ES2262155T3

ES2262155T3 - Formulacion liposomial mejorada.

Info

Publication number: ES2262155T3
Application number: ES96918308T
Authority: ES
Inventors: Carl R. Alving; Jean M. Muderhwa
Original assignee: Jenner Technologies
Current assignee: Jenner Technologies
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: AU721085B2; EP0831780B1; ATE321534T1; US5820880A; DE69635987T2; EP0831780A4; JPH11507628A; CA2221310A1; DE69635987D1; EP0831780A1; WO1996040065A1; AU6099796A

Abstract

DEPENDIENDO DEL ANTIGENO ENCAPSULADO, LOS FORMULADOS LIPOSOMICOS SUFREN INESTABILIDAD EN PRESENCIA DE ALUMBRE. LOS FORMULADOS QUE CONTIENEN UN DETERGENTE NO IONICO COMO AGENTE ESTABILIZANTE EVITAN ESTA INESTABILIDAD.

Description

Formulación liposomal mejorada.

Campo de la invención

La invención se refiere a formulaciones farmacéuticas, en especial a formulaciones liposomales. De forma más específica, la invención se refiere a un método para estabilizar liposomas administrados en presencia de un compuesto de aluminio adyuvante.

Antecedentes de la técnica anterior

La formulación de vacunas mediante encapsulación de antígenos/inmunógenos en liposomas constituye un método ampliamente utilizado. A menudo es deseable incluir, junto con el antígeno encapsulado en los liposomas, un adyuvante que incluya una sal de aluminio (es decir, un alumbre), por ejemplo hidróxido de aluminio. Se ha observado que en algunos casos el alumbre estimula en gran medida la inmunogenicidad del antígeno, mientras que en otros no tiene efectos o inhibe la respuesta inmune. Parece que la naturaleza del efecto observado depende de la naturaleza del antígeno. En conejos a los que se les han inyectado liposomas que contienen el lípido A y el antígeno de la malaria R32tet32, la producción de anticuerpos mejora cuando los liposomas son adsorbidos en alumbre (observaciones no publicadas). Sin embargo, un péptido de VIH encapsulado en liposomas presentaba una inmunogenicidad reducida cuando se incluía alumbre en la formulación (White, W.I. y col. Vaccine (1995), en impresión). Una composición similar que
contenía el antígeno de la malaria RLF no se vió afectada por la presencia de alumbre (observaciones no publicadas).

Sería deseable preparar una formulación de liposomas de tal forma que la administración con alumbre mejorara coherentemente la respuesta inmune. La presente invención describe estas formulaciones y también proporciona un medio para predecir, para un determinado antígeno, si la composición mejorada será o no deseable o necesaria.

Descripción de la invención

Se ha descubierto ahora, de forma sorprendente, que la presencia de un adyuvante de alumbre rompe los liposomas que contienen ciertos antígenos. Prevenir esta disrupción estabiliza y mantiene la inmunogenicidad de la composición. Además, la medida de la capacidad de una formulación particular de experimentar tal disrupción en presencia de alumbre proporciona una herramienta predictiva para determinar si el alumbre disminuirá o no la inmunogenicidad de la composición.

Así, en un aspecto, la invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende al menos un antígeno encapsulado en liposomas, comprendiendo además dicha composición alumbre y al menos un agente estabilizador en una cantidad efectiva para impedir la disrupción de dichos liposomas en presencia de alumbre, donde dicho agente estabilizador es un detergente no iónico, un polioxietilen sorbitan éster, cuya forma esterificada contiene menos de 18 átomos de carbono y/o al menos un enlace-\pi.

Breve descripción de las figuras

Figura 1a: es una representación gráfica de la velocidad de liberación de PSA desde los liposomas en ausencia de alumbre añadido;

Figura 1b: es una representación de la velocidad de liberación de PSA desde los liposomas en presencia de alumbre;

Figura 1c: representa los resultados de la Figura 1b corregidos para las velocidades de liberación mostradas en la Figura 1a.

Figura 2a: muestra el efecto de la concentración de Tween 80 sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia de alumbre en los liposomas;

Figura 2b: muestra el efecto de la concentración de Span 80 sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia de alumbre en los liposomas;

Figura 2c: muestra el efecto de la concentración de Tween 20 sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia de alumbre en los liposomas;

Figura 2d: muestra el efecto de la concentración de Tween 40 sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia de alumbre en los liposomas;

Figura 2e: muestra el efecto de la concentración de Tween 60 (Tween 60 es una marca comercial) sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia de alumbre en los liposomas;

Figura 2f: muestra el efecto de la concentración de Tween 65 (Tween 65 es una marca comercial) sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia de alumbre en los liposomas;

Figura 2g: muestra el efecto de la concentración de Tween 85 (Tween 85 es una marca comercial) sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia de alumbre en los liposomas.

Figura 3: muestra el tiempo de liberación de glucosa desde los liposomas en presencia de Alhydrogel^{TM} para liposomas preparados con y sin Tween 80 (Tween 80 es una marca comercial).

Figura 4a: muestra el efecto de la concentración de Tween 80 sobre la liberación de PSA desde los liposomas a dos temperaturas en ausencia de alumbre;

Figura 4b: muestra el efecto de la concentración de Tween 80 sobre la liberación de PSA desde los liposomas a dos temperaturas en presencia de alumbre;

Figura 4c: representa la diferencia entre las Figuras 4a y 4b.

Formas de llevar a cabo la invención

La invención proporciona un método para estabilizar preparaciones liposomales contra la disrupción causada por la presencia de geles de hidróxido de aluminio o de otros adyuvantes basados en alumbre. Los presentes solicitantes han descubierto que el efecto variable de la adición de adyuvantes de alumbre sobre la inmunogenicidad de las preparaciones liposomales es debido a un efecto del alumbre sobre la integridad de los liposomas per se. Por tanto, además de proporcionar un método para estabilizar estas preparaciones que se romperían en presencia de alumbre, la invención proporciona un método para predecir el efecto de la adición de adyuvantes de alumbre sobre la inmunogenicidad de una composición determinada.

La invención puede ensayarse in vitro en presencia y ausencia de un adyuvante de alumbre en lo que respecta a la liberación de la sustancia encapsulada en los liposomas. El ensayo empleado para detectar esta liberación, por supuesto, dependerá de la naturaleza de la sustancia encapsulada; a continuación se ponen como ejemplos la liberación de glucosa y de PSA, pero el método de ensayo será aquel más apropiado para la sustancia particular en cuestión. Por ejemplo, si la sustancia encapsulada es una citoquina, se puede comparar la concentración de citoquina atrapada en los liposomas y liberada midiendo la actividad proliferativa con respecto a células diana. Si la sustancia atrapada es una enzima, se puede evaluar la actividad de la enzima liberada. Los protocolos precisos para evaluar la velocidad de liberación de una sustancia encapsulada no forman parte de la invención; éstos son estándar en la técnica y propios de la sustancia en cuestión.

Sin embargo, los resultados de este ensayo, tal como lo descubrieron los inventores, predicen el comportamiento de la composición ensayada in vivo. Las composiciones que presentan mejores velocidades de liberación en presencia de alumbre in vitro mostrarán una menor inmunogenicidad in vivo; sin embargo, tanto la mejor velocidad de liberación como la menor inmunogenicidad pueden atenuarse de acuerdo con el método de la invención.

La invención proporciona un remedio especialmente para aquellas composiciones que en el ensayo in vitro demostraron ser propensas a una disrupción debida al alumbre y que, por tanto, redujeron potencialmente la inmunogenicidad. Las composiciones pueden estabilizarse mediante la inclusión en la composición liposomal de un agente estabilizador que impida eficazmente la disrupción de los liposomas debida al contacto con el adyuvante. Los liposomas son formulados utilizando un agente estabilizador, típicamente un detergente no iónico que se corresponde con las propiedades de Tween 80. Estas propiedades vienen determinadas por la estructura del detergente, que contiene cadenas laterales polioxietileno y que está libre de cadenas laterales hidrofóbicas saturadas de cadena larga. Así, el detergente no iónico preferente para ser incluido en las preparaciones liposomales de la invención incluye Tween 20 (Tween 20 es una marca comercial), Tween 40 (Tween 40 es una marca comercial), Tween 80 y
Tween 85.

Tal como es generalmente conocido, los liposomas son estructuras unilamelares o multilamelares en las que un medio acuoso está rodeado de una bicapa lipídica. En general, la composición de la bicapa lipídica, que forma la base estructural del liposoma, está compuesta al menos por fosfolípidos y, de forma más general, por mezclas de fosfolípidos con lípidos per se. Los liposomas más útiles para la presente invención, derivados de fosfatidilcolina, derivados de fosfatidilglicerol y similares, se utilizan junto con componentes no fosfolipídicos, si se desea, por ejemplo con colesterol. Otras realizaciones alternativas adecuadas incluyen mezclas de fosfolípidos con triglicéridos, por ejemplo. Además, se pueden utilizar ácidos grasos, vitaminas lipídicas, esteroides, medicamentos lipofílicos y otros compuestos lipofílicos que puedan incluirse en bicapas lipídicas estables, las cuales pueden incluir o no fosfolípidos. Los liposomas en general se denominan mesofases esmécticas.

De forma más detallada, los liposomas, tal como se utilizan normalmente, se componen de mesofases esmécticas y pueden incluir tanto mesofases esmécticas fosfolipídicas o como no fosfolipídicas o mezclas de las mismas. Las mesofases esmécticas son estados intermedios entre el sólido y el líquido, comúnmente conocidas como cristales líquidos. Estos estados se caracterizan por el orden residual en algunas direcciones pero no en otras. En general, las moléculas contenidas son un poco más largas que anchas y tienen una parte polar o aromática. La forma molecular y las interacciones polar-polar o aromáticas permiten que las moléculas se alineen en matrices parcialmente ordenadas, especialmente cuando las moléculas poseen un grupo polar en un extremo. Los cristales líquidos con un orden de alto rango en la dirección del eje longitudinal de las moléculas que contienen se denominan cristales líquidos esmécticos en capas o lamelares. En los estados esmécticos, las moléculas pueden encontrarse en capas simples o dobles, normales o inclinadas con respecto al plano de la capa y con cadenas alifáticas rígidas o fundidas.

En los liposomas empleados en la presente invención están incluidos fosfolípidos y los liposomas pueden llevar una carga positiva neta, una carga negativa neta o pueden ser neutros. La inclusión de diacetilfosfato es un método adecuado para dotar de carga negativa; se puede utilizar estearilamina para proporcionar una carga positiva. Preferentemente, los lípidos son diacilgliceroles en los cuales al menos un grupo acilo comprende como mínimo 12 átomos de C, preferentemente entre 14 y 24 átomos de C. También es preferente que al menos un grupo cabeza de los fosfolípidos -es decir, la parte de la molécula que contiene el grupo fosfato- sea una fosfocolina, una fosfoetanolamina, un fosfoglicerol, una fosfoserina o un fosfoinositol.

Las soluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol pueden almacenarse a aproximadamente -20ºC. Preferentemente, se utiliza cloroformo como único disolvente ya que se evapora de forma más rápidamente que el metanol.

Se pueden obtener fosfolípidos a partir de fuentes naturales, por ejemplo fosfatidilcolina del huevo o la soja, ácido fosfatídico del cerebro, fosfatidilinositol del cerebro o de vegetales, cardiolipina del corazón o fosfatidiletanolamina de vegetales o bacterias. Sin embargo, preferentemente éstos no se utilizan como fosfátidos primarios - es decir, constituyentes en más del 50% de la composición total de fosfátidos. Se prefiere utilizar fosfolípidos relativamente puros disponibles comercialmente.

En la presente invención, los liposomas pueden comprender lípidos en cualquier proporción molar y opcionalmente contienen colesterol. Preferentemente, DMPC, DMPG y colesterol se combinan en una proporción molar de aproximadamente 0,9:0,1:0,75.

Tal como se utiliza aquí, el término "mezcla lipídica liposomal" se refiere a los componentes que forman la parte estructural, esto es la bicapa lipídica, del liposoma que encapsula la sustancia contenida en un medio acuoso
encerrado.

Existen diversos métodos para elaborar liposomas; el tamaño depende del método elegido. Generalmente, los liposomas suspendidos en una solución acuosa son esféricos y tienen una o varias bicapas lipídicas concéntricas. Cada monocapa se compone de una matriz paralela de moléculas representadas por la fórmula XY donde X es hidrofílica e Y es hidrofóbica; en solución acuosa, las capas concéntricas se disponen de tal modo que las partes hidrofílicas permanecen en contacto con la fase acuosa y las regiones hidrofóbicas autoasociadas. Cuando las fases acuosas están presentes tanto dentro como fuera del liposoma, las moléculas lipídicas forman una bicapa, conocida como lamela, de disposición XY-YX.

Típicamente, los liposomas se preparan mezclando el fosfolípido y otros componentes que forman parte de la estructura del liposoma en un disolvente orgánico, evaporando el disolvente, resuspendiendo en un disolvente acuoso y finalmente liofilizando la composición lipídica/fosfolipídica. La composición liofilizada se reconstituye entonces en un tampón que contiene la sustancia que se vaya a encapsular.

En un método particularmente preferente, los liposomas se preparan mezclando los líquidos que se deben usar, incluido el lípido A, en la proporción deseada, en un recipiente por ejemplo en un matraz de vidrio con forma de pera cuyo volumen es diez veces superior al de la suspensión de liposomas prevista. En un evaporador rotatorio se elimina el disolvente a aproximadamente 40ºC bajo presión negativa. Se puede utilizar el vacío obtenido de un aspirador de bomba filtrante unido a un grifo de agua. Normalmente, el disolvente se elimina en 2-5 minutos. Se puede secar entonces la composición en un desecador bajo vacío, y es estable durante una semana aproximadamente.

Los lípidos secos pueden rehidratarse a aproximadamente fosfolípidos a 30 mM en agua estéril, libre de pirógenos, agitando hasta que toda la película lipídica salga del recipiente. Entonces, se pueden separar los liposomas acuosos en partes alícuotas, liofilizadas y selladas a vacío.

Como alternativa, los liposomas se pueden preparar de acuerdo con el método de Bangham y col., J. Mol. Biol. (1965) 13: 238-252, o tal como lo describe Gregoriadis en Drug Carriers in Biology and Medicine, G. Gregoriadis, Ed. (1979) pp. 287-341, o por el método de Deamer y Uster tal como está descrito en Liposomes, M. Ostro, Ed. (1983), o según el método de evaporación en fase inversa descrito por Szoka y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 4194-4198. Según el método elegido, los liposomas resultantes tendrán distinta capacidad para atrapar el material acuoso y éstos difieren en sus proporciones espaciales con respecto a los lípidos.

Se puede incluir un agente estabilizador en las composiciones de la invención, bien sea mediante la adición de un agente estabilizador en la proporción adecuada en la preparación de una mezcla lipídica liofilizada, o bien mediante la adición del agente estabilizador al tampón de reconstitución. El agente estabilizador puede ser añadido como único detergente o puede ser añadido, por supuesto, como mezcla de detergentes apropiados.

La proporción de agente estabilizador a incluir en la mezcla fosfolipídica/lipídica original o la concentración de agente estabilizador en el tampón de reconstitución dependerá de la naturaleza de la sustancia que deba ser encapsulada y se puede optimizar mediante una experimentación rutinaria. En general, el agente estabilizador estará presente aproximadamente al 0,2-5% molar con respecto a la mezcla lipídica liposomal, preferentemente al 0,5-4% molar aproximadamente.

El propio agente estabilizador será un detergente no iónico con las características físicas apropiadas. De forma más específica, el detergente no iónico debe ser soluble a una temperatura que no afecte negativamente a la integridad de los liposomas y que no desnaturalice o interfiera de otro modo en la inmunogenicidad del antígeno. Así, el detergente debe ser soluble a una temperatura razonable. Se piensa que la incapacidad de Tween 60 y Tween 65 para estabilizar las preparaciones liposomales, ilustrada a continuación en los ejemplos descritos, se debe a su insolubilidad a temperaturas razonables. Las características generales del detergente están representadas por la serie Tween siempre que presenten las propiedades de solubilidad adecuadas.

Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar pero no limitar la invención.

Ejemplo 1 Preparación de liposomas

Se prepararon liposomas encapsuladores de glucosa o del antígeno específico prostático (PSA) según el procedimiento de Alving, C.R. y col., en Liposome Technology: Interactions of Liposomes with the Biological Milieu (1993) III: CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 317-343. Otras descripciones se encuentran en Verma, J.N. y col., Infect Immun (1992) 60: 2438-2444, y en Richards, R.L. y col., Infect Immun (1988) 56: 682-686. La Tabla 1 a continuación muestra las abreviaturas utilizadas para los componentes empleados en estos Ejemplos.

TABLA 1

Abrev.	Nombre	Nº de carbonos	Nº de enlaces-\pi
		en cada acilo	en cada acilo
DLPC	dilauroil fosfatidilcolina	12	0
DMPC	dimiristoil fosfatidilcolina	14	0
DPPC	dipalitoil fosfatidilcolina	16	0
DSPC	diestearoil fosfatidilcolina	18	0
DOPC	dioleoil fosfatidilcolina	18	1
DLnPC	dilinoleoil fosfatidilcolina	18	2
DMPG	dimiristoil fosfatidilglicerol	14	0
CHOL	colesterol
LA	Lípido A
Tween 20	Monolaurato de polioxietilen sorbitano	12	0
Tween 40	Monopalmitato de polioxietilen sorbitano	16	0
Tween 60	Monoestearato de polioxietilen sorbitano	18	0
Tween 65	Triestearato de polioxietilen sorbitano	18	0
Tween 80	Monooleato de polioxietilen sorbitano	18	1
Tween 85	Trioleato de polioxietilen sorbitano	18	1
Span 80	Monooleato de sorbitano

En una preparación típica, se elaboran liposomas multilamelares a partir de una mezcla de DMPC:DMPG:CHOL:
LA en una proporción molar 9:1:7,5:0,011. Se incluye el lípido A como adyuvante. La mezcla lipídica se evapora con rotatición hasta una fina película seca, a aproximadamente 40ºC, a vacío, a partir de una solución de cloroformo, en un matraz en forma de pera. Para asegurar la eliminación completa del disolvente orgánico, se seca luego el matraz a muy bajo vacío (aproximadamente 0,05 mm de Hg) durante toda la noche en un desecador a temperatura ambiente. Después del secado, se esponjan cuidadosamente los lípidos en agua libre de pirógenos estéril, desionizada en un vórtex. Se congela la suspensión resultante a -55ºC, se liofiliza a -20ºC durante toda la noche y a 0ºC-10ºC al día siguiente utilizando un Virtis Unitop 800SL Freeze Mobile (Virtis Company, Gardener, NY).

Los lípidos liofilizados se reconstituyen entonces en presencia de la sustancia que se debe encapsular para obtener liposomas multilamelares que contienen dicha sustancia. Se encapsuló glucosa en los liposomas para facilitar la evaluación de la dispersión; se encapsuló PSA en los liposomas para determinar el efecto de la naturaleza de la sustancia encapsulada sobre la dispersión. El tampón de reconstitución era una solución salina tamponada con fosfato (PBS) o Tris-glicina/NaCl/Tween 80 (TG). Este último tampón se utilizó para incluir el agente estabilizador, en este caso Tween 80. En los ejemplos posteriores, cuando se añaden otros candidatos estabilizadores alternativos, éstos se sustituyen por Tween 80 en el tampón. La concentración fosfolipídica liposomal en el tampón de reconstitución es 10-200 mM.

Se elimina la sustancia no encapsulada (glucosa o PSA) mediante el lavado de los liposomas tres veces con NaCl 0,15 M a 27.000 x g durante 10 minutos a 10ºC. Los liposomas resultantes se suspenden en NaCl 0,15 M o en un tampón isotónico apropiado para alcanzar una concentración fosfolipídica final de 10-200 mM.

Ejemplo 2 Efecto de los geles de hidróxido de aluminio sobre la integridad de los liposomas

Para determinar la integridad de los liposomas, se calculó primero la glucosa atrapada mediante restando la glucosa atrapada de la glucosa total en el paso de reconstitución. Se midieron la glucosa atrapada y la glucosa total tal como lo describe Kinsky, S.C. Methods Enzymol (1974) 32:501-513; Alving, C.R. y col. (1993) (supra) mediante evaluación del cambio de absorbancia a 340 nm en presencia de hexoquinasa y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. Se midió la liberación de glucosa de la misma forma en función del tiempo a varias temperaturas en presencia y ausencia de alumbre. Los liposomas que contenían glucosa preparados como en el Ejemplo 1 fueron incubados con y sin varios geles de hidróxido de aluminio comercialmente disponibles en una proporción 1/1 (v/v). Alhydrogel^{TM} y Rehydrogel^{TM} son de Reheis, Inc., Berkeley Heights, NJ; el gel absortivo Rehsorptar^{TM} es suministrado por Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL.

Cuando no se añadió alumbre se liberó solamente un 0,06% aproximadamente de la glucosa atrapada después de 120 horas. Sin embargo, cuando se mezcló gel de hidróxido de aluminio con las preparaciones liposomales, la glucosa se liberó linealmente con el tiempo de forma dependiente de la temperatura a varias velocidades, según la elección del alumbre. La Tabla 2 resume las velocidades iniciales de liberación de la glucosa atrapada en presencia de los distintos geles de hidróxido de aluminio de los liposomas preparados en el Ejemplo 1 incubados a 100 mM de fosfolípidos mezclados a una proporción de 1/1 (v/v) con hidróxido de aluminio dosificado a 2 mg de aluminio/ml antes de la incubación.

TABLA 2

Liberación de glucosa
	V_{máx} (\mumol min^{-1} x 10^{6})
Tipo de compuesto alumínico	4ºC	Temperatura ambiente	37ºC
ensayado		(24ºC-27ºC)
Alhydrogel^{TM}	8,67	15,10	23,35
Rehydragel	6,69	11,50	25,70
Rehsorptar	2,92	3,85	9,69

Estos datos confirman la influencia de la temperatura y de la naturaleza de la preparación de alumbre sobre la velocidad de liberación.

Ejemplo 3 Efecto de la sustancia encapsulada sobre la estabilidad de los liposomas

Se prepararon liposomas que contenían PSA como sustancia encapsulada de acuerdo con el Ejemplo 1. Se determinaron las concentraciones de PSA en los liposomas mediante una modificación del ensayo de Lowry, O.H. y col. J. Biol. Chem (1951) 193: 265-275, tal como lo describe Alving, C.R. y col. (1993) (supra). Se determinó el PSA liberado utilizando un ensayo para proteínas estándar Lowry.

Brevemente, el ensayo del PSA en los liposomas se modifica para incluir la adición secuencial de cloroformo a una parte alícuota de la muestra de liposomas, con evaporación de la muestra hasta sequedad en un Speed Vac Concentrator SC100 (Savant Instruments, Inc., Farmingdale, NY) a 43ºC o en bajo corriente de nitrógeno, con la adición de un 15% de desoxicolato de sodio en salina normal, y mediante un vórtex para asegurar que todas las proteínas de la muestra están disueltas. La solución de la muestra de desoxicolato de sodio se procesa entonces en el ensayo para proteínas estándar Lowry. A los 20 minutos de incubación, se centrifuga la muestra a 27.000 x g durante 10 minutos, se recoge el sobrenadante y se mide la absorbancia a 750 nm.

Utilizando los ensayos anteriores se descubrió que la eficacia de encapsulación para el PSA era del 50%.

Se incubaron liposomas que contenían PSA con y sin Alhydrogel^{TM} en una proporción 1/1 (v/v) a 4ºC, temperatura ambiente y a 37ºC. Como se muestra en las Figuras 1a y 1b, se liberó linealmente el PSA con el tiempo durante un período de 14 días de forma dependiente de la temperatura con o sin alumbre, pero la liberación de PSA mejoraba notablemente en presencia de Alhydrogel^{TM}. La Figura 1c muestra la liberación de PSA en presencia del alumbre corregido para la liberación de PSA en su ausencia. La Tabla 3 muestra la V_{máx} calculada para su comparación con los valores correspondientes de glucosa. La comparación de los valores de la Tabla 3 con los de la Tabla 2 muestra que las velocidades de liberación inducida por el alumbre para el PSA tienen un orden de magnitud superior a los correspondientes a la glucosa.

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TABLA 3

Liberación de PSA
	V_{máx} (\mumol min^{-1} x 10^{6})
	4ºC	T. amb.	37ºC
Alhydrogel^{TM}	32,9	51,3	81,1

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Ejemplo 4 Efecto de la composición fosfolipídica sobre la integridad de los liposomas

Es sabido que los liposomas que comprenden cantidades sustanciales de fosfolípidos insaturados o saturados con menos de 14 átomos de carbono en sus cadenas acilo esterificado son inherentemente inestables. En consecuencia, cuando el experimento establecido en el Ejemplo 2 se repitió utilizando DLPC (12 carbonos) o DOPC o DLnPC (insaturado) como componente fosfatidilcolina, el efecto del alumbre fue indetectable ya que los liposomas eran ya inestables; cuando la preparación liposomal fue incubada a 37ºC, se liberó más del 60% de glucosa en los liposomas que contenían DMPC, DOPC o DLnPC aun en ausencia de Alhydrogel^{TM}. Sin embargo, la sustitución de DPPC o DSPC por DMPC en los liposomas no produjo ninguna diferencia en la velocidad de liberación de la que se había medido con los liposomas que contenían DMPC con o sin Alhydrogel^{TM}.

Se prepararon varias otras preparaciones liposomales, diseñadas para proporcionar fosfolípidos cargados positivamente, cargados negativamente y neutros, en general tal y como se establece en el Ejemplo 1 y se compararon con los liposomas del Ejemplo 1 en cuanto a la liberación de glucosa en presencia y ausencia de Alhydrogel^{TM} a 37ºC durante cinco días por medio del procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

Influencia de la carga fosfolipídica liposomal sobre da Desestabilización de la permeabilidad de
los liposomas por Alhydrogel^{TM}
Naturaleza fosfolipídica	Composición de los Liposomas	% de Glucosa atrapada liberada
		-Alhydrogel^{TM}	+Alhydrogel^{TM}
Fosfolípido	(1) DMPC/CHOL/LA	1,69	9,50
neutro	(10:7,5:0,011)
	(2) DMPC/CHOL	0,75	8,44
	(10:7,5)

TABLA 4 (continuación)

Naturaleza fosfolipídica	Composición de los Liposomas	% de Glucosa atrapada liberada
		-Alhydrogel^{TM}	+Alhydrogel^{TM}
Fosfolípido cargado	(3) DMPC/DMPG/CHOL/LA	1,43	23,24
negativamente	(9:1:7,5:0,011)
	(4) DMPC/DMPG/CHOL	-0,43	32,20
	(8:2:7,5)
Fosfolípido cargado	(5) DMPC/Estearilamina/CHOL	1,60	10,18
positivamente	(9:1:7,5)
	(6) DMPC/Estearilamina/CHOL/LA	2,02	19,95
	(9:1:7,5:0,011)

En ausencia de Alhydrogel^{TM}, todas las preparaciones de liposomas dan unos resultados comparables. Sin embargo, parece que existe alguna correlación entre la liberación y el estado de carga del fosfolípido. Por ejemplo, el incremento de la proporción de DMPG, un lípido de carga negativa relativa, mejora la liberación (comparar la preparación 4 con la preparación 3). De forma similar, la adición de LA negativamente cargado mejora la liberación en algunos casos (comparar la composición 6 con la composición 5), aunque esto no sea coherente (comparar la composición 1 con la composición 2).

Ejemplo 5 Efecto de ciertos detergentes sobre la estabilidad liposomal

Se añadieron varios detergentes no iónicos a la preparación de liposomas a unos niveles de concentración hasta 4% molar y se estudiaron los liposomas resultantes en referencia a su estabilidad en presencia y ausencia de Alhydrogel^{TM}, tal como se mide por medio de la liberación de glucosa después de la incubación. Los detergentes no iónicos ensayados incluían Span 80 y varios Tweens. Los resultados se muestran en las Figuras 2a-g. Estos datos muestran que Tween 20, Tween 40, Tween 80 y Tween 85 podían estabilizar los liposomas en presencia de alumbre; Span 80, Tween 60 y Tween 65 no podían.

En base a estos resultados, parece que el detergente estabilizador requiere las cadenas laterales polioxietileno de los Tweens y al menos una característica en el grupo acilo asociada a la desestabilización de los liposomas en general -es decir, una cadena acilo relativamente corta (< 18 carbonos o al menos un enlace-\pi). Se resumen estos resultados en la Tabla 5. En todos los casos, el agente estabilizador con éxito era más eficaz a una concentración aproximadamente del 4% molar (con respecto a la mezcla lipídica liposomal).

TABLA 5

Efecto del detergente sobre la estabilidad
Detergente	Presencia de polioxietileno	Nº de carbonos	Nº. de enlaces-\pi	¿Se estabiliza
	de cadena lateral	en cada acilo	en cada acilo	con alumbre?
Tween 20	+	12	0	+
Tween 40	+	16	0	+
Tween 60	+	18	0	-
Tween 65	+	18	0	-
Tween 80	+	18	1	+
Tween 85	+	18	1	+
Span 80	-	18	1	-

Las preparaciones liposomales preparadas según el Ejemplo 1, bien sea sin Tween 80 o con un contenido del 4% molar de Tween 80, fueron evaluadas en cuanto a su integridad según la liberación de glucosa en presencia de 1/1 v/v de Alhydrogel^{TM}, incubadas a 37ºC durante un período de 120 horas. Mientras los liposomas que contenían Tween 80 no mostraban esencialmente ninguna liberación de glucosa, existía una liberación lineal sustancial de glucosa durante este período de tiempo en los liposomas carentes de Tween 80, tal como se muestra en la Figura 3. Los valores V_{máx} calculados, en unidades \muM min^{-1} x 10^{6}, son 0,44 para los liposomas que contienen Tween 80, en comparación con 23,4 para los liposomas que no contienen Tween 80.

Se repitieron los experimentos utilizando concentraciones variables de Tween 80 en los liposomas preparados para encapsular el PSA e incubación con y sin Alhydrogel^{TM} a 4ºC y 37ºC. Se muestran los resultados en las Figuras 4a y 4b. La Figura 4a muestra que la liberación de PSA de los liposomas preparados en ausencia de alumbre es relativamente independiente de la presencia o ausencia de Tween 80. Por otro lado, la Figura 4b muestra que en presencia de Alhydrogel^{TM}, el Tween 80 es protector contra la liberación. La Figura 4c muestra los resultados para varias concentraciones de Tween 80 incluido en los liposomas en presencia de Alhydrogel^{TM} corregido para la liberación de PSA en su ausencia - es decir, la Figura 4b menos la Figura 4a. Parece que la estabilización máxima tiene lugar en el rango de 0,5-1% molar de Tween 80 cuando el PSA está encapsulado.

Claims

1. Composición farmacéutica que comprende al menos un antígeno encapsulado en liposomas, comprendiendo además dicha composición alumbre y al menos un agente estabilizador en una cantidad efectiva para impedir la disrupción de dichos liposomas en presencia de alumbre, caracterizada porque dicho agente estabilizador es un detergente no iónico que es un polioxietilen sorbitano éster, donde la forma esterificada contiene menos de 18 átomos de carbono y/o al menos un enlace-\pi.

2. Composición según la reivindicación 1 caracterizada porque dicho detergente no iónico se selecciona de entre el grupo formado por Tween 20 (monolaurato de polioxietilen sorbitano), Tween 40 (monopalmitato de polioxietilen sorbitano), Tween 80 (monooleato de polioxietilen sorbitano), Tween 85 (trioleato de polioxietilen sorbitano) y mezclas de los mismos.

3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque dicho antígeno es antígeno específico prostático (PSA).

4. Composición según la reivindicación 3, caracterizada porque el detergente noniónico comprende Tween 80.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dichos liposomas son formulados a partir de una mezcla de DMPC, DMPG, CHOL y LA.

6. Composición según la reivindicación 5, caracterizada porque los liposomas son formulados a partir de una mezcla DMPC:DMPG:CHOL:LA en una proporción molar de 9:1:7,5:0,011.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición farmacéutica se prepara mediante la reconstitución de la mezcla lipídica liposomal estructural en un tampón de reconstitución que contiene el antígeno y el agente estabilizador.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el agente estabilizador está presente en los liposomas aproximadamente a un 0,5-4% molar de la mezcla lipídica liposomal.