ES2260809T3 - Metodo para la determinacion del sexo de una progenie mamifera. - Google Patents

Metodo para la determinacion del sexo de una progenie mamifera.

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Abstract

PROCEDIMIENTO PARA AUMENTAR EL PORCENTAJE DE LA DESCENDENCIA DE UNO U OTRO SEXO DE MAMIFEROS, QUE COMPRENDE PONER UNA MUESTRA DE SEMEN EN CONTACTO CON UN ANTICUERPO ESPECIFICO DE LOS ESPERMATOZOOS QUE DETERMINAN UN SEXO, Y SEPARAR TALES ESPERMATOZOOS DE LOS QUE DETERMINAN EL OTRO SEXO, ENCONTRANDOSE DICHO ANTICUERPO FIJADO A UN SOPORTE DE ESFERAS MAGNETICAS NO POROSAS CON UN DIAMETRO DE 0,1 A 2 MICRAS.

Description

Método para la determinación del sexo de una progenie mamífera.
La presente invención se refiere a un método para separar espermatozoides determinantes de X e Y poniendo en contacto una muestra de esperma con un anticuerpo específico para un sexo, uniéndose el anticuerpo a una perla magnética de un diámetro que permita la separación de espermatozoides que tienen motilidad suficiente como para permitir una inseminación con éxito y fecundidad.
Los ganaderos y otras personas dedicadas a la cría de animales llevan reconociendo desde hace mucho tiempo lo deseable de mejorar la probabilidad de progenie de un sexo seleccionado. En el pasado se han propuesto métodos para aumentar el porcentaje de células espermáticas X o células espermáticas Y para lograr así unas posibilidades mayores de conseguir una progenie macho o hembra, respectivamente. Se han estudiado ejemplos de investigaciones anteriores, por ejemplo, en Garner, D.L. et al., "An Overwiew of Separation of X- and Y-Spermatozoa", Proceedings of the Tenth Technical Conference on Artificial Insemination and Reproduction ("Actas del décimo congreso técnico sobre inseminación artificial y reproducción") (National Association of Animal Breeders - "Asociación Nacional de Criadores de Animales"), págs. 87-92 (1984) y Pincel, D. et al., "Flow Cytometric Determination of the Proportions of X- and Y-Chromosome Bearing Sperm In Samples of Purportedly Separated Bull Sperm", J. Animal Scien., 60, págs. 1303-1307 (1985).
Métodos previos han incluido, por ejemplo, métodos basados en la sedimentación por densidad (véase, por ejemplo, Brandriff, B.F. et al., "Sex Chromosome Ratios Determined by Karyotipic Análisis in Albumin-Isolated Human Sperm", Fértil. Steril., 46, págs. 678-685 (1986)).
La patente de los EE.UU. 3.687.806 concedida a Van Den Bovenkamp describe un método inmunológico para controlar el sexo de una progenie mamífera mediante el uso de anticuerpos que reaccionan bien con los cromosomas X o Y y que utiliza una etapa de aglutinación para separar los anticuerpos unidos de los anticuerpos no afectados.
La patente de los EE.UU. 4.191.749 concedida a Bryant describe un método para aumentar el porcentaje de progenie mamífera de cualquier sexo mediante el uso un anticuerpo específico de macho asociado a un material inmunoabsorbente en fase sólida para unirse selectivamente a espermatozoides determinantes de macho, mientras que los espermatozoides determinantes de hembra permanecen sin unir en un sobrenadante.
La patente de los EE.UU. 5.021.244 concedida a Spaulding describe un método para clasificar células vivas basándose en el contenido de ADN, particularmente poblaciones espermáticas para producir subpoblaciones enriquecidas en esperma X o Y por medio de proteínas de membrana asociadas al sexo y anticuerpos específicos para tales proteínas.
El documento WO 9707399 describe un método para separar espermatozoides determinantes de X e Y utilizando anticuerpos y filtración a través de un filtro de lana de vidrio. Se describe un ejemplo teórico adicional que utiliza perlas magnéticas con un diámetro de 4,5 micras.
Sin embargo, estos métodos a menudo dan como resultado una separación insuficiente de esperma X e Y y a menudo dañan el esperma, reduciendo así su motilidad y su tasa de éxito de fecundidad.
Es, por tanto, un objeto de la presente invención proporcionar un método de separación de espermatozoides determinantes de X e Y que comprende poner en contacto una muestra de semen con un anticuerpo específico para espermatozoides determinantes de un sexo y separar dichos espermatozoides de espermatozoides determinantes del otro sexo, estando dicho anticuerpo unido a un soporte de perla magnética no poroso que tiene de 0,1 a 2 micras.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para aumentar la probabilidad de que una progenie mamífera no humana sea de un sexo deseado específico.
Es un objeto adicional de la invención proporcionar un método para la separación de espermatozoides determinantes de X e Y sin comprometer la motilidad o la tasa de fecundidad de los espermatozoides separados.
Es todavía un objeto adicional de la invención proporcionar un método para separar esperma determinante de X e Y mediante anticuerpos específicos para el esperma seleccionado, unido a perlas magnéticas, tal como se esbozó anteriormente, para permitir una separación altamente específica, de modo que se proporcione una muestra de esperma enriquecida en un tipo de espermatozoides seleccionado y sustancialmente libre del otro tipo de espermatozoides.
Estos y objetos adiciones de la presente invención se consiguen mediante un método tal como se esbozó anteriormente que pone en contacto una muestra de esperma con anticuerpos específicos frente a un tipo de espermatozoides seleccionado, estando unidos los anticuerpos a perlas, preferiblemente perlas magnéticas que tienen un diámetro de desde 0,1 hasta 2 micras, y posteriormente extraer las perlas, mediante lo cual puede recogerse el sobrenadante restante y contiene espermatozoides sólo del tipo determinante de X o Y.
La presente invención proporciona la separación de esperma portador de X e Y que es competente para fecundar utilizando técnicas convencionales de IA. Tal como se indicó anteriormente, los métodos de separación anteriores a menudo comprometen la motilidad y capacidad de fecundación del esperma, de modo que la fecundación que utiliza tal esperma separado requiere técnicas complicadas tales como FIV (fecundación in vitro). Puede utilizarse el método de la invención para separar esperma de X e Y de una variedad de especies mamíferas, incluyendo ganado diverso, tal como ganado vacuno y ovejas, así como perros, gatos, caballos, cerdos y otras especies. El procedimiento también puede aplicarse al semen humano.
Mediante la presente invención, puede separarse una muestra de esperma que contiene tanto esperma X como Y para producir una subpoblación espermática enriquecida en X o Y que es sustancialmente pura con respecto a los espermatozoides deseados y sustancialmente libre del otro tipo de espermatozoides. Por "sustancialmente libre" se quiere decir que el uso de una muestra enriquecida, por ejemplo, con esperma X, si se utiliza para inseminación artificial, sólo tendría pocas posibilidades de producir una progenie macho, porque la muestra de esperma tiene menos del 20%, preferiblemente menos del 10% de esperma Y. La separación de espermatozoides X o Y se lleva a cabo mediante el uso de anticuerpos que se unen a proteínas específicas de X o Y de las células espermáticas. Estos anticuerpos pueden ser de cualquier tipo de anticuerpo (incluyendo IgG e IgM) y pueden ser o bien anticuerpos policlonales o bien anticuerpos monoclonales. Si van a utilizarse anticuerpos policlonales, entonces tales anticuerpos pueden prepararse según procedimientos conocidos per se. Por ejemplo, pueden utilizarse procedimientos tales como los descritos en Hurn B.A. et al., (1980), Meth. in Enzymology, Ed. Van Vanakis, H. y Langone, J., págs. 104-142.
Si se desea, pueden utilizarse y prepararse anticuerpos monoclonales según los métodos que se conocen per se en la técnica, tales como los creados originariamente por Milstein y Kohler, publicados en Nature (1975), 256, págs. 495-497. Este procedimiento básico implica inyectar a un animal, normalmente un ratón, una sustancia inmunogénica. Tras un tiempo adecuado para la producción de anticuerpos frente al inmunógeno, se sacrifica el ratón. Se extraen las células del bazo y se fusionan con células de mieloma. Las células hibridoma que resultan de esta fusión pueden reproducirse in vitro, y cada una expresa información genética para un anticuerpo específico. Los anticuerpos producidos a partir de una fusión de hibridoma sólo reconocerán, por tanto, a un único determinante antigénico del inmunógeno.
Entonces las células cultivadas a partir de células de hibridoma individuales pueden seleccionarse para la producción de anticuerpos frente al determinante antigénico diana. Los hibridomas positivos para el antígeno diana pueden seleccionarse adicionalmente para identificar los que tienen el nivel deseado de afinidad. Los anticuerpos monoclonales que muestran todas estas características pueden seleccionarse entonces utilizando condiciones de ensayo reales para determinar si las condiciones de ensayo alteran las características de unión o afinidad del anticuerpo, y para descartar aquellos con reactividad cruzada frente a posibles antígenos contaminantes.
Anticuerpos preferidos son aquellos que son específicos para y se unen a esperma Y, tales como los anticuerpos que se unen al antígeno H-Y. Tales anticuerpos pueden prepararse, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en la patente de los EE.UU. 4.680.258 concedida a Hamerling et al.
Tal como se indicó anteriormente, los anticuerpos específicos para los espermatozoides X o Y se inmovilizan sobre perlas. Estas perlas pueden ser perlas de plástico o perlas magnéticas. Perlas de plástico útiles son de Sepharose 6MB, u otras perlas que son lo suficientemente grandes como para depositarse en un procedimiento de purificación discontinuo. Cuando se utilizan perlas de plástico, las perlas que tienen anticuerpo unido a las mismas se mezclan en una muestra de esperma y se deja que se depositen en el fondo del recipiente. Esta etapa puede repetirse, si se desea, para aumentar la completitud de la separación de esperma según un cromosoma sexual.
Si se utilizan perlas magnéticas, las perlas son microesferas de partículas magnéticas que representan una matriz de inmovilización. Se ha descubierto que, según la presente invención, las perlas magnéticas que tienen un diámetro de desde 0,1 hasta 2 micras de diámetro son específicamente útiles para separar la especie deseada de espermatozoides sin comprometer la motilidad y capacidad de fecundación de los espermatozoides. Perlas particularmente útiles se describen, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. 5.071.076; la patente de los EE.UU. 5.108.933; patente de los EE.UU. 4.795.698; publicación de patente PCT nº WO91/09678. Según los procedimientos descritos en estas patentes, las perlas pueden prepararse teniendo especialmente un diámetro de 0,1 a 0,5 micras.
Los anticuerpos se unen a las perlas por medio de procedimientos que se conocen per se en la técnica. En general, se une un compuesto de enlace a las perlas magnéticas durante la fabricación de las perlas. Sobre las perlas se une un anticuerpo (tal como un anticuerpo IgG que se dirige contra IgM de ratón) mezclando las perlas a aproximadamente 1 mg de hierro/ml con anticuerpo purificado a 1 mg/ml de proteína. Después de que el anticuerpo se une a las perlas, las perlas se lavan de manera que sólo permanece el anticuerpo unido. Procedimientos adicionales conocidos por los expertos en la técnica se describen, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. 4.018.886; patente de los EE.UU. 3.970.518; patente de los EE.UU. 4.855.045; y patente de los EE.UU. 4.230.685. La proteína A es un compuesto de enlace preferido que aumenta enormemente la eficacia de captación por parte de los anticuerpos unidos. (Forsgren et al., (1977) J. Immunol. 99:19). La proteína A se une a la parte Fc de los anticuerpos de subclase IgG, prolongando y presentando así la parte Fab de estos anticuerpos. La orientación correcta resultante de los anticuerpos y la prolongación alejada de las partículas conduce a una interacción muy eficaz entre los anticuerpos unidos y su diana.
El método para unir la proteína A a las partículas magnéticas puede avanzar mediante cualquiera de los diversos procedimientos disponibles a través de la bibliografía científica conocida. En uno de tales procedimientos, se derivatizan químicamente partículas magnéticas de óxido de hierro de aproximadamente un diámetro de un micrómetro mediante una reacción, en primer lugar con 3-aminopropiltrietoxisilano, y luego con glutaraldehído. Las partículas magnéticas derivatizadas se mezclan entonces con proteína A dando como resultado una partícula magnética a la que la proteína A se une covalentemente. Entonces, los anticuerpos se añaden a las partículas magnéticas de proteína A y tras una corta incubación, se forman los complejos de proteína A-anticuerpo. (Weetall,
H.H. (1976) Meth. In Enzymol. 44:134-48).
El siguiente es un ejemplo específico según el método de la invención.
Ejemplo 1
Se lavan aproximadamente 10^{5} a 10^{8} espermatozoides en una cantidad de 1-10 ml de volumen, con medio de cultivo tamponado (Medio de Eagle modificado por Dulbecco) centrifugando a 1.500 rpm durante 10 minutos. Entonces el esperma se resuspende en 4 ml de medio de cultivo tamponado tras decantar cuidadosamente el sobrenadante. La suspensión de esperma se divide entonces en dos viales, y en cada vial se añaden 500 \mul de perlas magnéticas a las que se han unido anticuerpos frente a esperma portador de Y. Se tapan los viales y entonces se hacen girar a 3 rpm, de manera continua, en un rotador a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Tras la rotación, se sueltan las tapas y se sitúan en un soporte de captación magnética ("magnetic capture rack"), tal como el descrito en la patente de los EE.UU. 5.571.481. Tras 15 minutos de exposición al campo magnético, se extrae el sobrenadante que es rico en esperma portador de X y sustancialmente libre de esperma portador de Y. Entonces, en el sobrenadante extraído se hace un recuento del esperma, y se ajusta la concentración según sea necesario para la inseminación. Esa muestra se carga entonces en una pajuela o pajuelas para el procedimiento de inseminación.
Si se desea, puede obtenerse una separación más completa repitiendo, de manera seriada, el procedimiento de captación magnética en el sobrenadante.
Habiendo descrito así la invención, quedará claro que la misma puede variarse de muchas maneras. Tales variaciones no deben considerarse como una desviación del espíritu y alcance de la invención, y se pretenden incluir todas esas modificaciones tal como serían obvias para un experto en la técnica, dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (8)

1. Método de separación de espermatozoides determinantes de X e Y que comprende poner en contacto una muestra de semen con un anticuerpo específico para espermatozoides determinantes de un sexo y separar dichos espermatozoides de espermatozoides determinantes del otro sexo, estando unido dicho anticuerpo a un soporte de perla magnética no poroso que tiene un diámetro de 0,1 a 2 micras.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo se une a dichas perlas a través de un compuesto de enlace intermedio.
3. Método según la reivindicación 2, en donde dicho compuesto de enlace intermedio es proteína A.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en donde dicho anticuerpo es específico para esperma portador de Y.
5. Método según la reivindicación 4, en donde dicho anticuerpo es específico para un antígeno H-Y.
6. Método según la reivindicación 4, en donde dichas perlas tienen un diámetro de 0,1 a 0,5 micras.
7. Método según la reivindicación 6, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
8. Método según la reivindicación 1, en donde dicha muestra de semen se pone en contacto con dichas perlas, la muestra se expone a un campo magnético, y el sobrenadante restante se extrae para proporcionar un sobrenadante rico en esperma portador de X.
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