ES2257087T3

ES2257087T3 - Metodo y reactivos para la deteccion del cancer.

Info

Publication number: ES2257087T3
Application number: ES99959578T
Authority: ES
Inventors: John Russell Robertson; Catherine Rosamund Louise Graves; Frances Price (Legal Representative Of Price)
Original assignee: University of Nottingham
Current assignee: University of Nottingham
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2006-07-16
Anticipated expiration: 2019-12-10
Also published as: WO2000034787A1; EP1137943B1; CY1105697T1; PT1137943E; JP4665069B2; DE69930666T2; AU1671300A; US7205117B1; JP2002532686A; DE69930666D1; DK1137943T3; GB9827228D0; ATE322014T1; EP1137943A1; CA2354702C; CA2354702A1; US20080108084A1

Abstract

Un método in vitro para detectar una proteína marcadora asociada al cáncer, presente en un fluido corporal de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) poner en contacto una muestra del fluido corporal de dicho mamífero, con anticuerpos dirigidos contra al menos un epítopo de dicha proteína marcadora; y (b) detectar la presencia de complejos formados entre dichos anticuerpos y cualquier proteína marcadora presente en dicha muestra; en donde dichos anticuerpos son autoanticuerpos de mamífero para dicha proteína marcadora asociada al cáncer que proceden de la misma especie que el mamífero, del cual se ha obtenido dicha muestra, y en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma modificada de una proteína de tipo natural.

Description

Método y reactivos para la detección del cáncer.

La presente invención se refiere a métodos específicos y altamente sensibles para detectar la presencia de proteínas marcadoras de cáncer en los fluidos corporales de un mamífero, a autoanticuerpos para uso en estos métodos, a células inmortalizadas para obtener estos autoanticuerpos y a kits para realizar los métodos. Estos métodos son útiles en la detección temprana de modificaciones carcinógenas o pre-neoplásicas en pacientes asintomáticos, en la monitorización del progreso de cáncer, en el escrutinio de la recidiva de la enfermedad en pacientes que han sufrido previamente tratamiento anti-cancerígeno, en la monitorización de la eficacia de un tratamiento sistemático en un paciente y en la determinación del tratamiento más apropiado para un paciente particular.

Las células cancerosas y pre-neoplásicas se caracterizan por la producción de proteínas marcadoras asociadas al cáncer. Estas consisten frecuentemente en formas anómalas de proteínas de tipo natural, que son producidas por las células cancerosas como resultado de mutaciones genéticas o procesos post-traduccionales alterados. Alternativamente, los marcadores cancerosos también pueden ser proteínas que llegan a sobre-expresarse en células tumorales, usualmente como resultado de la amplificación de genes o de la regulación transcripcional anormal. En algunos casos, estos dos fenómenos pueden ocurrir al mismo tiempo conduciendo a una acumulación de proteínas modificadas a través del desarrollo de la enfermedad. Por ejemplo, se ha encontrado que las formas modificadas de Ras, p53, c-myc, MUC-1, c-erb\beta2 están asociadas con una amplia variedad de cánceres.

Las proteínas asociadas al cáncer se encuentran tanto en los tejidos como en los fluidos corporales de un individuo que lleva células pre-neoplásicas o cancerosas. Estos niveles son muy bajos en las etapas tempranas del proceso carcinógeno y aumentan durante el progreso de la enfermedad. La detección de estas proteínas se ha usado ventajosamente en ensayos habituales para el diagnóstico del cáncer pero, desafortunadamente, estos ensayos tienen muchas limitaciones. En particular, los anticuerpos comerciales disponibles para uso en ensayos estándares no son en general suficientemente sensibles para detectar los bajos niveles de proteínas asociadas al cáncer que se encuentran en las etapas muy tempranas de la enfermedad, por ejemplo en pacientes asintomáticos, cuando sería más eficaz el tratamiento. Además, la mayoría de los anticuerpos comerciales no son específicos para formas modificadas de marcadores asociados al cáncer y reaccionan de forma cruzada con formas de tipo natural de estas proteínas. Como consecuencia, solamente son útiles para detectar aumentos sustanciales en niveles de suero de las proteínas marcadoras de cáncer, que usualmente ocurren en etapas avanzadas de cáncer.

Por ejemplo, el ensayo comercial CA15-3, que detecta tanto las formas no modificadas como las modificadas de MUC1, es útil el diagnóstico de cánceres de mama metastásicos, que se caracterizan por elevados niveles en suero de MUC1. Sin embargo, este ensayo no puede usarse en escrutar neoplasias o cáncer de mama primario porque los niveles en suero de MUC1 en estas etapas no difieren significativamente de los encontrados en individuos normales (Robertson et al. (1990), Eur. J. Cancer 26: 1127-1132). Se ha descrito que otras proteínas marcadoras, tales como, por ejemplo, el antígeno carcinoembriónico (CEA) y el marcador CA19.9 se encontraban en un número elevado en el suero de pacientes con cáncer de mama y colorrectal metastásico pero no en el de pacientes con cánceres primarios (Robertson et al. (1991), Cancer Immunol. Immunother. 133: 403-410; Thomas et al. (1991) Br. J. Cancer 63: 975-976). También en el caso de estos marcadores, los ensayos comerciales disponibles no son capaces de discriminar entre las formas modificadas y de tipo natural de las proteínas y por tanto son de uso limitado. Además, los anticuerpos comercialmente disponibles, por reacción cruzada con formas normales de proteínas asociadas al cáncer, también pueden conducir a falsos resultados positivos. Por tanto, existe la necesidad en la técnica de anticuerpos específicos y más sensibles para usar en estos ensayos con el fin de detectar las modificaciones pre-neoplásicas y carcinógenas tempra-
nas.

Como se usan en la presente memoria las expresiones "proteína marcadora asociada al cáncer", "proteína asociada al cáncer", "proteína marcadora" o "marcador canceroso" se refieren todas a formas modificadas asociadas al cáncer de proteínas de tipo natural.

Los marcadores cancerosos difieren frecuentemente de las proteínas de tipo natural correspondiente en que son reconocidos como moléculas extrañas por el sistema inmune de un individuo, desencadenando una respuesta autoinmune. La respuesta inmune puede ser humoral, conduciendo a la producción de autoanticuerpos contra la proteína marcadora de cáncer. Los autoanticuerpos son anticuerpos que se presentan de forma natural dirigidos contra un antígeno que el sistema inmune del individuo reconoce como extraño incluso aunque dicho antígeno realmente se origine en ese individuo. Por ejemplo, las formas modificadas de las proteínas p53, MUC-1, c-myc, c-erb3 y Ras pueden desencadenar la producción de autoanticuerpos. Tal como se usa en la presente memoria el término "autoanticuerpo" se refiere a un anticuerpo dirigido contra un antígeno que se auto-origina, presentándose dicho anticuerpo de forma natural en la circulación de un individuo o a un anticuerpo que exhibe las características del anticuerpo que se presenta de forma natural en que reconoce dicho antígeno autooriginado pero que se produce fuera del organismo, por ejemplo, por una célula inmortalizada.

Rao et al., en Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting, 1987, Volumen 28, página 358, describen la detección de tumor de ovario humano asociado con antígenos por anticuerpos autólogos aislados de fluido ascítico de carcinoma de ovario. La naturaleza del antígeno no está identificada.

Como se describirá en los Ejemplos siguientes, los inventores de la presente solicitud han encontrado sorprendentemente que los autoanticuerpos producidos por pacientes que sufren cáncer reconocen específicamente las proteínas marcadoras asociadas al cáncer de los mismos pacientes o de otros pacientes con cáncer y muestran muy poca reactividad cruzada con formas de tipo natural de estas proteínas. Además, los inventores de la presente solicitud han encontrado que los autoanticuerpos anteriores tienen mucha mayor sensibilidad que los anticuerpos usados comúnmente en ensayos habituales y por lo tanto son capaces de detectar cantidades más pequeñas de proteínas marcadoras asociadas al cáncer. Los autoanticuerpos producidos por pacientes con cáncer pueden por lo tanto usarse para diseñar ensayos alternativos, más fiables y sensibles para detectar modificaciones pre-neoplásicas o carcinógenas en un individuo desde el comienzo de su presentación. Estos ensayos también pueden emplearse para detectar cáncer o pre-neoplasia en cualquier otro mamífero, utilizando los autoanticuerpos producidos por un mamífero, de la misma especie que el del ensayo o autoanticuerpos que tienen las mismas características que dicho anticuerpo.

La presente invención proporciona un sistema de ensayo específico y más sensible para la detección de pre-neoplasia o cáncer en un mamífero, que permite la detección de proteínas marcadoras asociadas al cáncer en las etapas tempranas de la enfermedad.

Por consiguiente, en un primer aspecto la invención proporciona un método in vitro para detectar una proteína marcadora asociada al cáncer presente en un fluido corporal de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a): poner en contacto una muestra de un fluido corporal de dicho mamífero con anticuerpos dirigidos contra al menos un epítopo de dicha proteína marcadora; y

(b): detectar la presencia de complejos formados entre dichos anticuerpos y cualquier proteína marcadora presente en dicha muestra;

en donde dichos anticuerpos son autoanticuerpos de mamíferos para dicha proteína marcadora asociada al cáncer que proceden de la misma especie que el mamífero del cual se obtuvo dicha muestra.

La presencia de dichos complejos es indicativa de la presencia de proteínas marcadoras asociadas al cáncer en dicho mamífero.

Tal como se usa en la presente memoria "procede(n)" significa un autoanticuerpo o autoanticuerpos aislado(s) de dicha especie o un autoanticuerpo o autoanticuerpos que tiene(n) las características de un autoanticuerpo o autoanticuerpos aislado(s) de dicha especie.

El método de la invención puede emplear un solo autoanticuerpo dirigido contra una proteína marcadora de cáncer particular. Alternativamente, puede utilizarse un panel de autoanticuerpos que reconocen cierto número de proteínas asociadas al cáncer para obtener un perfil de marcadores de cáncer presentes en un individuo particular. Esto conduce a un diagnóstico más fiable y proporciona información útil en la elección del tratamiento más apropiado para un individuo.

El método de ensayo de la invención se realiza sobre una muestra de un fluido biológico del paciente tal como, por ejemplo, plasma, suero, sangre completa, orina, linfa, heces, fluido cerebroespinal o aspirado de pezón, dependiendo de la naturaleza del cáncer que ha de detectarse. Puesto que es un ensayo no invasivo puede repetirse tan frecuentemente como sea necesario para escrutar modificaciones neoplásicas o carcinógenas tempranas, para seguir el desarrollo de la enfermedad, para analizar la recidiva de la enfermedad, para verificar la eficacia de un tratamiento o para seleccionar el tratamiento más apropiado para un paciente particular.

El método de la invención se puede realizar usando cualquier técnica inmunológica conocida por los expertos en la técnica de inmunoquímica. Como ejemplos, pueden utilizarse las técnicas ELISA, radioinmunoensayo o similares. En general, un autoanticuerpo apropiado se inmoviliza en una superficie sólida y la muestra a ensayar se pone en contacto con el autoanticuerpo. Si la proteína marcadora de cáncer reconocida por el autoanticuerpo está presente en la muestra, se forma un complejo autoanticuerpo-marcador. El complejo puede ser dirigido o medido cuantitativamente usando, por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado que específicamente reconozca un epítopo de la proteína marcadora. El anticuerpo secundario puede ser marcado con marcadores bioquímicos, tales como, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (abreviadamente HRP por la expresión inglesa horseradish peroxidase) o fosfatasa alcalina (abreviadamente AP por la expresión inglesa alkaline phosphatase), y la detección del complejo puede conseguirse por la adición de un sustrato para la enzima que genere un producto colorimétrico, quimioluminiscente o fluorescente. Alternativamente, la presencia del complejo puede determinarse mediante la adición de una proteína marcadora etiquetada con un marcador detectable, por ejemplo una enzima apropiada. En este caso, la cantidad de actividad enzimática medida es inversamente proporcional a la cantidad de complejo formado y se necesita como referencia un control negativo para determinar la presencia de antígeno en la muestra. Otro método para detector el complejo puede utilizar anticuerpos o antígenos que han sido marcados con radioisótopos seguido por medida de la radiactividad.

El método de la invención puede realizarse en un formato cualitativo, que determina la presencia o ausencia de proteína marcadora de cáncer en la muestra, o en un formato cuantitativo, que, además, proporciona una medida de la cantidad de proteína marcadora de cáncer presente en la muestra. La cantidad de proteína marcadora presente en una muestra puede calcularse utilizando cualquiera de las técnicas antes descritas. En este caso, antes de realizar el ensayo, es necesario trazar una curva patrón midiendo la señal obtenida, usando la misma reacción de detección que se usará para el ensayo, de una serie de muestras estándares que contienen concentraciones conocidas de la proteína marcadora de cáncer. La cantidad de marcador de cáncer presente en una muestra a escrutar se interpola luego en la curva patrón.

Si es necesario verificar la presencia de cierto número de proteínas marcadoras de cáncer en una muestra, el ensayo de la invención puede realizarse en una placa de ensayo de múltiples pocillos en donde cada uno de los diferentes autoanticuerpos utilizados se coloca en un pocillo diferente.

El método de la invención puede emplearse en una variedad de situaciones clínicas, tales como, por ejemplo, en la determinación de la predisposición de un individuo al desarrollo de un cáncer, en la detección de modificaciones pre-neoplásicas o carcinógenas en pacientes asintomáticos, en el diagnóstico de cáncer primario o secundario, en la monitorización del progreso de la enfermedad en un paciente, en el escrutinio de la recidiva de modificaciones carcinógenas en un paciente que previamente ha sido diagnosticado como portador de células cancerosas y ha recibido terapia para reducir el número de estas células o en la elección del tratamiento anti-cancerígeno más apropiado para un paciente que padece cáncer. El método de la invención también es adecuado para uso veterinario en las mismas situaciones clínicas que las descritas anteriormente.

El método de ensayo de la invención puede emplearse para detectar proteínas marcadoras de cáncer que están asociadas a una variedad de cánceres, tales como, por ejemplo, linfomas, leucemia, cánceres de mama, cánceres colorrectales, cánceres de pulmón, cánceres pancreáticos, cánceres de próstata, cánceres del cuello del útero, cánceres de ovario, cánceres endometriales y cánceres de la piel. El método de la invención es particularmente adecuado para detectar y monitorizar cáncer de mama primario (abreviadamente PBC por la expresión inglesa primary breast cancer) y cáncer de mama avanzado (abreviadamente ABC por la expresión inglesa advanced breast cancer).

En un segundo aspecto, la invención proporciona autoanticuerpos y reactivos que comprenden dichos autoanticuerpos para uso en el ensayo, que reconocen específicamente al menos un epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer de mamífero. Dichos autoanticuerpos pueden aislarse de la sangre de los monocitos de sangre periférica de dicho mamífero, preferiblemente un ser humano. Alternativamente, los autoanticuerpos pueden ser producidos por linfocitos B inmortalizados y dirigidos a un antígeno originado en el mamífero propiamente dicho. Los reactivos que comprenden autoanticuerpos de acuerdo con este aspecto de la invención son particularmente adecuados para uso en la detección de proteínas marcadoras asociadas al cáncer de mamífero en fluidos corporales. Los autoanticuerpos preferidos para usar en el ensayo incluyen aquellos contra las formas asociadas al cáncer de la glicoproteína MUC1 (Batra, SK. et al., (1992) Int J. Pancreatology 12: 271-283), la proteína c-myc reguladora de la transducción de señal/ciclo celular (Blackwood, E. M. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell 5: 597-609), p. 53 (Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 3257-3262), c-erb\beta2 (Dsouza, B. et al. (1993) Oncogene 8: 1797-1806) y Ras (Gnudi, L. et al., (1997). Mol. Endocrinol. 11: 67-76). Sin embargo, en este ensayo pueden emplearse autoanticuerpos contra otras proteínas marcadoras asociadas al cáncer. Son particularmente adecuados para la detección de cánceres de mama los autoanticuerpos contra una proteína modificada MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc, c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama primario y los autoanticuerpos contra una proteína modificada MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc, c-erb\beta2 o Ras asociada con cáncer de mama avanzado. Estos autoanticuerpos proceden preferiblemente de pacientes a las que se ha diagnosticado el mismo tipo de cáncer que al que está asociada esta proteína marcadora de cáncer.

La invención también proporciona poblaciones de células inmortalizadas capaces de producir los autoanticuerpos anteriores.

Las poblaciones de células de la invención pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica. Como se describirá con detalle en el Ejemplo 1 más adelante, las células B de pacientes a las que se había diagnosticado cáncer pueden, por ejemplo, ser inmortalizadas con el virus de Epstein-Barr. Pueden aplicarse técnicas ELISA u otras cualesquiera similares para escrutar la producción de autoanticuerpos, utilizando proteínas marcadoras obtenidas de un paciente afectado de cáncer que han sido inmovilizadas en un soporte sólido.

La invención proporciona además kits para detectar una o más proteínas marcadoras asociadas al cáncer en los fluidos biológicos de un mamífero. Dichos kits incluyen al menos autoanticuerpos de mamíferos dirigidos contra uno o más epítopos de una proteína marcadora asociada al cáncer y medios para detectar la formación de complejos entre los autoanticuerpos y la proteína marcadora asociada al cáncer. Preferiblemente, los autoanticuerpos se inmovilizan sobre una superficie sólida.

La presente invención se entenderá más con referencia a los siguientes Ejemplos y a las Figuras que se acompañan en las que:

La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo ELISA para examinar la reactividad de autoanticuerpos producidos por células B procedentes de seis pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama (1 a 4, con cáncer de mama primario, 7 y 11 con cáncer de mama avanzado). Para cada grupo de autoanticuerpos, se usaron como antígenos inmovilizados la proteína MUC1 purificada de la misma paciente de la cual se tomaron las células B, de otras pacientes o de mujeres normales. La reactividad del anticuerpo monoclonal anti-MUC1 B55 de ratón en un ensayo paralelo se incluye como control comparativo. Como controles negativos se usa solución salina tamponada con fosfato (abreviadamente PBS por la expresión inglesa phosphate buffered saline) o anticuerpos producidos por linfocitos B procedentes de 4 mujeres sanas (N10, N12, N13 y N14). La MUC1 se eluyó en columnas de inmunoafinidad usando glicina 0,25 M pH 2,5.

La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo ELISA para determinar la reactividad de autoanticuerpos obtenidos de células B procedentes de pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama primario con la proteína MUC1 de diferentes fuentes. La reactividad de B55 se incluye como control comparativo. Se usa PBS como control negativo.

La Figura 3 muestra los resultados de un experimento de resonancia de plasmón superficial para medir la unión de los autoanticuerpos producidos por células B procedentes de pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama primario a la proteína MUC1 aislada (a) del suero de pacientes con cáncer de mama avanzado o (b) de la orina de individuos normales.

La Figura 4 muestra la secuencia del péptido que se usó para purificar por inmunoafinidad los anticuerpos MUC1 de los sueros de pacientes con cáncer de mama avanzado.

La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo ELISA que emplea autoanticuerpos inmovilizados de una paciente con (2) cáncer de mama primario o (3) cáncer de mama avanzado para detectar la proteína MUC1 purificada del suero de una paciente a la que se había diagnosticado cáncer de mama avanzado o de la orina de una mujer sana. Se incluye como ejemplo comparativo el resultado de un ensayo paralelo que utiliza el anticuerpo C595 anti-MUC1 (1).

La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo ELISA que utiliza autoanticuerpos inmovilizados de las células B de pacientes con cáncer de mama primario para detectar la proteína MUC1 en muestras de suero de individuos sanos o de pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama primario o avanzado. Se incluyen como ejemplos comparativos los resultados obtenidos con el anticuerpo C595 en un ensayo paralelo.

La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo ELISA usando autoanticuerpos inmovilizados de células B de pacientes con cáncer de mama primario para detectar la proteína MUC1 en muestras secuenciales de suero de una paciente con cáncer de mama avanzado durante el progreso de la enfermedad. Los resultados obtenidos con el anticuerpo monoclonal C595 en un ensayo paralelo o con el ensayo comercial CA15-3 se incluyen como ejemplos comparativos.

La Figura 8 muestra los resultados de cierto número de determinaciones de la reactividad de sueros de pacientes con cáncer de mama con MUC1 de ABC y MUC1 de orina.

Ejemplo 1 Inmortalización de mononucleocitos

Los mononucleocitos de sangre periférica se purificaron de una muestra de 4 ml de sangre heparinizada de pacientes o mujeres normales usando medio de separación de linfocitos (flujo ICN), como se describe con detalle en las instrucciones del fabricante. Los mononucleocitos aislados se lavaron en PBS y se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de una preparación semipurificada del virus de Epstein-Barr (EBV) a partir de la línea celular B95-8 productora de EBV de leucocitos transformados del mono tití. Las células se incubaron luego durante 1 hora a 37ºC en CO_{2} al 5% y se centrifugaron a 17000 rpm. El líquido sobrenadante de EBV se separó y los mononucleocitos se lavaron tres veces con medio RPMI, se volvieron a poner en suspensión en medio RPMI suplementado con suero de bovino fetal al 10% y 5 \mug/ml de fitohematoaglutinina (PHA-P) y se sembraron en placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos. El medio se cambió cada 3 días y se usó como una fuente de autoanticuerpos.

Ejemplo 2 Determinación de la reactividad de autoanticuerpos con el antígeno MUC1 de diferentes fuentes Métodos 1) Purificación por inmunoafinidad del antígeno MUC1

El antígeno MUC1 se purificó del suero de pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama primario o avanzado o de la orina de mujeres sanas de acuerdo con el protocolo siguiente.

El anticuerpo monoclonal de ratón B55 (también conocido como NCRC 11 que ha sido descrito por Ellis et al., (1984) en Histopathology 8: 501-516 y en la solicitud de patente internacional Nº WO 89/01153) se conjugó a perlas de CNBr-Sepharose. Se diluyeron 1/10, muestras de suero u orina en PBS y se incubaron con las perlas de Sepharose conjugadas al anticuerpo durante una noche a 4ºC con rodadura. Las perlas se centrifugaron y se retiró el líquido sobrenadante. Para separar cualquier molécula no unida específicamente a las perlas, estas se lavaron con PBS 5 veces o hasta que el tampón de lavado no mostró absorbancia a 280 nm. Cada lavado se realizó volviendo a poner en suspensión las perlas en PBS, haciéndolas rodar durante 10 minutos, centrifugando y retirando el líquido sobrenadante. Las perlas lavadas se volvieron a poner en suspensión en glicina 0,25 M pH 2,5, se hicieron rodar a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifugaron. El líquido sobrenadante se retiró, se ajustó a pH 7 por adición de TRIS y se conservó a 4ºC etiquetándose "fracción de glicina". Las perlas se volvieron a poner en suspensión luego en dietilamina 25 mM (DEA) pH 11, se hizo rodar a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifugaron. El líquido sobrenadante se retiro de nuevo, se ajustó a pH 7 por adición de TRIS y se conservó a 4ºC etiquetándose "fracción 25 DEA". Finalmente las perlas se volvieron a poner en suspensión en DEA 100 mM pH 11, se hicieron rodar a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifugaron. El líquido sobrenadante se retiró, se ajustó a pH 7 por adición de TRIS y se conservó a 4ºC etiquetándose "fracción 100 DEA". La presencia de MUC1 en las tres fracciones se confirmó por ELISA usando el anticuerpo monoclonal B55 o C595 (también conocido como NCRC proporcionado por Cancer Research Campaign). Para retirar las inmunoglobulinas contaminantes, las fracciones se incubaron con DTT (a 50 mM) durante 30 minutos, y luego yodoacetamida (a 75 mM) antes de ser sometidas a filtración por gel en una columna de S300. Se analizó el contenido de MUC1 de las fracciones por ELISA. Las frac-
ciones que contenían MUC1 se titularon de modo que dieran absorbancias equivalentes a las de las tandas previas.

2) Ensayo ELISA

Las diferentes preparaciones de MUC1, obtenidas como se ha descrito antes, se diluyeron apropiadamente con PBS y se cultivaron en placas a 50 \mul por pocillo en una microplaca de ensayo de 96 pocillos y se dejó secar durante la noche. La placa se lavó luego una vez con PBS/Tween para retirar los cristales de sal residuales, se bloqueó durante 60 minutos con una solución recientemente preparada de polivinilpirrolidona (PVP) al 2% (p/v) en PBS y se lavó tres veces con PBS/Tween. El líquido sobrenadante del cultivo de linfocitos inmortalizados procedentes de pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama primario o secundario se cultivó en placas por triplicado, a 50 \mul por pocillo. Como control comparativo también se cultivo por triplicado el anticuerpo B55 monoclonal anti-MUC1 de ratón. La placa se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación y se lavó cuatro veces con PBS/Tween. Se añadieron 50 \mul de anticuerpo secundario anti-humano o anti-ratón conjugado a HRP (obtenido de Dako) a cada pocillo a la dilución recomendada por el fabricante, y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación. La placa se lavó luego de nuevo cuatro veces con PBS/Tween. Se añadieron 50 \mul de tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo y se leyó cinéticamente la densidad óptica (DO) a 650 nm para cada pocillo de la placa de ensayo durante un periodo de 10 minutos.

Resultados

La Figura 1 muestra el resultado de un ensayo ELISA para determinar la reactividad de autoanticuerpos producidos por linfocitos procedentes de seis pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama (1 a 4, con cáncer de mama primario, 7 y 11 con cáncer de mama avanzado) con la proteína MUC1 purificada de la misma paciente de la cual se tomó el anticuerpo, de otras pacientes o de mujeres sanas. Las mujeres sanas que participaron en este estudio eran mujeres que no habían presentado signos clínicos y/o mamográficos de cáncer de mama. La reactividad del anticuerpo B55 monoclonal anti-MUC1 se midió como control comparativo. Los anticuerpos producidos por linfocitos de cuatro sujetos sanos (N10 a N14) se usaron como control negativo.

Los resultados presentados demuestran que los linfocitos B procedentes de pacientes con cáncer de mama producen autoanticuerpos que son capaces de reconocer la proteína MUC1 aislada tanto de las mismas pacientes como de diferentes pacientes. Además, estos autoanticuerpos se unen con alta especificidad a MUC1 presente en pacientes con cáncer, no mostrando casi reactividad con MUC1 aislada de individuos sanos. Estos resultados son altamente reproducibles, puesto que diferentes autoanticuerpos muestran un perfil de reactividad muy similar con la proteína MUC1 purificada de diferentes fuentes. Además, los resultados obtenidos también indican que la sensibilidad de los autoanticuerpos para MUC1 asociada al cáncer es mucho mayor que la observada para el anticuerpo monoclonal B55. Además, los anticuerpos producidos por linfocitos de pacientes normales no mostraron este perfil.

La Figura 2 muestra la reactividad de autoanticuerpos secretados por linfocitos B inmortalizados derivados de pacientes con cáncer de mama primario con la proteína MUC1 de diferentes fuentes, en comparación con la de B55. El perfil de reactividad de los diferentes autoanticuerpos es de nuevo muy reproducible. Los autoanticuerpos muestran alta especificidad para la MUC1 presente en el suero de pacientes con cáncer y no tienen casi afinidad por la MUC1 aislada de mujeres sanas o de la línea celular de cáncer de mama ZR75-1. Además, la afinidad de los autoanticuerpos por la proteína MUC1 asociada al cáncer de mama primario o cáncer de mama avanzado es mucho más alta que la medida para B55.

Ejemplo 3 Medida de la afinidad de autoanticuerpos con resonancia de plasmón superficial Métodos

La resonancia de plasmón superficial se realizó en un aparato Iasys Biosensor Plus (de Affinity Sensor). La proteína MUC1 de pacientes con cáncer de mama avanzado y de individuos normales se adhirió a células revestidas con aminosilano siguiendo las instrucciones del fabricante y las células se bloquearon con polivinilpirrolidona (PVP) al 1% (p/v). También se produjeron células de control revestidas solamente con PVP al 1%. Se midió la unión de diferentes diluciones del líquido sobrenadante de cultivo de células B de pacientes con cáncer de mama primario usando las siguientes condiciones experimentales:

\newpage

Intervalo de muestreo:	0,3 milisegundos
Velocidad del agitador:	70 rpm
Temperatura:	24ºC
Tiempo de unión:	3 minutos
Disociación con PBS:	2 minutos
Regeneración con HCl 20 mM:	3 minutos
Re-equilibración con PBS:	5 minutos

Resultados

La Figura 3 muestra que los autoanticuerpos producidos por linfocitos B procedentes de una paciente con cáncer de mama primario se unen con una afinidad mucho mayor a MUC1 aislada de otra paciente con cáncer de mama que a la MUC1 aislada de una mujer sana.

Ejemplo 4 Detección del antígeno MUC1 en ensayos ELISA utilizando autoanticuerpos Método 1) Purificación de autoanticuerpos anti-MUC1 de sueros

El péptido TAP2 de MUC1, con la secuencia mostrada en la Figura 4, se conjugó a perlas de CNBr-Sepharose. Los sueros reunidos de pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama avanzado se diluyeron 1/10 en PBS y se incubaron con las perlas conjugadas con Sepharose durante una noche a 4ºC con rodadura (en la relación de 25 ml de suero a 1 ml de perlas). Después de centrifugación se retiró el líquido sobrenadante y las perlas se lavaron 5 veces con PBS o hasta que la absorbancia a 280 nm fuera cero. Cada lavado se realizó volviendo a poner en suspensión las perlas en PBS, haciéndolas rodar 10 minutos, centrifugando y separando el líquido sobrenadante. Las perlas se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de tiocianato de sodio 3 M en PBS, se hicieron rodar a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifugaron. El líquido sobrenadante se retiró y se dializó frente a PBS a 4ºC. El contenido de anti-MUC1 se confirmó luego por ELISA usando como antígeno inmovilizado tanto MCU1 aislada de pacientes con cáncer de mama avanzado como un péptido de MUC1, con la secuencia APDTRTPAPG y conjugado a BSA.

2) Biotinilación de autoanticuerpos anti-MUC1

Los autoanticuerpos obtenidos como se ha descrito antes se concentraron hasta un volumen de 100 \mul usando filtros centrífugos y luego se diluyeron hasta un volumen de 1 ml con tampón de tetraborato sódico 0,1 M de pH 8,8. Se añadieron 20 \mug de N-hidroxisuccinimida-biotina y la solución autoanticuerpos/biotina se incubó durante 4 horas a temperatura ambiente con rodadura. La reacción se detuvo mediante la adición de 10 \mul de NH_{4}Cl 1M e incubación durante 10 minutos. Los autoanticuerpos se dializaron luego frente a PBS durante treinta y seis horas a 4ºC para separar la biotina no unida. Las partes alícuotas de la solución de autoanticuerpos se congelaron y conservaron a -20ºC en la oscuridad hasta su uso.

3) Ensayo ELISA

El líquido sobrenadante de linfocitos procedentes de pacientes con cáncer de mama primario o cáncer de mama avanzado o el anticuerpo C595 monoclonal anti-MUC1 se cultivó en placas a 50 \mul por pocillo en una microplaca de ensayo de 96 pocillos y se incubó una noche a 4ºC. La placa se lavó luego 4 veces con PBS/Tween, se bloqueó durante 60 minutos con una solución recién preparada de polivinilpirrolidona (PVP) al 2% (p/v) en PBS y se lavó dos veces con PBS/Tween. Se añadieron 50 \mul por pocillo de MUC1 de diferentes fuentes. Después de la incubación a temperatura ambiente durante sesenta minutos, la placa se lavó de nuevo cuatro veces con PBS/Tween. 50 \mul del anticuerpo secundario biotinilado apropiado, bien sea C595 o autoanticuerpo purificado de una mezcla de sueros de una paciente con cáncer de mama avanzado, preparado como se ha descrito antes, se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de 4 lavados con PBS/Tween, se añadieron 50 \mul de estreptavidina-HRP a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos. La placa se lavó de nuevo cuatro veces, se añadieron 50 \mul de TMB a cada pocillo y se leyó cinéticamente la densidad óptica (DO) a 650 nm para cada pocillo de la placa de ensayo durante un periodo de 10 minutos.

Resultados

La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo ELISA utilizando como anticuerpos inmovilizados los autoanticuerpos producidos por linfocitos B procedentes de pacientes con cáncer de mama primario o avanzado, en comparación con los obtenidos en un ensayo paralelo con el anticuerpo C595 monoclonal anti-MUC1. Los datos indican que pueden usarse los autoanticuerpos de pacientes con cáncer de mama en ensayos ELISA para detectar específicamente las formas modificadas de la proteína MUC1 asociada al cáncer. Estos ensayos son más sensibles y muestran mayor especificidad que los que utilizan el anticuerpo C595 monoclonal.

Ejemplo 5 Uso del ensayo para detectar proteínas MUC1 en muestras de suero de pacientes

Se realizó un ensayo ELISA, como se ha descrito en el Ejemplo 4, en muestras de suero de individuos sanos o pacientes con cáncer de mama primario o avanzado, utilizando como anticuerpos inmovilizados los autoanticuerpos producidos por linfocitos B procedentes de pacientes con cáncer de mama primario. Se realizó un ensayo paralelo utilizando el anticuerpo C595 monoclonal anti-MUC1 en las mismas muestras. Los resultados, mostrados en la Figura 6, indican que el ensayo que emplea autoanticuerpos puede detectar con alta sensibilidad MUC1 circulante en la sangre de pacientes con cáncer de mama. Además, contrariamente a la utilización del anticuerpo C595 monoclonal, este ensayo tiene una especificidad muy alta para formas de MUC1 asociadas al cáncer

Ejemplo 6 Uso del ensayo para controlar el progreso de la enfermedad

Se realizó un ensayo ELISA, como se ha descrito en el Ejemplo 4, sobre muestras de suero secuenciales de una paciente a la que se había diagnosticado cáncer metastásico durante el progreso de la enfermedad, usando como anticuerpos inmovilizados los autoanticuerpos producidos por linfocitos B procedentes de pacientes con cáncer de mama primario o el anticuerpo C595 monoclonal anti- MUC1. El ensayo comercial CA15-3 también se realizó sobre las mismas muestras. La Figura 7 muestra que puede usarse el ensayo que emplea autoanticuerpos para seguir el progreso del cáncer en una paciente, en donde los niveles crecientes de MUC1 detectados en el ensayo indican exacerbación de la enfermedad. Los datos también demuestran que el uso de autoanticuerpos conduce a resultados que representan mejor el desarrollo de la enfermedad que los obtenidos con el anticuerpo C959 o con el ensayo CA15-3.

Ejemplo 7 Comparación de la especificidad de los autoanticuerpos anti-MUC1 para MUC1 de orina o de ABC Método

Se obtuvieron preparaciones de MUC1 de ABC (MUC1 aislada del suero de pacientes a las que se había diagnosticado cáncer de mama avanzado) y MUC1 de orina como se describe en el Ejemplo 2.

Partes alícuotas preparaciones de MUC1 de ABC y de orina se secaron sobre los pocillos de microplacas por separado a concentraciones que proporcionaban la unión a NCRC-11 equivalente. Después de bloquear con PVP al 2%, se añadieron a los pocillos muestras de suero tomadas de pacientes con cáncer de mama, diluidas 1/100 con PBS, y se dejó que se unieran los anticuerpos anti-MUC1 contenido en los sueros. Después de lavado, los anticuerpos unidos se sondaron con IgM-HRP anti-humana y conjugados de IgG-HRP anti-humana.

Resultados

La Figura 8 muestra los resultados de cierto número de determinaciones de reactividad de sueros de pacientes con cáncer de mama con MUC1 de ABC y de orina. Los sueros de la mayoría de las pacientes exhibían claramente mayor especificidad para la MUC1 de ABC en comparación con la MUC1 de orina.

Claims

1. Un método in vitro para detectar una proteína marcadora asociada al cáncer, presente en un fluido corporal de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a): poner en contacto una muestra del fluido corporal de dicho mamífero, con anticuerpos dirigidos contra al menos un epítopo de dicha proteína marcadora; y

en donde dichos anticuerpos son autoanticuerpos de mamífero para dicha proteína marcadora asociada al cáncer que proceden de la misma especie que el mamífero, del cual se ha obtenido dicha muestra, y en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma modificada de una proteína de tipo natural.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde dicha muestra es de un mamífero sustancialmente asintomático de pre-neoplasia o cáncer.

3. Un método según la reivindicación 1, en donde dicha muestra es de un mamífero sintomático de cáncer.

4. Un método según la reivindicación 1, en donde dicha muestra es de un mamífero que ha recibido terapia para cáncer.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el mamífero es un ser humano y los autoanticuerpos son autoanticuerpos humanos.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho fluido corporal es plasma, suero, sangre completa, orina, heces, linfa, fluido cerebroespinal o aspirado de pezón.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer está asociada a linfomas, leucemias, cánceres de mama, cánceres colorrectales, cánceres de pulmón, cánceres pancreáticos, cánceres de próstata, cánceres del cuello del útero, cánceres de ovario, cánceres endometriales o cánceres de la piel.

8. Un método según la reivindicación 7, en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una proteína marcadora asociada al cáncer de mama.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma asociada al cáncer de la proteína MUC1, BRCA1, p53, c-myc, c-erb\beta2 o Ras.

10. Un método según la reivindicación 8, en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc, c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama primario.

11. Un método según la reivindicación 8, en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc, c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama avanzado.

12. Un método según la reivindicación 10, en donde dichos autoanticuerpos se obtienen a partir de monocitos aislados de una paciente con cáncer de mama primario.

13. Un método según la reivindicación 11, en donde dichos autoanticuerpos se obtienen de monocitos aislados de una paciente con cáncer de mama avanzado.

14. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichos autoanticuerpos son producidos por una célula o población de células inmortalizadas.

15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dichos autoanticuerpos son anticuerpos policlonales.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichos autoanticuerpos está inmovilizados sobre una superficie sólida.

17. Un método según la reivindicación 16, en donde los complejos formados entre dichos autoanticuerpos y cualquier proteína marcadora asociada al cáncer presente en dicha muestra se detectan usando anticuerpos secundarios o autoanticuerpos específicos para al menos un epítopo de dicha proteína marcadora, llevando dichos autoanticuerpos secundarios un marcador detectable.

18. Un método según la reivindicación 16, en donde además se añade a dicha muestra una proteína marcadora asociada al cáncer marcada que lleva al menos un epítopo reconocido por dichos autoanticuerpos.

19. Uso de un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para escrutar la recidiva de cáncer después de un tratamiento, para monitorizar las terapias sistémicas o para seleccionar las terapias.

20. Un reactivo de diagnóstico que comprende autoanticuerpos de mamífero con una especificidad para al menos un epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer de mamífero, en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma modificada de una proteína de tipo natural.

21. Un reactivo de diagnóstico según la reivindicación 20, para uso en la detección de la presencia de una proteína marcadora asociada al cáncer de mamífero en una muestra de fluido corporal.

22. Un reactivo según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en donde dichos autoanticuerpos son autoanticuerpos humanos y dicha proteína marcadora es una proteína marcadora asociada al cáncer humana.

23. Un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, en donde dichos autoanticuerpos tiene especificidad para al menos un epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer asociada a linfomas, leucemias, cánceres de mama, cánceres colorrectales, cánceres de pulmón, cánceres pancreáticos, cánceres de próstata, cánceres del cuello del útero, cánceres de ovario, cánceres endometriales o cánceres de la piel.

24. Un reactivo según la reivindicación 23, en donde dichos autoanticuerpos tiene especificidad para al menos un epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer de mama.

25. Un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en donde dicha proteína marcadora es una forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc, c-erb\beta2 o Ras.

26. Un reactivo según la reivindicación 24, en donde dicha proteína marcadora es una forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc, c-erb\beta32 o Ras asociada al cáncer de mama primario.

27. Un reactivo según la reivindicación 24, en donde dicha proteína marcadora es una forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc, c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama avanzado.

28. Un reactivo según la reivindicación 26 en donde dichos autoanticuerpos se obtienen de monocitos aislados de una paciente con cáncer de mama primario.

29. Un reactivo según la reivindicación 27, en donde dichos autoanticuerpos se obtienen de monocitos aislados de una paciente con cáncer de mama avanzado.

30. Una población de células inmortalizadas capaz de producir autoanticuerpos dirigidos contra al menos un epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer de mamífero, en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma modificada de una proteína de tipo natural.

31. Una población de células inmortalizadas según la reivindicación 30, que es capaz de producir autoanticuerpos dirigidos contra al menos un epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer humana.

32. Una población de células inmortalizadas según la reivindicación 31 o la reivindicación 32, en donde dichos autoanticuerpos se dirigen contra al menos un epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer asociada a linfomas, leucemias, cánceres de mama, cánceres colorrectales, cánceres de pulmón, cánceres pancreáticos, cánceres de próstata, cánceres del cuello del útero, cánceres de ovario, cánceres endometriales o cánceres de la piel.

33. Una población de células inmortalizadas según la reivindicación 32, en donde dichos autoanticuerpos están dirigidos contra un epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer de mama.

34. Una población de células inmortalizadas según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en donde dichos autoanticuerpos están dirigidos contra una forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc, cerb\beta2 ó Ras.

35. Una población de células inmortalizadas según la reivindicación 33, en donde dichos autoanticuerpos son autoanticuerpos para una forma asociada al cáncer de la proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, c-myc, p53, c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama primario.

36. Una población de células inmortalizadas según la reivindicación 33, en donde dichos autoanticuerpos son autoanticuerpos para una forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, c-myc, c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama avanzado.

37. Una población de células inmortalizadas según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 36, que procede de linfocitos B aislados de una paciente o un grupo de pacientes que tiene cáncer u otra neoplasia.

38. Una población de células inmortalizadas según la reivindicación 35, en donde dicha población de células procede de linfocitos B de una paciente o grupo de pacientes que tienen cáncer de mama primario.

39. Una población de células inmortalizadas según la reivindicación 36, en donde dicha población de células procede de linfocitos B de una paciente o grupo de pacientes con cáncer de mama avanzado.

40. Un kit para detectar una proteína marcadora asociada al cáncer presente en un fluido corporal de un mamífero, comprendiendo dicho kit:

(a): autoanticuerpos de mamífero dirigidos contra una proteína marcadora asociada al cáncer de la misma especie que dichos autoanticuerpos; y

(b): medios para detectar la formación de complejos entre dichos autoanticuerpos y dicha proteína marcadora asociada al cáncer;

en donde dicha proteína marcadora asociada al cáncer es una forma modificada de una proteína de tipo natural.

41. Un kit según la reivindicación 40, en donde dichos autoanticuerpos son autoanticuerpos humanos.

42. Un kit según la reivindicación 40 ó 41, en donde dichos autoanticuerpos son autoanticuerpos humanos.

43. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, en donde dicha proteína marcadora es una proteína marcadora asociada al cáncer asociada a linfomas, leucemias, cánceres de mama, cánceres colorrectales, cánceres de pulmón, cánceres pancreáticos, cánceres de próstata, cánceres del cuello del útero, cánceres de ovario, cánceres endometriales o cánceres de la piel.

44. Un kit según la reivindicación 43, en donde dicha proteína marcadora es una proteína marcadora asociada al cáncer de mama.

45. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 44, en donde dicha proteína marcadora es una forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc, c-erb\beta2 o Ras.

46. Un kit según la reivindicación 45, en donde dicha proteína marcadora es una forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, c-myc, p53, c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama primario.

47. A kit según la reivindicación 45, en donde dicha proteína marcadora es una forma asociada al cáncer de una proteína MUC1, BRCA1, BRCA2, p53, c-myc, c-erb\beta2 o Ras asociada al cáncer de mama avanzado.