ES2256776T3 - Regiones intergenicas como sitios de insercion en el genoma del virus vaccinia ankara modificado (mva). - Google Patents
Regiones intergenicas como sitios de insercion en el genoma del virus vaccinia ankara modificado (mva).Info
- Publication number
- ES2256776T3 ES2256776T3 ES03752741T ES03752741T ES2256776T3 ES 2256776 T3 ES2256776 T3 ES 2256776T3 ES 03752741 T ES03752741 T ES 03752741T ES 03752741 T ES03752741 T ES 03752741T ES 2256776 T3 ES2256776 T3 ES 2256776T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- mva
- baselineskip
- seqid
- igr
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000003780 insertion Methods 0.000 title claims description 109
- 230000037431 insertion Effects 0.000 title claims description 109
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 73
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 title description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 title description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 claims description 203
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 82
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 65
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 63
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 57
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 claims description 45
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 22
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 claims description 19
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 13
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 claims description 12
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 claims description 12
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 claims description 12
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 12
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 5
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150064860 PRM gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 3
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 48
- 206010072219 Mevalonic aciduria Diseases 0.000 description 34
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 16
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 101710148099 Blue fluorescence protein Proteins 0.000 description 11
- 101150049281 PRM1 gene Proteins 0.000 description 11
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 11
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 101000584877 Clostridium pasteurianum Putative peroxiredoxin in rubredoxin operon Proteins 0.000 description 9
- 101000618323 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 7.3 kDa protein in mobB-Gp55 intergenic region Proteins 0.000 description 9
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 9
- 101001056912 Saccharopolyspora erythraea 6-deoxyerythronolide-B synthase EryA1, modules 1 and 2 Proteins 0.000 description 9
- 101001056914 Saccharopolyspora erythraea 6-deoxyerythronolide-B synthase EryA3, modules 5 and 6 Proteins 0.000 description 9
- 101000819251 Staphylococcus aureus Uncharacterized protein in ileS 3'region Proteins 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 8
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 7
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 6
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 6
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 5
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- -1 phosphoribosyl Chemical group 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 101150106093 gpt gene Proteins 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 3
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 101150111412 npt gene Proteins 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 101150023320 B16R gene Proteins 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 2
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 101150073111 NPH1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000006825 purine synthesis Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101150044802 B12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150039806 B15L gene Proteins 0.000 description 1
- 101150095960 B19R gene Proteins 0.000 description 1
- 101150076749 C10L gene Proteins 0.000 description 1
- 101150084923 C19L gene Proteins 0.000 description 1
- 101100233978 Cowpox virus (strain GRI-90 / Grishak) KBTB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 101150109497 D10R gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102220530042 N-chimaerin_D10R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150071286 SPI-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 101100004095 Vaccinia virus (strain Copenhagen) B17L gene Proteins 0.000 description 1
- 101100226407 Vaccinia virus (strain Copenhagen) F15L gene Proteins 0.000 description 1
- 101100226409 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR054 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100008576 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR115 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100004100 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR199 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100219276 Variola virus (isolate Human/India/Ind3/1967) C4L gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Chemical class 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229940024231 poxvirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102220092797 rs114907619 Human genes 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA), que comprende una secuencia heteróloga exógena de DNA insertada en una región intergénica (IGR) del genoma vírico. Es un objeto de la presente invención identificar sitios de inserción adicionales del genoma de MVA y proporcionar vectores de inserción, que dirigen la inserción de secuencias exógenas de DNA en dichos sitios de inserción de nueva identificación del genoma de MVA. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un MVA recombinante que comprende secuencias exógenas de DNA integradas de manera estable en nuevos sitios de inserción del genoma de MVA.
Description
Regiones intergénicas como sitios de inserción en
el genoma del virus Vaccinia Ankara modificado (MVA).
La presente invención se refiere a nuevos sitios
de inserción útiles para integración de secuencias exógenas de DNA
en el genoma de MVA.
El virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA)
es un miembro de la familia Ortopoxvirus y ha sido generado por
aproximadamente 570 pasadas en serie en fibroblastos de embrión de
pollo de la cepa Ankara del virus Vaccinia (CVA) (para revisión
véase Mayr, A., et al. [1975], Infection 3,
6-14). Como consecuencia de estas pasadas, el virus
MVA resultante contiene 31 kilobases menos de información genómica
comparado con CVA y está muy restringido en cuanto a células
hospedadoras (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72,
1031-1038 [1991]). MVA se caracteriza por su
extremada atenuación, es decir por una virulencia o infectividad
reducidas, pero mantiene todavía una inmunogenicidad excelente.
Cuando se ensayó en una diversidad de modelos animales, se demostró
que MVA es avirulento incluso en individuos inmunodeficientes. Y, lo
que es más importante, las excelentes propiedades de la cepa MVA han
sido demostradas en pruebas clínicas extensas (Mayr et al.,
Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987]).
Durante estos estudios en más de 120.000 humanos, con inclusión de
pacientes de alto riesgo, no se observó efecto secundario alguno
(Stickl et al., Dtsch. Med. Wschr. 99,
2386-2392 [1974]).
Se ha encontrado adicionalmente que MVA está
bloqueado en la última etapa del ciclo de replicación del virus en
células de mamífero (Sutter, G. y Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89, 10847-10851). De acuerdo con ello, MVA
replica totalmente su DNA, sintetiza los productos génicos
iniciales, intermedios y finales pero no es capaz de ensamblar
viriones infecciosos maduros, que podrían liberarse de una célula
infectada. Por esta razón, es decir por estar restringido en su
replicación, fue propuesto el MVA para servir como vector de
expresión génica.
Más recientemente, se utilizó MVA para generar
vacunas recombinantes, que expresan secuencias antigénicas
insertadas sea en el sitio del gen de la
timidina-quinasa (tk) (documento US 5.185.146) o en
el locus de hemaglutinina (documento EP 0 753 581 A1) o en el sitio
de una deleción existente naturalmente dentro del genoma del MVA
(documento PCT/EP96/02926).
Aunque el locus de la inserción tk es utilizado
ampliamente para la generación de poxvirus recombinantes,
particularmente para la generación de virus Vaccinia recombinantes
(Mackett, et al. [1982] P.N.A.S. USA 79,
7415-7419), esta tecnología no podía aplicarse para
MVA. Se demostró por Scheiflinger et al., que MVA es mucho
más sensible a modificaciones del genoma en comparación con otros
poxvirus, que pueden utilizarse para la generación de poxvirus
recombinantes. Scheiflinger et al. demostraron en particular
que uno de los sitios utilizados más comúnmente para la integración
de DNA heterólogo en genomas de poxvirus, a saber el locus del gen
de timidina-quinasa (tk), no puede utilizarse para
generar MVA recombinante. Se demostró que cualquier MVA recombinante
tk(-) resultante ara sumamente inestable y durante la purificación
delecionaba inmediatamente el DNA insertado junto con partes del DNA
genómico de MVA (Scheiflinger et al. [1996], Arch Virol 141:
pp 663-669).
La inestabilidad y, por consiguiente, la alta
probabilidad de recombinación genómica es un problema conocido
dentro de la poxvirología. De hecho, el MVA se estableció durante
pasadas de larga duración aprovechando el hecho de que el genoma
vírico de CVA es inestable cuando se propaga in vitro en
células de tejidos cultivadas. Varios millares de nucleótidos (31
kb) habían sido delecionados del genoma de MVA que, como
consecuencia, se caracteriza por 6 deleciones mayores y numerosas
deleciones menores en comparación con el genoma del CVA
original.
La organización genómica del genoma de MVA ha
sido descrita recientemente (Antoine et al. [1998], Virology
244, 365-396). El genoma de 178 kb de MVA está
densamente compactado y comprende 193 marcos abiertos de lectura
(ORFs) individuales, que codifican proteínas de al menos 63
aminoácidos de longitud. En comparación con el virus Variola
altamente infeccioso y también con el prototipo del virus Vaccinia,
a saber la cepa Copenhagen, la mayoría de los ORFs de MVA están
fragmentados o truncados (Antoine et al. [1998], Virology
244, 365-396). Sin embargo, con muy pocas
excepciones todos los ORFs, con inclusión de los ORFs fragmentados y
truncados, llegan a transcribirse y traducirse en proteínas. En lo
que sigue, se utiliza la nomenclatura de Antoine et al y -en
caso apropiado- se indica también la nomenclatura basada en el
material digerido con la enzima de restricción Hind III.
Hasta ahora, únicamente la inserción de DNA
exógeno en los sitios de deleción existentes naturalmente del genoma
de MVA ha conducido a MVAs estables recombinantes (documento
PCT/EP96/02926). Lamentablemente, existe sólo un número restringido
de sitios de deleción existentes naturalmente en el genoma de MVA.
Además, se ha demostrado que otros sitios de inserción, tales como,
v.g., el locus del gen tk, apenas son útiles para la generación de
MVA recombinante (Scheiflinger et al. [1996], Arch Virol 141:
pp 663-669).
Es un objeto de la presente invención identificar
sitios de inserción adicionales del genoma de MVA y proporcionar
vectores de inserción, que dirigen la inserción de secuencias
exógenas de DNA en dichos sitios de inserción de nueva
identificación del genoma de MVA.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar un MVA recombinante que comprende secuencias exógenas
de DNA integradas de manera estable en nuevos sitios de inserción
del genoma de MVA.
Los autores de la presente invención han
identificado nuevos sitios para la inserción de secuencias exógenas
de DNA en el genoma del virus Vaccinia Ankara Modificado
(MVA). Los nuevos sitios de inserción están localizados en las
regiones intergénicas (IGRs) del genoma vírico, en donde dichas IGRs
están, a su vez, localizadas entre o están flanqueadas por dos
marcos abiertos de lectura (ORFs) adyacentes del genoma de MVA.
De acuerdo con ello, la presente invención se
refiere a un MVA recombinante que comprende una secuencia exógena de
DNA heteróloga insertada en una IGR del genoma vírico. De acuerdo
con la presente invención, pueden insertarse una o más secuencias
exógenas de DNA en una o más IGRs.
Sorprendentemente, se ha encontrado que las
secuencias exógenas de DNA se mantienen de hecho estables insertadas
en las IGRs del genoma de MVA: como ya se ha indicado arriba, el
genoma de MVA debe considerarse como sumamente inestable. Parece ser
que los genes o secuencias de DNA no esenciales para la propagación
del virus están delecionados o fragmentados. Aunque se encontró
-también de modo sorprendente- que se obtienen MVAs estables
recombinantes cuando se insertan secuencias heterólogas de DNA en
los sitios de deleción del genoma de MVA existentes naturalmente
(documento PCT/EP96/02926) se encontró -por el contrario- que los
genes de rango hospedador como, v.g., el locus tk utilizado
ampliamente para la generación de otros poxvirus recombinantes, no
son sitios de inserción adecuados en MVA. El hecho de que
Vero-MVA tiene una sola deleción genómica
suplementaria (documento PCT/EP01/02703) sugiere también que el
genoma es dinámico en el sentido de que el mismo deleciona
fácilmente genes que no se requieren para la propagación. Por esta
razón, se pudo deducir que podría esperarse que la inserción de
secuencias de DNA heterólogas no esenciales para la propagación
vírica en espacios entre los ORFs sería delecionada asimismo por el
virus.
Si bien la secuencia de nucleótidos de un ORF
codifica una secuencia de aminoácidos que forma un péptido,
polipéptido o proteína, las IGRs entre dos ORFs no tienen capacidad
codificante alguna, aunque pueden comprender elementos reguladores,
sitios de fijación, secuencias promotoras y/o intensificadoras
esenciales para o implicadas en el control de la transcripción de la
expresión de los genes víricos. Así pues, la IGR puede estar
involucrada en el control regulador del ciclo vital del virus. Sin
embargo, los autores de la presente invención han demostrado también
que los nuevos sitios de inserción presentan la ventaja inesperada
de que pueden insertarse de manera estable secuencias exógenas de
DNA en el genoma de MVA sin influir o cambiar las características
típicas y la expresión génica de MVA. Los nuevos sitios de inserción
son especialmente útiles, dado que no se altera ningún ORF o ninguna
secuencia codificante de MVA.
Además, se ha encontrado sorprendentemente que el
nivel de expresión de un gen extraño insertado en una IGR es mayor
que el nivel de expresión de un gen extraño insertado en un sitio de
deleción del genoma de MVA (véase también el Ejemplo 1).
La secuencia de nucleótidos de un ORF comienza
regularmente con un codón de inicio y termina con un codón de
parada. Dependiendo de la orientación de los dos ORFs adyacentes, la
IGR, la región entre estos ORFs, está flanqueada sea por los dos
codones de parada de los dos ORFs adyacentes, o bien por los dos
codones de inicio de los dos ORFs adyacentes, o bien por el codón de
parada del primer ORF y el codón de inicio del segundo ORF, o bien
por el codón de inicio del primer ORF y el codón de parada del
segundo ORF.
De acuerdo con ello, el sitio de inserción para
la secuencia exógena de DNA en la IGR puede estar situado aguas
abajo o 3' del codón de parada de un primer ORF. En el caso en que
el ORF adyacente, denominado también segundo ORF, tenga la misma
orientación que el primer ORF, este sitio de inserción aguas abajo
del codón de parada del primer ORF se encuentra aguas arriba o 5'
del codón de inicio del segundo ORF.
En el caso en que el segundo ORF tenga una
orientación opuesta con relación al primer ORF, lo que significa que
la orientación de los dos ORFs adyacentes está apuntada uno hacia
otro, entonces el sitio de inserción se encuentra aguas abajo de los
codones de parada de ambos ORFs.
Como tercera alternativa, en el caso en que los
dos ORFs adyacentes lean en dirección opuesta, pero la orientación
de los dos ORFs adyacentes apunte alejándose uno del otro, lo que es
sinónimo con un posicionamiento que se caracteriza porque los
codones de inicio de los dos ORFs son adyacentes uno a otro,
entonces el DNA exógeno se inserta aguas arriba con relación a ambos
codones de inicio.
Los ORFs en el genoma de MVA se encuentran en dos
direcciones codificantes. Por consiguiente, la actividad de
polimerasa ocurre de izquierda a derecha, es decir, en dirección
hacia delante y, correspondientemente, de derecha a izquierda
(dirección inversa). Es práctica común en tecnología de poxvirus y
se ha convertido en una clasificación estándar para los virus
Vaccinia identificar los ORFs por su orientación y su posición en
los diferentes fragmentos de digestión con la enzima de rescisión
HindIII del genoma. Para la nomenclatura, los diferentes
fragmentos HindIII se nombran por letras mayúsculas
descendentes correspondientes a su tamaño descendente. Los ORF se
numeran de izquierda a derecha en cada fragmento HindIII y la
orientación del ORF se indica por una L (que significa transcripción
de derecha a izquierda (Left) o R mayúscula (que significa
transcripción de izquierda a derecha (Right). Adicionalmente,
existe una publicación más reciente de la estructura del genoma de
MVA, que utiliza una nomenclatura diferente, numerando simplemente
el ORF desde el extremo izquierdo al derecho del genoma e indicando
su orientación con una L o R mayúsculas (Antoine et al.
[1998], Virology 244, 365-396). Como ejemplo, el ORF
I4L, de acuerdo con la nomenclatura antigua, corresponde al ORF 064L
de acuerdo con Antoine et al.. Si no se indica nada en
contrario, la presente invención utiliza la nomenclatura de acuerdo
con Antoine et al.
De acuerdo con la presente invención, pueden
insertarse secuencias heterólogas de DNA en una o más IGRs
intercaladas entre dos ORFs adyacentes seleccionados del grupo que
comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la nomenclatura antigua, ORF 006L
corresponde a C10L, 019L corresponde a C6L, 020L a N1L, 021L a N2L,
023L a K2L, 028R a K7R, 029L a F1L, 037L a F8L, 045L a F15L, 050L a
E3L, 052R a E5R, 054R a E7R, 055R a E8R, 056L a E9L, 062L a I1L,
064L a I4L, 065L a I5L, 081R a L2R, 082L a L3L, 086R a J2R, 088R a
J4R, 089L a J5L, 092R a H2R, 095R a H5R, 107R a D10R, 108L a D11L,
122R a A11R, 123L a A12L, 125L a A14L, 126L to A15L, 135R a A24R,
136L a A25L, 137L a A26L, 141L to A30L, 148R a A37R, 149L a A38L,
152R a A40R, 153L a A41L, 154R a A42R, 157L a A44L, 159R a A46R,
160L a A47L, 165R a A56R, 166R a A57R, 167R a B1R, 170R a B3R, 176R
a B8R, 180R a B12R, 184R a B16R, 185L a B17L, y 187R a B19R.
Preferiblemente, la secuencia heteróloga se
inserta en una IGR flanqueada por dos ORFs adyacentes seleccionados
del grupo que comprende 007R-008L,
018L-019L, 044L-045L,
064L-065L, 136L-137L, y
148R-149L.
Las secuencias de DNA heterólogas o exógenas son
secuencias que, por su naturaleza, no se encuentran asociadas
normalmente con el poxvirus tal como se utiliza de acuerdo con la
presente invención. De acuerdo con una realización adicional de la
presente invención, la secuencia exógena de DNA comprende al menos
una secuencia codificante. La secuencia codificante está enlazada
operativamente a un elemento de control de la transcripción,
preferiblemente a un elemento de control de la transcripción
poxvírico. Adicionalmente, también pueden utilizarse combinaciones
entre elementos de control de la transcripción poxvíricos y, v.g.,
sitios internos de entrada de ribosoma.
De acuerdo con una realización adicional, la
secuencia exógena de DNA puede comprender también dos o más
secuencias codificantes enlazadas a uno o varios elementos de
control de la transcripción. Preferiblemente, la secuencia
codificante codifica uno(a) o más proteínas, polipéptidos,
péptidos, antígenos extraños o epítopes antigénicos, especialmente
los de genes terapéuticamente interesantes.
Genes terapéuticamente interesantes de acuerdo
con la presente invención pueden ser genes derivados de u homólogos
a genes de patógenos o microorganismos infecciosos que son causantes
de enfermedades. De acuerdo con ello, en el contexto de la presente
invención tales genes terapéuticamente interesantes se presentan al
sistema inmunitario de un organismo a fin de afectar,
preferiblemente inducir una respuesta inmunológica específica y, con
ello, vacunar o proteger profilácticamente el organismo contra una
infección con el microorganismo. En realizaciones adicionalmente
preferidas de la presente invención, los genes terapéuticamente
interesantes se seleccionan de genes de virus infecciosos, v.g.
-pero sin carácter limitante- el virus Dengue, el virus de la
Encefalitis Japonesa, el virus de la Hepatitis B o C, o virus de
inmunodeficiencia tales como HIV.
Genes derivados del virus Dengue son
preferiblemente los genes NS1 y PrM, pudiendo derivarse dichos genes
de uno, dos, tres o de la totalidad de los cuatro serotipos del
virus Dengue. El gen NS1 se deriva preferiblemente del serotipo 2
del virus Dengue y está insertado preferiblemente en la IGR entre
los ORFs 064L-065L (I4L-I5L). Los
genes PrM, derivados preferiblemente de la totalidad de los cuatro
serotipos del virus Dengue, están insertados preferiblemente en las
IGRs entre los ORFs seleccionados de 007R, 008L,
044L-045L, 136L-137L, y
148R-149L. De modo más preferible, el gen PrM
derivado del serotipo 1 del virus Dengue (PrM1) está insertado en la
IGR de 148R-149L, PrM2 en la IGR
007R-008L, PrM3 en la IGR de los ORFs
044L-045L, y PrM4 en la IGR
136L-137L.
De acuerdo con la característica preferida
adicional de la presente invención, la secuencia heteróloga de DNA
se deriva de HIV y codifica env de HIV, estando insertado
preferiblemente el gen env de HIV en la IGR entre los ORFs
007R-008L.
Adicionalmente, genes terapéuticamente
interesantes de acuerdo con la presente invención comprenden también
genes relacionados con enfermedades, que tienen un efecto
terapéutico sobre trastornos proliferativos, cánceres o enfermedades
metabólicas. Por ejemplo, un gen terapéuticamente interesante con
relación al cáncer podría ser un antígeno del cáncer que tiene
capacidad para inducir una reacción inmunológica
anti-cáncer específica.
De acuerdo con una realización adicional de la
presente invención, la secuencia codificante comprende al menos un
gen marcador o de selección.
Los genes de selección transducen una resistencia
particular a una célula, con lo cual se hace posible un cierto
método de selección. El profesional experto está familiarizado con
una diversidad de genes de selección, que pueden ser utilizados en
un sistema de poxvirus. Entre éstos se encuentran, v.g., el gen de
resistencia a la neomicina (NPT) o el gen de la
fosforribosil-transferasa (gpt).
Los genes marcadores inducen una reacción de
color en las células transducidas, que puede utilizarse para
identificar células transducidas. El profesional experto está
familiarizado con una diversidad de genes marcadores, que pueden
utilizarse en un sistema poxvírico. Entre éstos se encuentran el gen
que codifica, v.g., \beta-galactosidasa
(\beta-gal), \beta-glucosidasa
(\beta-glu), la Proteína de Fluorescencia Verde
(EGFP) o la Proteína de Fluorescencia Azul.
De acuerdo con otra realización adicional de la
presente invención, la secuencia exógena de DNA comprende una
secuencia espaciadora, que separa el elemento de control de la
transcripción del poxvirus y/o la secuencia codificante en la
secuencia exógena de DNA del codón de parada y/o del codón de inicio
de los ORFs adyacentes. Esta secuencia espaciadora entre el codón de
parada/inicio del ORF adyacente y la secuencia codificante insertada
en el DNA exógeno tiene la ventaja de estabilizar el DNA exógeno
insertado y, por consiguiente, cualquier virus recombinante
resultante. El tamaño de la secuencia espaciadora es variable con
tal que la secuencia carezca de función codificante o reguladora en
sí misma.
De acuerdo con una realización adicional, la
secuencia espaciadora que separa el elemento de control de la
transcripción poxvírico y/o la secuencia codificante en la secuencia
exógena de DNA del codón de parada del ORF adyacente tiene al menos
la longitud de un nucleótido.
De acuerdo con otra realización de la presente
invención, la secuencia espaciadora que separa el elemento de
control de la transcripción poxvírico y/o la secuencia codificante
en la secuencia exógena de DNA del codón de inicio del ORF adyacente
tiene una longitud de al menos 30 nucleótidos. Particularmente, en
los casos en que un elemento promotor del virus Vaccinia típico está
identificado aguas arriba de un codón de inicio, la inserción del
DNA exógeno puede no separar el elemento promotor del codón de
inicio del ORF adyacente. Un elemento promotor de Vaccinia típico
puede identificarse por escaneo para, v.g., la secuencia
"TAAAT" para los promotores finales (Davison & Moss, J.
Mol. Biol. 1989; 210: 771-784) y un dominio rico en
A/T para los promotores iniciales. Una secuencia espaciadora de
aproximadamente 30 nucleótidos es la distancia preferida para
asegurar que un promotor poxvírico localizado aguas arriba del codón
de inicio del ORF no se vea influenciado. Adicionalmente, de acuerdo
con una realización ulteriormente preferida, la distancia entre el
DNA exógeno insertado y el codón de inicio del ORF adyacente es
alrededor de 50 nucleótidos, y más preferiblemente alrededor de 100
nucleótidos.
De acuerdo con una realización adicionalmente
preferida de la presente invención, la secuencia espaciadora
comprende un elemento de control de la transcripción poxvírico
adicional que es capaz de controlar la transcripción del ORF
adyacente.
Una cepa de MVA típica que puede utilizarse de
acuerdo con la presente invención para generar un MVA recombinante
es MVA-575, que ha sido depositada en la Colección
Europea de Cultivos de Células Animales bajo el número de depósito
ECACC V00120707.
Otra cepa de MVA preferida es
MVA-Vero o un derivado de la misma. Las cepas
MVA-Vero han sido depositadas en la Colección
Europea de Cultivos de Células Animales bajo los números de depósito
ECACC V99101431 y 01021411. La seguridad de la cepa
MVA-Vero se refleja por características biológicas,
químicas y físicas como se describen en la Solicitud de Patente
Internacional PCT/EP01/02703. En comparación con otras cepas de MVA,
Vero-MVA incluye una deleción genómica
adicional.
Todavía otra cepa de MVA más preferida es
MVA-BN. MVA-BN ha sido depositada en
la Colección Europea de Cultivos de Células Animales con el número
de depósito ECACC V00083008. El virus MVA-BN es un
virus extremadamente atenuado derivado también del virus Vaccinia
Ankara modificado (véase también el documento
PCT/EP01/13628).
El término "derivados" de un virus de
acuerdo con la presente invención hace referencia a virus de
progenie que exhiben los mismos rasgos característicos que el virus
parental, pero que presentan diferencias en una o más partes de su
genoma. El término "derivado de MVA" describe un virus, que
tiene las mismas características funcionales comparado con MVA. Por
ejemplo, un derivado de MVA-BN tiene los rasgos
característicos de MVA-BN. Una de estas
características de MVA-BN o derivados del mismo es
su atenuación y carencia de replicación en las células humanas
HaCat.
El MVA recombinante de acuerdo con la presente
invención es útil como medicamento o vacuna. De acuerdo con una
realización adicional, el mismo se utiliza para la introducción de
la secuencia codificante exógena en una célula diana, siendo dicha
secuencia homóloga o heteróloga al genoma de la célula diana.
La introducción de una secuencia codificante
exógena en una célula diana puede realizarse in vitro para
producir proteínas, polipéptidos, péptidos, antígenos o epítopes
antigénicos. Este método comprende la infección de una célula
hospedadora con el MVA recombinante de acuerdo con la invención,
cultivo de la célula hospedadora infectada en condiciones adecuadas,
y aislamiento y/o enriquecimiento del polipéptido, péptido,
proteína, antígeno, epítope y/o virus producido por dicha célula
hospedadora.
Adicionalmente, el método para la introducción de
una o más secuencias homólogas o una o más secuencias heterólogas en
células puede aplicarse para terapia in vitro e in
vivo. Para la terapia in vitro, células aisladas que han
sido infectadas previamente (ex vivo) con el MVA recombinante
de acuerdo con la invención se administran al cuerpo animal vivo
para afectar, preferiblemente inducir una respuesta inmunológica.
Para la terapia in vivo, el poxvirus recombinante de acuerdo
con la invención se administra directamente al cuerpo animal vivo
para afectar, preferiblemente inducir una respuesta inmunológica. En
este caso, las células que rodean el sitio de inoculación, pero
también las células a las que se transporta el virus por la vía,
v.g., del torrente sanguíneo, son infectadas directamente in
vivo por el MVA recombinante de acuerdo con la invención.
Después de la infección, estas células sintetizan las proteínas,
péptidos o epítopes antigénicos de los genes terapéuticos, que son
codificados por la secuencias codificantes exógenas y,
subsiguientemente, presentan los mismos o partes de los mismos en la
superficie celular. Células especializadas del sistema inmunitario
reconocen la presentación de tales proteínas, péptidos o epítopes
heterólogos y lanzan una respuesta inmunológica específica.
Dado que el MVA está sumamente restringido en
crecimiento y, por tanto, muy atenuado, es útil para el tratamiento
de una extensa gama de mamíferos con inclusión de humanos, con
inclusión de animales o humanos inmunodeficientes. La presente
invención proporciona también composiciones farmacéuticas y vacunas
para inducir una respuesta inmunológica en un cuerpo animal vivo,
con inclusión de un humano.
La composición farmacéutica puede incluir
generalmente uno o más vehículos, aditivos, antibióticos,
conservantes, adyuvantes, diluyentes y/o estabilizadores
farmacéuticamente aceptables y/o aprobados. Tales sustancias
adyuvantes pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol,
agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras del
pH, o análogos. Los vehículos adecuados son típicamente moléculas
grandes, que se metabolizan lentamente tales como proteínas,
polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos,
aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácidos, agregados
lipídicos, etcétera.
Para la preparación de vacunas, el poxvirus
recombinante de acuerdo con la invención se convierte en una forma
fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse basándose en la
experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus utilizadas para
vacunación contra la viruela (como ha sido descrito por Stickl, H.
et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99,
2386-2392). Por ejemplo, el virus purificado se
guarda a -80ºC con un título de 5 x 10E8 TCID_{50}/ml formulado en
Tris aproximadamente 10 mM, NaCl 140 mM de pH 7,4. Para la
preparación de dosis de vacuna, v.g., se liofilizan
10E2-10E8 partículas del virus en 100 ml de solución
salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de peptona al 2% y
albúmina humana al 1% en una ampolla, preferiblemente una ampolla de
vidrio. Alternativamente, las dosis de vacuna pueden producirse por
liofilización gradual del virus en una formulación. Esta formulación
puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano,
azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros adyuvantes
tales como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas
recombinantes (v.g. seroalbúmina humana) adecuados para
administración in vivo. La ampolla de vidrio se sella luego y
puede guardarse entre 4ºC y la temperatura ambiente durante varios
meses. Sin embargo, en tanto que no exista necesidad alguna, la
ampolla se guarda preferiblemente a temperaturas inferiores a
-20ºC.
Para la vacunación o terapia, el liofilizado
puede disolverse en 0,1 a 0,5 ml de una solución acuosa,
preferiblemente solución salina fisiológica o tampón Tris, y se
administra sistémica o localmente, es decir por vía parenteral,
subcutánea, intramuscular, por escarificación o cualquier otra vía
de administración conocida por el profesional experto. El modo de
administración, la dosis y el número de administraciones pueden ser
optimizados por los expertos en la técnica de manera conocida. Sin
embargo, la mayoría de las veces un paciente se vacuna con una
segunda dosis aproximadamente 1 a 6 meses después de la primera
dosis de vacunación.
La presente invención se refiere adicionalmente a
vectores plasmídicos, que pueden utilizarse para generar MVA
recombinante de acuerdo con la presente invención, y se refiere
también a ciertas secuencias de DNA:
Regularmente, la IGR localizada entre o
flanqueada por dos ORFs adyacentes comprende secuencias de
nucleótidos en las cuales puede estar insertada la secuencia exógena
de DNA de interés. De acuerdo con ello, el vector de plásmido de
acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de DNA
derivada de u homóloga al genoma de MVA, en donde dicha secuencia de
DNA comprende un fragmento completo o parcial de una secuencia de
IGR localizada entre o flanqueada por dos ORFs adyacentes del genoma
vírico. Preferiblemente, el vector de plásmido comprende, insertado
en dicha secuencia derivada de IGR, al menos un sitio de clonación
para la inserción de una secuencia exógena de DNA de interés y,
preferiblemente, para la inserción de un elemento de control de la
transcripción poxvírico enlazado operativamente a dicha secuencia de
DNA heteróloga. Opcionalmente, el vector de plásmido comprende una
casete de gen informador y/o de gen de selección. El vector de
plásmido comprende también preferiblemente secuencias de los dos
ORFs adyacentes que flanquean dicho fragmento completo o parcial de
la secuencia IGR.
Se han identificado algunas IGRs que no incluyen
secuencias nucleotídicas. En estos casos, el vector de plásmido
comprende secuencias de DNA de las secuencias de IGR flanqueantes,
es decir, secuencias de DNA de los dos ORF adyacentes.
Preferiblemente, el sitio de clonación para la inserción de la
secuencia de DNA heteróloga se inserta en la IGR. El DNA de las
secuencias de IGR flanqueantes se utiliza para dirigir la inserción
de las secuencias exógenas de DNA en la IGR correspondiente en el
genoma del MVA. Un vector de plásmido de este tipo puede incluir
adicionalmente un fragmento completo o parcial de una secuencia de
IGR que comprende el sitio de clonación para la inserción de la
secuencia de DNA heteróloga y, opcionalmente, de la casete del gen
informador y/o gen de selección.
Las secuencias IGR-DNA así como
secuencias IGR flanqueantes de los dos ORFs adyacentes se
seleccionan preferiblemente de IGRs y ORFs, respectivamente,
seleccionados del grupo que comprende
Las secuencias se seleccionan, más
preferiblemente, de IGRs y ORFs, respectivamente, seleccionados del
grupo que comprende 007R-008L,
018L-019L, 044L-045L,
064L-065L, 136L-137L y
148L-149L. Secuencias derivadas de IGR se
seleccionan, preferiblemente, del grupo que comprende las secuencias
de nucleótidos:
- no. 527-608 de SeqID No.
32;
- no. 299-883 de SeqID No.
33;
- no. 339-852 de SeqID No.
34;
- no. 376-647 de SeqID No.
35;
- no. 597-855 de SeqID No.
36;
- no. 400-607 de SeqID No.
37.
Las secuencias flanqueantes IGR de los dos ORFs
adyacentes se seleccionan preferiblemente del grupo que comprende
las secuencias de nucleótidos:
- no. 1-525 y
609-1190 de SeqID No. 32;
- no. 101-298 y
884-1198 de SeqID No. 33;
- no. 1-338 y
853-1200 de SeqID No. 34;
- no. 1-375 y
648-1200 de SeqID No. 35;
- no. 1-596 y
856-1200 de SeqID No. 36;
- no. 1-399 y
608-1081 de SeqID No. 37.
Las secuencias de DNA se derivan preferiblemente
de o son homólogas al genoma del MVA depositado en ECACC bajo el
número de depósito V00083008.
Para generar un vector de plásmido de acuerdo con
la presente invención, las secuencias de aíslan y se clonan a un
vector de clonación estándar, tal como pBluescript (Stratagene), en
el cual aquéllas flanquean el DNA exógeno a insertar en el genoma de
MVA. Opcionalmente, un vector de plásmido de este tipo comprende una
casete de gen de selección o informador, que puede delecionarse del
virus recombinante final, debido a una secuencia repetitiva incluida
en dicha casete.
Métodos para introducir secuencias exógenas de
DNA por un vector de plásmido en un genoma de MVA y métodos para
obtener MVA recombinante son bien conocidos por las personas
expertas en la técnica y, adicionalmente, pueden deducirse de las
referencias siguientes:
- Molecular Cloning, A Laboratory Manual.
2ª Edición, por J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989: describe técnicas y experiencia en
las técnicas estándar de biología molecular tales como clonación de
DNA, aislamiento de RNA, análisis por transferencia Western,
RT-PCR y técnicas de amplificación PCR;
- Virology Methods Manual. Recopilado por
Brian WJ Mahy y Hillar O Kangro. Academic Press. 1996: describe
técnicas para el manejo y la manipulación de virus;
- Molecular Virology: A Practical
Approach. Recopilado por AJ Davison y RM Elliott. The Practical
Approach Series. IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993.
Capítulo 9: Expresión de genes por vectores del virus Vaccinia;
- Current Protocols in Molecular Biology.
Editor: John Wiley and Sons Inc. 1998. Capítulo 16, sección IV:
Expresión de proteínas en células de mamífero utilizando un vector
del virus Vaccinia: describe técnicas y experiencia para el manejo,
la manipulación y la ingeniería genética del MVA.
El MVA de acuerdo con la presente invención,
preferiblemente el MVA depositado en ECACC bajo el número de
depósito V00083008, puede producirse por transfección de una célula
con un vector de plásmido de acuerdo con la presente invención,
infección de la célula transfectada con un MVA y, subsiguientemente,
identificación, aislamiento y, opcionalmente, purificación del MVA
de acuerdo con la invención.
Las secuencias de DNA de acuerdo con la invención
pueden utilizarse para identificar o aislar el MVA o sus derivados
de acuerdo con la invención y células o individuos infectados con un
MVA de acuerdo con la presente invención. Las secuencias de DNA se
utilizan, v.g., para generar iniciadores PCR, sondas de hibridación,
o se utilizan en tecnologías de redes.
Figura 1: Mapa de restricción de los constructos
vectores pBNX39 (Figura 1a), pBNX70 (Figura 1b) y pBN84 (Figura 1c),
que comprenden aproximadamente 600 pb de secuencias de MVA que
flanquean el sitio de inserción después del ORF I4L. Los plásmidos
comprenden adicionalmente DNA exógeno (Ecogpt y hBFP,
respectivamente) bajo el control de transcripción de un promotor de
poxvirus P) entre las secuencias flanqueantes: Flanco 1 (F1
I4L-I5L) y Flanco 2 (F2 I4L-I5L).
F1rpt representa una secuencia repetitiva del Flanco 1 que permite
la deleción de la casete informadora de un virus recombinante
resultante. pBN84 (Figura 1c) codifica adicionalmente la proteína
del virus Dengue NS1 (NS1 DEN). Abreviaturas adicionales: AmpR = gen
de resistencia a la ampicilina; bps = pares de bases.
Figura 2: Mapa de restricción de los constructos
vectores pBNX51 (Figura 2a), pBNX67 (Figura 2b) y pBN27 (Figura 2c),
que comprende aproximadamente 600 pb de secuencias de MVA que
flanquean el sitio de inserción después del ORF 137L (Flanco 1:
F1136-137 corresponde a la posición
129340-129930 del genoma de MVA; Flanco 2:
F2136-137 corresponde a la posición
129931-130540 del genoma de MVA). Adicionalmente, el
vector pBNX67 (Figura 2b) comprende DNA exógeno (gen NPT II =
resistencia a la neomicina) bajo el control de transcripción de un
promotor de poxvirus P) entre las secuencias flanqueantes. F2rpt
representa una secuencia repetitiva del Flanco 2 que permite la
deleción de la casete informadora de un plásmido recombinante
resultante. pBN27 (Figura 2c) codifica adicionalmente el PrM4 del
virus Dengue bajo control de un promotor de poxvirus. Abreviaturas
adicionales: AmpR = gen de resistencia a la ampicilina; pbs = pares
de bases; IRES = sitio de entrada de ribosoma interno; EGFP = gen
para la proteína de fluorescencia verde intensificada.
Figura 3: Mapa de restricción de los constructos
vectores pBNX79 (Figura 3a), pBNX86 (Figura 3b), pBNX88 (Figura 3c),
pBN34 (Figura 3d) y pBN56 (Figura 3e), que comprenden
aproximadamente 600 pbs de secuencias de MVA que flanquean el sitio
de inserción entre el ORF 007R y 008L (Flanco 1: F1 IGR
07-08 comienza en la posición 12200 del genoma de
MVA; Flanco 2: F2 IGR 07-08 termina en la posición
13400 del genoma de MVA). F2rpt representa una secuencia repetitiva
del Flanco 2 que permite la deleción de la casete informadora de un
virus recombinante resultante. Adicionalmente, el vector pBNX88
(Figura 3c) y pBNX86 (Figura 3b) comprenden DNA exógeno (BFP + gpt
y NPT II + EGFP, respectivamente) bajo el control de transcripción
de un promotor de poxvirus P) entre las secuencias flanqueantes.
F2rpt representa una secuencia repetitiva del Flanco 2 que permite
la deleción de la casete informadora de un virus recombinante
resultante. pBN56 (Figura 3e) codifica adicionalmente la proteína
env de HIV-1, y pBN34 (Figura 3d) contiene la
secuencia de codificante pRM2 del virus Dengue bajo el control de un
promotor de poxvirus. Abreviaturas adicionales: AmpR = gen de
resistencia a la ampicilina; pbs = pares de bases.
Figura 4: Mapa de restricción de los constructos
vectores pBNX80 (Figura 4a), pBNX87 (Figura 4b) y pBN47 (Figura 4c)
que comprenden aproximadamente 600/640 pbs de secuencias de MVA que
flanquean el sitio de inserción entre el ORF 044L y 045L (Flanco 1:
F1 IGR44-45 comienza en la posición 36730 del genoma
de MVA; Flanco 2: F2 IGR 44-45 termina en la
posición 37970 del genoma de MVA). Adicionalmente, el vector pBNX87
(Figura 4b) comprende DNA exógeno (gen NPT II + EGFP) bajo el
control de transcripción de un promotor de poxvirus P) entre las
secuencias flanqueantes. F2rpt representa una secuencia repetitiva
del Flanco 2 que permite la deleción de la casete informadora de un
virus recombinante resultante. PBN47 (Figura 4c) codifica
adicionalmente el PrM3 del virus Dengue bajo el control de un
promotor de poxvirus.
Abreviaturas adicionales: AmpR = gen de
resistencia a la ampicilina; pbs = pares de bases.
Figura 5: Mapa de restricción de los constructos
vectores pBNX90 (Figura 5a), pBNX92 (Figura 5b) y pBN54 (Figura 5c),
que comprenden aproximadamente 596-604 pbs de
secuencias de MVA que flanquean el sitio de inserción entre el ORF
148R y 149L (Flanco 1: F1 IGR148-149 que comienza en
la posición 136900 del genoma de MVA; Flanco 2: F2
IGR148-149 que termina en la posición 138100 del
genoma de MVA. Adicionalmente, el vector pBNX92 (Figura 5b)
comprende DNA exógeno (gpt + BFP) bajo el control de transcripción
de un promotor de poxvirus P) entre las secuencias flanqueantes.
PBN54 (Figura 5c) codifica adicionalmente el PrM1 del virus Dengue.
F2rpt representa una secuencia repetitiva del Flanco 2 que permite
la deleción de la casete informadora de un virus recombinante
resultante. Abreviaturas adicionales: AmpR = gen de resistencia a la
ampicilina; pbs = pares de bases.
Figura 6: Presentación esquemática de los sitios
de inserción intergénicos de MVA (Genbank Ac. U94848).
Figura 7: Análisis PCR de la IGR
I4L-I5L en MVA recombinante con el del virus Dengue
NS1 insertado en la IGR I4L-I5L. La pista "BN"
muestra el producto PCR utilizando el vector vacío
MVA-BN. Utilizando el MVA recombinante de NS1 puede
detectarse un fragmento de tamaño mayor (1, 2, 3, 4: concentraciones
diferentes de DNA). M = marcador de peso molecular, H_{2}O =
control negativo de agua.
Figura 8: Figura 8a: análisis PCR de la IGR
136-137 en MVA recombinante con el PrM4 del virus
Dengue insertado en la IGR 136-137. La pista
"BN" muestra el producto PCR utilizando el vector vacío
MVA-BN. Utilizando el MVA recombinante de PrM4 puede
detectarse un fragmento de mayor tamaño (mBN23, 1/10, 1/100:
concentraciones diferentes de DNA). M = marcador de peso molecular,
H_{2}O = control negativo de agua, pBN27 = control positivo de
plásmido.
Figura 8b: curva de crecimiento escalonado
múltiple para el vector vacío MVA-BN y el MVA
recombinante con PrM4 insertado en la IGR 136-137
(MVA-mBN23).
Figura 9: Figura 9a: análisis PCR de la IGR
07-08 en MVA recombinante con el PrM2 del virus
Dengue insertado en la IGR 07-08. La pista 3 muestra
el producto PCR utilizando el vector vacío MVA-BN.
Utilizando el MVA recombinante de PrM2 puede detectarse un fragmento
de mayor tamaño (pista 2). M = marcador de peso molecular, pista 1 =
control negativo de agua.
Figura 9b: curva de crecimiento escalonado
múltiple para el vector vacío MVA-BN y el MVA
recombinante con PrM2 insertado en la IGR 07-08
(MVA-mBN25).
Figura 10: análisis PCR de la IGR
07-08 en MVA recombinante con la env de HIV
insertada en la IGR 07-08. La pista BN muestra el
producto PCR utilizando el vector vacío MVA-BN.
Utilizando el MVA recombinante de PrM2 puede detectarse un fragmento
de mayor tamaño (pista 1, 2, 3). M = marcador de peso molecular, - =
control negativo de agua, + = control positivo de plásmido.
Figura 11: Figura 11a: análisis PCR de la IGR
44-45 en MVA recombinante con el PrM3 del virus
Dengue insertado en la IGR 44-45. La pista BN
muestra el producto PCR utilizando el vector vacío
MVA-BN. Utilizando el MVA recombinante de PrM3 puede
detectarse un fragmento de mayor tamaño (pista 1-4,
concentraciones diferentes de DNA). M = marcador de peso molecular,
- = control negativo de agua.
Figura 11b: curva de crecimiento escalonado
múltiple para el vector vacío MVA-BN y el MVA
recombinante con PrM3 insertado en la IGR 44-45
(MVA-mBN28).
Figura 12: Figura 12a: análisis PCR de la IGR
148-149 en MVA recombinante con el PrM1 del virus
Dengue insertado en la IGR 148-149. La pista BN
muestra el producto PCR utilizando el vector vacío
MVA-BN. Utilizando el MVA recombinante de PrM1 puede
detectarse un fragmento de mayor tamaño (pista 1). M = marcador de
peso molecular, - = control negativo de agua, + = control positivo
de plásmido.
Figura 12b: curva de crecimiento escalonado
múltiple para el vector vacío MVA-BN y el MVA
recombinante con PrM1 insertado en la IGR 44-45
(MVA-mBN33).
Los ejemplos que siguen ilustrarán adicionalmente
la presente invención. Debe quedar bien entendido por cualquier
persona experta en la técnica que los ejemplos que se proporcionan
no deben interpretarse de modo que limite la presente invención a
estos ejemplos. El alcance de la invención debe considerarse
limitado únicamente por el alcance global de las reivindicaciones
adjuntas.
Para la inserción de secuencias exógenas en la
región intergénica adyacente al ORF 065L (el sitio de inserción se
encuentra en la posición 56760 del genoma) de MVA, se construyó un
vector que comprende aproximadamente 1200 pb de las secuencias
flanqueantes adyacentes al sitio de inserción. Estas secuencias
flanqueantes están separadas en dos flancos que comprenden en un
flanco aproximadamente 610 pb del ORF 065L (nomenclatura
alternativa: ORF I4L) y por otra parte aproximadamente 580 pb de la
región intergénica detrás del ORF 065L, así como partes del ORF
próximo. Entre estas secuencias flanqueantes está localizado un gen
Ecogpt (gpt significa el gen de
fosforribosil-transferasa aislado de E. coli)
y una BFP (proteína de fluorescencia azul), respectivamente, bajo el
control de transcripción de un promotor de poxvirus. Adicionalmente,
existe al menos un sitio de clonación para la inserción de genes o
secuencias adicionales a insertar en la región intergénica detrás
del ORF I4L. Constructos vectores ilustrativos de acuerdo con la
presente invención se describen en la Figura 1 a) y b) (pBNX39,
pBNX70). En el vector pBN84 (Figura 1c), la región codificante para
del virus Dengue NS1 está insertada en el sitio de clonación de
pBNX70 (Figura 1b).
Pueden insertarse genes extraños en el genoma de
MVA por recombinación homóloga. Para dicho propósito, el gen extraño
de interés se clona en un vector de plásmido, como se ha descrito
arriba. Este vector se transfecta en células infectadas con MVA. La
recombinación tiene lugar en el citoplasma de las células infectadas
y transfectadas. Con ayuda de la casete de selección y/o
informadora, que está contenida también en el vector de inserción,
se identifican y aíslan las células que comprenden virus
recombinantes.
Para recombinación homóloga, se siembran células
BHK (riñón de cría de hámster) o CEF (fibroblastos primarios de
embrión de pollo) en placas de 6 pocillos utilizando DMEM (Medio de
Eagle Modificado de Dulbecco, Gibco BRL) + 10% de suero de ternero
fetal (FCS) o VP-SFM (Gibco BRL) + 4 mmol/l de
L-glutamina para un proceso de producción exento de
suero.
Las células precisan estar todavía en la fase de
crecimiento y por tanto deberían alcanzar 60-80% de
confluencia el día de la transfección. Las células se contaron antes
de la siembra, dado que el número de células tiene que ser conocido
para determinación de la multiplicidad de infección (moi) para la
infección.
Para la infección, el stock de MVA se diluye en
DMEM/FCS o VP-SFM/L-glutamina de tal
modo que 500 \mul de la dilución contengan una cantidad apropiada
de virus que dé una moi de 0,1-1,0. Se supone que
las células se han dividido una sola vez después de la siembra. Se
separa el medio de las células y se infectan las células con 500
\mul de virus diluido durante 1 hora de agitación mediante
sacudidas a la temperatura ambiente. Se separa el inoculante y se
lavan las células con DMEM/VP-SFM. Las células
infectadas se dejan en 1,6 ml de DMEM/FCS y
VP-SFM/L-glutamina, respectivamente,
mientras se dispone la reacción de transfección (Kit Qiagen
Effectene).
Para la transfección, se utiliza el kit de
transfección "Effectene" (Qiagen). Se prepara una mezcla de
transfección de 1-2 \mug de vector de inserción
linealizado (cantidad total para transfección múltiple) con tampón
EC para dar un volumen final de 100 \mul. Se añaden 3,2 \mul de
Enhancer, se agita enérgicamente y se incuba a la temperatura
ambiente durante 5 min. A continuación, se añaden 10 \mul de
Effectene después de agitar enérgicamente el tubo con el stock, y la
solución se mezcla concienzudamente por agitación enérgica y se
incuba a la temperatura ambiente durante 10 min. Se añaden 600
\mul de DMEM/FCS y
VP-SFM/L-glutamina, respectivamente,
se mezcla y se añade subsiguientemente la mezcla de transfección
total a las células, las cuales están ya cubiertas con el medio. La
cápsula se agita suavemente para mezclar la reacción de
transfección. La incubación tiene lugar a 37ºC con 5% de CO_{2}
durante una noche. Al día siguiente se retira el medio y se
reemplaza con DMEM/FCS de nuevo aporte o
VP-SFM/L-glutamina. La incubación se
continúa hasta el día 3.
Para la recogida, las células se pasan por
raspado al medio, y después de ello se transfiere la suspensión de
células a un tubo adecuado y se congela a -20ºC para almacenamiento
a corto plazo o a -80ºC para almacenamiento a largo plazo.
En una primera tanda, se infectaron células con
MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron
adicionalmente con el vector de inserción pBNX39 (Figura 1a) que
contenía el gen Ecogpt (Ecogpt, o abreviadamente
gpt, significa el gen de
fosforribosil-transferasa) como gen informador. Los
virus recombinantes resultantes se purificaron por 3 tandas de
purificación de placas bajo selección del metabolismo de la
fosforribosil-transferasa por adición de ácido
micofenólico, xantina e hipoxantina. El ácido micofenólico (MPA)
inhibe la monofosfato-deshidrogenasa de inosina y da
como resultado el bloqueo de la síntesis de purina y la inhibición
de la replicación vírica en la mayoría de las líneas de células.
Este bloqueo puede contrarrestarse por expresión de Ecogpt de
un promotor constitutivo y proporcionando los sustratos xantina e
hipoxantina.
Se identificaron los virus recombinantes
resultantes por ensayos PCR estándar utilizando un par de
iniciadores que amplifican selectivamente el sitio de inserción
esperado. Para amplificar el sitio de inserción I4L se utilizaron el
par de iniciadores BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID NO.: 1)
y BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID NO.: 2). En el caso en
que se amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR
esperado tiene una longitud de 328 nucleótidos (nt), y en el caso en
que se amplifica un MVA recombinante, que tiene DNA exógeno
incorporado en el sitio de inserción I4L, el fragmento está alargado
correspondientemente.
En una primera tanda, se infectaron células con
MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron
adicionalmente con el vector de inserción pBN84 (Figura 1c) que
contenía el gen Ecogpt para selección y BFP (proteína de
fluorescencia azul) como gen informador. Los virus recombinantes
resultantes se purificaron por 7 tandas de purificación en placas
bajo selección del metabolismo de la
fosforribosil-transferasa por adición de ácido
micofenólico, xantina e hipoxantina. El ácido micofenólico (MPA)
inhibe la monofosfato-deshidrogenasa de inosina y da
como resultado el bloqueo de la síntesis de la purina y la
inhibición de la replicación vírica en la mayoría de las líneas de
células. Este bloqueo puede contrarrestarse por expresión de
Ecogpt a partir de un promotor constitutivo y proporcionando
los sustratos xantina e hipoxantina.
Los virus recombinantes resultantes se
identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de
iniciadores que amplifican selectivamente el sitio de inserción
esperado. Para amplificar el sitio de inserción I4L se utilizaron el
par de iniciadores BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID NO.: 1)
y BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID NO.: 2). En el caso en
que se amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR
esperado tiene una longitud de 328 nucleótidos (nt), y en el caso en
que se amplifica un MVA recombinante para NS1, que tiene incorporada
la región codificante del virus Dengue NS1 en el sitio de inserción
I4L, se espera que el fragmento tenga una longitud de 1683 pb. Los
resultados de la PCR en la Fig. 7 muestran claramente la inserción
estable de NS1 en el sitio de inserción I4L después de 17 tandas de
amplificación del virus.
Un matraz T25 con monocapas de células BHK
confluyentes aproximadamente en un 80% se inoculó con 100 \mul del
stock de virus diluidos en relación 1 x 10^{7} en MEM\alpha con
1% de FCS y se agitó a la temperatura ambiente durante 30 minutos.
Se añadieron a cada matraz 5 ml de MEM\alpha con 3% de FCS y se
incubaron a 30ºC en una incubadora de CO_{2}. El matraz se cosechó
después de 48 horas. Se retiró el sobrenadante del matraz y se
centrifugó a 260 g durante 10 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se
guardaron en partes alícuotas a -80ºC. El sedimento se lavó con 5 ml
de 1 x PBS 2 veces y se resuspendió luego en 1 ml de tampón de
homogeneización hipotónico con 1% de TX100. Los lisados de células
se cosecharon y se centrifugaron durante 5 minutos a 16.000 g, y los
sobrenadantes se guardaron en un tubo de microcentrífuga a
-80ºC.
Los matraces inoculados con MVA que incluía GFP,
MVA que incluía el gen de NS1 en un sitio de deleción
(MVA-BN07), y matraces falsamente infectados se
trataron también del mismo modo que se ha descrito arriba.
El lisado célula/virus y el sobrenadante se
trataron en tampón de muestra no reductor/reductor en condiciones no
calentadas/calentadas. Las proteínas se separaron en SDS PAGE al 10%
y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las transferencias
se sondaron durante una noche con sueros agrupados de pacientes
convalecientes (PPCS) a dilución 1:500. Después de lavar 3 veces con
1X PBS, las transferencias se incubaron con IgG-HRP
anti-humana (DAKO) durante 2 horas a la temperatura
ambiente. Después de lavar las transferencias como se ha descrito
arriba, se reveló el color utilizando
4-cloro-1-naftol.
Los resultados de la transferencia Western
demostraron que NS1 se expresa en grandes cantidades en
MVA-BN22. NS1 se expresaba en la configuración
correcta, como un dímero en condición no calentada y como un
monómero en condición calentada.
La expresión de NS1 se comparó en
MVA-BN22 y MVA-BN07. Las células BHK
se inocularon con la misma pfu y se cosecharon después de 48 horas.
Los resultados demostraron que la expresión de NS1 era mucho mayor
en BN22 que en BN07. Los resultados de las transferencias Western
demostraron también que hay más NS1 secretado en el sobrenadante con
el constructo BN22 en comparación con BN07.
Los resultados indicaban también que NS1
expresado en células infectadas con BN22 es antigénico y es
reconocido por los sueros agrupados de los pacientes
convalecientes.
En conclusión, NS1 se expresa en grandes
cantidades y en la configuración correcta en las células BHK
infectadas con BN22. Tanto el dímero como el monómero son
antigénicos y son reconocidos por los sueros agrupados de los
pacientes convalecientes.
Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio
de inserción (en la posición 129940 del genoma) entre el ORF 136L y
137L se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de
interés utilizando los iniciadores siguientes:
oBN543 (TCCCCGCGGAGAGGCGTAAAAGTTAAATTAGAT; SEQ ID
NO.: 3) y
oBN544 (TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAATGCGGAGGT; SEQ ID
NO.: 4) para el flanco de aislamento 1;
oBN578 (CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID
NO.: 5) y
oBN579 (CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG; SEQ ID
NO.: 6) para el flanco de aislamiento 2.
El fragmento PCR que comprendía el Flanco 1 se
trató con las enzimas de restricción SacII y XbaI y se ligó a un
vector básico digerido con SacII/XbaI y desfosforilado, tal como
pBluescript (Stratagene).
El plásmido resultante se digirió con XhoI/ApaI,
se desfosforiló y se ligó al fragmento PCR digerido con XhoI/ApaI
que comprendía el Flanco 2.
Opcionalmente, una secuencia repetitiva del
Flanco 2 que se había aislado por PCR utilizando los iniciadores
oBN545 (CGGCTGCAGGGTACCTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID NO.: 7) y oBN546
(CGGAAGCTTTA
TATGGTTTAGGATATTCTGTTTT; SEQ ID NO.:8) y que había sido digerida con HindIII/PstI, se insertó en el sitio HindIII/PstI del vector resultante. La Figura 2a) muestra el vector (pBNX51).
TATGGTTTAGGATATTCTGTTTT; SEQ ID NO.:8) y que había sido digerida con HindIII/PstI, se insertó en el sitio HindIII/PstI del vector resultante. La Figura 2a) muestra el vector (pBNX51).
Una casete informadora que comprendía un promotor
sintético, el gen NPT II (resistencia a la neomicina), la región
poli-A, IRES, el gen EGFP
(Ps-NPTII-poli
A-IRES-EGFP) se digirió con
Ec1136II/XhoI y se insertó en el sitio HindIII/XhoI del vector de
inserción, en el cual el sitio HindIII se terminó con extremos romos
con DNA-polimerasa T4 (Roche). Un mapa de
restricción de un constructo vector ilustrativo de acuerdo con este
ejemplo se expone en la Figura 2b) (pBNX67).
Para la construcción de pBN27 (Figura 2c) se
insertó PrM del virus Dengue de serotipo 4 en el sitio único PacI de
pBNX67.
El vector pBNX67 (Figura 2b) puede utilizarse
para generar un MVA recombinante. La utilización del protocolo
arriba mencionado - v.g. utilizando pBN27 (Figura 2c) para la
recombinación homóloga, da como resultado un MVA recombinante que
lleva PrM4 del virus Dengue en la región intergénica entre dos ORFs
adyacentes.
En una primera tanda, se infectaron células con
MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron
adicionalmente con el vector de inserción pBN27 (Figura 2c) que
contenía el gen NPT para selección y EGFP (proteína de
fluorescencia verde intensificada) como gen informador. Los virus
recombinantes resultantes se purificaron por cuatro tandas de
purificación en placas bajo selección con G418.
Los virus recombinantes resultantes se
identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de
iniciadores que amplificaba selectivamente el sitio de inserción
esperado. Para amplificar el sitio de inserción
IGR136-137 se utilizaron el par de iniciadores BN900
(cgttcgcatgggttacctcc, SEQ ID NO.: 9) y BN901 (gacgcatgaaggctgaac ,
SEQ ID NO.: 10). En el caso en que se amplifica el DNA del virus
vector vacío MVA, el fragmento PCR esperado tiene una longitud de 88
nucleótidos (nt), y en el caso en que se amplifica un MVA
recombinante para PrM4, que tiene incorporada la región codificante
de PrM4 del virus Dengue en el sitio de inserción
IGR136-137, se espera que el fragmento tenga una
longitud de 880 pb. Los resultados de la PCR en la Fig. 8a) muestran
claramente la inserción estable de PrM4 en el sitio de inserción
IGR136-137 después de 22 tandas de amplificación del
virus. El MVA recombinante exhibe todavía las mismas características
de crecimiento que MVA-BN. El mismo se replica en
fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y crece atenuado en
células de mamífero (Fig. 8b).
Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio
de inserción (en la posición 12800 del genoma) entre el ORF 007R y
008L se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de
interés utilizando los iniciadores siguientes:
IGR 07/08 F1up (CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC; SEQ
ID NO.: 11) e
IGR 07/08 F1end (AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT;
SEQ ID NO.: 12) para el flanco de aislamiento 1;
IGR 07/08 F2up
(CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID NO.: 13) e
IRG 07/08 F2end (CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG; SEQ ID
NO.: 14) para el flanco de aislamiento 2.
El fragmento PCR que comprendía el Flanco 1 se
trató con las enzimas de restricción SacII y SacI y se ligó a un
vector básico digerido con SacII/SacI y desfosforilado, tal como
pBluescript (Stratagene).
El plásmido resultante se digirió con XhoI/ApaI,
se desfosforiló y se ligó al fragmento PCR digerido con XhoI/ApaI
que comprendía el Flanco 2.
Opcionalmente, una secuencia repetitiva del
Flanco 2 que se había aislado por PCR utilizando los iniciadores IGR
07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID NO.: 13) e
IGR 07/08F2 mid (TTTCTGCAGTGATATTTATCCAATACTA; SEQ ID NO.: 15) y que
se digiere con BaMHI/PstI, se insertó en el sitio BamHI/PstI del
vector resultante.
Cualquier gen informador o terapéutico que
comprenda casete, que tenga v.g. un promotor de poxvirus, un gen
marcador, una región poli-A y opcionalmente un
elemento IRES, un gen ulterior, v.g. que exprese una sustancia o
producto génico terapéuticamente activo(a), puede dotarse de
extremos romos con DNA-polimerasa T4 (Roche) después
de una digestión de restricción e insertarse en un sitio de
clonación adecuado del vector de plásmido. Un mapa de restricción de
un constructo vector ilustrativo de acuerdo con este ejemplo se
describe en la Figura 3a) (pBNX79). La inserción de la casete de
selección NPT/EGFP dio como resultado el vector pBNX86 (Fig. 3b) y
la inserción de la casete de selección gpt/BFP el vector pBNX88
(Fig. 3c), respectivamente. Considerando una unidad de expresión
para un gen terapéutico, que comprende un gen terapéutico y un
promotor enlazado operativamente, esta unidad de expresión se
inserta en el sitio PacI. Para la construcción de pBN34 (Fig. 3d),
se clonó el PrM2 del virus Dengue se clonó en pBNX88 (Fig. 3c) y
para la síntesis de pBN56 (Fig. 3e) la región codificante env de HIV
con PacI en pBNX86 (Fig. 3b).
Los vectores pBNX86 (Fig. 3b) y pBNX88 (Fig. 3c),
respectivamente, pueden utilizarse para generar un MVA recombinante
utilizando el protocolo arriba mencionado. La utilización de pBN34
(Fig. 3d) para la recombinación homóloga da como resultado un MVA
recombinante que lleva el PrM2 del virus Dengue en la región
intergénica entre dos ORFs adyacentes. La recombinación de pBN56
(Figura 3e) con el genoma de MVA-BN da como
resultado un MVA recombinante, que contiene el gen env de HIV en la
IGR correspondiente.
En una primera tanda, se infectaron células con
MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron
adicionalmente con el vector de inserción pBN34 (Fig. 3d) que
contenía el gen gpt para selección y BFP como gen informador. Los
virus recombinantes resultantes se purificaron por 3 tandas de
purificación en placas bajo selección por ácido micofenólico como se
describe en el Ejemplo 1.
Los virus recombinantes resultantes se
identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de
iniciadores que amplificaban selectivamente el sitio de inserción
esperado. Para amplificar el sitio de inserción
IGR07-08, se utilizaron el par de iniciadores BN902
(ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO.: 16) y BN903
(gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO.: 17). En el caso en que se
amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR
esperado tiene una longitud de 190 nucleótidos (nt), y en el caso en
que amplifica un MVA recombinante para PrM2, que tiene incorporada
la región codificante de PrM2 del virus Dengue en el sitio de
inserción IGR07-08, se espera que el fragmento tenga
una longitud de 950 pb. Los resultados de la PCR en Fig. 9a)
muestran claramente la inserción estable de PrM2 en el sitio de
inserción IGR07-08 después de 20 tandas de
amplificación del virus. El MVA recombinante exhibe todavía las
mismas características de crecimiento que MVA-BN. El
virus se replica en fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y
crece atenuado en células de mamífero (Fig. 9b).
En una primera tanda, se infectaron células con
MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron
adicionalmente con el vector de inserción pBN56 (Fig. 3e) que
contenía el gen NPT para selección y EGFP como gen informador. Los
virus recombinantes resultantes se purificaron por 6 tandas de
purificación en placas bajo la selección con G418.
Los virus recombinantes resultantes se
identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de
iniciadores que amplificaba selectivamente el sitio de inserción
esperado. Para amplificar el sitio de inserción
IR07-08, se utilizaron el par de iniciadores BN902
(ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO.: 16) y BN903
(gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO.: 17). En el caso en que se
amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR
esperado tiene una longitud de 190 nucleótidos (nt), y en el caso en
que se amplifica un MVA recombinante para env, que tiene incorporada
en el sitio de inserción IGR07-08 la región
codificante env de HIV, se espera que el fragmento tenga una
longitud de 2,6 kb. Los resultados de la PCR en Fig. 10 muestran
claramente la inserción estable de env en el sitio de inserción
IGR07-08 después de 20 tandas de amplificación del
virus.
Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio
de inserción (en la posición 37330 del genoma) entre el ORF 044L y
045L se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de
interés utilizando los iniciadores siguientes:
IGR44/45F1up (CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA; SEQ
ID NO.: 18) y
IGR44/45F1end (AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG; SEQ
ID NO.: 19) para el flanco de aislamiento 1
IGR44/45F2up
(CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT; SEQ ID NO.: 20) y
IGR44/45F2end (CAGGGCCCTAAATGCGCTTCTCAAG; SEQ ID
NO.: 21) para el flanco de aislamento 2.
El fragmento PCR que comprendía el Flanco 1 se
trató con las enzimas de restricción SacII y SacI y se ligó a un
vector básico digerido con SacII/SacI y desfosforilado, tal como
pBluescript (Stratagene).
El plásmido resultante se digirió con XhoI/ApaI,
se desfosforiló y se ligó al fragmento PCR digerido con XhoI/ApaI
que comprendía el Flanco 2.
Opcionalmente, una secuencia repetitiva del
Flanco 2, que se había aislado por PCR utilizando los iniciadores
IGR44/45F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT, SEQ ID NO.: 20)
e IGR44/45F2mid (TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTATTAACG, SEQ ID NO.: 22) y
que se digirió con BamHI/PstI, se insertó en el sitio BamHI/PstI del
vector resultante.
Cualquier gen informador o terapéutico que
comprenda casete, que tenga v.g. un promotor de poxvirus, un gen
marcador, una región poli-A y opcionalmente un
elemento IRES, un gen ulterior, v.g., que exprese una sustancia o
producto génico terapéuticamente activo(a), puede dotarse de
extremos romos con DNA-polimerasa T4 (Roche) después
de una digestión de restricción e insertarse en un sitio de
clonación adecuado del vector de plásmido. Considerando una casete
de gen informador, se prefiere como sitio de clonación el sitio de
las enzimas de restricción PstI, EcoRI, EcoRV, HindIII, AvaI o XhoI
entre el Flanco 2 y la repetición del Flanco 2. Para la
construcción de pBNX87 (Fig. 4b) se insertó la casete de selección
NPT/EGFP en pBNX80 (Fig. 4a). Considerando una unidad de expresión
para un gen terapéutico que comprende un gen terapéutico y un
promotor enlazado operativamente, esta unidad de expresión se
inserta en el sitio PacI.
Un mapa de restricción de constructos vectores
ilustrativos de acuerdo con este ejemplo se expone en la Figura 4a)
y b) (pBNX80, pBNX87).
El vector puede utilizarse para generar un MVA
recombinante -siguiendo el protocolo arriba mencionado- que lleva
una secuencia exógena en la región intergénica entre dos ORFs
adyacentes. Para la construcción de pBN47 (Fig. 4c) el PrM del
serotipo 3 del virus Dengue se clonó en pBNX87 (Fig. 4b).
En una primera tanda, se infectaron células con
MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron
adicionalmente con el vector de inserción pBN47 (Fig. 4c) que
contenía el gen NPT para selección y EGFP como gen informador. Los
virus recombinantes resultantes se purificaron por 3 tandas de
purificación en placas bajo selección con G418.
Los virus recombinantes resultantes se
identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de
iniciadores que amplificaban selectivamente el sitio de inserción
esperado. Para amplificar el sitio de inserción
IGR44-45, se utilizaron el par de iniciadores BN904
(cgttagacaacacaccgacgatgg, SEQ ID NO.: 23) y BN905
(cggatgaaaaatttttggaag, SEQ ID NO.: 24). En el caso en que se
amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR
esperado tiene una longitud de 185 nucleótidos (nt), y en el caso
en que se amplifica un MVA recombinante para PrM3, que tiene
incorporada la región codificante del virus Dengue PrM3 en el sitio
de inserción IGR44-45, se espera que el fragmento
tenga una longitud de 850 pb. Los resultados de la PCR en Fig. 11a)
muestran claramente la inserción estable de PrM3 en el sitio de
inserción de IGR44-45 después de 19 tandas de
amplificación del virus. El MVA recombinante exhibe todavía las
mismas características de crecimiento que MVA-BN. El
virus se replica en fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y
crece de modo atenuado en células de mamífero (Fig. 11b).
Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio
de inserción (en la posición 137496 del genoma) entre el ORF 148R y
149L se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de
interés utilizando los iniciadores siguientes:
IGR148/149F1up (TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG;
SEQ ID NO.:25) y
IGR148/149F1end
(CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC; SEQ ID NO.: 26) para el flanco
de aislamiento 1;
IGR148/149F2up
(CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID NO.: 27) y
IGR148/1492end (TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG; SEQ
ID NO.: 28) para el flanco de aislamiento 2.
El fragmento PCR que comprendía el Flanco 1 se
trató con las enzimas de restricción SacII y XbaI y se ligó a un
vector básico digerido con SacII/XbaI digerido y desfosforilado, tal
como pBluescript (Stratagene).
El plásmido resultante se digirió con
HindIII/ApaI, se desfosforiló y se ligó al fragmento PCR digerido
con HindIII/ApaI que comprendía el Flanco 2.
Opcionalmente, una secuencia repetitiva del
Flanco 2, que se había aislado por PCR utilizando los iniciadores
IGR148/149F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID NO.:
27) e IGR148/
149F2mid (TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC; SEQ ID NO.: 29) y que se digirió con BamHI/PstI, se insertó en el sitio BamHI/PstI del vector resultante.
149F2mid (TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC; SEQ ID NO.: 29) y que se digirió con BamHI/PstI, se insertó en el sitio BamHI/PstI del vector resultante.
Cualquier gen informador o terapéutico que
comprenda casete, que tenga v.g. un promotor poxvírico, un gen
marcador, una región poli-A y opcionalmente un
elemento IRES, un gen ulterior, v.g. que exprese una sustancia o
producto génico terapéuticamente activo(a), puede dotarse de
extremos romos con DNA-polimerasa T4 (Roche) después
de una digestión de restricción e insertarse en un sitio de
clonación adecuado del vector de plásmido. Para construcción de
pBNX92 (Fig. 5b) se insertó en este sitio de clonación la casete de
expresión gpt/BFP. Considerando una casete de gen informador, se
prefiere como sitio de clonación el sitio de las enzimas de
restricción PstI, EcoRI, EcoRV y HindIII entre el Flanco 2 y la
repetición del Flanco 2. Considerando una unidad de expresión para
un gen terapéutico, que comprende un gen terapéutico y un promotor
enlazado operativamente, esta unidad de expresión se inserta en el
sitio PacI. Para construcción de pBN54 (Fig. 5c) se insertó en este
sitio PacI el PrM1 del virus Dengue.
Un mapa de restricción de un constructo vector
ilustrativo de acuerdo con este ejemplo se describe en la Figura 5a)
y b) (pBNX90, pBNX92).
El vector puede utilizarse para generar un MVA
recombinante -siguiendo el protocolo arriba mencionado- que lleva
una secuencia exógena en la región intergénica entre dos ORFs
adyacentes. Para la generación de un MVA recombinante que exprese el
PrM1 del virus Dengue (Fig. 5c) se utilizó pBN54 para una
recombinación homóloga.
En una primera tanda, se infectaron células con
MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron
adicionalmente con el vector de inserción pBN54 (Fig. 5c) que
contiene el gen gpt para selección y BFP como gen informador. Los
virus recombinantes resultantes se purificaron por tres tandas de
purificación en placas bajo selección con ácido micofenólico.
Los virus recombinantes resultantes se
identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de
iniciadores que amplificaban selectivamente el sitio de inserción
esperado. Para amplificar el sitio de inserción
IGR148-149, se utilizaron el par de iniciadores
pBN960 (ctgtataggtatgtcctctgcc, SEQ ID NO.: 30) y BN961
(gctagtagacgtggaaga, SEQ ID NO.: 31). En el caso en que se amplifica
el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR esperado tiene
una longitud de 450 nucleótidos (nt), y en el caso en que se
amplifica un MVA recombinante para PrM1, que tiene incorporada la
región codificante del virus Dengue PrM1 en el sitio de inserción
IGR148-149, se espera que el fragmento tenga una
longitud de 1200 pb. Los resultados de la PCR en Fig. 12a) muestran
claramente la inserción estable de PrM1 en el sitio de inserción
IGR148-149 después de 23 tandas de amplificación del
virus. El MVA recombinante exhibe todavía las mismas características
de crecimiento que MVA-BN. Se replica en
fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y se desarrolla
atenuadamente en células de mamíferos (Fig. 12b).
<110> Bavarian Nordic A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Regiones Intergénicas como Nuevos
Sitios de Inserción en el Genoma del Virus Vaccinia Ankara
Modificado (MVA)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BN45PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DK PA 2002 00752
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-05-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaactctctt cttgattacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatcaaagt caatctatg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccccgcgga gaggcgtaaa agttaaatta gat
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatctagaa tcgctcgtaa aaactgcgga ggt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctcgagt tcacgttcag ccttcatgc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggggccct attttgtata atatctggta ag
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggctgcagg gtaccttcac gttcagcctt catgc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaagcttt atatggttta ggatattctg tttt
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgttcgcatg ggttacctcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgcatgaa ggctgaac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgagctca ataaaaaaaa gttttac
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggccgcgga tgcatgttat gcaaaatat
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctcgagc gcggatccca atatatggca tagaac
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagggccctc tcatcgcttt catg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttctgcagt gatatttatc caatacta
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggataaat acgaggacgt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacaattatc cgacgcaccg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgagctca tttcttagct agagtgata
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggccgcgga gtgaaagcta gagaggg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctcgagc gcggatccta aactgtatcg attatt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagggcccct aaatgcgctt ctcaat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttctgcagc cttcctgggt ttgtattaac g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgttagacaa cacaccgacg atgg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggatgaaaa atttttggaa g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccccgcggg gactcataga ttatcgacg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtctaga ctagtctatt aatccacaga aatac
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagcttg ggcgggatcc cgtttctagt atggggatc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagggcccgt tattgccatg atagag
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttctgcagt gtataatacc acgagc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtataggt atgtcctctg cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagtagac gtggaaga
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 64L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(526)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> IGR 64-65
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (527)..(608)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 65L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (609)..(1190)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF 135R
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(96)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ORF C 136L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (101)..(298)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> IGR 136-137
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (299)..(883)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 137L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (884)..(1198)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF 07R
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(338)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> IGR 07-08
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (339)..(852)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 08L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (853)..(1200)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<213> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 44L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(375)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 1GR 44-45
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (376)..(647)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 45L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (648)..(1200)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF 148R
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (596)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> IGR 148-149
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (597)..(855)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 149L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (856)..(1200)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF 018L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(399)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> IGR 018L-019L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (400)..(607)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 019L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (608)..(1081)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> non-coding region
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1082)..(1200)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> "primer": iniciador (todas las
veces)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> "Fragment of": Fragmento de
(todas las veces)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> "vaccinia virus": virus vaccinia
(todas las veces)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> "non-coding
region": región no codificante
Claims (46)
1. Un Virus Vaccinia Ankara Modificado
(MVA), que comprende una secuencia heteróloga exógena de DNA
insertada en una región intergénica (IGR) del genoma vírico.
2. El MVA de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual la secuencia heteróloga exógena de DNA está insertada en una
IGR entre dos marcos abiertos de lectura (ORFs) adyacentes
seleccionados del grupo que comprende: 007R-008L,
018L-019L, 044L-045L,
064L-065L, 136L-137L y
148R-149L.
3. El MVA de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
en el cual la secuencia heteróloga exógena de DNA comprende al menos
una secuencia codificante, preferiblemente bajo el control de
transcripción de un elemento de control de la transcripción
poxvírico.
4. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a
3, en el cual la secuencia heteróloga exógena de DNA codifica
uno(a) o más proteínas, polipéptidos, péptidos, antígenos
extraños o epítopes antigénicos.
5. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a
4, en el cual la secuencia heteróloga exógena de DNA se deriva del
virus Dengue, el virus de la Encefalitis Japonesa, el virus de la
Hepatitis B, el virus de la Hepatitis C y/o virus de
inmunodeficiencia, preferiblemente virus de la Inmunodeficiencia
Humana (HIV).
6. El MVA de acuerdo con la reivindicación 5, en
el cual la secuencia heteróloga exógena del DNA derivada del virus
Dengue se selecciona del grupo que comprende NS1 y PrM.
7. El MVA de acuerdo con la reivindicación 6, en
el cual el gen NS1 se inserta en la IGR entre los ORFs 064L-
065L.
8. El MVA de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7,
en el cual el gen PrM se deriva de uno o más de los cuatro serotipos
del virus Dengue.
9. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 6 a
8, en el cual el gen PrM está insertado en la IGR entre los ORFs
seleccionados del grupo que comprende 007R-008L,
044L-045L, 136L-137L, y
148R-149L.
10. El MVA de acuerdo con la reivindicación 5, en
el cual la secuencia de DNA heteróloga exógena derivada del virus de
inmunodeficiencia codifica env de HIV.
11. El MVA de acuerdo con la reivindicación 10,
en el cual el gen env de HIV se inserta en la IGR entre los ORFs
007R-008L.
12.- El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 11, que es el MVA depositado en el ECACC bajo el número de
depósito V00083008.
13. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 12 para uso como medicamento y/o vacuna.
14. Uso del MVA de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de un medicamento y/o
vacuna para el tratamiento y/o la profilaxis de una infección vírica
y/o una enfermedad proliferante.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14,
en el cual dicha infección vírica es una infección por el virus
Dengue o infección por virus de inmunodeficiencia, preferiblemente
infección por HIV.
16. Una vacuna que comprende el MVA de acuerdo
con las reivindicaciones 1 a 13.
17. Una composición farmacéutica que comprende el
MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13 y un vehículo,
diluyente, adyuvante y/o aditivo farmacéuticamente aceptable.
18. Un método para producir un(a)
proteína, polipéptido, péptido, antígeno o epítope in vitro
que comprendelos pasos de:
- -
- infección de una célula hospedadora con el MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13,
- -
- cultivo de la célula hospedadora infectada en condiciones adecuadas,
- -
- aislamiento y/o enriquecimiento del polipéptido, la proteína, el péptido, el antígeno, el epítope y/o el virus producido por dicha célula hospedadora.
19. Un método para introducir una secuencia de
DNA en una célula in vitro o ex vivo, siendo dicha
secuencia de DNA homóloga y/o heteróloga al genoma de dicha célula,
en el cual la célula se infecta con el MVA de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 13.
20. Una célula in vitro o ex vivo
que comprende el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
21.- Un vector de plásmido que comprende
- -
- una secuencia de DNA seleccionada del grupo que comprende:
- a)
- una secuencia de DNA que comprende una secuencia de IGR localizada entre dos ORFs adyacentes del genoma vírico de un MVA, y/o
- b)
- una secuencia de DNA que comprende secuencias de IGR flanqueantes de dos ORFs adyacentes del genoma vírico de un MVA;
- c)
- una secuencia de DNA que es homóloga a la secuencia de DNA a) y/o b), en la cual dicha secuencia homóloga dirige la inserción de una secuencia de DNA que es heteróloga al genoma del virus MVA ("secuencia heteróloga") por recombinación homóloga a la IGR del genoma vírico;
- -
- una secuencia heteróloga y,
- -
- opcionalmente, una casete de gen informador y/o de selección.
22. El vector de plásmido de acuerdo con la
reivindicación 21, en el cual la secuencia de IGR se deriva de una
IGR entre los ORFs seleccionados del grupo que comprende:
007R-008L, 018L-019L,
044L-045L, 064L-065L,
136L-137L y 148R-149L.
23. El vector de plásmido de acuerdo con la
reivindicación 21 ó 22, en el cual la secuencia derivada de IGR
comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende las
secuencias de nucleótidos
- no. 527-608 de SeqID No.
32;
- no. 299-883 de SeqID No.
33;
- no. 339-852 de SeqID No.
34;
- no. 376-647 de SeqID No.
35;
- no. 597-855 de SeqID No.
36;
- no. 400-607 de SeqID No.
37.
24. El vector de plásmido de acuerdo con las
reivindicaciones 21 a 23, en el cual las secuencias de IGR
flanqueantes de los dos ORFs adyacentes se seleccionan del grupo que
comprende: 007R-008L, 018L-019L,
044L-045L, 064L-065L,
136L-137L y 148R-149L.
25. El vector de plásmido de acuerdo con las
reivindicaciones 21 a 24, en el cual las secuencias de IGR
flanqueantes de los dos ORFs adyacentes comprenden una secuencia
seleccionada del grupo que comprende las secuencias de
nucleótidos
- no. 1-526 y
609-1190 de SeqID No. 32;
- no. 101-298 y
884-1198 de SeqID No. 33;
- no. 1-338 y
853-1200 de SeqID No. 34;
- no. 1-375 y
648-1200 de SeqID No. 35;
- no. 1-596 y
856-1200 de SeqID No. 36;
- no. 1-399 y
608-1081 de SeqID No. 37.
26. El vector de plásmido de acuerdo con las
reivindicaciones 21 a 25, en el cual dicho virus MVA es el MVA
depositado en ECACC bajo el número de depósito V00083008.
27. Un método para producir el MVA de acuerdo con
las reivindicaciones 1 a 13 in vitro, que comprende los pasos
de
- -
- transfectar una célula con un vector de plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 26;
- -
- infectar la célula transfectada con un MVA;
- -
- identificar, aislar y, opcionalmente, purificar el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
28. El método de acuerdo con la reivindicación
27, en el cual la célula se infecta con el MVA depositado en ECACC
bajo el número de depósito V00083008.
29. Un DNA que comprende
- -
- una secuencia de DNA seleccionada del grupo que comprende:
- a)
- una secuencia de DNA que comprende una secuencia de IGR localizada entre dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA, y/o
- b)
- una secuencia de DNA que comprende secuencias de IGR flanqueantes de dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA;
- c)
- una secuencia de DNA que es homóloga a la secuencia de DNA a) y/o b), en la cual dicha secuencia homóloga dirige la inserción de una secuencia de DNA que es heteróloga al genoma del virus MVA ("secuencia heteróloga") por recombinación homóloga a la IGR del genoma vírico;
- -
- una secuencia heteróloga.
30. La secuencia de DNA de acuerdo con la
reivindicación 29, en la cual la secuencia de IGR se deriva de una
IGR entre los ORFs seleccionados del grupo que comprende:
007R-008L, 018L-019L,
044L-045L, 064L-065L,
136L-137L y 148R-149L.
31. La secuencia de DNA de acuerdo con la
reivindicación 29 ó 30, en la cual la secuencia derivada de IGR
comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende las
secuencias de nucleótidos
- no. 527-608 de SeqID No.
32;
- no. 299-883 de SeqID No.
33;
- no. 339-852 de SeqID No.
34;
- no. 376-647 de SeqID No.
35;
- no. 597-855 de SeqID No.
36;
- no. 400-607 de SeqID No.
37.
32. La secuencia de DNA de acuerdo con las
reivindicaciones 29 a 31, en la cual las secuencias de IGR
flanqueantes de los dos ORFs adyacentes se seleccionan del grupo que
comprende: 007R-008L, 018L-019L,
044L-045L, 064L-065L,
136L-137L y 148R-149L.
33. La secuencia de DNA de acuerdo con las
reivindicaciones 29 a 32, en la cual las secuencias de IGR
flanqueantes de los dos ORFs adyacentes comprenden una secuencia
seleccionada del grupo que comprende las secuencias de
nucleótidos
- no. 1-526 y
609-1190 de SeqID No. 32;
- no. 101-298 y
884-1198 de SeqID No. 33;
- no. 1-338 y
853-1200 de SeqID No. 34;
- no. 1-375 y
648-1200 de SeqID No. 35;
- no. 1-596 y
856-1200 de SeqID No. 36;
- no. 1-399 y
608-1081 de SeqID No. 37.
34. La secuencia de DNA de acuerdo con las
reivindicaciones 29 a 33, en la cual dicho virus MVA es el MVA
depositado en ECACC bajo el número de depósito V00083008.
35. Uso de un vector de plásmido que
comprende
- -
- una secuencia de DNA seleccionada del grupo que comprende:
\newpage
- a)
- una secuencia de DNA que comprende una secuencia de IGR localizada entre dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA, y/o
- b)
- una secuencia de DNA que comprende secuencias de IGR flanqueantes de dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA;
- c)
- una secuencia de DNA que es homóloga a la secuencia de DNA a) y/o b), en la cual dicha secuencia homóloga dirige la inserción de una secuencia de DNA que es heteróloga al genoma del virus MVA ("secuencia heteróloga") por recombinación homóloga a la IGR del genoma vírico; e
- -
- insertado en dicha secuencia de IGR un sitio de clonación para la inserción de dicha secuencia heteróloga, y
- -
- opcionalmente, una casete de gen informador y/o de selección
para generar y/o producir un MVA recombinante de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
36. El uso de acuerdo con la reivindicación 35,
en el cual la secuencia de IGR se deriva de una IGR entre los ORFs
seleccionados del grupo que comprende: 007R-008L,
018L-019L, 044L-045L,
064L-065L, 136L-137L y
148R-149L.
37. El uso de acuerdo con la reivindicación 35 ó
36, en el cual la secuencia derivada de IGR comprende una secuencia
seleccionada del grupo que comprende las secuencias de
nucleótidos
- no. 527-608 de SeqID No.
32;
- no. 299-883 de SeqID No.
33;
- no. 339-852 de SeqID No.
34;
- no. 376-647 de SeqID No.
35;
- no. 597-855 de SeqID No.
36;
- no. 400-607 de SeqID No.
37.
38. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 35
a 37, en el cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs
adyacentes se seleccionan del grupo que comprende:
007R-008L, 018L-019L,
044L-045L, 064L-065L,
136L-137L y 148R-149L.
39. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 35
a 38, en el cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs
adyacentes comprenden una secuencia seleccionada del grupo que
comprende las secuencias de nucleótidos
- no. 1-526 y
609-1190 de SeqID No. 32;
- no. 101-298 y
884-1198 de SeqID No. 33;
- no. 1-338 y
853-1200 de SeqID No. 34;
- no. 1-375 y
648-1200 de SeqID No. 35;
- no. 1-596 y
856-1200 de SeqID No. 36;
- no. 1-399 y
608-1081 de SeqID No. 37.
40. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 35
a 39, en el cual dicho virus MVA es el MVA depositado en ECACC bajo
el número de depósito V00083008.
41. Uso de un DNA que comprende una secuencia de
DNA seleccionada del grupo que comprende:
- a)
- una secuencia de DNA que comprende una secuencia de IGR localizada entre dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA, y/o
- b)
- una secuencia de DNA que comprende secuencias de IGR flanqueantes de dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA;
- c)
- una secuencia de DNA que es homóloga a la secuencia de DNA a) y/o b), en la cual dicha secuencia homóloga dirige la inserción de una secuencia de DNA que es heteróloga al genoma del virus MVA ("secuencia heteróloga") por recombinación homóloga a la IGR del genoma vírico;
para generar y/o producir un vector de plásmido
de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 26 y/o
para generar y/o producir un MVA recombinante de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
42. El uso de cuerdo con la reivindicación 41, en
el cual la secuencia de IGR se deriva de una IGR entre los ORFs
seleccionados del grupo que comprende: 007R-008L,
018L-019L, 044L-045L,
064L-065L, 136L-137L y
148R-149L.
43. El uso de acuerdo con la reivindicación 41 ó
42, en el cual la secuencia derivada de IGR comprende una secuencia
seleccionada del grupo que comprende las secuencias de
nucleótidos
- no. 527-608 de SeqID No.
32;
- no. 299-883 de SeqID No.
33;
- no. 339-852 de SeqID No.
34;
- no. 376-647 de SeqID No.
35;
- no. 597-855 de SeqID No.
36;
- no. 400-607 de SeqID No.
37.
44. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 41
a 43, en el cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs
adyacentes se seleccionan del grupo que comprende:
007R-008L, 018L-019L,
044L-045L, 064L-065L,
136L-137L y 148R-149L.
45. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 41
a 44, en el cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs
adyacentes comprenden una secuencia seleccionada del grupo que
comprende las secuencias de nucleótidos
- no. 1-526 y
609-1190 de SeqID No. 32;
- no. 101-298 y
884-1198 de SeqID No. 33;
- no. 1-338 y
853-1200 de SeqID No. 34;
- no. 1-375 y
648-1200 de SeqID No. 35;
- no. 1-596 y
856-1200 de SeqID No. 36;
- no. 1-399 y
608-1081 de SeqID No. 37.
46. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 41
a 45, en el cual dicho virus MVA es el MVA depositado en ECACC bajo
el número de depósito V00083008.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200200753 | 2002-05-16 | ||
| DK200200753 | 2002-05-16 | ||
| DKPA200200752 | 2002-05-16 | ||
| DK200200752 | 2002-05-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2256776T3 true ES2256776T3 (es) | 2006-07-16 |
Family
ID=29551228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03752741T Expired - Lifetime ES2256776T3 (es) | 2002-05-16 | 2003-05-14 | Regiones intergenicas como sitios de insercion en el genoma del virus vaccinia ankara modificado (mva). |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (14) | US7338662B2 (es) |
| EP (3) | EP2253709B1 (es) |
| JP (4) | JP4693092B2 (es) |
| KR (4) | KR101041691B1 (es) |
| CN (6) | CN101831411A (es) |
| AT (1) | ATE315660T1 (es) |
| AU (4) | AU2003242540A1 (es) |
| BR (2) | BR0310051A (es) |
| CA (3) | CA2812019A1 (es) |
| DE (1) | DE60303218T2 (es) |
| DK (2) | DK1407033T3 (es) |
| EA (3) | EA007811B1 (es) |
| ES (1) | ES2256776T3 (es) |
| IL (4) | IL164177A0 (es) |
| MX (2) | MXPA04011194A (es) |
| NO (3) | NO334273B1 (es) |
| NZ (2) | NZ536502A (es) |
| PL (2) | PL218318B1 (es) |
| PT (1) | PT1407033E (es) |
| SI (1) | SI1407033T1 (es) |
| UA (1) | UA82479C2 (es) |
| WO (2) | WO2003097845A1 (es) |
Families Citing this family (75)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4101327C1 (es) * | 1991-01-18 | 1991-10-24 | Mercedes-Benz Aktiengesellschaft, 7000 Stuttgart, De | |
| UA76731C2 (uk) * | 2000-11-23 | 2006-09-15 | Баваріан Нордік А/С | Штам mva-bn модифікованого вірусу коров'ячої віспи ankara, фармацевтична композиція, вакцина, застосування mva-bn для приготування лікарського препарату та для приготування вакцини, спосіб введення гомологічної і/або гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в клітини-мішені in vitro, спосіб одержання пептиду або білка, спосіб одержання mva-bn, клітина, набір для основної/бустерної імунізації |
| CN100540051C (zh) * | 2002-04-19 | 2009-09-16 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 用于接种新生儿的改良的安卡拉痘苗病毒 |
| ATE315660T1 (de) | 2002-05-16 | 2006-02-15 | Bavarian Nordic As | Intergene regionen als insertionsstellen im genom von modifiziertem vaccinia virus ankara (mva) |
| US7501127B2 (en) | 2002-05-16 | 2009-03-10 | Bavarian Nordic A/S | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara |
| ES2305514T5 (es) * | 2002-09-05 | 2019-06-14 | Bavarian Nordic As | Método para la amplificación de un poxvirus en condiciones exentas de suero |
| EP2363493B1 (en) * | 2003-02-20 | 2012-11-14 | The Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Novel insertion sites in pox vectors |
| GB2402391A (en) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | Oxxon Pharmaccines Ltd | Fowlpox recombinant genome |
| WO2006052826A2 (en) * | 2004-11-05 | 2006-05-18 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary | Methods for preparing cells and viruses |
| UA100836C2 (ru) | 2005-02-23 | 2013-02-11 | Бавариан Нордик А/С | Применение модифицированного вируса осповакцины анкара (mva) для быстрой индукции иммунитета против поксвирусных или других инфекционных агентов |
| CA2651456A1 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Glycofi, Inc. | Recombinant vectors |
| DK2062023T4 (en) * | 2006-08-25 | 2017-02-20 | The Government Of The Us Secretary Dept Of Health And Human Services | INTERGENIC SITES BETWEEN CONSERVATED GENES THROUGH MODIFIED VACCINIA ANKARA (VAT) VACCINIAVIRUS |
| EP2097517B1 (en) * | 2006-10-16 | 2014-06-04 | Genelux Corporation | Recombinant Lister strain vaccinia virus encoding an anti-VEGF single chain antibody |
| US8440202B2 (en) * | 2006-11-09 | 2013-05-14 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Induction of an immune response against dengue virus using the prime-boost approach |
| ES2517615T3 (es) * | 2006-11-09 | 2014-11-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Inducción de una respuesta inmunitaria frente al virus del dengue usando un enfoque de sensibilización-refuerzo |
| CL2008000249A1 (es) * | 2007-01-30 | 2008-05-30 | Transgene Sa | Uso de una molecula de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido e2 del papilomavirus, un vector o una particula virica infecciosa que la comprenda para tratar una infeccion permanente por papilomavirus causada por al menos un papilomavirus |
| US8268327B2 (en) | 2007-04-27 | 2012-09-18 | Bavarian Nordic A/S | Immediate protection against pathogens via MVA |
| RU2462513C2 (ru) * | 2007-05-15 | 2012-09-27 | Трансген С.А. | Векторы для множественной генной экспрессии |
| US20080299149A1 (en) * | 2007-05-30 | 2008-12-04 | Wyeth | Raccoon Poxvirus Expressing Genes of Feline Antigens |
| TW200907058A (en) * | 2007-05-30 | 2009-02-16 | Wyeth Corp | Raccoon poxvirus expressing rabies glycoproteins |
| AU2008312444B2 (en) | 2007-10-18 | 2014-02-06 | Bavarian Nordic A/S | Use of MVA to treat prostate cancer |
| EP2303322A1 (en) * | 2008-06-20 | 2011-04-06 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine |
| KR100894430B1 (ko) * | 2008-11-11 | 2009-04-22 | 시스템디엔디(주) | 초음파, 음향 및 온도변화를 이용한 밸브의 유체누설 측정장치 및 이를 이용한 유체누설 측정방법 |
| DK2352834T3 (en) * | 2008-11-21 | 2017-03-13 | Bavarian Nordic As | VECTOR INCLUDING MULTIPLE HOMOLOGICAL NUCLEOTIDE SEQUENCES |
| US8580276B2 (en) | 2009-06-05 | 2013-11-12 | City Of Hope | Genetically stable recombinant modified vaccinia ankara (rMVA) vaccines and methods of preparation thereof |
| AU2010305030A1 (en) | 2009-10-08 | 2012-05-10 | Bavarian Nordic A/S | Generation of a broad T-cell response in humans against HIV |
| DK2488649T3 (da) | 2009-10-16 | 2019-06-17 | Us Health | Rekombinant modificeret vaccinia ankara (mva)-vaccinia-virus indeholdende restrukturerede insertionssteder |
| WO2011087839A1 (en) | 2009-12-22 | 2011-07-21 | Baxter International Inc. | Vaccine to influenza a virus |
| WO2011120045A1 (en) * | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | Ectodomains of influenza matrix 2 protein, expression system, and uses thereof |
| JP5945270B2 (ja) | 2010-07-20 | 2016-07-05 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | 発現産物を採取するための方法 |
| JP2013538577A (ja) * | 2010-09-23 | 2013-10-17 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | 組み換えウイルスベクターおよび黄熱病ウイルスに対する免疫反応を惹起するための方法 |
| WO2012048817A2 (en) | 2010-10-15 | 2012-04-19 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus ankara influenza vaccine |
| ES2733211T3 (es) | 2011-04-15 | 2019-11-28 | Genelux Corp | Cepas clonales de virus vaccinia atenuados y métodos de uso de las mismas |
| WO2013083254A1 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Bavarian Nordic A/S | Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c |
| EP2620446A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-07-31 | Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. | Immunogens for HIV vaccination |
| EP3530283A1 (en) | 2012-06-05 | 2019-08-28 | The Australian National University | Vaccination with interleukin-4 antagonists |
| KR102435054B1 (ko) | 2012-08-01 | 2022-08-22 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 재조합 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(ankara) (mva) 호흡기 신시티알 바이러스(rsv) 백신 |
| WO2014043535A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions for the treatment of cancer |
| US20140140959A1 (en) | 2012-10-05 | 2014-05-22 | Aladar A. Szalay | Energy Absorbing-Based Diagnostic and Therapeutic Methods Employing Nucleic Acid Molecules Encoding Chromophore-Producing Enzymes |
| EP2908851A1 (en) | 2012-10-19 | 2015-08-26 | Bavarian Nordic Inc. | Methods and compositions for the treatment of cancer |
| DE102013004595A1 (de) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Emergent Product Development Germany Gmbh | RSV-Impfstoffe |
| MY193724A (en) * | 2013-03-15 | 2022-10-27 | Sementis Ltd | Immune modulation |
| WO2014139587A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Okairòs Ag | Improved poxviral vaccines |
| US10238700B2 (en) | 2014-01-02 | 2019-03-26 | Genelux Corporation | Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity |
| KR101645642B1 (ko) | 2014-10-16 | 2016-08-11 | 대한민국 | Kvac１０３ 유래의 재조합 백시니아 바이러스 |
| KR101623498B1 (ko) | 2014-10-16 | 2016-05-24 | 대한민국 | 약독화 백시니아 바이러스주 kvac１０３ |
| CN115300622A (zh) | 2015-02-25 | 2022-11-08 | 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 | 使用灭活的修饰的痘苗病毒安卡拉作为实体肿瘤的单一免疫疗法或与免疫检查点阻断剂组合 |
| CN107847534B (zh) | 2015-04-17 | 2022-10-04 | 纪念斯隆凯特琳癌症中心 | Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用 |
| KR20160140075A (ko) * | 2015-05-29 | 2016-12-07 | 코오롱생명과학 주식회사 | 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터 |
| WO2016202828A1 (en) * | 2015-06-15 | 2016-12-22 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) foot and mouth disease virus (fmdv) vaccine |
| FR3042121A1 (fr) | 2015-10-08 | 2017-04-14 | Jean-Marc Limacher | Composition anti-tumorale |
| CN106591361A (zh) * | 2015-10-20 | 2017-04-26 | 钱文斌 | 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用 |
| WO2017120577A1 (en) | 2016-01-08 | 2017-07-13 | Geovax Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen |
| ES2921605T3 (es) * | 2016-01-29 | 2022-08-30 | Bavarian Nordic As | Vacuna contra el virus de la encefalitis equina basada en el virus de la variolovacuna modificado Ankara (VMA) recombinante |
| WO2017136419A1 (en) * | 2016-02-03 | 2017-08-10 | Geovax Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a flavivirus |
| KR20180133395A (ko) | 2016-02-25 | 2018-12-14 | 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 | 암 면역요법을 위한, 인간 flt3l 또는 gm-csf의 발현이 있거나 없으며 티미딘 키나제가 결실된 복제 가능 약독화 백시니아 바이러스 |
| IL261321B2 (en) | 2016-02-25 | 2023-12-01 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Recombinant mva or mvadele3l expressing human flt3l and use thereof as immuno-therapeutic agents against solid tumors |
| JP7053491B2 (ja) | 2016-05-02 | 2022-04-12 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | 治療用ｈｐｖワクチン組み合わせ |
| IL264893B (en) * | 2016-08-19 | 2022-08-01 | Sementis Ltd | Vaccines for viruses |
| US20200024610A1 (en) * | 2016-09-30 | 2020-01-23 | Monsanto Technology Llc | Method for selecting target sites for site-specific genome modification in plants |
| WO2018209315A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Vaccinia virus mutants useful for cancer immunotherapy |
| KR20200015759A (ko) * | 2017-06-15 | 2020-02-12 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Hiv 항원을 인코딩하는 폭스바이러스 벡터, 및 그 사용 방법 |
| US11311612B2 (en) | 2017-09-19 | 2022-04-26 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria |
| EP3790578A4 (en) | 2018-05-11 | 2022-04-06 | City of Hope | Genetically modified recombinant vaccinia ankara (rmva) vaccines of improved stability and methods of preparation thereof |
| CN112512569A (zh) * | 2018-05-11 | 2021-03-16 | 希望之城 | 表达多个巨细胞病毒(cmv)抗原的mva载体及其用途 |
| MX2021003013A (es) | 2018-09-15 | 2021-08-11 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Poxvirus recombinantes para inmunoterapia contra cáncer. |
| TWI810456B (zh) | 2019-05-22 | 2023-08-01 | 美商基利科學股份有限公司 | Tlr7調節化合物及hiv疫苗之組合 |
| CN111979204B (zh) * | 2019-05-24 | 2023-10-13 | 杭州功楚生物科技有限公司 | 携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途 |
| AU2020384323A1 (en) | 2019-11-14 | 2022-06-02 | Aelix Therapeutics, S.L. | Dosage regimens for vaccines |
| EP3842065A1 (en) * | 2019-12-23 | 2021-06-30 | Transgene | Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine |
| EP4103231A4 (en) | 2020-02-14 | 2024-03-27 | Geovax, Inc. | VACCINES AND THEIR USES TO INDUCE AN IMMUNE RESPONSE AGAINST SARS-COV2 |
| US20210299245A1 (en) * | 2020-03-31 | 2021-09-30 | Sementis Limited | Attenuated poxvirus vector based vaccine for protection against covid-19 |
| JP2024505274A (ja) | 2021-02-02 | 2024-02-05 | ゲオバックス インコーポレイテッド | ワクチン接種中のｔ細胞プライミングの強化において使用されるウイルスコンストラクト |
| IL318055A (en) | 2022-07-08 | 2025-02-01 | Viromissile Inc | ONCOLYTIC VACCINIA VIRUSES AND RECOMBINANT VIRUSES AND METHODS OF USE THEREOF |
| FR3160186A1 (fr) | 2024-03-13 | 2025-09-19 | Odimma Therapeutics | Vecteur non-viral pour transcription augmentee |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5338683A (en) * | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
| JPH0795956B2 (ja) * | 1986-09-22 | 1995-10-18 | 京都大学長 | ポックスウイルス由来発現制御領域 |
| US5093258A (en) * | 1988-08-26 | 1992-03-03 | Therion Biologics Corporation | Recombinant fowlpox virus and recombination vector |
| US5225336A (en) * | 1989-03-08 | 1993-07-06 | Health Research Incorporated | Recombinant poxvirus host range selection system |
| US5651972A (en) | 1989-04-21 | 1997-07-29 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector |
| US5514375A (en) | 1990-08-15 | 1996-05-07 | Virogenetics Corporation | Flavivirus recombinant poxvirus vaccine |
| MY109299A (en) * | 1990-08-15 | 1996-12-31 | Virogenetics Corp | Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins |
| US6893845B1 (en) * | 1990-09-28 | 2005-05-17 | Applied Molecular Evolution, Inc. | Surface expression libraries of heteromeric receptors |
| DE69233158T2 (de) * | 1991-03-07 | 2004-05-13 | Connaught Technology Corp., Greenville | Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe |
| BE1004877A3 (fr) * | 1991-05-27 | 1993-02-16 | Solvay | Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus. |
| FR2679249B1 (fr) * | 1991-07-15 | 1993-11-26 | Centre Nal Recherc Scientifique | Souches de levure avec integration stable de genes heterologues. |
| WO1993003145A1 (en) | 1991-07-26 | 1993-02-18 | Virogenetics Corporation | Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine |
| DE69229390T2 (de) * | 1991-08-26 | 1999-11-11 | Immuno Ag, Wien | Direkt molekuläre Klonierung eines modifizierten Genoms eines Chordopocken-Virus |
| DK0538496T3 (da) | 1991-08-26 | 2004-02-23 | Baxter Healthcare Sa | Rekombinant fjerkrækoppevirus med intakt FPV tk-gen |
| US5676950A (en) | 1994-10-28 | 1997-10-14 | University Of Florida | Enterically administered recombinant poxvirus vaccines |
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| EP0753581A1 (en) | 1995-07-10 | 1997-01-15 | Immuno Ag | Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines |
| DE19629828A1 (de) * | 1996-07-24 | 1998-01-29 | Bayer Ag | Carbanilide |
| MY150893A (en) * | 1996-09-24 | 2014-03-14 | Bavarian Nordic As | Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| AUPP380598A0 (en) * | 1998-05-29 | 1998-06-25 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Genetically manipulated entomopoxvirus |
| US6252871B1 (en) | 1998-07-01 | 2001-06-26 | Powerwave Technologies, Inc. | Switchable combiner/splitter |
| US20040265324A1 (en) * | 1999-03-23 | 2004-12-30 | Cardosa Mary Jane | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| JP5639736B2 (ja) * | 1999-05-28 | 2014-12-10 | ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー）Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ ＭｕｅｎｃｈｅｎＤｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ） | ポックスウイルスゲノムへの異種遺伝子の組込みのためのベクター |
| DK1263936T3 (da) * | 2000-03-14 | 2006-02-13 | Bavarian Nordic As | andret stamme af den modificerede Vacciniavirus Ankara (MVA) |
| CA2341356C (en) * | 2000-04-14 | 2011-10-11 | Transgene S.A. | Poxvirus with targeted infection specificity |
| MXPA03001680A (es) * | 2000-08-29 | 2004-11-01 | Wyeth Corp | Empaque de particulas de un replicon del virus de acido ribonucleico (arn) de hebra positiva. |
| UA76731C2 (uk) | 2000-11-23 | 2006-09-15 | Баваріан Нордік А/С | Штам mva-bn модифікованого вірусу коров'ячої віспи ankara, фармацевтична композиція, вакцина, застосування mva-bn для приготування лікарського препарату та для приготування вакцини, спосіб введення гомологічної і/або гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в клітини-мішені in vitro, спосіб одержання пептиду або білка, спосіб одержання mva-bn, клітина, набір для основної/бустерної імунізації |
| US7501127B2 (en) * | 2002-05-16 | 2009-03-10 | Bavarian Nordic A/S | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara |
| ATE315660T1 (de) | 2002-05-16 | 2006-02-15 | Bavarian Nordic As | Intergene regionen als insertionsstellen im genom von modifiziertem vaccinia virus ankara (mva) |
| CA2501168A1 (en) * | 2002-11-25 | 2004-06-10 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant poxvirus comprising at least two cowpox ati promoters |
-
2003
- 2003-05-14 AT AT03752741T patent/ATE315660T1/de active
- 2003-05-14 EA EA200401507A patent/EA007811B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 AU AU2003242540A patent/AU2003242540A1/en not_active Abandoned
- 2003-05-14 KR KR1020047018165A patent/KR101041691B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 EA EA200900180A patent/EA020230B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 MX MXPA04011194A patent/MXPA04011194A/es active IP Right Grant
- 2003-05-14 KR KR1020117031095A patent/KR20120002627A/ko not_active Withdrawn
- 2003-05-14 WO PCT/EP2003/005045 patent/WO2003097845A1/en not_active Ceased
- 2003-05-14 DE DE2003603218 patent/DE60303218T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 PL PL372088A patent/PL218318B1/pl unknown
- 2003-05-14 UA UA20041109409A patent/UA82479C2/uk unknown
- 2003-05-14 EP EP10008120.7A patent/EP2253709B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 DK DK03752741T patent/DK1407033T3/da active
- 2003-05-14 BR BR0310051A patent/BR0310051A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 CA CA 2812019 patent/CA2812019A1/en not_active Abandoned
- 2003-05-14 PT PT03752741T patent/PT1407033E/pt unknown
- 2003-05-14 US US10/510,189 patent/US7338662B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 EP EP20030752741 patent/EP1407033B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 DK DK03735384T patent/DK1506301T3/da active
- 2003-05-14 MX MXPA04010713A patent/MXPA04010713A/es active IP Right Grant
- 2003-05-14 JP JP2004506501A patent/JP4693092B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 CA CA2481521A patent/CA2481521C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 KR KR1020107021891A patent/KR101138067B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 CN CN200910208520A patent/CN101831411A/zh active Pending
- 2003-05-14 ES ES03752741T patent/ES2256776T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 CA CA2481799A patent/CA2481799C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 AU AU2003236646A patent/AU2003236646B2/en not_active Expired
- 2003-05-14 EP EP20030735384 patent/EP1506301B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 CN CN2012101926963A patent/CN102719408A/zh active Pending
- 2003-05-14 IL IL16417703A patent/IL164177A0/xx active IP Right Grant
- 2003-05-14 KR KR1020047018293A patent/KR101005630B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 SI SI200330215T patent/SI1407033T1/sl unknown
- 2003-05-14 CN CN038111063A patent/CN1653183B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 CN CNB038111225A patent/CN100494388C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 NZ NZ536502A patent/NZ536502A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 US US10/514,761 patent/US7550147B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 BR BRPI0311178A patent/BRPI0311178B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 PL PL372093A patent/PL216760B1/pl unknown
- 2003-05-14 JP JP2004506500A patent/JP4895505B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 WO PCT/EP2003/005047 patent/WO2003097846A1/en not_active Ceased
- 2003-05-14 CN CN2012101928085A patent/CN102703393A/zh active Pending
- 2003-05-14 EA EA200401506A patent/EA012160B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 CN CN2011100588236A patent/CN102199628A/zh active Pending
- 2003-05-14 IL IL16417203A patent/IL164172A0/xx unknown
- 2003-05-14 NZ NZ536501A patent/NZ536501A/en not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-11-12 NO NO20044940A patent/NO334273B1/no not_active IP Right Cessation
- 2004-12-16 NO NO20045480A patent/NO336489B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-11-15 US US11/985,510 patent/US9109233B2/en active Active
-
2008
- 2008-07-28 IL IL19308808A patent/IL193088A/en active IP Right Grant
- 2008-07-28 IL IL193087A patent/IL193087A/en active IP Right Grant
- 2008-12-09 AU AU2008255213A patent/AU2008255213B2/en not_active Expired
- 2008-12-19 US US12/339,743 patent/US20100173388A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-02-03 AU AU2009200380A patent/AU2009200380C1/en not_active Expired
- 2009-05-19 US US12/468,120 patent/US7964374B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2009-05-19 US US12/468,127 patent/US8034354B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-08-05 JP JP2010176512A patent/JP5777199B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2010-08-05 JP JP2010176511A patent/JP2011004755A/ja active Pending
- 2010-09-30 US US12/894,589 patent/US20110053260A1/en not_active Abandoned
- 2010-09-30 US US12/894,550 patent/US20110053259A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-04-15 US US13/087,649 patent/US8309326B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-15 US US13/087,715 patent/US8288125B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-15 US US13/233,329 patent/US8414900B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-16 US US13/234,230 patent/US8435543B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-29 NO NO20111324A patent/NO20111324A1/no not_active Application Discontinuation
-
2012
- 2012-02-13 US US13/371,580 patent/US20120178157A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-05-02 US US13/886,093 patent/US8741308B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2256776T3 (es) | Regiones intergenicas como sitios de insercion en el genoma del virus vaccinia ankara modificado (mva). | |
| US8029800B2 (en) | Recombinant modified vaccinia virus ankara (MVA) comprising human immunodeficiency virus (HIV) genes inserted into one or more intergenic regions (IGRs) | |
| ES2256747T3 (es) | Expresion de genes en el virus de la vacuna modificado, usando el promotor ati de la viruela de la vaca. | |
| AU2007200016B2 (en) | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of modified vaccinia virus ankara | |
| HK1076836B (en) | Intergenic regions as insertion sites in the genome of modified vaccinia virus ankara (mva) |