ES2258445T3 - Metodo in vitro para la sincronizacion de la maduracion de ovocitos. - Google Patents
Metodo in vitro para la sincronizacion de la maduracion de ovocitos.Info
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Abstract
Método in vitro para la sincronización de la maduración de ovocitos nuclear, citoplasmática y/o membranosa y para disminuir la incidencia de preembriones humanos con anomalias de los cromosomas (aneuploidía), donde los ovocitos humanos que han sido aspirados de una mujer, en un periodo consecutivo de 30 días, cuyo periodo temporal es de al menos aproximadamente 7 días, preferiblemente de al menos aproximadamente 10 días, mas preferido de al menos aproximadamente 14 días, han sido tratados con una hormona hipotalamica y/o una hormona pituitaria o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta, son puestos en contacto con un compuesto MAS en una cantidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 µmol por litro.
Description
Método in vitro para la sincronización de
la maduración de ovocitos.
Esta invención se refiere a medios mejorados para
la fertilización in vitro (en adelante denominada FIV).
Puesto que el primer embarazo por FIV fue
realizado en 1978, este procedimiento ha resultado en millares de
embarazos y ha abierto una nueva y amplia frontera de investigación
y tratamiento para las parejas infertiles. Además, hoy en día hay
una necesidad significante de modalidades de tratamientos para la
infertilidad mejorados. Se presume que aproximadamente una de siete
parejas experimenta problemas de subfertilidad o infertilidad.
La FIV de ovocitos humanos se ha vuelto muy usada
para el tratamiento de la subfertilidad en mujeres y hombres. El
tratamiento por FIV estendar incluye una larga fase de estimulación
hormonal de la paciente hembra, p. ej. 30 días, que se inicia
suprimiendo la hormona estimulante del foliculo propio de la
paciente (en adelante denominada FSH) y la hormona luteinizante (en
adelante LH) por la hormona liberadora de la gonadotropina (en
adelante denominada GnRH), y esta este seguida de inyecciones de
gonadotropinas exogenas, p. ej. FSH y/o LH, para asegurar el
desarrollo de folículos preovulatorios múltiples y la aspiración de
múltiples ovocitos madurados in vivo inmediatamente antes de
la ovulación. El ovocito aspirado es posteriormente fertilizado
in vitro y cultivado, normalmente durante tres días antes de
ser retransferido al útero en el 4-8 estadio
celular. Los esfuerzos continuos han sido hechos para optimizar y
simplificar este procedimiento. Sin embargo, el nivel de embarazo
global no puede ser aumentado significativamente mas de
aproximadamente el 20% con las modalidades de tratamiento actuales.
En una amplia encuesta europea de pacientes de FIV, se descubrió
que 7.2 ovocitos de 11.5 ovocitos aspirados por la paciente han
sufrido la reanudación de la meiosis inmediatamente antes de la
fertilización, solo 4.3 ovocitos fueron fertilizados y solo 2.2
ovocitos alcanzaron el estadio celular embrionario 8 después de la
fertilización y el cultivo in vitro (ESHRE, Edimburgo,
1997).
Debido a la calidad muy imprevisible de los
embriones del estado de la técnica actualmente, mas de un embrión
tiene que ser transferido para dar solo una posibilidad razonable
de éxito. En consecuencia, es común transferir 2-3
embriones (hasta 5 embriones en algunos países), lo que conlleva el
gran efecto secundario de embarazos múltiples con una gran
incomodidad y riesgo tanto para la paciente como para los niños.
Además, se ha estimado que los gastos aumentados en asistencia
sanitaria debido a un nacimiento múltiple (gemelos, trillizos etc.)
esta excediendo los gastos totales de la FIV.
Por lo tanto, hay diferentes desventajas con el
tratamiento actual, las cuatro mas notables siendo:
1. el riesgo de hiperestimulación ovárica con la
inyección de gonadotropinas que es una condición fatídica potencial
que requiere hospitalización,
2. embarazos múltiples (50-1.000
veces la frecuencia normal de gemelos y trillizos,
respectivamente),
3. la existencia de segmentos de pacientes
considerables que no toleran el método actual debido a, p. ej.
síndrome ovárico poliquistico y muchos diabéticos,
4. un riesgo potencial de cáncer a largo
plazo.
Además, el aumento de peso, hinchazón, nauseas,
vómitos, humor lábil y otras incomodidades de la paciente junto con
la resistencia de la paciente a inyectarse ella misma se presentan
como desventajas.
Es conocido a partir de WO 96/00235 que algunos
derivados de esterol pueden ser usados para regular la meiosis. Un
ejemplo de esterol de este tipo es
4,4-dimetil-5\alpha-colesta-8,14,24-trieno-3\beta-ol
(en adelante denominado FF-MAS).
En la presente, los términos compuestos MAS
designan compuestos que median la meiosis de los ovocitos. Mas
específicamente, los compuestos MAS son compuestos que en la prueba
descrita on el ejemplo 1 mas abajo tiene un porcentaje de
descomposición de la vesícula germinal (en adelante denominada GVB)
que es significativamente superior al control. Los compuestos MAS
preferidos son los que tienen un porcentaje de GVB de al menos el
50%, preferiblemente al menos el 80%.
Ejemplos de compuestos MAS están mencionados en
WO 96/00235; 96/27658; 97/00884; 98/28323; 98/54965 y 98/55498, mas
específicamente on la Reivindicación 1 de estos.
En WO 95/000265, algunas sustancias de regulación
de la meiosis potenciales fueron evaluadas en ratones hembra
inmaduros. 48 horas antes los animales de prueba fueron matados por
dislocación cervical, se les dio una única inyección de
urogonadotropina que contenía 20 IU de FSH y 20 IU de LH. Los
ovarios fueron eliminados, colocados en un medio de hipoxantina y
liberados de tejido extrano. Luego, los ovocitos fueron punzados de
los folículos, liberados de células del cumulus y cultivados en un
medio conteniendo un derivado regulador de la meiosis.
Actualmente, la maduración in vitro en
seres humanos ha demostrado no tener mucho éxito a pesar del
interés sustancial y los esfuerzos clínicos.
Un objeto de la presente invención es la
reivindicación 1.
Otro objeto de la presente invención es la
reivindicación 9.
Ahora, se ha encontrado sorprendentemente, que la
FIV puede ser mejorada sustancialmente al añadir un compuesto MAS
en el estadio en el método usual de realización de la fertilización
in vitro donde se podría esperar que la maduración hubiera
tenido lugar in vivo.
Brevemente, la presente invención se refiere a un
método para la maduración o sincronización in vitro de
ovocitos humanos y para disminuir la incidencia de preembriones
humanos con anomalias cromosómicas (aneuploidía), que han sido
aspirados de una mujer que, en un periodo consecutivo de 30 días,
ha sido tratada con una hormona hipotalamica y/o una hormona
pituitaria o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo
de esta, cuya maduración o sincronización se realiza contactando
dichos ovocitos con un compuesto MAS en una cantidad de
aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 \mumol por litro. Las
formas de realización preferidas de esta invención son las
establecidas en las reivindicaciones secundarias mas abajo.
En referencia al ciclo femenino, una manera de
realizar el tratamiento descrito en la presente es el
siguiente:
Alrededor del día 21 en un ciclo hasta alrededor
del día 15 del ciclo siguiente: los ovarios son estimulados
tratando a la mujer con GnRH, p. ej. Synarel
(400-600 \mug al día).
Alrededor de los días 6-15 en el
segundo ciclo: los ovarios son estimulados tratando a la mujer con
FSH, p. ej. Gonal-F, Puregon o Humegon
(150-400 IU al día).
Alrededor de los días 15-16 del
segundo ciclo: los ovarios son estimulados tratando a la mujer con
hCG, p. ej. Pregnyl o Profasi (2000-5000 IU al
día).
Alrededor del día 18 del segundo ciclo: los
ovarios son recuperados de la mujer.
Alrededor del día 18-19 del
segundo ciclo: los ovarios son madurados con un compuesto MAS para
estimular la meiosis. En esta fase de la maduración adicional, la
concentración de compuesto MAS puede estar en la gama de
aproximadamente 0.1-100 \mumol por litro, p. ej.
10-20 \mumol por litro. El tiempo para esta fase
de maduración puede estar en la gama de alrededor
1-60 horas. Si los folículos preovulatorios están
inducidos para lutenizarse con una hormona luteinizante o un
agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta y/o las
corion gonadotropinas humanas o un agonista o antagonista de estas
o un derivado activo de estas, la maduración de los ovocitos con el
compuesto MAS tiene una duración de aproximadamente
1-15 horas, preferiblemente aproximadamente 6
horas. Si, no obstante, los folículos preovulatorios no son
inducidos a lutenizarse con una hormona lutenizante o un agonista o
antagonista de esta o un derivado activo de esta y/o las corion
gonadotropinas humanas o un agonista o antagonista de estas o un
derivado activo de esas, la maduración de los ovocitos con el
compuesto MAS tendrá una duración de aproximadamente
15-60 horas.
Alrededor de los días 19-21 del
segundo ciclo: los ovarios son fertilizados in vitro.
A partir de la aspiración del día anterior, la
mujer recibirá un estrógeno, p. ej., estrógeno valerato (2 X 10 mg
al día). Dos días mas tarde, ella también recibirá un progestogeno,
p. ej., Progestane vagetoria, a diario, que volverá la pared del
útero mas propensa a recibir los futuros embriones. La duración de
este tratamiento sera designada individualmente por paciente. El
medico puede elegir entre una variedad de estrógenos y
progestogenos.
Alrededor del día 21 en el segundo ciclo: Uno o
mas embriones son transferidos al útero de la mujer.
La descripción anterior se denomina adición de
MAS al protocolo de FIV existente para mejorar la eficacia mediando
una maduración final o completa o sincronía en el ovocito. De forma
alternativa, MAS puede utilizarse para rescatar ovocitos en los
ciclos que de lo contrario serian cancelados debido a una hiper
respuesta de FSH aparente. En este ejemplo, el responsable clínico
considerare la cancelación en base al perfil de estradiol,
ultrasonografia (respuesta tipo PCO) evitando así el tratamiento de
hCG. Los ovocitos son aspirados al mismo tiempo alrededor del día
15-16 substituyendo el tratamiento de hCG.
Aparte de la fase de maduración adicional con un
compuesto MAS, la FIV anterior se realiza según la vía usual.
Puesto que se espera que por el procedimiento de FIV tradicional
los ovarios hayan sido madurados suficientemente, no se espera que
haya ningún efecto adicional para añadir esta fase de maduración
adicional.
La mayor parte de las fases en el tratamiento
anterior y procedimiento se realizan de una manera conocida y las
fases restantes son realizadas en cierto modo conocido per
se. Mas detalles sobre la eliminación de los ovocitos de
folículos en el ovario, cultivo de los ovocitos aislados, el medio
de cultivo que se debe usar, la fertilización con esperma, y la
transferencia del embrión a la trompa de Falopio pueden ser
encontrados en la bibliografía, por ejemplo, en la especificación
de patente estadounidense Nº. 5.693.534.
Según esta invención, el compuesto MAS se añade
al medio de cultivo usado. En este medio, la cantidad del compuesto
MAS este en el rango de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100
\muM.
Una razón preferida para tratar a una mujer, en
un periodo consecutivo de 30 días, con una hormona hipotalamica y/o
una hormona pituitaria o un agonista o antagonista de esta o un
derivado activo es obtener folículos preovulatorios múltiples.
Las hormonas hipotalemicas son hormonas presentes
en el hipotalamo humano. Las hormonas pituitarias son hormonas
presentes en la glándula pituitaria humana. Las hormonas
gonadotropicas son hormonas segregadas por el glóbulo anterior de
la pituitaria en las vertebras y por la placenta mamífera, que
controla la actividad de las gónadas. Químicamente, estas son
glicoproteínas. Ejemplos de hormonas gonadotropicas son FSH, LH y
corion gonadotropina, p. ej. La corion gonadotropina humana (en
adelante designada hCG). La FSH estimula el crecimiento de
folículos ováricos y sus ovocitos en el ovario y la formación de
espermatozoides en el testículo. La FSH puede ser, p. ej., FSH
menopáusica o FSH recombinante. En las mujeres, la LH activa el
tejido productor de estrógenos de los ovarios para producir
progesterona, probablemente promueve los estadios finales del
desarrollo de folículos ováricos, inicia la maduración de ovocitos
final, induce a la ovulación y en los mamíferos inicia el
desarrollo de cuerpo lúteo. Estas hormonas son conocidas. Es obvio
para el operario experto en la técnica que, de forma alternativa, se
pueden usar los agonistas o antagonistas de estas. Es también obvio
para el operario experto en la técnica que, de forma alternativa,
se pueden usar análogos activos de estas hormonas. Algunos de estos
agonistas, antagonistas y análogos son conocidos y otros pueden ser
preparados por procesos conocidos per se. Ejemplos de tales
procesos conocidos son la síntesis química y la ingeniería
genética.
En una forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un método in vitro donde el
periodo consecutivo de 30 días dentro del cual la mujer fue tratada
con una hormona hipotalamica y/o una hormona pituitaria o un
agonista o antagonista derivado de esta o un derivado activo de
esta, fue de al menos aproximadamente 7 días, preferiblemente de al
menos aproximadamente 10 días, mas preferido de al menos
aproximadamente 14 días.
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un método in vitro donde la
mujer fue tratada de esterilidad, y/o para mejorar la maduración de
sus ovocitos, y/o para mejorar la sincronía de la maduración de
ovocitos nuclear, citoplásmica y/o membranosa, y/o para mejorar la
fertilidad de sus ovocitos, y/o para mejorar el nivel de
implantación por maduración y fertilización in vitro
humana.
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un método in vitro cuyo
periodo consecutivo fue de un ciclo menstrual.
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un método in vitro donde la
maduración de los ovocitos con el compuesto MAS tiene una duración
de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 horas.
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un método in vitro donde los
folículos preovulatorios han sido inducidos para lutenizarse con
una hormona luteinizante (LH) o un agonista o antagonista de esta o
un derivado activo de esta y/o la corión gonadotropina humana (hCG)
o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de
esta.
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un método in vitro donde la
maduración de los ovocitos con el compuesto MAS tiene una duración
de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 horas, preferiblemente de
aproximadamente 6 horas.
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un método in vitro donde la
dosificación del compuesto MAS usada es de aproximadamente 0.01 a
aproximadamente 100 \mumol por litro, preferiblemente de
aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 \mumol por litro.
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un método in vitro donde el
compuesto MAS es uno de los compuestos mencionados en WO 96/00235;
96/27658; 97/00884; 98/28323; 98/54965 y 98/55498, mas
específicamente los compuestos mencionados en la reivindicación 1
de estos.
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un método in vitro donde el
compuesto MAS es FF-MAS.
Adicionalmente, la presente invención se refiere
a un kit farmacéutico en forma de dosificación unitaria para el use
por la fertilización in vitro que comprende dosificaciones
de unidades separadas, dicho kit comprendiendo unidades de
dosificación separadas para la administración diaria secuencial de
una hormona hipotalamica y/o una hormona pituitaria o un agonista o
antagonista de esta o un derivado activo de esta para la
administración diaria secuencial y 1 unidad de dosificación de un
compuesto MAS. Este kit puede tener las características preferidas
anteriormente descritas.
La presente invención esta ilustrada con mayor
detalle por los ejemplos siguientes, los cuales, no obstante, no
deben ser construidos como limitadores. Las características
descritas en la descripción precedente, en los ejemplos siguientes
y en las reivindicaciones pueden ser, tanto por separado como en
cualquier combinación de estos sustanciales para realizar la
invención de diversas maneras.
Los ovocitos fueron obtenidos a partir de ratones
hembra inmaduros (C57BL/6JxDBA/2JF1, Bomholtgaard, Dinamarca) con
un peso de 13-16 gramos, que fueron mantenidos bajo
temperatura controlada (20-22ºC), luz (luces entre
06.00-18.00) y humedad relativa
(50-70%). Los ratones recibieron una inyección
intraperitoneal de 0.2 ml gonadotropinas (Gonal-F,
Serono) conteniendo 20 IU de FSH y 48 horas mas tarde los animates
fueron matados por dislocación cervical. Los ovarios fueron
diseccionados y los ovocitos fueron aislados en un medio Hx (ver
mas abajo) bajo un estereomicroscopio por rotura manual de los
folículos usando un par de agujas de grosor 27. Los ovocitos
esféricos que mostraban una vesícula germinal intacta (en adelante
designada GV) fueron divididos en cumulus incluidos los ovocitos
(en adelante designados CEO) y los ovocitos desnudos (en adelante
designados NO) y colocados en un medio esencial
\alpha-mínimo (\alpha-MEM sin
ribonucleosidos, Gibco BRL, Cat. Nº. 22561) suplementados con 3
mg/ml de albumina de suero bovino (BSA, Cat Sigma. No.
A-7030), 5 mg/ml de albumina de suero humano (HSA,
Statens Seruminstitut, Dinamarca), 0.23 mM de piruvato (Sigma, Cat.
Nada S-8636), 2 mM de glutamina (Flow Cat. Nº.
16-801), 100 IU/ml de penicilina y 100 \mug/ml de
estreptomicina (Flow, Cat Nº. 16-700). Este medio
fue suplementado con 3 mM de hipoxantina (Cat Sigma. No.
H-9377) y designado medio Hx.
Los ovocitos fueron enjuagados tres veces en un
medio Hx y los ovocitos de tamaño uniforme fueron divididos en
grupos de CEO y NO. CEO y NO fueron cultivados en multiplacas de 4
pocillos (Nunclon, Dinamarca) en las cuales cada pocillo contenía
0.4 ml de medio Hx y el compuesto por evaluar en una concentración
de 10 \muM. Un pocillo de control (es decir, 35-45
ovocitos cultivados en un medio idéntico sin adición del compuesto
de prueba) fue siempre cultivado simultáneamente con 3 pocillos de
prueba (35-45 ovocitos por pocillo suplementados
con el compuesto de prueba).
Los ovocitos fueron cultivados en una atmósfera
humedecida del 5% de CO_{2} en aire durante 24 horas a 37ºC.
Hacia el final del periodo de cultivo, el numero de ovocitos con
GV, GVB y cuerpos polares (en adelante designados PB),
respectivamente, fueron contados usando un estereomicroscopio
(Wildt, Leica MZ 12). El porcentaje de GVB, definido como
porcentaje de ovocitos sometidos a GVB por numero total de ovocitos
\hbox{en este pocillo, fue calculado como:}
% GVB =
((numero de GVB + numero de PB)/ número total de ovocitos) x
100
Todos los pacientes de la FIV pueden de forma
potencial recibir este tratamiento, gama de edad de 20 a 45 años.
El tratamiento hormonal puede ser un tratamiento corto o largo a
base de gonadotropina con o sin subregulación pituitaria o con y
sin el uso del antagonista de GnRH y con o sin el use de hCG. Las
terapias hormonales apropiadas futuras designadas para la FIV
pueden también ser usadas. Los folículos de tamaño medio a completo
(tamaño 10 a 25 mM, preferencial folículos de 16 a 20 mM) serán
aspirados bajo guiado por ultrasonidos.
El fluido aspirado sera buscado para complejos de
ovocitos-cumulus (COC) y una vez identificado bajo el
estereomicroscopio (con o sin el uso de filtros de embriones), el
COC sera puesto en cultivo.
La exposición a FF-MAS puede
variar de 1 a 60 horas, preferentemente de 4 a 30 horas, y puede
ser antes, entre y hasta 24 horas después de la fertilización. Se
puede usar una amplia variedad de medios de cultivo de ovocitos o
componentes de medios conocidos por el operario experto. La
albumina de suero humano (HSA) puede o no ser añadida al medio. Si
se añade, puede hacerse en una concentración de 0.1 a 100 mg/ml,
preferentemente de 5 a 15 mg/ml o de 0.5 a 1.5 % de volumen/volumen.
La formulación de FF-MAS puede ser en forma de una
solución madre de etanol, DMSO u otra solución de solvente orgánico
o puede ser en forma de pocillos de FF- MAS/HSA revestidos en seco
listos para el uso añadiendo el medio de cultivo apropiado. La
concentración de FF-MAS puede variar de 0.1 \muM a
100 \muM, preferentemente de 10 a 30 \muM.
Después o durante el cultivo in vitro con
FF-MAS, los ovocitos pueden ser fertilizados por
FIV convencional o por inyección de esperma intracitoplasmatico
(ICSI) o por métodos de fertilización apropiados futuros que
conducen a zigotos fertilizados. El embrión en desarrollo puede ser
transferido en el día 1 hasta el día 6 después de la fertilización,
preferentemente en el día 2 hasta el 3, bien como una transferencia
ovárica individual o como una transferencia ovárica múltiple.
La paciente puede recibir una terapia de
progesterona y/o de estrógenos antes y después de la transferencia
ovárica en protocolos diseñados individuales para cebar y sustentar
la pared endométrica receptiva apropiada.
En comparación con los procedimientos conocidos,
se obtuvieron mejores resultados usando el procedimiento
anterior.
La paciente sufrió subregulación con FSH
recombinante con una dosis diaria de promedio de 225 IU empezando
el Día 1 o 2 del ciclo corriente y se use un antagonista de GnRH,
es decir, Cetrorelix (1 mg diario, subcutaneamente, una inyección),
en el ciclo corriente. Al menos 3 folículos de 17 mM o mas estaban
presentes al administrar hCG, es decir, Profasi (10.000 IU, una
inyección). Los folículos fueron aspirados y los ovocitos de la
metafase II fueron cultivados en sistema de cultivo de ovocitos
conteniendo medios de fertilización in vitro (FIV) estándar
(IVF 20 (que están disponibles por Scandinavian IVF Science AB,
Gothenburg, Suecia)) suplementados con albumina de suero humano
(0.8%) y FF-MAS (5 \muM). Todos los ovocitos
fueron cultivados en condiciones normales a 37ºC en la incubadora.
Cada ovocito fue cultivado en un pocillo en una placa de cultivo de
cuatro cámaras como sistema de medios de cultivo. La duración de la
exposición a los medios de cultivo con el tratamiento fue de 4
horas (\pm30 minutos) antes de la inyección de esperma
intracitoplasmico (en adelante designado ICSI) y 20 horas (\pm1
hora) después de ICSI en el anterior medio IVF 20. Los preembriones
fueron evaluados para la fase de seccionamiento y fragmentación /
morfología en los días 1, 2 y 3 post ICSI. Después de 3 días de
cultivo, se sustituyo una selección de los mejores preembriones,
normalmente dos preembriones, en la paciente hembra. La paciente
hembra recibió un estrógeno, es decir, Estrofem (6 mg/día), y una
progesterona, es decir Utrogestan (600 mg/día, supositorio
micronizado vaginal), para dejar la pared del endometrio en el
útero de la paciente sensible y lista para permitir la implantación
de los ovarios transferidos. La continuación de hormonas esteroides
de mantenimiento fue dependiente de la paciente y fue reducida
después de 3-10 semanas dependiendo del examen de
ultrasonidos y análisis de sangre.
En comparación con los procedimientos conocidos,
se obtuvieron mejores resultados usando el procedimiento
anterior.
La paciente sufrió subregulación con un análogo
de GnRH, es decir, Synarel (espray nasal, dos pulsaciones diarias),
durante al menos 14 días (empezando en la fase luteal del ciclo
precedente o Día 1 o 2 en la fase folicular del ciclo corriente) y
estimulación ovárica con FSH recombinante con una dosis diaria de
promedio de 225 IU. Al menos 3 folículos de 17 mM o mas estuvieron
presentes al administrar hCG, es decir Profase (10.000 IU, una
inyección). Los folículos fueron aspirados y los ovocitos de la
metafase II fueron cultivados en un sistema de cultivo de ovocitos
conteniendo medios de fertilización in vitro (FIV) estándar
(IVF 20 (que están disponibles por Scandinavian IVF Science AB,
Gothenburg, Suecia)) suplementados con albumina de suero humano
(0.8%) y FF-MAS (5 \muM). Todos los ovocitos
fueron cultivados en condiciones normales a 37ºC en la incubadora.
Cada ovocito fue cultivado en un pocillo en una placa de cultivo de
cuatro cámaras como sistema de medios de cultivo. La duración de la
exposición a los medios de cultivo con el tratamiento fue de 4
horas (\pm30 minutos) antes de la inyección de esperma
intracitoplasmico (ICSI) y 20 horas (\pm1 hora) después de ICSI en
el medio FIV 20 anterior. Los preembriones fueron evaluados para
fase de seccionamiento y fragmentación / morfología en los días 1,
2 y 3 post ICSI. Después de 3 días de cultivo, una selección de los
mejores preembriones, normalmente dos preembriones, fueron
sustituidos en la paciente hembra. La paciente hembra recibió un
estrógeno, es decir, Estrofem (6 mg/día), y una progesterone, es
decir, Utrogestan (600 mg/día, supositorio micronizado vaginal), a
diario para dejar la pared endometrial en el útero de la paciente
sensible y lista para permitir la implantación de los ovarios
transferidos. La continuación de hormonas esteroides de
mantenimiento fue dependiente de la paciente y fue reducida después
de 3-10 semanas dependiendo del examen de
ultrasonidos y análisis de sangre.
En comparación con los procedimientos conocidos,
se obtuvieron mejores resultados usando el procedimiento
anterior.
Usando el procedimiento descrito en el ejemplo 3
con la condición de que en vez de usar FF-MAS en
una concentración de 5 \muM, se usó FF-MAS en una
concentración de 20 \muM, se obtuvieron mejores resultados que con
los procedimientos conocidos.
Usando el procedimiento descrito en el ejemplo 4
con la condición de que en vez de usar FF-MAS en
una concentración de 5 \muM, se use FF-MAS en una
concentración de 20 \muM, se obtuvieron mejores resultados que con
los procedimientos conocidos.
Claims (9)
1. Método in vitro para la sincronización
de la maduración de ovocitos nuclear, citoplasmatica y/o membranosa
y para disminuir la incidencia de preembriones humanos con
anomalias de los cromosomas (aneuploidía), donde los ovocitos
humanos que han sido aspirados de una mujer, en un periodo
consecutivo de 30 días, cuyo periodo temporal es de al menos
aproximadamente 7 días, preferiblemente de al menos aproximadamente
10 días, mas preferido de al menos aproximadamente 14 días, han
sido tratados con una hormona hipotalamica y/o una hormona
pituitaria o un agonista o antagonista de esta o un derivado activo
de esta, son puestos en contacto con un compuesto MAS en una
cantidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 \mumol por
litro.
2. Método in vitro según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde la mujer ha sido tratada de
infertilidad, y/o para mejorar la maduración de sus ovocitos, y/o
para mejorar la fertilidad de sus ovocitos, y/o para mejorar el
nivel de implantación por maduración y fertilización humana in
vitro.
3. Método in vitro según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde el periodo consecutivo consistía
en un ciclo menstrual.
4. Método in vitro según la reivindicación
precedente donde la maduración de los ovocitos con el compuesto MAS
tiene una duración de aproximadamente 15 a aproximadamente 60
horas.
5. Método in vitro según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde los folículos preovulatorios
fueron inducidos a lutenizarse con una hormona luteinizante (LH) o
un agonista o antagonista de esta o un derivado activo de esta y/o
corion gonadotropina humana (hCG) o un agonista o antagonista de
esta o un derivado activo de esta.
6. Método in vitro según la reivindicación
precedente donde la maduración de los ovocitos con el compuesto MAS
tiene una duración de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 horas,
preferiblemente de aproximadamente 6 horas.
7. Método in vitro según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde la dosificación del compuesto
MAS es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100 \mumol por
litro, preferiblemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100
\mumol por litro.
8. Método in vitro según la precedente
reivindicación donde el compuesto MAS es
FF-MAS.
9. Kit farmacéutico en forma de dosificación
unitaria para el use por la fertilización in vitro que
comprende dosificaciones de unidades separadas, dicho kit
comprendiendo unidades de dosificación separadas para la
administración diaria secuencial de una hormona hipotalamica y/o
una hormona pituitaria o un agonista o antagonista suyo o un
derivado activo para la administración diaria secuencial y 1 unidad
de dosificación de un compuesto MAS.
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