ES2256027T3 - Complejos de anticuerpos que contienen multiples citoquinas. - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo que comprende una región de inmunoglobulina y una proteína de fusión de citoquina que comprende dos diferentes Citoquinas, en donde la primera citoquina es IL-12 en una forma heterodimérica o en una cadena sencilla y la segunda citoquina es IL-2 o GM-CSF, que está covalentemente enlazada al terminal amino o carboxilo de la subunidad p35 o p40 de IL-12; dicha proteína de fusión de citoquina estando fusionada al terminal amino o carboxilo de dicha región de inmunoglobulina.

Description

Complejos de anticuerpos que contienen múltiples citoquinas.

Referencia a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la U.S. Serial No. 60/147.924, presentada en agosto 9, 1999, cuya descripción se incorpora aquí como referencia.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con métodos para la construcción y expresión de múltiples complejos de la proteína citoquina y sus composiciones. Más específicamente, la invención se relaciona con proteínas de fusión compuestas de múltiples citoquinas y un componente objetivo, y con el uso de las mismas para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer e infecciones virales.

Antecedentes de la invención

Las redes reguladoras que controlan al sistema inmunológico cuentan con moléculas secretadas de señalización de proteína llamadas citoquinas para encender y a pagar las funciones de los inmunocitos así como regular su proliferación. Estas respuestas generalmente involucran a múltiples citoquinas que actúan en forma concertada para lograr el efecto biológico deseado. Ciertas citoquinas tales como la interleuquina-2 (IL-2) pueden inducir por sí mismas la proliferación de inmunocitos, y pueden activar otras funciones incluida la secreción de citoquina secundaria. Otra citoquina, la interleuquina-12 (IL-12) [reseñada por Trinchieri, 1994, Blood 84:4008-4027], puede inducir la proliferación de ciertos inmunocitos e inducir a otro moderador inmunológico clave, interferón-\gamma (IFN-\gamma). Esta inducción de IFN-\gamma es una actividad clave de IL-2, aunque IL-12 tiene otras importantes actividades que son independientes de IFN-\gamma. Ya que IL-12 por sí mismo es inducido en una etapa temprana en situaciones de enfermedad infecciosa, se piensa que enlaza a los sistemas inmunológicos innato y adquirido.

Muchos estudios in vitro tanto con inmunocitos humanos como de ratón han mostrado la importancia de las combinaciones de citoquina el desarrollo de respuestas inmunológicas óptimas. Por ejemplo, la mayoría de las células T no expresan a los receptores IL-12 (IL-12R) hasta que han sido activados con mitógenos, o cultivados en altas concentraciones de IL-2 [Desai y colaboradores. (1992), J. Immunol. 148:3125-3132]. Una vez que los receptores se expresan, las células se hacen mucho más sensibles a IL-12. Además, IL-12 induce la transcripción de IFN-\gamma, el ARNm de IFN-\gamma se degrada poco después. En presencia de IL-2, el ARNm se estabiliza, dando como resultado un dramático incremento en la cantidad de IFN-\gamma producido [Chan y colaboradores, (1992) J. Immunol. 148:92-98]. En otros estudios, se encontró que las combinaciones de citoquina IL-3 más IL-11 o IL-3 más el Factor Acero tenían un efecto sinergístico con IL-12 sobre la proliferación de las células progenitoras hematopoyéticas [Trinchieri, 1994; citado más arriba]. La combinación de interleuquina-4 y GM-CSF es particularmente útil en el estímulo de las células dendríticas (Palucka y colaboradores [1998] J. Immunology 160:4587-4595). Para la estimulación de respuesta inmune mediada por la célula, también es útil combinar IL-12 con IL-18, una citoquina promotora de Th-1 recientemente descubierta, con algunas actividades que son complementarias para IL-12 (Hashimoto y colaboradores [1999] J. Immunology 163:583-589; Barbulescu y colaboradores [1998] J. Immunology 160:3642-3647). Además, IL-2 y el interferón-\gamma son sinergísticos en ciertas circunstancias [Palladito, M. A., patente estadounidense No. 5.082.658].

En muchos de estos estudios de sinergia, se encontró que el nivel relativo de cada citoquina era muy importante. Mientras que la adición de IL-12 en presencia de cantidades inferiores al óptimo de IL-2 condujeron a sinergia en la inducción de proliferación, se encontró que la actividad citolítica y la inducción de IFN-\gamma, combinaciones de IL-2 e IL-12 utilizando una dosis alta de una citoquina era antagonista [Perussia y colaboradores, J. Immunol. 149:3495-3502 (1992); Mehrotra y colaboradores, J. Immunol. 151:2444-2452 (1993)]. Existe una combinación similar en las combinaciones de IL-12 e IL-7.

Los estudios de sinergia entre IL-12 y otras citoquinas para la generación de respuestas antitumorales en ratones han mostrado también resultados mixtos. En algunos modelos la sinergia fue observada en dosis por debajo del óptimo de cada citoquina, y dosis más altas condujeron a una toxicidad potenciada, mientras que en otros modelos, las combinaciones de IL-12 e IL-2 mostraron poca o ninguna sinergia [ver, por ejemplo, Nastala y colaboradores. J. Immunol. 153:1697-1706 (1994). Estos resultados pueden reflejar la dificultad inherente de la combinación de dos agentes potencialmente sinergísticos in vivo, especialmente cuando existe la necesidad de mantener una relación fija de actividades de los dos agentes con diferentes propiedades farmacológicas, tales como una vida media de circulación diferente y biodistribución.

En experimentos de cultivo de células in vitro, está dirigido al control de los niveles de citoquina, pero muchos factores pueden afectar la biodistribución relativa y la localización de citoquinas in vivo, afectando así su capacidad de inmunoestimuladora. El más importante de estos factores es la vida media. La vida media de IL-2 en circulación después de una inyección de bolo es de 10 minutos. En contraste notable con estas propiedades farmacocinéticas, la vida media en circulación de IL-12 se ha reportado que es > 3 horas en ratones [Wysocka y colaboradores (1995) Eur. J. Immunol. 25:672] y de 5-10 horas en humanos [Lotze y colaboradores, (1996) Ann NY Acad Sci 795:440-454].

Se piensa que la diferencia es debida a los tamaños relativamente pequeños tanto de IL-2 como de GM-CSF (15-25 kD vs. 75 kD para IL-12), permitiendo que IL-2 y GM-CSF sean retirados por medio de filtración renal. Las proteínas con un peso molecular aproximadamente menor a 50 kD son retiradas por medio de filtración renal. Casi todas las citoquinas son más pequeñas a 50 kD y experimentan una rápida eliminación similar por medio de filtración renal. Cuando se desea el tratamiento con dos de tales pequeñas citoquinas fácilmente eliminadas, es suficiente con administrar simplemente las citoquinas en forma conjunta. Sin embargo, la administración en forma conjunta no es óptima para las citoquinas con una vida media significativamente diferente.

La administración sistémica de citoquinas es difícil debido a sus efectos secundarios nocivos. Por ejemplo, altos niveles de interferón-alfa da como resultado efectos secundarios significativos, que incluyen toxicidad de la piel, neurológica, inmune y endocrina. Se espera que múltiples fusiones de citoquina puedan mostrar efectos secundarios particularmente serios.

Para reducir los efectos secundarios de la administración sistémica de citoquinas, una estrategia es la de fusionar una citoquina a una segunda molécula con capacidad de ser un objetivo. Las fusiones en las cuales una región Fc se ubica en el N-terminal de otro proteína (llamadas "inmunofusiones" o fusiones "Fc-X", en donde X es un ligando tal como el interferón-alfa) tienen una variedad de propiedades biológicas características ventajosas [Lo y colaboradores, patentes estadounidenses Nos. 5.726.044 y 5.541.087; Lo y colaboradores, Protein Engineering 11:495]. En particular, tales proteínas de fusión pueden enlazar sea un con los receptores Fc relevantes sobre las superficies celulares. Sin embargo, cuando el ligando se enlaza a su receptor sobre una superficie celular, la orientación de la región Fc se altera y las secuencias que median la citoxicidad mediada por las células dependientes del anticuerpo (ADCC) y la fijación del complemento parecen estar ocluidas. Como resultado, la región Fc en una molécula Fc-X no media la ADCC o la fijación del complemento en forma efectiva. El efecto citotóxico debido a la fusión de una citoquina N-terminal y una región Fc C-terminal es bien conocido. Por ejemplo, la fusión de IL-2 al N-terminal de una región Fc crea una molécula que es capaz de enlazarse a células que soportan a receptor IL-2, fijar al complemento, y como resultado lisar las células [Landolfi, N. F. (1993), patente estadounidense No. 5.349.053]. En contraste, las proteínas de fusión Fc-IL-2 no tienen esta propiedad. Así, se espera que las fusiones Fc-X tengan la virtud de una vida media mayor en suero y una concentración relativa en el hígado, si los efectos nocivos de ADCC y de fijación del complemento.

Se ha demostrado que muchas proteínas diferentes con corta vida media en el suero pueden fusionarse a una región Fc en una configuración Fc-X, y las fusiones resultantes tienen una vida media mayor en el suero. Sin embargo, la vida media en el suero de dos fusiones diferentes de Fc generalmente no serán idénticas. Así, cuando se desea la liberación de dos fracciones diferentes X, la administración conjunta de dos proteínas diferentes Fc-X generalmente no será óptima.

Bajo algunas circunstancias, una mejor aproximación es dirigir el efecto de la citoquina a un antígeno de la superficie de la célula fusionándola a un anticuerpo (o fragmento derivado del mismo) que tiene especificidad y afinidad por ese antígeno (Gillies, patente estadounidense No. 5.650.150; Gillies y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428) o enlazando un antígeno de proteína y una citoquina estimuladora a través del enlazamiento de un péptido en la forma de una proteína de fusión (Hazama y colaboradores, Vaccine 11:629). Se conoce una proteína de fusión anticuerpo-JL12 por Gillies y colaboradores, (J. Immunol., 1998, 160, 6195). Mientras que los anticuerpos por sí mismos pueden incrementar la vida media de una citoquinas fusionada, existen aún diferencias entre diferentes fusiones de citoquina con el mismo anticuerpo [ver, por ejemplo, Gillies y colaboradores, Bioconjugate Chem. 4:230-235 (1993); Gillies y colaboradores, J. Immunol. 160:6195-6203] que harían difícil la localización conjunta en un sitio objetivo. Como se discutió anteriormente, esto podría conducir a un desequilibrio en la actividad de las citoquinas y una disminución de los efectos sinergísticos deseados. Además, el uso de dos proteínas de fusión diferentes requiere del análisis separado de cada fusión para su perfil de seguridad y de efectividad, y luego ensayarlas además como mezclas.

Resumen de la invención

La presente invención provee complejos o fusiones entre dos o más citoquinas diferentes, que son útiles para inmunoterapia general así como para inmunoterapia dirigida. Estos complejos o fusiones incluyen opcionalmente a otras fracciones de proteína. Una característica de tales complejos o fusiones es que proveen la actividad de las citoquinas componentes en una relación fija.

Generalmente, la invención se relaciona con un complejo de proteína que contiene al menos dos diferentes citoquinas. Las citoquinas pueden estar en la misma cadena de polipéptido o conectadas por medio de un enlace covalente tal como un enlace disulfuro o un enlace formado por entrelazamiento químico. Alternativamente, las citoquinas podrían estar en asociación estable no covalente. En algunas modalidades preferidas, el complejo de proteína comprende una fracción de reconocimiento, tal como un anticuerpo o fracción de anticuerpo, que dirige al complejo a un locus en un mamífero.

En una modalidad preferida, la invención provee un complejo de proteína que combina la bioactividad de una citoquina de cadena doble, tal como IL-12, con aquella de una segunda citoquina. Las citoquinas pueden estar enlazadas en forma covalente (por ejemplo fusionadas) entre sí. Las citoquinas pueden estar asociadas también a través de otras fracciones. Por ejemplo, la cadena de polipéptido que contiene a la segunda citoquina podría incluir una fracción de enlazamiento que específicamente enlaza a IL-12, tal como un anticuerpo a IL-12 o un receptor a IL-12. Alternativamente, la fracción de enlazamiento podría interactuar con una segunda fracción que se asocia con la IL-12. Por ejemplo, si una cadena de polipéptido que codifica a una subunidad de IL-12 incluye también avidita, el polipéptido que contiene a la segunda citoquina puede incluir biotina como una fracción de reconocimiento. En una modalidad preferida, la segunda citoquina es IL-2.

La invención provee métodos para la producción de proteínas de fusión de IL-12 que mantienen tanto la actividad de IL-12 como aquella de la segunda citoquina, mientras que proporciona un comportamiento farmacocinético único mayor, similar a aquel de IL-12 por sí mismo, que incrementa la duración de la actividad de la segunda citoquina y mantiene el balance de actividades de las dos citoquinas después de la inyección en un animal.

En otra modalidad de la invención, las proteínas de fusión comprenden una forma heterodimérica ofIL-12 en la cual las subunidades p35 y p40 de IL-12 se enlazan por medio de un enlace disulfuro y se enlazan covalentemente a una segunda citoquina ya sea en el terminal amino o en el terminal carboxilo de la subunidad p35 o p40 de IL-12 con la fórmula general IL-12-X o X-IL-12, en donde X es una segunda citoquina.

En otra modalidad de la invención, las proteínas de fusión comprenden una segunda citoquina enlazada en forma covalente ya sea al terminal amino o al terminal carboxilo a una forma de cadena sencilla (sc) ofL-12 que comprende a las dos subunidades de polipéptido unidas a través de un enlazador flexible de péptido con la fórmula general scIL-12-X o X-scIL-12.

En aún otra modalidad, dos citoquinas se fusionando además a una proteína capaz de formar una estructura dimérica o multimérica, ya sea al terminal amino o al terminal carboxilo de dicha cadena de proteína. En una forma preferida de esta modalidad, una de las formas de la proteína de fusión de IL-12 con una segunda citoquina, se fusiona además a una porción de una cadena de inmunoglobulina (Ig), tal como la región Fc, que es capaz de dimerización. Otras modalidades incluyen fusión, o al menos una cadena de polipéptido de IL-12 en cualquier terminal de una porción de una cadena de Ig, y una segunda citoquina fusionada en el otro terminal.

En otra modalidad, dos o más citoquinas se fusionan a una proteína con una capacidad de reconocimiento en virtud del enlazamiento a un receptor específico. Por ejemplo, una región Fc es capaz de enlazarse a receptores Fc, que son abundantes en el hígado. Las fusiones de una región Fc con múltiples citoquinas ilustran las ventajas tanto de la dimerización como del reconocimiento, pero en algunas circunstancias es útil para construir fusiones de múltiples citoquinas que solamente tienen capacidad de multimerización o de reconocimiento, pero no de ambas capacidades.

En aún otra modalidad, una proteína de fusión que comprende múltiples citoquinas se fusiona además de al terminal amino o al terminal carboxilo, a un miembro de una clase de moléculas con variada capacidad de reconocimiento, tal como un anticuerpo o un péptido aptámero con o sin armazón proteínico (Colas y colaboradores [1998] Proc Natl Acad Sci USA. 95:14272-7). Una modalidad particular es la fusión de múltiples citoquinas al menos a una porción de un anticuerpo capaz de enlazar a un antígeno, tal como un anticuerpo intacto, un anticuerpo de cadena sencilla, o una región Fv de cadena sencilla. Otras modalidades incluyen fusiones de al menos una cadena de polipéptido de IL-12 a cualquier terminal de al menos una porción de una cadena de anticuerpo que es capaz de enlazar a un antígeno, y una segunda citoquina fusionada al otro terminal.

De acuerdo a las descripciones anteriores, se prefiere generalmente construir proteínas de fusión de múltiples citoquinas y proteínas de fusión de múltiples citoquinas-anticuerpo por medio de técnicas de ingeniería genética, de tal manera que las proteínas componentes se enlazan por medio de enlace covalentes tal como enlaces amida o enlaces disulfuro. Sin embargo, también es útil usar entrelazadores químicos para construir tales complejos de proteína. Tales métodos están bien establecidos en el arte de la química proteínas. Alternativamente, algunas veces es suficiente generar complejos de proteína por medio de la fusión de diferentes citoquinas con proteínas asociadas que forman complejos estables no covalentes. Por ejemplo, se utiliza una proteína heterodimérica no covalente de soporte: una primera citoquina se fusiona a una subunidad del heterodímero, una segunda citoquina se fusiona a una segunda subunidad del heterodímero, y las dos proteínas de fusión se mezclan bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican a las proteínas de fusión de las dos subunidades de citoquina se expresan en la misma célula. De esta forma, puede construirse un complejo de proteína de citoquinas múltiples en el cual las citoquinas componentes no se enlazan en forma covalente, directa o indirectamente. Para lograr el propósito de la invención, es necesario que un complejo así sea lo suficientemente estable como para mantenerse después de su administración a un animal lograr un efecto biológico.

La invención también provee ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que comprenden dos o más citoquinas, donde una de las citoquinas es preferiblemente IL-12 y la proteína de fusión codificada por el ácido nucleico incluye opcionalmente a otras fracciones de proteína. Las modalidades preferidas incluyen ácidos nucleicos que codifican fusiones de dos o más citoquinas para una proteína de dimerización, tal como una porción Fc de una cadena de anticuerpo. Otro juego de modalidades preferidas son los ácidos nucleicos que codifican fusiones de dos o más citoquinas a una proteína con capacidad de reconocimiento, tal como un anticuerpo.

La invención también proporciona métodos para la construcción de fusiones de dos o más citoquinas, así como métodos para la expresión de tales proteínas de fusión.

La invención también provee el uso de proteínas de fusión citoquina multinacional-anticuerpo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y otras condiciones médicas, cuyo tratamiento involucra la combinación útil de la actividad de dos o más proteínas. En una modalidad, al menos una de las proteínas tiene (por ejemplo menos de 20 minutos) una vida media en el suero corta o solamente moderadamente larga (por ejemplo menos de 40 minutos). Las proteínas se fusionan por medio de ingeniería genética o de otras técnicas y se administran a un humano o a un animal. De esta forma, las actividades de las dos proteínas están presentes en una proporción fija, y no se requiere la administración separada sobre diferentes programas de dosificación de las dos proteínas. Además, la vida media en el suero de la proteína de fusión generalmente será más similar a aquella del componente de la proteína con la vida media más larga en el suero, prolongando así la vida media efectiva de la proteína o de las proteínas con la vida media más corta el suero.

Más específicamente, la invención provee proteínas de fusión de citoquinas multifuncionales-anticuerpo para ser usadas en el tratamiento inmuno-terapéutico de enfermedades, tales como el cáncer o infecciones u otras enfermedades, que pueden ser provechosamente tratadas con una citoquina de doble cadena tal como IL-12 en combinación con una segunda citoquina. En una modalidad preferida, IL-12 se fusiona con IL-2 o GM-CSF y se los administra a un animal o a un humano. Tales tratamientos pueden ser utilizados en combinación con otros tratamientos para la enfermedad. Además, la invención dispone los usos para vacunación contra diversos antígenos, que pueden ser usados para prevenir o tratar diferentes enfermedades.

En otras modalidades de estos métodos, se fusionan dos diferentes citoquinas a una fracción dimérica de proteína, tal como la región Fc de un anticuerpo, y se los administra a un animal o a un humano. En una forma preferida de estos métodos, la citoquina IL-12 se fusiona a la región Fc junto con una segunda citoquina que es más preferiblemente IL-2 o GM-CSF.

En aún otras modalidades de estos métodos, se fusionan dos citoquinas diferentes a un anticuerpo intacto, y se los administra a un animal o a un humano. En una forma preferida de estos métodos, la citoquina IL-12 se fusiona a la fracción de anticuerpo junto con una segunda citoquina que es más preferiblemente IL-2 o GM-CSF. La invención también revela mezclas de proteínas de fusión anticuerpo-citoquina que son útiles en el tratamiento enfermedades. En una modalidad, una mezcla de una proteína de fusión anticuerpo-IL-2 y una proteína de fusión anticuerpo-IL-12, se usan para tratar una enfermedad. Por ejemplo, se trata cáncer, una infección viral, o una infección bacterial.

Breve descripción de los dibujos

Los precedentes y otros objetivos de la presente invención, y las diferentes características de la misma, pueden ser entendidos más completamente a partir de las siguientes descripciones, cuando se leen junto con los dibujos acompañantes. A través de los dibujos, números semejantes se refieren estructuras semejantes.

La Figura 1A ilustra esquemáticamente la fusión de dos citoquinas en su forma más simple: una citoquina se fusiona a una segunda citoquina, opcionalmente a través de un enlazador. Las Figuras 1B-1I muestran diferentes formas en las cuales una segunda citoquina (marcada "cyt") puede ser unida a la citoquina heterodimérica IL-12. Específicamente, la segunda citoquina puede considerarse al C-terminal de p40 (Figura 1B), el N-terminal de p40 (Figura 1C), el C-terminal de p35 (Figura 1D) o el N-terminal de p35 (Figura 1E). Además, la Figura 1 muestra como una segunda citoquina puede fusionarse a una versión de cadena única de IL-12. Específicamente, las moléculas IL-12 de cadena sencilla pueden tener N-terminal de p35 a p40, con la segunda citoquina en el C-terminal (Figura 1F) o el N-terminal (Figura 1G). Alternativamente, las moléculas IL-12 de cadena sencilla pueden tener N-terminal de p40 a p35, con la segunda citoquina en el C-terminal (Figura 1H) o en el N-terminal (Figura 1I).

Las Figuras 2A-2C muestran esquemáticamente como las fusiones de múltiples citoquinas (cajas) descritas en la Figura 1 pueden fusionarse además a una región Fc de un anticuerpo, mostrado aquí como una articulación (H), un dominio CH2 y un dominio CH3 (óvalos). Específicamente, cualquiera de las ocho moléculas de la Figura 1 puede fusionarse ya sea al C-terminal (Figura 2A) o al N-terminal (Figura 2B) de la región Fc. Además, la primera citoquina y la segunda citoquina (cada una en una caja) no necesitan unirse directamente una a la otra, pero pueden conectarse a través de la fracción Fc (Figura 2C).

Las Figuras 3A-3G muestran esquemáticamente un subconjunto de las formas en las cuales una proteína de fusión de múltiples citoquinas puede fusionarse además a una inmunoglobulina intacta tal como una IgG. La región V de cadena pesada se muestra como un óvalo marcado como V_{H}, la región V de cadena liviana se muestra como un óvalo marcado como V_{L}, y las regiones constantes son óvalos en blanco. Una fusión de múltiples citoquinas, como las ilustradas en la Figura 1, pueden ubicarse en el C-terminal de la cadena pesada (Figura 2A), en el N-terminal de la cadena pesada (Figura 2B), en el N-terminal de la cadena liviana (Figura 2C), o en el C-terminal de la cadena liviana (Figura 2D). Además, existen muchas formas en las cuales una primera y una segunda citoquinas podrían unirse en forma separada a los terminales N y C de las cadenas pesada y liviana; tres de estas se muestran en las Figuras 3E-3G.

Las Figuras 4A-4C muestran esquemáticamente como una primera citoquina y una segunda citoquina pueden fusionarse a un anticuerpo de "cadena sencilla" en la cual diferentes cadenas livianas y diferentes cadenas pesadas se fusionan, y la proteína se expresa como un polipéptido sencillo que se homodimeriza entonces. Específicamente, una fusión de múltiples citoquinas puede ubicarse en el C-terminal (Figura 4A), o el N-terminal (Figura 4B). Además, la primera citoquina y la segunda citoquina no necesitan estar directamente unidas, sino que pueden conectarse a través de la fracción de anticuerpo de cadena sencilla (Figura 4C).

Las Figuras 5A-5C muestran esquemáticamente como una primera citoquina y una segunda citoquina pueden fusionarse a una región Fv de cadena sencilla que consiste de las diferentes regiones fusionadas a partir de una cadena pesada y de una cadena liviana. Específicamente, una primera fusión citoquina-citoquina puede ubicarse en el C-terminal (Figura 5A), o el N-terminal (Figura 5B). Además, la primera citoquina y la segunda citoquina no necesitan estar directamente unidas, sino que pueden conectarse a través de la fracción Fv de cadena sencilla (Figura 5C).

Las Figuras 6A y 6B muestran la sinergia entre IL-12 e IL-2 en la inducción de IFN-\gamma por las células mononucleares de sangre periférica humana (las PBMC) en respuesta a las citoquinas separadas o a las proteínas de fusión. En la Figura 6A, las células fueron tratadas con IL-12 humana antes (cuadrados) o después de activación por fitohemaglutinina (X's), o con la proteína de fusión y IL-12-IL-2 antes (diamantes) o después de activación por fitohemaglutinina (triángulos). La Figura 6B muestra un experimento en el cual las células fueron tratadas con una mezcla de IL-12 más IL-2 añadida en una proporción molar 1:1 (diamantes negros), proteína de fusión humana Fc-IL-12-IL-2 (cuadrados grises), y proteína de fusión humana anticuerpo-IL12-IL-2 (triángulos gris claro). El eje X indica la concentración de IL-12 en pg/ml, presente ya sea como una proteína intacta o como una proteína de fusión. El eje Y indica la concentración de IFN-\gamma (en ng/ml), que se ensayó por medio de ELISA.

La Figura 7 muestra un bioensayo típico IL-12 que mide separadamente la actividad de una proteína de fusión y la compara con aquella de una molécula IL-12 no fusionada. Lo que se describe es la estimulación de timidina ^{3}H incorporada de las PBMC humanas en respuesta a IL-12 de murino (círculos blancos), a una mezcla de IL-12 de murino más IL-2 añadida en una proporción molar 1:1 (cuadrados negros), a IL-2 de murino (triángulos blancos), y a una proteína de fusión anticuerpo-IL-12-IL-2 de murino (diamantes negros). El eje X indica la concentración (pM) de la(s) citoquina(s), ya sea que se encuentre presente como una proteína intacta o como una proteína de fusión; el eje Y indica la incorporación de timidina tritiada en cpm.

La Figura 8 muestra un ensayo estándar de bioactividad de IL-2. La gráfica muestra la estimulación de la proliferación celular CTLL de ratón, en respuesta a IL-2 de murino (círculos), a una proteína de fusión IL-12-IL-2 de murino-anticuerpo (diamantes), e IL-12 de murino (cuadrados). El eje X indica la concentración (pM) de citoquina(s) monomérica(s), ya sea presentes como una proteína intacta o como una proteína de fusión. Las células se incubaron en un medio que contenía diferentes cantidades de citoquina o proteína de fusión durante 48 horas, luego se ensayaron por el número de células viables utilizando el ensayo MTT/MTS. El eje Y indica la absorbancia a 490 nanómetros en unidades de densidad óptica (OD).

La Figura 9 muestra la estimulación de timidina ^{3}H incorporada por las PBMC humanas en respuesta a IL-12 de murino (círculos blancos), a una mezcla de IL-12 de murino más IL-2 añadido en una proporción molar 1:1 (círculos negros), a una proteína de fusión IL-12-IL-2-cadena sencilla de Fc de murino (triángulos negros), y a un fusionado IL-12 de cadena sencilla de murino a IL-2 de murino (diamantes negros). El eje X indica la concentración (pM) de citoquina(s) monomérica(s), ya sea presentes como una proteína intacta o como una proteína de fusión, el eje Y indica la incorporación de timidina tritiada en cpm.

La Figura 10 muestra la estimulación de timidina ^{3}H incorporada por las PBMC humanas en respuesta a IL-12 de murino (círculos blancos), a una mezcla de IL-12 de murino más GM-CSF añadido en una proporción molar 1:1 (círculos negros), a GM-CSF de de murino (triángulos negros), y a una proteína de fusión IL-12-GM-CSF de murino-Fc de murino (X's). El eje X indica la concentración (pM) de citoquina(s) monomérica(s), ya sea presentes como una proteína intacta o como una proteína de fusión; e Pérez 1 eje Y indica la incorporación de timidina tritiada en cpm.

La Figura 11 muestra el efecto del tratamiento con proteína de fusión anticuerpo-citoquina-citoquina de ratones Balb/C con tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de colon CT26 que fueron modificadas genéticamente para expresar EpCAM humano, el antígeno para KS-1/4. Los diamantes negros indican los volúmenes promedio de tumor en ratones que fueron inyectados con PBS como controles en los días 0, 1, 2, 3, y 4. Los triángulos indican los volúmenes promedio de tumor en ratones tratados con 6 microgramos de KS-IL-12-IL-2. Los cuadrados indican los volúmenes promedio de tumor en ratones tratados con 3,4 microgramos de KS-IL-2 y 5,3 microgramos de KS-IL-12. Se efectuaron inyecciones intratumorales. El eje X indica el número de días transcurridos después de la primera inyección; el eje Y indica el volumen promedio de tumor en mililitros cúbicos.

La Figura 12 muestra el efecto del tratamiento con proteína de fusión anticuerpo-citoquina-citoquina de ratones SCID con tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de colon CT26 que fueron modificadas genéticamente para expresar EpCAM humano. Los diamantes indican los volúmenes promedio de tumor en ratones que fueron inyectados con PBS como controles en los días 0, 1, 2, 3, y 4. Los triángulos indican los volúmenes promedio de tumor en ratones tratados con 6 microgramos de KS-IL-12-IL-2. Los cuadrados indican los volúmenes promedio de tumor en ratones tratados con 3,4 microgramos de KS-IL-2 y 5,3 microgramos de KS-IL-12. Se efectuaron inyecciones intratumorales. El eje X indica el número de días transcurridos después de la primera inyección; el eje Y indica el volumen promedio de tumor en mililitros cúbicos.

La Figura 13 compara el efecto del tratamiento con proteína de fusión anticuerpo-citoquina y anticuerpo-citoquina-citoquina de ratones con tumores subcutáneos de células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) que fueron modificadas genéticamente para expresar EpCAM humano. Los diamantes indican los volúmenes promedio de tumor en ratones que fueron inyectados intratumoralmente con PBS como controles en los días 0, 1, 2, 3, y 4. Los cuadrados indican los volúmenes promedio de tumor en ratones inyectados intratumoralmente con 20 microgramos de KS-IL-2 en los días o, 1, 2, 3 y 4. Los cuadrados indican los volúmenes promedio de tumor en ratones inyectados intratumoralmente con 20 microgramos de KS-IL-12 en los días o, 1, 2, 3 y 4. X's indica los volúmenes promedio de tumor en ratones inyectados intratumoralmente con 20 microgramos de KS-IL-12-IL-2 en los días o, 1, 2, 3 y 4. El eje X indica el número de días transcurridos después de la primera inyección; el eje Y indica el volumen promedio de tumor en mililitros cúbicos.

La Figura 14 muestra el efecto del tratamiento con proteína de fusión anticuerpo-citoquina-citoquina de ratones con tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de pulmón de Lewis que fueron modificadas genéticamente para expresar EpCAM humano. Los diamantes indican los volúmenes promedio de tumor en ratones que fueron inyectados con PBS como controles en los días 0, 1, 2, 3, y 4. Los triángulos indican los volúmenes promedio de tumor en ratones tratados con 20 microgramos de KS-IL-12-IL-2. Los cuadrados indican los volúmenes promedio de tumor en ratones tratados con 11,5 microgramos de KS-IL-2 y 18 microgramos de KS-IL-12. Se efectuaron inyecciones intratumorales. El eje X indica el número de días transcurridos después de la primera inyección; el eje Y indica el volumen promedio de tumor en mililitros cúbicos.

La Figura 15 muestra el efecto del tratamiento con proteína de fusión anticuerpo-citoquina-citoquina de ratones con tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de pulmón de Lewis ya sea que expresen o no EpCAM humano. Los cuadrados negros indican los volúmenes promedio de tumor en ratones con tumores derivados de LLC/KSA.. Los diamantes negros indican los volúmenes promedio de tumor en ratones con tumores derivados de LLC. Los ratones fueron tratados con 20 microgramos de KS-IL-12-IL-2 en los días 0, 1, 2, 3, y 4. Se efectuaron inyecciones intratumorales. El eje X indica el número de días transcurridos después de la primera inyección; el eje Y indica el volumen promedio de tumor en mililitros cúbicos.

La Figura 16 muestra el efecto del tratamiento con proteína de fusión anticuerpo-citoquina-citoquina de ratones con tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de pulmón de Lewis. Aproximadamente 10^{6} células fueron inyectadas en forma subcutánea en el Día 0. Los diamantes indican los volúmenes promedio de tumor en ratones naive. Los cuadrados indican los volúmenes promedio de tumor en ratones que habían tenido previamente tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma de pulmón de Lewis que fueron modificadas genéticamente para expresar EpCAM humano, y habían sido curados de esos tumores por tratamiento con KS-IL-12-IL-2. El eje X indica el número de días transcurridos después de la primera inyección; el eje Y indica el volumen promedio de tumor en mililitros cúbicos.

Las Figuras 17A y 17B muestran el efecto de la secreción de proteína sencilla o de múltiples citoquinas por las células tumorales sobre la capacidad de las células para formar tumores en un animal con un sistema inmunológico normal. En la Figura 17A, se comparan cuatro juegos de ratones: ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 1 x 10^{6} células de tumor LLC (diamantes negros); ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5 x 10^{6} células de tumor LLC (diamantes blancos); ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 1 x 10^{6} células de tumor LLC que expresan scIL-12 (triángulos negros); y ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5 x 10^{6} células de tumor LLC que expresan scIL-12 (triángulos blancos). La Figura 17B compara a los ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 1 x 10^{6} células de tumor LLC (diamantes negros); ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5 x 10^{6} células de tumor LLC (diamantes blancos); ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 1 x 10^{6} células de tumor LLC que expresan scIL-12-IL-2 (X's); y ratones C57BL/6 inyectados s.c. con 5 x 10^{6} células de tumor LLC que expresan scIL-12 (círculos blancos). El eje X indica el número de días transcurridos después de la inyección de las células tumorales. El eje Y indica el volumen de tumor en mililitros cúbicos.

La Figura 18 muestra el efecto de la secreción de proteína sencilla o de múltiples citoquinas por las células tumorales sobre la capacidad de las células para formar tumores en un animal inmunológicamente deficiente. Esta Figura compara ratones SCID inyectados s.c. con 1 x 10^{6} células de tumor LLC (diamantes negros); ratones SCID inyectados s.c. con 1 x 10^{6} células de tumor LLC que expresan scIL-12 (triángulos negros); y ratones SCID inyectados s.c. con 1 x 10^{6} células de tumor LLC que expresan scIL-12 (círculos blancos). El eje X indica el número de días transcurridos después de la inyección de las células tumorales. El eje Y indica el volumen de tumor en mililitros cúbicos.

Descripción detallada de la invención

La intención provee moléculas de proteína en las cuales dos o más citoquinas distintas se fusionan o forman un complejo. Los complejos de proteína o las proteínas de fusión pueden incluir opcionalmente fracciones adicionales de proteína, que incluyen fracciones capaces de multimerización y reconocimiento tales como las regiones Fc del anticuerpo, y las regiones del anticuerpo que incluyen sitios de combinación con el antígeno. La invención también provee ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión de múltiples citoquinas. La invención también provee métodos para la construcción de ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión de múltiples citoquinas, métodos para la producción de proteínas de fusión de múltiples citoquinas, y el uso de proteínas de fusión de múltiples citoquinas en el tratamiento de enfermedades y de condiciones médicas.

Como se la utiliza aquí, "citoquinas" se refiere a una proteína secretada o a un fragmento activo o mutante de la misma que modula la actividad de las células del sistema inmunológico. Los ejemplos de citoquinas incluyen las interleuquinas, interferones, quimoquinas, factores de necrosis tumoral, factores de estimulación de colonias para precursores inmunocitos, etc.

Como se la utiliza aquí, "citoquina heterodimérica" se refiere a una citoquina que consiste de dos subunidades distintas de proteína. Hasta el momento, IL-12 es la única citoquina heterodimérica de ocurrencia natural. Sin embargo, pueden construirse citoquinas heterodiméricas artificiales. Por ejemplo, IL-6 y un fragmento soluble de IL-6R pueden combinarse para formar una citoquina heterodimérica, como CNTF y CNTF-R alfa [Trinchieri (1994) Blood 84:4008].

Como se la utiliza aquí, "interleuquina-12" (IL-12) se refiere a las dos subunidades de citoquina que consisten de una subunidad p35 y una subunidad p40, o una fusión activa de cadena sencilla de p35 y de p40, o una variante de la especie, fragmento, o derivado de la misma.

Como se la utiliza aquí, "interleuquina-2" (IL-2) se refiere a cualquier IL-2 de mamífero, tal como IL-2 humano, IL-2 de ratón, o una especie activa o variante alélica, fragmento o derivado de la misma.

Como se lo utiliza aquí, "GM-CSF" se refiere a una proteína citoquina es un Factor de Estimulación de Colonias para Granulocito/Monocito de mamífero, tal como GM-CSF humano, GM-CSF de ratón, una especie activa o variante alélica, fragmento o derivado de la misma.

Como se utiliza aquí, "región Fc de la inmunoglobulina" significa la porción carboxi-terminal de una región constante de inmunoglobulina de cadena pesada, o un análogo o porción de la misma. Por ejemplo, una región Fc de inmunoglobulina de IgG puede comprender al menos una porción de una región de articulación, un dominio CH2, y un dominio CH3. En otra modalidad preferida, la región Fc incluye al menos un dominio CH2 y más preferiblemente también incluye al menos una porción de una región de articulación.

Como se lo utiliza aquí, un "péptido enlazador" significa uno o más péptidos utilizados para acoplar entre sí a dos proteínas (por ejemplo, una proteína y una región Fc). El péptido enlazador a menudo es una serie de aminoácidos tales como por ejemplo, predominantemente glicina y/o serina. Preferiblemente, el péptido enlazador es una serie mezclada predominantemente de residuos de glicina y de serina, y tiene una longitud aproximada de 10-15 aminoácidos.

Como se lo utiliza aquí, el término "multimérico" se refiere a la asociación estable de dos o más subunidades de proteína a través de una interacción covalente o no covalente, por ejemplo un enlazamiento de disulfuro.

Como se lo utiliza aquí, el término "dimérico" se refiere a una molécula multimérica específica en donde dos subunidades de proteína están asociadas en forma estable a través de interacciones covalentes o no covalentes. Un complejo estable es un complejo con una velocidad de disociación, o off-rate, de al menos varios minutos (de tal manera que el complejo sería lo suficientemente estable durante su uso in vivo para alcanzar a un tejido objetivo y tener un efecto biológico. El fragmento Fc por sí mismo forma típicamente un dímero de los fragmentos de cadena pesada que comprende una porción de la región de articulación, un dominio CH2 y/o un dominio CH3. Sin embargo, se conocen muchos ligandos de proteína para enlazarse a sus receptores como un dímero. Sí una citoquina X se dimeriza naturalmente, la fracción X en una molécula Fc-X se dimerizará hasta un grado mucho mayor, ya que el proceso de dimerización es dependiente de la concentración. La proximidad física de las dos fracciones X conectadas por medio de Fc harían de la dimerización un proceso intramolecular, que cambia mucho el equilibrio en favor del dímero y mejora su enlazamiento al receptor.

Como se lo utiliza aquí, "vector" significa cualquier ácido nucleico que comprende una secuencia competente de nucleótidos para ser incorporado dentro de una célula huésped y para ser recombinado con, e integrado dentro del genoma de la célula huésped, o para replicarse en forma autónoma como un episoma. Tales vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos, vectores de ARN, vectores virales y similares. Los ejemplos no limitantes de un vector viral incluyen un retrovirus, un adenovirus y un virus adenoasociado.

Como se lo utiliza aquí, "expresión génica" o "expresión de una proteína" se entiende que significa la transcripción de la secuencia de ADN, traducción de la transcripción de ARNm, y o bien la secreción de un producto proteico o la producción del producto proteico en una forma aislable.

Como se lo utiliza aquí, "inmunocitoquina" es una proteína de fusión que comprende un anticuerpo y una citoquina, como lo revela la patente estadounidense No. 5.650.150.

Como se lo utiliza aquí, una "secuencia líder" es una secuencia de proteína que está unida, usualmente al N-terminal, a una segunda secuencia de proteína, y que dirige a la segunda secuencia de proteína para ser secretada de una célula. La secuencia líder es usualmente escindida y removida de la segunda secuencia de proteína, que se convierte en la proteína madura. El término "secuencia líder" es generalmente sinónimo de la "secuencia señal".

Como se lo utiliza aquí, "EpCAM" se refiere a moléculas de adhesión de células epiteliales (Cirulli y colaboradores [1998] 140:1519-1534), y es sinónimo de "KSA", que significa el antígeno enlazado por el anticuerpo monoclonal KS-1/4. EpCAM es una proteína de la superficie de la célula que se expresa abundantemente en células cancerosas derivadas de células epiteliales.

Como se lo utiliza aquí, "KS-1/4" se refiere a un anticuerpo monoclonal particular que se enlaza a EpCAM.

Como se los utiliza aquí, "KS-IL2", "KS-IL12" y "KS-IL12-IL2" (y similares) se refieren a proteínas de fusión anticuerpo-citoquina que consisten de KS-1/4 con interleuquina-12, y KS-1/4 tanto con la interleuquina-12 como con la interleuquina-2, respectivamente. Las construcciones de proteína de fusión llamadas en forma análoga también son utilizadas aquí. Debido a que es posible fusionar citoquinas en diferentes posiciones sobre una molécula de anticuerpo, una descripción tal como "KS-IL12-IL2" se refiere a la clase de proteínas que comprenden KS-1/4 tanto con interleuquina-12 como con interleuquina-2 fusionadas en cualquier posición posible, a menos que explícitamente se establezca otra cosa.

Como se lo utiliza aquí, "14.18" se refiere a un anticuerpo monoclonal particular que se enlaza al antígeno específico GD2 del tumor.

Diferentes modalidades ilustrativas de construcciones de proteína que incorporan a la invención se ilustran en las Figuras 1-5. Partes de las moléculas diagramadas en las figuras 2-5 están marcadas 1A-II, refiriéndose a las proteínas de fusión mostradas en las Figuras 1A-II e ilustrando que cualquiera de las fronteras de fusión de la Figura 1 puede fusionarse además a otras proteínas como las indicadas. Las citoquinas se muestran como rectángulos, las regiones constantes de anticuerpos se muestran como óvalos, y la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena liviana se muestran como óvalos marcados.

La presente invención describe complejo de proteína que contienen dos diferentes citoquinas y opcionalmente incluyen fracciones adicionales de proteína. Una citoquina homodimérica (por ejemplo interferón alfa, interferón beta, interferón gama, IL-5, IL-8, o similares), aunque contiene múltiples subunidades, es sin embargo una citoquinas sencilla. En forma similar, una citoquina heterodimérica tal como IL-12, aunque contiene subunidades que son diferentes, es una citoquina sencilla. Además, una forma heterodimérica de citoquinas normalmente homodiméricas, tal como un heterodímero MCP-l/MCP-2, o de dos alelos de una citoquina normalmente homodimérica (por ejemplo, Zhang, J. Biol. Chem. [1994] 269:15918-24) es una citoquina sencilla. Los complejos de la presente invención contienen dos citoquinas diferentes, cada una de las cuales (por ejemplo IL-2, IL-12; y GM-CSF), es capaz de modular una actividad de una célula del sistema inmunológico.

La Figura 1A describe una modalidad preferida de la invención: en la proteína de fusión 10, el C-terminal de una primera citoquina 12 se fusiona al N-terminal de una segunda citoquina 14, opcionalmente a través de una región enlazadora (no mostrada). En algunas modalidades de la inversión, el complejo de proteína de la invención contiene al menos dos citoquinas cada una con una vida media significativamente diferente en suero. Por ejemplo, utilizando una proteína pequeña y una grande a menudo resultará en una proteína de fusión con una vida media en circulación característica de la proteína más grande. Por lo tanto, en situaciones en donde se desean los efectos combinados de IL-12 y una segunda citoquina, sería conveniente expresar a las dos citoquinas como una proteína de fusión de la fórmula general: IL-12-X o X IL-12, en donde X es una segunda citoquina. Se observan dos ventajas particulares. Primero, se extiende la vida media en el suero de la citoquina más fácilmente depurada. Segundo, la vida media en el suero de ambas citoquinas se hace muy similar.

Una citoquina de cadena doble tal como IL-12 puede fusionarse a otra citoquina en el N-terminal o en el C-terminal en cualquiera de las cadenas de la citoquina doble cadena. En una modalidad, una segunda citoquinas se fusiona ya sea al N-terminal o al C-terminal de la subunidad p35 o de la subunidad p40 de IL-12 (Figuras 1B-1E). En la proteína de fusión y 6 de la Figura 1B, el N-terminal de una primera citoquina 12 se fusiona al C-terminal de la subunidad p40 de IL-12 18. La subunidad p40 18 se conecta a la subunidad p35 de IL-12 20 por medio de un enlace covalente 22. En la proteína de fusión 24 de la Figura 1C, el N-terminal de la subunidad p40 18 se fusiona al C-terminal de la primera citoquina 12 y se conecta a la subunidad p35 20 por medio de un enlace covalente 22. La Figura 1D describe a la proteína de fusión 26 en la cual el N-terminal de la primera citoquina 12 se fusiona al C-terminal de la subunidad p35 20, que se conecta por medio de un enlace covalente 22 a la subunidad p40 18. En la Figura 1E, la proteína de fusión 28 incluye una subunidad p35 20, fusionada a su N-terminal del C-terminal de la primera citoquina 12 y se conecta por medio de un enlace covalente 22 a la subunidad p40 18.

En una segunda modalidad, las subunidades de IL-12 pueden fusionarse para formar una proteína de cadena sencilla, scIL-12, ya sea con la subunidad p35 o con la subunidad p40 en la posición N-terminal; la segunda citoquina puede estar unida al N-terminal o al C-terminal de la scIL-12 resultante (Figuras 1F-1l). Así, en una modalidad preferida descrita en la Figura 1F, la proteína de fusión 30 contiene IL-12 de cadena sencilla, en la cual el N-terminal de la subunidad p40 18 se fusiona al C-terminal de la subunidad p35 20, opcionalmente a través de un péptido enlazador. En esta modalidad, el N-terminal de la citoquina 12 se fusiona al C-terminal de la subunidad p35 C-terminal de la subunidad p40 18. En la modalidad mostrada en la Figura 1G, el N-terminal de la subunidad p35 20 se fusiona al C-terminal de la subunidad p40, opcionalmente a través de un péptido enlazador. En la proteína de fusión 34, mostrada en la Figura 1H, el N-terminal de la citoquina 12 se fusiona al C-terminal de la subunidad p35 20. En la proteína de fusión 36, mostrada en la Figura 11, el N-terminal de la subunidad p40 18 se fusiona al C-terminal de las citoquina 12. En una modalidad altamente preferida, IL-12 se fusiona a IL-2.

La producción de tales moléculas se ilustra además en los ejemplos.

A menudo es conveniente expresar moléculas heteromultiméricas, tales como IL-12 o un anticuerpo, como moléculas de cadena sencilla en las cuales las subunidades no idénticas se conectan por medio de enlazadores cortos de aminoácidos [Huston y colaboradores (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. 85: 5879; Lieschke y colaboradores (1997) Nat Biotechnol. 15:35; Lieschke; G. J. y Mulligan; R C., patente estadounidense No. 5.891.680]. Se construye una fusión génica, y luego la proteína deseada puede expresarse en células que contienen una construcción sencilla de ADN recombinante. Tales versiones de cadena sencilla de una citoquina heteromultimérica pueden fusionarse además a una segunda citoquina, que aún permite a una proteína de fusión con las actividades deseadas, ser expresada a partir de una construcción sencilla de ADN recombinante. La expresión de tales moléculas se ilustra en los ejemplos.

La invención también describe proteínas de fusión en las cuales diferentes citoquinas múltiples fusionadas se fusionan además a una proteína capaz de formar multímeros, tales como homodímeros o heterodímeros. La ventaja de una molécula tal es que la potencia de una o más de las citoquinas puede mejorarse por dimerización. En algunos casos, el mejoramiento de la potencia por dimerización puede ocurrir debido a que la citoquina se enlaza a su receptor como un dímero. En una modalidad, se fusionan múltiples citoquinas a una porción de una molécula de anticuerpo, tal como una región Fc (Figura 2). En otra modalidad, IL-12 y una segunda citoquina se fusionan a la fracción de proteína de homodimerización. En una modalidad preferida, la segunda citoquina es EL-2 o GM-CSF. Las proteínas de fusión pueden crearse en una variedad de formas, reflejando todos los diferentes ordenamientos de las diferentes fracciones de proteína de los terminales N a C en una proteína de fusión. Por ejemplo, cuando la interleuquina -12 y una segunda citoquina se fusionan a una región Fc, las dos citoquinas pueden fusionarse ambas en cualquier orden al terminal N o al terminal C de la región Fc, o una citoquina puede fusionarse al N-terminal y la otra al C-terminal.

Algunas de estas permutaciones se ilustran en la Figura 2. Por ejemplo, en la modalidad mostrada en la Figura 2A, una proteína de fusión 44 de la invención se fusiona al C-terminal de una región Fc que contiene una región de articulación 38, una región CH2 40 y una región CH3 42. La proteína de fusión 44 podría tener una variedad de estructuras, incluyendo, por ejemplo, las estructuras de las proteínas de fusión 10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36 descritas en las Figuras 1A - 1l. Sí la proteína de fusión 44 tiene más de un N-terminal y un C-terminal, como en las proteínas de fusión 16, 24, 26 y 28, la región Fc podría fusionarse a cualquier N-terminal de la proteína de fusión 44. Como se muestra en la Figura 2B, la proteína de fusión 44 podría fusionarse al N-terminal de una región Fc. En la modalidad mostrada en la Figura 2C, una primera citoquina 12 podría fusionarse al N-terminal de una región Fc, y una segunda citoquina 14 podría fusionarse al C-terminal de la región Fc.

Consideraciones estructurales

Es importante observar que las citoquinas, como una clase de proteínas, son similares en tamaño y en las propiedades generales de plegamiento. Así, los Ejemplos específicos revelados aquí ilustran como construir proteínas de fusión de múltiples citoquinas para la familia de las proteínas citoquina. Por ejemplo, muchas citoquinas caen dentro de una clase de plegamiento de proteína llamada el "haz de cuatro hélices". Las proteínas en haz de cuatro hélices incluyen al factor de estimulación de colonias para granulocito (G-CSF), a la interleuquina 6 (IL-6), al factor inhibidor de leucemia (LIF), a la hormona de crecimiento, al factor ciliar neurotrófico (CNTF), a la leptina, a la eritropoyetina, al factor de estimulación de colonias macrófagas para granulocitos (GM-CSF), a la interleuquina-5 (IL-5) al factor estimulador de colonias macrófagas (M-CSF), IL-2, IL-4, a la interleuquina-3 (IL-3), IL-10, al interferón-beta, al interferón-alfa y al interferón tau estrechamente relacionado, y al interferón gama (IFN-gama).

Con la excepción de IL-5 y de IFN-gama, todas estas proteínas se pliegan como monómeros con cuatro hélices alfa aproximadamente paralelas y dos conexiones entrecruzadas. En cada caso, excepto para IL-5 e IFN-gama, el N-terminal y el C-terminal están sobre la misma cara de la proteína. Debido a que las proteínas en haz de cuatro hélices, excepto IL-5 e IFN-gama, tienen el mismo patrón de plegamiento, los métodos descritos aquí para IL-2, IL-4 y GM-CSF también aplican para otras proteínas en haz de cuatro hélices, y otras proteínas citoquinas pequeñas que se pliegan como monómeros.

Las quemoquinas son una clase específica de citoquinas que se piensan que forman gradientes extracelulares y median la quemotaxis de clases específicas de inmunocitos. Por ejemplo, MCP-1 es un quimioatrayente para monocitos, macrófagos, y células T activadas; la eotaxina es un quimioatrayente para eosinófilos; y la interleuquina-8 es un quimioatrayente para neutrófilos. Además de su función quimioatrayente, las quemoquinas, así como otras citoquinas, son capaces de inducir la expresión de genes específicos en células objetivo específicas. Por ejemplo, MCP-1 se piensa que induce la expresión del Factor Tisular en células vasculares de músculo liso (Schecter y colaboradores, J. Biol. Chem. [1997] 272:28568-73).

La invención revela fusiones citoquina-citoquina fusiones anticuerpo-citoquina-citoquina en las cuales una o más citoquinas es una quemoquina.

El genoma humano, por ejemplo, codifica al menos 50 quemoquinas. Las quemoquinas conocidas generalmente comparten una estructura similar tridimensional de monómero y un patrón de plegamiento de proteína. Por lo tanto, los tipos generales de construcciones de proteína y estrategias de construcción reveladas aquí pueden ser aplicadas a una variedad de quemoquinas conocidas o aún por descubrir.

Las quemoquinas tienen un patrón de plegamiento distinto con tres cadenas beta y una hélice alfa. Las quemoquinas se pliegan como monómeros y, en algunos pero no en todos los casos, se dimerizan entonces después del plegamiento. Para todas las quemoquinas, el patrón de plegamiento de las subunidades de monómero es idéntico y las estructuras completas son extremadamente similares. Por ejemplo, las estructuras tridimensionales de interleuquina-8, el factor Plaquetario 4, la actividad de estimulación de crecimiento de Melanoma (MGSA), la proteína Macrófaga inflamatoria, MIP, RANTES (regulada por activación, células T normales expresadas y secretadas), proteína-1 quimioatrayente de Monocitos (MCP-1, MCAF), Eotaxina, proteína-3 quimioatrayente de Monocitos (MCP-3), dominio de Quemoquina de fractalquina, péptido-2 de activación neutrófila (NAP-2), factor-1 derivado de células Estromales (SDF-1), proteína-2 Macrófaga inflamatoria. Se ha determinado por medio de cristalografía de rayos X y/o por métodos de RMN a la quemoquina hcc-2(proteína-5 macrófaga inflamatoria), a Gro beta, al quimioatrayente neutrófilo inducido por Citoquina, y a CINC/Gro; todas estas estructuras muestran el mismo plegamiento y son generalmente similares. Debido a que las quemoquinas tienen el mismo patrón de plegamiento, los métodos descritos aquí para la linfotactina aplican también para otras proteínas quemoquinas.

Un N-terminal libre de una quemoquina es a menudo importante por su función. Por lo tanto, es conveniente en algunas modalidades construir fusiones en las cuales una segunda citoquina, fracción de anticuerpo, u otra fracción de proteína puedan ser fusionadas al C-terminal de la quemoquina. Para construir un complejo de proteína que contiene dos quemoquinas activas, es útil, por ejemplo, fusionar las dos quemoquinas diferentes a los N-terminales de cadenas pesada y ligera de anticuerpo. Algunas quemoquinas, tales como IL-8, son diméricas bajo condiciones fisiológicas. Para ciertas aplicaciones, es útil expresar conjuntamente una fusión de anticuerpo con múltiples citoquinas, tal como una fusión IL-8-anticuerpo-citoquina, junto con una fracción IL-8 no fusionada o una fracción IL-8 con un patrón de fusión diferente que no interactúa con la fracción de anticuerpo. De esta forma, las fracciones IL-8 diferentes pueden heterodimerizarse sin constreñimientos espaciales o polimerización que pudiera resultar si todas las fracciones IL-8 fueran fusionadas a una cadena de anticuerpo. La proteína de fusión de múltiples citoquinas puede separarse entonces sobre la base del tamaño o sobre la base del enlazamiento a una proteína de enlazamiento a anticuerpo tal como una proteína de Estafilococo A.

Para proteínas de fusión de múltiples citoquinas que comprenden una quemoquina, una modalidad preferida es aquella en que la proteína de fusión también comprende una función de localización, tal como una fracción de anticuerpo que se enlaza a un antígeno. Sin desear estar sujeto a la teoría, se piensa generalmente que la extendida distribución en el organismo de una quemoquina, no tendrá efecto o conducirá a una desensibilización general de las células hacia esa quemoquina. Además, se piensa que la función quimioatrayente de una quemoquina solamente puede manifestarse cuando existe una concentración diferencial de la quemoquina.

Extendiendo la elevación media de las citoquinas múltiples con vidas medias cortas en el suero

La invención también describe proteínas de fusión que comprenden dos citoquinas, ambas con corta vida media en el suero, fusionadas a una tercera fracción con larga vida media en el suero. La molécula resultante es un potente estimulante de la proliferación y la actividad de las células dendríticas.

La región Fc, sola o como parte de un anticuerpo intacto, puede conferir diferentes propiedades a las fusiones de múltiples citoquinas que pueden ser ventajosas o desventajosas, dependiendo de la aplicación específica. Estas propiedades incluyen dimerización, extensión de la vida media en el suero, capacidad para fijar complementos, capacidad para mediar la citotoxicidad mediada por las células dependientes del anticuerpo (ADCC), y el enlazamiento a receptores Fc. Si la extensión de la vida media en el suero es una característica primaria deseada y las propiedades inmunológicas de la región Fc no son importantes o indeseables, es preferible utilizar una región Fc que es una variante o mutante natural que carece de una o más propiedades inmunológicas. Por ejemplo, para igualar y extender la vida media en le suero de dos o más citoquinas con corta vida media en el suero, es preferible construir una proteína de fusión de múltiples citoquinas que comprenden una región Fc de IgG2 o IgG4 humana, que tienen respectivamente habilidad reducida o ninguna afinidad por los receptores Fc, o para usar una región Fc que transporta una mutación en el sitio de enlazamiento del receptor Fc. En realidad, ya se ha mostrado que la fusión de algunas citoquinas a anticuerpos incrementa la afinidad de la proteína de fusión por los receptores Fc, y que esto resulta en velocidades más altas de depuración en animales. El uso de regiones Fc con afinidad reducida por los receptores Fc se mostró que mejora grandemente la vida media en el suero de estas moléculas (Gillies y colaboradores [1999] Cancer Res. 59:2159-2166). Bajo algunas circunstancias y dependiendo de las citoquinas utilizadas, una región Fc que se enlaza al receptor Fc resultará en la internalización de la proteína de fusión de múltiples citoquinas y la degradación de una o más fracciones de citoquina.

Reconocimiento

La invención también describe proteínas de fusión en las cuales dos o más citoquinas están unidas a una proteína que es capaz de localizar a las citoquinas en una molécula particular objetivo, célula o parte del cuerpo. La molécula preferida con capacidad de localización es un anticuerpo o una fracción que comprende a las regiones variables para enlazamiento del antígeno de un anticuerpo. Sin embargo, pueden utilizarse otras moléculas de localización o dominios de las mismas, tales como ligandos o receptores específicos, proteínas de enlazamiento de ocurrencia natural, enzimas que se enlazan a sustratos particulares, péptidos generados en forma artificial que han sido seleccionados para un enlazamiento particular o capacidad de localización, péptidos con propiedades fisicoquímicas distintas que resultan en una capacidad de reconocimiento, proteínas que poseen una capacidad de reconocimiento en virtud del enlazamiento a otra molécula que es dirigida, u otros tipos de proteínas. En el caso de fusión de dos citoquinas a una molécula de reconocimiento, una primera citoquina preferida es IL-12. Cuando se utiliza IL-12, una segunda citoquina preferida es IL-2 o GM-CSF.

En el caso de un anticuerpo, existen un gran número de formas por las cuales dos o más citoquinas pueden fusionarse, debido a que existen diferentes sitios posibles de unión. Por ejemplo, un anticuerpo de IgG consiste de dos cadenas pesadas, y dos cadenas livianas. Las dos citoquinas pueden fusionarse una a la otra, y luego fusionarse a un N-terminal o a un C-terminal ya sea de la cadena pesada o de la cadena liviana. Alternativamente cada citoquina puede fusionarse separadamente a uno de los terminales N o C sobre la molécula de anticuerpo.

La Figura 3 ilustra un subconjunto de formas en dos citoquinas que pueden fusionarse a una molécula de anticuerpo. Por ejemplo, con referencia a la Figura 3A, una proteína de fusión 44 de la invención podría fusionarse al C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobina 46, que está asociada a una cadena liviana de inmunoglobina 48. Como en la Figura 2, la proteína de fusión 44 puede tener una variedad de estructuras, incluyendo, por ejemplo, las estructuras de las proteínas de fusión 10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ó 36 descritas en las Figuras 1A-1l. Como se muestra en la Figura 3B, una proteína de fusión 44 podría fusionarse al N-terminal de una cadena pesada de inmunoglobina 46 asociada con una cadena liviana de inmunoglobina 48. En las modalidades mostradas en las Figuras 3C y 3D, la proteína de fusión 44 se fusiona al N-terminal (Figura 3C) o al C-terminal (Figura 3D) de una cadena liviana de inmunoglobina 48 asociada con una cadena pesada de inmunoglobina 46. Como se muestra en las Figuras 3E y 3F, una primera citoquina 12 puede fusionarse a una cadena liviana de inmunoglobina 48 asociada con una cadena pesada de inmunoglobina 46 fusionada a una segunda citoquina 14. Las citoquinas 12 y 14 pueden fusionarse a los N-terminales (Figura 3E) o a los C-terminales (Figura 3F) de las cadenas de inmunoglobina. Alternativamente, como en la Figura 3G, la primera citoquina 12 puede fusionarse al N-terminal de la cadena liviana de inmunoglobina 48 mientras que la segunda citoquina 14 se fusiona al C-terminal de cadena pesada de inmunoglobina 46.

Fusiones a anticuerpos de cadena sencilla

Algunas veces es conveniente expresar anticuerpos como moléculas de cadena sencilla. La invención también provee proteínas de fusión en las cuales dos o más citoquinas se fusionan a un anticuerpo de cadena sencilla. Esto tiene la ventaja de reducir el número de las construcciones de ADN utilizadas cuando se expresa la proteína de fusión deseada, que puede ser especialmente útil en terapia génica. En particular, si las citoquinas son moléculas de cadena sencilla, la fusión de las citoquinas al anticuerpo de cadena sencilla permitirá la expresión de la proteína de fusión como una cadena sencilla de proteína.

Como se muestra en las Figuras 4A-4C, en algunas modalidades, las citoquinas pueden fusionarse al anticuerpo de cadena sencilla en su N-terminal, su C-terminal, o a ambos terminales. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 4A, la proteína de fusión 44 puede fusionarse al C-terminal del anticuerpo de cadena sencilla 50 que tiene una región variable de cadena liviana 52 y una región variable de cadena pesada 54. Como se muestra en la Figura 4B, la proteína de fusión 44 puede fusionarse también al N-terminal de un anticuerpo de cadena sencilla 50. En la modalidad mostrada en la Figura 4C, una primera citoquina 12 se fusiona al N-terminal del anticuerpo de cadena sencilla 50, y una segunda citoquina 14 se fusiona al C-terminal del anticuerpo de cadena sencilla 50.

Una modalidad preferida comprende una fusión de IL-12 y una segunda citoquina al anticuerpo de cadena sencilla. Una modalidad más preferida comprende IL-2 o GM-CSF como la segunda citoquina.

Las regiones constantes de los anticuerpos tienen el potencial para mediar una variedad de funciones efectoras. Por ejemplo, IgG1 media la fijación del complemento, ADCC, y el enlazamiento al receptor Fc. La posición a la cual se fusiona la citoquina puede alterar la función efectora de la región constante del anticuerpo, que es útil si se desea la modulación de estas funciones efectoras.

En algunos casos puede ser deseable construir una fusión de dos o más citoquinas a una fracción con la región de reconocimiento de un anticuerpo, pero sin las regiones constantes. Tal proteína de fusión es más pequeña que una fusión de un anticuerpo completo a dos o más citoquinas, lo cual puede ser ventajoso para ciertos propósitos. Además, tal proteína de fusión carecerá de una o más funciones efectoras de un anticuerpo intacto, peo retendrá la capacidad de reconocimiento de un anticuerpo.

Por lo tanto la invención se parece a las proteínas de fusión en las cuales dos o más citoquinas se fusionan a una región Fv de cadena sencilla. Como se muestra en las modalidades descritas en las Figuras 5A-5C, dos citoquinas pueden fusionarse al N-terminal o al C-terminal de la región Fv, o una citoquina a cada terminal. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 5A, una proteína de fusión 44 de la invención, puede fusionarse al C-terminal de una región Fv de cadena sencilla que contiene una región variable de cadena liviana de inmunoglobina 52, y una región variable de cadena pesada de inmunoglobina 54. Una proteína de fusión 44 puede fusionarse también al N-terminal de una región Fv como se muestra en la Figura 5B. Como se muestra en la Figura 5C, una primera citoquina 12 puede fusionarse al N-terminal de una región Fv, y una segunda citoquina 14 puede fusionarse al C-terminal de la región Fv.

Anticuerpos como vehículos heterodiméricos para múltiples citoquinas

En algunas circunstancias, es deseable construir una fusión de dos o más citoquinas en la cuales, para dos de las citoquinas, el mismo extremo de la proteína es esencial para su actividad. Por ejemplo, puede ser que el N-terminal de ocurrencia natural de dos diferentes citoquinas sea esencial para la actividad de cada citoquina. No es posible construir una proteína de fusión de cadena sencilla de polipéptido en la cual ambas fracciones de citoquina fueran activas.

Los anticuerpos son proteínas heterodiméricas que consisten de cadenas livianas y pesadas que están covalentemente enlazadas por enlaces disulfuro. Si se desea construir una proteína de fusión de múltiples citoquinas con dos fracciones de citoquina que requieran ambas un N-terminal intacto no fusionado, es preferible fusionar separadamente a las dos citoquinas a los N-terminales de las cadenas pesada y liviana de un anticuerpo (Figura 3E). En forma similar, si se desea construir una proteína de fusión de múltiples citoquinas con dos fracciones de citoquina que requieren ambas un C-terminal intacto no fusionado, es preferible fusionar separadamente las dos citoquinas a los C-terminales de las cadenas pesada y liviana de un anticuerpo (Figura 3F). Si el anticuerpo se utiliza solamente como un vehículo para conectar a dos citoquinas de esta forma, puede ser útil mutar o suprimir esas porciones del anticuerpo que confieren propiedades adicionales relacionadas con la función inmune. Por ejemplo, puede ser preferible utilizar una región Fab como vehículo, ya que la región Fab retiene la característica de heterodimerización de un anticuerpo pero carece de las funciones características de la región Fc. También puede ser útil usar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo en el cual el sitio de combinación del antígeno es no funcional.

Las fusiones de múltiples citoquinas a anticuerpos combinan muchas de las nuevas características de la invención. En las fusiones anticuerpo-múltiples citoquinas, la vida media en el suero de las citoquinas es compensada y extendida; la actividad de ambas citoquinas es ubicada como un objetivo y se evitan los efectos especialmente tóxicos debidos a la administración sistémica de múltiples citoquinas que actúan sinergísticamente; cada citoquina es dimerizada o multimerizada en forma efectiva; y las citoquinas no necesitan ser directamente fusionadas pero pueden fusionarse a sitios diferentes sobre las cadenas pesada y liviana de la molécula de anticuerpo.

En el diseño de una proteína de fusión que comprende múltiples citoquinas y un anticuerpo, existe un número de opciones y de configuraciones que pueden caracterizarse por medio de experimentación de rutina. Las consideraciones biológicas estructurales también son útiles. Por ejemplo, muchas citoquinas caen dentro de una clase llamada de haces de 4 hélices. Estas estructuras consisten de cuatro hélices alfa y tienen al N-terminal y al C-terminal en los mismos alrededores. En general, la cara de una citoquina alrededor del N-terminal y del C-terminal no es utilizada en el enlazamiento a un receptor de citoquina, de tal manera que puede utilizarse cualquier terminal para la fusión a un anticuerpo o a una segunda citoquina. Sin embargo, a veces es difícil fusionar directamente ambos terminales N y C de una citoquina con un haz de 4 hélices a diferentes fracciones, por razones estéricas. Cuando se desea fusionar dos citoquinas diferentes de haz de 4 hélices a un anticuerpo, es útil por lo tanto fusionar cada citoquina a un sitio diferente sobre el anticuerpo. Alternativamente, si es necesario construir una cadena de polipéptido de la forma citoquina-citoquina-cadena de Ig, pueden utilizarse uno o más enlazadores flexibles para superar los problemas
estéricos.

En vez de un anticuerpo, también es posible utilizar otras moléculas heterodiméricas secretadas para transportar múltiples citoquinas. Por ejemplo, un complejo que incluye antígeno prostático específico y al inhibidor de la proteasa con el cual forme el complejo, podrían utilizarse la cadena pesada IgA y la cadena J, miembros de la familia TGF-beta y sus patrones de enlazamiento como los de la astacina, o IL-12.

Ácidos nucleicos

La invención también se ocupa de ácidos nucleicos capaces de expresar a cada uno de los tipos de proteínas anteriores. Estos incluyen ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que comprenden dos o más citoquinas, fusiones que comprenden dos o más citoquinas y un dominio de dimerización tal como una región Fc, fusiones que comprenden dos o más citoquinas fusionadas a un anticuerpo, y dos o más citoquinas fusionadas a una región Fv. Las formas preferidas de los ácido nucleicos son los vectores de ADN a partir de los cuales las proteínas de fusión pueden expresarse ya sea en células bacteriales o de mamífero. Para proteínas de fusión que comprenden múltiples cadenas de polipéptido, pueden utilizarse más de un ácido nucleico de codificación. Alternativamente, puede ser útil colocar dos o más secuencias de codificación de proteínas de fusión sobre una molécula sencilla de ácido nucleico. Los Ejemplos ilustran formas particulares de los ácidos nucleicos caracterizados que codifican a múltiples citoquinas.

Los ácidos nucleicos de la invención son particularmente útiles para la expresión de proteínas de fusión de múltiples citoquinas, ya sea para la producción de estas proteínas o para propósitos de terapia génica.

Los métodos para sintetizar modalidades útiles de la invención, así como los ensayos útiles para probar su actividad farmacológica, se describen en los Ejemplos.

La presente invención también provee composiciones farmacéuticas y su uso en el tratamiento y la prevención de una amplia variedad enfermedades, incluyendo pero no limitándose al tratamiento de diferentes infecciones y al cáncer, y la vacunación contra diferentes enfermedades.

Las proteínas de fusión de múltiples citoquinas pueden utilizase para tratar infecciones bacteriales, parasitarias, por hongos, virales, o cáncer. Por ejemplo, se sabe que IL-12 tiene un efecto protector en muchos tipos de infecciones, que incluyen pero no se limitan a infecciones con la bacteria Listeria monocylogenes; los parásitos Toxoplasma gondii, Leishmania major, y Schistosoma masoni; los hongos Candida albicans; y los virus coriomenigitis virus y citomegalovirus. Ya que las citoquinas actúan generalmente en combinación, a menudo es útil usar proteínas de fusión que comprenden dos o más citoquinas que son conocidas por actuar sinergísticamente. Por ejemplo, ya que IL-2 potencia los efectos de IL-12, es útil combinar estas citoquinas en el tratamiento de enfermedades bacteriales, parasitarias, por hongos y virales.

Un tratamiento preferido de enfermedades infecciosas involucra el uso de proteínas de fusión de múltiples citoquinas que se fusionan además a un agente de reconocimiento que ubica a las múltiples citoquinas en el sitio de la infección. Se describen más abajo diferentes estrategias de reconocimiento.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser usadas en forma de dosificaciones sólidas, semisólidas, o líquidas, tales como, por ejemplo, píldoras, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones, o similares, preferiblemente en formas de dosificación unitarias adecuadas para la administración de dosis precisas. Las composiciones incluirán un vehículo farmacéutico convencional o excipiente y, además, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, vehículos, adyuvantes, etc. Tales excipientes pueden incluir otras proteínas, tales como, por ejemplo, albúmina de suero humano o proteínas de plasma. Los métodos actuales para prepara tales formas de dosificación sin conocidos, o serna evidentes para aquellos entrenados en la técnica. Las composiciones o formulaciones que van a ser administradas, contendrán, en cualquier caso, una cantidad del(los) componente(s) activo(s) en una cantidad efectiva para lograr el efecto deseado en el individuo sometido a tratamiento.

La administración de estas composiciones puede hacerse a través de cualquiera de los modos aceptados de administración para los agentes que exhiben tal actividad. Estos métodos incluyen administración oral, parenteral, o tópica, u otras formas sistémicas. La inyección es un método preferido de administración.

La cantidad de compuesto activo administrada, será dependiente por supuesto, del individuo que está siendo tratado, de la severidad de la aflicción, de la forma de administración, y del juicio del médico que hace la prescripción.

Como se describió antes, citoquinas tales como IL-2, IL-12, GM-CSF, y otras, han sido investigadas para el tratamiento del cáncer. Bajo algunas circunstancias es conveniente utilizar una proteína de fusión de múltiples citoquinas en el tratamiento del cáncer, por razones de administración más simple, mayor vida media en el suero de una de las citoquinas componentes, y/o modulación superior de la actividad relativa de las dos citoquinas.

Un uso preferido para el tratamiento de cáncer involucra dirigir las citoquinas a un órgano o tejido particular, para que el efecto de las citoquinas pueda ser concentrado y pueden evitarse los efectos secundarios de la distribución sistémica. Por ejemplo, las funciones de múltiples citoquinas a una región Fc se espera que se concentre en el hígado, lo cual puede ser útil en el tratamiento del cáncer limitado al hígado. Una aproximación más preferida es el uso de una proteína de fusión de múltiples citoquinas que se fusiona además a un agente de reconocimiento tal como un anticuerpo. En particular, los anticuerpos KS-1/4 y 14.18 se dirigen contra anticuerpos específicos del tumor (Varki NM y colaboradores, Cancer Res [1984] 44:681-7; Gillies y colaboradores, Journal of Immunological Methods 125:191 [1989]; patentes estadounidenses Nos. 4.975.369 y 5.650.150). Cuando se utiliza la fusión anticuerpo-múltiples citoquinas, a menudo es útil investigar el tipo de tumor y escoger cualquier anticuerpo dirigido contra un antígeno que probablemente está presente sobre ese tipo de tumor. Por ejemplo, puede ser útil caracterizar el tumor por medio de análisis FACS, Western blot, examen del ADN del tumor, o identificación simple del tipo de célula tumoral. Tales métodos de caracterización del tumor son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica de caracterización tumoral, tales como oncólogos y biólogos de tumores. También es posible dirigir a las proteínas de fusión de múltiples citoquinas a través de una variedad de otros medios, tales como fusión a ligandos específicos o fracciones de receptores, fusión a aptámeros de péptidos con actividad de enlazamiento preseleccionada, conjugación química a moléculas pequeñas con características de localización, etc. Estos métodos dirigidos pueden utilizarse también para el tratamiento de otras enfermedades, tales como infecciones.

Tratamiento de cáncer y de otros desordenes celulares por medio de terapia génica

Los ácidos nucleicos de la invención pueden utilizarse como agentes para terapia génica para el tratamiento de cáncer y de otras enfermedades en las cuales es deseable dirigir el sistema inmunológico a un tipo específico de célula. Por ejemplo, Las células cancerosas pueden removerse de un humano o una animal, transfectar uno o más ácidos nucleicos que codifican a una proteína de fusión de múltiples citoquinas dentro de las células cancerosas, e introducir luego las células cancerosas en un humano o animal. Alternativamente, el ADN puede ser introducido dentro de células cancerosas in situ. El humano o el animal montan entonces una respuesta inmune a las células cancerosas, que pueden curar o disminuir la severidad del cáncer. Una fusión génica de múltiples citoquinas, acoplada a elementos reguladores apropiados para promover la expresión en células de mamífero, puede ser transfectada dentro de células cancerosas por medio de cualquier ente una variedad de técnicas, que incluyen el método de fosfato de calcio, una "pistola génica", vectores de adenovirus, liposomas catiónicos, vectores retrovirales, o cualquier otro método eficiente de transfección. El ácido nucleico puede codificar una proteína de fusión de múltiples citoquinas que se fusiona además a otras fracciones.

La terapia génica anticáncer con un ácido nucleico que expresa una fusión de más de una citoquina fusionada, puede combinarse con otros tratamientos para el cáncer, tales como los tratamientos que pueden aumentar las propiedades de estimulación inmunológica de la proteína fusionada de citoquina. Por ejemplo, el ácido nucleico de la invención puede expresar también otras fracciones de proteína que pueden ayudar en el desarrollo de una respuesta inmune a antígenos expresados por las células de cáncer, o puede ser cotransfectado con otros ácidos nucleicos que expresan a tales fracciones de proteína. En particular, los ácidos nucleicos que expresan a la proteína de superficie coestimuladora de B7 pueden cotranfectarse dentro de las células cancerosas [Robinson y colaboradores, patente estadounidense No. 5.738.852]. La transfección de células cancerosas con un ácido nucleico que expresa la fusión de múltiples citoquinas, puede también estar acompañada por el tratamiento con un anticuerpo o inmunocitoquina que dirige a las células del cáncer [Lode y colaboradores (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. 95:2475]. La transfección de células de cáncer con un ácido nucleico que expresa la fusión de múltiples citoquinas, puede también estar acompañada por el tratamiento con un bloqueador angiogénesis [Lode y colaboradores (1999) Proc. Nat. Acad. Sci. 9:1591].

Las terapias que utilizan estimuladores inmunológicos adicionales y/o bloqueadores de angiogénesis, pueden combinarse también con tratamiento sistémico con proteínas de fusión de múltiples citoquinas. Una ventaja del tratamiento conjunto con estimuladores inmunológicos adicionales o bloqueadores de angiogénesis, es que esos tratamientos, a diferencia de los agentes que dañan al ADN y de los bloqueadores del ciclo celular, no matan a las células inmunes que pueden dividirse debido a la estimulación por medio de la proteína de fusión de múltiples citoquinas.

Una modalidad preferida de esta aproximación de terapia génica es la de introducir uno o más ácidos nucleicos que codifican a IL-12 y una segunda citoquina dentro de células cancerosas, y luego reintroducir las células cancerosas dentro del humano o el animal. La segunda citoquina es preferiblemente IL-2 o GM-CSF.

La presente invención provee nuevas composiciones de vacunas y utiliza como adyuvantes de las pretendidas vacunas para proveer una respuesta inmune mediada por células protectoras en mamíferos huéspedes vacunados contra ciertos patógenos, utilizando como adyuvante dos o más citoquinas que han sido fusionadas. Por ejemplo, si se desea una respuesta inmune Th1, pueden fusionarse citoquinas que promueven múltiples Th1, y la proteína de fusión resultante administrada a un animal en combinación con un antígeno.

En particular, IL-12 e IL-2 pueden fusionarse y administrarse con un antígeno. Alternativamente, IL-12 e IL-2 pueden fusionarse además a una proteína antigénica en si misma, y utilizada par estimular una respuesta inmune. En este caso, la invención se dirige a vacunas que cuentan con la inmunidad mediada por células del huésped, eso es, la elicitación de linfocitos T citotóxicos y de fagocitos activados para proveer la protección contra la infección por parte de un patógeno particular. Es especialmente útil para realizar vacunaciones con proteínas de fusión que comprenden IL-12, IL-2, y el antígeno, mientras que esta combinación dirige una respuesta Th1 contra el antígeno. Los adyuvantes convencionales utilizados en humanos, tales como alúmina, tienden a inducir una respuesta Th2.

La presente invención también provee nuevas composiciones terapéuticas y usos para adyuvantes que permitan proveer un efecto sinergístico con ciertas composiciones terapéuticas, que incluyen a las así llamadas "vacunas contra el cáncer", que pueden incluir un antígeno seleccionado que se presenta sobre una célula cancerosa. Por ejemplo, una proteína que comprende dos o más citoquinas fusionadas, puede ser administrada directamente por una vía apropiada, junto con células cancerosas apropiadamente tratadas.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de fusiones génicas capaces de expresar proteínas de fusión citoquina-citoquina

Para crear proteínas multifuncionales con una variedad de citoquinas, se sintetizaron fusiones génicas entre p40 de IL-12 e IL-2, y entre p40 de IL-12 y GM-CSF. Además, la secuencia de codificación para p35 de murino maduro (SEQ ID NO:1) se fusionó a un promotor y a una secuencia líder que permiten altos niveles de expresión y secreción eficiente. Las secuencias de codificación de p40-IL-2 y p40-GM-CSF de murino se muestran en las SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO:3, respectivamente. Se construyó también una fusión p40-IL-2 humana (SEQ ID NO:4). Se construyeron fusiones de una región Fc de ratón de IgG2a para p35 de ratón (SEQ ID NO:5) y de p35 humano para una región Fc humana de IgG1 (SEQ ID NO:6), utilizando los plásmidos de expresión previamente revelados (Lo y colaboradores. Protein Engineering 11:495-500 [1998]; Lo y colaboradores, patente estadounidense No. 5.726.087).

La fusión de p35 humano y de ratón maduro al C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo KS-1/4 es descrita por Gillies y colaboradores. (J. Immunology [1998] 160:6195-6203). Se construyeron las fusiones de p35 humano y de ratón maduro al C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo 14.18 en una forma análoga (Publicación Internacional PCT WO 99/29732).

El tipo de estrategia discutida aquí para fusionar p40 a IL-2 y a GM-CSF es generalmente aplicable a la fusión de dos o más citoquinas. Específicamente, la secuencia de codificación de la fracción más N-terminal comprende una secuencia de señal para la secreción, mientras que las fracciones C-terminales no requieren una secuencia de señal. En algunas circunstancias, puede ser útil colocar una secuencia de codificación para un enlazador péptido corto, preferiblemente con una longitud de 10-15 aminoácidos y rico en glicina y en serina, entre las SECUENCIAS de codificación para las dos citoquinas. Las manipulaciones del ADN involucradas en la generación de todos esos tipos de fusiones están dentro del nivel de destreza en la técnica.

Por ejemplo, los detalles de la construcción de una fusión entre la subunidad IL-12p40 de murino e IL-2 de murino fueron las siguientes. El ADNc de longitud completa de la subunidad p40 de IL-12 de murino fue clonado por PCR a partir de células de bazo de ratón activadas con Concavalina A (5 \mug/ml en medio de cultivo durante 3 días). El cebador hacia adelante tenia la secuencia AA GCT AGC ACC ATG TGT CCT CAG AAG CTA ACC (SEQ ID NO:7) en la cual un sitio NheI GCTAGC (residuos 3-8 de la SEQ ID NO:7) fue colocado secuencia arriba del codón de iniciación de traducción ATG, y el cebador inverso tenía la secuencia CTC GAG CTA GGA TCG GAC CCT GCA GGG (SEQ ID NO:8), en la cual un sitio XhoI CTCGAG (residuos 1-6 de la SEQ ID NO:8) fue colocado inmediatamente secuencia abajo del codón de detención de la traducción TAG (anticodón CTA). Después de la verificación de la secuencia, el fragmento NheI-XhoI que contenía al ADNc de mu-p40 con su líder nativo fue ligado al vector de expresión pdCs digerido con XbaI-XhoI [Lo y colaboradores (1998) Protein Engineering 11:495-500]. Los sitios de restricción NheI y XbaI tienen extremos pegajosos compatibles, y el sitio NheI fue utilizado para la clonación de mu-p40 debido a que mu-p40 tiene un sitio XbaI interno.

Para la construcción del AND que codifica a mu-p40-muIL-2, se utilizó un enlazador oligonucleótido para unir al ADN de mu-p40 a través de se sitio PstI (C TGC AG) a un fragmento Smal-XhoI que contenía al ADNc de IL-2 de murino maduro. La secuencia de ADN en la unión de la proteína de fusión era C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGT AAA GCA CCC (SEQ ID NO:9), donde C TGC AG (residuos 1-6 de la SEQ ID NO:9) es el sitio PstI, C CCG GG (residuos 15-20 de la SEQ ID NO:9) es el sitio Smal, TCC es en residuo aminoácido C-terminal de p40 de murino, y GCA es el residuo N-terminal de IL-2 de murino maduro.

El AND que codifica a muIL12-muGMCSF de cadena sencilla se derivó de la construcción anterior de ADN que codifica a muIL12-muIL2 de cadena sencilla por medio del reemplazo de ADNc muIL2 por el ADNc de muGMCSF en el sitio Smal. La secuencia de ADN en la unión de muIL 12 de cadena sencilla y muGMCSF fue C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA AAA GCA (SEQ ID NO:10), donde C TGC AG (residuos 1-6 de la SEQ ID NO:10) es el sitio PstI, C CCG GG (residuos 17-22 de la SEQ ID NO:10) es el sitio SmaI, TCC es el residuo de aminoácido C-terminal de p40 de murino, y GCA es el residuo N-terminal de GMCSF de murino maduro.

Ejemplo 2 Expresión de proteínas de fusión IL-12

Las proteínas de fusión IL-12-IL-2 se expresaron como sigue. Diferentes combinaciones de los vectores individuales que codifican las fusiones p40 y los vectores que codifican a las proteínas que comprenden a p35 fueron cotransfectadas dentro de células de carcinoma epidérmico 293 humano para la expresión transitoria de las proteínas de fusión. El ADN fue purificado utilizando kits preparativos (Wizard, Promega Inc.), precipitados en etanol para esterilización y resuspendidos en agua estéril.

Para la expresión de heterodímeros de proteína de fusión IL-12 biológicamente activos, diferentes combinaciones de los vectores individuales que codifican las formas de fusión y de no fusión de las subunidades fueron expresados en forma transitoria por medio de cotransfección de células de carcinoma epidérmico 293 humano. El ADN se purificó utilizando kits preparativos (Wizard, Promega Inc.), precipitados en etanol para esterilización y resuspendidos en agua estéril. Los precipitados de fosfato de calcio se prepararon por medio de métodos estándar utilizando 10 \mug de ADN por ml (5 \mug de cada uno cuando dos plásmidos fueron transfectados en forma conjunta) y se añadieron 0,5 ml/placa a cultivos de 293 creciendo en placas de 60 mm aproximadamente con una confluencia del 70% (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Después de 16 horas, se removió el medio que contenía al precipitado y se lo reemplazó con medio fresco. Después de 3 días, se removió el sobrenadante y se analizó la producción de expresión génica transfectada por ELISA, determinación biológica de la actividad de IL-12, o imunoprecipitación y análisis sobre geles SDS de proteínas marcadas en forma radioactiva. Para la marcación, se utilizó medio fresco sin metionina para remplazar al medio de cultivo al segundo día del cultivo y se añadió metionina ^{35}S (100 \muCi/ml). Después de 16 horas adicionales de incubación, se recogió el medio, se lo clarificó por centrifugación (5 minutos a 13000 RPM en una microcentrífuga de mesa) y se lo incubó con cuentas de Sefarosa-proteína A (10 \mul de volumen de cuentas por ml de sobrenadante de cultivo). Después de 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron las cuentas por medio de centrifugación repetida y resuspensión en búfer PBS que contenía Nonidet-P40 al 1% (NP-40). Se resuspendió el precipitado final en búfer de gel que contenía SDS y ebulló durante 2 minutos. Después de remover las cuentas por centrifugación, se dividió el sobrenadante en dos alícuotas. Se añadió el agente reductor (2-mercaptoetanol al 5%) a una muestra y ambas muestras ebulleron durante 5 minutos antes de cargarlas sobre un gel de SDS de poliacrilamida. Después de la electroforesis, se expuso el gel a una película de rayos X (autoradiografía).

Se llevaron a cabo transfecciones utilizando los siguientes plásmidos de expresión: mu.p35 más mu.p40-IL-2, KS-1/4-mu.p35 más mu.p40, KS-1/4-mu.p35 más mu.p40-IL-2, 14.18-mu.p35 más mu.p40-IL-2, hu.Fc-.p35 más hu.p40-IL-2, KS-1/4-hu.p35 más hu.p40-IL-2, y 14.18-hu.p35 más hu.p40-IL-2, donde "mu" se refiere a proteínas de murino y "hu" se refiere a proteínas humanas.

Cuando se marcaron metabólicamente las células con metionina ^{35}S y se examinaron las proteínas secretadas por medio de electroforesis de reducción en gel SDS y autoradiografía, se observó un alto nivel de expresión en cada caso. Los pesos moleculares de las proteínas de fusión reducidas se predijeron con base en los pesos moleculares de las proteínas componentes, como sigue: p35 de IL-12, 35 kD; p40 de IL-12, 40 kD; IL-2, 16 kD; Fc, 32 kD; cadena pesada de Ig, 55 kD; y cadena liviana de Ig, 28 kD. Se observó la migración de proteínas con los pesos moleculares aproximadamente predichos.

También se aislaron las líneas celulares transfectadas en forma estable que expresan proteínas de fusión de múltiples citoquinas. En el caso de las construcciones heterodiméricas, las proteínas de fusión IL-12p40-IL-2 o IL-12p40-GM-CSF que codifican a los vectores de expresión como se describió antes para la subunidad IL-12p40 sola (Gillies y colaboradores [1998] J. Immunol. 160: 6195-62030). Las líneas celulares transfectadas que expresan a las proteínas de fusión p40 se transfectaron una segunda vez con vectores de expresión que codifican ya sea a la subunidad IL-12p35, un proteína de fusión Fc-p35, o un vector de expresión de la proteína de fusión anticuerpo-p35 como se describió (Gillies y colaboradores [1998] J. Immunol. 160: 6195-62030).

Se recolectó el sobrenadante de las células transfectadas en forma estable que expresan Fc-IL-12-IL-2 humano (esto es, que expresan KS-p35 y p40-IL-2) y se purificaron los productos por medio del enlazamiento a, y elusión desde Sefarosa-proteína A de acuerdo a los procedimientos del fabricante (Repligen, Needham, MA). Las proteínas puras se ensayaron por medio de ELISA para el contenido de IL-12 e IL-2. Los resultados mostraron que los contenidos individuales de citoquina eran aproximadamente 4 veces diferentes en masa que se correlaciona con la diferencia de 4 veces en peso molecular ente IL-12 e IL-2. En forma similar, el ensayo de los productos de las células transfectadas que expresan KS-IL-12-IL-2 humano por medio de ELISA para los niveles de IL-12 e IL-2, dieron valores similares de IL-12 y de IL-2. Así, dentro de la precisión de los ELISA, los valores medidos indican que IL-12 e IL-2 son producidos aproximadamente en una relación molar 1:1. Se obtuvieron los mismos resultados con las proteínas de fusión IL-12-GM-CSF elaboradas ya sea con la Fc o con el anticuerpo completo.

Ejemplo 3 Actividad sinergística de las proteínas de fusión en un ensayo de inducción de IFN-\gamma

La actividad biológica de las proteínas de fusión IL-12-IL-2 se midió en un ensayo de inducción de IFN-\gamma utilizando ya sea células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana activadas por mitógeno o inactivadas de voluntarios humanos (Figura 6). La producción de IFN- \gamma se midió por medio de ELISA.

Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se obtuvieron de voluntarios sanos y se purificaron por medio de centrifugación sobre un gradiente FicoII-Hypaque (Pharmacia) (1700 rpm durante 20 minutos). La "célula mononuclear de cultivo" que contiene a la PBMC se diluyo con medio de cultivo libre de suero (SF-RPMI) hasta un volumen de 50 ml y se recolectó por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Después de la centrifugación por gradiente, las células fueron resuspendidas en un medio de cultivo celular que contenía suero fetal bovino al 10% (RPMI-10) con o sin fitohemaglutinina (PHA; 10 \mug/ml) a una densidad de 5 x 10^{6} células/ml y se cultivaron durante 3 días a 37ºC en una incubadora húmeda de CO_{2}. Se recolectaron las células por centrifugación, se las lavó tres veces con un volumen igual de SF-RPMI y se las resuspendió en RPMI-10 fresco (1 x 10^{6} células/ml). Se dispensaron alícuotas (100 \mul) dentro de los pozos de las placas múltiples de 96 pozos para dar un número final de células de 10^{5} por pozo. Se diluyeron en forma serial las muestras de ensayo del medio de cultivo en medio de cultivo fresco y se añadieron a los pozos de la placa de 96 pozos. Los pozos de control recibieron IL-12 (Figura 6A) o una mezcla equimolar comercial de IL-2 e IL-12 (Figura 6B; citoquinas adquiridas a R & D Systems). Las placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC en una incubadora de CO_{2} luego de lo cual se removieron alícuotas (20 \mu) para el análisis de de la concentración de IFN-\gamma por medio de ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante (Endogen, Inc., Woburn, MA, Estados Unidos).

En la Figura 6A, las actividades de la proteína de fusión IL-12-IL-2 humana fueron comparadas con IL-12 sola. Los resultados ilustran que IL-12 sola indujo IFN-\gamma hasta niveles moderados, mientras que la proteína de fusión IL-12-IL-2 indujo fuertemente la síntesis de IFN-\gamma. Ya que se sabe también que IL-2 es insuficiente para la síntesis de IFN-\gamma, estos resultados indican que las fracciones IL-12 e IL-2 son ambas funcionales dentro de la proteína de fusión y funcionan sinergísticamente.

Luego, las actividades de una proteína de fusión Fc- IL-12-IL-2, una proteína de fusión KS-IL-12-IL-2, y una mezcla que consiste de una relación molar 1:1 de IL-12 a IL-2, fueron comparadas por su capacidad para inducir IFN-\gamma. Los resultados en la Figura 6B indican que la proteína de fusión Fc-Il-12-IL-2 y la proteína de fusión KS-IL-12-IL-2 tienen aproximadamente la misma actividad que una mezcla equimolar de IL-12 e IL-2. Se obtuvieron los mismos resultados cuando las formas de ratón de IL-2 e IL-12, construidas en la forma que acaba de describirse en el Ejemplo 1 para las formas humanas, fueron utilizadas para la construcción de proteínas de fusión.

Ejemplo 4 Bioactividad de IL-2 e IL-12 de las proteínas de fusión IL-12-IL-2

Se compararon las actividades de IL-2 y de IL-12 en las proteínas de fusión para las citoquinas libres en los ensayos basados en la proliferación. La actividad de una molécula 14.18-IL-12-IL-2 de anticuerpo de murino, se analizó en un ensayo típico de proliferación de IL-12. Se obtuvieron las PBMC humanas de voluntarios, y se cultivaron con 5 microgramos/ml de fitohemaglutinina-P durante tres días, se las lavó con HBSS de Hank, y se las sembró sobre placas de microtitulación de a 10^{5} células por pozo, de acuerdo a un procedimiento estándar (Gately, M. K., Chizzonite, R., y Presky, D. H. Current Protocols in Immunology [1995] págs. 6.16.1 - 6.16.15). Se incubaron las células en presencia de diferentes proteínas para análisis durante 48 horas, y se añadieron 0,3 microCuries de timidina ^{3}H diez horas antes de la determinación de los niveles de la incorporación radioactiva. IL-12 y una mezcla equimolar de IL-12 e IL-2 estimularon la incorporación de timidina ^{3}H dentro de las células en una forma dependiente de la dosificación, y la proteína de fusión 14.18-IL-12-IL-2 fue aproximadamente igualmente efectiva en la estimulación de la incorporación de timidina ^{3}H. IL-2 estimuló la incorporación de timidina ^{3}H solamente a concentraciones molares más altas, indicando que la incorporación observada de timidina ^{3}H estimulada por la proteína de fusión 14.18-IL-12-IL-2 es debida primeramente a su actividad IL-12. Los resultados se muestran en la Figura 7.

Además, la actividad biológica de la fracción IL-2 fue analizada en un ensayo diferente de proliferación celular, siguiendo un procedimiento estándar (Davis, L. S., Lipsky, P. E., y Bottomly, K. Current Protocols in Molecular Immunology [1995] pg. 6.3.1 - 6.3.7). La línea celular CTLL-2 de ratón depende de IL-2 para proliferación. La línea celular CTLL-2 puede también proliferar en respuesta a IL-4, pero no es sensible a IL-12. Las células CTLL-2 en crecimiento en fase logarítmica activa fueron lavadas dos veces en medio que carecía en IL-2 y sembradas en placa aproximadamente 1 x 10^{4} células por pozo en placas de microtitulación, en presencia de diferentes cantidades de IL-2 comercial de murino, proteína de fusión 14.18-IL-12-IL-2 de murino, o IL-12 comercial de murino, y se desarrollaron durante 48 horas. Al final del período de desarrollo, se cuantificó el número de células viables utilizando el ensayo MTT/MTS. La Figura 8 muestra un experimento en el cual se variaron los niveles de IL-2, IL-12, o de la proteína de fusión 14.18-IL-12-IL-2. Los resultados indican que IL-2 de murino y la proteína de fusión 14.18-IL-12-IL-2 de murino son aproximadamente igualmente potentes en la estimulación de la proliferación, mientras que las cantidades crecientes de IL-12 de murino no causaron una estimulación detectable de proliferación celular. Este resultado indica que la estimulación de la proliferación de células CTLL-2 por medio de la proteína de fusión 14.18-IL-12-IL-2 es debida a la fracción IL-2 y no a la fracción IL-12.

Ejemplo 5 Construcción y expresión de proteínas de fusión IL-12-IL-2 de cadena sencilla y de cadena múltiple con y sin fracciones de anticuerpo

Una proteína de fusión IL-12-IL-2 de murino de cadena sencilla se construyó como sigue. Se construyó una fusión de secuencia de codificación p40-IL-2 por métodos análogos a aquellos utilizados en la construcción de la fusión p40-IL-2 humana en el Ejemplo 1. Para conectar los ADN que codifican a las subunidades p35 y p40 de IL-12 y generar una secuencia de codificación sencilla, se sintetizó un ADN que codifica a un enlazador, con un sitio Xhol en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3'. El extremo 5' de la secuencia de codificación de p40-IL-2 madura, se modificó para introducir un sitio de restricción, y luego se lo ligó al extremo 3' del enlazador. El extremo 3' de la secuencia de codificación p35 de murino fue modificado para generar un sitio de restricción y ligado al sitio Xhol del enlazador. Los ADNc que codifican a muIL 12 de cadena sencilla y a mu-p40-muIL2, descritos en el Ejemplo 1, fueron combinados por medio del uso de un sitio de restricción conveniente en p40, para dar una tercera construcción de ADN que codifica a un muIL 12-muIL2 de cadena sencilla. Estas etapas se realizaron utilizando diferentes vectores y los aislamientos de fragmentos de ADN necesarios. La secuencia de la región resultante de codificación p35-enlazador-p40-IL-2 de murino es SEQ ID NO:11.

Al mismo tiempo, se construyó una secuencia correspondiente de codificación IL-12 de murino de cadena sencilla por medio de los métodos correspondientes. La secuencia de codificación es SEQ ID NO: 12.

Además, construimos adicionalmente una secuencia de ADN que codifica a una región Fc de IgG2a de murino fusionada al N-terminal de p35-enlazador-p40-IL-2. La secuencia de codificación es SEQ ID NO:13.

Las células 293 cultivadas fueron transfectadas con plásmidos de expresión que codifican a las proteínas Fc-IL-12 y Fc-IL-12-IL-2 de cadena sencilla de murino. La expresión de las proteínas de fusión fue analizada como se describe en el Ejemplo 2. Las proteínas de fusión Fc se purificaron por medio de su enlazamiento a Sefarosa-proteína A, y se observaron altos niveles de expresión de Fc-IL-12-IL-2 y Fc-IL-12. Las proteínas fueron sintetizadas intactas, como se infirió por medio de los pesos moleculares aparentes de la migración sobre geles SDS: Fc-IL-12-IL-2, 123 kD; y Fc-IL-12, 107 kD.

La proteína de fusión KS-scIL 12-IL2 descrita en el Ejemplo 1, es un tetrámero con dos diferentes cadenas de polipéptidos: la cadena liviana KS-1/4 y la cadena pesada con la fracción scIL 12-IL 2 en el C-terminal. Para investigar cuales sitios sobre una molécula de anticuerpo son adecuados para la unión de fracciones de citoquina, se construyó una segunda proteína de fusión en la cual el anticuerpo KS-1/4, las fracciones IL-12 e IL-2 estaban en una configuración distinta de la configuración KS-IL-12-IL-2 en el Ejemplo 1. Esta segunda proteína era tetramérica y consistía de dos diferentes polipéptidos. Un polipéptido consistía de la cadena liviana del anticuerpo KS-1/4. El otro polipéptido consiste de muIL12 de cadena sencilla fusionado al N-terminal maduro de la cadena pesada del anticuerpo KS-1/4, seguido por IL-2 de murino en el carboxilo terminal de la cadena pesada.

El ADNc que codifica a la subunidad p35de IL-12 de murino se clono por medio de PCR de células de bazo de ratón activadas con Concanavalina A (5 \mug/ml en medio de cultivo durante 3 días). El cebador hacia adelante tiene la secuencia AAGCTTGCTAGCAGCATG TGT CAA TCA CGC TAC (SEQ ID NO:14) donde un sitio HindIII AAGCTT (residuos 1-6 de la SEQ ID NO:14) fue colocado secuencia arriba del codón de iniciación de traducción ATG, y el cebador hacia atrás tiene la secuencia CTCGAGCTT TCA GGC GGA GCT CAG ATA GCC (SEQ ID NO:15), en la cual un sitio XhoI CTCGAG (residuos 1-6 de la SEQ ID NO:15) se coloca secuencia abajo del codón de detención de traducción TGA (anticodón TCA).

El ADN que codifica a IL-12 de cadena sencilla, comprende al ADN de mup35 unido a los oligonucleótidos que codifican un enlazador rico en residuos de glicina y serina, seguido por el ADN de mup40. La construcción resultante tiene la siguiente secuencia en la unión del oligonucleótido:

1

donde G AGC TC (residuos 1-6 de la SEQ ID NO: 16) es un sitio de restricción SacI justo secuencia arriba del codón de detención de traducción p35 de murino, GCG codifica al residuo aminoácido C-terminal de p35 de murino, GGA TCC (residuos 50-55 de la SEQ ID NO: 16) es un sitio de restricción BamHI introducido para facilitar la ligación, y ATG codifica al residuo N-terminal de mu-p40 maduro.

El ADN codifica a muIL-12-KS de cadena sencilla. muGMCSF de cadena pesada tiene la siguiente secuencia en la unión de mup40 y el N-terminal maduro de la cadena pesada de KS:

2

en donde C TGC AG (residuos 1-6 de la SEQ ID NO: 18) es un sitio Pstl justo secuencia arriba del codón de detención de traducción p40 de murino, TCC codifica al residuo aminoácido C-terminal de p40 de murino, y CAG codifica al residuo N-terminal de la cadena pesada de KS maduro. El ADN resultante codifica a muIL-12-KS de cadena sencilla. MuIL2 de cadena pesada fue coexpresado entonces con la cadena liviana de KS.

Para investigar además que extremos de una molécula de anticuerpos están disponibles para la generación de uniones de fusión, y para investigar cuantos polipéptidos distintos pueden ser ensamblados dentro de una proteína de fusión de múltiples citoquinas, se expresó y se analizó una tercera proteína que contenía KS-1/4, IL-12, e IL-2, principalmente IL 12-KS (cadena liviana) +KS(cadena pesada)-IL2, fue expresada y analizada por su actividad. Esta proteína de fusión es hexamérica y comprende tres diferentes polipéptidos. Un polipéptido consiste de p35 de murino fusionado a la cadena liviana del anticuerpo KS1/4. Un segundo polipéptido consiste de la cadena pesada del anticuerpo KS1/4 fusionado a IL 2 humana [Gillies y colaboradores. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428], y un tercer polipéptido es el p40 de murino. Después de la expresión, dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas se enlazan por disulfuro para formar la estructura tetramérica anticuerpo-citoquina. Además, el p35 en el N-terminal de la cadena liviana también se enlaza por disulfuro con p40.

El ADN que codifica a la cadena liviana de mup35-KS tiene la siguiente secuencia en la unión:

3

en donde G AGC TC (residuos 1-6 de la SEQ ID NO: 20) es un sitio de restricción Sacl justo secuencia arriba del codón de detención de traducción p35 de murino, GCG codifica al residuo aminoácido C-terminal de p35 de murino. GGA TCC (residuos 50-55 de la SEQ ID NO: 20) es un sitio de restricción BamHI introducido para facilitar la ligación, y GAG codifica al residuo aminoácido N-terminal de la cadena liviana.

Por expresión de esta proteína de fusión hexamérica, una línea celular que expresa a p40 de murino se generó por transfección con un vector de expresión que contenía un gen de resistencia a la neomicina y selección por medio G418. La línea celular que expresa a p40 de murino fue transfectada entonces con un vector de expresión que contenía tanto a las unidades de transcripción de cadena liviana como de cadena pesada, y un marcador de selección de dihidrofolato reductasa, que permitió la selección por medio de metrotexato [Gillies y colaboradores. (1998) J. Immunol. 160:6195].

Ejemplo 6 Actividad de las proteínas de fusión IL-12-IL-2 de cadena sencilla de murino

Los mismos métodos utilizados en el Ejemplo 4 fueron utilizados para analizar la actividad de IL-I2-IL-2 de cadena sencilla de murino producida por medio de expresión transciente. La cantidad de cada citoquina en el sobrenadante del cultivo celular, fue determinada primero por medio de ELISA y utilizada para constituir una curva de respuesta a la dosificación. Las actividades correspondieron cercanamente a lo que fue encontrado con la Fc y con las proteínas de fusión IL-12-IL-2 del anticuerpo descritas arriba.

Específicamente, la actividad de IL-12 de IL-12-IL-2 de cadena sencilla (sc) de murino, y las moléculas de Fc-scIL-12-IL-2 de murino fueron analizadas en el ensayo de proliferación de células PBMC humanas, descritas en Ejemplo 4. IL-12 y una mezcla equimolar de ofIL-12 e IL-2 estimularon la incorporación de timidina ^{3}H dentro de células en una forma dependiente de la dosificación. Sobre una base por mol, ambas proteínas de fusión scIL-12-IL-2 y Fc-scIL-I2-IL-2 fueron aproximadamente tan efectivas como IL-12 en estimular la incorporación de timidina ^{3}H (Figura 9). Como se describió en el Ejemplo 4, IL-2 estimula la incorporación de timidina ^{3}H solamente en concentraciones molares mucho mayores, indicando que la incorporación observada de timidina ^{3}H estimulada por las proteínas de fusión scIL-12-IL-2 es debida fundamentalmente a su actividad IL-12.

Además, la actividad biológica de la fracción IL-2 en las proteínas de fusiónscIL-12-IL-2 fue analizada en un ensayo basado en las células, y se encontró que era aproximadamente la misma que IL-2 comercial sobre una base por mol, dentro de la precisión del ensayo. La actividad biológica de la fracción IL-2 se analizó en el ensayo de proliferación de las células CTLL-2, como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados indican que las proteínas de fusión de IL-2 de murino, scIL-12-IL-2 de murino, y Fc-IL-12-IL-2 de murino fueron aproximadamente igualmente potentes en la estimulación de la proliferación. IL-12 de murino causa una estimulación no detectable de la proliferación de células CTLL-2. Estos resultados indican que la estimulación de la proliferación de células CTLL-2 por las proteínas de fusión scIL-12-IL-2 era debida a la fracción IL-2, y no a la fracción IL-12.

Las actividades de IL-12 e IL-2 de las proteínas Fc-IL 12-IL2, IL 12-KS-IL2, e IL 12-KS(Cadena liviana) + KS(Cadena pesada)-IL2 descritas en el Ejemplo 5 también fueron analizadas en los ensayos basados en la célula. Utilizando el ensayo de incorporación de la proliferación de células PBMC/ timidina tritiada, todas las proteínas Fc-IL12-IL2, IL 12-KS-IL2, e IL 12-KS(Cadena liviana) + KS(Cadena pesada)-IL2 mostraron todas una potente actividad de IL-12. En forma similar, utilizando el ensayo de proliferación celular CTLL-2, todas las proteínas Fc-IL1 2-IL2, IL12-KS-IL2, e IL 12-KS(Cadena liviana) + KS(Cadena pesada)-IL2 mostraron una potente actividad de IL-2. Además, en un ELISA, ambas proteínas IL12-KS-IL2 e IL 12-KS(Cadena liviana) + KS(Cadena pesada)-IL2 enlazaron fuertemente al antígeno EpCAM, aún cuando las regiones V, de cadena pesada y de cadena liviana respectivamente, se fusionan a otras proteínas en sus N-terminales.

Ejemplo 7 Actividad de proteínas de fusión IL-12-GM-CSF de murino

La actividad de IL-2 de una molécula de Fc-IL-12-BG-CSF de murino fue analizada en un ensayo de proliferación (Figura 10). Los PBMC humanos fueron obtenidos de tres voluntarios y cultivados con 5 microgramos/ml de fitohemaglutinina-P durante tres días, se las lavó con HBSS de Hank, y se las sembró sobre placas de microtitulación de a 10^{5} células por pozo, de acuerdo a un procedimiento estándar (Gately, M. K., Chizzonite, R., y Presky, D. H. Current Protocols in Immunology [1995] págs. 6.16.1 - 6.16.15). Se incubaron las células en presencia de diferentes proteínas para análisis durante 48 horas, y se añadieron 0,3 microCuries de timidina ^{3}H diez horas antes de la determinación de los niveles de la incorporación radioactiva. IL-12 y una mezcla equimolar de IL-12 e IL-2 y GM-CSF estimularon la incorporación de timidina ^{3}H dentro de las células en una forma dependiente de la dosificación, y la proteína de fusión 14.18-IL-12-GM-CSF fue aproximadamente igualmente efectiva en la estimulación de la incorporación de timidina ^{3}H. GM-CSF no estimuló la incorporación de timidina ^{3}H en las concentraciones analizadas, indicando que la incorporación observada de timidina ^{3}H estimulada por la proteína de fusión 14.18-IL-12-GM-CSF fue debida primeramente a su actividad IL-12.

Además, la actividad biológica de la fracción GM-CSF de diferentes proteínas de fusión IL-12-GM-CSF es analizada en ensayos basados en células. Se encontró que la fracción GM-CSF es activa, con una actividad por mol en el mismo rango general de GM-CSF comercial. Por ejemplo, la actividad biológica de de la fracción GM-CSF se analiza en un ensayo diferente de proliferación celular, siguiendo un procedimiento conocido por aquellos entrenados en la técnica ede inmunología molecular (Cooper, S. C., y Broxmeyer, H. E. Current Protocols in Molecular Immunology [1996] pg. 6.4.1 - 6.4.20). La línea celular 32D(GM) de ratón depende de GM-CSF para la proliferación; esta línea ha sido adaptada de la línea celular original 32D, descrita por Cooper y Broxmeyer, por ser particularmente sensible para GM-CSF (Faas y colaboradores, Eur. J. Immunol. [1993] 23:1201-14). La línea celular 32D(GM) no es sensible para IL-12. Las células 32D(GM) en crecimiento activo en fase logarítmica se lavaron dos veces en medio de carecía de GM-CSF y sembradas en placa aproximadamente 5 x 10^{3} células por pozo en pozos de microtitulación, en presencia de diferentes cantidades de GM-CSF comercial de murino o proteína de fusión IL-12-GM-CSF de murino, y se desarrollaron durante 48 horas. Se añadieron 0.3 microCuries de timidina ^{3}H dieciséis horas antes de determinar los niveles de la incorporación radioactiva. Existe un incremento en la dosis correspondiente en la incorporación de timidina ^{3}H con niveles crecientes de la proteína de fusión IL-12-GM-CSF, indicando que la fracción GM-CSF de la proteína de fusión IL-12-GM-CSF es activa. Además, la actividad biológica de GM-CSF de la proteína de fusión, calculada sobre una base molar, es comparable a aquella de GM-CSF comercial de
murino.

Ejemplo 8 Tratamiento de carcinoma de colon en un mamífero inmunoproficiente con una proteína de fusión de múltiples citoquinas

Para probar si una proteína de fusión múltiples citoquinas-anticuerpo podría ser utilizada para tratar carcinoma de colon en un mamífero con un sistema inmunológico intacto, s realizaron los siguientes experimentos. CT26 es una línea celular de carcinoma de colon derivada de ratones Balb/C. Por medio de técnicas de ingeniería genética, esta línea celular fue modificada para expresar a la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM), que es el antígeno reconocido por el anticuerpo KS-1/4; estas células son llamadas células CT26/KSA.

Los ratones Balb/c fueron inoculados en forma subcutánea con 2x10^{6} células CT26/KSA. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 100-200 milímetros cúbicos, los ratones fueron colocados en tres grupos aleatorios de 9 ratones para estudios adicionales. Comenzando en el día 0, los ratones con tumor fueron tratados con PBS, aproximadamente 3,4 microgramos e KS-IL2 mezclado con aproximadamente 5,3 microgramos de KS-IL12, o aproximadamente 6 microgramos de KS-IL2-IL12. Estas dosis están diseñadas para liberar un número igual de moléculas de IL-12 e IL-2 a cada conjunto de ratones. Los ratones fueron inyectados intratumoralmente, una vez al día durante cinco días. Los tamaños de los tumores fueron medidos con calibradores.

Los resultados de cada uno de tales experimentos se muestran en la Figura 11. En este experimento, KS-IL12-IL2 causó una profunda inhibición del crecimiento del tumor. La mezcla KS-IL12 y de KS-IL2 también causó una significativa inhibición en el crecimiento del tumor, pero no tan completa como con KS-IL12-IL2. En el grupo de los ratones tratados con KS-IL12-IL2, seis de los nueve ratones fueron aparentemente curados de sus tumores: estos seis ratones sobrevivieron hasta el día 93, cuando se terminó el experimento; y los tumores en estos ratones se contrajeron y desaparecieron, de tal manera que no pudieron detectarse tumores subcutáneos a partir del día 39 hasta el día 93. Los otros tres ratones tenían tumores cuyo crecimiento fue retrasado de tal manera que los volúmenes de los tumores excedieron los 4000 milímetros cúbicos solamente después del día 87.

De los ratones tratados con una mezcla de KS-IL12 y KS-IL2, dos ratones fueron aparentemente curados de sus tumores subcutáneos y sobrevivieron hasta el final del experimento. Los tumores en los siete ratones restantes no desaparecieron y eventualmente crecieron hasta volúmenes de 1000 milímetros cúbicos (1 ratón) o mayores a 4000 milímetros cúbicos (6 ratones).

El hecho de que KS-IL12-IL2 sea más efectivo que una mezcla equimolar de KS-IL12 y KS-IL2 es sorprendente. Los clones en este experimento liberan aproximadamente 15 picomoles de proteína de fusión por dosis, que corresponde aproximadamente a 9x10^{12} moléculas. Al inicio del tratamiento, cada tumor tiene un volumen aproximadamente de 160 milímetros cúbicos, que corresponde aproximadamente a 160 millones de células. Cada célula expresa aproximadamente 10^{6} moléculas de EpCAM, así que existen aproximadamente 1,6x10^{14} moléculas de antígeno EpCAM con los cuales el anticuerpo KS podría enlazarse. Así, cuando se mezclaron KS-IL12 y KS-IL2 y se inyectó que padecían de tales tumores, es improbable que estas dos proteínas de fusión de inmunocitoquina compitieran entre ellas por los sitios de enlazamiento del antígeno. Así, la dosis efectiva de IL-12 y de IL-2 en el sitio del tumor debe ser al menos tan alta para la mezcla de KS-IL12 y KS-IL2 como para KS-IL12-IL2.

Ejemplo 9 Tratamiento de carcinoma de colón en un mamífero inmunodeficiente con una proteína de fusión de múltiples citoquinas

Muchas formas de terapia para el cáncer tienen el efecto de matar a las células en división, incluyendo a las células del sistema inmunológico. Como resultado, los pacientes con cáncer a menudo se hacen inmunosuprimidos. Para saber si las proteínas de fusión de múltiples citoquinas pueden ser utilizadas para tratar a un mamífero con un sistema inmunológico suprimido, se trataron a los ratones SCID que tenían tumores CT26/KSA con KS-IL12-IL2, una mezcla de KS-IL12 y KS-IL2, o PBS. Los ratones SCID son deficientes tanto en células B como en células T y dependen de ramificaciones del sistema inmune innato, tal como las células NK, por su habilidad para combatir infecciones.

Los ratones con tumores subcutáneos CT26/KSA fueron generados como se describe en el Ejemplo 8. Tres grupos de 8 ratones cada uno, sufriendo de tumores aproximadamente de 100 a 200 milímetros cúbicos, fueron tratados por medio de inyección intratumoral con la misma dosis y cronograma que en el Ejemplo 8. Los resultados se muestran en la Figura 12. En este caso, la proteína de fusión KS-IL12-IL2 y la mezcla de KS-IL12 y KS-IL2 fueron aproximadamente igualmente efectivas: cinco de los ocho ratones fueron curados en cada grupo hacia el día 25. Sin embargo, en los ratones que no fueron curados, cinco de seis tumores comenzaron a crecer a una velocidad característica de los tumores en animales no tratados, con un retraso efectivo de aproximadamente 14 a 21 días. Esto esta en contraste con los tumores en los ratones inmunoproficientes en el Ejemplo 8: aún cuando los tumores no fueron completamente eliminados por el tratamiento con KS-IL12-IL2, los tumores no comenzaron a crecer agresivamente aproximadamente hasta 60 días después de iniciado el experimento.

Estos experimentos demuestran que una proteína de fusión de anticuerpo de múltiples citoquinas puede ser utilizada para tratar cáncer en un animal inmunosuprimido.

Ejemplo 10 Tratamiento de carcinoma de pulmón por medio de inyección intratumoral de una proteína de fusión de múltiples citoquinas: comparación con el tratamiento por medio de inmunocitoquinas individuales

Para dirigir la efectividad de las proteínas de fusión de múltiples citoquinas y de las inmunocitoquinas que transportan fracciones sencillas de citoquina contra un cáncer derivado de células de pulmón, se realizó el siguiente experimento.

El Carcinoma de Pulmón de Lewis (LLC) es un tumor agresivo derivado de ratones C57BL/6. Se construyó una línea celular de LLC que expresa a la proteína EpCAM humana por medio de técnicas de ingeniería genética estándar; la línea celular fue llamada LLC/KSA.

Se generaron ratones C57BL/6 con tumores subcutáneos LLC/KSA como se describe en el Ejemplo 8 (revisar el # de células con KML). Cuatro grupos de 5 ratones cada uno, sufriendo tumores aproximadamente de 100 a 200 milímetros cúbicos, fueron tratados por medio de inyección intratumoral durante cinco días. Los ratones fueron inyectados con PBS, aproximadamente 20 microgramos de KS-IL12, aproximadamente 20 microgramos de KS-IL12, o aproximadamente 20 microgramos de KS-IL12-IL2.

Los resultados se muestran en la Figura 13. En este caso, la proteína de fusión KS-IL12-IL2 fue mucho más efectiva que KS-IL12 o KS-IL2. En todos los ratones tratados con la proteína de fusión KS-IL12-IL2, los tumores desaparecieron el día 27. En el día 74, estos ratones fueron utilizados en un ensayo de metástasis de pulmón como se describe en el Ejemplo 14; los tumores subcutáneos originales no reaparecieron en el periodo intervenido o durante el segundo experimento. En contraste, el tratamiento con KS-IL2 o KS-IL12 resulto en algún encogimiento tumoral aparente y en un significativo retraso en el crecimiento del tumor, pero los tumores eventualmente crecieron. Una comparación de los resultados en este ejemplo y en los ejemplos anteriores indica que, para ciertas enfermedades y formas de administración, el tratamiento con una mezcla de inmunocitoquinas que transportan diferentes fracciones de citoquina es superior al tratamiento con un tipo sencillo de inmunocitoquina.

Ejemplo 12 Tratamiento de carcinoma de pulmón por medio de inyección intratumoral de una proteína de fusión de múltiples citoquinas: comparación con el tratamiento por medio de una mezcla de inmunocitoquinas

Para dirigir la efectividad de las proteínas de fusión de múltiples citoquinas y de las mezclas de inmunocitoquinas que transportan diferentes fracciones de citoquina contra un cáncer derivado de células de pulmón, se realizó el siguiente experimento.

Se generaron ratones C57BL/6 con tumores subcutáneos LLC/KSA como se describe en el Ejemplo 11. Tres grupos de 7 ratones cada uno, sufriendo tumores aproximadamente de 100 a 200 milímetros cúbicos, fueron tratados por medio de inyección intratumoral durante cinco días. Los ratones fueron inyectados con PBS, una mezcla de aproximadamente 18 microgramos de KS-IL12, aproximadamente 11,5 microgramos de KS-IL12, o aproximadamente 20 microgramos de KS-IL12-IL2.

Los resultados se muestran en la Figura 14. En este caso, la proteína de fusión KS-IL12-IL2 fue mucho más efectiva que la mezcla de KS-IL12 y KS-IL2. En todos los ratones tratados con la proteína de fusión KS-IL12-IL2, los tumores desaparecieron el día 27. En contraste, el tratamiento con la mezcla de KS-IL2 y KS-IL12 resultó en algún encogimiento tumoral aparente y en un significativo retraso en el crecimiento del tumor, pero todos los tumores en este grupo de tratamiento eventualmente volvieron a crecer.

Ejemplo 13 Dependencia al antígeno de la actividad antitumoral de una proteína de fusión de múltiples citoquinas-anticuerpo

Para dirigir la efectividad de sí la proteína de fusión de múltiples citoquinas-anticuerpo en el tratamiento de un tumor era dependiente de la expresión específica del tumor del antígeno reconocido por el anticuerpo, se realizó el siguiente experimento.

Un conjunto de siete ratones C57BL/6 con tumores subcutáneos LLC/KSA y un segundo conjunto de nueve ratones con tumores derivados de la línea celular LLC parental, fue generada como se describe en el Ejemplo 11. Estos dos grupos de ratones, sufriendo de tumores aproximadamente de 100 a 200 milímetros cúbicos, fueron tratados por medio de inyección intratumoral durante cinco días. Los ratones fueron inyectados con aproximadamente 20 microgramos de KS-IL12-IL2.

Los resultados se muestran en la Figura 15. En este caso, los ratones sufriendo de tumores LLC/KSA fueron todos completamente curados de sus tumores. En contraste, solamente dos de los ratones sufriendo de tumores LLC se curaron; los otros ratones sufriendo de tumor LLC, todos disfrutaron de una reducción transitoria en el volumen de sus tumores, pero eventualmente sus tumores crecieron hasta volúmenes mayores.

Estos resultados indican que el reconocimiento del antígeno de superficie EpCAM promueve la adherencia de KS-IL12-IL2 a la superficie de las células tumorales LLC/KSA, y la respuesta inmune resultante se mejora. Se observó también algún efecto antitumoral contra tumores derivados de LLC; sin desear quedar atados por la teoría, el efecto antitumoral de KS-IL12-IL2, en este caso puede ser debido al hecho de que la proteína de fusión fue inyectada directamente dentro del tumor y por lo tanto fue localizada transitoriamente en el tumor.

Ejemplo 14 Generación de una memoria inmune contra un tipo de célula tumoral

El desarrollo de metástasis en un problema principal en el tratamiento del cáncer. Para analizar si el tratamiento con una proteína de fusión múltiples citoquinas-anticuerpo podría conducir a la formación de una memoria inmune de larga duración contra un tipo de célula tumoral y podría prevenir el establecimiento de metástasis, se realizó el siguiente experimento.

Cinco ratones C57BL/6 del Ejemplo 11 habían sido tratados con KS-IL12-IL2, y aparentemente habían sido curados de sus tumores subcutáneos. El día 74 relativo a la iniciación del tratamiento como se describe en el Ejemplo 14, estos cinco ratones fueron inyectados i.v. con 10^{6} células LLC/KSA. Como control, ocho ratones C57BL/6 fueron también inyectados i.v. con 10^{6} células LLC/KSA.

En el día 28, los ratones fueron sacrificados y los pulmones fueron examinados por metástasis. Los pulmones de los ocho ratones de control estaban cubiertos entre un 70 a 100% con metástasis, con un promedio de cubrimiento superficial de los pulmones del 85%. El peso medio del pulmón para estos ratones fue de 0,86 gramos. En contraste, no se encontró metástasis sobre la superficie de los pulmones de los cinco ratones tratados previamente, y el peso promedio del pulmón fue de 0,28 gramos, que corresponde al peso de un pulmón normal de ratón. Estos resultados indicaron que el tratamiento de las células tumorales originales resultó en una memoria inmune de larga duración contra las células tumorales; esta memoria previno el establecimiento de metástasis de este tipo de célula tumoral.

TABLA X Protección de los ratones a la "regresión" de metástasis pulmonar LLC-KSA

Tratamiento Previo	Marcador Metastático	Peso del Pulmón (g)
Ninguno	4, 4, 4, 4, 4, 4, 3, 3	0,88 +/- 0,27
KSL-IL12/IL2	0, 0, 0, 0, 0	0,27 +/- 0,03

El peso promedio del pulmón del grupo de control, sin tumor, fue de 0,2 gramos. Los marcadores metastáticos se basan en el porcentaje de cubrimiento de la superficie de los nódulos metastáticos fusionados donde 0 = sin metástasis; 1 = 1-25% de cubrimiento; 2 = 25-50% de cubrimiento; 3 = 50-75% de cubrimiento; y 4 = 75-100% de cubrimiento.

Un segundo experimento para analizar la formación de la memoria inmune utilizó seis de los siete ratones del Experimento 12 que habían sido inyectados con células tumorales LLC/KSA, habían desarrollado tumores subcutáneos, y habían desaparecido esos tumores. Sesenta y dos días después de la iniciación del tratamiento en el Ejemplo 12, seis ratones tratados previamente y 10 naive, ratones de control C57BL/6 no tratados fueron inyectados s.c. con 10^{6} células LLC. Estas células no expresan el antígeno KS humano, EpCAM.

En los ratones naive, las células LLC inyectadas formaron tumores que crecieron a una rápida velocidad en todos los ratones. En contraste los tumores en los ratones tratados previamente crecieron mucho más lentamente, y en un ratón, no se detectó tumor subcutáneo. Los resultados se muestran en la Figura 16.

Debido a que el antígeno KS humano, EpCAM, no se expresa sobre células LLC, la respuesta inmune a las células LLC se basó en otros antígenos expresados por estas células.

Ejemplo 15 Proteínas de fusión de múltiples citoquinas como vacunas

Pueden utilizarse proteínas de fusión de múltiples citoquinas como vacunas cuando se fusionan a una proteína antígeno. El orden particular de las fracciones de N-terminal hasta C-terminal, o si la proteína de fusión es una cadena sencilla de polipéptido o un oligómero, puede variar dependiendo de la conveniencia de la construcción de los plásmidos de expresión. La proteína puede administrarse por medio de una variedad de rutas, tales como intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, etc. En forma similar, la dosis y la frecuencia de administración necesita ser generalmente determinada empíricamente, como es práctica estándar para vacunas humanas y es bien conocida por aquellos entrenados en la técnica del desarrollo de vacunas.

Por ejemplo, una proteína de fusión de la forma antígeno-IL-12-citoquina se administra a un ratón, donde la citoquina en la proteína de fusión es una segunda citoquina diferente de IL-12. Los ratones de control reciben la misma cantidad de antígeno-citoquina, antígeno-IL-12, o solamente antígeno. En diferentes momentos durante y/o después de la administración de la proteína de fusión del antígeno, las muestras de sangre se recolectaron por medio de sangrado retroorbital y se preparó y se analizó el plasma por la presencia de anticuerpos dirigidos contra el antígeno. Se encontró que los anticuerpos se generan contra el antígeno. Además, la naturaleza de la respuesta inmune al antígeno es característica de una respuesta Th1. La respuesta del anticuerpo es más fuerte y el tipo de anticuerpos producidos es diferente que en ciertas inmunizaciones de control.

Más específicamente, una proteína de fusión anticuerpo-IL-12-IL-2 de murino humanizada en búfer PBS, se inyectó en ratones Balb/c en forma intravenosa (5 \mug/día x 5). Los ratones de control recibieron el mismo anticuerpo, en las mismas cantidades, pero sin IL12-IL2 unido. Ni la solución de la inyección contenía ningún otro tipo de adyuvante. En el día diez, se recolectaron las muestras de sangre en tubos de microcentrífuga por medio de sangrado retroorbital, y se preparó el plasma recogiendo las muestras de sangre en tubos plásticos que contenían citrato de sodio, seguido por la centrifugación a máxima velocidad en una microcentrífuga Eppendorf de mesa. Las placas de ELISA (96 pozos) se recubren con la proteína humanizada de anticuerpo que contiene la región humana constante, y se la usa para capturar cualquier anticuerpo de ratón producido en respuesta a la inmunización. Después de retirar por lavado el material no enlazado, los anticuerpos enlazados de ratón se detectan con anticuerpo Fc antiratón de cabra (Jackson ImmunoResearch) acoplado a peroxidasa de rábano silvestre. Cualquier anticuerpo enlazado podría ser dirigido ya sea a las regiones humanas constantes o a la región variable, las cuales están compartidas entre el anticuerpo humanizado y las proteínas de fusión.

Existe poca o ninguna reactividad hacia el anticuerpo humanizado sin IL12-IL2 fusionado. La proteína de fusión, por otro lado induce una fuerte respuesta de anticuerpo en ausencia de adyuvantes exógenos y a pesar del hecho de que la vía intravenosa de administración es altamente desfavorable para inducir tales respuestas, comparado con la administración subcutánea o la intraperitoneal. Los anticuerpos del isotipo IgG2a, que son típicos de las respuestas mejoradas por IL12, son observados en el grupo inyectado con anticuerpo-IL-12-IL-2, pero no en el grupo inyectado con el anticuerpo humanizado.

La inmunogenicidad de las proteínas de fusión antígeno-IL-12-múltiples citoquinas administradas por medio de diferentes rutas es analizada por medio de la inyección de una solución de la proteína de fusión (tal como aquella descrita anteriormente) en PBS, u otro búfer biocompatible, o un adyuvante conocido tal como el adyuvante incompleto de Freund o el adyuvante completo. Por ejemplo, las inyecciones subcutáneas sencillas o múltiples, intradérmicas o intraperitoneales pueden ser suministradas cada dos semanas. Alternativamente, la proteína de fusión puede administrarse primero por medio de una inyección subcutánea y luego ser seguida por una inyección intraperitoneal. El adyuvante de Freund no puede ser utilizado para uso humano, debido a la irritación en el sitio de la inyección. Adyuvantes alternativos tales como precipitados de hidróxido de aluminio (Alum) están aprobados para uso humano y pueden ser utilizados en la presente invención. Pueden utilizarse también nuevos adyuvantes químicos orgánicos basados en escualenos y en lípidos, para inyecciones dentro de la piel.

Ejemplo 16 Terapia génica con proteínas de fusión de múltiples citoquinas

La actividad anticáncer de las proteínas de fusión de múltiples citoquinas suministrada por los métodos de terapia génica, fueron también demostrados para el tratamiento del cáncer de pulmón. Las células de Carcinoma de Pulmón de Lewis fueron transfectadas en forma estable utilizando el sistema de vector viral descrito anteriormente (pLNCX-scIL-12-IL-2 o ADN de pLNCX-scIL-12 transfectado dentro de la línea celular de empacamiento PA317). Estas construcciones codifican una versión ofIL12 de cadena sencilla, en la cual las subunidades p35 y p40 han sido conectadas con un enlazador. Los clones que fueron seleccionados in vitro utilizando un medio que contenía g418, y los clones que expresan establemente aproximadamente 50 a 60 ng/ml de ofIL-12, fueron identificados por medio de ELISA (R & D Systems).

Aproximadamente 1 x10^{6} y aproximadamente 5x10^{6} células LLC que expresan scIL-12 o scIL-12-IL-2 fueron inyectadas s.c. dentro de ratones C57BL/6 y también dentro de ratones SCID. Como control, se inyectaron 2 x 10^{6} células LLC dentro de ratones C57BL/6 y también dentro de ratones SCID. Las células LLC que expresan IL-12 forman tumores que crecen aproximadamente a la misma velocidad de los tumores derivados de células LLC que no han sido modificadas genéticamente para expresar citoquinas. Sin embargo, tanto en ratones C57BL/6 como en ratones SCID, las células LLC que expresan scIL-12-IL-2 no formaron tumores subcutáneos, ni formaron tumores que se contrajeron subsiguientemente y desaparecieron (Figuras 17 y 18).

Ejemplo 17 Construcciones de ADN que codifican linfotactina-KS-IL2 y la expresión de la proteína linfotactina-KS-IL2

Las quimoquinas son una clase distinta de citoquinas que se piensan que forman gradientes y median la quemotaxis de células inmunes. Además, así como otras citoquinas, las quemoquinas pueden inducir la expresión de genes específicos en células objetivo. Una característica de las quemoquinas es que el N-terminal libre es a menudo requerido para actividad, que colocaría límites a la forma en que las proteínas de fusión podrían ser construidas.

Una proteína de fusión citoquina-anticuerpo-citoquina fue construida consistiendo de la citoquina linfotactina, que es una quemoquina, el anticuerpo KS-1/4, y la citoquina IL-2. Esta proteína de fusión fue tetramérica y comprendía dos diferentes polipéptidos. Un polipéptido consistía linfotactina de murino fusionada al N-terminal de la cadena pesada del anticuerpo KS-1/4, seguido por IL-2 en el C-terminal. La fusión de la cadena pesada de KS-1/4 con IL-2 en el C-terminal, la "cadena pesada KS-IL2", ha sido descrita previamente [Gillies y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1428]. El otro polipéptido consistió de la cadena liviana del anticuerpo KS-1/4.

La secuencia completa de codificación de la linfotactina de murino fue publicada por Kelner y Zlotnik (Science 266:1395 [1998]). Para construir el ADN que codifica una proteína de fusión de linfotactina de murino y la cadena pesada de la KS-IL2, el ADNc de linfotactina de murino fue adaptada por PCR utilizando el cebador hacia adelante TCTAGAGCCACC ATG AGA CTT CTC CTC CTG AC (SEQ ID NO:29), en el cual un sitio XbaI TCTAGA (residuos 1-6 de la SEQ ID NO:29) fue colocado secuencia arriba del codón de iniciación de traducción ATG, y el cebador hacia atrás GGA TCC CCC AGT CAG GGT TAC TGC TG (SEQ ID NO:30), que colocó un sitio BamHI GGA TCC (residuos 1-6 de la SEQ ID NO:30) inmediatamente 3' de el codón GGG (anticodón CCC) que codifica al residuo aminoácido C-terminal de linfotactina de murino. Después de la clonación del fragmento por PCR y verificación de la secuencia, el fragmento XbaI-BamHI que contenía al ADNc de linfotactina de murino, fue ligado a un oligonucleótido doble BamHI-AfIII que codifica a un péptido enlazador flexible rico en residuos de glicina y serina. El extremo AfIII fue a su vez unido a un sitio AfIII artificial precediendo al N-terminal maduro de la cadena pesada de KS-IL2. La secuencia de ADN en las uniones resultantes de los dos ligandos se da a continuación:

4

En donde GGA TCC (residuos 4-9 de la SEQ ID NO:31) y CTTAAG (residuos 48-53 de la SEQ ID NO:31) son los dos sitios de restricción BamHI y AfIII, respectivamente, utilizados para reconstrucción; CCC codifica al residuo de aminoácido N-terminal de linfotactina de murino; CAG codifica al N-terminal maduro de la cadena pesada de KS-IL2; y la secuencia de aminoácidos del péptido enlazador rico en GlySer se muestra más atrás de la secuencia de ADN. El ADN que codifica a la cadena pesada de linfotactina-KS-IL2 de murino, fue clonada entonces dentro de un vector de expresión y luego coexpresada con la cadena liviana de KS 1/4.

La proteína de fusión de linfotactina-KS-IL2 de murino expresada, se ensaya por la actividad de la linfotactina en un ensayo de migración en una cámara Borden utilizando células T (Leonard y colaboradores, [1999] Current Protocols in Immunology p. 6.12.3). Alternativamente, se utilizan las células NK. Alternativamente, se observó la actividad de la linfotactina en un ensayo celular estándar para flujo de calcio en respuesta a la activación de un receptor acoplado de proteína G (Maghazachi y colaboradores, FASEB J. [1997];11:765-74.). Además, la proteína de fusión de linfotactina-KS-IL2 fue analizada y se encontró que era active en los ensayos para la capacidad de enlazarse a EpCAM y es también activa en ensayos para actividad de IL-2, tal como el ensayo de proliferación de células CTLL-2.

<110> Gillies, Stephen

\hskip1cm

Lo, Kin Ming

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<120> Complejos de Proteína de Múltiples Citoquinas

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<130> LEX-01OPC

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\vskip0.400000\baselineskip

<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 601147,924

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<151> 1999-08-09

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 32

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 582

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación p35 de murino para proteína madura

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<400> 1

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5

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<210> 2

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<211> 1472

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación p40-IL-2 de murino para proteína de fusión

\newpage

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<400> 2

6

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<210> 3

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<211> 1409

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación p40-GM-CSF de murina para proteína de fusión

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

7

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<210> 4

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<211> 1389

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación p40-IL-2 humano para proteína de fusión

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<400> 4

9

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<210> 5

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<211> 1278

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación Fc-p35 de murino para proteína de fusión

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<400> 5

10

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<210> 6

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<211> 1287

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificiación Fc-p35 humano para proteína de fusión

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

11

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<210> 7

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador delantero para la construcción de la proteína de fusión p40-IL-2 de murino

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (12)..(14)

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<223> codón de iniciación de traslación

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<400> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagctagcac catgtgtcct cagaagctaa cc

\hfill

32

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador hacia adelante para la construcción de la proteína de fusión p40-IL-2 de murina

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> Complemento(7)..(9))

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<223> codón detenido de traslación

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagctag gatcggaccc tgcaggg

\hfill

27

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN en la unión de la proteína de fusión p40-IL-2 de murina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

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<222> (14)..(16)

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<223> codifica al residuo aminoácido del C-Terminal de p40 de murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<222> (26)..(28)

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<223> codificación al residuo aminoácido del N-terminal de IL-2 de murino maduro

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctgcagggtc cgatccccgg gtaaagcacc c

\hfill

31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN en la unión de cadena sencilla de IL12 y GMCSF de murina

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<220>

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<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica al residuo C-Terminal de p40 de murina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica al residuo aminoácido del N-Terminal de GMCSF de murino maduro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgcagggtc cgatccccgg gaaaagca

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2013

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación de la proteína de fusión p35-enlazador-p40-IL-2 de murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1569

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación de la proteína de fusión p35-enlazador-p40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2709

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación de la proteína de fusión Fc-p35-enlazador-p40-IL-2 de murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador hacia adelante por amplificación PCR de la subunidad p35 de murino de IL12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codón iniciador de traslación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcttgcta gcagcatgtg tcaatcacgc tac

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial:cebador hacia atrás por amplificación PCR de la subunidad p35 de murino de IL-12

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> complemento ((10)..(12))

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codón de traslación detenido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagcttt caggcggagc tcagatagcc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de condificiación en la unión entre p35 y p40 que comprende a IL-12 de cadena sencilla de murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(10)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica el residuo aminoácido del C-Terminal de p35 de murino

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (59)..(61)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica al residuo de N-Terminal de p40 de taurino maduro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccgccat

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

g

\hfill

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de proteína en la unión entre p35 y p40 que comprende al IL-12 de cadena sencilla de murina

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación en la unión entre p40 de murina y N-Terminal

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

maduro de KS de cadena pesada

\hfill

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de murina p40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (71)..(73)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica al residuo aminoácido del C-Terminal de p40 de murina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación en la unión entre p40 de murino y N-Terminal

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

maduro de KS de cadena pesada

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

\sac{Leu Ser}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación entre la unión de p35 de murino y KS de cadena liviana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica al residuo aminoácido del C-Terminal de p35 de murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (62)..(64)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica al residuo aminoácido del C-Terminal de cadena liviana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: proteína de codificación en la unión entre p35 de murino y KS de cadena liviana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu}

\sac{Ser}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador hacia adelante por amplificación PCR de murino de IL-4

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codón de iniciación de traslación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctagaccat gggtctcaac ccccagc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador hacia atrás por amplificación PCR de murino de IL-4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> complemento ((8))..((10))

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica al residuo aminoácido del C-Terminal de IL-4 de murina

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggatcccga gtaatccatt tgcatgatgc tctttaggct ttccagg

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación en la unión entre IL-4 de murino y KS 1/4 maduro de cadena liviana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica al residuo en serie del C-Terminal de IL-4 de murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (55)..(57)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica al residuo aminoácido del N-Terminal de KS 1/4 maduro de cadena liviana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagcgag

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de proteína en la unión entre IL-4 de murino y KS 1/4 maduro de cadena liviana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

\sac{Leu Ser Glu}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: promueve el iniciador para la amplificación PCR de murina IL-4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codón de iniciación de la traducción

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctagaccat gggtctcaac ccccagc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: revierte el iniciador para la amplificación PCR de murina IL-4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> Complemento ((13)..(15))

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de murina IL-4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatatcccg gacgagtaat ccatttgcat gatgctcttt aggctttcca gg

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia de codificación en la unión entre murina IL-4 y murina GM-CSF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica la secuencia C_terminal de muIL4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(39)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codifica la secuenci N-terminal de muGM-CSF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<440> 28

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggattact cgtccgggat gggaaaagca cccgcccgc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Promover iniciador para la amplificación PCR de murina linfotactina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codón de iniciación de la traducción

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctagagcca ccatgagact tctcctcctg ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artifical: revertir el iniciador para la secuencia de PCR de murina linfotactina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> Complemento (7)..(9))

\vskip0.400000\baselineskip

<221> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de murina linfotactina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccccca gtcagggtta ctgctg

\hfill

26

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<210> 31

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: codifica secuencia en la unión entre murinalinfotactina y la cadena pesada de KS-IL2

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (1)..(3)

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<223> codifica el residuo de aminoácido C-terminal de murina linfotactina

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (55)..(57)

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<223> codifica el residuo de aminoácido N-terminal de la cadena pesada de KS-IL2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

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\hskip-.1em\dddseqskip

cccggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagccag

\hfill

57

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de codificación en la unión entre linfotactina de murino y KS-IL2 de cadena pesada

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<400> 32

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\sa{Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu}

\sac{Ser }

Claims (14)

1. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo que comprende una región de inmunoglobulina y una proteína de fusión de citoquina que comprende dos diferentes Citoquinas, en donde la primera citoquina es IL-12 en una forma heterodimérica o en una cadena sencilla y la segunda citoquina es IL-2 o GM-CSF, que está covalentemente enlazada al terminal amino o carboxilo de la subunidad p35 o p40 de IL-12; dicha proteína de fusión de citoquina estando fusionada al terminal amino o carboxilo de dicha región de inmunoglobulina.

2. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1, en donde la subunidad p35 y p40 de IL-12 se fusionan a través de un polipéptido enlazador.

3. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde IL-12 y la segunda citoquina de dicha proteína de fusión de citoquina están fusionadas a través de un polipéptido enlazador.

4. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en donde dicha región de inmunoglobulina y dicha proteína de fusión de citoquina están fusionadas a través de un polipéptido enlazador.

5. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la segunda citoquina en dicha proteína de fusión de citoquina es IL-2.

6. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha región de inmunoglobulina que comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comprende un dominio de región de articulación, un dominio CH2 y un dominio CH3.

7. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 6, en donde dicha región de inmunoglobulina es una región Fc.

8. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 6, en donde dicha región de inmunoglobulina comprende además un dominio CH1.

9. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 8, en donde dicha región de inmunoglobulina comprende además un dominio VH, que es inmunológicamente reactivo con un antígeno específico para el cáncer o antígeno viral.

10. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 9, en donde dicha región de inmunoglobulina comprende además una cadena liviana de inmunoglobulina asociada con la cadena pesada de inmunoglobulina formando así un anticuerpo intacto.

11. Una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 10, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.

12. Un ácido nucleico que codifica a una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, opcionalmente junto con un vehículo o excipiente farmacéutico.

14. El uso de una proteína de fusión multifuncional citoquina-anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer y de infecciones virales.