ES2262347T3

ES2262347T3 - Receptor tirosina quinasa humano.

Info

Publication number: ES2262347T3
Application number: ES99955501T
Authority: ES
Inventors: Namit Ghildyal; Govindaswamy Panchamoorthy
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1998-06-11
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2019-06-08
Also published as: DE69930662D1; AU4278299A; US6969596B2; EP1084245B1; DE69930662T2; ATE321856T1; US20050208566A1; US20030078222A1; EP1084245A1; WO1999064589A1; JP2002517241A

Abstract

Polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene al menos 80% de homología con un miembro elegido del grupo que consiste en: (la SEQ ID NO:3, las posiciones 1 a 122 de SEQ ID NO:3; las posiciones 26 a 422 de SEQ ID NO:3 y las posiciones 123 a 422 de SEQ ID NO:3).

Description

Receptor tirosina quinasa humano.

Se reivindica aquí la prioridad bajo el Título 35 USC § 119(e) de la Solicitud provisional, "Receptor tirosina quinasa humano", Serie nº 60/088.958, presentada el 11 de junio de 1998 en la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos de América, que se incorpora aquí como referencia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos que pertenecen a un nuevo receptor tirosina quinasa, y al uso de estas secuencias para identificar compuestos que modulan una actividad biológica y/o farmacológica de la biomolécula nativa. La invención también se refiere a moléculas antisentido biológicamente eficaces, así como también a versiones mutantes negativas dominantes del receptor tirosina quinasa, las cuales son adecuadas para uso terapéutico. La invención también se refiere al diagnóstico, estudio, prevención, y tratamiento de trastornos patofisiológicos relacionados con o mediados por el receptor tirosina quinasa.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis patológica se produce en muchas afecciones, y se piensa que está inducida por isquemia local. Las enfermedades en las que se piensa que la angiogénesis desempeña un papel crítico en la patología subyacente incluyen: enfermedades oculares tales como retinopatía diabética, retinopatía o premadurez y degeneración macular relacionada con la edad; enfermedades vasculares tales como cardiopatía isquémica y aterosclerosis; trastornos inflamatorios crónicos tales como soriasis y artritis reumatoide; y crecimiento de tumores sólidos. Una revisión reciente se centra principalmente en el papel de los RTK en la angiogénesis tumoral. Shawver, L.K., et al., Receptor Tyrosine as Targets for Inhibition of Angiogenesis, Drugs Discovery Today (Elsevier Science Ltd.), 2(2):50 (1997). La revisión apunta principalmente al papel de los factores de crecimiento y a sus receptores tirosina quinasa RTK en la regulación de la fisiología de los microvasos puesto que están relacionados con el proceso angiogénico. Para el crecimiento y metástasis de tumores sólidos es necesario el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. La importancia de la angiogénesis en tumores humanos ha sido subrayada por estudios recientes que relacionan el fenotipo angiogénico con la supervivencia del paciente. Estos estudios encontraron que el número de microvasos en un tumor primario tiene una importancia de pronóstico en el carcinoma de mama, en carcinomas de vejiga, carcinomas de colon, y tumores de la cavidad oral. Los agentes antiangiogénicos tienen potencialmente amplias aplicaciones en los hospitales. Véase también Herz, Jeffrey M., et al., Molecular Approaches to Receptors as Targets for Drugs Discovery, J. of Receptor & Signal Transduction Research, 17(5):671 (1997).

Marra et al.: EMBL ACC Nº AA098024, 27 de octubre de 1996, pretende describir una secuencia de EST de ratón para la cual la función asignada del polipéptido correspondiente es un receptor tirosina quinasa.

Auffray et al. EMBL ACC Nº Z42722, 6 de noviembre de 1994, describe un EST humano sin función asignada, que muestra identidad con partes de la secuencia de la presente invención.

Los RTK (también conocidos como receptores del factor de crecimiento) desempeñan un papel importante en muchos procesos celulares. Todas estas moléculas tienen un dominio de unión al ligando extracelular. Con la unión al ligando, los receptores se dimerizan, la tirosina quinasa se activa y los receptores se autofosforilan. Ulrich, A., et al., Cell, 61:203 (1990). La cascada accionada por la activación de RTK modula sucesos celulares, determinando la proliferación, diferenciación y morfogénesis de manera positiva o negativa. Las perturbaciones en la expresión de los factores de crecimiento, sus RTK cognatos, o constituyentes de las rutas de señalización en dirección 3' están asociadas habitualmente con mucho tipos cáncer. Se ha demostrado que las mutaciones génicas que dan lugar a productos proteínicos alterados alteran los mecanismos reguladores que influyen en la proliferación celular, dando como resultado la iniciación y la progresión de tumores. Shawver, L.K., et al., Receptor Tyrosine Kinases as Targets for Inhibition of Angiogenesis, DDT (Elsevier Science Ltd.), 2(2):50 (1997).

Una estrategia para interferir con la señalización del receptor es inhibir la unión al ligando. Esto se puede lograr con antagonistas específicos de la unión al receptor, tales como fragmentos de ligando, o con antagonistas no específicos, tales como suramina, con agentes neutralizantes del ligando o del receptor, o con un exceso de receptor soluble o de proteína que se une al ligando, que se secuestrará al ligando. Una segunda estrategia para interferir con la señalización del receptor es bloquear la transducción de la señal mediante la sobreexpresión de un receptor negativo dominante. Debido a que los receptores quinasas se dimerizan típicamente para inducir la transducción de señales a través de la transfosforilación, la prevención de la dimerización del receptor, debido a la sobreexpresión de receptores deficientes en quinasa, atenuará la activación de la señalización. Los receptores se pueden hacer deficientes en quinasas mediante la introducción de una mutación de punto en los aminoácidos, crítica para la función quinasa, o mediante la supresión de la quinasa o de todo el dominio citoplásmico. Otra estrategia para entender la función del receptor implica agotar la proteína del receptor. Esto se puede lograr mediante la introducción de agentes exógenos, tales como oligonucleótidos antisentido, ARN antisentido, o ribozimas, todos los cuales conducen a la degradación del ARNm del receptor, y al agotamiento gradual de la proteína en la célula. Id.

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Los profundos efectos celulares mediados por tirosina quinasas y por fosfotirosina fosfatasas los han hecho dianas atractivas para el desarrollo de nuevas moléculas terapéuticas. Por ejemplo, se sabe que la sobreexpresión de las tirosina quinasas, tales como HER2, puede desempeñar un papel decisivo en el desarrollo de cáncer, y que los anticuerpos capaces de bloquear la actividad de esta encima pueden anular el crecimiento tumoral. Slamon, D. J., et al., Science, 235:177 (1987); Drebin, et al., Oncogene 2:387 (1988). Más recientemente, se han hecho intentos para identificar pequeñas moléculas que actúen como inhibidores de tirosina quinasa. Por ejemplo, los compuestos arílicos monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos (documento PCT WO 92/20642), los derivados de vinilen-azaindol (documento PCT WO 94/14808) y las 1-ciclopropil-4-piridil-quinolonas (Patente U.S. nº 5.330.992), se han descrito generalmente como inhibidores de tirosina quinasas. Los compuestos de estirilo (Patente U.S. nº 5.217.999), los compuestos de piridilo sustituidos con estirilo (Patente U.S. nº 5.302.606), ciertos derivados de quinazolina (Solicitud EP nº 0566266 A1), los selenoindoles y los seleniuros (Documento PCT WO 94/03427), los compuestos polihidroxílicos tricíclicos (documento PCT WO 92/21660) y los compuestos de ácidos bencilfosfónicos (documento PCT WO 91/15495) se han descrito como compuestos para uso como inhibidores de tirosina quinasas para uso en el tratamiento de
cáncer.

La disponibilidad de una nueva especie de receptor tirosina quinasa humano que este claramente implicado mediante una conexión funcional a una enfermedad sería ideal para tal cribado farmacéutico, así como para el diagnóstico, estudio, prevención y tratamiento de enfermedades patofisiológicas relacionadas con la molécula biológica.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido que tiene al menos una homología del 80% con un miembro seleccionado del grupo que consiste en: (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 posiciones 1-122, SEQ ID NO:3 posiciones 26-422, y SEQ ID NO:3 posiciones 123-422).

La presente invención también se refiere a un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia según se representa en SEQ ID NO:3, en la que la posición 147 (lisina) de SEQ ID NO:3 está sustituida o eliminada.

Los polinucleótidos aislados y purificados de la presente invención incluyen secuencias que comprenden SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2.

La actual invención se refiere a un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO:3 o una variante de SEQ ID NO:3 que tiene al menos una homología de 80% con un miembro seleccionado del grupo que consiste en: (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 posiciones 1-25, SEQ ID NO:3 posiciones 1-122, SEQ ID NO:3 posiciones 26-422, y SEQ ID NO:3 posiciones 123-422).

Una realización preferida de la invención es una molécula polinucleotídica antisentido aislada y purificada, biológicamente eficaz, que comprende un oligómero en el intervalo de 12 a 25 nucleótidos de longitud, que es complementario a una región dentro de las posiciones 67-148 y 1333-1414 de SEQ ID NO:1.

La invención se refiere además a un vector de expresión, así como a células hospedantes que alojan al vector de expresión, para la expresión de un polipéptido, en el que dicho vector comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido como se representa en SEQ ID NO:3, o un derivado farmacológica y/o biológicamente activo, o biológicamente efectivo, como se describe anteriormente.

La actual invención se refiere además a métodos para identificar compuestos que modulan una actividad biológica y/o farmacológica de una tirosina quinasa, que comprenden:

(a): combinar un compuesto candidato modulador de la actividad con un polipéptido que tiene la secuencia como se representa SEQ ID NO:3, o una variante como se describe anteriormente, y

(b): medir el efecto del compuesto candidato modulador sobre la actividad biológica y/o farmacológica del polipéptido.

Adicionalmente, la invención se refiere a métodos de tratamiento de un paciente que necesite tal tratamiento para una afección que esta mediada por una tirosina quinasa, que comprende administrar: (a) una cantidad eficaz de un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante negativo dominante, biológicamente eficaz, que comprende la secuencia como se representa en SEQ ID NO:3, o una variante contemplada del mismo; y/o (b) una cantidad eficaz de una molécula antisentido biológicamente eficaz derivada del complemento de SEQ ID NO:1.

Descripción detallada de la invención

Excepto que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por el experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y patentes citadas aquí se incorporan como referencia.

La actividad biológica, como se usa aquí con referencia a la tirosina quinasa de la presente invención, se refiere a la actividad de quinasa de la biomolécula, y/o al comportamiento de una cualquiera o más de las funciones, incluyendo, pero sin limitarse a, la capacidad para autofosforilarse, para fosforilar un sustrato, para unirse a ATP, y para mediar la activación de Cdc2 quinasa. La actividad farmacológica, como se usa aquí con referencia a la tirosina quinasa de la presente invención, se refiere a la activación transcripcional directa o indirecta de uno o más genes, así como también a la capacidad para mediar uno cualquiera o más de los estados fisiológicos, incluyendo, pero sin limitarse a, mitosis, diferenciación celular, proliferación, transformación oncogénica, neoplasia, regulación de macrófagos, regulación de células endoteliales, regulación de fibroblastos, estructura citoesquelética, metástasis, agregación celular, movilidad celular, citoquinesis, cáncer, angiogénesis, envejecimiento celular, inflamación aguda y crónica, enfermedades autoinmunitaria, artritis, procesos neurodegenerativos, respuesta alérgica, respuesta a estrés, secreción, apoptosis, caquesia, trastornos neurológicos, insuficiencia venosa periférica, aterosclerosis, cardiopatía, asma y ateroma.

Mutante negativo dominante, como se usa aquí, se refiere a una secuencia de una región que codifica un polipéptido o un ácido nucleico que se ha cambiado con relación a al menos una posición en la secuencia, con relación a la versión nativa de tipo salvaje correspondiente, en una posición que cambia una posición de un resto de aminoácido en un sitio activo requerido para la actividad biológica y/o farmacológica del péptido nativo. Los mutantes negativos dominantes de SEQ ID NO:3 contemplados aquí incluyen, pero no se limitan a, especies polipeptídicas que manifiestan cualquier cambio con relación a un cambio cualquiera en el resto Lys(K)^{147}.

Biológicamente eficaz, como se usa aquí con relación a moléculas de ácidos nucleicos antisentido, así como también a regiones mutantes negativas codificantes de ácidos nucleicos y a péptidos mutantes negativos dominantes, se refiere a la capacidad de estas moléculas para modular la actividad biológica y/o farmacológica de la tirosina quinasa de la presente invención, incluyendo la modulación directa o indirecta de la activación transcripcional de uno o más genes, y/o la transcripción/traducción de regiones codificantes de ácidos nucleicos de la tirosina quinasa de la presente invención. Las moléculas antisentido biológicamente eficaces, así como también los ácidos nucleicos que codifican versiones mutantes negativas dominantes biológicamente eficaces de SEQ ID NO:3, son realizaciones preferidas de la presente invención.

"Como se representa", como se usa aquí, se refiere a la secuencia así como también a los derivados inherentes como se describen anteriormente, por ejemplo un derivado funcional que demuestra o realiza sustancialmente la misma actividad biológica y/o farmacológica sustancialmente de la misma manera. Por lo tanto, "como se representa" pretende englobar versiones truncadas biológica y/o farmacológicamente activas claramente derivadas de las secuencias descritas y caracterizadas aquí, (por ejemplo, dominios evidenciados), así como secuencias quiméricas que contienen una o más de ellas.

Variante, como se usa aquí, se refiere a secuencias sustancialmente como se muestran, que tienen cambios, por ejemplo, una secuencia polipeptídica que comprende una secuencia que difiere de la secuencia referida en al menos una sustitución, adición o supresión de un aminoácido, preferiblemente una sustitución de un aminoácido conservativa, que demuestra o realiza sustancialmente la misma actividad biológica y/o farmacológica sustancialmente de la misma manera, así como versiones truncadas de estas variantes. Sin embargo, como se usa aquí, "variante" pretende englobar todos los mutantes negativos dominantes biológicamente eficaces contemplados, varios de los cuales se exponen aquí.

El término modulación se usa aquí para referirse a la capacidad de potenciar o inhibir una función de una molécula biológica, incluyendo, pero sin limitarse a, una actividad biológica y/o farmacológica de una molécula de tirosina quinasa, o la capacidad para potenciar o inhibir una propiedad funcional de una región que codifica un ácido nucleico. "Modular la fisiología", como se usa aquí, se refiere a la regulación biofisiológica de células y/o del tejido, y al tratamiento de trastornos patofisiológicos relacionados con ello.

"Administración directa", como se usa aquí, se refiere a la administración directa de moléculas de ácidos nucleicos, péptidos, o compuestos, así como también derivados/variantes contemplados de la presente invención. La administración directa incluye, pero no se limita a, técnicas de terapia génica ex vivo así como in vivo.

"Purificada", como se usa aquí, se refiere a moléculas, ya sean secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, que se retiran de su entorno natural y se aíslan o se separan de al menos algún otro componente con el cual están asociadas de forma natural.

"Vector de expresión", como se usa aquí, se refiere a construcciones vectoriales de ácidos nucleicos para dirigir la transcripción de regiones de ácidos nucleicos en células hospedantes. Los vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores retrovíricos, vectores víricos y sintéticos.

"Células hospedantes transformadas", como se usan aquí, se refiere a células que contienen uno o más ácidos nucleicos de la presente invención.

RTK

Ahora se ha caracterizado una amplia variedad de receptores polipeptídicos del factor de crecimiento que poseen actividad intrínseca de tirosina quinasa. Los receptores tirosina quinasas (RTK) activados sufren la dimerización e inician la señalización a través de la fosforilación, específica de la tirosina, de diversos intermedios, activando una cascada de rutas intracelulares que regulan el metabolismo de fosfolípidos y araquidonatos, la movilización del calcio, la fosforilación de proteínas (que implica a otras proteína quinasas), y la regulación de la transcripción. La actividad de tirosina quinasa, dependiente del factor de crecimiento, del dominio citoplásmico de RTK es el mecanismo principal para la generación de señales intracelulares que inician múltiples respuestas celulares. Las respuestas celulares mediadas por RTK incluyen alteraciones en la expresión génica, proliferación celular, arquitectura citoesquelética, metabolismo celular, diferenciación y supervivencia celular. Los receptores tirosina quinasas constan de un dominio de unión a ligando extracelular amino-terminal, un dominio transmembránico, y un dominio de tirosina quinasa intracelular carboxi-terminal. Herz, Jeffrey M., et al., Molecular Approaches to Receptors as Targets for Drugs Discovery, J. of Receptor & Signal Transduction Research, 17(5):671 (1997).

Aunque existe una tremenda diversidad entre los numerosos miembros de la familia de RTK, los mecanismos de señalización usados por estos receptores comparten muchas características comunes. Estudios genéticos bioquímicos y moleculares han demostrados que la unión del ligando al dominio extracelular de la RTK activa rápidamente la actividad catalítica intrinseca de la tirosina quinasa del dominio intracelular. La actividad enzimática del dominio de la RTK quinasa es esencial para la transducción de señales. El aumento de actividad también conduce a la fosforilación de un numero de sustratos intracelulares, y a la activación de numerosas moléculas de señalización en dirección 3'. Los ejemplos de proteínas que se activan frecuentemente incluyen: fosfolipasa-C-\gamma (PLC-\gamma), fosfatidilinositol 3-quinasa (PI-3quinasa), la proteína activadora de GTPasa, pp60^{c-arc} proteína tirosina quinasa, p21-ras y otras. Id.

El papel de los receptores tirosina quinasas (RTK) en la formación de una nueva vasculatura sanguínea asociada con la enfermedad humana ha proporcionado una fuerte base teórica para identificar formas de inhibición de la función de estas enzimas. La inmensa mayoría de los esfuerzos se ha centrado sobre la inhibición de los receptores de FGF y VEGF. Se ha implicado a otras RTK en la engiogénesis. Estas dianas serían susceptibles a muchos de los enfoques que se han adoptado usando las dianas de receptores de FGF y VEGF. Las modalidades terapéuticas que se han estudiado para la anulación de la señalización dependiente de FGF y VEGF incluyen el uso de nucleótidos (terapia génica y antisentido), proteínas (anticuerpos, señuelos receptores y ligandos) compuestos de bajo peso molecular, así como la expresión de formas negativas dominantes. El uso de compuestos de bajo peso molecular para tratar la angiogénesis representa un área de actividades de investigación siempre en expansión. Shawer, L. K., et al., Receptor Tyrosine Kinases as Targets for Inhibition of Angiogenesis, DDT (Elsevier Science Ltd.), 2(2):50 (1997).

La artritis reumatoide, aunque caracterizada por inflamación e inmunoproliferación, es otra enfermedad en la que la angiogénesis se ha visto implicada en el proceso mórbido, debido a que los RTK representan proteínas con función enzimática, se prestan a una intervención farmacológica con compuestos de pequeñas moléculas. Id.

Receptor tirosina quinasa humano

Se expone aquí una secuencia de ADNc de 2607 pares de bases, SEQ ID NO:1, que pertenece a la SEQ ID NO:3 de receptor tirosina quinasa humano. La región estructural de 1269 pares de bases, ATG a TGA, SEQ ID NO:2 que codifica SEQ ID NO:3 (422 aminoácidos), está contenida en SEQ ID NO:1.

La secuencia física (SEQ ID NO:3) contiene todas las secuencias de signatura de tirosina quinasa, las secuencias de yuxtamembrana, las secuencias transmembránicas y las secuencias extracelulares que muestran similitud estructural con los receptores tirosina quinasas conocidos, por ejemplo, FGF-R, EGF-R, PDGF-R, IGF-R, VEGF-R, FLK, FLT, TIE, así como otros conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Dionne, C.A., et al., EMBO., 9:2685 (1990); Berchuk, A., et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 161:1247 (1989); Kraus, M.H., et al., Ann. NY Acad. Sci., 551:320 (1988); Bishop, J.M., et al., Science, 235:305 (1987). La SEQ ID NO:3 demuestra atributos del polipéptido que incluye un dominio transmembránico de 24 restos que separa una porción extracelular del dominio citoplásmico. El dominio citoplásmico incluye una secuencia yuxtamembránica seguido inmediatamente del dominio de tirosina quinasa, que contiene once subdominios. Las secuencias de signatura mostradas en la nueva molécula de transducción de señal de receptor de tirosina quinasa humano (SEQ ID NO:3) son cada una de los Subdominios I-XI.

El papel de los receptores tirosina quinasas en la proliferación celular, entre otros, ha conducido a la creencia de que los RTK tienen papeles importantes en la mediación de la enfermedad, y en consecuencia tienen un potencial significativo como agentes terapéuticos específicos. En consecuencia, en la industria farmacéutica son muy deseados los agentes moduladores de la actividad de quinasa y/o la actividad de receptor de RTK específica, como compuestos candidatos ha desarrollar. Las moléculas de receptor tirosina quinasa que son particularmente características del tejido enfermo, por ejemplo adenocarcinoma (por ejemplo, SEQ ID NO:3), sirven como importantísimos candidatos para el diagnóstico de patologías, así como dianas para la modulación de la fisiología tisular.

Se ha cartografiado la SEQ ID NO:1 al cromosoma 12p12.3 usando un panel híbrido de radiación Standford G3 por medio de clones celulares obtenidos de Research Genetics, Huntsville, AL. Stewart et al., Genome Res., 7, 422(1997). Se ha demostrado que se producen anormalidades citogenéticas y pérdida de heterozigosidad 12p12 en un gran número de tipos de tumores además del de los adenocarcinomas, por ejemplo tumores de células reproductoras, SCC oral, Ca ovárico, leucemia linfocítica aguda y tumores de células reproductoras testiculares. Se ha mostrado que la región del cromosoma 12p12-p13 se amplifica (4-11 copias) en un gran número de tumores.

La SEQ ID NO:1 demuestra un total de 14 secuencias de repetición GT entre las posiciones 2125 y 2152. La secuenciación del ADN a partir del ADN genómico correspondiente procedente de 27 caucásicos no emparentados mostró 11, 12, 13, 14 y 15 copias de la repetición GT en el gen de tirosina quinasa correspondiente a SEQ ID NO:1 de 27 caucásicos, con las siguientes frecuencias respectivas: 6/54; 2/54; 17/54; 16/54; y 13/54. No se observó ningún homocigoto para ningún alelo. Esta repetición CA/GT de número variable se puede usar como un marcador genético para el gen del receptor de tirosina quinasa y para el cromosoma 12p12.3 tanto para estudios de asociación de enfermedades como para estudios de pérdida de heterozigosidad. Se pretende que cada uno de estos alelo este dentro del alcance de las reivindicaciones aquí anejas (por ejemplo, cebadores de PCR que se pueden construir fácilmente a partir de ellos por una persona de pericia normal para métodos de diagnóstico y/o composiciones). Véase, Ejemplo II.

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El ARN mensajero que pertenece a SEQ ID NO:1 se expresa selectivamente en prosencéfalo.

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Las transferencias Northern de Clontech (Palo Alto, CA) mostraron que uno o más genes que pertenecen a la nueva tirosina quinasa (SEQ ID NO:1) se transcribió selectivamente en tejido de prosencéfalo humano. Se observaron en el putamen y en lóbulo frontal niveles elevados de expresión de ARNm que pertenecen al receptor tirosina quinasa, en contraste con los niveles bajos a indetectables del transcrito en el cerebelo y en el tejido del bulbo raquídeo.

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Las SEQ ID NO:3 se sobreexpresa en un gran número de tumores y en los tejidos cerebrales de los pacientes con Alzheimer

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Se realizó un análisis inmunocitoquímico, en colaboración con LifeSpan Biosciences (Seattle, WA), mediante el empleo de muestras clínicas primarias y el anticuerpo descritos aquí. En tejidos normales, el anticuerpo anti-SEQ ID NO:3 muestra tinción positiva: en neuronas y neurogliocitos ocasionales, y menos frecuentemente en sus procesos celulares, en el epitelio de la mama, los entericitos y células de Schwann en el colon, células APUD, hepatocitos y células de Kupffer, neumocitos tipo 2 ocasionales, y en macrófagos, leucocitos polimorfonucleares, y un subconjunto de linfocitos, células plasmáticas y células endoteliales. La tinción es negativa en tipos celulares normales incluyendo fibroblastos, adipositos, células caliciformes, el músculo liso de la capa muscular de la mucosa y la musculares propria (capa gruesa del tejido muscular), vías biliares, neumócitos de tipo I, epitelio respiratorio que forra los bronquiolos, y el epitelio glandular prostático.

Tejido	Diagnóstico	Edad/Sexo
Cerebro	Normal	56/V
Cerebro	Normal	45/H
Mama	Normal	37/H
Mama	Normal	69/H
Colon	Normal	87/V
Colorrectal	Normal	NA
Hígado	Normal	46/V
Hígado	Normal	75/V
Pulmón	Normal	ADULTO
Pulmón	Normal	ADULTO
Próstata	Normal	75/V
Próstata	Normal	46/V
Cerebro	Alzheimer	90/H
Cerebro	Alzheimer	81/V
Cerebro	Alzheimer	76/H
Cerebro	Alzheimer	80/H
Cerebro	Alzheimer	60/H
Cerebro	Glioblastoma	52/V
Cerebro	Glioblastoma	44/V
Cerebro	Adenocarcinoma metastásico	70/V
Cerebro	Adenocarcinoma metastásico	49/V
Mama	Adenocarcinoma mucoso
Mama	Carcinoma canalicular infiltrante
Mama	Carcinoma canalicular infiltrante
Mama	Carcinoma canalicular infiltrante
Mama	Carcinoma canalicular infiltrante

(Continuación)

Tejido	Diagnóstico	Edad/Sexo
Colon	Adenocarcinoma bien diferenciado	89/V
Colon	Adenocarcinoma bien diferenciado	62/V
Colon	Adenocarcinoma bien diferenciado	77/V
Colon	Adenocarcinoma bien diferenciado	87/V
Recto	Adenocarcinoma bien diferenciado	ADULTO
Recto	Adenocarcinoma bien diferenciado	ADULTO
Recto	Adenocarcinoma bien diferenciado	ADULTO
Recto	Adenocarcinoma bien diferenciado	ADULTO
Recto	Adenocarcinoma bien diferenciado	ADULTO
Próstata	Adenocarcinoma
Próstata	Adenocarcinoma poco diferenciado
Próstata	Adenocarcinoma
Próstata	Adenocarcinoma
Próstata	Adenocarcinoma
Pulmón	Adenocarcinoma de célula grande poco diferenciado	53/H
Pulmón	Adenocarcinoma	65/V
Hígado	Carcinoma hepatocelular	66/V
Hígado	Carcinoma hepatocelular	82/V

Análisis inmunocitoquímico de tejidos enfermos (anticuerpo anti-SEQ ID NO:3)

A.: Tejidos cancerosos: dentro de los tejidos neoplásicos, se demuestra tinción positiva en dos adenocarcinomas metastáticos, tinción positiva en los cinco adenocarcinomas de mama, tinción positiva en los cinco adenocarcinomas de colon, tinción positiva en los cinco adenocarcinomas del rectosigmoide, y tinción positiva en cuatro de cinco adenocarcinomas prostáticos, y tres de cinco adenocarcinomas de pulmón.

B.: Tejidos de Alzheimer: la tinción más notable con el anticuerpo antirreceptor tirosina quinasa se observó en los casos de Alzheimer, tanto aquellos con signo de lesión isquémica adicional (es decir, signo de infarto reciente o antiguo debido a tromboembolia) como aquellos sin signo de lesión. El grado de tinción en las neuronas en el tejido cerebral y neurogliocitos de áreas relativamente normales fue débil, y similar a la tinción ocasional débil de células y procesos celulares observada en los cerebros normales. En contraste con la tinción débil en las regiones normales, hubo un nivel significativamente aumentado de señal en neuronas y sus procesos celulares asociados en áreas de lesión. Además, este incremento en la señal no fue notable en los procesos celulares del neurópilo (en lugar de en el citoplasma perinuclear de la neurona o astrocito), produciendo anillos similares a auréolas en una distribución perisomática alrededor de las neuronas, arborizando señales alrededor de astrocitos, y depósitos extensos, difuminados dentro de los axones y procesos celulares del neurópilo. El incremento en la señal se observó en cerebro sin infartos con enfermedades de Alzheimer importante (particularmente en regiones con una concentración elevada de placas neuríticas o en marañas neurofibrilares), y también en cerebros que contienen regiones de infarto además de los cambios clásicos de la enfermedad de Alzheimer.

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La tirosina quinasa SEQ ID NO:3 es importante en tejido de cáncer de próstata.

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Basándose en hallazgos inmunohistoquímicos (más arriba), se obtuvieron tejidos de tumor de próstata del National Disease Research Interchange, Phila., PA. El análisis de transferencia Western de los lisados titulares confirmó la presencia de 2 proteínas (60 y 55 kDa) que reaccionaron con el anticuerpo anti-SEQ ID NO:3. Para confirmar adicionalmente si estas proteínas están fosforiladas en la tirosina, la muestra de tumor de próstata se soldó con anticuerpo anti-fosfotirosina. El anti-pY Ab se unió a la proteína de 55 kDa (la más prominente de todas las proteínas que reaccionan con pY) en los lisados de próstata, que se encontró que era la SEQ ID NO:3 al extraer y volver a sondar la transferencia con anticuerpo anti-SEQ ID NO:3.

Oligonucleótidos antisentido derivados de SEQ ID NO:1 que inhiben la proliferación de células A549

En vista de la demostración de que el receptor tirosina quinasa está sobreexpresado en estirpes celulares tumorales así como en tejido tumorales clínicos primarios, se examinó la actividad farmacológica de la tirosina quinasa para inducir la proliferación celular. Particularmente, se decidió investigar si moléculas antisentido, complementarias a regiones del ARNm del receptor tirosina quinasa, tendrían un efecto sobre la proliferación celular. Se sintetizaron dos oligonucleótidos antisentido ejemplares, y sus correspondientes oligonucleótidos sentido (como controles), que pertenecen a las posiciones 75-92 (oligo 1) y 1348-1365 (oligo 2) de SEQ ID NO:1 (más abajo se exponen realizaciones adicionales preferidas de moléculas antisentido). Los resultados de tres experimentos independientes mostraron una media de inhibición del 50% de la proliferación de células A549 con la administración de oligo 1 antisentido. La administración de oligo 2 antisentido demostró un efecto inhibidor del 20%. Ca da uno de los oligonucleótidos sentido (controles) correspondientes no demostraron ningún efecto sobre la proliferación. Véase el Ejemplo III.

Estudios de actividad biológica usando constructor quiméricos de CD8

Para verificar una actividad biológica particular del receptor tirosina quinasa, se generaron constructores quiméricos que constan del dominio extracelular de CD8 (CD8 es una proteína de superficie celular específica de CTL bien conocida) y del dominio citoplásmico de SEQ ID NO:3 (posiciones 26-422). Estos constructos se expresaron con éxito en células COS-7, en fibroblastos NIH/3T3 y en estirpes celulares de HEK293, según se determina mediante transferencia Western usando el anticuerpo anti-SEQ ID NO:3. Se ha dado a conocer que los restos Cys extracelulares de CD8 pueden formar enlaces de disulfuro intermoleculares; en consecuencia, se teorizó que las moléculas quiméricas se dimerizarían, después de la expresión, uniendo los dos dominios de quinasa juntos, y estimulando la trans-fosforilación. Se realizó un ensayo de quinasa in vitro sobre el material inmunoprecipitado obtenido de células HEK293 transfectadas. Los resultados mostraron que se observaron niveles bajos de fosforilación de la tirosina en las proteínas quimérica. Para comprender adicionalmente la función celular del receptor tirosina quinasa, se realizó un experimento preliminar en células U937 transfectadas con las quimeras, seguido de la activación con Ab anti-CD8 durante 15 minutos (las células U937 se escogieron puesto que son células no adherentes, y por tanto requieren cantidades bajas de Ab anti-CD8). Los resultados se analizaron mediante análisis de transferencia Western usando Ab anti-fosfotirosina (pY). Aunque hubo diferencias sutiles en los patrones de pY entre las líneas activadas e inactivadas de Ab se encontró que una proteína destacada de 34 kDa fosforilada en la tirosina, mostró una movilidad retardada en la muestra activada de Ab anti-CD8. Esta proteína de 34 kDa se identificó como Cdc2 al volver a sondar la transferencia con Ab monoclonal anti-Cdc2. Estos datos sugieren claramente que el nuevo receptor tirosina quinasa (SEQ ID NO:3) está relacionado con la progresión del ciclo celular.

La actividad biológica, como se usa aquí con referencia a la tirosina quinasa de la presente invención, se refiere entre otras a la mediación de la activación de Cdc2 quinasa que, a su vez, media la mitosis. Véase, por ejemplo, Nishio K., et al., Antitumor effects of butyrolactone I, a selective cdc2 kinase inhibitor, on human lung cancer cell lines, Anticancer Research, 16(6B): 3387(1996); Vicent I., et al., Aberrant expression of mitotic cdc2/cyclin BI kinase in degenerating neurons of Alzheimer's disease brain, Journal of Neuroscience, 17 (10):3588 (1997).

Expresión del receptor tirosina quinasa durante la retirada del factor de crecimiento nervioso (NGF) en células PC12

Se da ha conocer que la apóptosis neural, según se manifiesta en la enfermedad de Alzheimer, es debida en parte a un intento descoordinado de las células que no se dividen de reentrar y avanzar a través del ciclo celular. Davis PK, et al., Journal of Neurochemistry, 68:2338 (1997). Esto se cree que es importante debido al hecho de que el receptor tirosina quinasa descrito aquí se sobreexpresa en tejido que pertenece tanto a la enfermedad de Alzheimer como en tumores primarios proliferativos; así como la demostración de que la activación de SEQ ID NO:3 está ligada a la progresión del ciclo celular. Como corolario, se decidió determinar si la nueva tirosina quinasa se sobreexpresa en células neuronales en células neuronales apoptóticas. Otros han demostrado que el nivel de Cdc2 quinasa aumenta en cinco veces en células PC12 apoptóticas tras la supresión del NGF. Id. Las células PC12 se trataron con NGF durante 10 días. Las células se lavaron entonces en medio, y se incubaron en ausencia de NGF durante una hora. Las células se cosecharon, y los lisados se sometieron a electroforesis de SDS-PAGE, seguido de la transferencia Western con un anticuerpo anti-SEQ ID NO:3. Los resultados demostraron que la proteína de SEQ ID NO:3 aumentó drásticamente una hora después de la retirada del NGF. Estos datos sugieren que la expresión de SEQ ID NO:3 puede estar implicada en apoptosis neuronal.

Importancia farmacológica

Es muy probable que el receptor tirosina quinasa descrito aquí (SEQ ID NO:3) sea un regulador importante del crecimiento celular en tumores particulares. Similar a la familia EGFR de RTK (EGF-R, FGF-R, PDGF-R, Flk-1/KDR, Flt-1, Tie-1 y Tek/Tie-2), la nueva tirosina quinasa humana de transducción de señales se sobreexpresa en una variedad de carcinomas (por ejemplo, adenocarcinoma colorrectal y carcinoma de pulmón), y parece que está íntimamente relacionada y puede contribuir directamente al desarrollo de tumores cancerigenos. De este modo, se contempla la identificación de agentes de modulación para el tratamiento de una variedad de adenocarcinomas.

Se contempla modular la actividad farmacológica y/o biológica del receptor tirosina quinasa, descrito aquí, en relación con el tratamiento de una amplia variedad de patologías incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedad manifestada por engiogénesis anormal, enfermedad vascular periférica, artritis, enfermedades oculares tales como retinopatía diabética, retinopatía o degeneración macular de la premadurez y relacionada con la edad, cardiopatía isquémica y aterosclerosis, trastornos inflamatorios crónicos tales como soriasis y artritis reumatoide, y crecimiento de tumores sólidos y metástasis.

La SEQ ID NO:3 o las secuencias de ácidos nucleicos que codifica, por ejemplo SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:2, tiene un potencial significativo por la capacidad de atenuar respuestas patofisiológicas. La capacidad para detectar sistemáticamente antagonistas y/o agonistas que modulan la actividad biológica y/o farmacológica de la molécula de tirosina quinasa humana nativa, como se describe aquí es significativamente valiosa para la identificación y desarrollo de agentes terapéuticos. Además, las aplicaciones de diagnóstico son fácilmente manifiestas para la detección de estados patofisiológicos manifestados por niveles anormales de moléculas tales como SEQ ID NO:2 y/o SEQ ID NO:3, por medio de la amplificación de secuencias mediante PCR y la posterior detección y/o ensayos a base de anticuerpos, por ejemplo ensayos a base de ELISA, que son bien conocidos por los expertos en la técnica y que se realizan fácilmente dada la información descrita aquí.

La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos de la tirosina quinasa, y variantes como se describen anteriormente, y al uso de estas secuencias para identificar compuestos que modulan la actividad biológica y/o farmacéutica de una molécula de transducción de señales.

Las secuencias polinucleotídicas que codifican la tirosina quinasa como se representa en SEQ ID NO:3, y las variantes como se describen anteriormente, contempladas aquí, son una realización particularmente preferida de la presente invención. Las moléculas y ácidos nucleicos antisentido, biológicamente eficaces, que codifican versiones mutantes negativas dominantes biológicamente efectivas de SEQ ID NO:3, o derivados como se describen anteriormente, así como versiones mutantes negativas de SEQ ID NO:3, y derivados como se describen aquí anteriormente, ejemplos de cada uno de los cuales se describen más abajo, son realizaciones preferidas de la presente invención, y están destinada a caer dentro del alcance de las reivindicaciones aquí anejas.

La presente invención también proporciona un método de tratamiento de un paciente que necesita de tal tratamiento, a saber de un paciente que sufre una patología mediada por la tirosina quinasa de SEQ ID NO:3 o por otra molécula de transducción de señales o por un activador transcripcional en dirección 3', que comprende administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico antisentido biológicamente eficaz derivada de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, o administrar una cantidad eficaz de un ácido nucleico que codifica una versión mutante negativa dominante biológicamente eficaz de la tirosina quinasa.

La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2) y a secuencias de aminoácidos (por ejemplo, SEQ ID NO:3; posiciones 1-122 de SEQ ID NO:3, posiciones 26-422 de SEQ ID NO:3 y posiciones 123-422 de SEQ ID NO:3) de la nueva quinasa humana de transducción de señales, así como derivados inherentes como se describen anteriormente, por ejemplo un derivado funcional que demuestra o realiza sustancialmente la misma actividad biológica y/o farmacológica sustancialmente de la misma forma. La invención también pretende englobar versiones truncadas biológica y/o farmacológicamente activas, derivadas claramente de las secuencias descritas y caracterizadas aquí (por ejemplo, dominios evidenciados descritos más arriba), así como secuencias quiméricas que contienen una o más de ellas.

Variantes

La presente invención se refiere a variantes de secuencias de ácidos (por ejemplo, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2) y a secuencias de aminoácidos (por ejemplo, SEQ ID NO:3) como se describen anteriormente, que tienen cambios, por ejemplo una secuencia polipeptídica que comprende una secuencia que difiere de la secuencia citada en al menos una sustitución de aminoácido, preferiblemente una sustitución conservativa de aminoácido, que demuestra o realiza sustancialmente la misma actividad biológica y/o farmacológica sustancialmente de la misma forma, así como a moléculas que comprenden versiones truncadas de estas variantes. Sin embargo, variante, como se usa aquí, está destinada, dentro de la limitación de lo que se describió anteriormente, a englobar todos los mutantes negativos dominantes biológicamente eficaces contemplados, varias de cuyas especies se exponen aquí.

Una variante, como se representa en SEQ ID NO:3, es aquella que tiene al menos un 80% de homología (identidad) de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:3; una variante preferida es aquella que tiene una homología de secuencia de aminoácidos de al menos 90%; y una variante más preferida es aquella que tiene una homología de secuencia de aminoácidos de al menos 95%, con la secuencia de aminoácidos de la molécula de quinasa según se representa en SEQ ID NO:3. Las variantes como se describen anteriormente y dentro del alcance de esta invención también incluyen mutantes negativos dominantes biológicamente eficaces de estas realizaciones contempladas.

Una variante, como se describe anteriormente, de la molécula de quinasa humana SEQ ID NO:3 de la presente invención puede tener una secuencia de aminoácidos que es diferente en una o más sustituciones de aminoácidos. También se contemplan realizaciones que comprenden supresiones y/o adiciones de aminoácidos. Tal variante puede tener cambios conservativos (similitud de aminoácidos), en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo la sustitución de leucina con isoleucina. Una variante como se describe anteriormente puede tener cambios no conservativos, por ejemplo la sustitución de una glicina con un triptófano. Las realizaciones dentro del alcance pretendido de la invención también incluyen SEQ ID NO:3 que tiene una o más supresiones o inserciones, o ambas, de aminoácidos, en tanto que la variante sea como se describe anteriormente. A la vista de esta descripción, se pueden inferir razonablemente las directrices a la hora de determinar cuáles y cómo muchos restos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar o suprimir sin anular la actividad biológica o farmacológica propuesta, y se
pueden encontrar usando programas de ordenador bien conocidos en la técnica, por ejemplo el programa DNAStar.

Las sustituciones de aminoácidos de SEQ ID NO:3 se pueden realizar, por ejemplo, en base a la similitud de la polaridad, de la carga, de la solubilidad, de la hidrofobia, de la hidrofilia y/o de la naturaleza anfipática de los restos, en tanto que se retenga la actividad biológica y/o farmacológica de la molécula nativa. Sin embargo, las sustituciones de aminoácidos son importantes para construir los mutantes negativos dominantes biológicamente eficaces contemplados, varias de cuyas especies se exponen aquí.

Los aminoácidos cargados negativamente, por ejemplo, incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados, que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Sin embargo, en la construcción de mutantes negativos dominantes biológicamente eficaces, al menos se cambia una posición de un resto de aminoácido en un sitio activo requerido para la actividad biológica y/o farmacológica en el péptido nativo, para producir un agente o entidad que tiene una actividad reducida o que está desprovisto de actividad de tipo salvaje negativa detectable.

Las sustituciones adecuadas de aminoácidos incluyen el uso de un resto químicamente derivatizado, en lugar de un resto no derivatizado. Los isómeros D, así como otros derivados conocidos, también se pueden sustituir por los aminoácidos de origen natural. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. nº 5.652.369, Amino Acid Derivatives, presentada el 29 de julio de 1997. A continuación, en la Tabla 1 se exponen ejemplos de sustituciones:

TABLA 1

Resto original	Ejemplos de sustituciones comparativas
Ala (A)	Gly; Ser; Val; Leu; Ile; Pro
Arg (R)	Lys; His; Gln; Asn
Asn (N)	Gln; His; Lys; Arg
Asp (D)	Glu
Cys (C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
Gly (G)	Ala; Pro
His (H)	Asn; Gln; Arg; Lys
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe
Leu (L)	Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K)	Arg; Gln; His; Asn
Met (M)	Leu; Tyr; Ile; Phe
Phe (F)	Met; Leu; Tyr; Val; Ile; Ala
Pro (P)	Ala; Gly
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala

"Homología" es una medida de la identidad de las secuencias nucleotídicas o de las secuencias de aminoácidos. A fin de caracterizar la homología, las secuencias objeto se alinean de forma que se obtenga la homología (emparejamiento) de mayor orden. "Identidad" per se tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular usando técnicas publicadas. Los métodos de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias, por ejemplo, incluyen el programa DNAStar. (DNAStar. Inc., Madison, WI); el paquete de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387); BLASTP, BLASTN. FAST A (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215:403). La homología (identidad), como se define aquí, se determina convencionalmente usando el programa de ordenador bien conocido BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineación de secuencias, para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 80% homóloga con una secuencia de referencia, según la presente invención, los parámetros se ajustan de forma que el porcentaje de identidad se calcule a lo largo de toda la longitud de la secuencia nucleotídica o de la secuencia de aminoácidos de referencia, y de forma que se permitan saltos en la homología de hasta 20% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Por lo tanto, el ochenta por ciento de homología se determina, por ejemplo, usando el programa BESTFIT con parámetros ajustados de manera que el porcentaje de identidad se calcule a lo largo de toda la longitud de la secuencia de referencia, por ejemplo, SEQ ID NO:3, y se permitan saltos de hasta 20% del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia, y en el que hasta el 20% de los restos de aminoácidos en la secuencia de referencia pueden estar suprimidos o sustituidos con otro aminoácido, o se puede insertar en la secuencia de referencia un número de aminoácidos hasta el 20% de los restos de aminoácidos totales en la secuencia de referencia. Igualmente se determinan los porcentajes de homologías, por ejemplo, para identificar las especies preferidas, dentro del alcance de las reivindicaciones anejas aquí, que están en el intervalo de 80 por ciento hasta el 100 por cien de homología con la SEQ ID NO:3, así como derivados funcionales biológica y/o farmacológicamente activos como se describen anteriormente y mutantes negativos dominantes biológicamente eficaces contemplados aquí.

El porcentaje de similitud (sustituciones conservativas) entre dos polipéptidos también se puede evaluar comparando las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos usando programas bien conocidos en la técnica, incluyendo el programa BESTFIT, empleando ajustes por defecto para determinar la similitud.

La presente invención se refiere, en parte, a la inclusión del polinucleótido que codifica la molécula de tirosina quinasa en un vector de expresión que se puede usar para transformar células u organismos hospedantes. Tales hospedantes transgénicos son útiles para la producción de la proteína quinasa así como sus variaciones valiosas contempladas aquí.

La secuencia de ácidos nucleicos también proporciona el diseño de moléculas antisentido, cuyas realizaciones ejemplares se proporcionan aquí, que son útiles para regular a la baja, disminuir o eliminar la expresión, por ejemplo, transcripción y/o traducción de SEQ ID NO:2 en células.

La molécula del receptor tirosina quinasa de la presente invención se usa en ensayos de cribado para identificar antagonistas o inhibidores que se unen a la quinasa, emulan su sustrato, o inactivan de otro modo la biomolécula o compiten biológicamente, por ejemplo, interacción competitiva o inhibición de unión competitiva, con la biomolécula de SEQ ID NO:3 nativa. La tirosina quinasa también se puede usar en ensayos de cribado para identificar agonistas que agonizan o imitan la actividad biológica y/o farmacológica, inducen la producción de o prolongan la semivida biológica de la molécula in vivo o in vitro.

La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden moléculas como se representan en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o variantes como se describen anteriormente, de estas moléculas como se definen aquí para el tratamiento de trastornos patológicos relacionados o mediados con la tirosina quinasa de la presente
invención.

Realizaciones ejemplares y mutantes negativos dominantes

Se prefiere un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia como se representa en SEQ ID NO:3 o una variante SEQ ID NO:3, incluyendo, pero sin limitarse a, SEQ ID NO:3 en la que la posición 147 (lisina) de SEQ ID NO:3 está sustituida o eliminada, posiciones 1-25 de SEQ ID NO:3 (dominio extracelular para la interacción con otras moléculas, incluyendo ligandos o agonistas/antagonistas), posiciones 1-122 de SEQ ID NO:3 (dominio no quinasa que se puede usar como una forma negativa dominante), posiciones 26-422 de SEQ ID NO:3 (dominio funcional intracelular que también se puede usar para obtener quimeras con otras proteínas extracelulares conocidas), y posiciones 123-422 de SEQ ID NO:3 (dominio de tirosina quinasa que se puede usar para identificar sistemáticamente compuestos (así como en protocolos de ensayos)).

La región codificante, SEQ ID NO:2, de la tirosina quinasa (SEQ ID NO:3), se puede obtener a partir de ADNc existente, por ejemplo, mediante amplificación con PCR usando cebadores derivados de SEQ ID NO:1. Véase, por ejemplo, el Ejemplo I. Por ejemplo, la SEQ ID NO:2 (así como sus variaciones) se puede insertar en vectores de expresión, con o sin "marcas" de proteínas de fusión, para la expresión de una proteína, por ejemplo SEQ ID NO:3, que se puede purificar y cribar en busca de la actividad biológica y/o farmacológica, incluyendo la actividad de transducción de señales, y la activación del sustrato. Se puede usar vectores de expresión procariotas, incluyendo similares, por ejemplo a pGEX (fusión de GST), pET (marca +/- His_{6} o T7), así como vectores de expresión eucariotas, incluyendo los similares a, por ejemplo pcDNA3.1His, pIRES-E:GFP, pcDNA3, y pEBVHis. Se proporcionan proteínas recombinantes, derivadas de SEQ ID NO:3, para uso en ensayos de identificación sistemática para la identificación de compuestos que puede modular la actividad biológica y/o farmacéutica de tirosina quinasas.

En una realización se expone un ejemplo de mutante negativo dominante de SEQ ID NO:3 (lisina en la posición 147 cambiada con arginina), que se predice que es catalíticamente inactivo.

Moléculas antisentido

En otra realización de la invención, se pueden usar diversas secuencias de ácido nucleicos complementarias a SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:2 proporcionadas aquí, para modular la expresión de una tirosina quinasa o la función biológica de una molécula de transducción de señales en dirección 3' o de un activador transcripcional, incluyendo, pero sin limitarse a, Cdc2 quinasa afectando a la transcripción y/o traducción de secuencias correspondientes a la nueva tirosina quinasa (SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:2) en células. La actividad farmacológica del gen endógeno se puede modular afectando a la transcripción y/o traducción, por ejemplo, del gen endógeno mediante uso o administración de constructor antisentido para producir transcritos antisentido, o mediante el suministro directo de oligómeros antisentido. Los constructos y oligómeros antisentido se pueden usar cada uno como realizaciones de la presente invención, y cada uno está relacionado con realizaciones del método terapéutico puesto en práctica vía la administración directa como se define aquí. La traducción se inhibe de forma más eficaz bloqueando el ARNm en un sitio en o próximo al codón de iniciación o de terminación. De este modo, se prefieren oligonucleótidos complementarios a la región 5' o 3' Terminal del transcrito de ARNm del receptor tirosina quinasa. Se proporcionan ejemplos de especies.

Realizaciones preferidas de la invención son moléculas antisentido que comprenden oligómeros en el intervalo de 12 a 25 nucleótidos, que son complementarios a las regiones de SEQ ID NO:1 y/o a la región 5' de pSEQ ID NO:2 que están próximas a, o incluyen, el codón de partida o de terminación de traducción, o una porción del mismo. Realizaciones particularmente preferidas son moléculas antisentido que comprenden oligómeros de 12 a 25 nucleótidos de longitud, que son complementarios a una región dentro de las posiciones 67-148 ó 1333-1414 de SEQ ID NO:1. Son realizaciones ejemplares de la invención los oligonucleótidos que comprenden secuencias complementarias a las siguientes posiciones de SEQ ID NO:1:

: Posiciones 67-79; 70-82; 73-85.75-92; 76-88; 79-91; 80-92; 81-93; 82-94; 83-95; 84-96; 85-97; 86-98; 87-99; 88-100; 89-101; 90-102; 91-103; 92-104; 93-105; 94-106; 95-107; 96-108; 97-109; 98-110; 99-111; 100-112; 101-113; 102-114; 103-115; 104-116; 105-117; 106-118; 107-119; 108-120; 109-121; 110-122; 111-123; 112-124; 113-125; 114-126; 115-127, 116-128; 117-129; 118-130; 119-131; 120-132: 103-115; 104-116; 105-117; 106-118; 107-119; 108-120; 109-121; 110-122; 111-123; 112-124; 113-125; 114-126; 115-127; 116-128; 117-129; 118-130; 119-131; 120-132; 121-133; 122-134; 123-135; 124-136; 125-137; 126-138; 127-139; 128-140; y 136-148 de SEQ ID NO:1.

: Posiciones 1333-1345; 1336-1348; 1339-1351; 1342-1354; 1345-1357; 1346-1358; 1347-1359; 1348-1360; 1348-1365; 1349-1361; 1350-1362; 1351-1363; 1352-1364; 1353-1365; 1354-1366; 1355-1367; 1356-1368; 1357-1369; 1358-1370; 1359-1371; 1360-1372; 1361-1373; 1362-1374; 1363-1375; 1364-1376; 1365-1377; 1366-1378; 1367-1379; 1368-1380; 1369-1381; 1370-1382; 1371-1383; 1372-1384; 1373-1385; 1374-1386; 1375-1387; 1376-1388; 1377-1389; 1378-1390; 1379-1391; 1380-1392; 1381-1393; 1382-1394; 1383-1395; 1384-1396; 1385-1397; 1386-1398; 1387-1399; 1388-1400; 1389-1401; 1390-1402; 1391-1403; 1392-1404; 1393-1405; y 1394-1406 de SEQ ID NO:1.

Se contemplan para uso terapéutico los oligonucleótidos que comprenden secuencias complementarias y que se hibridan a cada una de las áreas recitadas del ARNm del receptor tirosina quinasa humano. Además, se incorpora aquí como referencia la Patente U.S. nº 5.639.595, Identification of Novel Drugs and Reagents, presentada el 17 de junio de 1997, en la que se describen a conciencia métodos para identificar secuencias oligonucleotídicas que muestran actividad in vivo.

Las secuencias nucleotídicas que son complementarias a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica tirosina quinasa se pueden sintetizar para terapia antisentido. Esta moléculas antisentido pueden ser ADN, derivados estables de ADN tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, ARN, derivados estables de ARN tales como 2'-O-alquilARN, u otros miméticos oligonucleotídicos. Se incorporan como referencia la Patente U.S. nº 5.652.355, Hybrid Oligonucleotide Phosphorothioates, presentada el 29 de julio de 1997, y la Patente U.S. nº 5.652.356, Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotides, presentada el 29 de julio de 1997, que describen la síntesis y el efecto de moléculas antisentido fisiológicamente estables. Las moléculas antisentido de tirosina quinasa se pueden introducir en las células mediante microinyección, encapsulamiento liposómico, o mediante expresión a partir de vectores que contienen la secuencia antisentido. La terapia antisentido puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en las que es beneficioso modular la actividad biológica y/o farmacológica eficaz de la tirosina quinasa presentada aquí.

Terapia génica

Las realizaciones de ácidos nucleicos de tirosina quinasa o sus versiones mutantes negativas dominantes, así como también las realizaciones antisentido descritas aquí, se puede administrar a un sujeto, vía terapia génica, par modular, es decir impulsar o atenuar, la actividad biológica y/o farmacológica correspondiente o la expresión génica de una tirosina quinasa endógena. Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden suministrar ex vivo o in vivo a las células de órganos diana, de manera específica para tejidos. La región codificante del polipéptido de tirosina quinasa humano se puede ligar a varios vectores víricos que median la transferencia del ADN del polipéptido quinasa mediante infección de células hospedantes receptoras. Los vectores víricos adecuados incluyen retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus de la vacuna, virus de la poliomielitis, y similares. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. nº 5.624.820, Episomal Expression Vector for Human Gene Therapy, presentada el 29 de abril de 1997. Por ejemplo, GENOVO Corporation, Sharon Hill, PA, en la fecha de esta solicitud, tiene una cartera de vectores de expresión comercial y fácilmente disponibles que comprende una variedad de vectores que se completa con métodos bien establecidos que demuestran consistentemente la expresión específica de tejidos. La GENOVO Corporation es un ejemplo de fuente de vectores y métodos para la práctica de métodos de terapia génica de la presente invención. Las regiones codificantes de ácidos nucleicos de la presente invención se incorporan en vectores de expresión eficaces, los cuales se administran o introducen directamente en células somáticas para la terapia génica (también se puede administrar directamente o introducir en células somáticas un fragmento de ADN que comprende una región codificante, preferiblemente transcritos de ARNm). Véase, por ejemplo, la Patente nº 5.589.466, presentada el 31 de diciembre de 1996. Tales ácidos nucleicos y vectores pueden seguir siendo episómicos, o se pueden incorporar en el ADN cromosómico del hospedante como un provirus o porción del mismo que incluye la fusión génica y señales apropiadas de transcripción y traducción eucariotas, es decir, un promotor de ARN polimerasa situado eficazmente en 5' con respecto al sitio de partida transcripcional, y un codón ATG de iniciación de la traducción de la fusión génica, así como un codón o codones de terminación y señales de poliadenilación del transcrito situados en 3' con respecto a la región codificante. Como alternativa, el ADN del polipéptido de tirosina quinasa humano se puede transferir a células, para terapia génica, mediante técnicas no víricas que incluyen transferencia, mediada por el receptor, de ADN seleccionado como diana, usando conjugados de ligando y ADN o conjugados de adenovirus con ligando y ADN, fusión de la membrana mediante lipofección, o microinyección directa. Estos procedimientos y sus variaciones son adecuados para la terapia génica ex vivo así como in vivo con el polipéptido de tirosina quinasa humano, según métodos ya consolidados en esta técnica.

Vectores generalmente aceptables

Según la presente invención, las secuencias polinucleotídicas que codifican la tirosina quinasa, fragmentos del polipéptido, proteínas de fusión o equivalentes funcionales de los mismos, se pueden usar en moléculas de ADN recombinante que dirigen la expresión de la molécula respectiva en células hospedantes apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden usar otras secuencias de ADN, que codifican sustancialmente la misma secuencia o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente, para clonar y expresar la tirosina quinasa, así como sus variaciones y sus mutantes negativos dominantes. Como entenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso producir secuencias nucleotídicas que posean codones de origen no natural.

El ADNc de tirosina quinasa clonado, obtenido a través de los métodos descritos aquí, se puede expresar recombinantemente mediante clonación molecular en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción apropiados, y se puede transferir a células hospedantes procariotas o eucariotas para producir el receptor quinasa. En Sambrook, J., et al., Molecular Cloning Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1990), se describen completamente técnicas para tales manipulaciones y son bien conocidas en la técnica.

Los vectores de expresión se describen aquí como secuencias de ácidos nucleicos para transcripción de realizaciones de la presente invención. Tales vectores se pueden usar para expresar secuencias de ácidos nucleicos en una variedad de hospedante tales como bacterias, algas verdes azuladas, células vegetales, células de insectos, células fúngicas, células humanas y células animales. Los vectores diseñados específicamente permiten el traslado de ADN entre hospedantes, tales como bacterias y levaduras, o células de bacterias y animales, o células de bacterias y fúngicas, o células de bacterias y de invertebrados.

Se puede usar una variedad de vectores de expresión mamíferos para expresar la molécula de tirosina quinasa humana recombinante, así como variantes contempladas aquí. Los vectores de expresión de mamíferos comercialmente disponibles, que son adecuados para la expresión recombinante, incluyen pero no se limitan a pcDNA3 (Invitrogen), pMC1 neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), y IZD35 (ATCC 37565), pLXIN y pSIR (CLONTECH), pIRES-EGFP (CLONTECH). INVITROGEN Corporation proporciona una amplia variedad de vectores/sistemas de expresión de mamíferos comercialmente disponibles, que se pueden usar eficazmente con la presente invención, INVITROGEN, Carlsbad, CA. Véanse, también, los productos, vectores y sistemas de PHARMINGEN, San Diego, CA.

También se pueden usar con la presente invención sistemas de expresión baculovíricos, para producir grandes cantidades de quinasa biológicamente activa. Se prefieren vectores y protocolos tales como el sistema de expresión baculovírico BacPak^{TM} de CLONTECH, los cuales están comercialmente disponibles. CLONTECH, Palo Alto, CA. Miller, L.K., et al., Curr. Op. Genet. Dev. 3:97 (1993); O'Reilly, D.R., et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, 127. También se prefieren vectores tales como el sistema de expresión baculovírico MaxBac^{TM}, células de insectos y protocolos de INVITROGEN, que están comercialmente disponibles. INVITROGEN, Carlsbad, CA.

Ejemplos de células hospedantes

Las células hospedantes, transformadas con una secuencia nucleotídica que codifica la molécula de transducción de señales de la presente invención, se pueden cultivar en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína recodificada, a partir del cultivo celular. Son realizaciones particularmente preferidas de la presente invención las células hospedantes transformadas con un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácido nucleico para codificar el polipéptido que tiene la secuencia como se representa en SEQ ID NO:3 o una variante contemplada de la misma. Se pueden usar células de este tipo, o preparaciones obtenidas de ellas, para identificar sistemáticamente moduladores de la actividad biológica y/o farmacológica de las moléculas nativas de transducción de señales de tirosina quinasa SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, y SEQ ID NO:3.

Se prefieren especialmente las células hospedantes recombinantes eucariotas. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, levadura, células de mamíferos que incluyen pero no se limitan a estirpes celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono y de roedor, y células de insecto que incluyen pero no se limitan a estirpes celulares derivadas del gusano de la seda y Drosophila. Las estirpes celulares derivadas de especies mamíferas, que pueden ser adecuadas y que están comercialmente disponibles, incluyen pero no se limitan a células L L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CCL 171).

Los vectores de expresión se pueden introducir en células hospedantes que expresan la nueva tirosina quinasa vía cualquier número de técnicas, incluyendo pero sin limitarse a la transformación, la transfección, la lipofección, la fusión de protoplasto, y la electroporación. Los kits comercialmente disponibles aplicables para uso con la presente invención para la expresión heteróloga, que incluyen vectores bien caracterizados, reactivos de transfección y condiciones, y los materiales de cultivo celular están bien consolidados y son fácilmente disponibles. CLONTECH, Palo Alto, CA; INVITROGEN, Carlsbad, CA; PHARMINGEN, San Diego, CA; STRATAGEN E, LaJolla, CA. Las células que contiene el vector de expresión se propagan mediante clonación y se analizan individualmente para determinar el nivel de producción de polipéptido de tirosina quinasa. La identificación de los clones de la célula hospedante que expresan la nueva quinasa se puede realizar a través de varios medios, incluyendo, pero sin limitarse a, la reactividad inmunológica con anticuerpos descrita aquí, y/o la presencia de actividad biológica específica asociada a la célula hospedante, y/o la capacidad de reticular covalentemente el sustrato específico al receptor tirosina quinasa con el reactivo de reticulación bifuncional suberato de disuccinimidilo o reactivos de reticulación similares.

La molécula de transducción de señales de la presente invención también se puede expresar como una proteína recombinante con uno o más dominios polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metales, tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados (Porath, J., Protein Exp. Purif. 3:263 (1992)), dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle WA). Para facilitar la purificación, es útil incluir secuencias ligadoras escindibles, tales como el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y la región codificante.

Se prefieren sistemas y protocolos, tales como el kit de purificación de proteínas no desnaturalizante TALON^{TM} de CLONTECH para purificar proteínas marcadas con 6xHis en condiciones nativas, que están comercialmente disponibles. CLONTECH, Palo Alto, CA.

Además, se puede escoger una cepa de célula hospedante por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas, o para procesar de manera deseada la proteína expresada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lapidación y acilación. El procesamiento después de la traducción, que rompe una forma naciente de la proteína, también puede ser importante para la correcta inserción, plegamiento y/o función. Diferentes células hospedantes tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3, HEK293, etc., tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales, y se pueden escoger para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña introducida.

Para la producción a largo plazo, con alto rendimiento, de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las estirpes celulares que expresan establemente SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:3, por ejemplo, se pueden transformar usando vectores de expresión que contiene orígenes víricos de replicación o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Tras la introducción del vector, se puede dejar que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite hacer crecer y recuperar células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Mediante el uso de técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo celular, se pueden hacer que proliferen racimos resistentes de células establemente transformadas.

La molécula de transducción de señales, por ejemplo SEQ ID NO:3, se puede producir en la levadura S. cerevisiae tras la inserción del cistrón de ADNc óptimo en vectores de expresión diseñados para dirigir la expresión intracelular o extracelular de la proteína heteróloga. En el caso de la expresión intracelular, los vectores tales como EmBLyex4 o similar se ligan al cistrón de la subunidad beta. Véase, por ejemplo, Rinas, U., et al., Biotechnology, 8:543 (1990); Horowitz, B., et al., J. Biol. Chem., 265:4189 (1989). Para la expresión extracelular, el cistrón de quinasa se liga en vectores de expresión de levadura que emplean cualquiera de una serie de señales de secreción bien caracterizadas. Los niveles de la nueva quinasa expresada se determinan mediante los ensayos descritos aquí.

En la técnica se conoce una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de la nueva molécula, así como derivados funcionales como se describen anteriormente, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la proteína. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se puede emplear un inmunoensayo a base de anticuerpo monoclonal, de dos sitios, que utiliza anticuerpos monoclonales que reaccionan con dos epítopos que no interfieren. También se pueden emplear técnicas de unión competitiva bien conocidas. Véase, por ejemplo, Hampton, R., et al., (1990), Serological Methods - a Laboratory Manual, APS Press, St Paul Minn.; Maddox, D.E., et al., J. Exp. Med., 158:1211.

Ensayos de identificación sistemática

Se proporcionan métodos para identificar compuestos individualmente o mediante el empleo de librerías de compuestos para la identificación de compuestos que tienen la capacidad de modular una actividad biológica y/o farmacéutica de un receptor tirosina quinasa, por ejemplo, SEQ ID NO:3 descrita aquí. La presente invención también se refiere a métodos para identificar sistemáticamente compuestos que modulan la expresión (transcripción y/o traducción) de ADN o ARN, que codifican el polipéptido de tirosina quinasa SEQ ID NO:3. Los compuestos que modulan estas actividades pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas, o moléculas orgánicas no proteinosas (por ejemplo, compuestos farmacéuticos de pequeña molécula).

Los compuestos pueden modular una actividad biológica y/o farmacológica última incrementando o atenuando la expresión de ADN o ARN que codifica la biomolécula humana de transducción de señales, o una función de la SEQ ID NO:3 nativa. Los compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN que codifican el polipéptido de tirosina quinasa, o la función del polipéptido, se pueden detectar mediante una variedad de ensayos. El ensayo puede ser un ensayo de "sí/no" simple, para determinar si hay cambio en la expresión o en la función. El ensayo se puede hacer cuantitativo comparando la expresión o función de una muestra de ensayo con los niveles de expresión o función en una muestra estándar.

El receptor tirosina quinasa humano descrito aquí, SEQ ID NO:3, sus fragmentos funcionales y oligopéptidos que incluyen las posiciones 1-25 de SEQ ID NO:3, las posiciones 1-122 de SEQ ID NO:3, las posiciones 26-422 de SEQ ID NO:3, y las posiciones 123-422 de SEQ ID NO:3, así como variantes contempladas aquí, se pueden usar para identificar sistemáticamente eventuales compuestos terapéuticos en cualquier variedad de técnicas de identificación de fármacos. El fragmento o entidad que se emplea en tal ensayo puede estar libre en disolución, fijo a un soporte, transportado sobre una superficie celular, o localizado intracelularmente. La supresión o modulación de la actividad, o la formación de complejos de unión, entre la quinasa humana de transducción de señales y el agente ensayado, se puede medir, por ejemplo, a través de los medios proporcionados.

Es de esperar que el nuevo receptor tirosina quinasa humano de transducción de señales tenga una elevada actividad catalítica que permitirá la adaptación fácil a ensayos de identificación automatizados de alta producción, incluyendo ensayos de proximidad de centelleo, que son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. nº 5.763.198, Screening Assays for Compounds, presentada el 9 de junio de 1998 (un ejemplo de sistemas de ensayos rápidos, cuantitativos, específicos, de alta producción, para identificar sistemáticamente compuestos de ensayo tales como fármacos, ligandos (naturales o sintéticos), antagonistas de ligando, péptidos, o pequeñas moléculas orgánicas para determinar su capacidad para modular la actividad de tirosina quinasa en la célula o en un sistema libre de células); Patente U.S. nº 5.763.584, Receptor Activation with Hepatocyte Growth Factor Agonists, presentada el 9 de junio de 1998 (un ejemplo de método para activar receptores seleccionados de receptores tirosina quinasas, y para obtener variantes de ligandos que actúan como agonistas competitivos de los ligandos nativos respectivos); y Patente U.S. nº 5.763.441, Coumpounds for the Treatment of Disorders Related to Vasculogenesis and/or Angiogenesis, presentada el 9 de junio de 1998, que se incorporan aquí como referencias como ejemplos. Además, la tecnología del ensayo de proximidad de centelleo (SPA) se expone como una realización que permite el ensayo rápido y sensible de una amplia variedad de interacciones moleculares en un sistema homogéneo (AMERSHAM, Bucks, UK).

En consecuencia, la presente invención proporciona un método para identificar sistemáticamente una pluralidad de compuestos en busca de la actividad de unión específica con el polipéptido SEQ ID NO:3 nativo o una variante contemplados aquí, que comprende proporcionar una pluralidad de compuestos; combinar una realización de la tirosina quinasa de la presente invención con cada uno de una pluralidad de compuestos durante un tiempo suficiente para permitir la unión en condiciones adecuadas; y detectar la unión del polipéptido de quinasa, o su fragmento, a cada una de la pluralidad de compuestos, identificando de este modo los compuestos que se unen específicamente al polipéptido de quinasa de transducción de señales.

Generalmente se prefieren métodos para identificar compuestos que modulan una actividad biológica y/o farmacológica de una molécula de transducción de señales, que comprenden combinar un compuesto candidato, modulador de la actividad de transducción de señales (biológica y/o farmacológica), con un polipéptido que tiene la secuencia según se representa en SEQ ID NO:3 o una variante de la misma contemplada aquí, y medir el efecto del compuesto candidato modulador sobre la actividad biológica y/o farmacológica del polipéptido. La actividad de quinasa de la biomolécula se puede evaluar y/o se puede medir el comportamiento de una cualquiera o más de las funciones, incluyendo pero sin limitarse a la capacidad para autofosforilarse, para fosforilar un sustrato, para unirse a ATP, y para mediar la activación de Cdc2 quinasa. La actividad farmacológica de la biomolécula se puede evaluar comparando, con células de control, por ejemplo, la manifestación y la velocidad de mitosis, la diferenciación celular, la proliferación, la transformación oncogénica, la neoplasia, la agregación celular y la citocinesis.

Los ensayos para determinar la actividad de quinasa del nuevo receptor tirosina quinasa se realizan vía ensayos de ser/thr quinasa bien conocidos, excepto que MBP se sustituye con enolasa. Cooper, et al., J. Biol. Chem., 259:7835 (1984). Los sitios de fosforilación en enolasa son utilizados por tirosina proteína quinasas in vivo e in vitro. Véanse los Ejemplos V y VI.

La capacidad del receptor tirosina quinasa para fosforilar un sustrato y/o unirse a un ligando cognato se puede medir por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. nº 5.763.584, Receptor Activation with Hepatocyte Growth Factor Agonists, presentada el 9 de junio de 1998 (un ejemplo de método para activar receptores seleccionados de receptores tirosina quinasas, y para obtener variantes de ligandos que actúan como agonistas competitivos de los ligandos nativos respectivos); la Patente U.S. nº 5.763.198, Screening Assays for Compounds, presentada el 9 de junio de 1998 (un ejemplo de sistemas de ensayos rápidos, cuantitativos, específicos, de alta producción, para identificar sistemáticamente compuestos de ensayo tales como fármacos, ligandos (naturales o sintéticos), antagonistas de ligando, péptidos, o pequeñas moléculas orgánicas para determinar su capacidad para modular la actividad de tirosina quinasa en la célula o en un sistema libre de células); y la Patente U.S. nº 5.763.441, Compounds for the Treatment of Disorders Related to Vasculogenesis and/or Angiogenesis, presentada el 9 de junio de 1998, que se incorporan aquí como referencias como ejemplos.

La actividad biológica, como se usa aquí como referencia a la tirosina quinasa de la presente invención, se refiere entre otras a la mediación de la activación de Cdc2 quinasa que media la mitosis. Véase, por ejemplo, Nishio K., et al., Antitumor effects of butyrolactone I, a selective cdc2 kinase inhibitor, on human lung cancer cell lines, Anticancer Research, 16(6B):3387 (1996); Vicent I., et al., Aberrant expression of mitotic cdc2/cyclin BI kinase in degenerating neurons of Alzheimer's disease brain, Journal of Neuroscience, 17 (10):3588 (1997).

En consecuencia, se prefieren particularmente métodos para identificar compuestos que modulan una actividad biológica y/o farmacológica de una tirosina quinasa, que comprenden combinar un compuesto candidato modulador con una células hospedante que expresa un polipéptido que tiene la secuencia como se representa en SEQ ID NO:3 o una variante de la misma contemplada aquí, y medir el efecto del compuesto candidato modulador sobre la actividad biológica y/o farmacológica del polipéptido. Los ensayos celulares preferidos para moduladores de la molécula de tirosina quinasa presente, de transducción de señales, caen en dos categorías generales: 1) medida directa de una actividad biológica, y 2) medida de sucesos en dirección 3' en la cascada de señalización, que incluyen manifestaciones fisiológicas de las células/del tejido/del organismo.

A fin de medir la actividad de la tirosina quinasa, la fuente de la molécula a ensayar puede ser un lisado celular completo, preparado mediante 1 a 3 ciclos de congelación-descongelación en presencia de inhibidores de proteasas estándares. Como alternativa, la quinasa se puede purificar parcial o completamente mediante métodos de purificación de proteínas estándares. La quinasa se puede purificar mediante cromatografía de afinidad usando anticuerpos descritos aquí, o mediante ligandos específicos para el marcador del epítopo, modificado mediante ingeniería, en la quinasa recombinante descrita además aquí. La preparación se puede evaluar entonces en busca de la actividad. Por ejemplo, más abajo se exponen ejemplos de ensayos usados para identificar sistemáticamente compuestos que modulan la actividad de quinasa. Véase, por ejemplo, los Ejemplo V y VI.

En otra realización de método de la invención para identificar agentes que modulan una actividad biológica de la nueva biomolécula expuesta aquí, se puede ligar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de transducción de señales, por ejemplo como se representa en SEQ ID NO:3 a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión para uso en un sistema de dos híbridos de levadura. Para identificar sistemáticamente compuestos para la modulación de la actividad biológica de SEQ ID NO:3, es necesario codificar un péptido quimérico para la expresión en células hospedantes heterólogas. También se usan constructos quiméricos para expresar un "asa", según métodos bien conocidos que usan un sistema de levadura de dos híbridos, usando péptidos nativos accesorios que se espera que se asocien con la molécula de tirosina quinasa descrita aquí. El sistema de dos híbridos usa la capacidad de un par de proteínas que interaccionan para aproximar estrechamente un dominio de activación de la transcripción a un sitio de unión de ADN que regula la expresión de un gen informador adyacente. Los compuestos que son capaces de modular la actividad biológica de la nueva biomolécula como se define aquí se identifican por su capacidad para efectuar interacciones proteína:proteína (reconstitución de los activadores transcripcionales quiméricos), y por tanto por los ensayos de lectura de levadura de dos híbridos bien conocidos por los expertos normales en esta área de la biología molecular. Fields, S., et al., Trends Genet., 10:286 (1994); Allen, J.B., et al., TIBS, 20:511 (1995). Fields, S., Song, O., Nature, 340:245 (1989). Se pueden usar con la presente invención sistemas comercialmente disponibles tales como los sistemas y protocolos Matchmaker^{TM} de CLONTECH. CLONTECH, Palo Alto, CA. Véase también Mendelsohn, A.R., Brent, R., Curr. Op. Biotech., 5:482 (1994); Phizicky, E.M., Fields, S., Microbiological Rev., 59(1):94 (1995); Yang, M., et al., Nucleic Acids Res., 23(7):1152 (1995); Fields, S., Sternglanz, R., TIG, 10(8):286 (1994); y las Patentes U.S. 5.283.173, System to Detect Protein-Protein Interactions, y 5.468.614, que se incorporan aquí como referencia.

Para evaluar adicionalmente la capacidad de un compuesto para modular la actividad farmacológica, por ejemplo de SEQ ID NO:3, se inyectan células tumorales humanas en ratones con SCID (importante inmunodeficiencia combinada) para formar masas tumorales palpables. Véase el Ejemplo VII.

Se prefiere un método para modular una actividad biológica y/o farmacológica de una quinasa de transducción de señales en una célula, tejido u organismo, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polinucleótido contemplado aquí. "Polinucleótido" incluye un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene una homología de al menos 80% con SEQ ID NO:3, con las posiciones 1-122 de SEQ ID NO:3, con las posiciones 26-422 de SEQ ID NO:3, y con las posiciones 123-422 de SEQ ID NO:3; así como un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia como se representa en SEQ ID NO:3, en la que la posición 147 (lisina) de SEQ ID NO:3 está sustituida o suprimida; así como también moléculas antisentido que son complementarias a una región dentro de las posiciones 67-148 o 1333-1414 de SEQ ID NO:1, cuyos ejemplos de realizaciones terapéuticas se exponen más arriba.

Anticuerpos

El receptor tirosina quinasa se puede usar para generar anticuerpos de diagnósticos para detectar niveles anormales de la biomolécula in vivo. Por lo tanto, según aún un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan anticuerpos frente al polipéptido del receptor tirosina quinasa que se pueden usar como parte de diversos ensayos de diagnóstico para detectar trastornos fisiológicos, incluyendo tejido canceroso. Un ejemplo para la producción de anticuerpos policlonales eficaces frente a péptidos derivados de SEQ ID NO:3, para el empleo en métodos descritos aquí, es EADRPSPRELRLRLE (SEQ ID NO:4) que se identificó en la región C-terminal de la nueva tirosina quinasa humana (SEQ ID NO:3) utilizando un método algorítmico bien consolidado desarrollado por Jameson y Wolf, The antigenic Index: A Novel Algorithm for Predicting Antigenic Determinants, CABIOS, 4:181 (1988). Este péptido se conjugo con hemocianina de lapa californiana, y se uso para la generación de anticuerpos mediante GENOSYS BIOTECHNOLOGIES, 1442 Lake Front Circle, Suite 185, The Woodlands, Texas 77380. Los anticuerpos específicos se pueden generar mediante animales vacunados, prefiriéndose los conejos, con una concentración apropiada de tirosina quinasa humana con o sin un adyuvante inmunitario.

Los anticuerpos monoespecíficos para el polipéptido de la presente invención se purifican a partir de antisueros de mamíferos que contienen anticuerpos que reaccionan frente al polipéptido, o se preparan como anticuerpos monoclonales que reaccionan con el polipéptido de transducción de señales usando la técnica de Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). El anticuerpo monoespecífico, como se usa aquí, se define como una única especie de anticuerpo o como múltiples especies de anticuerpos con características de unión homogénea para la nueva molécula de transducción de señales. "Unión homogénea", como se usa aquí, se refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo para unirse a un antígeno o epítopo específico, tal como los asociados con SEQ ID NO:3. Los anticuerpos monoclonales se producen in vivo mediante inyección de ratones Balb/c sensibilizados con pristano, aproximadamente 0,5 ml por ratón, con alrededor de 2 x 10^{6} hasta alrededor de 6 x 10^{6} células de hibridoma alrededor de cuatro días después de la sensibilización. Se recogió el fluido ascítico a aproximadamente 8-12 días después de las transferencias de las células, y los anticuerpos monoclonales se purificaron mediante técnicas conocidas en la técnica. La producción in vitro del mAb anti-polipeptídico se llevó a cabo haciendo crecer el hibridoma en DMEM que contiene alrededor de 2% de suero fetal de ternera, para obtener cantidades suficientes del mAb específico. El mAb se purificó mediante técnicas conocidas en la técnica.

Purificación de SEQ ID NO:3 vía columnas de afinidad

Es fácilmente manifiesto para los expertos en la técnica que los métodos para producir anticuerpos se pueden utilizar para producir anticuerpos específicos para los fragmentos del polipéptido de tirosina quinasa, o para el polipéptido naciente de longitud completa, por ejemplo SEQ ID NO:3. Específicamente, es fácilmente manifiesto para los expertos en la técnica que se pueden generar anticuerpos que son específicos para la proteína completamente funcional y fragmentos y variantes de la misma, como se describen aquí.

Las columnas de afinidad con el anticuerpo del polipéptido de tirosina quinasa se obtienen añadiendo los anticuerpos a Affigel-10 (Biorad), un soporte en gel que se activa con ésteres de N-hidroxisuccinimida, de manera que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de perlas de azarosa. Los anticuerpos se acoplan entonces al gel vía enlaces de amida con el brazo espaciador. Los ésteres activados que quedan se desactivan entonces con etanolamina-HCl 1M (pH 8). La columna se lava con agua, seguido de hidrocloruro de glicina 0,23M (pH 2,6) para eliminar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína extraña. La columna se equilibra entonces en disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) con detergente apropiado, y los sobrenadantes del cultivo celular o los extractos celulares que contiene el polipéptido de tirosina quinasa humana, obtenidos usando detergentes solubilizantes de membranas apropiados, se hacen pasar lentamente a través de la columna. La columna se lava entonces con detergente y disolución tamponada con fosfato, hasta que la densidad óptica cae hasta el valor de fondo, y después la proteína se eluye con hidrocloruro de glicina 0,23M (pH 2,6)/detergente. El polipéptido purificado se dializa entonces frente a disolución salina tamponada con fosfato/detergente.

Las moléculas de tirosina quinasas recombinantes se pueden separar de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad obtenida con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para el polipéptido naciente de transducción de señales, de longitud completa, o fragmentos polipeptídicos.

Los polipéptidos descritos aquí se pueden usar para purificar mediante afinidad efectores biológicos a partir de materiales biológicos nativos, por ejemplo tejido enfermo. Las técnicas de cromatografía de afinidad son bien conocidas por los expertos en la técnica. Un péptido de tirosina quinasa descrito aquí, o un fragmento eficaz del mismo, se fija a una matriz sólida, por ejemplo Sepharose activada con CNBr, según el protocolo del proveedor (Pharmacia, Piscataway, NJ), y se hace pasar a través de la columna una disolución celular homogeneizada/tamponada que contiene una molécula potencial de interés. Después del lavado, la columna retiene sólo el efector biológico, el cual se eluye subsiguientemente, por ejemplo, usando ácido acético 0,5M o un gradiente de NaCl.

Ensayos de diagnóstico

Los títulos de anticuerpos de fluidos ascíticos o de cultivo de hibridoma se determinan mediante diversos ensayos serológicos o inmunológicos que incluyen, pero que no se limitan a, precipitación, aglutinación pasiva, técnica de inmunoensayo absorbente ligado a enzima (ELISA) y técnicas de radioinmunoensayos (RIA). Se usan ensayos de diagnóstico similares para detectar la presencia de un nuevo polipéptido de quinasa de transducción de señales, en fluidos corporales o en extractos celular y de tejidos.

Los ensayos de diagnóstico que usan los anticuerpos específicos del polipéptido humano de transducción de señales son útiles para el diagnóstico de patologías, trastornos o enfermedades caracterizados por la expresión anormal del receptor tirosina quinasa o la expresión de genes asociados con el crecimiento celular anormal. Los ensayos de diagnóstico para la quinasa de esta invención, de transducción de señales, incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar el polipéptido de quinasa humano en fluidos corporales humanos, células, tejidos o secciones o extractos de tales tejidos. Los polipéptidos y los anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y los anticuerpos se marcaran uniéndolos, ya sea covalentemente o no covalentemente, con una molécula informadora, una miríada de las cuales son bien conocidas por los expertos en la técnica.

En la técnica se conoce una variedad de protocolos para medir el polipéptido de quinasa, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos de la proteína respectiva. Los ejemplos incluyen el inmunoensayo absorbente ligado enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se prefiere un inmunoensayo a base de anticuerpos monoclonales, de dos sitios, que utiliza anticuerpos monoclonales que reaccionan con dos epítopos que no interfieren en el polipéptido de quinasa humano de transducción de señales, pero también se puede emplear un ensayo de unión competitiva. Estos ensayos se describen, entre otros sitios, en Maddox, D.E. et al., J. Exp. Med. 158:1211 (1983); Sites, D.P., et al., Basic and Clinical Immunology, Cap. 22, 4ª Ed., Lange Medical Publications, Los Altos, CA (1982); las Patentes U.S. nº 3.654.090, nº 3.850.752; y nº 4.016.043.

A fin de proporcionar una base para el diagnóstico de la enfermedad, se deben establecer valores normales o estándares para los niveles normales de expresión de la tirosina quinasa. Esto se logra combinando fluidos corporales o extractos celulares extraídos de sujetos normales, ya sean un animal o un ser humano, con anticuerpo para el polipéptido de quinasa humana, en condiciones adecuadas para la formación de complejos las cuales son bien conocidas en la técnica. La cantidad de formación de complejos estándar se puede cuantificar comparándola con una serie de diluciones de controles positivos, en los que una cantidad conocida de anticuerpo se combina con concentraciones conocidas de polipéptido de tirosina quinasa purificado. Después, los valores estándares obtenidos de muestras normales se pueden comparar con valores obtenidos de muestras procedentes de sujetos afectados potencialmente por un trastorno o enfermedad relacionada con la expresión de tirosina quinasa humana. La desviación entre los valores estándar y del sujeto establece la presencia del estado mórbido.

Se pueden preparar kits que contienen un ácido nucleico de tirosina quinasa correspondiente, o anticuerpos para un polipéptido correspondiente, o proteína, por ejemplo SEQ ID NO:3. Tales kits se usan para detectar un ácido nucleico heterólogo que se hibrida al ácido nucleico o que se puede amplificar vía PCR, o para detectar la presencia de fragmentos proteínicos o peptídicos en una muestra. Tal caracterización es útil para una variedad de fines, incluyendo, pero sin limitarse a, el diagnóstico de estados patofisiológicos, análisis forenses, y estudios epidemiológicos.

Las moléculas de ADN, las moléculas de ARN, la proteína recombinante y los anticuerpos de la presente invención, se pueden usar para identificar y medir niveles del nuevo ADN, ARN o proteína de la quinasa. Las proteínas recombinantes, las moléculas de ADN, las moléculas de ARN y los anticuerpos permiten ellos mismos la formulación de kits adecuados para la detección y el tipado de la tirosina quinasa de transducción de señales. Tal kit comprende un soporte con compartimientos, adecuado para contener, encerrado, al menos un recipiente. El soporte comprendería además reactivos, tales como la quinasa recombinante o anticuerpos anti-quinasa, adecuados para detectar la nueva molécula como se representa en SEQ ID NO:3. El soporte también puede contener un medio para la detección, tal como un antígeno marcado o sustratos enzimáticos o similares.

Las secuencias polinucleotídicas que codifican la molécula de transducción se pueden usar para el diagnóstico de patologías o enfermedades con las cuales está asociada la expresión de la nueva quinasa humana activada por estrés. Por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas que codifican la molécula de transducción de señales se pueden usar en ensayos de hibridación o de PCR de fluidos o tejidos procedentes de biopsias, para detectar la expresión de la quinasa. La forma de tales métodos cualitativos o cuantitativos puede incluir el análisis Southern o Northern, la transferencia de punto u otras tecnologías a base de membranas; tecnologías de PCR, tecnologías de bastoncillo de inmersión, de alfiler, de chip y ELISA. Todas estas técnicas son bien conocidas en la técnica, y son la base de muchos kits de diagnóstico comercialmente disponible. Tales ensayos también se pueden usar para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular en estudios con animales, en ensayos clínicos, o en la monitorización del tratamiento de un paciente individual. Una vez se confirma la enfermedad, se administra un agente terapéutico, y se genera un perfil de tratamiento. Tales ensayos se pueden repetir con regularidad para evaluar si los valores en el perfil progresan o vuelven al patrón normal o estándar. Se pueden usar perfiles sucesivos de tratamiento para mostrar la eficacia del tratamiento durante un periodo de varios días o de varios meses.

Las secuencias polinucleotídicas que codifican la nueva quinasa también se pueden emplear en análisis para cartografiar localizaciones cromosómicas, por ejemplo para identificar la asociación funcional con marcadores de la enfermedad. Además, se contempla el uso de las secuencias descritas aquí para identificar polimorfismos de secuencias humanos y la asociación posible con la enfermedad, así como análisis para seleccionar la secuencia óptima de entre las secuencias polimórficas posibles para el diseño de compuestos para modular la actividad biológica y/o farmacológica. Además, las secuencias se contemplan como herramientas de identificación sistemáticas para uso en la identificación de sujetos y pacientes humanos apropiados para ensayos clínicos terapéuticos.

Diagnósticos mediante PCR

La secuencia de ácidos nucleicos, los oligonucleótidos, los fragmentos, las porciones o moléculas antisentido de los mismos, se pueden usar en ensayos de diagnósticos de fluidos corporales o de tejidos procedentes de biopsias, para detectar el nivel de expresión de la nueva molécula de quinasa humana de transducción de señales. Por ejemplo, las secuencias diseñadas a partir de la secuencia de ADNc SEQ ID NO:1, o secuencias comprendidas en SEQ ID NO:2, se pueden usar para detectar la presencia de los transcritos de ARNm en un paciente, o para monitorizar la modulación de los transcritos durante el tratamiento. Se dan aquí varios ejemplos de cebadores de PCR derivados de SEQ ID NO:1.

Se prefieren composiciones para diagnóstico o composiciones para análisis farmacogenómico, para la identificación de una secuencia polipeptídica que comprende cebadores de PCR derivados de SEQ ID NO:1 o secuencias alélicas descritas aquí representativas de 11, 12, 13 o 15 repeticiones GT entre las posiciones 2125 y 2152 de SEQ ID NO:1.

Un método para la amplificación de ácidos nucleicos diana, o para el análisis posterior mediante ensayos de hibridación, es conocido como la técnica de reacción en cadena de polimerasa ("PCR") o PCR. La técnica de PCR se puede aplicar para detectar secuencias de la invención en muestras sospechosas usando cebadores oligonucleotídicos separados entre si y basados en la secuencia genética, por ejemplo SEQ ID NO:1, expuesta aquí. Los cebadores son complementarios a hebras opuestas de una molécula de ADN bicatenario, y están típicamente separados alrededor de 50 hasta 450 nucleótidos o más (habitualmente no más de 2000 nucleótidos). Este método supone preparar los cebadores oligonucleotídicos específicos, seguido de ciclos repetidos de desnaturalización del ADN diana, de la unión al cebador, y de la extensión con un ADN polimerasa para obtener fragmentos de ADN de la longitud esperada, basándose en el espaciamiento del cebador. Un ejemplo de realización de la presente invención es una composición de diagnóstico para la identificación de una secuencia polnucleotídica que comprende la secuencia como se representa en SEQ ID NO:2, que comprende cebadores de PCR derivados de SEQ ID NO:1. El grado de amplificación de una secuencia diana está controlado por el número de ciclos que se realizan, y se calcula teóricamente mediante la sencilla fórmula 2n, en la que n es el número de ciclos. Véase, por ejemplo, Perkin Elmer, PCR Bibliography, Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey; CLONTECH products, Palo Alto, CA; U.S. Patente nº 5.629.158, Solid Phase Diagnosis of Medical Conditions, presentada el 13 de mayo de 1997.

Composiciones

Las composiciones terapéuticas farmacéuticamente útiles, que comprenden una región codificante de ácidos nucleicos, una región codificante de un mutante negativo dominante, una molécula antisentido descrita aquí, un polipéptido como se representa en SEQ ID NO:3, o una variación del mismo contemplada aquí, se pueden formular según métodos bien conocidos, tales como mediante la mezcla de un vehículo farmacéuticamente aceptable, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co, Easton, PA). Se pueden encontrar ejemplos de tales vehículos y métodos de formulación. Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para la administración eficaz, tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína, ADN o ARN.

Las composiciones terapéuticas o de diagnóstico de la invención se administran a un individuo o se usan en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar trastornos relacionados con o mediados por el receptor tirosina quinasa descrito aquí. La cantidad eficaz puede variar según una variedad de factores tales como el estado del individuo, el peso, el sexo y la edad. Otros factores incluyen el modo de administración.

La expresión "derivado funcional" incluye una molécula que contiene restos químicos adicionales que normalmente no son una parte de la molécula base. Tales restos pueden mejorar la solubilidad, la semivida, la absorción, etc., de la molécula base. Como alternativa, los restos pueden atenuar efectos secundarios indeseables de la molécula base, o pueden disminuir la toxicidad de la molécula base. Los ejemplos de tales restos se describen en una variedad de textos, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el fin que se pretende. La determinación de una dosis eficaz está perfectamente dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica. La dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivo celular, por ejemplo de células neoplásicas, o en modelos de animales, habitualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo de animal también se usa para lograr un intervalo de concentración deseable y una vía de administración. Tal información se puede usar entonces para determinar las dosis útiles y las vías de administración en seres humanos. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad de compuesto, proteína, péptido, ácido nucleico, anticuerpos, antagonistas o inhibidores, que mejora los síntomas o el estado. La dosis exacta se escoge por el médico individual a la vista del paciente a tratar.

Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar al individuo mediante una variedad de vías tales como la subcutánea, tópica, oral e intramuscular. La administración de composiciones farmacéuticas se logra oral o parenteralmente. Los métodos para el suministro parenteral incluyen la administración tópica, intraarterial (directamente al tejido), intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o intranasal. La presente invención también tiene como objeto proporcionar formulaciones farmacéuticas tópicas, orales, sistémicas y parenterales adecuadas, para uso en los nuevos tratamientos médicos de la presente invención. Las composiciones que contienen los compuestos identificados según esta invención como el ingrediente activo para uso en la modulación de una molécula de transducción de señales se pueden administrar en una amplia variedad de formas de dosificación terapéuticas en vehículos convencionales para administración. Por ejemplo, los compuestos se pueden administrar en formas de dosificación oral tales como comprimidos, cápsulas (incluyendo cada una formulaciones de liberación en el tiempo y de liberación sostenida), pastillas, polvos, gránulos, elixires, tinturas, disoluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o mediante inyección. Del mismo modo, también se pueden administrar en forma intravenosa (tanto en bolo como en infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión, o intramuscular, usando todas ellas formas bien conocidas para los expertos normales en las técnicas farmacéuticas. Como agente modulador de tirosina quinasa de transducción de señales, se puede emplear una cantidad eficaz pero no tóxica del compuesto deseado.

La dosis diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo desde 0,01 hasta 1.000 mg por humano adulto/por día. Para la administración oral, las composiciones se proporcionan preferiblemente en forma de comprimidos rasurados o no rasurados, que contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0 y 50,0 miligramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosis para el paciente a tratar. Normalmente se suministra una cantidad eficaz del fármaco a una dosis desde alrededor de 0,0001 mg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg de peso corporal por día. El intervalo es más particularmente desde alrededor de 0,001 mg/kg hasta 10 mg/kg de peso corporal por día. Incluso más particularmente, el intervalo varía desde alrededor de 0,05 hasta alrededor de 1 mg/kg. Por supuesto, el nivel de dosificación variará dependiendo de la potencia del compuesto particular. Ciertos compuestos serán más potentes que otros. Además, la cantidad de dosis variará dependiendo de la biodisponibilidad del compuesto. Cuanto más biodisponile y potente sea el compuesto, menos cantidad de compuesto será necesaria administrar a través de cualquier vía de suministro, incluyendo pero sin limitarse al suministro oral. Las dosis de los moduladores de quinasa humana de transducción de señales se ajustan cuando se combinan para lograr los efectos deseados. Por otro lado, las dosis de estos diversos agentes se pueden optimizar independientemente y se pueden combinar para lograr un resultado sinérgico en el que se reduzca la patología de una manera mayor que si se usase cualquiera de los agentes solo. Los expertos en la técnica emplearán formulaciones para nucleótidos diferentes de aquellas para proteínas o sus inhibidores. De forma similar, el suministro de polinucleótidos o polipéptidos será específico para células y condiciones particulares.

Ejemplo

Ejemplo I Producción y purificación de proteína de fusión de GST que contiene el nuevo polipéptido humano de tirosina quinasa de transducción de señales

El ADNc (SEQ ID NO:1) que codifica la nueva tirosina quinasa humana de transducción de señales (SEQ ID NO:3) se puede producir usando los cebadores:

1

El producto de PCR se clona en los sitios de las enzimas de restricción SalI y NotI, en el vector pGEX-5X-3 (PHARMACIA BIOTECH, Piscataway, NJ).

Se inocula una única colonia de DH5alfa (LIFE TECHNOLOGIES, Gaithersburg, MD), que expresa GST fusionada a la nueva tirosina quinasa con y sin la región transmembránica, en 10 ml de LB/amp (100 \mug/ml) para el cultivo durante toda una noche con una rotación de 275 rpm a 37ºC. Al siguiente día, el cultivo de toda la noche (O/N) se diluye hasta 100 ml en LB/amp y se hace crecer durante una hora. Se añade IPTG hasta 0,5 mM, y se hace crecer durante 3 horas adicionales. El resto de las etapa se realizaron a 4ºC. Las bacterias se cosechan haciendo girar a 5000 RPM durante 5 minutos, y se resuspendieron en 15 ml de tampón de lisis que contiene 50 mM de Tris (pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,5% de Tritón X-100, 1 mM de PMSF y cóctel inhibidor de proteasa completo. Las células se lisaron al someterlas a ultrasonido en hielo. Las células lisadas se centrifugaron, y se recogió el sobrenadante que contiene proteínas de fusión. La proteína de fusión a GST se purificó usando 150 \mul de perlas empaquetadas de perlas Glutationa-Sefarosa 4B. Las perlas se incubaron con lisado celular durante una hora, y se lavaron 5x con 50 mM de Tris (pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tritón X-100, 1 mM de PMSF y cóctel inhibidor de proteasa completo. Las perlas lavadas se mantuvieron a 4ºC como una suspensión al 2% en el mismo tampón, con 0,02% de azida.

Ejemplo II Demostración de un número variable de repeticiones GT en el gen de tirosina quinasa

Para determinar la frecuencia alélica de la tirosina quinasa en humanos, se usaron las posiciones 2062-2083 de la SEQ ID NO:1 (cebador directo) y las posiciones 2239-2250 de SEQ ID NO:1 (cebador inverso) en una amplificación mediante PCR de este fragmento de ADN genómico a partir de 27 caucásicos no emparentados. El oligo inverso se modificó para incluir la secuencia de M13F (Vieira, J. y Messing, J., Methods in Enzymol., 153:3 (1987)) en su extremo 5'. Los productos de la PCR se secuenciaron mediante secuenciación con cebador de tinción (Martin, et al., Bio/Technology, 3:911 (1985) usando un cebador M13F.

Se contó el número de repeticiones de CA/GT entre las posiciones 2125 y 2152 correspondientes a SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:1 como se lista aquí demuestra un total de 14 secuencias con repeticiones GT entre las posiciones 2125 y 2152. La secuenciación del ADN de los fragmentos de la PCR mostró 11,12,13,14 y 15 copias de la repetición de GT en el ADN genómico del nuevo gen de tirosina quinasa procedente de 27 caucásicos, con las siguientes frecuencias:

Alelo	Frecuencia
11	6/54
12	2/54
13	17/54
14	16/54
15	13/54

No se observaron homocigotos para ningún alelo. Cada uno de los alelos está destinado a encontrarse en el alcance de las reivindicaciones anejas (SEQ ID NO:1).

Ejemplo III Oligonucleótidos antisentido derivados de SEQ ID NO:1 que inhiben la proliferación de células A549

Se añadieron oligonucleótidos a células A549 a una concentración de 2 \mum usando las siguientes condiciones experimentales. Las células A549 se sembraron a una concentración de 3000 células por pocillo, en una placa de cultivo de 96 pocillos. Las células se incubaron toda la noche antes de la transfección. El medio se aspiró, y las células se lavaron una vez con 150 \mul Opti-MEM. Posteriormente, se usaron 70 \mul de Opti-MEM que contiene 30 \mul de Lipofectina/ml de Opti-MEM por 2 \muM de oligo. Las células se incubaron con el oligómero seleccionado, durante 3-6 horas a 37ºC con 5% de CO_{2}. Después de esa incubación, se añadió a cada pocillo 70 \mul de medio completo que contiene 2X FBS. La proliferación celular se midió 20 horas después de la transfección, usando un kit de ensayo de la proliferación celular de una disolución, de Promega. En resumen, se añadió a cada pocillo 28 \mul de Reactivo de Una Disolución, y las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} humidificada. Después de la incubación de 2 horas, la absorbancia se midió a 490 nm.

Ejemplo IV Immunoprecipitación

Los experimentos demuestran la presencia de la nueva tirosina quinasa de transducción de señales. Se lisó una estirpe celular de carcinoma de pulmón humano (A549) en tampón de lisis que contiene 50 mM de Tris (pH 8,0), 150 mM de NaCl, 0,5% de Tritón X-100, 1 mM de PMSF y cóctel de inhibidor de proteasa completo. Todas las etapas se llevaron a cabo a 4ºC. Los lisados celulares de aproximadamente 2,5 X 10^{6} células de carcinomas de pulmón se incubaron con 10 \mul de antisuero policlonal de conejo, durante 2 horas con giro continuo. Como control negativo, se usó suero preinmune procedente del mismo conejo. Los complejos inmunitarios se capturaron mediante adición de perlas de proteína A-Sefarosa (Pharmacia), y meciendo durante una hora adicional. Las perlas se lavaron cinco veces en tampón de lisis. La proteína unida se eluyó en tampón de muestra y se sometió a SDS-PAGE en un gel al 8%.

Ejemplo V Ensayo para determinar la actividad de quinasa

Se añadió GST/quinasa SEQ ID NO:3 purificada recombinante (u otra proteína recombinante derivada de SEQ ID NO:3) a 20 \mug de enolasa en 10 \mul de un tampón de reacción de quinasa (KRB) 3X que contiene (en mM): 60 de HEPES (pH 7,5), 30 de acetato de magnesio, 0,15 de ATP, 3 de DTT, 0,03 de ortovanadato de sodio. La reacción se comenzó mediante adición de 5 \muCi de [\gamma-^{32}P]ATP (10 \mul). Las muestras se incubaron durante 5 minutos a 30ºC. La reacción se detuvo mediante adición de 4X de tampón de muestra de Laemmli. Las proteínas se separaron en geles de SDS con 12% de Tris/glicina, se tiñeron con azul de Coomassie, se secaron y se expusieron a una película de autoradiografía.

Ejemplo VI Identificación sistemática de alta producción para compuestos que modulan la actividad

La identificación sistemática de alta producción para compuestos moduladores se realiza usando FlashPlates® (NEN^{TM} Life Science Products) de 96 pocillos revestidos con enolasa. Se añade a cada pocillo tampón de reacción de quinasa (3X tampón de reacción de quinasa (KRB) que contiene: 60 mM de HEPES (pH 7,5), 30 mM de acetato de magnesio, 0,15 mM de ATP, 3 mM de DTT, 0,03 mM de ortovanadato de sodio) y 0,25 \muCi de [\gamma^{33}P]-ATP a una concentración no mayor que 1 \mug/ml, (determinada mediante valoración de las preparaciones enzimáticas individuales para una concentración que permita determinaciones cinéticas durante un transcurso de tiempo de 1 hora de la tirosina quinasa), y se incubó una hora a 30ºC en presencia o en ausencia de 10 \muM de compuesto de ensayo. El volumen de reacción total es 100 \mul. Tras la incubación, la mezcla de reacción se aspiró, y los pocillos se enjuagaron dos veces con 300 \mul de PBS. La incorporación de fosfato radiomarcado se determina mediante recuento por centelleo, con un contador de centelleo para microplacas de 96 pocillos, de 12 detectores, Packard Instrument Co. Top Count, y un contador de luminiscencia, modelo B991200. Los compuestos que inhiben la actividad de quinasa en una cantidad \geq 50% a 10 \mum están indicados mediante una reducción de > 50% en los recuentos de centelleo. La especificidad y la selectividad se determinan mediante valoración de los compuestos inhibidores para determinar la IC_{50} (u otra cantidad estándar bien conocida en la técnica, para comparación) y mediante la sustitución de otras quinasas en el ensayo. Por ejemplo, la determinación de la actividad inhibidora relativa de las quinasas, en comparación con SEQ ID NO:3 recombinante expresada y aislada de manera similar, evaluada en condiciones similares, proporciona los datos de selectividad. Cooper, et al., J.Biol. Chem., 259:7835 (1984). Los sitios de fosforilación en la enolasa son utilizados por tirosina proteína quinasas in vivo e in vitro.

Como alternativa, se puede usar un ensayo de filtro. Este protocolo es el mismo, pero la reacción se detiene mediante adición de EDTA (pH 7,0) a una concentración final de 80 mM. Entonces, las muestras se centrifugan y se colocan 50 \mul del sobrenadante en forma de puntos sobre papel de filtro de intercambio catiónico p81 (Whatman, Nº. 3698915). Los filtros se lavaron entonces tres veces en 200 ml de 180 mM de H_{3}PO_{4} (5-10 minutos cada vez), y una vez en 200 ml de etanol al 96%. Después de secar los filtros en aire, la radioactividad se determinó mediante el recuento de Cerenkov en un contador de centelleo.

Ejemplo VII Identificación sistemática in vivo de la eficacia (actividad farmacológica)

Para evaluar adicionalmente la capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento de tumores humanos, por ejemplo, se inyectaron células tumorales humanas en ratones SCID (grave inmunodeficiencia combinada) para formar masas tumorales palpables. Los efectos de diversas dosis (por ejemplo, 0,5-50 mg) de un compuesto que inhibe el crecimiento tumoral se pueden determinar según lo siguiente: se suspendieron aproximadamente 1 x 10^{7} células de la estirpe celular CCL 221 (ATCC, Rockville, MD), una estire celular de adenocarcinoma de colon humano, en 100 \mul de DMEM, y se inyectaron subcutáneamente en ratones con SCID, de manera que se formaron dos tumores por ratón. Los ratones con SCID recibieron células CCL 221, y los tumores se hicieron crecer durante 7 días sin tratamiento; en el séptimo día (Día 0) se registraron los diámetros máximos de los tumores y los pesos de los animales, y se determinó el tamaño medio del tumor para los ratones. En el Día 1 (ocho días después de la inyección de las células tumorales), se comenzó el tratamiento de los ratones con el compuesto candidato o con el vehículo solo. Se inyectó intraperitonealmente a un grupo de los ratones (controles) con 0,2 ml de vehículo, y un segundo grupo de ratones recibió compuesto mediante inyección intraperitoneal. Se pueden estudiar diversas dosis (0,25-75 mg) del compuesto en grupos separados de ratones. En el Día 7 y en el Día 14, se midió el peso del animal y el diámetro máximo del tumor. Se comparó el tamaño máximo medio del tumor, para cada grupo, en el Día 0, Día 7 y Día 14. en el Día 14, se siguió un animal con dosis elevada para determinar si el agente produce una inhibición, dependiente de la dosis, del crecimiento del tumor. Los efectos de toxicidad se pueden examinar rastreando el peso de los ratones y recogiendo los pulmones, hígados y bazos para tinción histológica.

<110> ZENECA Limited

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<120> RECEPTOR TIROSINA QUINASA HUMANO

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<130> 70332/US.sustantiva

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<150> Documento U.S. 60/088.958

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<151> 11-06-1998

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<160> 6

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 2607

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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2

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<210> 2

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<211> 1269

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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3

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<210> 3

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<211> 422

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 3

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4

40

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<210> 4

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ala Asp Arg Pro Ser Pro Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gccgtcgact gtgggcctag cagggaa

\hfill

27

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gccgcggccg ctcaaagcat gctatag

\hfill

27

Claims

1. Polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene al menos 80% de homología con un miembro elegido del grupo que consiste en: (la SEQ ID NO:3, las posiciones 1 a 122 de SEQ ID NO:3; las posiciones 26 a 422 de SEQ ID NO:3 y las posiciones 123 a 422 de SEQ ID NO:3).

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia tal como se representa en la SEQ ID NO:3.

3. Polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia tal como se representa en la SEQ ID NO:3, en la que la posición 147 (lisina) de la SEQ ID NO:3 está sustituida o suprimida.

4. Polinucleótido según la reivindicación 3, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia tal como se representa en la SEQ ID NO:3, en la que la posición 147 de la SEQ ID NO:3 es Arginina.

5. Polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia que se elige del grupo que consta de: (la SEQ ID NO:3, las posiciones 1 a 25 de SEQ ID NO:3, las posiciones 1 a 122 de SEQ ID NO:3, las posiciones 26 a 422 de SEQ ID NO:3, y las posiciones 123 a 422 de SEQ ID NO:3).

6. Polinucleótido según la reivindicación 2, en el que la secuencia de polinucleótidos comprende la secuencia tal como se representa en la SEQ ID NO:2.

7. Molécula antisentido que comprende un oligómero, de longitud comprendida en el intervalo que varía de 12 a 25 nucleótidos, que: (a) es complementaria de una región que se encuentra en el seno de las posiciones 67 hasta 148 de la SEQ ID NO:1; o (b) comprende una secuencia, que es complementaria de una secuencia elegida en el grupo que consta: (de las posiciones 67 hasta 79; 70 hasta 82; 73 hasta 85; 75 hasta 92; 76 hasta 88; 79 hasta 91; 80 hasta 92; 81 hasta 93; 82 hasta 94; 83 hasta 95; 84 hasta 96; 85 hasta 97; 86 hasta 98; 87 hasta 99; 88 hasta 100; 89 hasta 101; 90 hasta 102; 91 hasta 103; 92 hasta 104; 93 hasta 105; 94 hasta 106; 95 hasta 107; 96 hasta 108; 97 hasta 109; 98 hasta 110; 99 hasta 111; 100 hasta 112; 101 hasta 113; 102 hasta 114; 103 hasta 115; 104 hasta 116; 105 hasta 117; 106 hasta 118; 107 hasta 119; 108 hasta 120; 109 hasta 121; 110 hasta 122; 111 hasta 123; 112 hasta 124; 113 hasta 125; 114 hasta 126; 115 hasta 127; 116 hasta 128; 117 hasta 129; 118 hasta 130; 119 hasta 131; 120 hasta 132; 121 hasta 133; 122 hasta 134; 123 hasta 135; 124 hasta 136; 125 hasta 137; 126 hasta 138; 127 hasta 139; 128 hasta 140; y 136 hasta 148, de la SEQ ID NO:1).

8. Molécula antisentido que comprende un oligómero, de longitud comprendida en el intervalo que varía de 12 hasta 25 nucleótidos, que: (a) es complementaria de una región que se encuentra en el seno de las posiciones 1333 hasta 1414 de la SEQ ID NO:1; o (b) que comprende una secuencia, que es complementaria de una secuencia elegida en el grupo compuesto por: (de las posiciones 1333 hasta 1345; 1336 hasta 1348; 1339 hasta 1351; 1342 hasta 1354; 1345 hasta 1357; 1346 hasta 1358; 1347 hasta 1359; 1348 hasta 1360; 1348 hasta 1365; 1349 hasta 1361; 1350 hasta 1362; 1351 hasta 1363; 1352 hasta 1364; 1353 hasta 1365; 1354 hasta 1366; 1355 hasta 1367; 1356 hasta 1368; 1357 hasta 1369; 1358 hasta 1370; 1359 hasta 1371; 1360 hasta 1372; 1361 hasta 1373; 1362 hasta 1374; 1363 hasta 1375; 1364 hasta 1376; 1365 hasta 1377; 1366 hasta 1378; 1367 hasta 1379; 1368 hasta 1380; 1369 hasta 1381; 1370 hasta 1382; 1371 hasta 1383; 1372; 1384; 1373 hasta 1385; 1374 hasta 1386; 1375 hasta 1387; 1376 hasta 1388; 1377 hasta 1389; 1378 hasta 1390; 1379 hasta 1391; 1380 hasta 1392; 1381 hasta 1393; 1382 hasta 1394; 1383 hasta 1395; 1384 hasta 1396; 1385 hasta 1397; 1386 hasta 1398; 1387 hasta 1399; 1388 hasta 1400; 1389 hasta 1401; 1390 hasta 1402; 1391 hasta 1403; 1392 hasta 1404; 1393 hasta 1405; y 1394 hasta 1406, de la SEQ ID NO:1).

9. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1.

10. Célula hospedante transformada con el vector de expresión según la reivindicación 9.

11. Polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO:3 o una variante de SEQ ID NO:3, que tiene al menos 80% de homología con un miembro elegido del grupo que consiste en: (la SEQ ID NO:3; las posiciones 1 a 122 de SEQ ID NO:3; las posiciones 26 a 422 de SEQ ID NO:3, y las posiciones 123 a 422 de SEQ ID NO:3).

12. Anticuerpo específico del polipéptido de SEQ ID NO:3.

13. Procedimiento para producir un polipéptido según la reivindicación 11, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:

a): cultivar una célula hospedante según la reivindicación 10, en condiciones apropiadas para la expresión de dicho polipéptido; y

b): recuperar dicho polipéptido a partir del cultivo de células hospedantes.

14. Procedimiento de identificación de compuestos que modulan una actividad biológica y/o farmacológica de una tirosina quinasa, que comprende:

a): combinar un compuesto candidato modulador con un polipéptido según la reivindicación 11; y medir un efecto del compuesto candidato modulador sobre la actividad biológica y/o farmacológica del polipéptido.

15. Procedimiento de identificación de compuestos que modulan una actividad biológica y/o farmacológica de una tirosina quinasa, que comprende: combinar un compuesto candidato modulador con una célula hospedante que expresa un polipéptido según la reivindicación 11; y medir un efecto del compuesto candidato modulador sobre la actividad biológica y/o farmacológica del polipéptido.

16. Composición de diagnóstico para la identificación de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO:3, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 12.