JPH09501169A - 小胞に生体高分子物質を高度に充填する方法 - Google Patents
小胞に生体高分子物質を高度に充填する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
いずれの原料に由来してもよいヒトの生化学的又は生理学的システムにおいて機能する生体高分子物質を小胞に高度に充填する方法であって、前記物質が好ましくは酵素、前酵素、補助因子、ビリオンのようなミクロン以下の粒子、成長因子、サイトカイン、リボソーム、Ｂ型肝炎表面抗原、オリゴ及びポリヌクレオチド、抗体並びに／又は抗原であり、前記小胞が両親媒性物質により形成され、以下の工程：a)水に不混和性の有機溶媒中で脂質小胞を形成するのに適当な脂質を混合すること；或いは、乾燥した脂質又は脂質混合物を何らかの形態（粉末、顆粒など）で直接使用することもできる、b)固体支持体の存在下で溶媒を除去すること；c)工程b)の生成物を、生理的に相溶性の溶液中の被包化すべき物質の溶液に入れること；d)可溶化又は分散化させる性質を持つ有機溶媒を加えること；及びe)工程d)で得られたフラクションを被包化すべき物質の機能が保持される条件下で乾燥させること、を含む方法。
Description
【発明の詳細な説明】
小胞に生体高分子物質を高度に充填する方法
本発明は、いずれの原料に由来してもよいヒトの生化学的又は生理学的システ
ムにおいて機能する生体高分子物質を小胞に高度に充填することに関するもので
あり、当該物質は好ましくは酵素、成長因子、サイトカイン、前酵素、補助因子
、ビリオンのようなミクロン以下の粒子、リボソーム、Ｂ型肝炎表面抗原、ワク
チン、オリゴ及びポリヌクレオチド、抗体並びに／又は抗原であり、当該小胞は
本発明の方法により得られる物質を処方する工程を含む処理によって両親媒性物
質により形成され、小胞中に充填される有効物質の量が改善されており、本発明
はまた本発明の処方を含む薬剤、及び本発明の薬剤を有効量投与することにより
疾病を治療する方法に関する。
有効な物質を投与するために天然又は合成のリン脂質をビヒクルとして形成さ
れた脂質小胞を用いる試みが幾つかなされている。
グレイ及びモーガン(Grey，A．and Morgan，J.)は、リポソームがほぼ四半世
紀前に始めて述べられ、脂質二分子層の物理化学及び細胞膜の生物学を研究する
ための有用なモデルとされてきたことを報告している。それらは薬物放出のため
のビヒクルとして使用できるが臨床的応用がなかなか現れないことも示された。
臨床的用途として提唱されたものにはワクチン用アジュバントとしての使用、遺
伝子転移及び診断用イメージングがあったが、主な努力は悪性腫瘍の治療におい
て標的を定めることができる薬物キャリアーとしてのリポソームの開発に注がれ
てきた。良好なインビトロデータ及び動物実験に基づいてはいるが、網内系によ
る優先的だが不必要な取り込み及び限定された管外遊出範囲のためにこの計略は
ほとんど実行できないでいる。同じ特徴が、それにもかかわらず、非経口使用が
認可された最初のリポソーム処方剤に最近なったアンフォテリシンＢのケースで
は好結果を生んでいる。リポソーム性ドキソルビシンも現在、臨床試験で評価中
である。初期の証拠から、リポソームによる被包形成は有効性を非常に増大させ
ることはないかもしれないが、これらの薬剤の毒性が非常に弱められることが示
唆される（グレイ及びモーガン（A．Grey，J．Morgan）、“血液学におけるリポ
ソーム”、Blood Reviews、５巻、258-271頁、1991年）。
リポソームは、網内系等の血漿管外スペースのような生物系において、リポソ
ームの細胞取り込みをより多く利用すべく使用されてきた。リポソームに、効果
はあるが毒性もある抗真菌剤であるアンフォテリシンが充填された。アドリアマ
イシン等の抗腫瘍剤もリポソーム中に取り込まれた。リンフォカインなどのよう
な生体応答修飾物質と共にワクチンやアジュバントも被包形態で研究された。リ
ポソームは、遺伝子転移の分野でビヒクルとして検討されている。
サクラガワら（N．Sakuragawa et al.）は Thrombosis Research、38巻、681-
685頁、1985年；Clinical Hematology、29巻の５、655-661頁、1988年で、第８
因子を含むリポソームをフォンウィレブラント病患者に経口投与するために調製
したことを報告している。被包形成は第８因子蛋白濃縮液をアプロチニン含有溶
液中に溶解することによって行われ、レシチン被覆フラスコ中に移された。減圧
下で30分間回転させてフラスコを乾燥させた後、第８因子濃縮液を封じ込めたリ
ポソームが形成された。このリポソーム溶液を遠心して、40%の第８因子がリポ
ソーム中に封じ込められた。
薬物をリポソーム中に封じ込めるもう一つの方法は脱水―再水和に基づくもの
である。これは、カービィ及びグレゴリアディス(C．Kirby and G.Gregoriadis)
によりBio/Technology、1984年11月号、979-984頁に述べられている。この調製
法では、脂質を追加して用いることにより封じ込める量を増加することができる
。薬物の封じ込めにプラスの影響を持つものとしてコレステロールの使用が開示
されている。コレステロールは幾つかの疾患の病理生化学に関係しているために
、コレステロールを含有する小胞の投与は全く無害とは言えない。
従来の技術によるリポソーム調製の欠点は、例えば、物質の被包形成効率の低
さであり、この被包形成効率は50%よりも低い。
本発明の目的の一つは、酵素、前酵素、補助因子、抗体及び抗原等の医薬上有
効な物質のような生体高分子物質を小胞（リポソーム）に充填するための改良さ
れた方法を提供することである。さらに別の目的は、小胞（リポソーム）中に充
填された高含有量の有効物質を持つ処方を提供することである。もう一つの目的
は、疾病を治療及び予防するための本発明の処方の使用法を示すことである。リ
ポソーム構造体中に有害な脂質を避けることにより改良が成されることが望まし
い。
驚くべきことに、以下に詳細に述べる方法は小胞（リポソーム）の充填を改善
することができる。小胞という用語はリポソーム又はリポソーム小胞の同義語で
ある。
リポソームは種々のパラメーターによって分類することができる。例えば、ラ
メラ（薄層）の大きさ及び数（構造パラメーター）を用いて、３つの主なリポソ
ームタイプが挙げられている：すなわち、マルチラメラ小胞(MLV)、小型ユニラ
メラ小胞(SUV)及び大型ユニラメラ小胞(LUV)である。MLVは、乾燥リン脂質のそ
のゲルから液晶相への転移温度（Tm）より高温での水和により自発的に形成され
る種類である。それらの大きさは不均一であり、構造は同一中心の水層及び脂質
層が交互にあるタマネギの外皮に似ている。
SUVはMLVから超音波処理によって作られ、単一層を持つ。これは、表面積対容
量比が高い最も小さな種類であり、従って脂質重量に対する水性スペースの捕獲
容量が最も低い。
第三のタイプのリポソームであるLUVは大きな水性区画を持ち、単一（ユニラ
メラ）又は極わずか（オリゴラメラ）の脂質層を持つ。
より詳しくは、リヒテンバーグ及びバレンホールズ(D．Lichtenberg and Y．B
arenholz)による「リポソーム：製法、特性決定、及び保存」、Methods of Bioc
hemical Analysis、33巻、337-462頁、に開示されている。
ここで用いる「充填」という用語は、充填される生体高分子物質の何らかの種
類の相互作用、例えば、被包形成、（小胞の内壁又は外壁への）付着又は、生体
高分子物質の押し出し成形を伴うか若しくは伴わない壁内への埋め込みのような
相互作用を意味する。
ここで用いる「リポソーム」という用語は、自発的又は非自発的に小胞を形成
することができる何らかの両親媒性化合物、例えば、少なくとも一個のアシル基
が複合リン酸エステルで置換されているリン脂質による全ての球体又は小胞を含
むことを意図されている。ほとんどのトリアシルグリセロールは適当であり、本
発明において最も一般的なリン脂質は、リン酸のコリンエステルに結合したステ
アリン酸、パルミチン酸及びオレイン酸のジグリセリドの混合物であるレシチン
（ホスファチジルコリン（PC）とも言う）である。レシチンは、鶏卵、大豆、及
び動物組織（脳、心臓など）のように全ての動物及び植物に見られ、合成により
製造することもできる。リン脂質の原料又はその合成方法は重要ではなく、いず
れの天然又は合成ホスファチドを使用してもよい。
特定のホスファチドの例としては、脳、肝臓、卵黄、心臓、大豆などから調製
されたか又は合成されたL-α-(ジステアロイル)レシチン、L-α-(ジアパルミト
イル)レシチン、L-α-ホスファチジン酸、L-α-(ジラウロイル)ホスファチジン
酸、L-α-(ジミリストイル)ホスファチジン酸、L-α-(ジオレオイル)ホスファチ
ジン酸、DL-α-(ジパルミトイル)ホスファチジン酸、L-α-(ジステアロイル)ホ
スファチジン酸、及び多様なタイプのL-α-ホスファチジルコリン、並びにそれ
らの塩が挙げられる。他の適当な修飾には、ホスファチジルコリン（PC）及び、
それ自身で又はPCのアルキルアナログのようなPC類と混合するとミセルを形成す
る両性イオン性両親媒性化合物の中の脂肪族アシル残基架橋剤にコントロールさ
れた過酸化処理を行うことが含まれる。
リン脂質は多様な純度でよく、完全に又は部分的に水素化されていてもよい。
水素化により、望ましくない過酸化のレベルが低下し、充填及び漏出量に影響を
及ぼすゲルから液晶相への転移温度（Tm）が変化及び制御される。
リポソームは、種々の生体液を含む特定のリザーバーの必要条件に合わせて「
仕立てる(tailored)」ことができ、凝集又はクロマトグラフィー分離することな
く安定性を維持し、注入された液体中に良好に分散及び懸濁され続ける。元の場
所(in situ)での流動性は、組成、温度、塩分濃度、二価イオン及び蛋白の存在
によって変化する。リポソームは、他の何らかの溶媒又は界面活性剤と共に、又
はそれらを伴わずに使用することができる。
リン脂質を選択する際のもう一つの重要な考慮点は、そのアシル鎖組成である
。現時点では、少なくとも転移温度（Tm）については鶏卵又は大豆のPCにおける
アシル鎖成分に特有なアシル鎖組成を有すること、すなわち一本は飽和した鎖で
一本は不飽和であるか又は両方とも不飽和であることが好ましい。しかしながら
、
二本の飽和鎖を使用する可能性を排除するものではない。
リポソームは他の脂質成分も、これらが不安定性及び／又は凝集及び／又はク
ロマトグラフィー分離をもたらさない限りは、含んでよい。これは通常の実験に
より決定することができる。
ユニラメラ型又はマルチラメラ型の改良リポソームを製造する種々の方法が公
知であり、利用できる：
１．リン脂質の薄膜を水性媒質で水和した後、機械的振蘯及び／又は超音波処理
及び／又は適当なフィルターを通しての押し出しを行う；
２．リン脂質を適当な有機溶媒に溶解し、水性媒質と混合した後、溶媒を除去す
る；
３．臨界点よりも高い状態にあるガス（すなわち、フレオン；及びCO2又はCO2と
他の気体状炭化水素の混合物のようなその他の気体）を使用する；又は
４．脂質洗浄剤混合ミセルを調製した後、洗浄剤の濃度をリポソームが形成され
る臨界濃度より低いレベルまで低下させる（リヒテンバーグ、バレンホールズ（
Lichtenberg，Barenholz）、1988年）。
一般に、リポソームは約0.02から10μm又はそれ以上の不均質な大きさに製造
されている。比較的小さく大きさが良く限定されているリポソームが本発明に使
用する際に好ましいので、「リポソーム小型化処理」と定義される第二の処理工
程は大きさの低下及びリポソーム懸濁液の大きさの不均質性の減少を目的とする
。
リポソーム懸濁液は、小胞の選択的な大きさの分布が約５μmより小さく、好
ましくは≦0.4μmの大きさの範囲になるように大きさの調整をしてもよい。この
範囲のリポソームは適当なフィルターを通すことにより容易に滅菌できる。より
小さな小胞は貯蔵に際しての凝集傾向も低いことが示され、従ってリポソームが
静脈内注射された場合に重大となりうる閉塞又は栓形成問題が緩和される。最後
に言うならば、ミクロン以下の範囲に小型化されたリポソームはより均一な分布
を示す。
本発明に適当な様式でリポソームの大きさ及び大きさの不均質性を減少させる
には幾つかの技法が利用できる。リポソーム懸濁液を標準的水浴ソニケーション
(sonication)又はプローブソニケーションのいずれかによって超音波処理するこ
とにより、0.02ないし0.08μmの大きさの小型ユニラメラ小胞(SUV)に大きさが漸
減される。ホモジナイズはもう一つの方法であり、大きなリポソームをより小さ
なものに切断する剪断エネルギーに依存している。典型的なホモジナイズ法では
、選択された大きさのリポソーム、典型的には0.1ないし0.5μmの大きさが観察
されるまで、リポソーム懸濁液を標準的エマルジョンホモジナイザーを通して再
循環させる。どちらの方法においても、粒子径分布は通常のレーザービーム粒子
径測定によって観測することができる。
小さなポアを持つポリカーボネートフィルター又は同等のメンブランを通じて
のリポソームの押し出し処理も、メンブランのポアサイズに応じて約0.02ないし
５μmの範囲に平均を持つ比較的良く限定された粒径分布にリポソームの大きさ
を低下させる効果的な方法である。典型的には、所望のリポソーム粒径分布が得
られるまで、懸濁液を１又は２枚の積層メンブランを通して数回循環させる。リ
ポソームの粒径が徐々に減少するようにリポソームを逐次より小さなポアのメン
ブランを通して押し出してもよい。
遠心及び分子ふるいクロマトグラフィーは、１μm未満の選択された限界値よ
り小さな粒子径を持つリポソーム懸濁液を製造するために利用できる別の方法で
ある。これらの２個の方法はそれぞれ、大きな粒子を小さなものに転化するので
はなく、大きなリポソームの選択的な除去を伴う。相応してリポソームの収率は
低下する。
粒径を調整したリポソーム懸濁液は、通常の0.45μmの深さのメンブランフィ
ルターのような約0.4μmの粒子識別サイズを持つ滅菌メンブランを通過させるこ
とによって容易に滅菌することができる。リポソームは凍結乾燥形態で安定であ
り、水中に入れることによって使用前に簡単に元に戻すことができる。
本発明の方法により、ビリオン、酵素、成長因子、サイトカイン、前酵素、補
助因子、リボソームのようなミクロン以下の粒子、Ｂ型肝炎表面抗原、ワクチン
、オリゴ及びポリヌクレオチド、抗体又は抗原物質である生体高分子物質が、小
胞に充填される。酵素又は前酵素については補助因子と同様に、特に血流中に自
然に存在する物質である。これらの物質には、例えば、第７因子、第８因子、第
９
因子、第10因子、第13因子、フィブリノーゲン、プロトロンビン及び／又はトロ
ンビンのような血液凝固連鎖反応系において機能するものである。また、本発明
の方法によりリポソームに、プラスミン、プラスミノーゲン又は、補体系におい
て活性を持ち、且つ／又は免疫系における他の機能（体液又は組織結合）に関与
する物質のような線維素溶解活性を持つ物質を充填することもできる。生体高分
子物質は、動物若しくはヒトの組織培養物、微生物若しくは形質転換された微生
物、血液、血漿、又は他の体液のようないずれの原料に由来するものでもよい。
リポソーム形成に適当な脂質は上に述べたが、特に好ましいものは、ジミリス
トイルホスファチジルコリン（DMPC）及び／又はジミリストイルホスファチジル
グリセロール（DMPG）；部分精製又は完全精製後に直接得られるか、続いて部分
的又は完全な水素化を行った後に得られるような、鶏卵及び大豆に由来するリン
脂質のようなリン脂質である。
一般に、本発明の方法（図１の方法Ａ）は以下の工程を含む：
a)水に不混和性の有機溶媒中で小胞を形成するのに適当な脂質のような両親媒
性物質を混合する；
b)固体支持体の存在下で溶媒を除去する；
或いは、乾燥した両親媒性物質又はその混合物を何らかの形態（粉末、顆粒
など）で直接使用することもできる；
c)工程b)の生成物を、生理的に相溶性の溶液中の生体高分子物質溶液に入れる
；
d)可溶化又は分散化させる性質を持つ有機溶媒を加える；及び
e)工程d)で得られたフラクションを生体高分子物質の機能が保持される条件下
で乾燥させる。
この方法を、以下、方法Ａと呼ぶ。
方法Ａの工程a)では、上述のような小胞を形成するのに適当な両親媒性物質を
水に不混和性の有機溶媒中で混合する。好ましくは、水に不混和性の有機溶媒は
フッ素化炭化水素、塩素化炭化水素などのような極性プロトン溶媒である。
本発明の方法の工程b)では、固体支持体の存在下で溶媒を除去する。好ましく
は、固体支持体はビーズ様の構造を持つ不活性の有機又は無機材料である。好
ましくは、無機支持体材料の材料はガラスであり、有機材料はテフロン又は他の
同様のポリマーでもよい。
本発明の方法Ａの工程c)は、生理的に相溶性の溶液中の被包形成される物質の
溶液中に工程b)の生成物を入れるものである。好ましくは、この生理的に相溶性
の溶液は最大約1.5重量%の塩化ナトリウム溶液と等価である。他の塩も、例えば
糖及び／又はアミノ酸などの凍結防止剤のように生理的に相溶性である限りは、
使用することができる。好ましくは、ラクトース、スクロース又はトレハロース
を凍結防止剤として使用する。
所望により、工程a)と工程b)の間に、工程a)のフラクションのウィルス不活性
化、滅菌、脱発熱物質処理、濾過等の工程を行ってもよい。これは、調製の早い
段階で医薬的に許容しうる溶液を作るためには都合がよい。
本発明の方法の工程d)は、可溶化又は分散化させる性質を持つ有機溶媒を加え
るものである。好ましくは、この有機溶媒は水と混和性の有機極性プロトン溶媒
である。好ましくは、アルキル鎖中に１ないし５個の炭素原子を有する低級脂肪
族アルコールを使用することができる。非常に好ましいのは第三ブタノール（te
rt-ブタノール）の使用である。水と混和性の有機極性プロトン溶媒の量が、リ
ポソームに充填される物質との干渉に強く依存することは当業者には理解される
。例えば、蛋白を充填する場合は、その蛋白の有効性が生かされるような溶媒量
によって上限が設定される。これは、充填される物質の性質によって大きく変動
してよい。例えば、凝固因子である第９因子が充填される場合は、約30%というt
ert-ブタノール量が許容できるが、第８因子はtert-ブタノールの影響に対して
はるかに感受性が高い。この場合、tert-ブタノールの量は10%よりも少ないこと
が好ましい。これらの例でtert-ブタノールのパーセンテージは最終濃度につい
て計算した容量パーセントに基づいている。
所望により、工程d)の次に、工程d)で得られたフラクションのウィルス不活性
化、滅菌及び／又は分配を行ってもよい。
本発明の工程e)は、工程d)で得られたフラクションを、充填する物質の機能が
保持される条件下で乾燥させるものである。この混合物を乾燥する好ましい方法
は凍結乾燥である。凍結乾燥は、例えばラクトース若しくは他の糖類又はア
ミノ酸のような凍結防止剤の存在下で行ってもよい。或いは、エバポレーション
又は噴霧乾燥法を使用してもよい。
乾燥した残査はその後、使用前に水性媒質中に入れてもよい。固体を入れた後
に、これは各リポソームの分散液を形成する。水性媒質は好ましくは食塩水を含
み、場合によっては形成された分散液を必要に応じてリポソームを小型化するた
めに適当なフィルターを通してもよい。好ましくは、リポソームは0.02から５μ
mの粒径を持ち、より好ましくは≦0.4μmの範囲である。
本発明の方法Ａによって得ることができるリポソームは、生体高分子物質につ
いて高い充填率を示す。
本発明により、ヒトの生化学的又は生理学的システムにおいて機能する酵素、
前酵素、補助因子、抗原及び／又は抗体のような生体高分子物質を含み本発明の
方法により得られる処方が請求の範囲に記載される。この処方は、上記のような
物質、例えば、第７因子、第８因子、第９因子、第10因子、フィブリノーゲン、
プロトロンビン及び／又はトロンビンのような血液凝固連鎖反応系において機能
するもの、若しくはプラスミノーゲン、プラスミンのような線維素溶解活性を持
つもののような血流中に自然に存在する物質、又は、補体系において活性を持ち
、且つ／又は免疫系における他の機能（体液又は組織結合）に関与する物質を充
填したリポソームを含む。後者は、抗原又は抗体でもよい。本発明の処方は又、
方法Ａの工程c)又はd)のいずれかのフラクションを単離することにより得られる
中間生成物でもよい。本発明によれば、本発明の処方は分散体（水性媒質中のリ
ポソーム）の形態を取る、方法Ａの工程e)の生成物を水中に入れた後に得られる
水性分散液も含む。
本発明の処方は、この処方及び／又はさらに他の医薬活性を持つ物質、並びに
ビヒクル及び／又はアジュバントやワクチンを含む薬剤を製造するために使用す
ることができる。
或いは、本発明の処方は以下の方法Ｂ、Ｃ及びＤと呼ばれる方法により得るこ
ともできる。
方法Ｂ
この方法は、方法Ａの工程a)、b)及びc)を同様に含む。しかしながら、方
法Ａの工程d)以降は省かれる。
方法Ｃ
方法Ｃでは、方法Ａの工程d)が凍結及び解凍サイクルに置き換えられ、このサ
イクルは少なくとも２回以上繰り返さなければならない。この工程は、リポソー
ムを製造するための従来の技術において周知である。
方法Ｄ
方法Ｄでは浸透性成分の使用が除外される。方法Ｄの小胞製造工程には、充填
される物質の実質的に塩を含まない溶液の混合及び、それにより得られたフラク
ションの共乾燥が含まれる。
方法Ｅ
方法Ｅは上記の方法Ａ−Ｄよりも単純である。これは、リポソーム調製に使用
する化合物（脂質抗酸化剤等）をtert-ブタノールのような水と混和性の極性プ
ロトン性溶媒中に溶解することを必要とする。この溶液をその後、抗原、酵素、
前酵素、凝固因子、オリゴ又はポリヌクレオチド等でもよい活性薬剤を含む水性
溶液又は分散液と混合する。混合は、薬剤の生物活性及び薬理活性を維持するの
に求められる最適な容量比で行う。この混合物をその後、凍結防止剤の存在下又
は非存在下で凍結乾燥する。リポソーム処方を使用する前に、再水和する必要が
ある。これらのリポソームはマルチラメラ型であり、それらの小型化は上記の方
法のうちの一つによって行う（図３参照）。
ＡからＥまでの方法により、有利な様式でそれぞれの物質が高度に充填される
ことが示される。とりわけ、方法Ａ、Ｄ及びＥは、酵素、前酵素及び／又は、血
液凝固連鎖反応系において重要な役割を演じる第７因子、第８因子、第９因子、
第13因子のような血液系中に自然に存在する補助因子の取り込みに適している。
薬剤の形態をとる本発明の処方は、例えば凝固因子を充填したリポソームは驚
くべきことに薬物の徐放性だけでなく非常に低い免疫反応性を予想外の薬物動態
と共に示すので、有利な面がある。これはリポソームがある器官、おそらくは肝
臓に蓄積し、その器官から各凝固因子が予想外の長い期間及び量で放出されるこ
とによると思われる。方法Ａ−Ｅにより得られるリポソーム中に充填された蛋白
様物質の抗原性及び阻害剤による認識性が低いことは、それがリポソーム中に「
遮蔽」されていることによると思われる。予想外の薬物動態は図４及び６に示す
が、活性因子の二相性の放出が示されている。
本発明の薬剤を有効量投与することにより疾病を治療する方法も請求の範囲に
記載される。治療の方法には、本発明の薬剤を経口、バッカル(buccal)、静脈内
、局所、腹腔内、肺内、又は直腸内投与する過程を含む。例えば、出血性疾患を
治療しなければならない場合は、各因子を充填したリポソームが形成されて患者
に投与されるべきである。好ましくは、これは静脈内投与で行われる。
本発明の薬剤の投与量は効力のある生体高分子物質の有効性と共にその濃度に
依存することが、当業者には理解される。
好ましくは、リポソーム中の活性因子が充填リポソームの調製に使用された全
活性に対して50%よりも高い効率で充填されていて、体重１kg当たり最大2.000mg
/リポソーム脂質の用量が患者に投与される。
正確な用量は大きく変化してよい。しかしながらこの変化は、例えば、リポソ
ーム中に被包された物質のタイプ及び効力、被包形成反応自体の効率（本発明の
方法では高い）、投与の種類等に依存する。それぞれのパラメーターは当業者に
によって容易に最適化され、日常的な実験と見なすことができる。
より特定な以下の態様は、本発明をさらに説明するものである：
Ｂ型肝炎ウィルス(HBV)に対するワクチンには２つの主なタイプがあり、それ
らは両方とも免疫原としてＢ型肝炎ウィルス表面抗原(HBsAg)の22nm粒子、及び
アジュバントとして水酸化アルミニウム（alum）を基本とする水性分散液である
。第一のワクチンは、慢性HBVキャリアーのヒト血漿から得られるHBsAg粒子を基
本とする。第二のワクチンは、組み換えDNA技術を用いて酵母によって製造され
たHBsAg粒子を基本とする。このワクチンは、低反応者及び無反応者からなるあ
る種のグループを除いて、ほとんどのヒトにおいて安全で病気の予防に効果があ
る。しかしながらこのワクチンは、凍結及び８℃以上の加熱のような、最適とは
言えない保存条件でその免疫原性を失う。事実、これらの水酸化アルミニウムに
基づくワクチンには、「凍結により有効性が失われるため、凍結させないこと」
とか「２〜８℃で保存のこと」とか「所定の温度よりも高いか又は低い温度
で保存すると、有効性が低下することがある」（レコンビバックス(Recombivax)
として使われている水酸化アルミニウムに関係している。
本発明はまた、凍結、凍結乾燥及び室温までの加熱を含む広い範囲の保存条件
下で安定な抗HBVリポソーム性ワクチンの開発に向けたものである。このワクチ
ンは抗原としては組み換えHBsAg、並びにアジュバント及び安定化剤としてはリ
ポソームに基づく。このリポソーム性ワクチンを製造する好ましい２つの方法を
述べる。
マウスにおける血清変換から、本発明のリポソーム性ワクチンがHBVに対して
効果があり、防御力価を持つHBs抗体を産生し、alumをアジュバントとする新鮮
なワクチンを用いて得られたものと比較して少なくとも同等又はより優れた血清
濃度の抗HBsAg抗体をもたらすことが明らかに示された。本出願者らのリポソー
ム性ワクチンが、最適条件に及ばない条件下でその免疫原活性を保持することは
明らかである。予備形成されたマルチラメラ小胞を基本とする抗-HBVリポソーム性ワクチンの調 製方法（方法Ａ、Ｂ及びＣ）
図１は、方法Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥを用いた抗-HBVワクチンの調製を概略図で示し
たものである。これらの方法では、リポソームは水和処理の間に製造される。
HBVに対する乾燥粉末形態のワクチンを開発することが望ましく、それは現在
利用できるワクチンと少なくとも同等の効き目があるべきで、その安定性は特に
きびしい保存条件下において現在のワクチンよりも高くあるべきである。
製造されたワクチンはアジュバントとしてリポソームを基本とし、免疫原性抗
原としてHBsAg粒子を含む。本出願に記載される方法を用いて抗HBVリポソーム性
ワクチンを製造するには免疫原性抗原としていずれのHBsAgを使用してもよく、
完全なHBsAg粒子又はその成分のいずれを用いてもよい。ここで用いるHBsAgはWO
90/10058に記載されているようにCHO細胞中で組み換え法によって製造される。
それは３個のポリペプチド−Ｓ、PreS1、PreS2（重量比でそれぞれ、78：８：14
）から成る。その重量のおよそ30%はリン脂質であり、およそ10%はコ
レステロールである（図１参照）。ホスファチジルコリンが主なリン脂質である
；正確な組成については表１を参照のこと。
リポソーム性ワクチン製剤に用いるリン脂質の選択は２つの主なパラメーター
に基づいて行われる：(i)化学的安定性；(ii)マクロファージによる取り込み。
驚くべきことに、リポソーム調製には原材料としてジミリストイルホスファチジ
ルコリン（DMPC）及びジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）を選
択すると都合がよかった。これらの二飽和リン脂質は種々の酸化作用を受けない
。それらのゲルから液晶相への転移温度（Tm）は24℃であり、従って37℃でこれ
らの脂質は液晶状態にあり、これはマクロファージによる取り込みにとって好ま
しい。DMPGによって導入される負の電荷も、抗原付与細胞として作用するマクロ
ファージによるリポソーム取り込みを増加させる。大きなリポソーム（大型マル
チラメラ小胞）がマクロファージによって優先的に取り込まれることから有利で
ある。
アジュバントとしてのリポソームの一般的な利点は、グレゴリアディス（G．G
regoriadis）：Immunology Today、11巻、89-97頁、1990年、及びアルビング
(C．Alving)、「リポソーム：治療への生物物理学」、マーセル・デッカー、N.Y
.、オストラ(Ostra，M.)編、195-218頁、1987年、を含めて当技術分野において
公知である。
大型マルチラメラ小胞を含むリポソームを作る方法は当技術分野において公知
であり、多数の刊行物に述べられているが、例えば以下の主な概説を参考文献と
してここに組み入れる：ニュー(New，F.R.C.)編、「リポソーム」、IRL、ニュー
ヨーク、1990年；リヒテンバーグ及びバレンホールズ(Lichtenberg，D．and Bar
enholz，Y.)、「生化学分析法」、33巻、337-462頁、グリック(Glick，D)編、19
88年。
大型マルチラメラ小胞(MLV)に基づくリポソーム性ワクチンを製造する５つの
方法Ａ−Ｅを、以下の実施例並びに図１、２及び３で詳細に述べるように使用し
た。試験及び比較したパラメーターには、脂質対抗原比の効果、抗原にさらされ
たリポソーム表面の範囲、リポソーム性ワクチンの化学的及び物理的安定性、上
記のパラメーターにおける種々のリポソーム調製法の間の比較、凍結及び解凍に
対する効果、凍結防止剤（ラクトース）の存在下又は非存在下での凍結乾燥、並
びに免疫修飾剤の効果が含まれる。ワクチンの効力は、Balb/Cマウスにおいてワ
クチンを腹腔内注射した35日後の血清変換によって測定した。
この結果の要約を表２に示す。これらの結果から、方法Ａが好ましいことが示
された。
リチャードら(Richards，R.L．et al.)は、Vaccine、７巻、506-512頁、1989
年で、DMPC及びDMPGを利用するがそれだけを利用するのではないリポソーム性マ
ラリア・スポロゾイト抗原の製造方法を開示した。このリポソームは９：１：7.
5のモル比のDMPC、DMPG及びコレステロールから成った。脂質Ａ及び水酸化アル
ミニウムも存在し、これらの２個の化合物の非存在下では低い免疫原性しか得ら
れなかった。
リチャードら（Richards et al．、1989年）によって述べられたリポソーム性
ワクチンは、乾燥粉末としてではなく水性分散液として調製された。
実施例１ 方法Ａを使用した抗-HBVリポソーム性ワクチンサンプルの調製
以下の(5)、(6)及び(7)と表すワクチンサンプルを、下記のように修正した方
法Ａ（図１参照）を用いて調製した。サンプル(5)
：HBsAgを含むリポソーム及び「空リポソーム」をサンプル(1)につ
いて述べるように調製した。tert-ブタノールを加え(1:1 v/v)、調製品を凍結乾
燥した。得られた乾燥粉末を使用前に、発熱物質を含まない滅菌再蒸留水を加え
て元に戻した。抗原の充填率は平均97%であった。リポソーム表面上のHBsAgにさ
らされた範囲をELISAによって測定し、検出限界以下であった。リポソームの粒
径は4.5μmと測定され、他のサンプルにおけるリポソームの粒径と同様であった
。
免疫化：６週齢のBalb/cマウスを４つのグループに分け、サンプル(2)について
述べるような用量でワクチン接種した。35日後にマウスから採血して抗-HBs力価
を測定し、HBV感染に対して防御するのに十分なレベルよりも高いことが見出さ
れた。この力価は、水酸化アルミニウムに基づくワクチンを用いて同じHBsAgを
ワクチン接種した後に得られたものとほぼ同等であった。サンプル(6)
：HBsAgを含むリポソーム及び「空リポソーム」をサンプル(5)につ
いて述べたように調製した。６週齢のBalb/cマウス７匹から成るグループを「空
リポソーム」で希釈したリポソーム中に封じ込めた0.09μgのHBsAg及び0.9%NaCl
で免疫化した。7:3モル比の1-パルミトイル-2-オレイル ホスファチジルコリン
（POPC）及びジオレイル ホスファチジルセリン（DOPS）0.5mlである注射容量
に、免疫修飾剤であるムラニル トリペプチド ホスファチジルエタノールアミ
ン（MTP-PE）を１mg MTP-PE/１kgマウスのレベルで含むリポソームを加えた。35
日後に抗-HBsを測定した。MTP-PEを含まない同じ用量のリポソーム性ワクチンに
よって得られた抗体力価よりも改善は見られなかった。（免疫修飾剤としてのMT
P-PEの使用はヘルペス・シンプルズ・ウィルス・グリコプロテインワクチンにつ
いてサンチェス−ピスカドールら(Sanchez-Piscador et al.)、J．Immuno.、141
巻、1720-1727頁、1988年、によって述べられている。）サンプル(7)
：HBsAgを含むリポソーム及び「空リポソーム」を、脂質水和用の溶
液が凍結防止剤として5%ラクトースも含んでいたことを除けば、サンプル(5)に
ついて述べたものと同様に調製した。リポソームを凍結させて乾燥した。得られ
た乾燥粉末を使用前に、発熱物質を含まない滅菌再蒸留水を加えて元に戻した。
この調製品におけるHBsAgの充填効率、リポソームの粒径及びリポソーム上のHBs
Agにさらされた範囲はサンプル(1)について述べるように測定した。サンプル(5)
のものと同様の結果が得られた。リポソーム性ワクチンの免疫化効力は、サンプ
ル(2)について述べるようにBalb/cマウスで確認し、ワクチン接種の35日後に抗-
HBsを測定した。全てのケースでHBV感染に対する防御が可能な高い力価の抗体が
得られた。ラクトースを含む凍結乾燥ワクチン（サンプル(5)）との比較から、
高用量(蛋白2.5μg)を除いて、使用した全用量の抗原についてラクトースを含む
ワクチンが好ましいことが明らかに示されている。実施例２ 方法Ｂを使用した抗-HBVリポソーム性ワクチンの調製
サンプル(1)及び(2)と呼ばれる以下のワクチンサンプルを下記のように修正し
た方法Ｂ（図１参照）を用いて調製した。サンプル(1)
：リン脂質のジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及びジ
ミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）が9:1のモル比となる混合液
をクロロホルムに溶解した。溶媒を減圧下のフラッシュエバポレーションにより
除去して完全に乾燥させた。乾燥した脂質をHBsAgを含む0.9% NaCl溶液に懸濁し
た。リポソーム調製中のHBsAg：脂質(w/w)比は0.0015であった。このサンプルで
は、脂質水和時に使用した抗原の約73%が充填されたリポソームが得られた。方
法Ｂを使用した同様のサンプルでは50-60%しか充填されなかった。遊離（非リポ
ソーム会合）抗原を、リポソーム溶液を180,000gで60分間超遠心して除去した。
ペレットを発熱物質を含まない滅菌済0.9% NaClに分散させて、ワクチン接種に
使用した。抗原を含まないリポソーム（「空リポソーム」と呼ぶ）を同等サンプ
ルの脂質濃度を保つために同じ方法によって調製した。
調製品の安定性：リポソームの物理的安定性を、コールター・カウンター・モデ
ルPCA-1を用いて貯蔵期間中にリポソーム粒径を測定することによって試験した
。
調製直後のリポソームの平均直径は4.5μmであった。リポソーム中の抗原の存在
及び18ヶ月までの加齢はリポソーム粒径に有意の効果を示さなかった。リポソー
ム成分の安定性を１ないし３回の洗浄後に調べた。洗浄は180,000g、60分間の超
遠心によって行った。各洗浄の後に、リポソームペレット中の脂質：HBsAg(w/w)
比を測定した。この比の値は洗浄を通じて一定であり続け、リポソーム調製直後
に得られた比の値と同じであることが見出された。これはすなわち、リポソーム
からの抗原の「漏出」がなかったことを意味する。リポソーム表面上のHBsAgに
さらされた範囲を標準的な市販のキット（デュポン）を使用したELISAによって
測定し、5%未満であった。
免疫原性試験：６週齢のBalb/cマウスを使用した。マウスを８匹ずつ２グループ
に分けた。第一のグループは0.27μgのサンプル(1)で免疫化した。腹腔内(i.p.)
注射の容量は0.5ml/マウスであり、HBsAgが封入されたリポソーム及び「空リポ
ソーム」を0.9% NaCl中に含んでいた。この２つは注射に先立って、全てのマウ
スに同じ量の脂質が注射されるように混合した。免疫化の35日後にマウスから採
血し、抗体力価を測定した。サンプル(1)で免疫化したマウスは全て、HBVによる
感染から自身を防御すると考えられるレベルの防御抗体力価を発現させたことが
見出された。これらの結果はその値において、同じ遊離の抗原(HBsAg)及びアジ
ュバントとしての水酸化アルミニウムで免疫化したマウスを含む対照グループに
おいて得られた結果と同様であった。サンプル(2)
：リン脂質のDMPC及びDMPGが9:1のモル比となる混合液をクロロホル
ムに溶解した。溶媒を減圧下のフラッシュエバポレーションにより除去して完全
に乾燥させた。乾燥した脂質をHBsAg及び5%（重量）ラクトースを含む0.9% NaCl
溶液に分散させた。リポソーム(MLV)は機械的振蘯によって製造した後に凍結乾
燥した。乾燥粉末を使用前に、発熱物質を含まない滅菌再蒸留水を加えて元に戻
した。投入HBsAgの75%が充填された。「空リポソーム」は上記と同様の条件下で
調製された。リポソームの粒径（サンプル(1)について述べたように測定）はサ
ンプル(1)と同等であった。凍結乾燥処理はリポソーム粒径に影響を及ぼさなか
った。リポソーム表面上のHBsAgにさらされた範囲を測定し、検出限界以下であ
ることが見出された。
免疫化：６週齢のBalb/cマウスを８匹ずつ４つのグループに分けた。サンプル(1
)について述べたようなリポソーム調製品をマウスにワクチン接種した。以下の
抗原用量（蛋白重量）を注射した：0.09μg、0.27μg、0.81μg、2.5μg。
ワクチン接種の35日後にマウスから採血して、このサンプルにおける抗-HBs力
価を測定した。全てのマウスは防御抗体力価を発現させた。実施例３ 方法Ｃを使用した抗-HBVリポソーム性ワクチンの調製
サンプル(3)及び(4)と呼ばれる以下のワクチンサンプルを下記のように修正し
た方法Ｃ（図１参照）を用いて調製した。サンプル(3)
：HBsAgを充填したリポソーム及び「空リポソーム」をサンプル(1)
について述べたように調製した後、10サイクルの-180℃での凍結及び37℃での解
凍を行った。リポソーム中の抗原充填率は平均81%であった。充填されなかった
遊離の抗原は超遠心（180,000g、60分間）によって除去した。ペレットだけをワ
クチンとして使用した。リポソームの安定性をサンプル(1)について述べたよう
に確認し、検査結果はサンプル(1)について得られたものと同様であった。
免疫化：６週齢のBalb/cマウスに、HBVに対するリポソーム性ワクチンを接種し
た。試験グループ及び生体内(in vivo)の実験手順はサンプル(1)について述べた
ものと同等であった。リポソーム性ワクチンによるワクチン接種後に発現された
HBs抗体力価は常に防御レベルよりも高かった。このワクチンによって得られた
抗体力価は、本発明者らが試験した種々のリポソーム調製品の中で最も高かった
。この力価は、同じHBsAgを含む水酸化アルミニウムに基づくワクチンによって
ワクチン接種した対照グループにおいて得られたものよりもさらに高かった。サンプル(4)
：HBsAgを充填したリポソーム及び「空リポソーム」を、脂質の水和
を5%ラクトース中で行ったことが異なる以外は、サンプル(3)について述べたよ
うに調製した。形成されたマルチラメラリポソームを凍結乾燥した。この乾燥粉
末を使用するまで-21℃で保存した。リポソームの粒径及びリポソーム表面上のH
BsAgにさらされた範囲をサンプル(1)について述べたように試験し、結果
はサンプル(2)で得られたものと同等であった。
リポソーム中に充填された抗原のパーセンテージは平均82%であった。
この調製品の免疫化効力をBalb/cマウスで試験した。試験グループ及び実験手
順はサンプル(2)について述べたものと同じであった。この試験の結果から、抗H
Bs抗体の製造レベルは検査した全ての抗原用量において防御レベルを越えていた
ことが明らかとなる。
乾燥リポソーム調製品の効力を分散液として保存された調製品（サンプル(3)
）と比較すると、低用量では凍結乾燥ワクチンが、また高用量では分散液として
保存されたワクチンが優れていることが示される。方法Ａと方法Ｃの比較
方法Ａは、方法Ｃで行われる凍結−解凍サイクルを必要とせずに、高いレベル
のリポソーム充填効率（封入）をもたらす（約97%）。凍結及び乾燥は工業レベ
ルでは高コストで効率が悪いために、方法Ｅのほうが工業的応用には好ましい方
法である。従って、（tert-ブタノール及び水相の種々の混合物の使用を含む）
方法Ｅが免疫活性を持つ凍結乾燥抗Ｂ型肝炎ウィルスワクチンの製造において好
ましい方法である。方法Ｂ及びＣの比較
方法Ｃは、リポソームの被包形成効率（抗原封入）を増加させるための当技術
分野において公知の処理である凍結−解凍サイクル（リヒテンバーグ及びバレン
ホールズ(Lichtenberg，D．and Barenholz，Y.)、1988年）を含む点で、方法Ｃ
は方法Ｂとは異なる。しかしながら、凍結及び解凍は高コストであり工業的処理
としては費用効率が悪いと考えられる。実施例４ 種々の温度で貯蔵した後のリポソーム性HBsAgワクチンの安定性
上記のように、当技術分野において公知の肝炎ワクチンはアジュバント及び安
定化剤として水酸化アルミニウムを使用する。水酸化アルミニウムを基本とする
ワクチンの不利な点は、それらが凍結させることも８℃以上で貯蔵することもで
きないことである。これらのワクチンは従って、その効力を維持するためには2-
8℃で貯蔵しなければならない。
種々の条件下におけるワクチンの安定性を示すには３つのパラメーターがある
：
１．有効性（免疫原性の測定）
２．化学的安定性（脂質加水分解の測定；蛋白対脂質比の測定）
３．物理的安定性（粒子径の測定）
新規ワクチンの安定性を３種類の温度(a)-20℃、(b)2-6℃及び(c)室温で貯蔵
した後に試験した。
得られた結果は以下のようであった：
(a) -20℃で貯蔵したワクチンは１ヶ月以上の後も有効であり、1.5年以上の後も
化学的及び物理的に安定であった。
(b) 2-6℃で貯蔵したワクチンは１ヶ月以上の後も有効であり、1.5年以上の後も
化学的及び物理的に安定であった。
(c) 室温で貯蔵したワクチンは1.5年以上の後も化学的及び物理的に安定であっ
た。
これらの結果は、リポソームの形態の本発明のワクチンが幅広い温度範囲で安
定であることを示す。
現在の肝炎ワクチンは凍結の間にその免疫原性を失うので、本発明のリポソー
ム―ワクチンが凍結乾燥処理の凍結工程の間及び０℃以下でのワクチン貯蔵の間
のいずれにおいてもその活性を保持するのは予想外のことである。
従って、本発明のHBVワクチンの利点は明らかである。これは冷蔵庫に貯蔵す
る必要もなければ、凍結に敏感でもない。このようなワクチンは、特にＢ型肝炎
に対するワクチンの必要性が最も高い第三世界の国々において非常に簡単に流通
でき；さらに、凍結してもよいワクチンはロシアや中国のような周囲温度がしば
しば凍結温度以下になる国々における流通を助ける。
出願者らはこのように、０℃以下及び室温の両方で安定な新規のリポソーム性
HBsAgワクチン、すなわち最適条件以外で貯蔵することができるワクチンを製造
した。実施例５ 第８因子の充填
安定性試験：リン脂質膜内に蛋白を充填して「セル」を形成するには、この区画
の内部を外側の溶液と等張性にしなければならない。
市販の第８因子製品(Octa VI 250)を５mlの水に溶解し（50ユニット/mlとなる
）、種々の濃度のアミノ酸に対して４℃で６時間透析した。透析した因子を20時
間凍結乾燥した。このサンプルを最初に水に加えて戻し、次いで食塩水を加えて
1:500希釈液を得た。充填実験
Ａ．方法Ｅによる充填
この調製法ではtert-ブタノールに溶解した脂質をこの因子の水溶液と混合し
て均質な溶液を得る。この溶液を凍結し、溶媒を凍結乾燥によって除去する。こ
の乾燥混合物を、最初に少量の再蒸留水、次いで食塩水で段階的に、最終的なリ
ポソーム濃度に達するまで水和することによって、第９因子が充填されたマルチ
ラメラ小胞が得られる。この時点で、マルチラメラ小胞を押し出し成形によって
粒径調整しオリゴラメラ又は小型ユニラメラ小胞を得ることができる。
第９因子活性の測定
第９因子活性を凝固アッセイによって測定した。このアッセイでは第９因子活
性のパーセントを、試験サンプルの希釈液を第９因子欠損血漿（バクスター・ダ
イアグノスティック社より購入）に加えた際に得られる補正の程度によって測定
することができる。測定器はインストルメンテイション・ラボラトリー（イタリ
ア）製でACL-オートメイテッド・コアギュレイション・ラボラトリーと呼ばれる
ものである。
第９因子の凝固アッセイ用の検量線を、約50U/mlの原液の適当な希釈液を用い
て最初に作成した。図２から、線型回帰に良好に適合することが示される(R2=0.
989)。
第９因子を含むリポソームをエッペンドルフ遠心器で12,000g、10分間遠心し
てペレットにし、第９因子活性を上清及びペッレットについて測定した。ペレッ
トは分析に先立ってトライトン(Triton)X-100で可溶化した。第９因子活性に
対してトライトン(Triton)X-100の濃度依存性が見られた。1%トライトン(Triton
)X-100(最終濃度)は活性を50%消失させたが、0.2%では消失は観察されなかった
。一般に、この因子の全活性が回収された。すなわち、上清及びペレットの活性
は常にこの調製品の最初の活性と同等又は高いことすらあった。充填効率は80%
よりも高かった。
Ｂ．方法Ｄによる充填
ウサギによる実験：血流中におけるリポソームからの第８因子の放出を試験する
ために、モデル系としてウサギを使用した。
実験は、２グループに分けた体重3-3.5kgのウサギで行った。一方のグループ
のウサギに330ユニットのOcta VIを注射し、他方のグループのウサギにリポソー
ム中に充填した330ユニットの第８因子を注射した。リポソームは鶏卵ホスファ
チジルコリン(EPC)から製造し、SUV法によって調製した。被包形成パーセントは
約70%であった。
４mlの血液サンプルを、注射前並びに注射後30分、１時間、２時間、４時間、
６時間、21時間、30時間、45時間、54時間、72時間及び144時間目にウサギの耳
から採取した。血液サンプルから血漿を調製して凍結した。実験終了時に、第８
因子活性を一段階凝固アッセイによって確認した。
実験を完了したウサギの第８因子凝固活性の平均結果及び標準偏差を図４に示
す。
330ユニットの遊離の第８因子を注射した後、活性が４ユニット/mlの基礎レベ
ルから30分後に７ユニット/mlまで上昇し、その後低下して45時間後に基礎レベ
ルに到達したことがわかる。リポソーム被包された第８因子を注射した際の第８
因子活性は最初に30分後まで上昇し、その後すみやかに基礎レベルまで
低下した。２度目の上昇が注射の９時間後に始まり、注射の54時間後に最大値に
達し144時間後に基礎レベルまで低下した。
これらの結果に基づくと、リポソームによる第８因子の被包化はウサギにおけ
るその半減期を延長させるようである。実施例６ リン脂質及び第８因子処方（方法Ｄ）
のアルモー(Armour)社の処方である。この処方は大量のアルブミンによって安定
化されているだけのF VIII:Cを含む。特異活性は非常に低く、５ユニット/mg蛋
白である。被包形成はDRV法によって、蛋白１mgに対してリン脂質を107及び214m
gのwt/wt比で使用して行った。
Ｂ．コレステロールを追加したPLとOcta VI：
結論
リポソーム中にOcta VIを被包化するためには、脂質：蛋白の比率は400：１(w
t/wt)が最も適していた。
良好な被包形成はコレステロールを追加した鶏卵-PCを用いて達成することも
できる。もっとも、これはＡ型血友病のような慢性患者には勧められないが、急
性の患者には使用することができる。実施例７
F VIII(Octa VI)を充填したリポソームの遮蔽効果は、阻害物質を高率に含む
患者の血漿について生体外(in vitro)で阻害剤試験を行うことによって明らかに
される。
血友病患者の血漿中に現れる阻害物質は、等容量の患者血漿（F VIIIは存在し
ないと仮定される）及び正常な血漿(１ユニットのF VIII)を37℃でインキュベー
トするベテスダ(Bethesda)阻害試験によって検出することができる。正常な血漿
及び食塩水の混合物と比較して凝集時間が有意に延長される場合に、阻害物質と
推測される。
以下の実験では例えばそのような患者の血漿を種々に希釈して、プールした標
準血漿（100%＝１ユニット/mLの第８因子を含む）とともにインキュベートした
。インキュベートした血漿の第８因子活性を50%低下させる（残存濃度で表され
る）希釈を所定の血漿のベテスダ阻害物質ユニット(BIU)量と定量的に表示する
。
図７は、食塩水と混合した正常血漿と比較した場合の患者血漿と正常血漿の混
合物中の第８因子:C残存濃度の比率を記録している。結果は、試験した血漿希釈
に対して半対数パーセントでプロットした。元の血漿の50%に当たる希釈を、所
定の血漿１ml当たりのBIUと定義する。図１では、試験した血漿は160BIU/mLを有
する。第８因子:Cを充填したリポソームを試験血漿とともにインキュベートした
場合には阻害は見られなかった（図１）。この実験では、リポソーム中に充填し
た第８因子(Octa VI)を所定の患者血漿希釈液とともに37℃で２時間インキュベ
ートした。患者血漿の代わりに生理食塩水とともにインキュベートして得られた
残存活性を100%とした。実施例８
２匹のビーグル犬、オスとメス、に900ユニットのリポソーム充填F VIIIを注
射した。オスのイヌにリポソーム充填Octa VI(オクタファルマAG)を投与し、
メスのイヌに被包化したモノクレート-P(Armour、USA)を投与した。血液サンプ
ルを注射時から16日間採取した。第８因子の活性を発色性アッセイによってモニ
ターした。
図８及び図９で判るように、F VIII活性はほぼ３週間維持され、遊離のF VIII
から想定される薬物動態（半減期が約10-14時間）とは完全に異なっていた。実施例９ 阻害物質レベルの測定
ウサギは第８因子に対する阻害物質を急速に作る傾向がある。
種々に希釈したウサギ血漿を５ユニット/mlのOcta VIと共に37℃で１時間イン
キュベートした。その後、活性を凝固アッセイにより試験した。
このリン脂質処方の低い免疫原性は以下のメカニズムの両方又はいずれか一方
によるものと思われる：
a)リン脂質二層膜中に被包された又はむしろ埋め込まれたOcta VIが偶然にも
、それが蓄積される器官（おそらくは肝臓）を標的としており、免疫系による認
識を免れて血流中に放出された；
又は
b)結果はリポソーム性F VIIIが免疫系にとってより小さな標的を与えるにすぎ
ないことを示唆するらしい。言い換えれば、リポソームはこの因子の抗原性を「
遮蔽する」部分である。実施例10
抗血友病性第８因子を含むリポソームの調製
リポソーム調製：
と同様の手順を使用した。60から90%の充填効率が得られた。実施例11 第９因子：方法Ｅを用いたイヌの実験
２匹のビーグル犬に750ユニットの市販の第９因子製品であるOctaNyne（オク
タファルマ）を注射した。第一のイヌには遊離のOctaNyneを４回目として注射し
、第二のイヌには被包化したF IXを投与したが、このイヌはこの因子を投与され
るのは１回目であった（「未使用」イヌ）。リポソームでのOctaNyne処方は方法
Ｅによって行い、被包化はほぼ100%で、遊離の因子は無視できる量であった。
隣接する図（図５及び６）から、遊離の因子は半減期を二つ持つことが判る。
このボーラス(bolus)の約20%は約1.8日の半減期を持つが、ボーラス(bolus)のほ
とんどである80%は0.15日の半減期を持つ。
一方、リポソーム処方は全く異種の挙動を示す。凝固アッセイから得られた結
果を分析すると、２つのピーク：0.25日後に一つと５日後にもう一つがあること
が示される。ELISAによって試験すると血中に存在する第９因子は相対的に低い
抗原活性を示し、どちらの方法でも凝固アッセイによって記録される活性の1/5-
1/10である。しかしながら、活性ピークは偶然にも同じ時に見られた。
免疫アッセイによって記録された低い活性はリポソームによって起こる「遮蔽
」効果によるものと思われ、このリポソームには血流中を循環する間に他の血液
蛋白が二層リン脂質中に連続的に埋め込まれた。この現象に対する指標は次の実
験で見ることができる。
この薬物動態曲線に見られるピークの遅れは第９因子が器官（おそらくは肝臓
）中に蓄積され数日間の後に徐々に放出されることを示唆していると思われる。実施例12 リポソームの免疫原性遮蔽効果（生体外(in vitro)実験）
レシチンによるF VIIIの大量処方
3,000ユニットの第８因子を方法Ｄにより被包化した。この処方は全てクラス1
00のクリーンルーム中の無菌条件下で行われた。
リポソームを水で戻した後の結果を以下に示した：
遊離の第８因子及びリポソーム被包化第８因子の分離
１．リポソーム溶液を血液フィルターに通す。
２．１mlを1.5ml試験管に移す。
３．この試験管を室温で14,000g、５分間遠心する。
４．上清を「上清」とラベルした新しい試験管に移す。
５．上清と同じ量をリポソームペレットに加え、注意深く再懸濁する（ボルテッ
クス(vortex)は使用しない）。
６．ステージ４と同様に再び遠心し、上清を「洗浄液Ｉ」とラベルした洗浄済1.
5ml試験管中に移す。
７．洗浄液Ｉと同じ量をリポソームペレットに加え、注意深く再懸濁する。第８因子活性の測定
１．全(whole)リポソーム溶液（遊離の第８因子及びリポソームに充填された第
８因子を含む）の抽出及び活性測定：１%ヒト血清アルブミン(HSA)を含むアッセ
イ用バッファー中にリポソーム溶液を40倍に希釈する。Triton X-
100を0.5%になるように加える。溶液が透明になるまで10分間待つ。リポゾーム
抽出液を1% HSAを含むアッセイバッファー中に少なくとも５倍に希釈し、一段階
凝固アッセイにより第８因子を測定する。
２．洗浄したリポソームの抽出及び活性測定：ステージ１に述べたように行う。
３．一段階凝固アッセイで上清及び洗浄液Ｉフラクションの活性を測定する（1%
HSAを含むアッセイバッファー中に50-100倍に希釈する）。
４．充填パーセント=洗浄リポソーム抽出液／全リポソーム溶液の活性。
充填パーセントは85%であった。
イヌの血漿中の第８因子を検出するための免疫アッセイ
イヌの血漿における定量的免疫アッセイは正常なイヌにおける遊離の第８因子
の検出に重要であり、凝固アッセイと第８因子Agの比率はイヌの免疫系に対する
F VIII抗原の表現のあり方を反映することができる。ELISAアッセイ手順
20℃でモノクローナル抗FVIIIAg（ヨーク）の1/500希釈液（PBS中）とインキ
ュベートすることにより微量滴定プレートをコーティングした。遮断は、PBS-ト
イーン(Tween)20(0.05%)中に1/5に希釈したイヌ血漿で室温で２時間行った。FVI
II検量線はOCTAVIをイヌ血漿に希釈することにより作成した。サンプルは室温で
２時間インキュベートした。ヤギ抗FVIII関連抗体（ATAB）を第二抗体として使
用した。PBS中に1/500に希釈したものを室温で２時間インキュベートした。反応
は共役体及び基質を加えた後５分間行った。
結論：
定量的ELISAによりイヌ血漿中のFVIIIAg 2-70％凝固活性を検出することがで
き、これは約0.02-0.7ユニット/mlのヒトFVIIIである（数ナノグラムの感度）。イヌ血清におけるリポソーム中のFVIII:C/FVIIIAg比の測定 アッセイ手順
：方法Ｄによって種々のリン脂質比(蛋白／レシチン 1/1,000、1/4
00、1/100)で調製したリポソームを洗浄して遊離の非充填FVIIIを除き、膜に埋
め込まれたFVIIIの活性を測定した。凝固活性を一段階凝固試験によって試
験し、免疫反応性はELISAによって試験した。次いでリポソームをTriton-100で
分解し、充填（埋め込み＋被包化）FVIIIの合わせた活性を測定した。
結論：最良の充填及び抗原遮蔽は1/400の蛋白対リン脂質比で達成された。
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ，
ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，Ｇ
Ｅ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ
，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，
ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，Ｕ
Ａ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．いずれの原料に由来してもよいヒトの生化学的又は生理学的システムにおい て機能する生体高分子物質を小胞に高度に充填する方法であって、前記物質が好 ましくは酵素、前酵素、補助因子、ビリオンのようなミクロン以下の粒子、成長 因子、サイトカイン、リボソーム、Ｂ型肝炎表面抗原、オリゴ及びポリヌクレオ チド、抗体並びに／又は抗原であり、前記小胞が両親媒性物質により形成され、 以下の工程： a)水に不混和性の有機溶媒中で脂質小胞を形成するのに適当な脂質を混合するこ と； 或いは、乾燥した脂質又は脂質混合物を何らかの形態（粉末、顆粒など）で直 接使用することもできる； b)固体支持体の存在下で溶媒を除去すること； c)工程b)の生成物を、生理的に相溶性の溶液中の被包化すべき物質の溶液に入れ ること； d)可溶化又は分散化させる性質を持つ有機溶媒を加えること；及び e)工程d)で得られたフラクションを被包化すべき物質の機能が保持される条件下 で乾燥させること、 を含む方法。 ２．工程a)と工程b)の間に別の工程が含まれ、当該工程が工程a)のフラクション の滅菌、脱発熱物質処理、ウィルス不活性化及び／又は濾過である、請求項１に 記載の方法。 ３．工程d)と工程e)の間に別の工程が含まれ、当該工程が工程d)のフラクション の滅菌、ウィルス不活性化及び／又は分配である、請求項１及び／又は２に記載 の方法。 ４．前記生体高分子物質が血流中に自然に存在する抗体、酵素、前酵素及び／又 は補助因子である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。 ５．前記酵素、前酵素及び／又は補助因子が第７因子、第８因子、第９因子、第 10因子、第13因子、フィブリノーゲン、プロトロンビン及び／又はトロンビンの ような血液凝固連鎖反応系において機能するものである、請求項４に記載の方法 。 ６．前記酵素、前酵素及び／又は補助因子が、プラスミン、プラスミノーゲンの ような線維素溶解活性を持つ蛋白であるか、又は補体系において活性を持ち、及 び／若しくは免疫系における他の機能（体液又は組織結合）に関与する、請求項 ４に記載の方法。 ７．前記抗体、酵素、前酵素及び／又は補助因子の原料が動物若しくはヒトの組 織培養物、微生物若しくは形質転換された微生物、血液、血漿、他の体液である 、請求項１から６のいずれか一つに記載の方法。 ８．小胞を形成することができる前記両親媒性物質が、鶏卵及び大豆リン脂質、 ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び／又はジミリストイルホスフ ァチジルグリセロール（DMPG）、鶏卵ホスファチジルコリン（PC）のようなリン 脂質のような脂質である、請求項１から７のいずれか一つに記載の方法。 ９．水に不混和性の前記有機溶媒がフッ素化炭化水素、塩素化炭化水素などのよ うな極性プロトン溶媒である、請求項１から８のいずれか一つに記載の方法。 10．前記固体支持体がビーズ様の構造を持つ不活性の無機又は有機材料である、 請求項１から９のいずれか一つに記載の方法。 11．前記生理的に相溶性の溶液が約1.5重量%の塩化ナトリウム溶液と等価である 、請求項１から10のいずれか一つに記載の方法。 12．可溶化又は分散化させる性質を持つ前記有機溶媒がtert-ブタノールのよう な水と混和性の有機極性プロトン溶媒である、請求項１から11のいずれか一つに 記載の方法。 13．フラクションの乾燥が請求項１の工程d)のフラクションの蒸発乾燥、凍結乾 燥又は噴霧乾燥によって達成される、請求項１から12のいずれか一つに記載の方 法。 14．請求項１の工程e)の乾燥フラクションを水性媒質に入れて分散液又はペース トを形成する、請求項１から13のいずれか一つに記載の方法。 15．ヒトの生化学的又は生理学的システムにおいて機能する、酵素、前酵素、補 助因子、ビリオンのようなミクロン以下の粒子、成長因子、サイトカイン、リボ ソーム、Ｂ型肝炎表面抗原、オリゴ及びポリヌクレオチド、抗体並びに／又は抗 原のような生体高分子物質の処方であって、請求項１から14のうちの少なくとも 一つに記載の方法によって得られる得る処方。 16．1)請求項１に記載の方法の工程a)、b)及びc)を有する方法であるが、 (i)工程d)を含まない方法（方法Ｂ）か、若しくは (ii)請求項１に記載の工程d)に代わる、少なくとも１回の凍結及び解凍サイク ルの工程を含む方法（方法Ｃ） のいずれかの方法、又は 2)小胞製造工程である、酵素、前酵素及び／又は補助因子の実質的に塩を含まな い溶液の混合及び、それにより得られたフラクションの共乾燥が含まれる方法（ 方法Ｄ） によって得られる得る、請求項15に記載の処方。 17．第７因子、第８因子、第９因子、第10因子、第13因子、フィブリノーゲン、 プロトロンビン及び／又はトロンビンのような血液凝固連鎖反応系において機能 するもの；又はプラスミノーゲン、プラスミンのような線維素溶解活性を持つか 若しくは、抗体のような、補体系において活性を持ち、及び／若しくは免疫系に おける他の機能（体液又は組織結合）に関与するもののような血流中に自然に存 在する被包化された物質を有する、請求項14及び／又は15に記載の処方。 18．請求項１の工程c)又はd)のいずれかのフラクションの単離によって得られる 得る中間生成物としての請求項15に記載の処方。 19．請求項14による水性分散液又はペーストの形態をとる請求項15に記載の処方 。 20．請求項15から19に記載の処方を含む薬剤。 21．さらに他の医薬活性を持つ物質、並びにビヒクル及び／又はアジュバントを 含む、請求項20に記載の薬剤。 22．請求項20及び／又は21に記載の薬剤を局所、経口、バッカル、腹腔内、肺内 、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内又は眼内に有効量投与することにより疾病を治 療する方法。 23．体重１kg当たり最大約２gのリポソーム性脂質の用量が患者に投与される、 請求項22に記載の方法。 24．第８因子及び／又は第９因子を、所望によって他の医薬用物質を組み合わせ て、充填した小胞を投与することによって、第８因子及び／又は第９因子の欠乏 に関連する疾患の患者における第８因子阻害物質及び／又は第９因子阻害物質の 形成を予防し、すでに存在する第８因子阻害物質及び／又は第９因子阻害物質を 妨害する方法。
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