ES2254370T3 - Derivados de acido malonico, procedimientos para su preparacion, su uso como inhibidor de la actividad de factor xa y composiciones farmaceuticas que los contienen. - Google Patents

Derivados de acido malonico, procedimientos para su preparacion, su uso como inhibidor de la actividad de factor xa y composiciones farmaceuticas que los contienen.

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Abstract

Compuestos de fórmula I, en la cual a) R(1) es metilo, alilo, fenilo o bencilo; R(2) es hidrógeno o metilo; R(3) es fenilo que está sustituido con R(7); R(4) es hidrógeno; R(5) es butilo, ciclohexilo, ciclohexilmetilo, fenilo, bencilo, 2-feniletilo, 1-naftilmetilo, 2-naftilmetilo, aminobecilo, benciloximetilo, carboximetilo, ó 2-carboxietilo; R(6) es NR(8)R(9); R(7) es amidino o hidroxiamidino; R(8) es hidrógeno; R(9) es (Ver fórmula) R(10) es NR(12)R(13) u OR(14); R(12) es hidrógeno o metilo; R(13) es hidrógeno o fenil-(alquilo C1-C2); R(14) es hidrógeno, alquilo C1-C2, o alilo.

Description

Derivados de ácido malónico, procedimientos para su preparación, su uso como inhibidor de la actividad de factor Xa y composiciones farmacéuticas que los contienen.
La presente invención se refiere a compuestos de fórmula I,
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en la cual R(1), R(2), R(3), R(4), R(5), y R(6) tienen los significados que se indicarán más adelante. Los compuestos de fórmula I son valiosos compuestos farmacológicamente activos. Presentan un intenso efecto antitrombótico y son adecuados, por ejemplo, para la terapia y la profilaxis de trastornos cardiovasculares tales como enfermedades tromboembólicas o restenosis. Son inhibidores reversibles de la enzima de coagulación sanguínea factor Xa, y pueden ser aplicados en general en estados en los cuales esté presente una actividad indeseada de factor Xa o cuando para la curación o la prevención de los mismos se desee la inhibición del factor Xa. La invención se refiere también a procedimientos para preparar los compuestos de fórmula I, a métodos para inhibir la actividad de factor Xa y para inhibir la coagulación sanguínea, al uso de los compuestos de fórmula I en el tratamiento y la profilaxis de enfermedades que puedan ser tratadas o prevenidas mediante la inhibición de la actividad de factor Xa, tales como enfermedades tromboembólicas, y al uso de los compuestos de fórmula I en la preparación de medicamentos que han de ser aplicados en dichas enfermedades.
La invención se refiere también a composiciones que contienen un compuesto de fórmula I mezclado o asociado de otra forma con un vehículo inerte, en particular composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de fórmula I junto con sustancias vehiculantes y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables.
La capacidad de formar coágulos sanguíneos es vital para la supervivencia. Sin embargo, en algunos estados morbosos la formación de coágulos sanguíneos dentro del sistema circulatorio alcanza un grado indeseado y es en sí misma una fuente de morbilidad que puede conducir potencialmente a consecuencias patológicas. En cualquier caso, en estos estados morbosos no resulta deseable inhibir por completo el sistema de coagulación, ya que se producirían hemorragias que podrían ser fatales. En el tratamiento de estos estados se requiere una intervención equilibrada en el sistema de coagulación sanguínea, y aún se necesitan sustancias que presenten un perfil de actividad farmacológica adecuado para conseguir dicho resultado.
La coagulación sanguínea es un proceso complejo que implica una serie progresivamente amplificada de reacciones de activación enzimática, en la cual se activan secuencialmente zimógenos plasmáticos mediante proteólisis limitadas. Se ha dividido mecanísticamente la cascada de coagulación sanguínea en rutas intrínsecas y extrínsecas, que convergen en la activación del factor X. La posterior generación de trombina tiene lugar a través de una única ruta común (véase el Esquema 1).
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Esquema 1
Cascada de la coagulación sanguínea
2
Las pruebas actuales sugieren que la ruta intrínseca desempeña un papel importante en el mantenimiento y crecimiento de la formación de fibrina, mientras que la ruta extrínseca es crítica en la fase de iniciación de la coagulación sanguínea. Generalmente se acepta que la coagulación sanguínea se inicia físicamente con la formación de un complejo de factor tisular (TF) y factor VIIa. Una vez formado, este complejo inicia rápidamente la coagulación al activar los factores IX y X. El factor X activado, es decir el factor Xa, recién generado forma un complejo uno a uno con el factor Va y fosfolípidos, para formar un complejo de protrombinasa que es responsable de la conversión de fibrinógeno soluble en fibrina insoluble, a través de la activación de la trombina desde su precursora protrombina. A medida que transcurre el tiempo, la actividad del complejo factor VIIa/factor tisular (ruta extrínseca) es suprimida por una proteína inhibidora de proteasas de tipo Kunitz, TFPI, que, cuando se acompleja con el factor Xa, puede inhibir directamente la actividad proteolítica del factor VIIa/factor tisular. Para mantener el proceso de coagulación en presencia de un sistema extrínseco inhibido, se produce factor Xa adicional mediante la actividad de la ruta intrínseca, en la cual interviene la trombina. Así, la trombina desempeña un papel autocatalítico doble, interviniendo en su propia producción y en la conversión de fibrinógeno a fibrina.
La naturaleza autocatalítica de la generación de trombina constituye una salvaguardia importante contra la hemorragia incontrolada, y asegura que cuando esté presente un cierto nivel umbral de protrombinasa, la coagulación sanguínea continuará hasta completarse, produciendo, por ejemplo, el fin de la hemorragia. Por ello, es muy deseable desarrollar agentes que inhiban la coagulación sin inhibir directamente la trombina, sino inhibiendo otras fases de la cascada de coagulación, por ejemplo el factor Xa.
En muchas aplicaciones clínicas existe una gran necesidad de prevenir los coágulos sanguíneos intravasculares o de una terapia anticoagulante. Por ejemplo, casi el 50% de los pacientes que han sufrido una artroplastia total de cadera desarrollan trombosis de venas profundas (siglas inglesas DVT). Las terapias actualmente aprobadas son la heparina de bajo peso molecular (siglas inglesas LMWH) con dosis fija, y la heparina con dosis variable. Incluso con estos tratamientos, de 10% a 20% de los pacientes sufren DVT, y en 5% a 10% aparecen complicaciones hemorrágicas.
Otra situación clínica para la cual se precisan mejores anticoagulantes se refiere a pacientes a quienes se ha practicado una angioplastia coronaria transluminal, y a pacientes con riesgo de infarto o angina de miocardio. La terapia actual, aceptada convencionalmente, y que consiste en la administración de heparina y de aspirina, está asociada con una proporción de obstrucción súbita del vaso del 6% al 8%, en las 24 horas siguientes a la intervención. La proporción de complicaciones hemorrágicas que requieren terapia de transfusión, debidas al uso de heparina, se sitúa también en aproximadamente 7%. Más aún, aunque las obstrucciones diferidas son significativas, la administración de heparina tras el término de la intervención tiene escaso efecto, y puede ser perjudicial.
Los inhibidores de la coagulación sanguínea más ampliamente utilizados son la heparina y los polisacáridos sulfatados afines, la LMWH y el sulfato de heparina. Estas moléculas producen su efecto anticoagulante favoreciendo la fijación de un regulador natural del proceso de la coagulación, la antitrombina III, a la trombina y al factor Xa. La actividad inhibidora de la heparina se dirige principalmente hacia la trombina, que queda inactivada aproximadamente 100 veces más deprisa que el factor Xa. Aunque, en comparación con la heparina, el sulfato de heparina y la LMWH son inhibidores algo más potentes frente al Xa que frente a la trombina, las diferencias in vitro son modestas (entre 3 y 30 veces), y los efectos in vivo pueden ser intranscendentes. La hirudina y el hirulog son dos anticoagulantes adicionales, específicos para la trombina, que han sido ensayados en ensayos clínicos. Sin embargo, estos anticoagulantes, que inhiben la trombina, están asociados también con complicaciones hemorrágicas.
Los estudios preclínicos en mandriles y en perros han demostrado que inhibidores específicos del factor Xa previenen la formación de coágulos sin producir los efectos secundarios hemorrágicos que se observan con los inhibidores directos de la trombina.
Se han descrito varios inhibidores específicos del factor Xa. Se han identificado inhibidores de factor Xa tanto de naturaleza sintética como de naturaleza proteica, entre ellos, por ejemplo, la atistasina ("ATS") y el péptido anticoagulante de las garrapatas (siglas inglesas "TAP"). El ATS, que se aísla de la sanguijuela Haementerin officinalis, contiene 119 aminoácidos, y su Ki para el factor Xa es 0,05 nM. El TAP, que se aísla de la garrapata Ornithodoros moubata, contiene 60 aminoácidos, y su Ki para el factor Xa es aproximadamente 0,05 nM.
Se ha investigado en diversos sistemas animales modelo la eficacia de ATS y TAP producidos de manera recombinante. Ambos inhibidores disminuyen el tiempo de hemorragia en comparación con otros anticoagulantes, y previenen la coagulación en un modelo de trombosis de venas profundas constituido por una vena yugular ligada, e inducido por tromboplastina. Los resultados conseguidos en este modelo concuerdan con resultados obtenidos empleando al actual fármaco de elección, la heparina.
También se ha hallado que la ATS subcutánea es un tratamiento eficaz en un modelo, inducido por tromboplastina, de coagulación intravascular diseminada (siglas inglesas DIC). El TAP previene de manera eficaz la trombosis arterial por "elevado esfuerzo cortante" y el "caudal disminuido" originado por la colocación quirúrgica de un injerto de poliéster ("DACRON"), a niveles que habían producido una prolongación clínicamente aceptable del tiempo de tromboplastina parcial activada (siglas inglesas aPTT), es decir, una prolongación inferior a aproximadamente el doble. En comparación, la heparina estándar, incluso a dosis que habían causado un incremento de cinco veces en el aPTT, no impidió la trombosis ni el caudal disminuido dentro del injerto. El aPTT es un ensayo clínico particularmente sensible a los inhibidores de trombina.
La ATS y el TAP no han sido desarrollados clínicamente. Constituye una gran desventaja de estos dos inhibidores el hecho de que la administración de las dosis repetidas necesarias produce la generación de anticuerpos neutralizantes, lo que limita su uso clínico potencial. Además, los tamaños del TAP y de la ATS hacen que su administración por vía oral sea imposible, restringiendo aún más el número de pacientes que podrían beneficiarse de estos agentes.
Un inhibidor específico de factor Xa con un favorable perfil de propiedades tendría un valor práctico sustancial en la práctica de la medicina. En particular, un inhibidor del factor Xa sería eficaz en circunstancias en las cuales los actuales fármacos de elección, la heparina y los polisacáridos sulfatados afines, son ineficaces o sólo marginalmente eficaces.
Se han descrito inhibidores de la coagulación sanguínea específicos para el factor Xa, de bajo peso molecular, que son eficaces pero que no provocan efectos secundarios indeseados, por ejemplo, en el documento WO-A-95/29189. En el documento WO-A-99/33800 se han descrito derivados de indol como inhibidores de la coagulación sanguínea específicos para el factor Xa, de bajo peso molecular. Sin embargo, además de ser inhibidores de la coagulación sanguínea específicos para el factor Xa, y eficaces, es deseable que dichos inhibidores posean además propiedades farmacológicas ventajosas, por ejemplo una buena biodisponibilidad por vía oral, elevada estabilidad en plasma y hepática, y/o buena selectividad respecto a otras proteasas de serina cuya inhibición no se desea, tales como la trombina. Existe, por tanto, una necesidad continua de más inhibidores de la coagulación sanguínea específicos para el factor Xa, de bajo peso molecular, que sean eficaces y que además posean las ventajas antes citadas. En las solicitudes de patente europea números 99100002, 99119537 (WO 00/40571) y 99100001, 99119538 (WO 00/40548) se han propuesto derivados de arilalcanoílo y de ácido malónico que son inhibidores de factor Xa adecuados.
La presente invención satisface también las necesidades antes citadas, proporcionando nuevos compuestos de fórmula I que presentan actividad inhibidora de factor Xa, y que son agentes adecuados para inhibir la coagulación sanguínea indeseada y la formación de trombos.
Así, son un objeto de la presente invención compuestos de fórmula I,
3
en la cual
a)
R(1) es metilo, alilo, fenilo o bencilo, con preferencia metilo o bencilo;
R(2) es hidrógeno o metilo;
R(3) es fenilo que está sustituido con R(7);
R(4) es hidrógeno;
R(5) es butilo, con preferencia n-butilo, ciclohexilo, ciclohexilmetilo, fenilo, bencilo, 2-feniletilo, 1-naftilmetilo, 2-naftilmetilo, aminobencilo, con preferencia 4-aminobencilo, benciloximetilo, carboximetilo, ó 2-carboxietilo;
R(6) es NR(8)R(9);
R(7) es amidino o hidroxiamidino;
R(8) es hidrógeno;
R(9) es
\vskip1.000000\baselineskip
4 
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R(10) es NR(12)R(13) u OR(14);
R(12) es hidrógeno o metilo;
R(13) es hidrógeno o fenil-(alquilo C_{1}-C_{2});
R(14) es hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{2}, o alilo; o bien
b)
R(1) es propilo o butilo, con preferencia butilo;
R(2) es propilo o butilo, con preferencia butilo;
R(3) es fenilo que está sustituido con R(7);
R(4) es hidrógeno;
R(5) es ciclohexilo;
R(6) es NR(8)R(9);
R(7) es amidino o amino;
R(8) es hidrógeno;
\newpage
R(9) es
5
R(10) es
6
X^{-} es un anión fisiológicamente aceptable;
en todas sus formas estereoisómeras y mezclas de los mismos en cualquier proporción, y sus sales fisiológicamente aceptables.
Los radicales alquilo presentes en los compuestos de fórmula I pueden ser de cadena lineal o ramificados. Son ejemplos de radicales alquilo: metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo, isopentilo, isohexilo, neopentilo, 3-metilpentilo, y terc-pentilo.
Son ejemplos de arilo: fenilo o naftilo.
Los radicales arilalquilo presentes en los compuestos de fórmula I pueden estar compuestos por un radical alquilo, que puede contener de uno a tres restos arilo. Son ejemplos de radicales arilalquilo: fenilmetilo, feniletilo, fenilpropilo, fenilbutilo, naftilmetilo, naftiletilo, naftilpropilo, naftilbutilo, difenilmetilo, difeniletilo, difenilpropilo, difenilbutilo, naftilfenilmetilo, naftilfenilbutilo, dinaftilbutilo, y trifeniletilo.
En radicales fenilo monosustituidos, el sustituyente puede estar situado en la posición 2, en la posición 3, o en la posición 4.
Los radicales naftilo pueden ser 1-naftilo y 2-naftilo. En radicales naftilo sustituidos, los sustituyentes pueden estar situados en cualquier posición, es decir, en radicales 1-naftilo monosustituidos pueden estar en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, y en radicales 2-naftilo monosustituidos pueden estar en la posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.
En los compuestos de fórmula I, un radical (aril C_{6}-C_{10})-(alquilo C_{1}-C_{4}) preferido es el bencilo (fenilmetilo).
Los especialistas en la técnica conocen grupos protectores de amino adecuados, que comprenden, por ejemplo, los utilizados habitualmente en la síntesis de péptidos.
Se entenderá que los radicales presentes más de una vez en un compuesto de fórmula I, son independientes entre sí, y pueden ser idénticos o diferentes.
Los aniones X^{-} fisiológicamente aceptables que están presentes en los compuestos de fórmula I si está presente un grupo cargado positivamente, pueden ser aniones derivados de ácidos inorgánicos, o ácidos carboxílicos orgánicos, o ácidos sulfónicos, adecuados. Son ácidos adecuados, en particular, los que forman sales farmacéuticamente aceptables o no tóxicas. Son ejemplos de tales ácidos los que se ofrecen a continuación como ejemplos de ácidos que pueden formar sales fisiológicamente aceptables con los compuestos de fórmula I que contienen grupos básicos. Si un compuesto de fórmula I contiene un anión X^{-} y simultáneamente se presenta como una sal por adición de ácidos formada en un grupo básico, el anión X^{-} puede ser el mismo o diferente del anión introducido por la formación de sal. La presente invención cubre también las sales internas (betaínas) de los compuestos de fórmula I.
Son sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de fórmula I, en particular, las sales farmacéuticamente aceptables o no tóxicas. Dichas sales se forman, por ejemplo, a partir de compuestos de fórmula I que contienen grupos ácidos, por ejemplo grupos de ácido carboxílico. Son ejemplos de dichas sales, por ejemplo, sales que contienen cationes de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos tales como, por ejemplo, sodio, potasio, magnesio o calcio, o el catión amonio sin sustituir o cationes amonio orgánicos, incluyendo estos últimos cationes obtenidos de aminas orgánicas fisiológicamente aceptables tales como, por ejemplo, metilamina, etilamina, trietilamina, etanolamina, tris(2-hidroxietil)amina o aminoácidos, mediante protonación, o bien cationes cuaternarios adecuados tales como, por ejemplo, tetrametilamonio.
Los compuestos de fórmula I que contienen grupos básicos, por ejemplo un agrupo amino o un grupo amidino, forman sales por adición de ácidos con, por ejemplo ácidos inorgánicos, ácidos carboxílicos orgánicos, y ácidos sulfónicos orgánicos. Son ejemplos de ácidos cuyos aniones pueden estar presentes en sales fisiológicamente aceptables de compuestos de fórmula I: ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido benzoico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido metansulfónico, ácido p-toluensulfónico o ácidos naftalensulfónicos.
Las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de fórmula I se pueden preparar mediante procedimientos habituales, por ejemplo combinando el compuesto de fórmula I con la base deseada, por ejemplo un hidróxido de metal alcalino o carbonato de metal alcalino o hidrogenocarbonato de metal alcalino, o una amina, o con el ácido deseado, en un disolvente o diluyente. También se puede preparar una sal fisiológicamente aceptable de un compuesto de fórmula I a partir de otra sal, por ejemplo una sal de ácido trifluoroacético, a través del intercambio de cationes o intercambio de aniones, mediante procedimientos habituales. La presente invención cubre también, en general, sales de los compuestos de fórmula I que se obtienen, por ejemplo, durante la síntesis química de los compuestos y que pueden ser empleadas como materiales de partida para la posterior preparación de una sal fisiológicamente aceptable, deseada. La presente invención cubre además solvatos de los compuestos de fórmula I, por ejemplo hidratos o alcoholatos.
Los compuestos de fórmula I de acuerdo con la invención pueden contener átomos de carbono ópticamente activos que, de manera independiente entre sí, pueden tener configuración R ó S. Por tanto, pueden estar presentes en forma de enantiómeros individuales o de diastereómeros individuales, o bien en forma de mezclas enantioméricas que incluyen los racematos, o de mezclas diastereoméricas. La presente invención se refiere tanto a los enantiómeros puros como a mezclas de enantiómeros en todas proporciones, y a diastereómeros puros y a mezclas de diastereómeros en todas proporciones. La invención cubre mezclas de dos estereoisómeros, así como mezclas de más de dos estereoisómeros de fórmula I, y todas las proporciones de estereoisómeros en las mezclas.
Los compuestos de fórmula I pueden presentarse también como isómeros E o como isómeros Z. La presente invención se refiere tanto a isómeros E y Z puros, como a mezclas de isómeros E/Z en todas proporciones. Los diasterómeros, entre ellos los isómeros E/Z, pueden ser separados en los isómeros individuales, por ejemplo mediante cromatografía. Los racematos pueden ser separados en los dos enantiómeros mediante cromatografía en fases quirales, o mediante resolución según procedimientos habituales. Por otra parte, también se pueden obtener los enantiómeros puros empleando en la síntesis materiales de partida ópticamente activos.
Los compuestos de fórmula I de acuerdo con la invención pueden contener además átomos de hidrógeno móviles, es decir, pueden presentarse en diversas formas tautómeras. La presente invención se refiere también a todos estos tautómeros.
La invención incluye también derivados y modificaciones de los compuestos de fórmula I, por ejemplo profármacos, formas protegidas y otros derivados fisiológicamente tolerables, que incluyen ésteres y amidas, así como metabolitos activos, de los compuestos de fórmula I. Estos ésteres y amidas son, por ejemplo, ésteres de alquilo C_{1}-C_{4}, amidas sin sustituir, o (alquil C_{1}-C_{8})-amidas. La invención se refiere en particular a profármacos y formas protegidas de los compuestos de fórmula I, que pueden ser convertidos en compuestos de fórmula I en condiciones fisiológicas. Los especialistas en la técnica conocen profármacos adecuados para los compuestos de fórmula I, es decir, derivados modificados químicamente de los compuestos de fórmula I que tienen propiedades que han sido mejoradas de una manera deseada, por ejemplo con respecto a la solubilidad, la biodisponibilidad o la duración del efecto. En la bibliografía convencional se encuentra información más detallada referente a profármacos, por ejemplo en Design of Prodrugs, compilado por H. Bundgaard, Elsevier, 1985; Fleisher y otros, Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1996) 115-130; o H. Bundgaard, Drugs of the Future 16 (1991) 443, los cuales quedan todos incorporados en la presente memoria por referencia. Son profármacos adecuados para los compuestos de fórmula I, en especial, profármacos de éster y profármacos de amida de grupos ácidos carboxílicos, y también profármacos de acilo y profármacos de carbamato de grupos que contienen nitrógeno acilable, por ejemplo el grupo amino, el grupo amidino, y el grupo guanidino. En los profármacos de acilo y en los profármacos de carbamato, uno o más, por ejemplo uno o dos, átomos de hidrógeno situados en átomos de nitrógeno en dichos grupos han sido reemplazados por un grupo acilo o por un grupo oxiacilo. Son grupos acilo y grupos oxiacilo adecuados para profármacos de acilo y profármacos de carbamato, por ejemplo, los grupos R^{p1}-CO- y R^{p2}-CO-, en los cuales R^{p1} es hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, cicloalquilo C_{3}-C_{7}, (cicloalquil C_{3}-C_{7})-(alquilo C_{1}-C_{4}), arilo C_{6}-C_{14} que está sin sustituir o bien está sustituido con un radical alquilo C_{1}-C_{2}, alcoxi C_{1}-C_{2}, fluoro, o cloro; heteroarilo, (aril C_{6}-C_{14})-(alquilo C_{1}-C_{4}), en donde arilo está sin sustituir o bien está sustituido con un radical alquilo C_{1}-C_{2}, alcoxi C_{1}-C_{2}, fluoro, o cloro; o bien heteroaril-(alquilo C_{1}-C_{4}), y en los cuales R^{p2} tiene los significados indicados para R^{p1}, con la excepción de hidrógeno.
Son compuestos preferidos de fórmula I que se pueden mencionar:
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(1-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-N',N'-dimetil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de éster alílico de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida, diastereómero más polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-2-[4-(N-hidroxicarbamimidoil)-bencil]-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de N-[2-(4-amino-fenil)-1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-etil]-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-pentil]-N'-metil-malonamida,
ácido 4-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetilcarbamoil-propionilamino]-4-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-bu-
tilcarbamoil)-butírico,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-2-naftalen-2-il-etil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-3-fenil-propil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de ácido 3-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetil-carbamoil-propionilamino]-N-[1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butil)-succinámico,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-fenil-metil]-N'-metil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-fenil-metil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de N-[2-benciloxi-1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-etil]-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-pentil]-N',N'-dimetil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetil-carbamoil-propionilamino]-hexanoilamino}-5-guanidino-pentanoico,
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetilcarbamoil-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico; compuesto con ácido trifluoroacético,
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-metilcarbamoil-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico;
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-bencilcarbamoil-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico;
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetilcarbamoil-propionilamino]-3-ciclohexil-propionilamino}-5-guanidino-pentanoico;
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-2-fenil-etil]-N',N'-dimetil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-2-naftalen-1-il-etil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-pentil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-N'-metil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-2-ciclohexil-etil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-2-[4-(N-hidroxicarbamimidoil)-bencil]-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido clorhídrico de éster etílico de ácido 2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetilcarbamoil-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico,
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-bencilcarbamoil-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico,
diastereómero menos polar,
sal con ácido clorhídrico de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(S)-ciclohexil-(4-guanidino-1-(S)-fenetilcarbamoil-butilcarbamoil)-metil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida, diastereómero más polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-N-metil-malonamida,
sal con ácido clorhídrico de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico,
sal con ácido trifluoroacético de éster metílico de ácido 2-(S)-{2-[2-(bencil-metil-carbamoil-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-N'-{[1-(S)-(bencil-metil-carbamoil)-4-guanidino-butilcarbamoil]-ciclohexil-metil}-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-metil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-((S)-{1-(S)-[1-(S)-(2-(S)-carbamoil-pirrolidin-1-carbonil)-3-metil-butilcarbamoil]-4-guanidino-butilcarbamoil}-ciclohexil-metil)-N',N'-diisopropil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de trifluoroacetato de 3-{2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-diisopropilcarbamoil-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-2-[1-(S)-(2-(S)-carbamoil-pirrolidin-1-carbonil)-3-metil-butil-
carbamoil]-etil}-1-metil-piridinio, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-amino-bencil)-N-((S)-{1-(S)-[1-(S)-(2-(S)-carbamoil-pirrolidin-1-carbonil)-3-metil-butilcarbamoil]-4-guanidino-butilcarbamoil}-ciclohexil-metil)-N',N'-diisopropil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-((S)-{1-(S)-[1-(S)-(2-(S)-carbamoil-pirrolidin-1-carbonil)-3-metil-butilcarbamoil]-4-guanidino-butilcarbamoil}-ciclohexil-metil)-N',N'-diisobutil-malonamida, diastereómero más polar,
y/o sus sales fisiológicamente aceptables.
Un especialista ordinario en la técnica puede preparar los compuestos de fórmula I utilizando procedimientos y técnicas bien conocidos y apreciados. Los materiales de partida o bloques de construcción para uso en los procedimientos sintéticos generales que pueden ser aplicados en la preparación de los compuestos de fórmula I son fácilmente asequibles para cualquiera que tenga una pericia ordinaria en la técnica. En muchos casos están disponibles comercialmente, o bien han sido descritos en la bibliografía. Si no fuese así, pueden ser preparados a partir de compuestos precursores fácilmente disponibles, de manera análoga a procedimientos descritos en esta solicitud.
Las reacciones descritas a continuación, que se llevan a cabo en la síntesis de los compuestos de fórmula I, pueden ser realizadas en general según los métodos de la química en fase de solución convencional, y también según los métodos de la química en fase sólida que son bien conocidos, por ejemplo, en la síntesis de péptidos.
Los compuestos de fórmula I pueden ser preparados, por ejemplo, por el método A descrito en los Esquemas 2 y 3, en los cuales los radicales R(1), R(2), R(3), R(4), R(5) y R(6) están definidos tal como se ha indicado antes.
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Esquema 2
7
El ácido de Meldrum III puede ser alquilado empleando una base tal como el carbonato potásico, el hidróxido de sodio, o la trietilamina, y IV, en donde
LG es un grupo eliminable, por ejemplo un halógeno o un grupo hidroxi sustituido, tal como tosiloxi o mesiloxi;
R(3a) es fenilo que está sustituido con R(23);
R(23) es N(R(24))_{2}, nitro o ciano;
R(24) es alquilo C_{1}-C_{6}, (aril C_{6}-C_{10})-(alquilo C_{1}-C_{4}), (alquil C_{1}-C_{6})-carbonilo, ó (alcoxi C_{1}-C_{6})-carbonilo;
para proporcionar V, o mediante condensación del ácido de Meldrum III con el aldehído IVa en presencia de un agente reductor, por ejemplo cianoborohidruro de sodio,
mientras que la apertura del anillo de V se puede conseguir por reacción de una amina VI, preferiblemente en presencia de un agente sililante, por ejemplo N,O-bis-(trimetilsilil)-acetamida en un disolvente orgánico, por ejemplo en diclorometano a reflujo, para proporcionar la amida de ácido malónico VII.
Los compuestos de fórmulas III, IV, IVa, y VI están disponibles comercialmente, o bien se pueden preparar mediante procedimientos corrientes, que son conocidos para los especialistas en la técnica.
Esquema 3
8
La copulación de VII con VIII, en donde R(25) es un éster fácilmente escindible (por ejemplo alquilo C_{1}-C_{4}, bencilo, o 4-metoxibencilo), para proporcionar IX, puede llevarse a cabo mediante reactivos copulantes comunes empleados en la síntesis de péptidos. Estos reactivos copulantes son, por ejemplo, carbodiimidas tales como diciclohexilcarbodiimida (DCCI) o diisopropilcarbodiimida (DICI), carbonildiazoles tales como carbonildiimidazol y reactivos similares, anhídrido propilfosfónico, tetrafluoroborato de O-((ciano-(etoxicarbonil)-metilen)amino)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TOTU), N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-1-il-metilen]-N-metilmetanaminio (HATU), y muchos otros. Los compuestos de fórmula VIII están disponibles comercialmente, o bien se pueden preparar mediante procedimientos corrientes, que son conocidos para los especialistas en la técnica.
En caso necesario, la conversión de R(3a) en R(3) (IX \rightarrow X) puede llevarse a cabo mediante la introducción de un grupo amidino tal como se describe más adelante, o mediante la reducción de un grupo nitro por hidrogenación con, por ejemplo, níquel-Raney, paladio/carbón, u otros catalizadores, en presencia de hidrógeno.
Se pueden preparar amidinas a partir de los cianocompuestos correspondientes, mediante la adición de alcoholes, por ejemplo metanol o etanol, en medio ácido anhidro, por ejemplo dioxano, metanol o etanol, y posterior aminólisis, por ejemplo tratamiento con amoníaco en alcoholes tales como, por ejemplo, isopropanol, metanol o etanol (G. Wagner, P. Richter y Ch. Garbe, Pharmazie 29 (1974), 12-55). Otros métodos de preparar amidinas son la adición de sulfuro de hidrógeno al grupo ciano, seguida de alquilación, por ejemplo metilación, de la tioamida resultante, y posterior reacción con amoníaco (patente de la RDA número 235 866), y la adición de hidroxilamina que puede obtenerse de una sal de hidroxilamonio con una base, al grupo ciano, seguida de la conversión de la amidoxima a la amidina, por ejemplo mediante hidrogenación catalítica.
La saponificación del éster de los compuestos de fórmula X para proporcionar compuestos de fórmula IX puede llevarse a cabo mediante métodos habituales. La copulación de XI con XII para proporcionar compuestos de fórmula I puede llevarse a cabo con reactivos copulantes tales como los antes descritos. Los compuestos de fórmula XII están disponibles comercialmente, o bien se pueden preparar mediante procedimientos corrientes, que son conocidos para los especialistas en la técnica.
Los compuestos de fórmula I pueden obtenerse también mediante el método B tal como se ilustra en los Esquemas 4 y 5.
Esquema 4
9
Tras haber protegido la función carboxilo con un grupo protector PG fácilmente escindible (tal como, por ejemplo, alquilo C_{1}-C_{4}, bencilo, o 4-metoxibencilo), mediante métodos habituales, el radical R(3a) de los compuestos de fórmula VII puede ser transformado en el radical R(3), y puede ser desprotegido tal como se ha bosquejado antes, para proporcionar compuestos de fórmula XIII.
Esquema 5
10 
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El aminoácido protegido XIV, en donde PG es un grupo protector de amino adecuado, por ejemplo Fmoc, benciloxicarbonilo (Z), ó Boc, con preferencia Fmoc, puede ser copulado mediante métodos habituales tales como los descritos más arriba, con compuestos de fórmula XII para proporcionar compuestos de fórmula XV. Los compuestos de fórmula XIV pueden ser preparados mediante procedimientos habituales, que son conocidos para los especialistas en la técnica.
Los compuestos de fórmula XV pueden ser desprotegidos mediante métodos habituales, por ejemplo mediante métodos habituales para la desprotección de Fmoc (L.A. Carpino y otros, J. Org. Chem. 1988, 53, 6139-44), para proporcionar compuestos de fórmula XVI. Los compuestos de fórmula XVI pueden ser copulados con compuestos de fórmula XIII mediante métodos habituales, para proporcionar compuestos de fórmula I.
También se pueden obtener compuestos de fórmula I mediante síntesis de péptidos en fase sólida (método C) tal como se ilustra en el Esquema 6. Estos métodos han sido descritos, por ejemplo, por Steward y Young (Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman and Co., San Francisco, 1969), que queda incorporado en la presente memoria por referencia.
Cuando se emplean métodos de síntesis en fase sólida, se puede manipular la composición química de un compuesto mientras el péptido naciente está unido a la resina o una vez que el péptido ha sido escindido de la resina para obtener, por ejemplo, un derivado N-terminal. También se pueden realizar modificaciones similares a un grupo carboxilo de un compuesto, por ejemplo se puede amidar un grupo carboxilo de un extremo C-terminal. Un especialista en la técnica puede sintetizar también un compuesto de la invención empleando química orgánica en fase de solución.
Esquema 6
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11 
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Empleando este método (C) (Esquema 6), se pueden copular compuestos de fórmula XVIII, en la cual un aminoácido está copulado a un soporte adecuado, que es por ejemplo una resina Wang, de tritilo o Rink, u otras resinas escindibles con ácido que son conocidas para un especialista en la técnica, y en donde
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R(26) es -(CH_{2})_{3}-NR(28)-C(=N-R(27))-NH-R(28),
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R(27) es R(28), ciano, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{6}, (aril C_{6}-C_{14})-(alcoxi C_{1}-C_{6}) que está sin sustituir o bien está sustituido en el resto arilo, o amino;
R(28) es hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, o (alquil C_{1}-C_{6})-carbonilo;
puede ser copulado con, por ejemplo, un aminoácido (XVII) protegido con Fmoc, empleando técnicas habituales. No obstante, también es posible el uso de aminoácido XVII protegido de otra manera, pero se prefiere el uso de aminoácido XVII protegido con Fmoc.
Los compuestos de fórmula XVIII, pueden ser preparados mediante procedimientos habituales, que son conocidos para los especialistas en la técnica.
El dipéptido XIX resultante puede ser desprotegido por medio de una base, por ejemplo una solución de piperidina al 20-50% en dimetilformamida, para obtener compuestos de fórmula XX con un grupo amino primario o secundario, que puede ser copulado a los bloques de construcción VII ó XIII, preparados mediante los métodos A y B para proporcionar compuestos de fórmula XXI ó XXII. La conversión del radical R(3a) del compuesto XXI resultante, en el radical R(3) se puede realizar tal como se ha descrito antes, para proporcionar compuestos de fórmula XXII. Se pueden obtener compuestos de fórmula I escindiendo compuestos de fórmula XXII en condiciones ácidas, por ejemplo ácido trifluoroacético/agua en distintas concentraciones, que varían de 1% a 95% de ácido trifluoroacético dependiendo de la resina usada.
Estos compuestos sintetizados pueden ser purificados empleando métodos bien conocidos tales como la cromatografía líquida de alta presión en fase invertida (siglas inglesas RP-HPLC), u otros métodos de separación basados, por ejemplo, en el tamaño, la carga o la hidrofobicidad del compuesto. De manera similar, para caracterizar la estructura de un compuesto de la invención se pueden utilizar métodos bien conocidos tales como el análisis de secuencia de aminoácidos o la espectrometría de masas (MS ó HPLC/ESMS) (véase el Ejemplo 1).
Tal como se demuestra en los ensayos farmacológicos que se describen a continuación, los compuestos de fórmula I inhiben la actividad de factor Xa. Por tanto, se pueden utilizar ventajosamente como agentes farmacéuticos, en especial cuando se desee reducir la actividad de factor Xa, o para producir efectos que se puedan conseguir inhibiendo la actividad de factor Xa en un sistema, por ejemplo para influir en la coagulación o para inhibir la coagulación sanguínea. Así, la presente invención se refiere también a los compuestos de fórmula I para uso como agentes farmacéuticos, así como a la producción de medicamentos, en especial de medicamentos para el tratamiento o la profilaxis de los estados y enfermedades mencionadas a continuación y en lo que antecede. Además, la presente invención proporciona un método para inhibir específicamente la actividad de factor Xa, poniendo en contacto factor Xa con un compuesto de fórmula I. Más específicamente, una cantidad eficaz de un compuesto de la invención inhibe la actividad catalítica de factor Xa, bien sea directamente, dentro del complejo de protrombinasa o como una subunidad soluble, inhibiendo el ensamblaje del factor Xa dentro del complejo de protrombinasa. Una realización preferida de la invención comprende aquellos compuestos de fórmula I que pueden inhibir la actividad de factor Xa con una K_{i} \leq 10 \muM, preferiblemente con una K_{i} \leq 100 nM.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "actividad de factor Xa" se refiere a la capacidad del factor Xa, por sí mismo o dentro del conjunto de subunidades conocido como complejo de protrombinasa, para catalizar la conversión de protrombina a trombina. Cuando se utiliza en relación con la actividad de factor Xa, el término "inhibición" incluye tanto la inhibición directa como la inhibición indirecta de la actividad de factor Xa. La inhibición directa de la actividad de factor Xa se puede conseguir, por ejemplo, mediante la fijación de un compuesto de la invención a factor Xa o a protrombinasa, para evitar la fijación de protrombina al sitio activo del complejo de protrombinasa. La inhibición indirecta de la actividad de factor Xa se puede conseguir, por ejemplo, mediante la fijación de un compuesto de la invención a factor Xa soluble, de manera que se impide su incorporación al complejo de protrombinasa. Tal como se emplea en la presente invención, el término "específico", cuando se utiliza en relación con la inhibición de la actividad de factor Xa, significa que un compuesto de fórmula I puede inhibir la actividad de factor Xa sin inhibir sustancialmente la actividad de proteasas de serina tales como, por ejemplo, trombina, tripsina o calicreína (utilizando la misma concentración de inhibidor). Estas proteasas están implicadas en la coagulación sanguínea y en la cascada de la fibrinólisis.
La inhibición de la actividad de factor Xa, o la inhibición de la producción de efectos que se consigue con dicha inhibición, pueden tener lugar in vivo, es decir, dentro de un individuo. Tal como se emplea en la presente memoria, el término "individuo" significa un animal vertebrado, estando incluidos los mamíferos tales como, por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo, un perro, un cerdo, un mono y, en especial, un ser humano, en los cuales el factor Xa está implicado en la cascada de la coagulación. También puede tener lugar fuera del organismo de un individuo, por ejemplo en una circulación extracorpórea o en el tratamiento de muestras de sangre de un individuo y, en general, in vitro. Son usos in vitro de los compuestos de fórmula I, por ejemplo, el uso como herramienta bioquímica en investigaciones científicas o analíticas, o el uso para el diagnóstico in vitro. Se puede emplear ventajosamente un compuesto de fórmula I como anticoagulante, que puede ser puesto en contacto con una muestra de sangre para evitar la coagulación. Por ejemplo, se puede poner en contacto una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I con una muestra de sangre recientemente extraída, para evitar la coagulación de la muestra de sangre.
Tal como se emplea en la presente memoria, cuando se utiliza la expresión "cantidad eficaz" en relación con este contexto, significa una cantidad de un compuesto de fórmula I que inhibe la actividad de factor Xa en el grado deseado. El especialista en la técnica reconocerá que la cantidad eficaz de un compuesto de la invención se puede determinar empleando los métodos descritos en la presente invención u otros métodos conocidos en la técnica.
A la vista de la utilidad descrita de los compuestos de fórmula I, el especialista en la técnica reconocerá también que un compuesto de la invención puede sustituir a un agente tal como la heparina. Este uso de un compuesto de fórmula I puede dar lugar, por ejemplo, a un ahorro de costes respecto a otros anticoagulantes.
En una realización adicional, la presente invención proporciona un método para inhibir factor Xa en un paciente que lo necesite, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad, eficaz como inhibidora de factor Xa, de un compuesto de fórmula I. Tal como se emplea en la presente memoria, el término "paciente" se refiere en especial a un animal de sangre caliente, entre ellos un mamífero, y en particular un ser humano. Un paciente necesita tratamiento para inhibir el factor Xa cuando dicho paciente sufre un estado morboso que puede ser influido beneficiosamente por la inhibición de la actividad de factor Xa, o bien un facultativo espera que sea influido beneficiosamente por la inhibición de la actividad de factor Xa.
La identificación de los pacientes que necesitan tratamiento para inhibir el factor Xa se encuentra enteramente dentro de la capacidad y el conocimiento de un especialista en la técnica. Un facultativo especializado en la técnica puede identificar fácilmente, mediante el empleo de ensayos clínicos, el examen físico, y la historia médico/familiar, a los pacientes que necesitan dicho tratamiento.
Dado que un compuesto de fórmula I puede inhibir la actividad de factor Xa, dicho compuesto puede ser utilizado para reducir o inhibir la coagulación sanguínea en un individuo. Así, la presente invención proporciona además un método para reducir o inhibir la formación de coágulos sanguíneos en un individuo, especialmente en un paciente que los necesita, administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I.
Una cantidad terapéuticamente eficaz con respecto a la producción en un individuo de un efecto tal como la inhibición o la reducción de la coagulación sanguínea, o una cantidad de un compuesto de fórmula I, eficaz como inhibidora de de factor Xa, significan la cantidad o la dosis de un compuesto de fórmula I que debe ser administrada a un individuo para conseguir o mantener el efecto deseado, o para inhibir la actividad de factor Xa en el individuo hasta el grado deseado. Esta cantidad o dosis eficaz que hay que administrar debe estar ajustada a las circunstancias individuales de cada caso. Puede determinarse fácilmente mediante el empleo de técnicas convencionales, utilizando los métodos descritos en la presente memoria u otros métodos conocidos en la técnica, y observando los resultados obtenidos en circunstancias análogas. A la hora de determinar la dosis eficaz se considerarán diversos factores, que incluyen, pero sin quedar limitados a éstos: la especie del paciente; su tamaño, edad y estado de salud general; la enfermedad específica de que se trate; el grado de afección o la extensión o gravedad de la enfermedad; la respuesta del paciente individual; el compuesto particular administrado; el modo de administración; las características de biodisponibilidad de la preparación farmacéutica administrada; la posología elegida; y el uso simultáneo de otra medicación. La dosis apropiada se puede establecer aplicando criterios clínicos bien conocidos en la técnica
médica.
En general, a la vista de los factores precedentes, resulta evidente que la cantidad inhibidora eficaz de factor Xa de un compuesto de fórmula I, o la cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I, variarán, y podrán ser hechas variar dentro de amplios límites. Usualmente, una cantidad eficaz abarcará de aproximadamente 0,01 miligramos por kilogramo de peso corporal y día (abreviado mg/kg y por día) hasta aproximadamente 20 mg/kg y por día. Se prefiere una dosis diaria de aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. Estos datos se refieren a una persona de aproximadamente 75 kg de peso corporal. En particular, cuando se administran cantidades relativamente grandes, puede ser favorable subdividir la dosis diaria en varias administraciones de subdosis, por ejemplo en 2, 3 ó 4 administraciones de subdosis.
Se puede administrar un compuesto de fórmula I a un individuo para tratar diversos estados clínicos, entre ellos, por ejemplo, el tratamiento y profilaxis de trastornos cardiovasculares o complicaciones asociadas, por ejemplo, a infecciones o intervenciones quirúrgicas. Los ejemplos de trastornos cardiovasculares incluyen la restenosis, por ejemplo restenosis posterior a angioplastia, la profilaxis de la reoclusión, estados posteriores a operaciones de derivación coronaria, estados morbosos arteriales, venosos y microcirculatorios, infarto cardíaco, angina de pecho, enfermedades tromboembólicas, trombosis, embolismo, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, fracaso multiorgánico, infarto o trastorno de coagulación intravascular diseminada. Los ejemplos de complicaciones relacionadas con la cirugía incluyen, por ejemplo, trombosis de venas profundas y de venas proximales, que se pueden producir tras una intervención quirúrgica. Así, un compuesto de la invención es útil como medicamento para reducir o inhibir la coagulación sanguínea indeseada en un individuo.
Los compuestos de fórmula I, sus sales fisiológicamente aceptables, y otros derivados adecuados de los mismos, pueden ser empleados como medicamentos o agentes farmacéuticos en los métodos antes mencionados, por sí solos, en mezclas entre sí, o en forma de composiciones farmacéuticas que comprenden como ingrediente activo, una cantidad eficaz de al menos un compuesto de fórmula I y/o una sal fisiológicamente aceptable y/u otro derivado adecuado del mismo, mezclado o asociado de otro modo con uno o más sustancias vehiculantes y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables.
Para llevar a cabo el tratamiento de un paciente, los compuestos de fórmula I por sí solos o las composiciones farmacéuticas que los comprenden, pueden ser administrados en cualquier forma o de cualquier modo que haga que los compuestos de fórmula I se encuentren biodisponibles en cantidades eficaces, por ejemplo a través de la administración por vía oral y por vía parenteral. Por ejemplo, se pueden administrar por vía oral, por ejemplo en forma de píldoras, comprimidos, comprimidos barnizados, comprimidos revestidos, gránulos, cápsulas de gelatina dura y de gelatina blanda, soluciones, jarabes, emulsiones, suspensiones o mezclas para aerosol; por vía rectal, por ejemplo en forma de supositorios; por vía parenteral, por ejemplo por vía intravenosa, intramuscular, transdérmica, intranasal, o subcutánea; en forma de soluciones para inyección o soluciones para infusión, microcápsulas, implantes o varillas; por vía percutánea o por vía tópica, por ejemplo en forma de pomadas, soluciones o tinturas, o de otros modos, por ejemplo en forma de aerosoles o nebulizaciones nasales. Generalmente se prefiere la administración por vía oral, pero dependiendo del caso específico, también pueden ser favorables otros modos de administración: por ejemplo, en un estado agudo de una enfermedad, la administración intravenosa mediante inyección o infusión. Un especialista en la técnica de preparar formulaciones puede elegir fácilmente la forma y modo de administración adecuados, dependiendo del estado morboso que ha de tratarse, del avance de la enfermedad, y de otras circunstancias relevantes.
Las composiciones farmacéuticas o los medicamentos que comprenden un compuesto de fórmula I y/o una sal fisiológicamente aceptable y/u otro derivado adecuado de los mismos, pueden prepararse combinando los compuestos de fórmula I y/o una sal fisiológicamente aceptable y/u otro derivado adecuado de los mismos, con sustancias vehiculantes y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, cuya proporción y naturaleza vienen determinadas por la ruta de administración elegida y por la práctica farmacéutica habitual. Las composiciones farmacéuticas o medicamentos se preparan de una manera bien conocida en la técnica farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas contendrán, por regla general, una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I y/o una sal fisiológicamente aceptable y/u otro derivado adecuado de los mismos, junto con una cantidad adecuada de un vehículo, constituyendo así la dosificación adecuada para la administración a un individuo. Las composiciones farmacéuticas pueden estar adaptadas al uso por vía oral o por vía parenteral, y pueden ser administradas al paciente en forma, por ejemplo, de comprimidos, cápsulas, supositorios, soluciones, suspensiones, pomadas, tinturas, nebulizaciones nasales, mezclas para aerosol, implantes, varillas, microcápsulas, o similares. Así, junto con los compuestos que se reivindican, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas o medicamentos útiles para inhibir la actividad de factor Xa y la coagulación sanguínea en un individuo.
La presente invención abarca también un procedimiento para preparar composiciones farmacéuticas o medicamentos que comprenden al menos un compuesto de fórmula I y/o una sal fisiológicamente aceptable y/u otro derivado adecuado de los mismos, y abarca también el uso de los compuestos de fórmula I y/o sales fisiológicamente aceptables y/u otros derivados adecuados de los mismos, para preparar medicamentos, en especial medicamentos para el tratamiento o profilaxis de las enfermedades antes mencionadas.
Las sustancias vehiculantes y auxiliares farmacéuticamente aceptables son sustancias o composiciones que no son tóxicas para el individuo o bien tienen una toxicidad aceptable determinada por la agencia reguladora apropiada. La sustancia vehiculante o excipiente puede ser un material sólido, semisólido, o líquido, que puede servir como vehículo o medio para el ingrediente activo. Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" comprende cualquiera de los vehículos farmacéuticos habituales, tales como vehículos líquidos, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato, agua, una emulsión tal como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite, o bien vehículos sólidos o semisólidos tales como, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz, grasas, ceras, etc. Los vehículos farmacéuticos adecuados y sus formulaciones son bien conocidos en la técnica, y han sido descritos, por ejemplo, por Martin en Remington´s Pharmaceutical Sciences, 15ª edición (Mack Publishing Co., Easton 1975), que queda incorporado en la presente memoria por referencia, y también con respecto a otros aspectos de los ingredientes y la preparación de composiciones farmacéuticas.
Son ejemplos de sustancias auxiliares: cargas, desintegrantes, aglutinantes, deslizantes, agentes humectantes, estabilizadores, emulsionantes, conservantes, edulcorantes, colorantes, saborizantes, agentes aromatizantes, espesantes, diluyentes, sustancias tamponadoras, agentes solubilizantes, agentes para conseguir un efecto de liberación lenta, sales para alterar la presión osmótica, agentes de revestimiento, antioxidantes, etc.
Para la administración por vía oral, se pueden incorporar a los compuestos de fórmula I excipientes o diluyentes inertes, o vehículos comestibles, y se pueden emplear en forma de, por ejemplo, comprimidos, comprimidos con película, comprimidos revestidos, píldoras, trociscos, cápsulas, gránulos, soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires, jarabes, obleas, gomas de mascar y similares, o bien se pueden introducir en cápsulas de gelatina. Las composiciones farmacéuticas para administración por vía oral pueden variar dependiendo de la forma particular. Usualmente contienen al menos 1% del ingrediente activo de fórmula I, y pueden contener convenientemente hasta aproximadamente 90% del peso de la unidad. Preferiblemente, el contenido de compuestos de fórmula I y/o de sales fisiológicamente aceptables y/u otros derivados adecuados, se sitúa de aproximadamente 4% a aproximadamente 70% en peso. La cantidad de ingrediente activo presente en la composición es tal que se obtiene una forma de dosificación unitaria adecuada para la administración.
Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener también, por ejemplo, uno o más de las siguientes sustancias vehiculantes y auxiliares: aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes desintegrantes tales como ácido algínico, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato magnésico o Sterotex; deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; y se pueden añadir agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina, o agentes saborizantes tales como menta, salicilato de metilo, o sabor a naranja. Cuando la unidad de dosificación es una cápsula puede contener, además de los materiales del tipo citado, un vehículo líquido tal como polietilenglicol o un aceite graso. Otras formas de dosificación unitarias pueden contener otros diversos materiales que modifican la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo revestimientos. Así, los comprimidos o las píldoras pueden estar revestidos con azúcar, goma laca, u otros materiales de revestimiento entérico. Un jarabe puede contener, además del ingrediente activo, por ejemplo sacarosa como agente edulcorante y algunos conservantes, tintes, colorantes y sabores.
Para la administración por vía parenteral, los compuestos de fórmula I y/o sales fisiológicamente aceptables y/u otros derivados adecuados de los mismos, pueden ser incorporados a una solución o a una suspensión. Las soluciones o suspensiones pueden incluir también, por ejemplo, uno o más de las siguientes sustancias vehiculantes y auxiliares: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos; agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El contenido de los compuestos de fórmula I dentro de las preparaciones para la administración por vía parenteral puede variar. Estas contienen usualmente al menos 0,1% en peso del compuesto de fórmula I. Preferiblemente, el contenido de compuesto de fórmula I y/o de sales fisiológicamente aceptables y/o de otros derivados adecuados del mismo, se sitúa en aproximadamente 0,1% a 50%. Las preparaciones parenterales pueden ser envasadas en ampollas, jeringas desechables, viales de dosis múltiple fabricados de vidrio o de plástico, o frascos para infusión. Los excipientes adecuados para microcápsulas, implantes y varillas son, por ejemplo, polímeros mixtos de ácido glicólico y ácido láctico.
Los materiales utilizados para preparar las diversas composiciones farmacéuticas deben ser farmacéuticamente puros y no tóxicos en las cantidades utilizadas.
Además de uno o más compuestos de fórmula I y/o uno o más sales fisiológicamente aceptables de los mismos y/o uno o más de otros derivados adecuados de los mismos como compuestos activos, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden contener también uno o más compuestos farmacológicamente activos.
En otra realización más general, la presente invención proporciona composiciones que comprenden al menos un compuesto de fórmula I y/o sales de los mismos y/u otros derivados adecuados de los mismos, mezclados o asociados de otro modo con uno o más vehículos inertes. Estas composiciones son útiles, por ejemplo, como patrones de valoración, como medios convenientes de preparar envíos a granel, o como composiciones farmacéuticas. Una cantidad valorable de un compuesto de fórmula I es una cantidad que es fácilmente medible mediante procedimientos y técnicas de ensayo habituales, tal como es bien sabido y apreciado por los especialistas en la técnica. La cantidad valorable de un compuesto de fórmula I variará en general de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 90% en peso de la composición. Los vehículos inertes pueden ser cualquier material que no se degrade ni reaccione covalentemente de otro modo con un compuesto de fórmula I. Son ejemplos de vehículos inertes adecuados el agua, tampones acuosos tales como, por ejemplo, los que son generalmente útiles en el análisis mediante cromatografía líquida de alta presión (siglas inglesas HPLC), disolventes orgánicos tales como acetonitrilo, acetato de etilo, hexano y similares; y vehículos y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos de fórmula I pueden ser utilizados también como materiales de partida o intermedios químicos en la preparación de otros compuestos, en especial en la preparación de otros compuestos farmacológicamente activos. A continuación se ofrecen ejemplos de dichas conversiones de compuestos de la invención en otros compuestos de la invención. Para este uso, además de los compuestos de fórmula I y de sus sales fisiológicamente aceptables, pueden ser útiles también otras sales de los compuestos de fórmula I que no sean adecuadas, o sean menos adecuadas, para el uso como agentes farmacéuticos. Así, la presente invención se refiere también a compuestos de fórmula I y a sus sales en general como intermedios químicos, en especial como intermedios en la preparación de compuestos farmacológicamente activos.
Los siguientes ensayos sirven para investigar la actividad farmacológica y para ilustrar la utilidad de los compuestos de la presente invención como inhibidores de factor Xa.
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Ensayo 1
Inhibición in vitro de enzimas de coagulación purificadas seleccionadas, y de otras proteasas de serina
Se puede evaluar la capacidad de un compuesto de fórmula I para inhibir factor Xa, trombina, plasmina, elastasa y tripsina, determinando la concentración de compuesto de fórmula I que inhibe la actividad de la enzima en un 50% (CI_{50}). Se emplean enzimas purificadas en ensayos cromogénicos. Para determinar la constante de inhibición, se corrige el valor de CI_{50} teniendo en cuenta la competición con el sustrato, mediante la fórmula:
K_{i} = CI_{50} x (1/{1+ ((concentración de sustrato)/Km de sustrato )})
en donde Km es la constante de Michaelis-Menten (véase Y.-C. Chen y W.H. Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3018 (1973), que queda incorporado en la presente por referencia).
a. Ensayo para factor Xa
Para este ensayo se utiliza tampón TBS-PEG (Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 200 mM, PEG-8000 al 0,05% (peso/volumen), NaN_{3} al 0,02% (peso/volumen)). Se determina la CI_{50} combinando en pocillos apropiados de una placa de microvaloración Costar de media superficie, 25 \mul de factor Xa humano (Enzyme Research Laboratories, Inc.; South Bend, IN) en TBS-PEG; 40 \mul de DMSO al 10% (volumen/volumen) en TBS-PEG (testigo no inhibido), o diversas concentraciones del compuesto a ensayar diluido en DMSO al 10% (v/v) en TBS-PEG; y sustrato S-2765 (N-benciloxicarbonil-D-Arg-Gly-L-Arg-p-nitroanilida; Kabi Pharmacia, Inc.; Franklin OH) en TBS-PEG.
Los ensayos se llevan a cabo preincubando el compuesto de fórmula I más enzima durante 10 minutos, y después se inicia el ensayo añadiendo sustrato para obtener un volumen final de 100 \mul. Se mide la velocidad inicial de hidrólisis del sustrato cromogénico mediante el cambio en la absorbancia a 405 nm utilizando un lector cinético de placas de Bio-tek Instruments (Ceres UV900HDi) a 25°C durante la porción lineal del curso del tiempo (usualmente 1,5 minutos después de la adición de sustrato). Después de representar gráficamente las velocidades relativas de hidrólisis (comparadas con el testigo sin inhibir) frente al logaritmo de la concentración de compuesto de fórmula I, se predice mediante regresión lineal la concentración de inhibidor que provoca una disminución de 50% en la velocidad de hidrólisis de sustrato. La concentración de enzima es 0,5 nM, y la concentración de sustrato es 140 \muM.
b. Ensayo de Trombina
Para este ensayo se utiliza tampón TBS-PEG. La CI_{50} se determina de la misma manera que para el factor Xa, salvo porque el sustrato es S-2366 (L-PyroGlu-L-Pro-L-Arg-p-nitroanilida; Kabi) y la enzima es trombina humana (Enzyme Research Laboratories, Inc.; South Bend, IN). La concentración de enzima es 175 \muM.
c. Ensayo de plasmina
Para este ensayo se utiliza tampón TBS-PEG. La CI_{50} se determina de la misma manera que se ha descrito antes para el factor Xa, salvo porque el sustrato es S-2251 ((D)-Val-L-Leu-L-Lys-p-nitroanilida; Kabi) y la enzima es plasmina humana (Kabi). La concentración de enzima es 5 nM y la concentración de sustrato es 300 \muM.
d. Ensayo de tripsina
Para este ensayo se utiliza tampón TBS-PEG que contiene CaCl_{2} 10 mM. La CI_{50} se determina de la misma manera que se ha descrito antes en el ensayo del factor Xa, salvo porque el sustrato es BAPNA (benzoil-L-Arg-p-nitroanilida; Sigma Chemical Co.; St. Louis MO) y la enzima es tripsina pancreática bovina (tipo XIII, tratada con TPCK; Sigma). La concentración de enzima es 50 nM y la concentración de sustrato es 300 \muM.
e. Ensayo de elastasa
Para este ensayo se utiliza tampón con Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 300 mM, N-metil-pirrolidona al 2% (volumen/volu-
men), NaN_{3} al 0,01% (peso/volumen)). La CI_{50} se determina de la misma manera que se ha descrito antes en el ensayo del factor Xa, salvo porque el sustrato es succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (Calbiochem-Nova Biochem Corp.; San Diego CA) y la enzima es elastasa neutrófila humana (Athens Research and Technology, Inc.; Athens GA). La concentración de enzima es 75 nM y la concentración de sustrato es 600 \muM. El compuesto testigo es "TENSTOP" (éster metílico de N-alfa-tosil-Gly-p-amidinofenilalanina; American Diagnostica, Inc.; Greenwish CT), que es un inhibidor reversible de factor Xa (véanse los artículos de Stuerzebecher y otros, Thromb. Res. 54; 245-252 (1989); Hauptmann y otros, Thromb. Haem. 63: 220-223 (1990), cada uno de los cuales queda incorporado en la presente memoria por referencia).
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Ensayo 2
Pruebas para determinar la inhibición de la coagulación
Se puede evaluar la eficacia de los compuestos de fórmula I mediante el tiempo de protrombina (siglas inglesas PT) in vitro, empleando plasma combinado de varios donantes humanos. Se puede utilizar también un ensayo ex vivo en el cual se extrae plasma a diversos intervalos tras la administración intravenosa (iv) de un compuesto de fórmula I a ratas o a conejos, o tras la administración intraduodenal (id) a ratas, y se analiza mediante la prueba del PT para determinar la semivida plasmática. La prueba de PT se inicia con una dilución de tromboplastina elegida de manera que se obtiene un punto final de coagulación prolongado y sumamente reproducible, lo que se conoce como "ensayo de PT diluido", tal como se describe más adelante. También se puede determinar la eficacia de diversos compuestos empleando un modelo de trombosis basado en una comunicación arteriovenosa in vivo en ratas.
a. Prueba de tiempo de protrombina diluida in vitro
En el vaso de un fibrómetro (Baxter Diagnostics, Inc.; McGaw Park IL) se disponen 100 \mul de plasma pobre en plaquetas (PPP) humano, mezcla de varios orígenes, y precalentado (a 37°C). Se añaden 50 \mul de diversas concentraciones de un compuesto de fórmula I en TBS-BSA con calcio (Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, albúmina sérica de bovino al 0,1% (peso/volumen), CaCl_{2} 20 mM). En experimentos testigo se añadió TBS-BSA con calcio pero sin compuesto de prueba de fórmula I, para medir el tiempo de coagulación no inhibido. Se añadieron al vaso del fibrómetro 150 \mul de tromboplastina de conejo (Baxter) diluida y precalentada, y se puso en marcha el temporizador del fibrómetro. Antes de tratar con el compuesto se obtuvo una curva de dilución de la tromboplastina de conejo, y se empleó para elegir una dilución de tromboplastina que permitiese un tiempo PT de aproximadamente 30 segundos en los testigos sin inhibir. A partir de los tiempos de la curva de dilución se calculó la concentración experimental que produjo 50% de inhibición de la coagulación (CE_{50}) con el compuesto de prueba.
De manera alternativa, se llevó a cabo un ensayo de tiempo de protrombina diluida, utilizando el modo de "investigación" de un instrumento de coagulación automatizado ACL3000-plus de Instrumentation Laboratories (IL; Milán, Italia). Se diluyó tromboplastina hasta conseguir un tiempo de coagulación de 30-35 segundos. Se tomó este tiempo de coagulación como 100% de actividad. Se construyó una curva patrón para la calibración mediante una serie de diluciones a concentración mitad del reactivo de tromboplastina diluido (tromboplastina de cerebro de conejo marca IL). Durante el ensayo se mezcló una muestra de 50 \mul (plasma separado por centrifugación) con 100 \mul de reactivo de tromboplastina, y se realizaron lecturas nefelométricas durante 169 segundos. Se determinó el tiempo de coagulación a partir de la velocidad máxima de cambio de la dispersión de la luz calculada por el instrumento. Se expresó la inhibición como porcentaje de la actividad, determinado por comparación con la curva de calibración.
b. Ensayo de tiempo de protrombina diluida ex vivo
Se administró un compuesto de prueba de fórmula I por vía intravenosa (iv), o bien a través de la vena caudal (en ratas) o a través de la vena auricular (en conejos) siguiendo un protocolo aprobado. Se extrajeron muestras de sangre de 0,5 ml a intervalos especificados, después de haber administrado un compuesto de prueba de fórmula I en la arteria carótida canulada (en ratas) o en la arteria auricular, también canulada (en conejos). Tras centrifugar para obtener PPP, se conservó inmediatamente en hielo el plasma, o se congeló.
Para determinar el tiempo de protrombina diluido, se precalentó el plasma y se valoró de la manera antes descrita. Se calculó el porcentaje de inhibición a partir de una curva de dilución de tromboplastina, determinada junto a cada serie de muestras, y se utilizó para determinar el tiempo en el cual queda en el plasma aproximadamente 50% de la actividad anticoagulante inicial (T_{1/2}).
También se pueden administrar los compuestos de prueba de fórmula I a ratas empleando un protocolo de dosificación intraduodenal. Siguiendo un protocolo aprobado se anestesiaron ratas Sprague-Dawley machos que pesaban aproximadamente 300 g, con una combinación de ketamina/xilazina, por vía subcutánea. Se canuló la arteria carótida derecha para extraer sangre. Se realizó una laparotomía, y se canuló el duodeno con una aguja con punta esférica, sujetándola mediante una ligadura para asegurar que la sutura se encontrase en posición distal respecto al punto de inserción. Se colocó otra ligadura adicional en posición proximal al punto de inserción, para evitar la pérdida de contenido gástrico. Al término de cada experimento se confirmó la eficacia de la sutura para evitar que el compuesto llegase al punto de inserción, realizando una prueba con presión. El punto de inserción estaba situado aproximadamente a 4 cm de la unión duodeno-estómago. Los compuestos fueron administrados en 1 ml de solución salina normal. Se extrajo una muestra de 0,7 ml de sangre antes de la administración del compuesto de prueba de fórmula I, y transcurridos 15, 30, 60, 90 y 120 minutos desde la administración. Se separó el plasma mediante centrifugación, y se determinó la inhibición de la coagulación utilizando el ensayo de tiempo de protrombina diluida.
c. Modelo de trombosis mediante comunicación arteriovenosa en ratas
Se puede evaluar la eficacia antitrombótica de diversos compuestos de la invención utilizando una comunicación arteriovenosa (AV) extracorpórea en ratas. El circuito de la comunicación AV consistía en un tubo de polietileno (PE) 60, de 20 cm de longitud, insertado en la arteria carótida derecha, un tubo de PE 160 de 6 cm de longitud que contenía una hebra de 6,5 cm de longitud de algodón mercerizado (5 cm expuestos al flujo sanguíneo), y un segundo tramo de tubo de PE 60 (20 cm), que completaba el circuito hasta la vena yugular izquierda. Antes de insertarlo, se llenó todo el circuito con solución salina normal.
Los compuestos de prueba de fórmula I se administraron mediante infusión continua en la vena caudal, empleando una bomba de jeringa y un catéter de mariposa (volumen de infusión 1,02 ml/hora). Se administró el compuesto durante 30 minutos, después se abrió la comunicación, y se dejó que la sangre circulase durante un período de 15 minutos (en total 45 minutos de infusión). Al término del período de 15 minutos, se cerró con pinzas la comunicación, se extrajo cuidadosamente la hebra, y se pesó en una balanza analítica.
El porcentaje de inhibición de formación de trombo se calculó a partir del peso de trombo obtenido en ratas testigo que habían sido infundidas con solución salina.
La Tabla 1 ofrece a continuación las actividades inhibidoras de factor Xa (valores Ki) de compuestos de fórmula I seleccionados (la determinación de la actividad inhibidora de los compuestos se realizó empleando el ensayo de factor Xa in vitro antes descrito (Ensayo 1a)).
TABLA 1 Actividad inhibidora de Factor Xa (valores Ki)
Ejemplo Ki(FXa) [\muM]
3 0,1558
5 0,0006
6 0,0010
8 0,0351
13 0,0218
16 2,29
18 0,047
20 0,153
28 1,1
30 0,0107
38 0,0021
40 0,0575
43 0,957
48 4,3
56 0,0393
63 1,7
66 0,04
89 0,36
93 0,01
97 0,011
105 0,001
Ejemplos
Los siguientes ejemplos presentan síntesis típicas de compuestos de fórmula I. Se pretende que estos ejemplos sean sólo ilustrativos, y no están destinados a limitar en modo alguno el alcance de la presente invención. Los compuestos de los ejemplos han sido caracterizados mediante los espectros de masas (MS) y/o espectros de RMN, y/o su punto de fusión. En algunos casos, cuando en el paso final de la síntesis de un compuesto se ha empleado un ácido tal como el ácido trifluoroacético o el ácido acético, por ejemplo cuando se ha empleado ácido trifluoroacético para eliminar un grupo terbutilo, o cuando se ha purificado un compuesto mediante cromatografía utilizando un eluyente que contenía dicho ácido, y dependiendo del procedimiento de elaboración, por ejemplo de los detalles de un proceso de liofilización, se ha obtenido el compuesto parcial o completamente en forma de una sal del ácido empleado, por ejemplo en forma de la sal con ácido acético o la sal con ácido trifluoroacético, o la sal con ácido clorhídrico.
Ejemplo 1 Método general para la síntesis de derivados de ácido malónico en fase sólida
Para producir la mayoría de los compuestos de esta invención se empleó la síntesis general de péptidos en fase sólida. Estos métodos han sido descritos, por ejemplo, por Steward y Young en su texto Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman and Co., San Francisco, 1969), que queda incorporado en la presente por referencia.
A menos que se indique otra cosa, los compuestos fueron sintetizados en resina de poliestireno reticulada con 1% de divinilbenceno. Se unió al soporte sólido un enlazador sensible a ácidos (enlazador de Rink) (véanse las publicaciones de Rink, Tetr. Lett. 28:3787 (1987); Sieber, Tetr. Lett. 28:2107 (1987), cada una de las cuales queda incorporada en la presente memoria por referencia). Todos los compuestos fueron sintetizados en un sintetizador peptídico semiautomatizado construido artesanalmente. Los derivados de aminoácidos L y D protegidos con Boc y con Fmoc procedían de diversas fuentes comerciales tales como Advanced Chem Tech (Louisville, KY 40228-9973, EE.UU.); Bachem (King of Prusia, PA 19406, EE.UU.) y PerSeptive Biosystems (Framingham, MA 01701, EE.UU.).
La síntesis de los compuestos de fórmula I se llevó a cabo según la metodología Fmoc clásica (E. Atherton y R.C. Sheppard, en "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", IRL Press, Oxford, Inglaterra, 1989) empleando diisopropilcarbodiimida y benzotriazol-1-ol como reactivos activantes. Todas las copulaciones se llevaron a cabo en dimetilformamida o en dimetilformamida:diclorometano (mezcla 1:1), a temperatura ambiente y durante 40 minutos. El avance de la copulación se controló mediante el ensayo con ninhidrina tal como ha sido descrito por Kaiser (Kaiser y otros, Anal. Biochem. 34:595 (1970), que queda incorporado en la presente por referencia). En los casos en que la copulación quedó incompleta en el primer intento, se realizó una segunda copulación (doble).
Una vez completado el ensamblaje del péptido en la resina, se llevó a cabo la desprotección final del grupo Fmoc, seguida de los ciclos normales de lavado y de la determinación a 302 nm de la cantidad de grupo Fmoc eliminado por la desprotección. Después se copularon de manera similar los derivados de ácido malónico mediante el procedimiento de diisopropilcarbodiimida/benzotriazol-1-ol. Se lavó la resina acabada, sucesivamente, con diclorometano, dimetilformamida y diclorometano, después se secó bajo vacío y se empleó en el paso siguiente.
Síntesis de amidoximas en fase sólida
El procedimiento general consistió en mezclar la resina (procedente del paso antes indicado) de la sustancia que contenía nitrilo, y 20-40 equivalentes de hidrocloruro de hidroxilamina en presencia de una mezcla 1:1:1 (en volumen) de trietilamina, piridina y dimetilformamida. Usualmente se sonicó la suspensión durante aproximadamente 30 segundos, y se agitó por sacudidas a temperatura ambiente, durante 12-24 horas. El avance de la conversión de nitrilo a amidoxima fue controlado, o bien mediante FT-IR (pastilla de KBr), siguiendo la desaparición de la absorción de -CN a 2225 cm^{-1}, o bien escindiendo con ácido trifluoroacético:H_{2}O (95:5) o con reactivo K (véase más adelante) una pequeña muestra de la resina, y determinando el peso molecular mediante espectrometría de masas por electrospray. Antes de su uso en el paso siguiente, se lavó la resina acabada con dimetilformamida, con 10% de H_{2}O en dimetilformamida, con etanol y con diclorometano, y se secó en vacío.
Síntesis de amidinas en fase sólida
Se han publicado varios métodos para la síntesis de compuestos que contienen amidina (véase una revisión en el texto de P.J. Dunn (1995) en "Comprehensive Organic Functional Group Transformations: Amidines and N-Substituted Amidines", volumen 5, 741-782 (compiladores Alan R. Katritzky, Otto Meth-Cohen y Charles W. Rees), Pergamon, N.Y., 1995). Ninguno de estos métodos era compatible con la síntesis orgánica en fase sólida. Los autores de la presente invención han desarrollado un procedimiento adecuado para la síntesis de amidinas a través de precursores de amidoxima mediante la reducción con trietilsilano en exceso, en presencia de catalizador soluble (diclorotetraquis(trifenilfosfina)rutenio (II), DCRu). Se ha hallado que la adición de trifenilfosfina en presencia de ácido acético facilita la reducción y mejora el rendimiento de compuestos de amidina. En un experimento típico se añadió la resina seca al cóctel de reducción compuesto por DCRu, trifenilfosfina, ácido acético, dimetilformamida y trietilsilano, en un matraz cerrado (véanse los Ejemplos 4/5). Normalmente, la reducción requiere 12-24 horas a temperatura ambiente. En caso de una reducción incompleta, se empleó una cantidad adicional de trietilsilano, y se prolongó 4-8 horas más el tiempo de reacción. La resina peptidomimética acabada fue lavada con dimetilformamida, con etanol, y con diclorometano, y se suspendió en cóctel de reactivo K (King y otros, Int. J. Pept. Prot. Res. 36:255-266 (1990)) (5 ml por gramo de resina con péptido) durante 180 minutos a temperatura ambiente. Después se filtró la mezcla de escisión hacia dietiléter anhidro, se aisló mediante filtración el precipitado sólido, se secó en vacío sobre gránulos de KOH sólido, se disolvió el material sólido en una mezcla 1:1 de ácido trifluoroacético al 0,1% en agua, y acetonitrilo, y se liofilizó.
Para purificar los compuestos de fórmula I, se disolvió una muestra de compuesto liofilizado crudo en una mezcla de ácido trifluoroacético acuoso al 0,1%, que contenía de 10% a 50% de acetonitrilo. Usualmente se filtró la solución de compuesto a través de una jeringa conectada a un filtro de nylon de 0,45 \mum "ACRODISC" 13 (Gleman Sciences; Ann Arbor MI). Se inyectó en una columna semipreparativa C_{18} (Vydac Protein and Peptide C18, 218TP1010; The Separation Group; Hesperia CA) un volumen adecuado de solución de peptidomimético filtrada. Mediante un aparato HPLC Beckman "SYSTEM GOLD" se mantuvo el caudal de una mezcla en gradiente o isocrática de tampón de ácido trifluoroacético al 0,1% y acetonitrilo (de calidad para HPLC) como eluyente. La elución del peptidomimético fue seguida mediante detección UV a 230 nm (Beckman, System Gold, Programmable Solvent Module 166 y Programmable Detector Module 166 controlados por el programa "SYSTEM GOLD"). Tras identificar mediante MS el pico correspondiente a cada diastereómero, se recogieron los compuestos, se liofilizaron, y se sometieron al análisis biológico. La espectrometría de masas (siglas inglesas MS) fue realizada con un instrumento SCIEX API III+. Además, la resonancia magnética nuclear (siglas inglesas NMR) fue realizada con un instrumento General Electric (300 MHz) o Bruker Advance DPX 300 (300 MHz). Para la NMR, las muestras se midieron típicamente en DMSO-d_{6} o en CDCl_{3} (Aldrich).
En el Esquema 6 se encuentra resumida la síntesis típica de compuestos individuales, y los siguientes Ejemplos ilustran los detalles experimentales.
Ejemplos 2 y 3
Sal con ácido trifluoroacético de N-[(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-(S)-ciclohexil-metil]-2-[4-(N-hidroxicarbamimidoil)-bencil]-N,N'-dimetil-malonamida, diastereómero más polar, y
sal con ácido trifluoroacético de N-[(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-(S)-ciclohexil-metil]-2-[4-(N-hidroxicarbamimidoil)-bencil]-N,N'-dimetil-malonamida, diastereómero menos polar
a) N-[(1-(S)-{Carbonil-(resina Rink)}-4-(bis-terc-butoxicarbonil-guanidino-butilcarba-moil)-(S)-ciclohexil-metil]-2-(R,S)-(4-ciano-bencil)-N,N'-dimetil-malonamida
Se copuló resina Rink desprotegida de Fmoc (210 mg, 0,16 mmol) a ácido 2-(Fmoc-amino)-4-(S)-(N,N'-bis-terc.-butoxicarbonil-guanidino)-butírico (326 mg, 0,5 mmol, 2 equivalentes), empleando benzotriazol-1-ol y diisopropilcarbodiimida (2 equivalentes de cada uno), tal como se indicó a grandes rasgos en el Ejemplo 1. Tras la desprotección de Fmoc, se copuló la resina con ácido (S)-ciclohexil-(Fmoc-amino)-acético (2 equivalentes), empleando las mismas condiciones de copulación. Tras la desprotección de Fmoc, se copuló la resina con ácido 2-(R,S)-(4-ciano-bencil)-N,N-dimetilmalonámico (45 mg, 0,17 mmol, 1,1 equivalentes) empleando diisopropilcarbodiimida/benzotriazol-1-ol (1,1 equivalentes de cada uno) en dimetilformamida durante 4 horas a temperatura ambiente. Mediante la prueba con ninhidrina se confirmó que la reacción se había completado. Se lavó la resina con dimetilformamida, con metanol y con diclorometano, y se secó en vacío durante 2-3 horas.
b) Trifluoroacetato de N-[(1-(S)-{carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-(S)-ciclohexil-metil]-2-(R)-[4-(N-hidroxicarbamimidoil)-bencil]-N',N'-dimetil-malonamida
y
Trifluoroacetato de N-[(1-(R)-{carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-(S)-ciclohexil-metil]-2-(S)-[4-(N-hidroxicarbamimidoil)-bencil]-N',N'-dimetil-malonamida
Se transfirió la resina seca del paso (a) a un vial de 20 ml con tapón de rosca, y se mezcló con clorhidrato de hidroxilamina (350 mg, 5 milimoles, 25 equivalentes). Se añadió al vial de reacción una mezcla de trietilamina, piridina y dimetilformamida (1:1:1,8 ml), se tapó el vial, y se sonicó durante 30 segundos. Se agitó la solución por balanceo a temperatura ambiente durante una noche. De la manera mencionada en el Ejemplo 1 se verificó que la reacción se había completado. La resina acabada fue dividida en dos porciones. Se escindió una porción, y se elaboró de la manera bosquejada en el Ejemplo 1, para proporcionar el compuesto del título. El análisis mediante MS proporcionó un peso molecular de 573,4 (calculado 573,3). La segunda porción de la resina fue utilizada en los Ejemplos 4 y 5.
Ejemplos 4 y 5
Sal de ácido trifluoroacético con 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(1-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-N',N'-dimetil-malonamida, mezcla diastereó-mera y diastereómero menos polar
Se calentó a 50°C durante 10-15 minutos una solución de diclorotetraquis(trifenilfosfina)rutenio(II) (20 mg) y trifenilfosfina (80 mg) en dimetilformamida (1 ml) y ácido acético glacial (135 \mul), para proporcionar una solución de color pardo claro. Se enfrió hasta la temperatura ambiente el vial de reacción, y se añadió la segunda porción (100 mg) de la resina seca del Ejemplo 2/3b, seguida de trietilsilano (1 ml). Se tapó el vial bajo N_{2}, y se agitó por sacudidas a temperatura ambiente durante 12 horas. Se siguió el avance de la reducción a amidina escindiendo una pequeña cantidad de la resina y analizando el producto mediante HPLC/ESMS. Se lavó la resina acabada con dimetilformamida, con metanol y con diclorometano, y se elaboró de la manera indicada a grandes rasgos en el Ejemplo 1. El producto liofilizado (14 mg) fue purificado mediante HPLC, y se separaron los dos diasteroisómeros. Se analizó mediante ESMS el producto purificado: calculado 560,35, hallado 560.
Ejemplos 6 y 7
Sal con ácido trifluoroacético de éster alílico de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico, diastereómero menos polar,
y
Sal con ácido trifluoroacético de éster alílico de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico, diastereómero más polar a) Acido N-bencil-2-(R,S)-(4-ciano-bencil)-N-metil-malonámico
Se calentó a reflujo durante 3 horas una solución de bencil-metil-amina (120 ml, 887 mmol), bis-(trimetilsilil)-acetamida (118 ml, 482 mmol) y diclorometano anhidro (1000 ml). Se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente la mezcla de reacción, y se añadió en porciones 4-(R,S)-(2,2-dimetil-4,6-dioxo-[1,3-dioxano-5-ilmetil)-benzonitrilo (25 g, 97 mmol). Se hizo refluir la mezcla de reacción durante 3 horas más, se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente, y se vertió en una mezcla fría de 1700 ml de ácido clorhídrico 1 N y 800 ml de acetato de etilo, se llevó a pH 4 con solución 6 N de hidróxido sódico, y se extrajo con acetato de etilo y con diclorometano. Se lavaron con salmuera las capas orgánicas combinadas, se secaron, y se concentraron en vacío. Se filtraron con succión los cristales precipitados, y se secaron para proporcionar 25,0 g (80%) del producto deseado.
punto de fusión (p. f.): 152-153°C (con descomposición)
b) Ester metílico de ácido (S)-[2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(R,S)-(4-ciano-fenil)-propionil-amino]-ciclohexil-acético
Se enfrió hasta 10°C una solución de ácido N-bencil-2-(R,S)-(4-ciano-bencil)-N-metil-malonámico (25,0 g, 78 mmol), éster metílico de ácido (S)-amino-ciclohexil-acético (14,2 g, 83 mmol), diisopropiletilamina (16 ml, 94 mmol), 3-hidroxi-3H-benzo[d][1,2,3]triazin-4-ona (3,2 g, 20 mmol), y dimetilformamida (520 ml). Se añadió gota a gota una solución de diciclohexil-carbodiimida (18,7 g, 91 mmol) en tolueno (30 ml), y se dejó reposar la mezcla de reacción durante una noche. Se filtró con succión la urea precipitada, se evaporó en vacío el filtrado, se disolvió en acetato de etilo, se lavó con solución saturada de hidrogenocarbonato de sodio y con salmuera, y se evaporó en vacío. La cristalización en n-heptano/isopropanol proporcionó 6,3 g (17%) del producto deseado, p.f.:
119-120°C.
Se evaporó el filtrado, y se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice con n-heptano/acetato de etilo = 10/1 como eluyente. Las fracciones combinadas proporcionaron 6,1 g (17%) del producto deseado, p.f.: 120-121°C.
c) Ester metílico de ácido {2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(R,S)-[4-(N-hidroxicarbami-midoil)-fenil]-propionila- mino}-ciclohexil-acético
Se calentó a reflujo durante 4 horas una suspensión de éster metílico de ácido [2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(R,S)-(4-ciano-fenil)-propionilamino]-(S)-ciclohexil-acético
(12,0 g, 26 mmol) e hidroxilamina (4,3 g, 130 mmol) en etanol (150 ml). Se enfrió hasta la temperatura ambiente la mezcla de reacción, se evaporó en vacío, se disolvió en etanol, y se vertió en agua de hielo. Se recogió por filtración con succión el precipitado, y se secó a 60°C en vacío para proporcionar 11,6 g (90%) del producto deseado, p.f.: 135-138°C, MS: 509 (M+H).
d) Ester metílico de ácido [2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(R,S)-(4-carbamimidoil-fenil)-ropionilamino]-(S)-ciclohexil-acético
Se hidrogenó éster metílico de ácido {2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(R,S)-[4-(N-hidroxicarbamimidoil)-fenil]-pro-
pionilamino}-(S)-ciclohexil-acético (11,0 g, 22 mmol) en ácido acético con paladio/carbón, para proporcionar 9,2 g (77%) del producto deseado, que se utilizó sin más purificación en el paso siguiente.
p.f.: 123-124°C, MS: 493 (M+H)
e) Sal de ácido trifluoroacético con ácido [2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(R,S)-(4-carbamimidoil-fenil)-propionila- mino]-(S)-ciclohexil-acético
Se suspendió en acetonitrilo (350 ml), el éster metílico de ácido [2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(R,S)-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-(S)-ciclohexil-acético anterior (9,2 g, 19 mmol), se añadió agua/ácido clorhídrico concentrado (1/1, 500 ml), y se agitó a temperatura ambiente la mezcla de reacción. Después de 4 días se evaporó la mezcla de reacción, se añadió agua, y se liofilizó la mezcla. El producto fue purificado mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice con diclorometano/metanol/ácido trifluoroacético = 15/1/0,5 hasta 4/1/0,5. Las fracciones recogidas proporcionaron 8,2 g (74%) del producto deseado.
MS: 479 (M+H).
f) Sal de ácido trifluoroacético con éster alílico de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico, diastereómero menos polar,
y
Sal de ácido trifluoroacético con éster alílico de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico, diastereómero más polar
A una solución de sal de ácido trifluoroacético con ácido [2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(R,S)-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-(S)-ciclohexil-acético (2,9 g, 4,9 mmol) en dimetilformamida (350 ml) se añadieron colidina (2,4 g, 19,6 mmol) y HATU (2,1 g, 5,4 mmol) a 0°C. Se agitó la mezcla de reacción a esta temperatura durante 30 minutos, y después se añadió éster alílico de ácido (S)-2-amino-5-guanidino-pentanoico (1,2 g, 4,9 mmol). Se dejó que la mezcla de reacción se calentase hasta la temperatura ambiente, y se dejó en reposo durante 60 horas. Se evaporó en vacío el disolvente, y se purificó el residuo mediante MPLC sobre material RP_{18}, empleando agua/etanol/ácido trifluoroacético (9/1/0,1 hasta 5/5/0,1) como eluyente, para proporcionar 1,0 g (23%) del diastereómero más polar y 584 mg (13%) del diastereómero menos polar. Ambas fracciones presentaban el espectro MS correcto. Los siguientes compuestos fueron preparados empleando los procedimientos antes descritos:
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Ejemplos 95 y 96
Sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida, diastereómero menos polar,
y
Sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida, diastereómero más polar a) Acido N-bencil-2-(R,S)-(4-ciano-bencil)-malonámico
Se calentó a reflujo durante 3 horas una disolución de bencilamina (58,6 g, 534 mmol), bis-(trimetilsilil)-acetamida (71 ml, 90 mmol) y diclorometano anhidro (600 ml). Se dejó que la mezcla de reacción se enfriase hasta la temperatura ambiente, y se añadió en porciones 4-(R,S)-(2,2-dimetil-4,6-dioxo-[1,3]dioxan-5-ilmetil)-benzonitrilo (15 g, 58 mmol). Se calentó la mezcla de reacción durante 3 horas más, se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente, y se vertió en una mezcla fría de 1000 ml de ácido clorhídrico 1 N y 500 ml de acetato de etilo. Se lavaron con salmuera las fases orgánicas combinadas, se secaron, y se concentraron en vacío. Se filtraron con succión los cristales precipitados, y se secaron para proporcionar 11,07 g (62%) del producto deseado.
p.f.: 152-153°C (con descomposición), MS: 309 (M+H).
b) Ester metílico de ácido [2-bencilcarbamoil-3-(R,S)-(4-ciano-fenil)-propionilamino]-(S)-ciclohexil-acético
Se enfrió a 10°C una disolución de ácido N-bencil-2-(R,S)-(4-ciano-bencil)-malonámico (10 g, 32,4 mmol), éster metílico de ácido (S)-amino-ciclohexil-acético (5,94 g, 34,7 mmol), diisopropiletilamina (6,45 ml, 37,9 mmol), 3-hidroxi-3H-benzo[d][1,2,3]triazin-4-ona (1,32 g, 8,1 mmol), y dimetilformamida (100 ml). Se añadió gota a gota una disolución de diciclohexil-carbodiimida (7,83 g, 37,9 mmol) en tolueno (10 ml), y se dejó reposar la mezcla durante una noche. Se filtró con succión la urea precipitada, se evaporó en vacío el filtrado, se disolvió en acetato de etilo, se lavó con disolución saturada de bicarbonato sódico y con salmuera, se secó, y se evaporó en vacío. La cristalización en n-heptano/isopropanol proporcionó 9,91 g (66%) del producto deseado.
p.f.: 170-174°C, MS: 462 (M+H).
c) Éster metílico de ácido {2-bencilcarbamoil-3-(R,S)-[4-(N-hidroxicarbamimidoil)-fenil]-propionilamino}-(S)-ciclohexil-acético
Se calentó a reflujo durante 4 horas una suspensión de éster metílico de ácido [2-bencilcarbamoil-3-(R,S)-(4-ciano-fenil)-propionilamino]-(S)-ciclohexil-acético (9,0 g, 19,5 mmol) e hidroxilamina (3,22 g, 97,5 mmol) en etanol (180 ml). Se enfrió a temperatura ambiente la mezcla de reacción, se evaporó en vacío, se disolvió en etanol, y se vertió en agua de hielo. Se recogió mediante succión el precipitado, y se secó a 50°C en vacío para proporcionar 7,9 g (82%) del producto deseado.
p.f.: 101-104°C, MS: 495 (M+H).
d) Éster metílico de ácido [2-bencilcarbamoil-3-(R,S)-(4-carbamimidoil-fenil)-propionil-amino]-(S)-ciclohexil-acético
Se hidrogenó éster metílico de ácido {2-bencilcarbamoil-3-(R,S)-[4-(N-hidroxi-carbamimidoil)-fenil]-propionila-
mino}-(S)-ciclohexil-acético (7,6 g, 15,4 mmol) en ácido acético con paladio/carbono, para proporcionar el producto deseado, que fue utilizado sin más purificación en el paso siguiente.
p.f.: 101-104°C, MS: 479 (M+H).
e) Hidrocloruro de ácido [2-bencil-carbamoil-3-(R,S)-(4-carbamimidoil-fenil)-propionil-amino]-(S)-ciclohexil-acético
Se suspendió el éster metílico de ácido [2-bencilcarbamoil-3-(R,S)-(4-carbami-midoil-fenil)-propionil-amino]-(S)-ciclohexil-acético anterior en agua/ácido clorhídrico concentrado (1/1, 200 ml), y se agitó a temperatura ambiente. Al cabo de 8 días se añadió acetonitrilo (100 ml), y se agitó durante 2 días más. Se filtró la mezcla de reacción, y se vertió en agua de hielo.
Se recogió el filtrado mediante cristalización fraccionada:
Fracción 1: 3,36 g (52%, mezcla de diastereómeros: 6,7% del más polar, 78,0% del menos polar)
Fracción 2: 857 mg (13%, mezcla de diastereómeros: 55,3% del más polar, 31,9% del menos polar), aceite
Fracción 3: 461 mg (7%, mezcla de diastereómeros: 3,8% del más polar, 93,5% del menos polar), p.f.: 166°C (sublima)
Fracción 4: 455 mg (7%, 96,7% del diastereómero menos polar), aceite
HPLC: diastereómero polar: 15,62 minutos, diastereómero no polar: 16,21 minutos
Condiciones de HPLC: Nucleosil 250/4 mm, 7 \mum, 1 ml/minuto, gradiente: 100% (H_{2}O + 0,1% de ácido trifluoroacético) hasta 100% de acetonitrilo en 30 minutos, 100% de acetonitrilo en 5 minutos, = 254 nm.
MS de todas las fracciones: 465 (M+H).
Se intentó purificar la fracción 1 mediante cromatografía relámpago sobre gel de sílice (diclorometano/metanol/á-
cido acético glacial = 9/1/0,5), pero se produjo isomerización del centro quiral malónico para proporcionar la sal de ácido acético del compuesto del título.
f) Sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(R)-(4-carbamimidoil)-bencil]-N'-[(1-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida,
y
Sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(S)-(4-carbamimidoil)-bencil]-N'-[(1-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida
Se agitó durante 30 minutos una disolución de acetato de ácido [2-bencil-carbamoil-3-(R,S)-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-(S)-ciclohexil-acético (103 mg, 0,20 mmol), hidrato de benzotriazol-1-ol (32 mg, 0,24 mmol), y amida de ácido 2-(S)-amino-5-guanidino-pentanoico en dimetilformamida (4 ml), y se enfrió a una temperatura de 0 a -5°C. Se añadió una disolución de 1,3-diciclohexilurea (49 mg, 0,24 mmol), y se agitó la mezcla de reacción durante 24 horas a 0°C. Se evaporó el disolvente, y se purificó el residuo mediante HPLC preparativa, para proporcionar 4,5 mg (3%) de F1 (diastereómero más polar) y 7,8 mg (5%9 de F2 (diastereómero menos polar).
Condiciones de HPLC: Nucleosil 250/21 mm, 7 \mum, 15 ml/minuto, 68% de H_{2}O + 0,1% de ácido trifluoroacético, 32% de acetonitrilo.
F1: p.f.: 150-154°C, MS m/z: 620,5 ((M+H)^{+}, 9%), 310,9 ((M+2H)^{2+}, 100%).
F2: p.f.: 102-106°C, MS m/z: 620,5 ((M+H)^{+}, 5%), 310,9 ((M+2H)^{2+}, 34%), 150,0 (100%)
\newpage
Empleando los procedimientos antes descritos se prepararon los siguientes compuestos:
24
Abreviaturas usadas
aPTT
tiempo de tromboplastina parcial activada
ATS
antistatina
AV
arteriovenoso
BAPNA
benzoil-L-Arg-p-nitroanilida
Boc
terc-butoxicarbonilo
CDCl_{3}
deuterocloroformo
DCCl
diciclohexilcarbodiimida
DCRu
diclorotetraquis(trifenilfosfina)rutenio (II)
DIC
coagulación intravascular diseminada
DICI
diisopropilcarbodiimida
DMSO
dimetilsulfóxido
DVT
trombosis de venas profundas
ESMS
espectro de masas por electrospray
FAB
bombardeo con átomos rápidos
Fmoc
9-fluorenilmetoxicarbonilo
FT-IR
infrarrojo por transformada de Fourier
HATU
N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo- [4,5-b]piridin-1-il-metilen]-N-metilmetanaminio
HPLC
cromatografía líquida de alta presión
HPLC/ESMS
cromatografía líquida de alta presión/espectro de masas por electrospray
id
intraduodenal
iv
intravenoso
Km
constante de Michaelis-Menten
LMWH
heparina de bajo peso molecular
mM
milimolar
mmol
milimol
MS
espectro de masas
p.f.
punto de fusión
\mul
microlitro
\mum
micrómetro
\muM
micromolar
nM
nanomolar
NMR
resonancia magnética nuclear
PE
polietileno
PEG
polietilenglicol
PG
grupo protector
PPP
sangre pobre en plaquetas
PT
tiempo de protrombina
TAP
péptido anticoagulante de garrapatas
TBS-BSA
albúmina sérica de bovino en solución salina tamponada con tris
TBS-PEG
polietilenglicol en solución salina tamponada con tris
TF
factor tisular
TFPI
inhibidor de ruta de factor tisular
TOTU
tetrafluoroborato de O-((ciano-(etoxicarbonil)-metilen)amino)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
TPCK
tosilfenilclorometilcetona
TRIS-Cl
bis(2-hidroxietil)iminotris(hidroximetil)metano 2-bis(2-hidroxietil)amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol, sal de hidrocloruro
UV
ultravioleta.

Claims (10)

1. Compuestos de fórmula I,
25
en la cual
a)
R(1) es metilo, alilo, fenilo o bencilo;
R(2) es hidrógeno o metilo;
R(3) es fenilo que está sustituido con R(7);
R(4) es hidrógeno;
R(5) es butilo, ciclohexilo, ciclohexilmetilo, fenilo, bencilo, 2-feniletilo, 1-naftilmetilo, 2-naftilmetilo, aminobencilo, benciloximetilo, carboximetilo, ó 2-carboxietilo;
R(6) es NR(8)R(9);
R(7) es amidino o hidroxiamidino;
R(8) es hidrógeno;
R(9) es
26
R(10) es NR(12)R(13) u OR(14);
R(12) es hidrógeno o metilo;
R(13) es hidrógeno o fenil-(alquilo C_{1}-C_{2});
R(14) es hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{2}, o alilo; o bien
b)
R(1) es propilo o butilo;
R(2) es propilo o butilo;
R(3) es fenilo que está sustituido con R(7);
R(4) es hidrógeno;
R(5) es ciclohexilo;
R(6) es NR(8)R(9);
R(7) es amidino o amino;
R(8) es hidrógeno;
R(9) es
27
R(10) es
\vskip1.000000\baselineskip
28
X^{-} es un anión fisiológicamente aceptable;
en todas sus formas estereoisómeras y mezclas de los mismos en cualquier proporción, y sus sales fisiológicamente aceptables.
2. Compuestos de fórmula I según la reivindicación 1, que son
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(1-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-N',N'-dimetil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de éster alílico de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida, diastereómero más polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-2-[4-(N-hidroxicarbamimidoil)-bencil]-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de N-[2-(4-amino-fenil)-1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-etil]-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-pentil]-N'-metil-malonamida,
ácido 4-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetilcarbamoil-propionilamino]-4-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-bu-
tilcarbamoil)-butírico,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-2-naftalen-2-il-etil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-3-fenil-propil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de ácido 3-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetil-carbamoil-propionilamino]-N-[1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butil)-succinámico,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-fenil-metil]-N'-metil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-fenil-metil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de N-[2-benciloxi-1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-etil]-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-pentil]-N',N'-dimetil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetil-carbamoil-propionilamino]-hexanoilamino}-5-guanidino-pentanoico,
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetilcarbamoil-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico; compuesto con ácido trifluoroacético,
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-metilcarbamoil-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico;
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-bencilcarbamoil-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico;
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetilcarbamoil-propionilamino]-3-ciclohexil-propionilamino}-5-guanidino-pentanoico;
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-2-fenil-etil]-N',N'-dimetil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-2-naftalen-1-il-etil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-pentil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-N'-metil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[1-(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-2-ciclohexil-etil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-2-[4-(N-hidroxicarbamimidoil)-bencil]-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido clorhídrico de éster etílico de ácido 2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-dimetilcarbamoil-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico,
sal con ácido trifluoroacético de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-bencilcarbamoil-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico, diastereómero menos polar,
sal con ácido clorhídrico de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-[(S)-ciclohexil-(4-guanidino-1-(S)-fenetilcarbamoil-butilcarbamoil)-metil]-N',N'-dimetil-malonamida,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida, diastereómero más polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N'-[(S)-(1-(S)-carbamoil-4-guanidino-butilcarbamoil)-ciclohexil-metil]-N-metil-malonamida,
sal con ácido clorhídrico de ácido 2-(S)-{2-(S)-[2-(bencil-metil-carbamoil)-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico,
\newpage
sal con ácido trifluoroacético de éster metílico de ácido 2-(S)-{2-[2-(bencil-metil-carbamoil-3-(4-carbamimidoil-fenil)-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-5-guanidino-pentanoico, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de N-bencil-N'-{[1-(S)-(bencil-metil-carbamoil)-4-guanidino-butilcarbamoil]-ciclohexil-metil}-2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-metil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-((S)-{1-(S)-[1-(S)-(2-(S)-carbamoil-pirrolidin-1-carbonil)-3-metil-butilcarbamoil]-4-guanidino-butilcarbamoil}-ciclohexil-metil)-N',N'-diisopropil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de trifluoroacetato de 3-{2-(S)-{2-(S)-[3-(4-carbamimidoil-fenil)-2-diisopropilcarbamoil-propionilamino]-2-ciclohexil-acetilamino}-2-[1-(S)-(2-(S)-carbamoil-pirrolidin-1-carbonil)-3-metil-butilcarba-
moil]-etil}-1-metil-piridinio, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-amino-bencil)-N-((S)-{1-(S)-[1-(S)-(2-(S)-carbamoil-pirrolidin-1-carbonil)-3-metil-butilcarbamoil]-4-guanidino-butilcarbamoil}-ciclohexil-metil)-N',N'-diisopropil-malonamida, diastereómero menos polar,
sal con ácido trifluoroacético de 2-(4-carbamimidoil-bencil)-N-((S)-{1-(S)-[1-(S)-(2-(S)-carbamoil-pirrolidin-1-carbonil)-3-metil-butilcarbamoil]-4-guanidino-butilcarbamoil}-ciclohexil-metil)-N',N'-diisobutil-malonamida, diastereómero más polar,
y/o sus sales fisiológicamente aceptables.
3. Una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 2 y/o sus sales fisiológicamente aceptables, junto con un vehículo y/o sustancias auxiliares, farmacéuticamente aceptables.
4. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 2 y/o sus sales fisiológicamente aceptables, para uso como agente farmacéutico.
5. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 2 y/o sus sales fisiológicamente aceptables, para uso como inhibidor de factor Xa.
6. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 2 y/o sus sales fisiológicamente aceptables, para uso como inhibidor de la coagulación sanguínea.
7. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 2 y/o sus sales fisiológicamente aceptables, para uso en el tratamiento o la profilaxis de trastornos cardiovasculares o de estados tromboembólicos.
8. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 2 y/o sus sales fisiológicamente aceptables, para uso en el tratamiento o la prevención de complicaciones asociadas con la infección o la cirugía.
9. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 2 y/o sus sales fisiológicamente aceptables, para el uso según la reivindicación 7, en donde los trastornos cardiovasculares son restenosis, restenosis posterior a angioplastia, la profilaxis de la reoclusión, estados posteriores a operaciones de derivación coronaria, estados morbosos arteriales, venosos y microcirculatorios, infarto cardíaco, angina de pecho, enfermedades tromboembólicas, trombosis, embolismo, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, fracaso multiorgánico, infarto o trastorno de coagulación intravascular diseminada.
10. Un compuesto de fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 2 y/o sus sales fisiológicamente aceptables, para el uso según la reivindicación 8, en donde las complicaciones relacionadas con la cirugía son trombosis de venas profundas y de venas proximales, que se pueden producir tras una intervención quirúrgica.
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