ES2257548T3 - Un metodo para medir la polimerizacion de adn y aplicaciones del metodo. - Google Patents
Un metodo para medir la polimerizacion de adn y aplicaciones del metodo.Info
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Abstract
Un método para medir la polimerización de ADN dependiente de ADN en una muestra biológica, que comprende las etapas de: a) proporcionar un cebador con una secuencia específica corta monocatenaria, que es incapaz de formar pares de bases de modo interno, unido a una fase sólida, b) poner en contacto el constructo del cebador con una mezcla de reacción que contiene un constructo del molde de desoxinucleótidos monocatenarios compuesto, desde el extremo 5'', de un polímero (A)n, una parte variable (CTGA)m, y una secuencia complementaria con el cebador y los cuatro desoxinucleósidos trifosfato, uno de los cuales está modificado de forma que un anticuerpo marcado lo reconoce de manera específica, c) añadir una muestra biológica que comprende la ADN polimerasa a la mezcla de b), d) permitir que se desarrolle la reacción de polimerasa, e) incubar el producto de reacción inmovilizado resultante de d) con el anticuerpo marcado, f) detectar la cantidad de anticuerpo marcado unido con la ayuda del marcador utilizado, y g) medir la cantidad de desoxinucleótido trifosfato modificado incorporado como una medida de la polimerización de ADN, con la ayuda del marcador del anticuerpo unido.
Description
Un método para medir la polimerización de ADN y
aplicaciones del método.
La presente invención se refiere a un método para
medir la polimerización de ADN y las aplicaciones del método. Más
concretamente, la invención se refiere a un método para medir la
polimerización de ADN dependiente de ADN.
En las últimas décadas se ha experimentado un
rápido desarrollo de nuevos métodos para la medida de la
polimerización de ADN dependiente de ARN por transcripción inversa
(véase, por ejemplo, el documento WO 01/01129). La cuestión, más
compleja, que concierne a los métodos para la cuantificación de la
polimerización de ADN dependiente de ADN, hasta la fecha, ha
recibido mucha menos atención.
Los ensayos clásicos de actividad de ADN
polimerasa implican el uso de ADN tratado con ADNasa ("ADN
activado") como cebador/molde, y la incorporación de nucleótidos
marcados radiactivamente en el ADN (Aposhian y Komberg, 1962). La
medida de la radiactividad precipitable en los ácidos permite el
cálculo de la cantidad de nucleótidos incorporados y del número de
unidades enzimáticas presentes. Sin embargo, en la actualidad, en
muchos laboratorios el uso de radiactividad está restringido y se
rechaza y, debido a esto, existe una tendencia general a apartarse
de las técnicas basadas en la radiactividad.
Para las ADN polimerasas, se encuentra disponible
un ensayo comercial basado en la detección mediante ELISA de
nucleótidos marcados con digoxigenina incorporados en ADN recién
creado (Roche Molecular Biochemicals, nº de catálogo 1468120,
documento US5635354). Este ensayo tiene el inconveniente de utilizar
dos análogos de sustrato de nucleótidos diferentes que portan
grupos voluminosos, la digoxigenina como marcador y la biotina para
la inmovilización del producto. Como resultado, la velocidad de la
reacción de la polimerización y la posterior sensibilidad de la
detección se reducen. La utilización de análogos de sustrato con
propiedades cinéticas muy desviadas hace que este sistema sea menos
relevante para los estudios de susceptibilidad a fármacos de
diferentes polimerasas.
Otro método alternativo más atractivo es un
ensayo basado en la fluorescencia para la holoenzima de la ADN
polimerasa, basado en la reacción específica del tinte PicoGreen con
ADN bicatenario (Seville et al., 1996). Este último proceso
ha sido modificado recientemente para que sea más adecuado para una
gama más amplia de diferentes enzimas polimerizantes del ADN (Tveit
y Kristensen, 2001). Este ensayo es sencillo desde el punto de
vista técnico y se basa en la utilización de nucleótidos naturales.
Sin embargo, la sensibilidad de la detección se encuentra en el
mismo intervalo que el ensayo de radiactividad de ADN polimerasa
clásico, y las aplicaciones descritas demuestran un intervalo de
detección de 0,05-0,5 U de ADN
polimerasa/muestra.
En la actualidad, la terapia del VIH se basa en
una terapia de múltiples fármacos. Los regímenes se basan en
combinaciones de los tres tipos de fármacos disponibles: análogos de
nucleósidos, análogos no nucleosídicos e inhibidores de proteasas.
La estrategia consiste en minimizar la probabilidad de que un virus
mutante sobreviva.
Los inhibidores de la transcriptasa inversa
("reverse transcriptase", RT) son análogos de nucleósidos o
análogos no nucleosídicos. Los inhibidores no nucleosídicos se unen
a un bolsillo hidrófobo en la enzima de RT próximo, pero no
contiguo, al sitio activo. La replicación del VIH-1
se inhibe de modo alostérico, mediante el desplazamiento de los
restos aspartato catalíticos con relación al sitio de unión de la
polimerasa.
Los inhibidores de nucleósidos utilizados en la
actualidad terminan el alargamiento de la cadena de ADN, puesto que
carecen de un grupo 3'-hidroxilo. Una terapia
prolongada con inhibidores de nucleósidos conduce, habitualmente,
al desarrollo de virus resistentes. Este proceso está asociado con
la aparición gradual de mutaciones en el gen pol del virus,
conduciendo cada una a sustituciones definidas de aminoácidos (para
un informe, véase Vandamme et al., 1998). Los efectos de
estas sustituciones a nivel enzimático son complicados, e incluyen
la potenciación de una función de edición de ADN primitiva. Esta
reacción es dependiente de nucleótidos y produce dinucleósido
polifosfato y un extremo 3' extensible en el ADN (Arion et
al., 1998; Meyer et al., 1999).
La RT del VIH-1, así como otras
transcriptasas inversas, realiza tres reacciones enzimáticas
diferentes: la polimerización de ADN dependiente de ARN, la
polimerización de ADN dependiente de ADN, y la degradación de ARN
en el híbrido ADN-ARN (ARNasa H). La transcriptasa
inversa del VIH, codificada por el gen pol, es un heterodímero que
consiste en una subunidad p66 y una subunidad p51. La polimerización
de ADN dependiente de ARN y la polimerización de ADN dependiente de
ADN son realizadas por el mismo sitio activo localizado en la
subunidad p66 (para un informe, véase Goff, 1990). El mecanismo de
reacción de estos fármacos se ha definido, principalmente, según su
acción sobre la reacción de polimerización de ADN dependiente de
ARN. El efecto sobre la polimerización de ADN dependiente de ADN ha
sido comparativamente menos estudiada.
Siempre que el mecanismo de reacción y el fármaco
metabolizado activo sean conocidos y estén disponibles, puede
determinarse la susceptibilidad al fármaco del virus fenotípico a
nivel enzimático. Dependiendo de la capacidad de los ensayos
enzimáticos y de las técnicas de aislamiento del virus utilizadas,
el ensayo de la sensibilidad al fármaco puede realizarse, en
teoría, con los sobrenadantes procedentes de la propagación del
cultivo de virus, el aislamiento del virus primario, o sobre
preparaciones de virus recuperados directamente de los pacientes.
El ensayo de actividad RT convencional se realiza utilizando una
construcción artificial de molde-cebador, y
desoxinucleósido trifosfato marcado como sustrato de nucleótidos. El
par molde/cebador de poli(rA)/oligo(dT) es el más
eficaz y es la combinación más utilizada para la determinación del
VIH, así como para otras RT de retrovirus. Un inconveniente de este
tipo de ensayo, cuando está implicado el ensayo de sensibilidad al
fármaco, es que sólo pueden ensayarse análogos no nucleosídicos o
análogos que pueden formar pares de bases con rA. Los análogos de
otras bases de nucleótidos requieren un ensayo basado en un molde de
polímero variable. Los polímeros de ARN que contienen bases de
pirimidina son notoriamente sensibles a las ARNasas y, en la
práctica, no son compatibles con muestras biológicas. Por tanto,
sería ventajoso basar un ensayo de polimerasa previsto para el
ensayo de la sensibilidad al fármaco sobre un molde de ADN variable,
con la condición de que este sistema de ensayo produzca resultados
que se correlacionen con los obtenidos de la inhibición de la
transcripción inversa y los ensayos clásicos de resistencia a
fármacos fenotípicos.
La terapia del VIH utilizada en la actualidad es
sólo un ejemplo de la potencia de los inhibidores de ADN polimerasa.
La situación actual con respecto al desarrollo de resistencia entre
bacterias y otros microorganismos motiva la búsqueda de nuevas
clases de fármacos antimicrobianos. Las ADN polimerasas son una de
las principales dianas durante este esfuerzo. Así, existe una gran
demanda de ensayos de polimerasas sencillos desde el punto de vista
técnico, que no provoquen peligros medioambientales potenciales y
que puedan aplicarse a la selección de fármacos para una amplia
gama de isozimas de ADN polimerasas microbianas. La toxicidad de los
fármacos potenciales encontrados debe evaluarse aún más frente a
las correspondientes ADN polimerasas de mamífero.
La cuantificación de las polimerasas asociadas a
la proliferación, como la polimerasa-\alpha y
-\delta puede utilizarse para controlar la proliferación celular.
En este contexto, puede mencionarse que los niveles séricos de
timidina quinasa, otra enzima asociada con la proliferación
celular, se utilizan en la actualidad para la prognosis y
clasificación de enfermedades malignas (documento US4637977). La
fosforilación de la timidina es sólo una de las dos vías sintéticas
intracelulares que proporciona timidina trifosfato para la síntesis
de ADN. La medida de la ADN polimerasa en sí misma tiene el
potencial de proporcionar una estimación más correcta de la síntesis
de ADN total, comparada con la actividad timidina quinasa o la
incorporación de timidina.
La presente invención proporciona un ensayo de
ADN polimerasa no radiactivo en un formato de placa de
microvaloración, permitiendo la detección colorimétrica o
fluorimétrica del producto.
En una realización preferida utiliza, como
sustrato de nucleósido trifosfato,
5-bromodesoxiuridina 5'-trifosfato
(BrdUTP). La diferencia en el radio de Van der Waals entre el bromo
en la posición 5' en BrdUTP y el grupo metilo en la posición 5' en
la timidina trifosfato es mínima (1,95 A, comparado con 2,0 A), y
las propiedades cinéticas enzimáticas de estos dos nucleótidos es
bastante similar. El método puede aromatizarse y tener un intervalo
de detección tan bajo con 3 nU de actividad polimerasa/muestra.
Una de las aplicaciones de la presente invención
es el ensayo de susceptibilidad a fármacos. Todos los fármacos
antirretrovíricos aprobados hasta la fecha interfieren con la
reacción enzimática de la proteasa vírica o de la RT. Además, hay
fármacos candidatos en trámite que afectan a la función de la
integrasa retrovírica.
En particular, la presente invención proporciona
un procedimiento para medir una amplia gama de diferentes ADN
polimerasas dependientes de ADN. Ha demostrado ser adecuado incluso
para estudios de sistemas de ADN polimerasa muy procesables, a
pesar del molde comparativamente corto utilizado. Se demuestra la
utilidad para la determinación de la actividad de la polimerasa I y
III bacteriana, la ADN polimerasa \alpha, \beta y \gamma de
mamífero, una actividad polimerasa asociada a la proliferación en
suero humano, y la polimerización de ADN dependiente de ADN por la
RT de VIH, pero el método puede emplearse para estudios de casi
todas las ADN polimerasas víricas y celulares. Una de las
características que distingue el presente ensayo de ADN polimerasa
de la técnica anterior es su notable sensibilidad, que hace posible
una detección de actividad de ADN polimerasa I de E. coli tan
baja como 3 nU.
Por tanto, un aspecto de la invención se dirige a
un método para medir la polimerización de ADN dependiente de ADN en
una muestra biológica, que comprende las etapas de:
a) proporcionar un cebador con una secuencia
específica corta monocatenaria, que es incapaz de formar pares de
bases de modo interno, unido a una fase sólida,
b) poner en contacto el constructo del cebador
con una mezcla de reacción que contiene un constructo del molde de
desoxinucleótidos monocatenarios compuesto, desde el extremo 5', de
un polímero (A)n, una parte variable (CTGA)m, y una
secuencia complementaria con el cebador y los cuatro
desoxinucleósidos trifosfato, uno de los cuales está modificado de
forma que un anticuerpo marcado lo reconoce de manera
específica,
c) añadir una muestra biológica que comprende la
ADN polimerasa a la mezcla de b),
d) permitir que se desarrolle la reacción de
polimerasa,
e) incubar el producto de reacción inmovilizado
resultante de d) con el anticuerpo marcado,
f) detectar la cantidad de anticuerpo marcado
unido con la ayuda del marcador utilizado, y
g) medir la cantidad de desoxinucleótido
modificado incorporado como una medida de la polimerización de ADN,
con la ayuda del marcador del anticuerpo unido.
En otra realización, la polimerización de ADN se
realiza mediante una transcriptasa inversa (RT) de retrovirus, como
la RT del virus de la inmunodeficiencia human (VIH).
En otra realización, el dexosinucleósido
trifosfato modificado es 5-bromodesoxiuridina
5'-trifosfato (BrdUTP), y el anticuerpo marcado es
un anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con
fosfatasa alcalina ("alkaline phosphatase", Ap).
En una realización preferida del método según la
invención, la polimerización de ADN medida se utiliza para el ensayo
de susceptibilidad a fármacos.
El ensayo de susceptibilidad a fármacos se
realiza para evaluar si un fármaco concreto es eficaz en un
individuo mamífero, y el resultado puede utilizarse para seleccionar
una terapia de tratamiento con fármacos para ese individuo. En la
práctica, el individuo se somete a un ensayo en varios momentos para
controlar el desarrollo del tratamiento con fármacos en dicho
individuo.
La invención también está dirigida a un envase
comercial para medir la polimerización de ADN dependiente de ADN
según la invención. El envase comprenderá al menos los siguientes
artículos:
a) un cebador con una secuencia específica corta
monocatenaria, que es incapaz de formar pares de bases de modo
interno, unido a una fase sólida,
b) un constructo del molde de desoxinucleótidos
monocatenarios compuesto, desde el extremo 5', de un polímero
(A)n, una parte variable (CTGA)m, y una secuencia
complementaria con el cebador en a),
c) los cuatro desoxinucleósidos trifosfato, uno
de los cuales está modificado de forma que un anticuerpo marcado lo
reconoce de manera específica, y
d) el anticuerpo marcado que reconoce el
desoxinucleósido trifosfato modificado en c).
El envase contendrá opcionalmente también
instrucciones escritas y/o en un portador de datos para medir la
polimerización de ADN dependiente de ADN según la invención.
La invención se ilustrará a continuación mediante
la siguiente descripción no limitante de las realizaciones y dibujos
de la invención.
Las enseñanzas de la bibliografía citada se
incorporan en la presente como referencia.
La figura 1. demuestra los efectos de la
variación en la secuencia del molde sobre la inhibición de la ADN
polimerasa III con TMAU.
La figura 2. ejemplifica la sensibilidad de
detección del ensayo de ADN polimerasa - RT de VIH-1
de tipo salvaje (\blacklozenge), ADN polimerasa \beta de
mamífero (\bullet), y ADN polimerasa I de E. coli
(\ding{115}).
La figura 3. demuestra la capacidad del ensayo de
ADN polimerasa para medir la inhibición por los análogos de didesoxi
de las cuatro bases de ADN. Símbolos: ddATP (\blacksquare), ddGT
(\blacklozenge), ddCTP (\bullet), y ddTP (\ding{115}).
La figura 4. demuestra que el mecanismo
bioquímico subyaciente a la resistencia al fármaco antivírico
tenofovir está basado en la potenciación de una reacción de
fosforolisis dependiente de ATP. Símbolos: RT de
VIH-1 de tipo salvaje en la disolución de reacción
patrón (\circ), RT de VIH-1 de tipo salvaje en la
disolución de reacción con ATP (\bullet), RT de
VIH-1 mutante en la disolución de reacción patrón
(\lozenge), y RT de VIH-1 mutante en la disolución
de reacción con ATP (\blacklozenge).
La figura 5. ejemplifica la determinación de la
susceptibilidad al fármaco antivírico nevirapina utilizando RT
aisladas de plasma de individuos infectados con VIH. Símbolos:
(\square), (\blacksquare) y (\ding{115}) son RT de individuos
infectados, (\bullet) es un control que consiste en RT de
VIH-1 de tipo salvaje recombinante, y
(\blacklozenge) es un control que consiste en RT de
VIH-1 recombinante mutado (L100I) con resistencia
intermedia a nevirapina.
Se añadió hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carboimida
(concentración final 10 mg/ml) a tampón de
1-metilimidazol 100 mM (pH 7,0), y la mezcla se
utilizó para diluir el constructo del cebador hasta una
concentración final de 1 \mug/ml. Se introdujeron partes alícuotas
de 100 \mul de la disolución del cebador en cada pocillo de una
placa de microvaloración que consistía en tiras transparentes Nalge
Nunc NucleoLink® (nº de catálogo 248259). Las placas se incubaron
durante 6-8 horas a 37ºC, se lavaron a fondo en NaOH
2 M con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM, y se empaparon
en tres viales de 5 l con agua. El fluido residual de los pocillos
se retiró dando golpecitos sobre las placas invertidas sobre tela o
papel absorbente. Las placas se dejaron secar durante 30 min a
temperatura ambiente y, por último, se congelaron para su
conservación a -20ºC.
El ensayo de ADN polimerasa está basado en un
cebador corto con una secuencia específica que está unida
covalentemente a los pocillos de una placa de microvaloración de 96
pocillos. La mezcla de reacción contiene un molde de
desoxinucleótido monocatenario con una parte de su secuencia
complementaria con el cebador, y los cuatro desoxinucleósidos
trifosfato. Sin embargo, la timidina trifosfato está sustituida por
5-bromodesoxiuridina 5'-trifosfato
(BrdUTP). La cantidad de bromodesoxiuridina monofosfato (BrdUTP)
incorporada al ADN durante la reacción de polimerasa se detecta con
anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con
fosfatasa alcalina (Ap). Se utiliza un sustrato de Ap, el
4-metilumbeliferilo fosfato, para la detección
fluorimétrica del producto.
Se añaden 100 \mul de la mezcla de reacción de
ADN polimerasa a cada pocillo de las placas de microvaloración
revestidas con cebador. Las muestras se diluyeron en tampón básico
de ADN polimerasa, y la reacción de polimerasa se inició
transfiriendo 50 ml de la dilución de la muestra a cada pocillo de
la placa. La placa de microvaloración se incubó a 33ºC y la
reacción se terminó tras el tiempo indicado lavando la placa con
tampón borato 3 mM (pH 8,9) con octofenoxipolietoxietanol (Triton
X-100) al 1,5% (en v/v). Normalmente se emplearon
dos tiempos de incubación, 4 horas y durante la noche (16 horas),
para comprobar la linealidad de la reacción de polimerización. Las
placas se lavaron a fondo con NaOH 2 M con EDTA 2 mM, y se empaparon
en tres viales de 5 l con agua.
Después, las placas se incubaron durante 90
minutos a 33ºC con 100 \mul de anticuerpo monoclonal
anti-BrdU conjugado con fosfatasa alcalina (Ap)
diluido hasta 4,8 \mug/ml en tampón
(bis[2-hidroxietil]iminotris[hidroximetil]metano;2-bis[2-hidroxietil]amino-2-[hidroximetil]-1,3-propandiol)
(Bis Tris) 25 mM (pH 7,2) con NaCl 50 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 37,4 mM, sulfato de dextrano 1 mg/ml, Triton X-100 al 1%, y leche deshidratada desnatada Sigma 25 mg/ml.
(NH_{4})_{2}SO_{4} 37,4 mM, sulfato de dextrano 1 mg/ml, Triton X-100 al 1%, y leche deshidratada desnatada Sigma 25 mg/ml.
Después las placas se lavaron de nuevo en tampón
borato 3 mM (pH 8,9) con Triton X-100 al 1,5% (en
v/v) para eliminar el anticuerpo marcado no unido. Se determinó la
actividad fosfatasa alcalina utilizando el sustrato de
4-metilumbeliferilo fosfato disuelto en tampón Tris
(pH 8,9). La fluorescencia se leyó a 460 nm con un lector Wallac
Victor 2 a intervalos definidos (excitación, 355 nm).
Los estudios de inhibición se realizaron en un
ensayo de ADN polimerasa modificado. Los fármacos se diluyeron en
serie en cinco etapas y partes alícuotas de 25 \mul de
transfirieron a cada pocillo de la placa de microvaloración,
mezcladas con 100 \mul de mezcla de reacción de ADN polimerasa, y
la reacción enzimática se inició mediante la adición de 25 \mul
de la dilución de enzima. Se estudiaron análogos no nucleosídicos en
condiciones de reacción patrón, mientras que la concentración de
los cuatro desoxinucleósidos trifosfato (dNTP) se redujo hasta 1
\muM en los estudios de los inhibidores de competencia de dNTP.
Se dejó que la reacción de polimerasa se desarrollase durante la
noche (16-24 horas a 33ºC). Después, la reacción se
terminó mediante un lavado de la placa. El valor de IC_{50} se
define como la concentración de fármaco que produce 50% de
inhibición de la actividad polimerasa estudiada.
Se utilizó una modificación del ensayo de RT
colorimétrico (kit de actividad RT Cavidi® Lenti), disponible en
Cavidi Tech, Uppsala, Suecia, para la determinación del nivel de
actividad RT en las preparaciones de virus estudiadas. El método ha
sido descrito (Ekstrand et al., 1996). Brevemente,
poli(rA) unido covalentemente a los pocillos de una placa de
microvaloración de 96 pocillos sirve como molde para la
incorporación de 5-bromodesoxiuridina
5'-trifosfato (BrdUTP) durante la etapa de
transcripción inversa a 33ºC. La cantidad de bromodesoxiuridina
monofosfato (BrdUMP) incorporado al ADN se detecta con anticuerpo
monoclonal anti-BrdU conjugado con fosfatasa
alcalina (Ap). Por último, se utiliza un sustrato de Ap, el
4-metilumbeliferilo fosfato, para la detección
fluorimétrica.
Los estudios de inhibición se realizaron en un
ensayo con el kit de RT Cavidi HS-Lenti modificado.
Los inhibidores se diluyeron en serie en cinco etapas y se
trasladaron partes alícuotas de 25 \mul a cada pocillo de la placa
de microvaloración, mezcladas con 100 \mul de la mezcla de
reacción de RT, y la reacción enzimática se inició mediante la
adición de 50 \mul de la dilución de enzima. La concentración
final de sustrato de nucleósido trifosfato (BrdUTP) es 16 \muM, y
la cantidad de cebador (odT_{22}) es 12 ng por pocillo. Se dejó
que la reacción de RT se desarrollase durante la noche
(16-24 horas a 33ºC). Después, la reacción se
terminó lavando la placa. El valor de IC_{50} se define como la
concentración de fármaco que produce una inhibición de 50% de la
actividad RT estudiada.
1) Etiquetar los tubos de plástico de 4,5 ml que
se van a utilizar. Colocarlos en una caja Nalgene. Añadir 1 ml de
muestra (por ejemplo, plasma con EDTA procedente de individuos
afectados por VIH) a cada tubo etiquetado. Añadir 100 \mul de una
disolución 66 mM de ácido
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) en
agua tamponada, agitar en vórtice e incubar las muestras durante
una hora a temperatura ambiente. La actividad de las enzimas
plasmáticas libres se destruye durante este procedimiento, mientras
que las enzimas contenidas dentro de los viriones permanecen
intactas. Los viriones entonces pueden purificarse del ácido
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico), los
anticuerpos que bloquean la actividad enzimática y otras sustancias
que pueden interferir en la cuantificación de la RT vírica, mediante
varios sistemas de separación. El protocolo a continuación se basa
en el uso de gel Fractogel® EMD TMAE Hicap.
2) Suspender el gel de separación con cuidado y
transferir 1500 \mul de la suspensión de gel a cada tubo de
pretratamiento de muestras.
3) Incubar las muestras con la suspensión de gel
durante 90 minutos a temperatura ambiente con los tubos en posición
horizontal en un agitador orbital.
4) Etiquetar la cantidad deseada de minicolumnas
de plástico de 10 ml para identificar las muestras que se van a
analizar. Montar las columnas en un dispositivo de lavado de
columnas, es decir, un colector de extracción al vacío de fase
sólida Supelco Visiprep. Transferir los contenidos de los tubos de
unión a sus correspondientes columnas. Antes de transferir, agitar
en vórtice los tubos brevemente para distribuir con uniformidad el
gel.
5) Cuando todas las columnas estén llenas,
aplicar el vacío y absorber los geles hasta que estén secos. Quitar
el vacío y comenzar el lavado llenando cada columna con 9 ml de
tampón A. Cuando todas las columnas se hayan llenado aplicar el
vacío y absorber los geles hasta que estén seco.
6) Repetir la etapa 5 tres veces más, dando un
total de cuatro lavados. Absorber los geles hasta que estén secos
después de cada lavado. Después de absorber los geles hasta que
estén secos después del cuarto lavado quitar el vacío y pasar a la
etapa 7. La etapa de lavado elimina los anticuerpos que bloquean la
RT sin unir y el ácido
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) del
sistema.
7) Añadir a todos los geles secos 9 ml de tampón
de acondicionamiento (B). Después de un minuto aplicar el vacío y
absorber los geles hasta que estén secos.
8) Repetir la etapa 7. Antes de quitar el vacío
comprobar que todo el tampón de acondicionamiento (B) se ha retirado
de todos los geles.
9) Retirar la parte superior del dispositivo de
lavado de columnas. Montar el soporte para tubos con los tubos
etiquetados en un recipiente limpio. Volver a ajustar la parte
superior del dispositivo. Controlar que los tubos pequeños de cada
columna se introduzcan en sus correspondientes tubos.
10) Añadir 600 \mul de tampón de lisis (C) a
cada columna. Dejar el tampón en reposo durante cinco minutos.
Después aplicar el vacío lentamente y absorber los geles hasta que
estén secos. Esto dejará en cada tubo aproximadamente 600 \mul de
lisado de virus procedente del gel conectado.
La actividad RT recuperada en los lisados de la
etapa 10, que están esencialmente exentos de anticuerpos que
bloquean la RT, fármacos y actividad polimerasa celular, puede
cuantificarse con un ensayo de actividad RT sensible, es decir, el
kit de RT Cavidi HS-Lenti, que se basa en el método
descrito por Ekstrand et al. [7]. Son suficientes 25 \mul
de lisado obtenido según el presente protocolo para la determinación
de la actividad RT en una muestra. Los 575 \mul restantes de la
muestra deben congelarse a -70ºC o menos para su posterior uso en el
ensayo de sensibilidad al fármaco.
Nota: las enzimas RT que no son sensibles a los
agentes modificadores de cisteína, por ejemplo la RT de
VIH-1 de tipo salvaje, pueden ensayarse
opcionalmente en presencia de ácido
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico)
hasta 5 mM. Por otra parte, las enzimas sensibles, como RT de MULV y
RT de ciertas cepas de VIH-1 resistentes a terapia
(que contienen, por ejemplo, la mutación Y181C) requieren la adición
de un agente reductor de sulfhidrilo, es decir cisteína o
cisteamina, al tampón de lisis.
La secuencia del cebador tiene 18 bases
5'-GTC-CCT-GTT-CCG-GCG-CCA-3'
(SEQ ID NO:12) y está unida en el extremo 5' a una amina primaria
mediante un brazo espaciador C6.
El constructo del molde contiene tres partes con
diferentes funciones. Desde el extremo 5': un polímero (A)n
utilizado para amplificar la señal BrdU, una parte variable
(CTGA)m para obtener una reacción de polimerasa que es
dependiente de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato, y una
secuencia complementaria con el cebador.
En los experimentos incluidos en los ejemplos, n
= 12 y m = 5, si no se indica lo contrario.
ddATP, 2',3'-didesoxiadenosina
trifosfato; ddGTP, 2',3'-didesoxiguanosina
trifosfato; ddCTP, 2',3'-didesoxicitidina
trifosfato; ddTTP, 2',3'-didesoxitimidina
trifosfato.
TMAU,
6-([3,4-trimetilen]anilino)uracilo.
Tenofovir,
(R)-9-(fosfonilmetoxipropil)adenina;
nevirapina,
(11-ciclopropil-5,11-dihidro-4-metil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-f][1,4]diazepin-6-ona)
(NVP); y efavirenz,
(-)-6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona)
(EFV).
La ADN polimerasa I (E. coli) se obtuvo en
Amersham Bioscience. La ADN polimerasa III recombinante de
Staphylococcus aureus se produjo como se ha descrito
(Brown et al., 1998). La ADN polimerasa \alpha (timo de
ternero) y \beta (humana) de mamífero se obtuvo en CHIMERx
(Milwaukee). La ADN polimerasa \gamma se purificó a partir de
corazón de buey como se ha descrito (Pileur et al.,
2000).
Se produjeron formas mutantes de RT de
VIH-1 resistentes a NNRTI (L100I, K103N,
L100I/K103N, Y181C). Como molde para las mutaciones se utilizó el
vector de expresión pETRT, que se construyó a partir del aislado
BH10. Las mutaciones se generaron utilizando kits de mutagénesis
dirigidas a sitio comerciales QuikChange (Stratagene). Las
mutaciones se verificaron mediante análisis de la secuencia de ADN.
Las formas mutadas y nativas de RT se aislaron como se ha descrito
previamente (Lindberg et al., 2002).
Nota: las enzimas RT que no son sensibles a los
agentes modificadores de cisteína, por ejemplo la RT de
VIH-1 de tipo salvaje, pueden ensayarse
opcionalmente en presencia de ácido
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico)
hasta 5 mM. Por otra parte, las enzimas sensibles, como RT de MULV y
RT de ciertas cepas de VIH-1 resistentes a terapia
(que contienen, por ejemplo, la mutación Y181C) requieren la adición
de un agente reductor de sulfhidrilo, es decir cisteína o
cisteamina, al tampón de lisis.
La secuencia del cebador tiene 18 bases
5'-GTC-CCT-GTT-CCG-GCG-CCA-3'
(SEQ ID NO:12) y está unida en el extremo 5' a una amina primaria
mediante un brazo espaciador C6.
El constructo del molde contiene tres partes con
diferentes funciones. Desde el extremo 5': un polímero (A)n
utilizado para amplificar la señal BrdU, una parte variable
(GTCA)m para obtener una reacción de polimerasa que es
dependiente de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato, y una
secuencia complementaria con el cebador. En los experimentos
incluidos en los ejemplos, n = 12 y m = 5, si no se indica lo
contrario.
ddATP, 2',3'-didesoxiadenosina
trifosfato; ddGTP, 2',3'-didesoxiguanosina
trifosfato; ddCTP, 2',3'-didesoxicitidina
trifosfato; ddTTP, 2',3'-didesoxitimidina
trifosfato.
TMAU,
6-([3,4-trimetilen]anilino)uracilo.
Tenofovir,
(R)-9-(fosfonilmetoxipropil)adenina;
nevirapina,
(11-ciclopropil-5,11-dihidro-4-metil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-f][1,4]diazepin-6-ona)
(NVP); y efavirenz,
(-)-6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona)
(EFV).
La ADN polimerasa I (E. coli) se obtuvo en
Amersham Bioscience. La ADN polimerasa III recombinante de
Staphylococcus aureus se produjo como se ha descrito
(Brown et al., 1998). La ADN polimerasa \alpha (timo de
ternero) y \beta (humana) de mamífero se obtuvieron en CHIMERx
(Milwaukee). La ADN polimerasa \gamma se purificó a partir de
corazón de buey como se ha descrito (Pileur et al.,
2000).
Se produjeron formas mutantes de RT de
VIH-1 resistentes a NNRTI (L100I, K103N,
L100I/K103N, Y181C). Como molde para las mutaciones se utilizó el
vector de expresión pETRT, que se construyó a partir del aislado
BH10. Las mutaciones se generaron utilizando kits de mutagénesis
dirigidas a sitio comerciales QuikChange (Stratagene). Las
mutaciones se verificaron mediante análisis de la secuencia de ADN.
Las formas mutadas y nativas de RT se aislaron como se ha descrito
previamente (Lindberg et al., 2002).
El procedimiento para la producción de RT de
VIH-1 recombinantes con mutaciones específicas AZT
fue similar, pero las mutaciones se introdujeron en la región
codificadora de RT a partir del aislado HXB2-D.
Se seleccionaron retrospectivamente muestras
plasmáticas procedentes de pacientes no tratados o pacientes
tratados con la terapia de combinación normal. La cantidad de ARN de
VIH-1 en cada muestra se midió mediante PCR de ARN
de VIH-1 convencional (Cobas, Roche Diagnostica).
Las muestras séricas procedentes de pacientes con trastornos
linfoproliferativos se obtuvieron del Departmento de Medicina
Interna, Universidad de Uppsala, Akademiska sjukhuset, Uppsala. Gel
de separación: por ejemplo, Fractogel® EMD TMAE o Fractogel® EMD
TMAE Hicap en ácido
(2-(N-morfolino)etansulfónico) (MES) 314 mM,
pH 5,1, yoduro de potasio 413 mM, y heparina 0,5 mg/ml.
Minicolumnas, por ejemplo, Biorad
Poly-Prep® (7311553).
Dispositivo de lavado de minicolumnas, es decir,
un colector de extracción al vacío de fase sólida Supelco
Visiprep.
Tubos de plástico, por ejemplo, tubos criogénicos
de 4,5 ml Nunc.
Placas de microvaloración con prA inmovilizado,
es decir, Nalge Nunc NucleoLinck®.
Agente modificador de cisteína, por ejemplo,
ácido
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) 66
mM en agua tamponada con tris(hidroximetil)aminometano
0,87 M (pH 8,3).
Agente reductor de sulfihidrilo suave, por
ejemplo, cisteamina 33 mM en agua.
A) Tampón de lavado: MES 20 mM, pH 5,4, acetato
de potasio (KAc) 500 mM.
B) Tampón de acondicionamiento: un tampón
compatible con el ensayo de RT, por ejemplo, ácido
(N-(2-hidroxietilpiperazin-N'-(2-etansulfónico)
(Hepes) 50 mM, pH 7,6, KAc 25 mM, cloruro de magnesio (MgCl_{2})
20 mM, ácido
etilenglicol-bis(b-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético
(EGTA) 0,2 mM, espermina 2 mM, y albúmina de suero bovino (BSA)
inactivada con calor 0,5 mg/ml.
C) Tampón de lisis: un tampón compatible con el
ensayo de RT que incluye un detergente, por ejemplo, polioxietilen
4 lauril éter (Brij 30) al 1,25%, odT_{22} 13 ng/ml, y los mismos
componentes que el tampón de acondicionamiento (B). Se añade
opcionalmente un agente reductor de sulfihidrilo, es decir,
cisteamina 0,2 mM, cuando se procesan virus con RT que es sensible
a la oxidación/modificación de SH.
Mezcla de reacción de RT: ácido
(N-(2-hidroxietilpiperazin-N'-(2-etansulfónico)
(Hepes) 11,7 mM, pH 7,6, BrdUTP 28,3 \muM, odT_{22} 120 ng/ml,
MgCl_{2} 4 mM, sulfato de dextrano 0,05 g/l, espermina 2 mM,
Triton X-100 al 0,5% (en v/v), ácido
etilenglicol-bis(\beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético
(EGTA) 0,2 mM, y albúmina de suero bovina (BSA) 0,5 mg/ml.
Tampón básico de ADN polimerasa\gammay retroADN polimerasa: Hepes 50 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 8 mM,
sulfato de dextrano 1,5 \mug/l, espermina 1 mM, Triton
X-100 al 0,5% (en v/v), EGTA 0,2 mM, ditiotreitol
(DTT) 1,5 mM, y albúmina de suero bovina (BSA) 0,5 mg/ml.
Tampón básico de ADN polimerasa III: ácido
(2-(N-morfolino)etansulfónico) (MES) 40 mM,
pH 6,8, acetato de potasio (KAc) 40 mM, MgCl_{2} 10 mM, espermina
2 mM, monolaureato de polioxietilensorbitán (Tween 20) al 0,5% (en
v/v), EDTA 0,1 mM, ditiotreitol 1 mM, y albúmina de suero bovina
(BSA) 50 \mug/ml.
Tampón básico de ADN polimerasa\beta:
ácido
3-[(1,1-dimetil-2-hidroxietil)amino]-2-hidroxi-1-propansulfónico
(AMPSO) 20 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 1 mM, espermidina 3 mM, BSA 1
\mug/ml, EDTA 10 \muM, DTT 0,1 mM, Tween 20 al 0,01%.
Mezcla de reacción de ADN polimerasa:
tampón básico de ADN polimerasa reforzado con BrdUTP 24 \muM, dGTP
49,5 \muM, dATP 49,5 \muM, dCTP 49,5 \muM, y 500 ng de
molde/ml.
Mezcla de reacción de retroADN polimerasa con
ATP: la mezcla de reacción de ADN polimerasa \gamma y retroADN
polimerasa se reforzó con ATP 3,2 mM y el pH se ajustó a 7,1.
Una dilución en serie en dos etapas de los
constructos del molde indicados, comenzando a partir de 200 ng/ml,
se incluyó en cada pocillo de placas de microvaloración con cebador
inmovilizado, según "Producción de placas de microvaloración
revestidas con cebador". Se añadieron 100 fg de RT de
VIH-1 recombinante a cada pocillo, y la duración de
la reacción de RT fue de 19 horas. La actividad polimerasa de cada
molde se determinó según "Protocolo para el ensayo de ADN
polimerasa", utilizando el tampón básico de ADN polimerasa
\gamma y retroADN polimerasa. Se empleó NaCl 50 mM o, como
alternativa, 100 mM durante la unión del anticuerpo monoclonal
anti-BrdU. Las actividades encontradas se
representaron gráficamente frente a la concentración de molde y se
calculó la señal máxima lograda para cada tipo de molde a partir
del valor meseta de la respectiva gráfica. Los resultados se
resumen en la tabla 1. Se encontró una correlación evidente entre la
longitud de la cola de A y la señal máxima obtenible en el ensayo
de polimerasa. La longitud de la cola de A también afecta a la
capacidad del anticuerpo utilizado para la detección del producto
para unirse cuando la fuerza iónica es mayor.
Los 6-anilinouracilos son
inhibidores selectivos de ADN polimerasa III de bacterias
gram-positivas. La molécula de anilinouracilo
inhibe su diana de polimerasa III secuestrándola en un complejo de
ADN-fármaco-proteína inactivo
(Tarantino et al., 1990). El fármaco TMAU puede considerarse
como un análogo de GTP. La capacidad inhibidora de las
concentraciones indicadas de TMAU contra 1,25 ng/pocillo de ADN
polimerasa III recombinante se determinó según "Protocolo para
la determinación de la síntesis de la segunda hebra en moldes de ADN
variables" utilizando (CTGA)6-A12
(SEQ ID NO:10) (\blacksquare) o (CTG)6-A3
(SEQ ID NO:11) (\ding{115}) como molde. El tiempo de reacción de
polimerasa era de una hora, y la concentración de GTP en la mezcla
de reacción de DNA polimerasa III se redujo a 2,5 \muM. Las
actividades de polimerasa obtenidas en el molde indicado se
recalcularon en porcentaje de las actividades encontradas con la
misma polimerasa incubada en ausencia de inhibidor.
Los resultados se representan en la figura 1.
Este inhibidor muy específico muestra una capacidad inhibidora
variable dependiendo de la secuencia del molde utilizada. La
presente invención proporciona un sistema en el que el molde de ADN
utilizado puede cambiarse con facilidad para adaptarse a las
condiciones específicas requeridas por la enzima o inhibidor
estudiado.
La actividad de diluciones en serie de RT de
VIH-1 de tipo salvaje (\blacklozenge), ADN
polimerasa \beta de mamífero (\bullet) y ADN polimerasa I de
E. coli (\ding{115}) se midió según "Protocolo para el
ensayo de ADN polimerasa" utilizando tampones básicos
optimizados para la enzima indicada. El tiempo de reacción de la
polimerasa utilizado fue durante la noche (18 horas). Los resultados
se representan en la figura 2. Cada una de las tres preparaciones
de enzimas muestra una relación lineal entre la cantidad de enzima
utilizada y la cantidad de producto recuperado. El fondo del ensayo
era 3800 rfu/hora. Utilizando un doble fondo como valor de punto de
corte para una detección de señal significativa fue posible detectar
un valor tan bajo como 10 nU de RT de VIH-1 de tipo
salvaje, 6 nU de ADN polimerasa \beta de mamífero y 3 nU de ADN
polimerasa I de E. coli.
La actividad de diluciones en serie de ADN
polimerasa \alpha, ADN polimerasa \beta, ADN polimerasa
\gamma, suero de un paciente que padece un linfoma no de Hodgkin,
y RT de VIH-1 se midió según "Protocolo para el
ensayo de ADN polimerasa" y "Protocolo para la
determinación de actividad RT" utilizando disoluciones de
reacción basadas en los tampones básicos de polimerasa indicados. El
tiempo de reacción de la polimerasa utilizado fue de 2 horas. Las
actividades encontradas se recalcularon en porcentaje de actividad
sobre moldes de ADN variables en las condiciones de reacción óptimas
para cada enzima. Los resultados aparecen en la tabla 2. Cada una de
las cinco preparaciones enzimáticas investigadas tenían sus
preferencias individuales con respecto a las condiciones de reacción
óptimas. Sin embargo, la ADN polimerasa \alpha y la polimerasa
sérica humana muestran un patrón similar. Sólo la RT de
VIH-1 y la ADN polimerasa \gamma produjeron una
actividad significativa en el ensayo de la transcripción
inversa.
La capacidad inhibidora de concentraciones
indicadas de ddATP (\blacksquare), ddGTT (\blacklozenge), ddCTP
(\bullet) y ddTTP (\ding{115}) contra la actividad de 80 fg de
RT de VIH-1 de tipo salvaje recombinante se
determinó según "Protocolo para la determinación de la
inhibición de la síntesis de la segunda hebra en moldes de ADN
variables". La actividad polimerasa de cada concentración de
inhibidor se recalculó en porcentaje de la actividad de un control
en ausencia de inhibidor. Los resultados se representan en la figura
3.
Se descubrió que la reacción de polimerasa que
utiliza el molde (CTGA)_{6}-A_{12} (SEQ
ID NO:10) era sensible a la inhibición por los análogos de didesoxi
de las cuatro bases del ADN. Los valores de IC_{50} encontrados
variaban de 20 nM para ddCTP a 80 nM para ddATP.
Los efectos de tres inhibidores no nucleosídicos
sobre las RT de VIH-1 recombinante indicadas se
determinó según "Protocolo para la determinación de la
inhibición de la síntesis de la segunda hebra en moldes de ADN
variables" utilizando el tampón básico de ADN polimerasa
\gamma y retroADN polimerasa, y "Protocolo para la
determinación de la inhibición de la transcripción inversa",
respectivamente. La duración de las reacciones de polimerización fue
de 19 horas para la síntesis de la segunda hebra en
(CTGA)_{6}-A_{12} (SEQ ID NO:10), y de 2
horas para la síntesis de la primera hebra en prA, respectivamente.
Las actividades RT obtenidas se recalcularon en porcentaje de
actividad encontrada con la misma RT incubada en ausencia de
inhibidor.
Los resultados se resumen en la tabla 3. Ambos
sistemas de ensayo tienen la capacidad de distinguir entre enzimas
RT resistentes (Y181C, V179D) y sensibles. Los valores de IC_{50}
para cualquiera de los inhibidores no se vieron significativamente
afectados por la diferencia en cinco veces en la cantidad de enzima
utilizada en cualquiera de los dos sistemas de ensayo. Además, no
se produjo una diferencia significativa entre los valores de
IC_{50} logrados midiendo la inhibición de la síntesis de la
primera o segunda hebra del ADN.
Una terapia prolongada de individuos infectados
por VIH con análogos de nucleósidos conduce al desarrollo de virus
resistentes. Este proceso está asociado con la aparición gradual de
mutaciones en el gen vírico pol. Los efectos de estas sustituciones
a niveles enzimáticos son complicados, e incluyen la potenciación de
una función editora del ADN primitiva. Esta reacción es dependiente
de nucleótidos y produce dinucleósido polifosfato y un extremo 3'
extensible del ADN.
Los efectos de diluciones en serie de tenofovir
trifosfato sobre 4 pg/pocillo de la RT de VIH-1
recombinante indicada se determinaron según "Protocolo para la
determinación de la inhibición de la síntesis de la segunda hebra en
moldes de ADN variables", utilizando una disolución de
reacción patrón basada en el tampón básico de ADN polimerasa
\gamma y retroADN polimerasa, y la misma disolución de reacción
suplementada con ATP. La duración de las reacciones de
polimerización fue de 19 horas. Las actividad RT obtenidas se
recalcularon en porcentaje de actividad de la misma RT incubada en
ausencia de inhibidor. La figura 4 muestra los resultados.
Símbolos: RT de VIH-1 de tipo
salvaje en la disolución de reacción de ADN polimerasa (\circ), RT
de VIH-1 de tipo salvaje en la disolución de
reacción de ADN polimerasa con ATP (\bullet), RT de
VIH-1 mutante T69S \rightarrow SS/L210W/T215Y en
la disolución de reacción de ADN polimerasa patrón (\lozenge), y
RT de VIH-1 mutante T69S \rightarrow
SS/L210W/T215Y en la disolución de reacción de ADN polimerasa con
ATP (\blacklozenge).
Los resultados que aparecen en la figura 4
demuestran que la diferencia en la susceptibilidad al fármaco entre
la RT de tipo salvaje y mutante aumenta aproximadamente 10 veces
cuando se utiliza una disolución de reacción con capacidad para
soportar una reacción de fosforolisis dependiente de ATP.
\newpage
Se procesaron muestras de 1 ml de plasma de 3
individuos infectados por VIH de Estocolmo, Suecia, según
"Protocolo para el aislamiento de RT vírica a partir de
material que contiene anticuerpos que bloquean la RT, basado en la
destrucción de enzimas celulares solubles, seguido del aislamiento
de RT vírico a partir de minicolumnas". Cada RT plasmática y
dos enzimas control se valoraron frente a un conjunto de diluciones
en serie de nevirapina, según "Protocolo para la determinación
de la inhibición de la síntesis de la segunda hebra en moldes de ADN
variables" utilizando el tampón básico de ADN polimerasa
\gamma y retroADN polimerasa. Véase la figura 5.
Símbolos: (\square) RT del paciente 1 que tiene
140.000 copias del genoma/ml, (\blacksquare) RT del paciente 2
que tiene 180.000 copias del genoma/ml, (\ding{115}) RT del
paciente 3 que tiene 390.000 copias del genoma/ml, (\bullet) un
control que consiste en RT de VIH-1 de tipo salvaje
recombinante, y (\blacklozenge) un control que consiste en RT de
VIH-1 recombinante mutante (L100I) con resistencia
intermedia a nevirapina.
Los valores de IC_{50} hacia la nevirapina
encontrados para las RT de los pacientes varían de 0,7 a 1,2 \muM.
Compárese con 0,5 \muM para la RT de tipo salvaje control, y
>10 \muM para la RT mutante con resistencia intermedia a la
nevirapina (L100I).
\vskip1.000000\baselineskip
El suero de cuatro pacientes que padecen linfoma
no de Hodgkin y de seis donantes de sangre sanos se diluyó en serie
en tampón básico de ADN polimerasa III. La actividad polimerasa en
cada etapa de dilución se midió según "Protocolo para el ensayo
de ADN polimerasa" utilizando dos y seis horas de tiempo de
reacción de la
polimerasa.
polimerasa.
Se calculó la actividad ADN polimerasa/\mul de
muestra de suero y hora de ensayo de polimerasa en el intervalo de
dilución en el que existía una relación lineal entre la cantidad de
producto formado y la cantidad de plasma añadido al ensayo (véase la
tabla 4).
Cada muestra de suero de los pacientes con
linfoma no de Hogdkin contenía cantidades individuales de actividad
ADN polimerasa, con propiedades similares a la ADN polimerasa
\alpha (véase la tabla 3). La cantidad de actividad varía de
aproximadamente 2 a 190 veces el valor medio encontrado entre
donantes de sangre sanos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Molde utilizado | Señal máxima* | Fondo | Señal a NaCl^{a} 100 mM | SEQ ID NO: |
| (rfu/hora) | (rfu/hora) | (porcentaje de la | ||
| señal máxima) | ||||
| (CTGA)5 | 89444 | 1629 | 20 | SEQ ID NO:1 |
| (CTGA)5-A | 63694 | 1958 | 25 | SEQ ID NO:2 |
| (CTGA)5-AA | 184421 | 613 | 33 | SEQ ID NO:3 |
| (CTGA)5-AAA | 239688 | 2565 | 44 | SEQ ID NO:4 |
| (CTGA)5-A8 | 198894 | 1544 | 58 | SEQ ID NO:5 |
| (CTGA)6 | 60627 | 1285 | 22 | SEQ ID NO:6 |
| (CTGA)6-AAA | 83555 | 1009 | ND | SEQ ID NO:7 |
| (CTGA)6-A5 | 119326 | 914 | ND | SEQ ID NO:8 |
| (CTGA)6-A9 | 202668 | 963 | ND | SEQ ID NO:9 |
| Molde utilizado | Señal máxima* | Fondo | Señal a NaCl^{a} 100 mM | SEQ ID NO: |
| (rfu/hora) | (rfu/hora) | (porcentaje de la | ||
| señal máxima) | ||||
| (CTGA)6-A12 | 226062 | 726 | ND | SEQ ID NO:10 |
| (CTG)6-A3 | 124334 | 814 | ND | SEQ ID NO:11 |
| * \begin{minipage}[t]{158mm} Se incluyeron series de diluciones en dos etapas del molde indicado, comenzando a partir de 200 ng/ml, en cada pocillo de placas de microvaloración con cebador inmovilizado. Se añadieron 100 fg de RT de VIH-1 recombinante a cada pocillo, y la duración de la reacción de RT fue de 18 horas. Se utilizaron 50 mM durante la unión del anticuerpo monoclonal anti-BrdU. Las actividades encontradas se representaron gráficamente frente a la concentración del molde, y se calculó la señal máxima lograda para cada molde.\end{minipage} | ||||
| ^{a} \begin{minipage}[t]{158mm}Las condiciones de reacción de RT y los cálculos son idénticos que en la "señal máxima", pero se utilizó NaCl 100 mM durante la unión del anticuerpo.\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
| Actividad de la isozima de ADN polimerasa en el ensayo indicado (%*) | |||||
| Tampón básico | ADN pol \alpha | ADN pol \beta | ADN pol \gamma | ADNp sérica | RT de VIH |
| Pol III | 100 | 17 | 0 | 100 | 0 |
| ADN pol \beta | 40 | 100 | 5 | 30 | 33 |
| ADN pol \gamma^{a} | 1 | 13 | 100 | 9 | 100 |
| prA/Lenti^{b} | 0 | 0 | 10 | 0 | 2175 |
| * porcentaje de actividad sobre moldes de ADN variables con tampón básico óptimo para la isozima indicada. | |||||
| ^{a} tampón básico de ADN polimerasa \gamma y retroADN polimerasa. | |||||
| ^{b} actividad en el ensayo de RT con prA/odT como molde de cebador. |
\vskip1.000000\baselineskip
| Enzima RT | IC_{50} (\mum) en el molde* | |||
| Inhibidor | tipo | cantidad (fg) | (CTGA)_{6}-A_{12} | prA |
| nevirapina | salvaje | 100 | 2,0 | 2,2 |
| salvaje | 20 | 2,0 | 2,5 | |
| Y181C | 100 | >500 | 200 | |
| Y181C | 20 | >500 | 180 | |
| V179D | 100 | 8 | 7 | |
| V179D | 20 | 12 | 8 |
| Enzima RT | IC_{50} (\mum) en el molde* | |||
| Inhibidor | tipo | cantidad (fg) | (CTGA)_{6}-A_{12} | prA |
| efavirenz | salvaje | 100 | 0,04 | 0,02 |
| salvaje | 20 | 0,03 | 0,02 | |
| Y181C | 100 | 0,12 | 0,15 | |
| Y181C | 20 | 0,14 | 0,13 | |
| V179D | 100 | 0,5 | 0,7 | |
| V179D | 20 | 0,4 | 0,6 | |
| foscarnet | salvaje | 100 | 0,5 | 0,7 |
| salvaje | 20 | 0,5 | 0,6 | |
| * \begin{minipage}[t]{158mm} Los efectos de tres inhibidores no nucleosídicos sobre la RT de VIH-1 recombinante indicada se determinaron según "Protocolo para la determinación de la inhibición de la síntesis de la segunda hebra en moldes de ADN variables" y "Protocolo para la determinación de la inhibición de la transcripción inversa", respectivamente. La duración de la reacciones de polimerización fue de 19 horas para la síntesis de la segunda hebra en (CTGA)_{6}-A_{12} (SEQ ID NO:10), y de 2 horas para la síntesis de la primera hebra en prA, respectivamente. Las actividades RT obtenidas se recalcularon en porcentaje de las actividades encontradas con la misma RT incubada en ausencia de inhibidor.\end{minipage} |
| Código del suero | Origen del suero | Actividad polimerasa (rfu/hora/\mul de |
| suero/horas de la reacción de polimerasa) | ||
| T1 | paciente NHL^{a} | 158521 |
| T2 | paciente NHL | 1305 |
| T3 | paciente NHL | 3405 |
| T4 | paciente NHL | 16619 |
| B1-B6 | donantes de sangre | 841 \pm 180 |
| ^{a} paciente que padece linfoma no de Hogdkin. | ||
| * NS, no significativo. |
El suero de cuatro pacientes que padecen linfoma
no de Hodgkin y de seis donantes de sangre sanos se diluyó en serie
en tampón básico de ADN polimerasa III. La actividad polimerasa en
cada etapa de dilución se midió según "Protocolo para el ensayo
de ADN polimerasa". Las actividades de ADN polimerasa
tabuladas se calcularon a partir del intervalo de dilución en el que
existía una relación lineal entre la cantidad de producto formado y
la cantidad de plasma añadido. El fondo del ensayo, 854 flu/h, se ha
restado de todos los valores.
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipctgactgact gactgactga
\hfill20
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<210> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipctgactgact gactgactga a
\hfill21
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<210> 3
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<211> 22
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipctgactgact gactgactga aa
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipctgactgact gactgactga aaaa
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<210> 5
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 5
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\hfill28
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 7
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipctgactgact gactgactga ctgaaaaaaa aaa
\hfill33
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<210> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipctgactgact gactgactga ctgaaaaaaa aaaaaa
\hfill36
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<210> 11
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: molde
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipctgctgctgc tgctgctgaa a
\hfill21
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<210> 12
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccctgttc cggcgcca
\hfill18
Claims (6)
1. Un método para medir la polimerización de ADN
dependiente de ADN en una muestra biológica, que comprende las
etapas de:
a) proporcionar un cebador con una secuencia
específica corta monocatenaria, que es incapaz de formar pares de
bases de modo interno, unido a una fase sólida,
b) poner en contacto el constructo del cebador
con una mezcla de reacción que contiene un constructo del molde de
desoxinucleótidos monocatenarios compuesto, desde el extremo 5', de
un polímero (A)n, una parte variable (CTGA)m,
y una secuencia complementaria con el cebador y los cuatro desoxinucleósidos trifosfato, uno de los cuales está modificado de forma que un anticuerpo marcado lo reconoce de manera específica,
y una secuencia complementaria con el cebador y los cuatro desoxinucleósidos trifosfato, uno de los cuales está modificado de forma que un anticuerpo marcado lo reconoce de manera específica,
c) añadir una muestra biológica que comprende la
ADN polimerasa a la mezcla de b),
d) permitir que se desarrolle la reacción de
polimerasa,
e) incubar el producto de reacción inmovilizado
resultante de d) con el anticuerpo marcado,
f) detectar la cantidad de anticuerpo marcado
unido con la ayuda del marcador utilizado, y
g) medir la cantidad de desoxinucleótido
trifosfato modificado incorporado como una medida de la
polimerización de ADN, con la ayuda del marcador del anticuerpo
unido.
2. El método según la reivindicación 1, en el que
la ADN polimerasa es una transcriptasa inversa (RT) de
retrovirus.
3. El método según la reivindicación 2, en el que
la RT de retrovirus es la RT del virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH).
4. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que el desoxinucleósido
trifosfato modificado es 5-bromodesoxiuridina
5'-trifosfato (BrdUTP), y el anticuerpo marcado es
un anticuerpo monoclonal anti-BrU conjugado con
fosfatasa alcalina (Ap).
5. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que la polimerización de
ADN medida se utiliza para ensayar la susceptibilidad a
fármacos.
6. Un envase comercial para medir la
polimerización de ADN dependiente de ADN según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, que comprende:
a) un cebador con una secuencia específica corta
monocatenaria, que es incapaz de formar pares de bases de modo
interno, unido a una fase sólida,
b) un constructo del molde de desoxinucleótidos
monocatenarios compuesto, desde el extremo 5', de un polímero
(A)n, una parte variable (CTGA)m, y una secuencia
complementaria con el cebador en a),
c) los cuatro desoxinucleósidos trifosfato, uno
de los cuales está modificado de forma que un anticuerpo marcado lo
reconoce de manera específica, y
d) el anticuerpo marcado que reconoce el
desoxinucleósido trifosfato modificado en c).
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