, 21,5 mmol) en cloruro de metileno seco (80 ml) y se trató secuencialmente con soluciones de DCC (4,58 g, 22,2 mmol) en cloruro de metileno (54 ml), ZnCl_{2} 1 M en éter (4,4 mmol) y maitansinol (2) (2,0 g, 3,5 mmol) en cloruro de metileno (80 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante cuatro

\hbox{horas y a continuación se filtró.}

Se equilibró una columna de HPLC preparativa de ciano Diazem™ (250 mm x 50 mm, tamaño de partícula 10 micras) en una mezcla de hexano:2-propanol:acetato de etilo (17:2:6, v/v/v) a una velocidad de flujo de 150 ml/min. Se inyectó en la columna una solución de la mezcla de éster L- y D-aminoacilo 10 de maitansinol (1 g en 25 ml de acetato de etilo). Bajo estas condiciones, el isómero L deseado (10b) posee un tiempo de retención de 42 min, mientras el isómero D eluye a 56 min. El producto puro ópticamente se obtiene por este procedimiento y la recuperación es > 90%.

^{1}H RMN (CDCl_{3}) isómero L-aminoacilo (10b): \delta 0,84 (3H, s), 1,11-1,23 (1H, m), 1,31 (3H, d, J = 6 Hz), 1,35 (3H, d, J = 7 Hz), 1,46-1,52 (1H, m), 1,68 (3H, s), 1,97 (1H, d, J = 9 Hz), 2,24 (1H, dd, J = 12 Hz y 15 Hz), 2,30 (3H, s), 2,65 (1H, dd, J = 12 Hz y 15 Hz), 2,73-2,86 (2H, m), 2,90 (3H, s), 2,92-3,03 (2H, m), 3,08 (1H, d, J = 9 Hz), 3,14 (1H, d, J = 12 Hz), 3,28 (3H, s), 3,39 (3H, s), 3,54 (1H, d, J = 9 Hz), 3,72 (1H, d, J = 13 Hz), 4,02 (3H, s), 4,31 (1H, t, J = 11 Hz), 4,82 (1H, dd, J = 3 Hz y 12 Hz), 5,45 (1H, q, J = 7 Hz), 5,69 (1H, dd, J = 9 Hz y 15 Hz), 6,25 (1H, s), 6,47 (1H, dd, J = 11 Hz y 15 Hz), 6,67 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,77 (1H, d, J = 11 Hz), 6,85 (1H, d, J = 1,5 Hz),

Esterificación de maitansinol (2) con N-metil-N-(metilditiobutanoíl)-L-alanina (6c)

Se agitó bajo una atmósfera de argón una solución de N-metil-N-(metilditiobutanoíl)-L-alanina (6c) (8,9 mg, 35,5 \mumol) en cloruro de metileno seco (0,15 ml) y se trató secuencialmente con soluciones de DCC (8,8 mg, 42,6 \mumol) en cloruro de metileno, ZnCl_{2} 1 M (7,1 \mumol) en éter y maitansinol (2) (4,0 mg, 7,1 \mumol) en cloruro de metileno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante tres horas y a continuación se filtró y se evaporó el filtrado bajo presión reducida, proporcionando una mezcla de ésteres L y D-aminoacilo de maitansinol. Este material se puede purificar adicionalmente utilizando una columna de HPLC preparativa de ciano Diazem™ (250 mm x 50 mm, tamaño de partícula de 10 micras) equilibrada con una mezcla de hexano:2-propanol:acetato de etilo (17:2:6, v/v/v) a una velocidad de flujo de 150 ml/min según se ha descrito anteriormente para 10b.

Esterificación de maitansinol (2) con N-metil-N-(fenilditiopropanoíl)-L-alanina (6e)

Se agitó bajo argón una solución de N-metil-N-(fenilditiopropanoíl)-L-alanina (6e) (31,5 mg, 105 \mumol) en cloruro de metileno (0,4 ml) y se trató secuencialmente con soluciones de DCC (26 mg, 126 \mumol) en cloruro de metileno, ZnCl_{2} 1 M (17,7 \mumol) en éter y maitansinol (2) (10 mg, 17,7 \mumol) en cloruro de metileno (0,2 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante tres horas. Se eliminó el precipitado mediante filtración y se concentró el filtrado bajo presión reducida.

La mezcla se puede purificar adicionalmente utilizando una columna de HPLC preparativa de ciano Diazem™ (250 mm x 50 mm, tamaño de partícula 10 micras), equilibrada con una mezcla de hexano:2-propanol:acetato de etilo (17:2:6, v/v/v) a una velocidad de flujo de 150 ml/min según se ha descrito anteriormente para (10b).

^{1}H RMN (CDCl_{3}) isómero L-aminoacilo (10e): \delta 0,82 (3H, s), 1,11-1,25 (1H, m), 1,33 (3H, d, J = 3 Hz), 1,61 (3H, s), 1,63 (3H, d, J = 14 Hz), 2,19 (1H, dd, J = 13 Hz y 15 Hz), 2,61 (1H, dd, J = 12 Hz y 15 Hz), 2,78 (3H, s), 2,68-3,03 (2H, m), 3,07 (1H, d, J = 9 Hz), 3,20 (3H, s), 3,38 (3H, s), 3,53 (1H, d, J = 9 Hz), 3,63 (1H, d, J = 13 Hz), 3,68 (3H, s), 4,01 (3H, s), 4,30 (1H, t, J = 11 Hz), 4,79 (1H, dd, J = 3 Hz y 8 Hz), 5,43 (1H, q, J = 7 Hz), 5,68 (1H, dd, J = 9 Hz y 15 Hz), 6,23 (1H, s), 6,45 (1H, dd, J = 12 Hz y 15 Hz), 6,60 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,75 (1H, d, J = 12 Hz), 6,77 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,22-7,40 (5H, m).

Esterificación de maitansinol (2) con N-metil-N-metilditio-(3-metilditiobutanoíl)-L-alanina (6g)

Se agitó bajo una atmósfera de argón, una solución de N-metil-N-(3-metilditiobutanoíl)-L-alanina (6g) (23,2 mg, 0,088 mmol) en diclorometano (0,2 ml) y se trató secuencialmente con una solución de maitansinol (5 mg, 0,0088 mmol) en diclorometano (0,2 ml), DCC (20,6 mg) en diclorometano (0,2 ml) y cloruro de zinc 1 M (0,0088 mmol) en éter. La reacción se dejó en agitación durante toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró a continuación y se evaporó el disolvente. Se purificó el residuo mediante TLC preparativa sobre gel de sílice, utilizando metanol al 6% en cloroformo para proporcionar el éster L-maitansinoide deseado 10g. El producto 10g se puede purificar más eficazmente utilizando una columna de HPLC preparativa de ciano Diazem™ (250 mm x 10 mm, tamaño de partícula 10 micras) equilibrada con una mezcla de hexano:2-propanol:acetato de etilo (17:2:6, v/v/v) a una velocidad de flujo de 4,70 ml/min según se ha descrito anteriormente para (10b).

Esterificación de maitansinol (2) con N-acetil-N-metil-metilditiocisteína (9a)

Se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón una solución de N-acetil-N-metil-metilditiocisteína (9a) (15,6 mg, 0,07 mmol) en cloruro de metileno seco (0,45 ml) y se trató secuencialmente con soluciones de ZnCl_{2} 1 M en éter de etilo (0,028 mmol), DCC (17,3 mg, 0,084 mmol) en cloruro de metileno (0,2 ml) y maitansinol (2) (4,0 mg, 0,007 mmol) en cloruro de metileno (0,1 ml). La mezcla de reacción se agitó durante tres horas y a continuación se filtró y se evaporó el filtrado bajo presión reducida.

El residuo se puede purificar adicionalmente utilizando una columna de HPLC preparativa de ciano Diazem™ (250 mm x 50 mm, tamaño de partícula 10 micras) equilibrada con una mezcla de hexano:2-propanol:acetato de etilo (17:2:6, v/v/v) a una velocidad de flujo de 150 ml/min según se ha descrito anteriormente para (10b).

Etapa 3

Reducción de maitansinoide que contiene disulfuro

Se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón una solución del éster L-aminoacilo que contiene disulfuro de maitansinol 10b (1,95 g, 2,5 mmol) en una mezcla de acetato de etilo (140 ml) y metanol (210 ml) y se trató con una solución de ditiotreitol (0,95 g, 6,2 mmol) en tampón de fosfato de potasio 0,05 M (140 ml), pH 7,5, que contiene ácido etilendiamintetraacético 2 mM (EDTA). El progreso de la reacción se monitorizó mediante HPLC y se completó en tres horas.

La mezcla de reacción acabada se trató con una solución de tampón de fosfato de potasio 0,2 M (250 ml), pH 6,0, que contenía EDTA 2 mM, y se extrajo a continuación el acetato de etilo (3 x 600 ml). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (100 ml) y a continuación se secaron con sulfato de sodio. La evaporación del disolvente proporcionó un residuo de maitansinoide que contiene tiol crudo 11b.

El maitansinoide que contiene tiol crudo 11b se purificó mediante una columna de HPLC preparativa de ciano Diazem™ (250 mm x 50 mm, tamaño de partícula 10 micras) equilibrada con una mezcla de hexano:2-propanol: acetato de etilo (78,0:5,5:16,5, v/v/v) y que funcionó a una velocidad de flujo de 150 ml/min. El maitansinoide que contiene tiol 11b se eluyó como un pico centrado a 16 min. Se evaporaron las fracciones que contienen el producto para dar maitansinoide puro que contiene tiol 11b como un sólido blanco (76% de rendimiento con una pureza del 99%).

La presencia de un mol de grupo sulfhidrilo/mol de producto se confirmó utilizando el ensayo Ellman. El producto se caracterizó adicionalmente mediante espectroscopia de RMN. 1H RMN (CDCl_{3}): \delta 0,84 (3H, s), 1,33 (3H, d, J = 5 Hz), 1,35 (3H, d, J = 5 Hz), 1,60 (3H, s), 1,68 (3H, s), 2,22 (1H, dd, J = 3 Hz y 14 Hz), 2,60-2,82 (2H, m), 2,88 (3H, s), 3,08-3,20 (2H, m), 3,25 (3H, s), 3,39 (3H, s), 3,55 (1H, d, J = 9 Hz), 3,71 (1H, d, J = 12 Hz), 4,02 (3H, s), 4,32 (1H, t, J = 10 Hz), 4,81 (1H, dd, J = 3 Hz y 12 Hz), 5,45 (1H, q, J = 7 Hz), 5,67 (1H, dd, J = 9 Hz y 15 Hz), 6,25 (1H, s), 6,47 (1H, dd, J = 11 Hz y 15 Hz), 6,70 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,75 (1H, d, J = 11 Hz), 6,86 (1H, d, J = 1,5 Hz).

Mientras la presente invención se ha descrito en detalle y haciendo referencia a las formas de realización específicas de la misma, será evidente para un experto en la materia que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la misma.

Claims

1. Procedimiento para la preparación de un maitansinoide que contiene tiol que comprende las etapas siguientes:

(1): llevar a cabo una hidrólisis reductora de un éster C-3 maitansinoide con un agente reductor seleccionado de entre el grupo constituido por hidruro de trimetoxialuminio litio (LiAl(OMe)_{3}H), hidruro de trietoxialuminio litio (LiAl(OEt)_{3}H) e hidruro de tripropoxialuminio litio (LiAl(OPr)_{3}H), para proporcionar un maitansinol;

(5): reducir el éster L-aminoacilo de maitansinol para proporcionar un maitansinoide que contiene un tiol; y

(6): purificar el maitansinoide que contiene tiol.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente reductor en (1) es hidruro de trimetoxialuminio litio.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente reductor en (1) se utiliza en una concentración de aproximadamente 5 a 100 equivalentes por mol del éster C-3 de maitansinoide.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente reductor en (1) se utiliza en una concentración de aproximadamente 7,5 a 30 equivalentes por mol del éster C-3 de maitansinoide.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente reductor en (1) se utiliza en una concentración de aproximadamente 10 a 20 equivalentes por mol del éster C-3 de maitansinoide.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la hidrólisis reductora en (1) se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente -80ºC a 0ºC.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la hidrólisis reductora en (1) se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente -45ºC a -27,5ºC.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la hidrólisis reductora en (1) se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente -35ºC a -30ºC.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el agente reductor en (1) se añade durante un periodo de aproximadamente 5 a 40 minutos.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el agente reductor en (1) se añade durante un periodo de aproximadamente 7 a 20 minutos.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el agente reductor en (1) se añade durante un periodo de aproximadamente 8 a 12 minutos.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el maitansinol se purifica en (2) mediante cromatografía.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la cromatografía es cromatografía de columna de gel de sílice, cromatografía preparativa de capa fina sobre gel de sílice o cromatografía de columna de HPLC de sílice unida a ciano.

14. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la cromatografía es cromatografía de columna de gel de sílice.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la purificación se lleva a cabo a temperatura ambiente.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el maitansinol se purifica hasta una pureza de aproximadamente 95%.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el ácido carboxílico en (3) se selecciona de entre el grupo constituido por N-metil-N-metilditioacetil-L-alanina, N-metil-N-(3-metilditiopropanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(3-metil-ditiobutanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(4-metilditiobutanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(5-metil-
ditiopentanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(3-fenilditiopropanoíl)-L-alanina, N-metil-N-(3-(4-nitrofenilditio)propanoíl)-L-
alanina, N-acetil-N-metil-metilditiocisteína y N-acetil-N-metil-metilditiohomocisteína.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el ácido carboxílico en (3) es N-metil-N-(3-metilditiopropanoíl)-L-alanina.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la esterificación en (3) se lleva a cabo a temperatura ambiente.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que la esterificación en (3) comprende además la utilización de diciclohexilcarbodiimida y cloruro de zinc.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que la separación en (4) se lleva a cabo haciendo pasar la mezcla de reacción por una columna de HPLC de sílice unida a ciano.

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que la separación en (4) se lleva a cabo a aproximadamente 25ºC.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que la reducción en (5) utiliza ditiotreitol como agente reductor.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que la reducción en (5) se lleva a cabo en una mezcla de acetato de etilo-metanol-tampón acuoso que es capaz de mantener las sales tampón, el ditiotreitol, los maitansinoides no reducidos y los maitansinoides reducidos en solución.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que la mezcla de acetato de etilo-metanol tampón acuoso es 1:1,5:1, v/v/v, acetato de etilo:metanol:tampón acuoso.

26. Procedimiento según la reivindicación 24 ó 25, en el que la concentración de maitansinoide que contiene tiol es tal que el maitansinoide que contiene tiol permanece soluble en acetato de etilo-metanol-tampón acuoso.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que la concentración del maitansinoide que contiene tiol es aproximadamente 4 g/l.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que la reducción en (5) se lleva a cabo en una atmósfera libre de oxígeno.

29. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que la reducción en (5) se lleva a cabo a aproximadamente 25ºC.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el que la purificación del maitansinoide que contiene tiol en (6) se lleva a cabo mediante cromatografía.

31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que la purificación del maitansinoide que contiene tiol en (6) se lleva a cabo mediante cromatografía de columna de HPLC unida a ciano.

32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que la cromatografía se lleva a cabo mediante columna de HPLC unida a ciano equilibrada y eluída en un disolvente orgánico.

33. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que el disolvente orgánico es una mezcla de hexano:2-propanol:acetato de etilo.

34. Procedimiento según la reivindicación 33, en el que el disolvente orgánico es una mezcla de hexano:2-propanol:acetato de etilo 78,0:5,5:16,5, v/v/v.

35. Procedimiento para la purificación de maitansinol a partir de maitansinol crudo mediante cromatografía de columna de HPLC de sílice modificada químicamente.

36. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que la sílice modificada químicamente es sílice unida a ciano.

37. Procedimiento según la reivindicación 35 ó 36, que utiliza una columna que se eluye en fase normal.

38. Procedimiento según la reivindicación 37, que utiliza disolventes orgánicos en la fase móvil.