ES2256850T5 - Nuevo gen de la lisina descarboxilasa y procedimiento para la producción de L-lisina - Google Patents
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Abstract
LA L - LISINA SE PRODUCE CON EFICIENCIA CULTIVANDO, EN UN MEDIO LIQUIDO, UN MICROORGANISMO PERTENECIENTE AL GENERO ESCHERICHIA CON ACTIVIDAD LISINA DESCARBOXILASA REDUCIDA O SUPRIMIDA NECESARIA PARA LA DEGRADACION DE LA L - LISINA, POR EJEMPLO, UNA BACTERIA PERTENECIENTE AL GENERO ESCHERICHIA CON EXPRESION INHIBIDA DE UN NUEVO GEN QUE CODIFICA LA LISINA DESCARBOXILASA Y/O UN GEN CONOCIDO CADA, CONSIGUIENDO ASI QUE LA L - LISINA SE PRODUZCA Y ACUMULE EN UN MEDIO LIQUIDO PARA LUEGO RECOGERLA.
Description
Nuevo gen de la lisina descarboxilasa y procedimiento para la producción de L-lisina.
La presente invención se refiere a un nuevo gen de la lisina descarboxilasa de Escherichia Coli, apropiado para la descomposición de la L-lisina, un microorganismo que pertenece al género Escherichia con una expresión moderada del gen y/o otro gen de la lisina descarboxilasa conocido como gen cadA, y un procedimiento para la producción de L-lisina utilizando el microorganismo. Recientemente, aumenta activamente la demanda de L-lisina como aditivo alimentario.
La lisina descarboxilasa, que cataliza una reacción para la producción de cadaverina mediante la descarboxilación de la L-lisina, se conoce como una enzima de Escherichia Coli que descompone la L-lisina. Se ha informado ya de una secuencia nucleótida de su gen denominado cadA, y de una secuencia de aminoácidos codificada por el gen (Meng, S. y Bennett, G. N., J. Bacteriol., 174 , 2659 (1992)). Existen dos informes para la lisina descarboxilasa codificada por un gen distinto que el cadA de Escherichia Coli, que describen que se detectó una tenue actividad en una cepa mutante de Escherichia Coli (Goldemberg, S.H., J. Bacteriol., 141, 1428 (1980); Wertheimer, S.J. y Leifer, Z., Biochem. Biophys. Res. Commun., 114, 882 (1983)). Sin embargo, Goldemberg, S.H. informó respecto a esta actividad que la actividad enzimática disminuía en una cuantía de aproximadamente 30% después de un tratamiento con calor a 60ºC durante 4 minutos, mientras que Wertheimer, S.J. et al informaron de que no se había observado dicho fenómeno. De acuerdo con esto, la presencia de la segunda lisina descarboxilasa es indeterminada.
Por otra parte, la L-lisina es producida mediante procedimientos conocidos que utilizan Escherichia Coli, que incluyen un procedimiento que comprende el cultivo de una cepa mutante resistente a un análogo de la lisina o de una cepa recombinante que alberga un vector con ácido desoxirribonucleico incorporado que transporta información genética importante para la biosíntesis de la L-lisina (Patente Japonesa abierta al público nº 56-18596). Sin embargo, no existen informes en absoluto respecto a la producción de la L-lisina utilizando un microorganismo que pertenezca al género Escherichia con una expresión moderada del gen de la lisina descarboxilasa.
B. Lereverend et al., Proc. Int. Symp. Genet. Ind. Microorgan isms, 4 Meet., 1982, página 113, da a conocer un mutante de Escherichia Coli superproductor de lisina que transporta una mutación cadA que afecta a la actividad lisina-descarboxilasa, disminuyendo, por tanto, el catabolismo de la lisina.
K. Igarashi et al., J. Bacteriol., vol. 166, nº 1,. 1986, páginas 128-124, da a conocer la presencia de dos tipos de actividad lisina descarboxilasa en E. Coli. Una es la lisina descarboxilasa inducible habitual y la otra es la ornitina descarboxilasa codificada por el gen speC.
Un objetivo de la presente invención es obtener un nuevo gen de la lisina descarboxilasa de Escherichia Coli, crear un microorganismo productor de L-lisina que pertenezca al género Escherichia con una expresión moderada del gen y/o el gen cadA, y proporcionar un procedimiento para la producción de L-lisina cultivando el microorganismo que pertenezca al género Escherichia.
Los objetivos de la presente invención son resueltos por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando estos inventores crearon una cepa de Escherichia Coli en la que se destruyó el gen cadA como un conocido gen de la lisina descarboxilasa, se descubrió que la cadaverina, como producto de descomposición de la L-lisina por la lisina descarboxilasa, se producía todavía en esta cepa microbiana. Por tanto, estos inventores convinieron que en Escherichia Coli debía estar presente una nueva lisina descarboxilasa, y que podría afectar en gran manera la producción fermentativa de L-lisina, utilizando un microorganismo que perteneciera al género Escherichia. Como resultado de ensayos para obtener la clonación del gen, estos inventores alcanzaron el éxito en la obtención de un nuevo gen de la lisina descarboxilasa distinto del gen cadA. Se descubrió asimismo que la actividad de descomposición de la L-lisina disminuyó notablemente o desapareció, y la productividad de la L-lisina mejoró significativamente restringiendo la expresión de este gen, y restringiendo la expresión del gen cadA en un microorganismo de Escherichia Coli productor de L-lisina. De este modo, se concluyó la presente invención.
Concretamente, la presente invención proporciona un nuevo gen que codifica la lisina descarboxilasa que se origina de Escherichia Coli. Este gen se ha denominado gen "ldc".
En otro aspecto, la presente invención proporciona un microorganismo que pertenece al género Escherichia que produce L-lisina con una disminución o desaparición de la actividad lisina descarboxilasa en las células.
Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de L-lisina, que comprende las etapas de cultivar en un medio líquido el microorganismo que pertenece al género Escherichia que se ha descrito anteriormente, para permitir que se produzca la L-lisina y se acumule en un líquido de cultivo, pudiéndola recuperar.
El microorganismo que pertenece al género Escherichia que se ha descrito anteriormente incluye un microorganismo en el que la actividad de la lisina descarboxilasa en las células disminuye o desaparece por la expresión moderada (o restringida) del gen ldc y/o del gen cadA.
La presente invención se describirá detalladamente a continuación.
<1> Preparación del fragmento de ADN que contiene el nuevo gen de la lisina descarboxilasa
Un fragmento de ADN que contiene el nuevo gen de la lisina descarboxilasa (ldc) de la presente invención puede obtenerse de la manera siguiente, a partir de una cepa disponible de Escherichia Coli, por ejemplo, la cepa K-12 o de una cepa derivada de ella.
En primer lugar, el gen cadA, que es un gen conocido de la lisina descarboxilasa, se obtiene a partir del ADN cromosómico de la cepa W3110 que se origina de Escherichia Coli K-12 utilizando el método de la reacción en cadena de la polimerasa (al que en adelante se denominará "método PCR"). La secuencia nucleótida del gen cadA, y la secuencia de aminoácidos codificada por él, se muestran en SEC ID nº 5 y nº 6, respectivamente. Fragmentos de ADN que tienen secuencias similares al gen cadA son clonados a partir de una biblioteca de ADN cromosómico de Escherichia Coli W3110 según un procedimiento que utiliza un vector plasmídico o un vector fágico para confirmar si el nuevo gen de la lisina descarboxilasa está o no contenido en los fragmentos del ADN. La confirmación del hecho de que el gen objetivo está contenido, puede obtenerse según un procedimiento de hibridización Southern, utilizando una sonda preparada mediante el método PCR.
Del gen contenido en el fragmento de ADN, gen que se ha obtenido de esta forma, se determina su secuencia nucleótida de la siguiente manera. En primer lugar, el fragmento de ADN se une a un vector plasmídico que se replica autónomamente en células de Escherichia Coli, para preparar ADN recombinante que se introduce en células competentes de Escherichia Coli. Después de la obtención de un transformante, se cultiva en un medio líquido, recuperándose el ADN recombinante a partir de las células que proliferaron. De acuerdo con el procedimiento didesoxi (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 74 , 5463 (1977), se determina una secuencia nucleótida entera del fragmento de ADN contenido en el ADN recombinante recuperado. Se analiza la estructura del ADN para determinar las posiciones que existen del promotor, operador, secuencia SD, codón de iniciación, codón de finalización, marco abierto de lectura, etc.
El nuevo gen de la lisina descarboxilasa de la presente invención posee una secuencia de 1005-1007 ATG a 31413143 GGA de la secuencia nucleótida entera del fragmento de ADN que se muestra en SEC ID nº: 3 en el listado de secuencias. Este gen codifica la lisina descarboxilasa que posee una secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID nº: 4 en el Listado de Secuencias. Se ha descubierto que la homología entre la nueva lisina descarboxilasa y la lisina descarboxilasa codificada por el gen cadA es del 69,4%.
El gen de la presente invención puede ser aquél que codifica la lisina descarboxilasa que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID nº: 4 en el listado de secuencias, una secuencia nucleótida de la cual no está limitada a la secuencia nucleótida que se ha descrito anteriormente. La lisina descarboxilasa codificada por el gen de la presente invención puede tener sustituciones, deleciones, o inserciones de 3 aminoácidos o menos, en la secuencia de aminoácidos que se ha descrito anteriormente, sin un sustancial deterioro de la actividad de la lisina descarboxilasa. Los genes que codifican la lisina descarboxilasa que presenta dichas deleciones, inserciones o sustituciones, pueden obtenerse a partir de variantes, cepas mutantes espontáneas, o cepas mutantes artificiales de Escherichia Coli, o de microorganismos que pertenecen al género Escherichia distinto a Escherichia Coli. Los genes mutantes que codifican la lisina descarboxilasa que presenta deleciones, inserciones o sustituciones, pueden obtenerse asimismo llevando a cabo un tratamiento mutacional in vitro , o un tratamiento de mutagénesis dirigida para el gen que codifica la lisina descarboxilasa que posee la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID nº: 4. Estos tratamientos mutacionales pueden llevarse a cabo según los procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia tal como se describe seguidamente.
Sin embargo, el gen que codifica la lisina descarboxilasa que presenta sustituciones, deleciones o inserciones de 3 o menos residuos aminoácidos, al que se hace alusión en la presente memoria, incluye el que se origina a partir del "gen ldc" y puede considerarse sustancialmente el mismo que el gen ldc. No se tiene la intención de ampliar el significado a aquellos genes que tienen orígenes diferentes. Se entenderá fácilmente por parte de los expertos en la materia que, por ejemplo, el gen cadA que codifica la proteína (que es) diferente en no menos de 200 residuos aminoácidos respecto a una que tenga la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID nº: 4, es distinto del gen de la presente invención, y los genes que codifican las proteínas que muestran una actividad lisina descarboxilasa equivalente, se incluyen en la presente invención, incluso si son distintos del que posee la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID nº: 4, con respecto a dos o tres residuos aminoácidos.
<2> Creación de un microorganismo que pertenece al género Escherichia con una expresión moderada del gen de la lisina descarboxilasa
El microorganismo que pertenece al género Escherichia de la presente invención es un microorganismo que pertenece al género Escherichia en el que la actividad de la lisina descarboxilasa en las células ha disminuido o desaparecido. El microorganismo que pertenece al género Escherichia incluye Escherichia Coli. La actividad de la lisina descarboxilasa en las células ha disminuido o desaparecido, por ejemplo, moderando la expresión de cualquiera o de los dos nuevos genes de la lisina descarboxilasa (ldc) y del gen cadA conocido que se ha descrito anteriormente. Alternativamente, la actividad de la lisina descarboxilasa en las células puede asimismo disminuir o desaparecer mediante la disminución o desaparición de las actividades específicas de las enzimas lisina descarboxilasa codificadas por estos genes, modificando la estructura de las enzimas.
Los medios para moderar la expresión del gen ldc y del gen cadA conocido, incluyen, por ejemplo, un procedimiento para moderar la expresión de los genes a nivel transcripcional, provocando la sustitución, deleción, inserción, adición
o inversión de uno o de varios de los nucleótidos en las secuencias promotoras de estos genes, y disminuyendo las actividades del promotor (M. Rosenberg y D. Court, Ann. Rev. Genetic s 13 (1979), pág 319, y P. Youderian, S. Bouvier y M. Susskind, Cell 3D (1982) pág 843-853). Alternativamente, la expresión de estos genes puede moderarse a nivel traduccional provocando la sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o de varios de los nucleótidos en una región entre una secuencia SD y un codón de iniciación (J.J. Dunn, E. Buzash-Pollert y F.W.Studier, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75 (1978), pág 2743). Además, para que disminuya o desaparezca la actividad específica de la enzima lisina descarboxilasa, está disponible un procedimiento, en el que la región codificante del gen de la lisina descarboxilasa es modificada o anulada provocando la sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o de varios de los nucleótidos en una secuencia nucleótida en la región codificante.
Los genes en los cuales se permite que tenga lugar la sustitución, deleción, inserción, adición o inversión, pueden ser los genes ldc o los genes cadA que presentan sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o de varios residuos aminoácidos que no provocan el deterioro de la actividad sustancial de la lisina descarboxilasa codificada, además del gen ldc o del gen cadA.
El procedimiento para provocar la sustitución, deleción, inserción, adición o inversión en el gen, incluye específicamente un procedimiento de mutagénesis dirigida (Kramer, W. y Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), y un procedimiento de tratamiento utilizando un agente químico tal como el hiposulfito sódico y la hidroxilamina (Shortle, D. y Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75, 270 (1978)).
El procedimiento de mutagénesis dirigida es un procedimiento que utiliza un oligonucléotido sintético, que es una técnica para permitir la introducción de una sustitución, deleción, inserción, adición o inversión opcionales en un par de nucleótidos limitado y opcional. Para utilizar este procedimiento, se prepara en primer lugar un filamento monocatenario, desnaturalizando un plásmido que posee un gen diana clonado con una determinada secuencia nucleótida de ADN. A continuación, se sintetiza un oligonucleótido sintético complementario a una parte que se tiene la intención de que cause la mutación. Sin embargo, en este procedimiento, no se deja que el oligonucleótido sintético posea una secuencia completamente complementaria, sino que es diseñado para que presente una sustitución, deleción, inserción, adición o inversión nucleótida opcional. Después de esto, el ADN monocatenario se hibridiza con el oligonucleótido sintético que tiene la sustitución, deleción, inserción, adición o inversión nucleótida opcional. Un plásmido bicatenario completo se sintetiza utilizando la T4 ligasa y el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, el cual plásmido se introduce en células competentes de Escherichia Coli. Algunos de los transformantes así obtenidos poseen un plásmido que contiene un gen en el que se fija la sustitución, deleción, inserción, adición o inversión opcional. Como un procedimiento similar, capaz de introducir la mutación en un gen, para llevar a cabo una modificación o una destrucción, puede mencionarse un método de PCR recombinante (PCR Technology, Stockton Press (1989)).
El procedimiento para utilizar el agente químico es un procedimiento en el que la mutación que presenta la sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de los nucleótidos, se introduce al azar en un fragmento de ADN, tratando directamente el fragmento de ADN que contiene un gen diana con hiposulfito sódico, hidroxilamina o un análogo.
La expresión del gen ldc y/o el gen cadA en las células puede moderarse sustituyendo un gen normal en el cromosoma de un microorganismo que pertenece al género Escherichia con el gen modificado o destruido, obtenido introduciendo la mutación, tal como se ha descrito anteriormente. El procedimiento para sustituir el gen incluye procedimientos que utilizan la recombinación homóloga (Experiments in Molecu lar Ge netics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. y Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)). La recombinación homóloga se basa en la capacidad que posee generalmente el microorganismo que pertenece al género Escherichia. Cuando un plásmido o análogo que presenta homología con una secuencia en el cromosoma, se introduce en las células, tiene lugar la recombinación con una cierta frecuencia en un lugar de la secuencia que presenta la homología, y la totalidad del plásmido que se ha introducido, se incorpora al cromosoma. Después de esto, si tiene lugar una recombinación posterior en el lugar de la secuencia que presenta la homología en el cromosoma, el plásmido se suelta otra vez del cromosoma . Sin embargo, durante este proceso, el gen con la mutación que se ha introducido se fija preferentemente en el cromosoma, dependiendo de la posición a la que la recombinación tiene lugar, y, junto con el plásmido, un gen normal original se suelta del cromosoma. La selección de dichas cepas microbianas hace posible obtener una cepa microbiana en la que el gen normal en el cromosoma es sustituido con el gen modificado o destruido obtenido mediante la introducción de la mutación que presenta la sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de los nucleótidos.
El microorganismo que pertenece al género Escherichia y que va a someterse a la sustitución génica, es un microorganismo que produce L-lisina. El microorganismo que pertenece al género Escherichia que produce L-lisina, por ejemplo, una cepa microbiana de Escherichia Coli, puede obtenerse aplicando un tratamiento mutacional a una cepa que no produce L-lisina, para proporcionarle resistencia a un análogo de la lisina tal como S-(-2-aminoetil)-Lcisteína (a la que se alude de aquí en adelante como "AEC"). Los procedimientos para el tratamiento mutacional incluyen procedimientos en los que las células de Escherichia Coli se someten a un tratamiento con un agente químico tal como la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina y el ácido nitroso, o un tratamiento con irradiación de luz ultravioleta, radiación o análogos. Dicha cepa microbiana, incluye específicamente Escherichia Coli AJ13069 (FERM P-14690). Esta cepa microbiana se crió proporcionando resistencia mediante AEC a la cepa W3110 originaria de Escherichia Coli K-12. La Escherichia Coli AJ13069 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japón), con el número de registro FERM P-14690 el 6 de diciembre de 1994, y se transfirió a un depósito internacional basado en el Tratado de Budapest el 29 de septiembre de 1995, con un número de registro FERM BP-5252.
La cepa microbiana de Escherichia Coli que produce L-lisina puede asimismo criarse introduciendo y potenciando el ADN que transporta la información genética pertinente para la biosíntesis de la L-lisina mediante la tecnología de la recombinación genética. Los genes que van a introducirse son genes que codifican enzimas de la vía biosintética de la L-lisina, tales como aspartoquinasa, dihidrodipiColinatosintetasa, dihidrodipiColinato reductasa, succinildiaminopimelato transaminasa, y succinildiaminopimelato deacilasa. En el caso de un gen de la enzima que experimenta retroinhibición por la L-lisina, tal como la aspartoquinasa y la dihidrodipiColinato sintetasa, es deseable utilizar un gen de tipo mutante que codifique una enzima que esté desensibilizada de dicha inhibición. Para introducir y potenciar el gen, está disponible un procedimiento, en el que el gen se une a un vector capaz de replicarse autonomamente en las células de Escherichia Coli para preparar ADN recombinante con el cual se transforma Escherichia Coli. Alternativamente, el gen puede asimismo incorporarse al cromosoma de un huésped según un procedimiento para utilizar la ttransducción, un transposón (Berg, D. E. y Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), el fago Mu (Patente Japonesa abierta al público nº 2-109985), o la recombinación homóloga (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).
Otros procedimientos para obtener el microorganismo que pertenece al género Escherichia con la función del gen anulada, incluyen un procedimiento para provocar una mutación genética aplicando un tratamiento con un agente químico tal como la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina y el ácido nitroso, o un tratamiento con irradiación de luz ultravioleta, radiación o análogos, perteneciendo las células del microorganismo al género Escherichia que posee el gen.
En el Ejemplo que se describe más adelante, se creó una cepa de Escherichia Coli con la función anulada del gen de la lisina descarboxilasa, suprimiendo una parte de su región codificante e insertando un gen drogo-resistente en vez de ella, para obtener un gen de la lisina descarboxilasa que se utilizó para substituir un gen de la lisina descarboxilasa en el cromosoma de Escherichia Coli, según el procedimiento que utiliza la recombinación homóloga, descrito anteriormente.
Es posible moderar la expresión de cualquiera de los nuevos genes de la lisina descarboxilasa de la presente invención y del gen cadA, o moderar la expresión de los dos, en una cepa microbiana. La expresión del gen de la lisina descarboxilasa puede moderarse en el microorganismo que pertenece al género Escherichia que produce Llisina, o puede proporcionarse la producción de L-lisina al microorganismo que pertenece al género Escherichia con una expresión moderada del gen de la lisina descarboxilasa, según el procedimiento descrito anteriormente.
<3> Producción de L-lisina utilizando un microorganismo que pertenece al género Escherichia con expresión moderada del gen de la lisina descarboxilasa.
Una cantidad considerable de L-lisina se produce y se acumula en un cultivo líquido, cultivando el microorganismo que pertenece al género Escherichia con una expresión moderada del gen de la lisina descarboxilasa obtenida tal como se ha descrito anteriormente. La cantidad acumulada de L-lisina aumenta sólo moderando la expresión del gen conocido cadA. Sin embargo, para aumentar la cantidad acumulada de L-lisina, es más efectivo moderar la expresión del nuevo gen de la lisina descarboxilasa de la presente invención. El resultado más preferido para la producción de L-lisina se obtiene utilizando una cepa microbiana en la que la expresión, tanto del gen cadA como del nuevo gen de la presente invención, se moderen.
El medio a utilizar para la producción de L-lisina es un medio ordinario que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos, y opcionalmente, otras fuentes de nutrientes orgánicos traza. Como fuente de carbono, es posible utilizar azúcares tales como glucosa, lactosa, galactosa, fructosa, e hidrolizado de almidón; alcoholes, tales como glicerol y sorbitol; y ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido cítrico, y ácido succínico. Como fuente de nitrógeno, es posible utilizar sales amónicas inorgánicas tales como sulfato amónico, cloruro amónico, y fosfato amónico; fuentes nitrogenadas orgánicas, tales como hidrolizado de soja; gas amoníaco; y amoníaco líquido. Como iones inorgánicos, fosfato potásico, sulfato magnésico, iones de hierro, iones de manganeso, etc, se añaden en pequeñas cantidades. Además de lo anterior, es deseable que se contengan vitamina B, extracto de levadura o análogos, en cantidades apropiadas, como fuentes de nutrientes orgánicos traza.
El cultivo se lleva a cabo preferentemente bajo condiciones aeróbicas durante 16-72 horas aproximadamente. La temperatura del cultivo se controla entre 30 y 45ºC, y el pH se controla entre 5 y 7 durante el cultivo. Para ajustar el pH, pueden utilizarse sustancias inorgánicas y orgánicas, ácidas o alcalinas, o gas amoníaco, o análogos.
Después de la finalización del cultivo, se puede llevar a cabo convenientemente la recuperación de la L-lisina a partir de un licor fermentado, combinando un procedimiento ordinario mediante una resina intercambiadora de iones, un procedimiento de precipitación y otros procedimientos conocidos.
La Fig 1 muestra una estructura de un plásmido pUC6F5HH5 que contiene el nuevo gen de la lisina descarboxilasa.
La Fig 2 muestra una estructura de un plásmido pTS6F5HH5 termosensible, que contiene el nuevo gen de la lisina descarboxilasa, y la construcción de un plásmido pTS6F5HH5Cm, en el que una parte del gen se sustituye con un fragmento que contiene un gen de resistencia al cloranfenicol.
La Fig 3 muestra la comparación de las actividades de descomposición de la L-lisina en una cepa WC196 que alberga un gen normal de la lisina descarboxilasa, y las cepas WC196C, WC196L y WC196LC con los genes de la lisina descarboxilasa destruidos.
La presente invención se explicará más específicamente a continuación haciendo referencia a los Ejemplos.
Ejemplo 1
(1) Clonación del nuevo gen de la lisina descarboxilasa
Se extrajo ADN cromosómico según un procedimiento ordinario a partir de las células de la cepa W3110 de Escherichia Coli K-12 obtenidas del National Institute of Genetics (Yata 1111, Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japón). Por otra parte, se sintetizaron dos iniciadores de ADN tal como se muestran en SEC ID nº: 1 y nº 2 en el listado de secuencias, según un procedimiento ordinario que se basa en la secuencia nucleótida del gen cadA (véase SEC ID nº: 5) que se describe en Meng, S. y Bennett, G.N., J. Bacteriol, 174, 2659 (1992). Tenían secuencias homólogas a una parte corriente arriba del extremo 5' y a una parte terminal del extremo 3' del gen cadA, respectivamente. El ADN cromosómico y los iniciadores de ADN se utilizaron para llevar a cabo un método PCR, según el procedimiento de Erlich et al. (PCR Technology, Stockton Press (1989)). De este modo, se obtuvo un fragmento de ADN de 2,1 kpb que contenía casi la totalidad del gen cadA. Este fragmento se marcó con un Equipo de Marcaje al Azar del Iniciador (producido por Takara Shuzo) y [a-32P]dCTP (producido por Amersham Japan) para preparar una sonda para la hibridización.
A continuación, se llevó a cabo la hibridización según un procedimiento ordinario (Molecular Cloning (2ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), utilizando la sonda preparada y la Membrana de Elaboración de mapas Génicos/Escherichia Coli (producida por Takara Shuzo). A la Membrana de Elaboración de mapas Génicos/Escherichia Coli (producida por Takara Shuzo), se absorbió una biblioteca de Kohara et al. (biblioteca del fago lambda del ADN cromosómico de Escherichia Coli): véase Kohara, Y et al . Cell, 5D , 495-508 1987). Se rastrearon los clones del fago lambda que tenían secuencias similares al gen cadA, suavizando las condiciones para el lavado de la sonda (2 x SSC, 55ºC, 30 minutos), cuando se llevó a cabo la hibridización. Como resultado, se logró encontrar señales débiles de tres clones de E2B8, 6F5H y 10F9, además de las señales intensas de los clones que contenían la región (21H11, 5G7) del gen cadA. Las secuencias de la inserción de los tres clones del fago lambda de E2B8, 6F5H y 10F9, continúan en el cromosoma de Escherichia Coli, aunque se solapan entre ellas. De este modo, el ADN de 6F5H del fago lambda que pertenece a la biblioteca de Kohara et al. (Kohara, Y et al. Cell, 5D, 495508 (1987), se separó según un procedimiento ordinario, el cual fue digerido con varios enzimas de restricción, para llevar a cabo la hibridización de la transferencia Southern utilizando la sonda descrita anteriormente según un procedimiento similar al descrito anteriormente. Como resultado, se reveló que en un fragmento de ADN de aproximadamente 5 kbp obtenido mediante digestión con HindIII, se encontraba presente una secuencia similar al gen cadA.
De este modo, el fragmento de aproximadamente 5kbp obtenido mediante digestión del ADN de 6F5H del fago lambda con HindIII se unió con el digesto HindIII de un plásmido pUC19 (producido por Takara Shuzo) utilizando la T4 ADN ligasa. Esta mezcla reactiva se utilizó para transformar Escherichia Coli JM109 (producida por Takara Shuzo) para obtener cepas resistentes a la ampicilina que se hicieron crecer en un medio completo (que contenía 10 g de polipeptona, 5 g de extracto de levadura, y 5 g de cloruro sódico en 1 L de agua) que se añadió con 50 mg/mL de ampicilina. Se obtuvo entonces a partir de ello una cepa microbiana que albergaba un plásmido con la inserción del fragmento de aproximadamente 5 kbp obtenido mediante digestión del ADN de 6F5H del fago lambda con HindIII. Se extrajo un plásmido de sus células, obteniéndose un plásmido pUC6F5HH5. La Fig 1 muestra una estructura del plásmido pUC6F5HH5.
La Escherichia Coli JM109/pUC6F5HH5 que albergaba este plásmido se denominó como AJ13068, que se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology con el número de registro FERM P-14689 el 6 de diciembre de 1994, y se transfirió a un depósito internacional basado en el Tratado de Budapest el 29 de septiembre de 1995, con un número de registro FERM BP-5251.
- (2)
- Determinación de la secuencia nucleótida del nuevo gen de la lisina descarboxilasa
Se determinó una secuencia nucleótida de una región entre los sitios de restricción enzimática de ClaI y HindIII del pUC6F5HH5 obtenido, según un procedimiento descrito en Molecular Clon ing (2ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Como resultado, se reveló que la secuencia nucleótida que se muestra en SEC ID nº: 3 en el listado de secuencias, estaba codificada. Esta secuencia de ADN contiene un marco de lectura abierto que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID nº: 4 en el listado de secuencias.
- (3)
- Preparación de Escherichia Coli con producción de L-lisina
La Escherichia Coli W3110 se cultivó a 37ºC durante 4 horas en un medio completo (que contenía 10 g de polipeptona, 5 g de extracto de levadura, y 5 g de cloruro sódico en 1 L de agua) para obtener células microbianas que se sometieron a tratamiento mutacional a 37ºC durante 30 minutos en una solución de N-metil-N'-nitro-Nnitrosoguanidina a una concentración de 200 !g/ml, lavándose después, y aplicándose entonces en un medio mínimo de placa (que contenía 7 g de hidrogenfosfato disódico, 3 g de dihidrogenfosfato potásico, 1 g de cloruro amónico, 0,5 g de cloruro sódico, 5 g de glucosa, 0,25 g de sulfato magnésico heptahidratado, y 15 g de agar en 1 L de agua;, añadiéndose 5 g/L de AEC. Las cepas resistentes a AEC se obtuvieron separando las colonias que aparecieron después del cultivo a 37ºC durante 48 horas. La cepa WC196, como una cepa entre ellas, producía Llisina. La cepa WC196 se denominó como AJ13069, y se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology con el número de registro FERM P-14690 el 6 de diciembre de 1994, y se transfirió a un depósito internacional basado en el Tratado de Budapest el 29 de septiembre de 1995, con un número de registro FERM BP-5252.
- (4)
- Creación de la cepa WC196 con la función anulada del nuevo gen de la lisina descarboxilasa
El fragmento de aproximadamente 5 kbp obtenido mediante digestión del ADN de 6F5H del fago lambda con HindIII, descrito anteriormente, se unió con un digesto HindIII de un plásmido pMANO31 termosensible (Yasueda, H. et al., Appl. Microb iol. Biotechno l., 36 , 211 (1991)), utilizando la T4 ADN ligasa. Esta mezcla reactiva se utilizó para transformar Escherichia Coli JM109, seguido por el cultivo a 37ºC durante 24 horas en un medio completo de placa al que se añadieron 50 mg/L de ampicilina para que se desarrollaran cepas resistentes a la ampicilina. Se obtuvo entonces una cepa microbiana, que albergaba un plásmido con la inserción del fragmento de aproximadamente 5 kbp obtenido mediante digestión del ADN de 6F5H del fago lambda con HindIII. Se extrajo un plásmido de las células de esta cepa, obteniéndose un plásmido pTS6F5HH5. El plásmido pTS6F5HH5 se sometió a digestión con EcoRV para eliminar un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kbp. A continuación, se utilizó T4 ligasa para insertar un fragmento que contenía un gen de resistencia al cloranfenicol de aproximadamente 1 kbp obtenido mediante digestión de pHSG399 (producido por Takara Shuzo) con AccI. De este modo, se construyó un plásmido ppTS6F5HH5Cm. Como resultado de la operación descrita anteriormente, se logró la construcción del plásmido que poseía un fragmento de ADN con la función anulada del nuevo gen de la lisina descarboxilasa. La Fig 2 muestra una estructura del plásmido pTS6F5HH5, y del plásmido pTS6F5HH5Cm.
A continuación, se creó una cepa, en la que el nuevo gen de la lisina descarboxilasa en el cromosoma de la cepa WC196 se sustituyó con el fragmento de ADN con la función anulada del nuevo gen de la lisina descarboxilasa, de acuerdo con una técnica general de recombinación homóloga (Matsuyama, S. y Mizushima, S., J. Bacteriol., 162 , 1196 (1985), utilizando la propiedad de termosensibilidad del plásmido pTS6F5HH5Cm. Concretamente, la cepa WC196 se transformó con el plásmido pTS6F5HHCm para obtener en primer lugar una cepa que fuera resistente a la ampicilina y resistente al cloranfenicol a 300ºC. A continuación, esta cepa se utilizó para obtener una cepa que fuera resistente a la ampicilina y resistente al cloranfenicol a 420ºC. Posteriormente, esta cepa se utilizó para obtener una que fuera sensible a la ampicilina y resistente al cloranfenicol a 300ºC. De este modo, se creó la cepa tal como se ha descrito anteriormente, en la que el nuevo gen de la lisina descarboxilasa en el cromosoma de la cepa WC196 fue sustituido con el fragmento de ADN con la función anulada del nuevo gen de la lisina descarboxilasa. Esta cepa se denominó cepa WC196L.
(5) Creación de la cepa WC196 y de la cepa WC196L con deficiencia del gen cadA
Escherichia Coli, en la que el gen cadA como gen conocido de la lisina descarboxilasa es anulado, es ya conocida, incluyendo, por ejemplo, a la cepa GNB10181 que se origina de Escherichia Coli K-12 (véase Auger, E.A. et al., Mol. Microbiol., 3, 609 (1989); esta cepa microbiana está disponible a partir, por ejemplo, del Genetic Stock Center de E. Coli (Connecticut, USA)). Se ha desvelado que en esta cepa microbiana, la región del gen cadA es deficiente. Así, el carácter deficiente del gen cadA de la cepa GNB10181 se transdujo a la cepa WC196 según un procedimiento general, utilizando el fago P1 (A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992)) para crear la cepa WC196C. La deficiencia del gen cadA de la cepa WC196 se confirmó mediante hibridización de transferencia Southern. Además, se creó la cepa WC196LC con deficiencia del gen cadA a partir de la cepa WC196L según un procedimiento similar al descrito anteriormente.
Ejemplo 2
(1) Confirmación de las actividades de descomposición de la L-lisina de las cepas WC196, WC196C, WC196L y WC196LC
Las cuatro cepas creadas que se describen anteriormente se cultivaron a 37ºC durante 17 horas utilizando un medio para la producción de L-lisina (que contenía 40 g de glucosa, 16 g de sulfato amónico, 1 g de dihidrogenfosfato potásico, 2 g de extracto de levadura, 10 mg de sulfato de manganeso tetra a pentahidratado, y 10 mg de sulfato férrico heptahidratado en 1 l de agua; se ajustó el pH a 7 con hidróxido potásico, añadiendo entonces 30 g de carbonato cálcico esterilizado separadamente). Las células microbianas recuperadas se lavaron dos veces con una solución salina fisiológica, se suspendieron en un medio para ensayar la descomposición de la lisina (que contenía 17 g de hidrogenfosfato disódico dodeca-hidratado, 3 g de dihidrogenfosfato potásico, 0,5 g de cloruro sódico, y 10 g de clorhidrato de L-lisina en 1 l de agua), cultivándose a 37ºC durante 31 horas.
La Fig 3 muestra cambios en las cantidades de la L-lisina que quedan en el líquido de cultivo, a lo largo del tiempo. La cantidad de L-lisina se determinó cuantitativamente utilizando un Analizador Biotech AS-210 (producido por Asahi Chemical industry). En la cepa WC196 se observó una descomposición significativa de la L-lisina. Sin embargo, la actividad de descomposición disminuyó un poco en la cepa WC196C con deficiencia del gen cadA, como gen conocido de la lisina descarboxilasa. La descomposición de la L-lisina no se observó en las cepas WC196L y WC196LC con la función anulada del nuevo gen de la lisina descarboxilasa. La L-lisina que permanecía en el líquido del cultivo disminuyó durante un tiempo de hasta 3 horas del cultivo en cualquiera de las cepas microbianas. Sin embargo, este fenómeno fue causado por la incorporación de la L-lisina en las células microbianas, y no por la descomposición.
(2) Producción de L-lisina por las cepas WC196, WC196C, WC196L y WC196LC
Las cuatro cepas descritas anteriormente se cultivaron a 37ºC durante 20 horas en el medio para la producción de Llisina descrito anteriormente. Se midieron las cantidades de L-lisina y de cadaverina producidas y acumuladas en el líquido del cultivo. La cantidad de L-lisina se determinó cuantitativamente utilizando el Analizador Biotech As-210 tal como se ha descrito anteriormente. La cantidad de cadaverina se determinó cuantitativamente utilizando cromatografía líquida de alta resolución.
Los resultados se muestran en la tabla 1. La acumulación de L-lisina aumentó, y la acumulación de cadaverina como producto de descomposición de la L-lisina, disminuyó en la cepa WC196C con destrucción del gen cadA, comparado con la cepa WC196 y la cepa WC196L con la función anulada del nuevo gen de la lisina descarboxilasa, comparado con las cepas WC196 y WC196C. La acumulación de L-lisina aumentó posteriormente, y la acumulación de cadaverina como producto de descomposición de la L-lisina no se detectó en la cepa WC196LC con la función anulada de ambos genes de la lisina descarboxilasa.
- TABLA 1
- Cepa microbiana WC196 WC196C WC196L WC196LC
- Acumulación de lisina(g/L) 1,4 1,9 2,3 3,3 Acumulación de cadaverina (g/L) 0,6 0,4 0,1 no detectada
Ejemplo 3
La Escherichia Coli WC196LC en la que la actividad de descomposición de la L-lisina había desaparecido, se transformó con pUC6F5HH5 que contenía el nuevo gen de la lisina descarboxilasa para obtener una cepa resistente a la ampicilina. La cepa WC196LC y la cepa WC196LC/pUC6F5HH5 se cultivaron a 37ºC durante 16 horas en un medio para la producción de L-lisina al que se habían añadido 5 g/L de L-lisina, midiéndose la cantidad de cadaverina producida.
Los resultados se muestran en la Tabla 2. La cepa WC196LC no consiguió convertir la L-lisina a cadaverina, mientras que la cepa WC196LC/pUC6F5HH5 mostró la capacidad de convertir la L-lisina a cadaverina.
Cepa microbiana Cantidad producida de cadaverina (g/L)
WC196LC no detectada
WC196LC/pUC6F5HH5 0,93
El nuevo gen de la lisina descarboxilasa de la presente invención participa en la descomposición de la Llisina en Escherichia Coli. La L-lisina puede producirse eficientemente y de modo barato cultivando la bacteria que pertenece al género Escherichia que produce la L-lisina con una expresión moderada del gen descrito anteriormente y/o del gen cadA.
- (1)
- INFORMACIÓN GENERAL:
- (i)
- SOLICITANTE: AJINOMOTO Co., Inc.
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVO GEN DE LA LISINA DESCARBOXILASA Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR LA L-LISINA
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 6
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA
- (A)
- DESTINATARIO: Ajinomoto Co., Ltd.
- (B)
- CALLE: 15-1, Kyobashi 1-chome, Chuo-ku
- (C)
- CIUDAD: Tokyo 104
- (D)
- ESTADO:
- (E)
- PAíS: Japón
- (F)
- CP:
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
- (D)
- SOFTWARE: FastSEC Versión 1.5
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: 95 938 648.3
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 05.12.95
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: 6-306386
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09.12.94
(viii) DATOS DEL APODERADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
- (A)
- NOMBRE: Strehl Schübel-Hopf Groening & Partner
- (B)
- NUMERO DE REGISTRO: : 94
(ix) INFORMACIÓN DE CONTACTO: EPN-43688
- (A)
- TELÉFONO: [49] (89)223911
- (B)
- FAX: [49] (89) 22 39 15
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº1:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 20 bases
- (A)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: único
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: /desc= "ADN sintético"
(iii) HIPOTÉTICO: NO
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº2
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 20 bases
- (A)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: único
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: /desc: "ADN sintético"
(iii) HIPOTÉTICO: NO
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SI
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº3:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 3269 pares de bases
- (A)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: doble
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
(iii) HIPOTÉTICO: NO
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia Coli
- (B)
- CEPA: W3110
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
- (A)
- NOMBRE/CÓDIGO: CDS
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1005..3143
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº5:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
- (A)
- LONGITUD: 2145 pares de bases
- (A)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: doble
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº4:
- 5
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
- (A) LONGITUD: 713 aminoácidos
- (A) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal
- 10
- (ii) (ix)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
(iii) HIPOTÉTICO: NO
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia Coli
- (B)
- CEPA: CS520
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..2145
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº6:
- 5
- (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
- (A) LONGITUD: 715 aminoácidos
- (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal
- 10
- (ii) (ix)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
Claims (9)
- REIVINDICACIONES1. Gen que codifica la lisina descarboxilasa que posee una secuencia de aminoácidos que se define en los apartados (A) o (B) siguientes:
- (A)
- una secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 4,
- (B)
- una secuencia de aminoácidos que presenta sustitución, deleción o inserción de 3 residuos aminoácidos o menos en la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 4 en el listado de secuencias sin ningún deterioro sustancial de la actividad lisina descarboxilasa.
-
- 2.
- Gen según la reivindicación 1, en el que el gen posee una secuencia nucleótida desde el nucleótido 1005º al 3143º representada en SEC ID nº: 3.
-
- 3.
- Fragmento de ADN que contiene un gen según la reivindicación 1 ó 2.
-
- 4.
- Procedimiento para que disminuya o desaparezca la actividad de la lisina descarboxilasa codificada por el gen según la reivindicación 1 ó 2, en el que el gen según la reivindicación 1 ó 2 se modifica por sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o de una pluralidad de nucleótidos en una secuencia nucleótida en el gen.
-
- 5.
- Microorganismo que pertenece al género Escherichia, en el que el gen según la reivindicación 1 ó 2, una secuencia promotora del gen o una región entre una secuencia SD y un codón de iniciación del gen, es modificada por sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o una pluralidad de nucleótidos en la secuencia nucleótida del gen, la secuencia promotora o la región entre una secuencia SD y un codón de iniciación, por lo que disminuye o desaparece en las células la actividad de una lisina descarboxilasa codificada por el gen.
-
- 6.
- Microorganismo según la reivindicación 5, en la que dicho microorganismo es Escherichia Coli.
-
- 7.
- Microorganismo según la reivindicación 5 ó 6, en el que el gen cadA que codifica la lisina descarboxilasa que posee la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 6, una secuencia promotora del gen cadA o una región entre una secuencia SD y un codón de iniciación del gen cadA, son modificados por sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o una pluralidad de nucleótidos en la secuencia nucleótida del gen cadA, la secuencia promotora del gen cadA o la región entre una secuencia SD y un codón de iniciación del gen cadA, por lo que disminuye o desaparece adicionalmente la actividad de una lisina descarboxilasa codificada por el gen cadA.
-
- 8.
- Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 y 7, que pertenece al género Escherichia y presenta la capacidad de producir L-lisina.
-
- 9.
- Procedimiento para la producción de L-lisina, que comprende la etapa de cultivo de un microorganismo según la reivindicación 8 en un medio líquido.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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