ES2264440T3

ES2264440T3 - Amplificacion de mrna.

Info

Publication number: ES2264440T3
Application number: ES01915408T
Authority: ES
Inventors: Dietlind Zohlnhofer; Christoph Klein
Original assignee: Micromet GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2007-01-01
Anticipated expiration: 2021-03-23
Also published as: US7229760B2; EP1370683A2; AU4250901A; DE60120501D1; ATE329060T1; DK1370683T3; EP1728874B1; EP1370683B1; WO2001071027A3; AU2001242509B2; CA2402534C; US20040029124A1; IL151872A0; EP1728874A1; WO2001071027A2; DE60120501T2; JP2004508010A; CA2402534A1

Abstract

Un método para la amplificación del mRNA de una muestra, que comprende los siguientes pasos: i. generación de cDNA a partir de RNA poliadenilado utilizando por lo menos un cebador que hibride con este RNA poliadenilado y que contenga un extremo 5¿ poli(C) o 5¿ poli(G), estando la concentración de este cebador en un intervalo de 10 a 60 µM; ii.(aa) eliminación del exceso de cebador o cebadores no hibridados o del exceso de dNTP, si existe cualquiera de ellos; ii.(ab) adición en el extremo 3¿ del cDNA generado de una cola de poli(G) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5¿ poli(C), o de una cola de poli(C) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5¿ poli(G); o bien ii.(b) adición en el extremo 3¿ del cDNA generado de una cola de poli(G) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5¿ poli(C), o una cola de poli(C) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5¿ poli(G) utilizando una RNAligasa, independientemente de la presencia o ausencia de cebador, cebadores o dNTP en exceso; y (iii) amplificación del cDNA con cola mediante un cebador que hibride con la cola o colas generadas en el paso ii (ab) o ii(b).

Description

Amplificación de mRNA.

La presente invención está relacionada con un método de amplificación del mRNA de una muestra, que comprende los siguientes pasos: i.) la generación de cDNA a partir de un RNA poliadenilado utilizando por lo menos un cebador que hibride con este RNA poliadenilado y que contenga un extremo 5' poli(C) o 5' poli(G), estando la concentración de este cebador en un intervalo de 10 a 60 \muM; ii.)(aa) la eliminación del exceso de cebador o cebadores no hibridados o del exceso de dNTP, si existe cualquiera de ellos; ii.)(ab) la adición de una cola de poli(G) en el extremo 3' del cDNA generado, cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(C), o de una cola de poli(C) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(G); o bien ii.)(b) la adición de una cola de poli(G) en el extremo 3' del cDNA generado, cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(C) o de una cola de poli(C) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(G) utilizando una RNA ligasa, independientemente de la presencia o ausencia de cebador/es o dNTP en exceso; y iii.) la amplificación del cDNA con cola mediante un cebador que hibride con la cola o colas generadas en el paso ii(ab) o ii(b). La invención también está relacionada con métodos para la identificación de genes expresados en una muestra de ensayo, para la identificación de un candidato a fármaco para el tratamiento de un trastorno patológico y para la detección in vitro de un trastorno patológico utilizando el método de amplificación de mRNA mencionado. Además, la presente invención está relacionada con el uso de cDNA amplificados como los obtenidos a través del método de la invención en arrays enzimáticos, de interacción o de hibridación. Además, la especificación describe métodos para la preparación de sustitutivos in vitro.

Recientemente el estudio de la expresión génica y de los patrones de expresión génica ha sufrido un gran adelanto gracias al análisis global de la expresión de mRNA en ensayos de filtrado de cDNA o de los microarrays de cDNA (véanse, entre otros, Southern, Trends Genet. 12 (1996), 110-115; Debouck, Nat. Genet. 21:48-50 (1999); Hacia, Nat. Genet., 21, 42-7 (1999); Cole, Nat. Genet. 21, 38-41 (1999); Bowtell DD., Nat. Genet., 21, 25-32 (1999); Cheung, Nat. Genet., 21, 15-19 (1999); Duggan, Nat. Genet., 21, 10-14 (1999); Southern, Nat. Genet., 21, 5-9 (1999); WO 97/13877). Por ejemplo, la patente WO 97/13877 describe un método para evaluar la toxicidad de un compuesto en un organismo a ensayo mediante la medición de los perfiles de expresión génica en tejidos seleccionados. Lockhardt (Nature Biotechnology 14 (1996), 1675-1680) describe un enfoque basado en la hibridación de una gran cantidad de mRNA con arrays pequeños y de alta densidad que contienen decenas de miles de oligonucleótidos sintéticos, lo cual permite el seguimiento simultáneo de decenas de miles de genes (expresados). Se han descrito otros análisis en microarrays de la expresión génica en Shalo (Pathol. Biol. 46 (1998), 107-109), Lockhardt (Nuc. Acids Symp. Ser. 38 (1998), 11-12) o en Schena (Trends Biotech. 16 (1998), 301-306). Sin embargo, una de las desventajas mayores de la tecnología de arrays de cDNA antes descrita es el hecho de que estas tecnologías requieren una cantidad de 2,5 a 10 \mug de sondas de ácido nucleico a ensayar tanto en forma de mRNA, RNA producido por transcripción inversa, o cDNA amplificado (véase, entre otros, Schena (Science 270 (1995), 467-470 y PNAS EE.UU. 93 (1996), 10614-10619) o Lockhardt (1996) loc. Cit.). Normalmente, esta cantidad de material solo se obtiene a partir de un gran número de células, como unas 10^{9}. Bryant, PNAS USA 96 (1999), 5559-5564 o Mahadevappa, Nat. Biotech. 17 (1999), 1134-1136 describieron un enfoque de este tipo en el que utilizaban por lo menos desde 50.000 células. El menor número de células utilizado hasta el momento para análisis de tejidos ex vivo y de la correspondiente expresión génica ha sido de 1.000 células (Luo, Nat. Medicine 5 (1999), 117-122). Sin embargo, una plétora de trastornos fisiológicos o patológicos haría necesario el estudio del patrón expresión génica o "transcriptoma", definido como la totalidad de moléculas de mRNA de una muestra biológica dada (Velculescu, Cell, 88, 243-251 (1997)) de un número menor de células o incluso de una célula única. Por ejemplo, la investigación de la expresión génica regulada espacial y temporalmente en la embriogénesis se beneficiaría claramente de un método mediante el cual se puede obtener la información a partir de un número de células reducido, en concreto una única célula. De forma similar, sería de gran interés investigar el patrón de expresión génica o transcriptoma de células individuales o de un número reducido de células derivadas de tejido adulto, como, entre otras, células hemáticas o neuronales (madre). Además, se podrían clarificar numerosos trastornos patológicos, por ejemplo, la delineación de la expresión génica desregulada en la proliferación atípica, la mutaplasia, las lesiones preneoplásicas o el carcinoma in situ. Otros ejemplos de procesos patológicos localmente restringidos que se podrían investigar, sin abarcar todos los posibles, son: estenosis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de injerto contra huésped o inflamaciones relacionadas con la autoinmunidad. Además, la micrometástasis oculta debida a un cáncer pequeño tiene graves consecuencias si las células tumorales diseminadas sobreviven en órganos alejados y acaban dando lugar a metástasis manifiestas. Las células tumorales que quedan tras la resección de tumores primarios se detectan actualmente en aspirados de médula ósea mediante tinción inmunocitoquímica con anticuerpos dirigidos contra citoqueratinas (revisado en Pantel, J. Natl. Canc. Inst. 91, 1113-1124 (1999)). A pesar de que varios estudios han establecido la importancia pronóstica de las células micrometastásicas positivas para la citoqueratina en la médula ósea (Braun, N. Engl. J. Med. 342, 525-533 (2000); Pantel, J. Natl. Canc. Inst. 91, 1113-1124 (1999)), la biología de estas células ha permanecido enigmática durante mucho tiempo debido a su frecuencia extremadamente baja en el intervalo de 10^{-5}-10^{-6}.

La diseminación sistémica de las células cancerosas requiere que las células salgan del tumor sólido, se distribuyan a través de los vasos sanguíneos o linfáticos, atraviesen barreras endoteliales y tisulares y sobrevivan ectópicamente como células individuales. Los cambios fenotípicos que acompañan estos pasos se consideran un proceso de desarrollo, la llamada transición epitelio-mesénquima (TEM) (Hay, Acta Anatómica, 154, 8-20, (1995); Birchmeier, Acta Anatómica, 156, 217-226 (1996)). Solo una pequeña fracción de las células diseminadas a partir de un tumor acabará adquiriendo características asociadas a la TEM (Boyer, Acta Anatómica, 156, 227-239 (1996)). Todavía no se conocen los cambios epigenéticos que conducen a la TEM, pero pueden tener implicaciones importantes para el desarrollo de tratamientos futuros.

Los obstáculos técnicos principales para el estudio de los cambios epigenéticos de, por ejemplo, células tumorales diseminadas o tejido modificado patológico son los siguientes: accesibilidad limitada, baja frecuencia, identificación inequívoca, posterior análisis de transcriptoma a nivel de células individuales o de un número reducido de células (véase p. ej. WO 90/01065). Se han desarrollado una diversidad de protocolos para la generación de "bibliotecas de cDNA de células individuales" y para la amplificación global del mRNA de células individuales (véase Belyavsky, Nucl. Acid. Res., 17, 2919-2932 (1989); Brady, Methods en Enzymology, 225, 611-623 (1993); Brady, Current Biology, 5, 909-922 (1995); y Karrer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3814-3818 (1995)). Por ejemplo, Brady (1995) describe el análisis de la expresión génica en una jerarquía compleja de diferenciación mediante amplificación de cDNA de células individuales. Sin embargo, estos procedimientos presentan desventajas evidentes, como es la restricción a extremos 3' y una insuficiente sensibilidad cuando los productos amplificados por PCR hibridan con los arrays de cDNA.

En estos procedimientos se redujo la variación introducida durante la amplificación de fragmentos de cDNA limitando la longitud de los cDNA durante la transcripción inversa. Esto último se consiguió mediante unas condiciones de baja cantidad de sustrato para la transcripción inversa; es decir, la utilización de concentraciones bajas de un cebador oligo d(T) y concentraciones bajas de dNTP. Sin embargo, existe el riesgo de comprometer la transcripción inversa y la posterior eficiencia de la PCR, lo cual conduciría a resultados arbitrarios a la hora de investigar los patrones de expresión génica o transcriptomas de varias células o de células individuales. Además, la utilización de un cebador oligo d(T) para la amplificación por PCR limita el empleo de temperaturas de hibridación elevadas y por tanto de condiciones de hibridación astringentes. De forma característica, la hibridación se lleva a cabo a 42ºC (Brail, Mut. Res. Genomics 406 (1999, 45-54). Como se ha resaltado anteriormente, un enfoque de este tipo puede ser adecuado para una síntesis de cDNA restringida a 3'. Sin embargo, unas mayores temperaturas de hibridación reducen la presencia de estructuras secundarias en el cDNA y la probabilidad de que se produzca hibridación inespecífica con secuencias internas del cDNA, lo que provocaría un acortamiento de los productos de amplificación comparado con las moléculas de cDNA. Las temperaturas de hibridación del método de la invención son preferiblemente superiores a 45ºC, más preferiblemente superiores a 55ºC y, más preferiblemente, superior a 65ºC.

Como se ha mencionado anteriormente, la cantidad de mRNA de un número reducido de células, o incluso de una célula individual, es insuficiente para su uso en el análisis global directo. Por lo tanto, el análisis global del mRNA expresado (de un "transcriptoma") en un número reducido de células, o incluso una única célula individual, requiere la amplificación de mRNA poliadenilado extraído o transcrito de forma inversa. Hasta la fecha, la amplificación por PCR de pequeñas cantidades de mRNA no ha dado lugar a una representación fiable de la expresión relativa del mRNA presente en una célula determinada o en un número reducido de células determinado en un momento específico, en un estado de desarrollo específico o en un estado fisiológico específico (Brail, Mut. Res. Genomics 406 (1999), 45-54). Brail (1999), (loc. cit.) concluye que el método descrito por Brady (Brady (1993), loc. cit.) probablemente introduce variaciones en la reacción de adición de cola o en los pasos de amplificación por PCR. En concreto, el análisis de Brail (Brail (1999), loc. cit.) mostró una variación cinco veces mayor incluso en el caso de genes "housekeeping" que son muy abundantes (comparación directa de GAPDH y gen L32 ribosómico).

Por esta razón, el problema técnico de la presente invención consiste en proporcionar medios y métodos que cumplan con la necesidad de una amplificación global y uniforme de mRNA, en concreto del transcriptoma de un número reducido de células o de una célula individual. La solución a este problema técnico se alcanza proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

En consecuencia, la presente invención está relacionada con un método para la amplificación del mRNA de una muestra, que comprende los siguientes pasos:

(i) generación de cDNA a partir de un RNA poliadenilado utilizando por lo menos un cebador que hibride con este RNA poliadenilado y que contenga un extremo 5' poli(C) o 5' poli(G), estando la concentración de este cebador en un intervalo de 10 a 60 \muM;

(ii)(aa) eliminación del exceso de cebador o cebadores no hibridados o del exceso de dNTP, si existe cualquiera de ellos;

(ii)(ab) adición en el extremo 3' del cDNA generado de una cola de poli(G) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(C), o de una cola de poli(C) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(G); o bien

(ii)(b) adición en el extremo 3' del cDNA generado de una cola de poli(G) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(C), o una cola de poli(C) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(G) utilizando una RNA ligasa, independientemente de la presencia o ausencia de cebador, cebadores o dNTP en exceso; y

(iii) amplificación del cDNA con cola mediante un cebador que hibride con la cola o colas generadas en el paso (ii)(ab) o (ii)(b).

Se puede obtener RNA poliadenilado a partir de una muestra mediante métodos conocidos en el campo. Estos métodos incluyen pasos de selección de oligo d(T). La muestra puede ser de origen animal o vegetal y puede ser una muestra tisular o celular. Esta muestra también puede estar formada por tejido/s o célula/s en cultivo. En particular, se prefiere una muestra de origen humano. Las muestras se pueden obtener mediante métodos conocidos en el campo que, entre otros, incluyen la aterectomía, el vaciado, la biopsia, la disección por láser o procedimientos quirúrgicos macroscópicos.

El método y la técnica aquí descritos para la amplificación de mRNA de dicha muestra comprenden pasos en los que el RNA poliadenilado obtenido a partir de una muestra se emplea para la generación de un primer producto o productos de cDNA utilizando un cebador o cebadores que contienen regiones flanqueantes 5' oligo(dC)/poli(C) (o 5' oligo(dG)/poli(G)). Este cebador 5' oligo(dC) o 5' oligo(dG) contiene preferiblemente entre 8 y 20 nucleótidos de citosina (o guanina), más preferiblemente 10 nucleótidos de citosina (o guanina); dicho/s cebador/es contiene/n más preferiblemente 11, aún más preferiblemente 13 y, en la forma más preferible, dicho/s cebador/es contienen 15 nucleótidos de citosina (o guanina). Se prefiere que la primera síntesis de cDNA se lleve a cabo tras eliminar los tRNA o rRNA potencialmente contaminantes. Esta eliminación se puede realizar mediante métodos conocidos por los expertos; por ejemplo, mediante la unión del mRNA poliadenilado a soportes sólidos recubiertos de oligo(dT)/poli(T) como los aquí definidos y posteriores pasos de lavado.

Además, este primer paso de síntesis de cDNA comprende preferiblemente cebadores aleatorios que se encuentran en una concentración que es de 2000 a 8000 veces mayor que las concentraciones utilizadas en estudios previos (por ejemplo, de 10 nM como se empleó en Trumper, Blood 81 (1993), 3097-3115). En consecuencia, todavía se prefiere más que esta primera síntesis de cDNA -es decir, la generación de cDNA a partir de RNA poliadenilado-, se lleve a cabo en una concentración de dNTP alta, preferiblemente en una concentración de 0,5 mM de dNTP. Este primer paso de preparación de cDNA (paso "i") puede también comprender sistemas de marcaje del cDNA resultante. La introducción de marcadores se puede realizar a través de métodos conocidos por los expertos (véase, entre otros, "Current Protocolos en Molecular Biology", editado por Ausbel et al., John Wiley & Sons, USA (1998)), y pueden incluir el empleo de dNTP marcados (con biotina, fluoresceína o radiomarcaje). Este primer paso de síntesis de cDNA (transcripción inversa), que utiliza preferiblemente cebadores aleatorios, puede incluir el empleo de enzimas estándar, preferiblemente transcriptasa inversa deficiente en actividad ribonucleasa H, como la Transcriptasa Inversa Superscript II (GIBCO).

Dado que una concentración alta de dNTP mejora esta primera síntesis de cDNA pero puede interferir en cualquier reacción ulterior (como las reacciones de adición de cola), es preferible que, antes de llevar a cabo cualquier otra reacción o paso del método de la invención, se elimine el exceso de dNTP libres. También es preferible eliminar el exceso de cebador o cebadores no hibridados antes de realizar más pasos. Esta eliminación se puede realizar, entre otros, mediante pasos de lavado, como intercambios de solución tampón (como se muestra en los ejemplos anexos), o mediante métodos de filtración (es decir, con membranas selectivas para el tamaño). Sin embargo, dicho paso de eliminación también se puede omitir si no existe ningún exceso de dNTP o cebadores. Además, el paso de eliminación se puede evitar en el caso de que el siguiente paso de "adición de cola" se realice mediante un paso de RNA ligasa.

La reacción de adición de cola en el extremo 3' del método de la presente invención (véase el paso (ii)(ab) o (ii)(b) del método de la invención) conlleva la adición de una cola de poli(G) cuando en el paso "i" se empleó un cebador o cebadores que contenían un extremo 5' poli(C), o con un poli(C) cuando en el paso "i" se empleó un cebador o cebadores que contenían un extremo 5' poli(G). Se ha descubierto de manera sorprendente, y en los ejemplos anexos se demuestra, que, entre otros, los cebadores poli(C) unidos a colas de poli(G) son al menos 100 veces más sensibles que los cebadores poli(T) unidos a colas de poli(A), como se proponía anteriormente en el campo (Brady (1993), loc. cit.; Trumper, Blood, 81, 3097-3115 (1993)).

La reacción de adición de cola se puede llevar a cabo utilizando una enzima con actividad desoxinucleótido transferasa 3' terminal, preferiblemente en un tampón de conservación sin cacodilato, como la desoxinucleótido transferasa terminal (MBI Fermentas; Pharmacia). Sin embargo, debe mencionarse que dicho paso de "adición de cola" también se puede realizar mediante RNA ligasa (véase Edwards, Nucl. Acids Res., 19, 5227-5232 (1991)). En este caso, es posible que las regiones flanqueantes oligo(dC) o oligo(dG) estén ligadas al extremo 3' de las moléculas de cDNA de cadena única mediante dicha RNA ligasa. Las secuencias de las regiones flanqueantes son capaces de hibridar con la región flanqueante del cebador o cebadores de la síntesis de cDNA (Edwards, Nucl. Acid Res., 19, 5227-5232 (1991)).

Finalmente, el cDNA con cola de poliG/poliC se puede amplificar más, ya que este o estos cDNA contienen un tramo oligo(C)(o -G) 5' introducido por el cebador y un tramo oligo(G)(o -C) 3' introducido por, por ejemplo, la desoxinucleótido transferasa terminal. Esta segunda reacción PCR se puede llevar a cabo en presencia de nucleótidos marcados. Los preferidos son los nucleótidos marcados con biotina, fluoresceína, digoxigenina o radiomarcados que son conocidos en el campo. Además, esta invención engloba la utilización de cebadores oligonucleotídicos marcados (como los marcados con biotina, fluoresceína, digoxigenina o los radiomarcados) para obtener un único marcador por especie de cDNA.

En una realización preferida del método de la invención, el mencionado "por lo menos un cebador" en el paso "i" es un cebador aleatorio, un cebador oligo(dT) o una combinación de los mismos. Este cebador aleatorio puede contener un tramo de 4 a 10 nucleótidos aleatorios, preferiblemente un tramo de 5 a 9 nucleótidos aleatorios. Más preferiblemente, dicho cebador aleatorio contiene un oligonucleótido hexámero aleatorio o uno octámero aleatorio. Se prefiere particularmente que dicho cebador aleatorio tenga una secuencia como la mostrada en los ID SEC Núms.: 1 o del 7 al 9. Todavía más particularmente preferido es el cebador aleatorio CFI5CN6, empleado en los ejemplos anexos que contienen los nucleótidos 5'-(CCC)_{5}GTCTAG-A(N)_{6} (ID SEC Núm.: 8).

En los ejemplos anexos se muestra que este cebador o cebadores aleatorios también se pueden emplear en combinación con otros cebadores aleatorios o con un cebador o cebadores oligo(dT). Por ejemplo, en el paso "i" de la presente invención se puede utilizar un par de cebadores (CFI5c8, correspondiente al ID SEC Núm.: 9, y CFI5cT, correspondiente al ID SEC Núm.: 10), que contienen las secuencias 5'-(CCC)_{5}GTCTAGA(N)_{8} y 5'-(CCC)_{5}GTCTAGATT
(TTT)_{4}TVN, en la que "V" representa G, C o A y N representa G, T, C o A. Por lo tanto, se prefiere particularmente el empleo de una combinación de un cebador poli d(C)/(G) que contiene un octámero (véase, p. ej., el ID SEC Núm.: 9) con un cebador oligo(dT) (véase, p. ej., el ID SEC Núm.: 10).

En consecuencia, en otra realización preferida del método de la presente invención, el cebador oligo(dt) a emplear en el paso "i" contiene la secuencia mostrada en el ID SEC Núm.: 10, que contiene la secuencia 5'-(CCC)_{5}
GTCTAGATT(TTT)_{4}TVN. Como se ha mencionado antes aquí, dicho cebador o cebadores oligo(dT) a emplear en el paso "i" del método de la presente invención se pueden utilizar exclusivamente o en combinación con un cebador o cebadores aleatorios como se ha descrito anteriormente. Dicho cebador o cebadores oligo(dT) son preferiblemente cebadores que contienen un tramo oligo(dT).

En otra realización preferida del método de la presente invención, la concentración de dicho "por lo menos un cebador" en el paso "i" está en un intervalo de 10 \muM a 60 \muM. La concentración más preferida es de unos 50 \muM, como se muestra en el ejemplo anexo.

En aún otra realización preferida del método de la presente invención, dicho cebador del paso "i" contiene un tramo de al menos 10, preferiblemente al menos 12 y, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos capaces de hibridar con la cola o colas generadas en el paso "ii(ab)" o "ii(b)". Se prefiere que este cebador no contenga más de 20 nucleótidos capaces de hibridar con la cola o colas generadas en los pasos "ii(ab)" o "ii(b)" del método de la presente invención. En una realización preferida, el cebador del paso "iii" contiene la secuencia descrita en los ID SEC Núms.: 11, 12, 13, 14 o 15. Como se muestra en los ejemplos anexos, un cebador preferido en particular en el paso "iii" es el cebador "CP2" que contiene la secuencia nucleotídica 5'TCAGAATTCATG(CCC)_{5} (véase el ID SEC Núm.: 14), con el que se han obtenido resultados particularmente buenos en este paso de "amplificación global". Por esta razón, en el caso de que se emplee un único cebador en este paso, se prefiere particularmente el cebador "CP2" antes descrito cuando en el paso "ii(ab)" o "ii(b)" se haya llevado a cabo la adición de una cola de poli(G). Una ventaja de emplear solamente un único cebador en el paso "iv" de la invención es que las posibles interacciones entre cebadores pueden evitarse y que se pueden utilizar concentraciones de cebador relativamente elevadas: preferiblemente superiores a 0,2 \muM, más preferiblemente superiores a 0,8 \muM y, aún más preferiblemente, superiores a 1,0 \muM. También se pueden emplear concentraciones de cebador mayores, superiores a 1,0 \muM o a 1,2 \muM.

En otra realización preferida del método de la presente invención, el mencionado RNA poliadenilado (o mRNA a amplificar) está unido a un soporte sólido. Este soporte sólido puede ser, entre otros, una microesfera, una membrana, un filtro, un pocillo, un chip o un tubo. En particular se prefieren las microesferas magnéticas, de látex o de metal coloide. Sin embargo, este RNA poliadenilado también puede estar unido a soportes sólidos como microesferas de poliestireno. Las fases sólidas conocidas en el campo también incluyen superficies de vidrio o de silicio, cintas o membranas de nitrocelulosa o tubos (de ensayo) de plástico. Algunos métodos adecuados para la inmovilización de ácidos nucleicos, en concreto RNA poliadenilado sobre fases sólidas, son interacciones covalentes, hidrofóbicas, iónicas y similares. La fase sólida puede retener uno o más receptores adicionales, como por ejemplo un tramo de poli(T), que poseen la capacidad de atraer e inmovilizar el RNA poliadenilado. Este receptor también puede contener una sustancia cambiada que esté cargada en oposición al ácido nucleico. Por lo tanto, en una realización especialmente preferida, el soporte sólido (como las microesferas magnéticas mencionadas) contiene un tramo oligo(dT).

Como se muestra en los ejemplos anexos, el mRNA/RNA poliadenilado a amplificar mediante el método de la presente invención puede aislarse fácilmente sobre un soporte sólido recubierto de oligo(dT), como es el caso de las microesferas magnéticas recubiertas de oligo(dT).

Aún en otra realización de la presente invención, el RNA a amplificar proviene de un tejido, un número reducido de células o una célula individual. Este número reducido de células puede estar en un margen de entre 10^{6} y 2 células. El tejido, las células o la célula individual pueden tener origen animal o vegetal. En concreto, se prefiere que este tejido, células o célula individual sean de origen humano. Además, este tejido, células o célula individual pueden ser una muestra patológica o una muestra sospechosa de ser patológica. Estos tejidos, células (número reducido) o célula individual, tanto si son patológicos, sospechosos de ser patológicos o son normales/sanos, pueden proceder de un fluido corporal o de tejido sólido. Los fluidos corporales pueden ser: sangre, líquido linfático, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, orina o heces. El tejido sólido puede proceder de cualquier órgano o glándula de origen animal o humano. Además este tejido puede contener transformaciones malignas, como tumores o tejido reestenótico. Por lo tanto, estos tejido, células (número reducido) o célula individual también pueden proceder de carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemias o gliomas. Sin embargo, debe resaltarse que el método de la presente invención también se puede aplicar en muestras provenientes de tejido benigno o tejido normal, así como de muestras en cultivo como cultivos tisulares o celulares. La obtención de los tejidos, número reducido de células o células individuales puede realizarse mediante métodos habituales de la técnica que incluyen, entre otros, biopsias, aspiraciones o diluciones. También es posible separar y obtener las muestras mediante citometría de flujo o aislamiento a través de métodos inmunológicos o métodos de unión "receptor/ligando". Como se muestra en los ejemplos anexos, las muestras también se pueden obtener mediante aterectomía, por ejemplo con un dispositivo en hélice para aterectomía (X-sizer, Endicor).

En otra realización preferida del método de la presente invención, estos tejido, número reducido de células o célula individual están fijados químicamente. Esta fijación se puede llevar a cabo en (para)formaldehído. Las concentraciones preferidas están en un margen de un 0,1 a un 1%; sin embargo, es más preferible una concentración de 0,1%. Esta fijación se realiza preferiblemente durante menos de 30 minutos (cuando se utilizan concentraciones menores al 1%). Lo más preferible es realizar la fijación a una concentración de (para)formaldehído del 0,1% durante cinco minutos.

En otra realización preferida, el método de la presente invención comprende también un paso "iv" en el que se modifica más el cDNA amplificado generado. Esta modificación puede consistir en la introducción de sistemas de detección, por ejemplo la introducción de análogos de nucleótidos emparejados con uno o más cromóforos, uno o más colorantes fluorescentes, uno o más radionucleótidos, biotina o DIG. El marcaje de cDNA amplificado se puede llevar a cabo del modo en que se describe en los ejemplos anexos o como se describe, entre otros, en Spirin (1999), Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 40, 3108-3115.

Además, se prefiere que el cDNA amplificado obtenido esté unido a un soporte sólido, tal como se ha definido anteriormente.

Dado que los tampones estándar que contienen cacodilato (como algunos tampones para la síntesis de cDNA) pueden interferir con pasos individuales del método de la invención (como la "reacción de adición de cola") se prefiere que todos los pasos o los pasos individuales se lleven a cabo en un tampón sin cacodilato. En concreto, se prefiere un tampón fosfato y especialmente se prefiere un tampón KH_{2}PO_{4} como el empleado en los ejemplos anexos. Se trata preferiblemente de un tampón de baja fuerza iónica (véase Nelson, Methods in Enzymology, 68, 41-50 (1979)). Además, la utilización de dGTP o dCTP en las reacciones de "adición de cola" proporciona una extensión corta de 15 a 30 nucleótidos, mientras que la utilización de dATP o dTTP proporciona extensiones grandes que oscilan entre 70 y varios cientos de nucleótidos (Nelson (1979), loc. cit.; MIB Fermentas 1998/1999 catálogo, pág. 125); Deng, Methods Enzymology, 100, 96-116 (1983)). Sin embargo, las colas de poli(dA)/(dT) largas dan lugar a poblaciones de cDNA no homogéneas durante la amplificación debido a diversos sitios de hibridación. Por el contrario, el método de la invención, con su cebador 5' corto (10-30 bases) y sus regiones flanqueantes oligo(dG) o oligo(dC) introducidas por adición de cola en el extremo 3', genera poblaciones homogéneas de cDNA amplificados, amplificando preferentemente las regiones codificantes de las moléculas originales de cDNA.

En otra realización todavía más preferida del método de la presente invención, la muestra que contiene el mRNA/RNA poliadenilado a amplificar proviene de una célula o de un tejido (o es una célula o un tejido) cuya identidad genética ha sido definida mediante hibridación genómica comparativa (HGC). Como se muestra en los ejemplos anexos, recientemente se ha descubierto un método que consiste en la HGC de una célula individual (SCOMP; véase Klein (1999), PNAS USA 96, 4494-4499)) y que permite la identificación inequívoca de una única célula. Con este método es posible identificar, entre otras, una célula tumoral o una célula de origen tumoral a través de sus aberraciones cromosómicas. De esta forma, utilizando el método de amplificación de mRNA que aquí se describe y combinándolo con el método SCOMP, es posible aislar mRNA y DNA genómicos a partir de la misma célula individual.

La especificación también describe un método para la preparación de un sustitutivo in vitro de una célula o células o de un tejido o tejidos patológicamente modificados que comprende los siguientes pasos:

(a) Amplificación del mRNA de esta célula/s o tejido/s patológicamente modificados de acuerdo con los pasos del método aquí descrito.

(b) Valoración de la cantidad y, opcionalmente, las características biofísicas del cDNA obtenido o de los transcritos del mismo, con lo que se determina el patrón de expresión génica de este tejido/s o célula/s patológicamente modificados;

(c) Selección de una célula in vitro cuyo patrón de expresión génica sea parecido al de dicho tejido/s o célula/s patológicamente modificados; y

(d) Adaptación del patrón de expresión génica de esta célula in vitro al patrón de expresión génica de la célula o tejido patológicamente modificados.

El término "sustitutivo in vitro" tal como aquí se emplea significa una célula o células o una línea o líneas celulares que es capaz de imitar una situación patológica o un trastorno patológico. Este sustitutivo puede ser de utilidad en experimentos, entre otros, médicos, farmacológicos o científicos, y puede emplearse para la selección de fármacos. En concreto, una célula o línea celular sustitutiva de este tipo se puede utilizar para identificar fármacos o medicamentos potenciales. Esta identificación se puede realizar a través del cribado de bibliotecas de sustancias químicas o biológicas y, preferiblemente, este sustitutivo o sustitutivos se emplean en cribados de alto rendimiento.

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La valoración de la cantidad y, opcionalmente, de las características biofísicas del cDNA obtenido o de los transcritos del mismo puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica o del modo que aquí se describe.

El término "célula in vitro" como aquí se emplea, está relacionado preferiblemente con una célula que puede mantenerse en cultivo. Esta célula se mantiene en cultivo preferiblemente durante al menos una hora, más preferiblemente durante al menos seis horas, más preferiblemente durante al menos 12 horas, más preferiblemente durante al menos un día, más preferiblemente durante al menos dos días, más preferiblemente durante al menos tres días, más preferiblemente durante al menos una semana y, de la forma más preferible, durante varias semanas.

El sustitutivo o sustitutivo in vitro mencionado debe reflejar fielmente el patrón de expresión génica o transcriptoma de la célula o tejido patológicamente modificados. Este sustitutivo debe ser muy parecido al tejido patológicamente modificado o a la célula patológicamente modificada. Por esta razón se prefiere que la "célula in vitro" tal como se ha mencionado en el paso c. Anteriormente sea similar al tejido o célula patológicamente modificado. Por ejemplo, la "célula in vitro" puede proceder de un tejido u órgano similar al tejido patológicamente modificado o enfermo. Entre otras, las células del músculo liso arterial coronario, cuyo patrón de expresión es similar al del tejido reestenótico, se pueden emplear como "células in vitro". De modo similar, se pueden utilizar hepatocitos (como, p. ej. HepG2) para obtener un sustitutivo de tejido hepático patológicamente modificado, de hepatocitos en cultivo (como, p. ej. ATCC 45505) para tejido hepático enfermo, de cardiomioblastos (como, p. ej. cardiomiocito murino) para tejido enfermo de miocardio o de líneas celulares del NCI (National Cáncer Institute, EE.UU.) (como las descritas en Ross, Nat. Genetics 24 (2000), 227-235) para enfermedades tumorales, enfermedades neoplásicas o cáncer.

La "adaptación" del paso (d), tal como aquí se ha mencionado, se lleva a cabo para adaptar el patrón de expresión génica de la "célula in vitro" seleccionada a uno que refleje más certeramente el patrón de expresión génica del tejido o célula patológicamente modificados. En concreto, cuando se encontró (en los pasos (a) y (b) del método antes descrito) que un transcrito o gen expresado en particular (o un grupo en particular de transcritos o genes expresados) presentaban una regulación negativa en comparación con la mencionada "célula in vitro" (o célula control), se decidió que se debía intentar regular positivamente la expresión de dicho transcrito o gen expresado (o grupo de dichos transcritos o genes expresados) en la "célula in vitro ". En consecuencia, en el caso de que un gen expresado o transcrito específico (o un grupo de genes expresados o transcritos específicos) estén regulados positivamente en comparación con dicha "célula in vitro" (o célula control), debe intentarse regular negativamente este gen expresado o transcrito (o grupo de los mismos) en la "célula in vitro". A continuación se describen métodos, factores, compuestos o sustancias particulares que pueden servir para adaptar el patrón de expresión génica de dicha célula in vitro.

Este paso de adaptación puede incluir la puesta en contacto de dicha célula in vitro con al menos un compuesto, factor o sustancia, una variedad de compuestos, factores o sustancias, o una combinación de los mismos, y la valoración de si esta puesta en contacto conduce a un patrón de expresión o transcriptoma modificado en dicha célula in vitro. La valoración del patrón de expresión génica se puede realizar mediante el método de la invención, pero también puede necesitarse el empleo de otros métodos de análisis conocidos en el campo, como por ejemplo métodos bioquímicos y biofísicos. Se prefieren especialmente los métodos siguientes de análisis proteómico, incluidas las electroforesis (en gel) en una y dos dimensiones; cromatografía de líquidos de alto rendimiento; espectrografía de masas o métodos de detección basados en anticuerpos (sistemas de transferencia o de array).

Los tejidos o células patológicamente modificados o la célula in vitro antes mencionados son preferiblemente de origen animal. Se prefieren particularmente los tejidos o células derivados u obtenidos a partir de primates, roedores o artiodáctilos. Aún se prefieren más los tejidos o células procedentes de humanos, monos, cerdos, ratas o ratones.

El método aquí descrito para la preparación de un sustitutivo in vitro de tejidos o células patológicamente modificados consiste en los siguientes pasos:

b(1). Determinar el patrón de expresión génica de una célula o células control o de un tejido o tejidos control; y

b(2). Determinar el gen o los genes que se expresan diferencialmente en estos tejidos o células patológicamente modificados y en estos tejidos o células control.

Un experto en la técnica puede determinar las células o tejidos control aquí mencionados fácilmente. Por ejemplo, es posible emplear tejido similar de un donante sano. Como se muestra en los ejemplos anexos, por ejemplo, la media o media/íntima de arterias coronarias sanas puede servir como tejido control para tejido reestenótico. Además, los tejidos o células control se pueden obtener durante la biopsia de tejido hepático, tejido renal, próstata, tejido cervical, etcétera.

Se ha descrito que el patrón de expresión génica, es decir, el "transcriptoma", de dichos célula control o tejido control también puede determinarse utilizando el método de amplificación del mRNA de una muestra como aquí se describe. De manera preferible, este análisis del transcriptoma de muestras como las células o tejidos patológicamente modificados o las células o tejidos control, comprende los siguientes pasos:

i. Generación de un cDNA a partir de RNA poliadenilado de dicho tejido o célula patológicamente modificado, dicho tejido o célula control o dicha célula in vitro utilizando por lo menos un cebador que híbrida con este RNA poliadenilado y que contiene un extremo 5' poli(C) o 5' poli(G), donde la concentración de este cebador está en un intervalo de 10 \muM a 60 \muM.

ii.(aa) Eliminación del exceso de cebador o cebadores no hibridados o del exceso de dNTP, si existe cualquiera de ellos;

ii.(ab) Adición en el extremo 3' del cDNA generado de una cola de poli(G) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(C), o con una cola de poli(C) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(G); o bien

ii.(b) Adición en el extremo 3' del cDNA generado de una cola de poli(G) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(C), o una cola de poli(C) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(G) utilizando una RNA ligasa, independientemente de la presencia o ausencia de cebador, cebadores o dNTP en exceso.

iii. Amplificación del cDNA con cola mediante un cebador que hibride con la cola o colas generadas en el paso ii(ab) o ii(b).

iv. Utilización del cDNA amplificado en ensayos de hibridación.

v. Detección de las diferencias o similitudes en el patrón de expresión génica de dicho tejido o célula patológicamente modificados, dicho tejido o célula control o dicha célula in vitro.

Las realizaciones aquí descritas para el método de la invención pueden aplicarse para este análisis del transcriptoma de dichos tejidos o células patológicamente modificados, tejidos o células control o dicha célula in vitro.

El método arriba descrito para la preparación de un sustitutivo in vitro puede emplearse, entre otros, para tejido reestenótico o para una célula reestenótica. Estas células control o tejido/s control pueden seleccionarse del grupo formado por células del músculo liso, media/íntima de arterias coronarias (sanas) y media/íntima de arterias periféricas (sanas).

La "célula in vitro" a adaptar para el patrón de expresión génica de célula/s o tejido/s patológicamente modificados puede provenir de un cultivo celular primario, un cultivo celular secundario, un cultivo tisular o una línea celular. Preferiblemente, estas células o líneas celulares son, entre otras, miocitos en cultivo, células en cultivo de músculo liso, células en cultivo de músculo liso de arteria coronaria, células HepG2, células Jurkat, células THP-1, células Monomac-6 o células U937. Estas células se obtienen fácilmente a partir de fuentes conocidas en el campo como, por ejemplo, DSMZ, Braunschweig o la ATCC, EE.UU. Además, se pueden utilizar cardiomioblastos como "célula in vitro" para la adaptación a un "sustitutivo".

Este paso de adaptación (paso d. Del método para la preparación de un sustitutivo in vitro descrito anteriormente) puede incluir la exposición de dicha célula in vitro a uno o varios cambios físicos o químicos; entre los físicos se encuentran cambios de temperatura, de luz, de presión, de pH, de fuerza iónica o de composición de la fase o fases gaseosas (como O_{2}, N_{2}, CO, CO_{2}) y entre los químicos se encuentran intercambios, sustituciones, eliminación o adición de los medios de cultivo. Especialmente se prefiere que estos cambios químicos incluyan la exposición a compuestos del tipo factores de crecimiento, hormonas, vitaminas, anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos, ligandos de moléculas pequeñas, citocinas, factores de transcripción, quinasas, antibióticos, ligandos de receptores naturales o no o componentes de vías de transducción de señales. Este paso de adaptación también puede incluir el cocultivo con otras células o líneas celulares; por ejemplo, cocultivo con células hemáticas, células gliales, células dendríticas u osteoclastos. Las células hemáticas pueden ser monocitos o linfocitos T.

En el método descrito anteriormente para la preparación de un sustitutivo in vitro, la citocina puede ser IFN-\gamma (o un derivado funcional de la misma), el ligando de receptor natural o no natural puede ser un ligando para el receptor de IFN-\gamma (cadena a o b), el factor de transcripción puede ser IRF-1 o ISGF3-\gamma-(p48), la quinasa puede ser tirosina quinasa Pyk2, los componentes de las vías de transducción de señales pueden ser Dap-1, BAG-1, Pim-1 o proteína 9-27 inducible por IFN-\gamma, el factor de crecimiento puede ser el factor de crecimiento plaquetario AA, angiotensina o factor de crecimiento de fibroblastos y el antibiótico puede ser rapamicina.

En este contexto, el término "derivado funcional" de IFN-\gamma está relacionado con derivados que retienen, o retienen esencialmente, las propiedades biológicas del IFN-\gamma natural. Las muteínas son ejemplos de estos derivados. Lo mismo se puede aplicar, mutatis mutandis, al resto de componentes mencionados.

Los sustitutivos in vitro obtenidos a través de los métodos antes descritos son de especial utilidad en los métodos de selección de fármacos o en los análisis toxicológicos. Esos métodos comprenden, entre otros, la detección del patrón de expresión génica modificado tras la puesta en contacto de dicho sustitutivo in vitro con una sustancia de ensayo o un posible candidato a fármaco. Estos métodos de selección son ampliamente conocidos en el campo y están descritos en, entre otros, Scherf, Nat. Genetics 24 (2000), 236-244; Ross, Nat. Genetics 24 (2000), 227-235. Los cribados de alto rendimiento están descritos o revisados en Sundberg, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2000), 47-53; Hopfinger, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2000), 97-103; Vidal, Trends Biotechnol. 17 (1999), 374-381; Gonzales, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1989), 624-631; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol. 2 (1998), 597-603.

Además, la presente invención está relacionada con un método de identificación de los genes expresados diferencialmente en una muestra de ensayo, método que incluye los siguientes pasos: (a) proporcionar una muestra de ensayo y una muestra control, conteniendo cada una de ellas RNA poliadenilado; (b) utilizar los pasos del método para la amplificación de mRNA de la presente invención en dichas muestras de ensayo y control; y (c) comparar el cDNA amplificado obtenido de dicha muestra de ensayo con el cDNA amplificado obtenido de dicha muestra control. Las muestras de ensayo y control pueden proceder del mismo organismo así como de diferentes organismos o individuos. Además, dicha muestra de ensayo puede contener cultivos tisulares o cultivos celulares. Dicha muestra de ensayo o muestra control también puede estar formada por el mismo tipo de células o tejidos. La comparación del paso (c) puede llevarse a cabo, por ejemplo, como se muestra en los ejemplos anexos y puede implicar la hibridación del cDNA amplificado obtenido con arrays de cDNA. Por lo tanto, el método para identificar genes expresados de forma diferencial puede comprender la comparación de tejido, (un número reducido de) células o una célula individual de origen diferente. Por ejemplo, se pueden comparar el tejido, (número reducido de) células o célula individual patológicos y no patológicos a nivel de transcriptoma.

La presente invención también está relacionada con un método de identificación de un candidato a fármaco para la prevención o el tratamiento de un trastorno patológico o una alteración patológica que comprende los siguientes pasos: (a) puesta en contacto de una muestra que contiene RNA poliadenilado con dicho candidato a fármaco; (b) utilización de los pasos del método de amplificación de mRNA de la presente invención en esta muestra; y (c) detección de la presencia, ausencia, aumento o descenso de determinados genes expresados en dicha muestra.

La muestra a poner en contacto con el candidato a fármaco puede ser un órgano aislado, tejido, (número reducido de) células o una célula individual. Esta muestra también puede ser una muestra de cultivo tisular o celular. Además, también se preve que un animal o un sujeto de laboratorio puede entrar en contacto con dicho candidato a fármaco y que tras este contacto o durante el mismo se obtiene una muestra mediante biopsia, por ejemplo.

Además, la presente invención proporciona un método para la detección in vitro de un trastorno patológico o de la sensibilidad frente a un trastorno patológico en un sujeto que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una muestra que contiene RNA poliadenilado de dicho sujeto; (b) utilizar el método de amplificación de mRNA de la presente invención en dicha muestra; y (c) detectar un trastorno patológico o la sensibilidad frente a un trastorno patológico basándose en la presencia, ausencia, aumento, descenso o cantidad de un gen o genes expresados en dicha muestra.

La presencia, ausencia, aumento, descenso o cantidad pueden detectarse, entre otros, mediante la comparación del cDNA o los cDNA obtenidos con el cDNA o los cDNA de una muestra control sana. La muestra o muestras pueden ser de origen humano.

Además, la presente invención describe la utilización del cDNA amplificado obtenido a través del método de la invención para la expresión in vitro o in vivo. En este campo se conocen ampliamente métodos para la expresión in vitro o in vivo y están descritos, entre otros, en "Current Protocoles in Molecular Biology", editado por Ausubel et al., John Wiley & Sons, EE.UU. (1988); en Schoelke, Nature Biotech., 18, 233-234 (2000) o en "Biotechnology", editado por Rehn y Reed, VCM Verlagsgeseiischaft mbH, Weinheim, FRG, (1993). Además, la expresión in vitro en células vegetales está descrita en Weissbach, "Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, San Diego, EE.UU. (1988). Los sistemas en particular preferidos para la expresión in vitro son los sistemas de traducción conocidos en el campo, como lisados de E. coli para la transcripción/traducción acoplada (Basset, J. Bacteriol., (1983) 156, 1359-1362), sistemas de traducción derivados del germen de trigo o lisados reticulocíticos (Walter, Methods Enzymol., 93, 682-691 (1983); Dasnahapatra, Methods Enzymol., 217, 143-151 (1993); Hancock, Methods Enzymol., 255, 60-65 (1995); Wilson, Methods Enzymol., 250, 79-91 (1995)). La expresión in vitro o in vivo del cDNA amplificado comprende tanto sucesos de transcripción como de traducción y, por tanto, comprende la generación de mRNA además de, si se desea, proteínas o péptidos. Por esta razón, la presente invención también está relacionada con el uso del cDNA amplificado obtenido mediante el método de la presente invención para la preparación in vitro o in vivo de transcritos de mRNA.

La presente invención también describe la utilización del cDNA amplificado obtenido mediante el método de la presente invención o de los transcritos de mRNA antes definidos y obtenidos mediante la expresión in vitro o in vivo del cDNA obtenido a través del método de la presente invención, en ensayos de hibridación o en ensayos de interacción.

Es preferible realizar estos ensayos de hibridación bajo unas condiciones definidas. Especialmente se prefiere que estas condiciones de hibridación sean astringentes. Sin embargo, el término "de hibridación" tal como se emplea en relación con la presente invención está relacionado con condiciones de hibridación tanto de astringencia como de no astringencia. Estas condiciones de hibridación pueden establecerse de acuerdo con protocolos convencionales descritos en, por ejemplo, Sambrook, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989); Ausubel, "Current Protocoles in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989); o Higgins and Hames (eds) "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press Oxford, Washington DC, (1985).

Este ensayo de hibridación puede incluir la hibridación con arrays de oligonucleótidos, arrays de cDNA o arrays de PNA; el ensayo de interacción puede incluir la interacción con carbohidratos, lectinas, ribozimas, proteínas, péptidos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o aptámeros.

Los arrays arriba mencionados son ampliamente conocidos en el campo (véase, entre otros, Debouck, Nat. Genet. 21, 48-50 (1999); Hacia, Nat. Genet., 21, 42-7 (1999); Cole, Nat. Genet., 21, 38-41 (1999); Bowtell DD., Nat. Genet., 21, 25-32 (1999); Cheung, Nat. Genet., 21, 15-19 (1999); Duggan, Nat. Genet., 21, 10-14 (1999); Southern, Nat. Genet., 21, 5-9 (1999)).En concreto, los arrays de cDNA se pueden obtener a partir de Clontech, Palo Alto o de Research Genetics, Huntsville e incluyen microarrays de cDNA; los arrays de oligonucleótidos pueden obtenerse a partir de Affymetrix, Santa Clara. La preparación de los arrays de cDNA puede seguir, entre otros, los métodos descritos en De Risi, Nat. Genet. (1996), 14, 457-460; Lashkari, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 94, 13057-13062 (1997); Winzeler, Methods Enzymol., 306, 3-18 (1999); o Schena (1995), loc. cit.; la de los arrays de oligonucleótidos puede seguir, entre otros, los descritos en Southern (1999), loc. cit.; Chee, Science, 274, 610-614 (1996). Los arrays mencionados pueden incluir tanto macroarrays como microarrays.

Tal como muestran los ejemplos anexos, el cDNA obtenido mediante el método de la presente invención (o transcritos de mRNA de dicho cDNA) se puede emplear en arrays o en microarrays de cDNA para deducir el patrón de expresión génica o transcriptoma de una muestra (de ensayo) que contiene RNA poliadenilado.

Los ensayos de hibridación descritos anteriormente son útiles, entre otros, en aplicaciones médicas, diagnósticas, farmacológicas y, también, científicas. Como se muestra en los ejemplos anexos, es posible emplear DNA obtenido mediante el método de la presente invención para deducir el patrón de expresión génica de células o tejidos patológicamente modificados, por ejemplo tejidos (células) tumorales, o tejido reestenótico.

Los ejemplos anexos documentan, entre otros, que el método de la presente invención se puede utilizar para deducir genes expresados diferencialmente en tejido reestenótico. De este modo se identificaron 224 genes que se expresan de manera diferencial en reestenosis, de los que 167 genes fueron sobreexpresados y 56 genes infraexpresados en comparación con los controles. Por lo tanto, la detección de genes expresados diferencialmente o patrones de expresión génica específicos también se puede utilizar en métodos diagnósticos con el fin de definir, entre otros, tejido reestenótico. Además, como se describe en los ejemplos anexos, el método de la presente invención puede resultar útil para el diagnóstico de enfermedades neoplásicas, cáncer.

Por esta razón, el cDNA amplificado obtenido mediante el método de la presente invención es particularmente útil en el establecimiento de perfiles de expresión génica de tejidos o células. Estos perfiles de expresión génica/patrones de expresión génica pueden ser de particular utilidad e importancia en los cribados de búsqueda de fármacos. En concreto, se prefiere que los datos obtenidos mediante esta realización de perfiles de expresión génica se utilicen junto con patrones de actividad farmacológica (véase, entre otros, Weinstein, Science 275 (1997), 343-349; Weinstein, Science 258 (1992), 447-451; van Osdol, J. Natl. Cáncer Inst. 86 (1994), 1853-1859; o Pauli, J. Natl. Cáncer Inst. 81 (1989), 1088-1092). Además, se preve el empleo del cDNA obtenido a través del método de la presente invención o de transcritos de mRNA del mismo en ensayos en los que se correlacionan patrones de expresión génica y perfiles de actividad farmacológica como se describe en Scherf, Nat. Genetics 24 (2000), 236-244 y en Ross, Nat. Genetics 24 (2000), 227-235. También es posible correlacionar, como se demuestra en los ejemplos anexos, los datos referentes al "transcriptoma" obtenidos a través de los métodos de la invención descritos anteriormente, a nivel de proteínas.

La presente invención también describe la utilización del cDNA amplificado obtenido mediante el método de la invención para las PCR específicas de secuencia, la clonación de cDNA, la clonación por hibridación sustractiva o la clonación por expresión. Por ejemplo, es posible utilizar la PCR específica para determinar la cantidad relativa de transcritos en una muestra dada y entre muestras. También se puede aplicar el cDNA generado por la presente invención a la clonación por hibridación sustractiva para seleccionar cDNA específicos de la muestra o ausentes de ella, lo que se demuestra en los ejemplos anexos (Rothstein, Methods Enzymol. 225, 587-610 (1993); Diatchenko, Methods Enzymol., 303, 349-380 (1999)).

En una realización preferida, los adaptadores-cebadores Eco 44 I : 5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CTC GCC CGG GCA GG-3' (ID SEC NÚM.: 31), Eco 12 I: 5'-AAT TCC TGC CCG-3' (ID SEC NÚM.: 32), Eco 43 II : 5'-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG TCG CGT GGT GCG GAG GGC G-3' (ID SEC NÚM.: 33) o Eco 12 II : 5'-AAT TCG CCC TCC-3' (ID SEC NÚM.: 34) se pueden emplear con el método antes mencionado , es decir, el análisis por hibridación sustractiva. En otra realización preferida, los cebadores P1-30 : 5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG-3' (ID SEC NÚM: 35), P2-30 : 5'-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG TCG CGT-3' (ID SEC NÚM: 36), P1-33: 5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CTC-3' (ID SEC NÚM.: 37), P2-33: 5'-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG TCG CGT GGT-3' (ID SEC NÚM: 38), PN1-30: 5'-CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CTC GCC-3' (ID SEC NÚM: 39) o PN2-30 : 5'-GTG AAG ACG ACA GAA AGG TCG CGT GGT GCG-3' (ID SEC NÚM: 40) se pueden utilizar para la amplificación de las poblaciones de cDNA posiblemente resultantes del análisis de hibridación sustractiva antes mencionado. En una realización más preferida los cebadores P1-3O: 5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG-3' (ID SEC NÚM.: 35), P2-3O: 5'-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG TCG CGT-3' (ID SEC NÚM.: 36) se utilizan para el método anteriormente mencionado tal como muestran los ejemplos anexos.

La presente invención también proporciona un equipo que contiene al menos un cebador como los aquí antes descritos.

Opcionalmente, el equipo de la presente invención también proporciona, además de dicho cebador o cebadores, soportes sólidos (como microesferas magnéticas), enzimas (como transcriptasas inversas), RNA ligasa o desoxinucleotidiltransferasa terminal, así como un tampón o tampones de reacción (como "tampón de lavado" o "tampón de adición de cola" de cDNA) o una solución o soluciones de conservación.

Además, cabe la posibilidad de que partes del equipo de la invención estén empaquetadas individualmente en viales o combinadas en unidades contenedoras o multicontenedoras. El equipo de la presente invención puede utilizarse para llevar a cabo el método o métodos de la invención y, entre otros, emplearse en una diversidad de aplicaciones antes descritas, por ejemplo, en equipos de diagnóstico o como herramientas de investigación. El equipo de la invención puede contener adicionalmente sistemas de detección adecuados para fines diagnósticos o científicos. La fabricación de los equipos sigue preferiblemente procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia.

Las Figuras muestran:

Fig. 1: parámetros que determinan el éxito de la amplificación. a) Se aislaron individualmente veinte células HT29 de carcinoma de colon ((ATCC: HTB-38) carriles 1-20) y se sometió su mRNA a transcripción inversa en presencia de diferentes concentraciones de cebadores hexámeros aleatorios (carriles 1-5, 80 \muM; carriles 6-1O, 8 \muM; carriles 11-15, 0,8 \muM; carriles 16-20, 0,08 \muM). Posteriormente se sometió a ensayo una décima parte del cDNA para detectar el transcrito k-ras mediante PCR específica de gen. b) Influencia de la cola de homopolímero sobre la sensibilidad. Se aisló un fragmento del TGF-\alpha de 350 pb, se diluyó y se le añadió una cola de dA o bien de dG. Mediante PCR se analizaron diluciones en serie utilizando cebadores que contenían poli-dT o poli-dC, respectivamente, y un cebador con la secuencia del TGF-\alpha. Las diluciones que dan información se muestran en duplicados. (carriles 1+2, control negativo; carriles 3+4, dilución de 10^{-3}; carriles 5+6, dilución de 10^{-5}). c) Al mRNA cebado con FL4-N6 y sometido a transcripción inversa se le añadió una cola de dG y fue amplificado utilizando los cebadores CP3 + FL4 (carriles 1-3) o CP2 + FL4 a diferentes temperaturas de hibridación (carriles 1+4, 68ºC; carriles 2+5, 65ºC; carriles 3+6, control negativo). d) Se sometió a transcripción inversa a una cantidad idéntica de mRNA a la transcrita en c) utilizando el cebador CFL5cN6, y se amplificó con el cebador CP2. Una cantidad igual de cDNA a la transcrita en c) (carriles 3+4) dio lugar a una amplificación de una gran variedad de fragmentos de cDNA; el mismo resultado lo dio una dilución 1:200 (carriles 1+2) a diferentes temperaturas de hibridación (carriles 1+3, 68ºC; carriles 2+4, 65ºC; carril 5, control negativo).

Fig. 2: PCR específica de gen para \beta-actina y varios transcritos MAGE utilizando cDNA no amplificado recogido de células A431 como control positivo (+) y productos de amplificación de células A431 individuales (carriles 24 y 68) que, previamente a la PCR global, se dividieron en dos mitades (a+b). Se realizaron dos experimentos independientes (carriles 1-4 y 5-8) con los carriles 1 y 5 como controles negativos para la PCR global.

Fig. 3: perfiles de HGC de dos leucocitos normales (rojo) y dos células de cáncer de mama MCF-7 (azul), el DNA genómico de las cuales se aisló del sobrenadante tras el aislamiento del mRNA. Las proporciones cromosómicas de las células normales se encuentran en las líneas discontinuas, marcando el umbral de significación, mientras que los perfiles de las células cancerosas son similares por lo que respecta a sus amplificaciones y deleciones cromosómicas.

Fig. 4: perfil de HGC de célula B derivada de un paciente con cáncer de mama que presenta un tumor primario muy pequeño (fase T1a). Las deleciones cromosómicas están marcadas con una barra roja a la izquierda del símbolo de cromosoma y las adiciones cromosómicas con una barra verde a su derecha.

Fig. 5: Diagrama que ilustra los genes comunes y los expresados diferencialmente de las células B, C y L.

Fig. 6: hibridación de la célula L (izquierda); matriz de posiciones y nombres de los cDNA inmovilizados. Los genes se colocaron en duplicados en diagonal, con los símbolos de gen azules orientados de la esquina superior izquierda a la esquina inferior derecha y los símbolos de gen rojos orientados de la esquina superior derecha a la esquina inferior izquierda.

Fig. 7: Tinciones inmunohistoquímicas de neoíntima procedente de reestenosis intra-stent de arteria coronaria humana para van Giesson (panel izquierdo) y \alpha-actina de músculo liso (panel derecho). El experimento mostrado es representativo de tres especímenes independientes. Las barras indican 100 \mum.

Fig. 8: PCR con un cebador específico de gen para \beta-actina (carriles 1), EF-l\alpha (carriles 2) y \alpha-actina (carriles 3) como control de una amplificación por PCR satisfactoria de la primera cadena de cDNA generada a partir de un espécimen tisular microscópico. Se muestra un caso representativo de cada grupo de estudio (panel derecho: paciente B; panel izquierdo: donante b control). También se muestra la posición de tres marcadores de tamaño (M).

Fig. 9: análisis de array de cDNA. Se muestra el mismo array en tres experimentos de hibridación independientes en que se compara mRNA aislado de neoíntima (panel A) o de un vaso control (panel B), y en ausencia de una muestra biológica (panel C). El array de cDNA contenía 588 genes entre los que incluía nueve genes "housekeeping" y tres controles negativos [DNA de cadena M13 mp 18 (+); DNA lambda; DNA pUC18]. El experimento aquí mostrado es representativo de los experimentos de hibridación con 10 especímenes de neoíntima y 10 de control. Los círculos indican cuatro señales de hibridación (A-D) expresadas de manera diferencial entre la reestenosis y el control.

Fig. 10: perfiles de transcripción de muestras microscópicas de neoíntima intra-stent humana y vasos control. Cada columna representa un análisis de expresión génica de un único espécimen para 53 genes seleccionados. Las flechas indican genes que muestran una regulación positiva o negativa significativa en la neoíntima frente al control. Al final se muestran ocho genes "housekeeping" con una alta expresión. Un valor gris corresponde a una intensidad de señal mostrada al final de la figura.

Fig. 11: verificación mediante PCR específica de gen de los mRNA expresados diferencialmente procedentes de arrays de cDNA. A la derecha se indica el tamaño del fragmento de PCR esperado.

Fig. 12: tinción inmunohistoquímica para la proteína FKBP12 de la neoíntima procedente de una reestenosis de arteria carótida. El experimento mostrado es representativo de tres experimentos independientes. Las barras representan una distancia de 100 \mum. El panel A muestra una tinción de hematoxilina-eosina, los paneles B a D muestran una tinción para FKBP12 de la zona limítrofe entre la media sana y la neoíntima (panel B), de la media control sana (panel C) y del tejido neointimal (panel D).

Fig. 13: análisis de la expresión génica en arrays de cDNA. Se hibridaron cuatro microarrays Clontech Atlas, que contenían un total de 2435 cDNA humanos, con cDNA marcado con Dig-dUPT preparado a partir de RNA de neoíntima intra-stent (n=10) y de media/íntima control (n=11) como se describe en Materiales y Métodos. Los puntos indican la media de la expresión relativa de los dos grupos examinados. El panel A muestra la expresión de todos los genes examinados en este estudio. El panel B muestra la expresión de los 224 genes expresados diferencialmente, que fueron inducidos o reducidos en neoíntima en más de 2,5 veces y que mostraron una significación estadística de p<0,03 en el test de Wilcoxon. En esta presentación el valor de cero se reemplazó por un valor de 0,0001, ya que un valor de cero no se puede representar en una escala logarítmica.

Fig. 14: imagen en "cluster" que muestra las diferentes clases de perfiles de expresión génica de los doscientos veinticuatro genes cuyos niveles de mRNA eran diferentes entre la neoíntima y el control. Este subconjunto de genes se agrupó en cuatro grupos teniendo en cuenta su expresión en diferentes tipos celulares. El patrón de expresión de cada gen de este conjunto se representa aquí con una banda horizontal. Cada columna representa el nivel medio de expresión de mRNA del grupo examinado. Para cada gen, la media del nivel de mRNA de la neoíntima (n=10), del control (n=11), de células del músculo liso de arterias coronarias (CASMC) proliferativas (n=2) y de muestras sanguíneas (n=10) normalizados según el nivel de expresión de mRNA de los genes "housekeeping" está representada por un color, de acuerdo con la escala de color situada debajo. El grupo I contenía genes expresados solamente en el espécimen de neoíntima (Fig. 14A). El grupo II contenía genes expresados simultáneamente en la neoíntima y en CASMC proliferativas (Fig. 14B). El grupo III consistía en genes cuyos mRNA se expresaban tanto en la neoíntima como en la sangre (Fig. 14C). El grupo IV contenía genes cuyos mRNA se sobreexpresaban en el espécimen control (Fig. 14D).

Fig. 15: vista ampliada del cluster de factores de transcripción que contiene 14 genes que fueron regulados positivamente en la neoíntima frente al control y tres factores de transcripción que fueron regulados negativamente en la neoíntima. En este caso, cada columna representa un único espécimen y cada fila representa un único gen.

Fig. 16: Vista ampliada del cluster asociado a IFN-\gamma que contiene 32 genes que fueron regulados positivamente en la neoíntima frente al control. En este caso, cada columna representa un único espécimen y cada fila representa un único gen.

Fig. 17: tinciones inmunohistoquímicas de la neoíntima de una reestenosis carotídea y de la media sana control para la proteína IRF-1 (panel izquierdo: media control; panel derecho: neoíntima). El experimento mostrado es representativo de seis experimentos independientes.

Fig. 18: tinción inmunohistoquímica de la neoíntima de una intra-stent coronaria para la proteína IRF-1. El panel A muestra una tinción hematoxilina-eosina del espécimen neointimal procedente de reestenosis intra-stent, el panel B muestra una tinción para el marcador \alpha-actina de células de músculo liso, el panel C muestra la tinción inmunohistoquímica para el factor de transcripción IRF-1 en la neoíntima de una reestenosis intra-stent y el panel D muestra la tinción inmunohistoquímica para CD3. El experimento aquí mostrado es representativo de tres experimentos independientes.

Fig. 19: vista del cluster asociado a IFN-\gamma que contiene los 32 genes que fueron regulados positivamente en la neoíntima frente al control comparado con la expresión en CASMC en cultivo y con CASMC en cultivo estimuladas durante 16 h con 1000 U/mL de IFN-\gamma. En este caso, cada columna representa un único espécimen y cada fila representa un único gen. Un valor gris corresponde a una intensidad de señal mostrada al final de la figura.

Fig. 20: tinción doble de células tumorales diseminadas en médula ósea. Se realizó la tinción para citoqueratina (fluorescencia roja) y EMMPRIN (azul) de células en pequeños agregados (de siete y dos células) en el panel superior y una única célula detectada en médula ósea de dos pacientes diferentes.

Fig. 21: expresión diferencial del receptor de transferrina (CD71) en células tumorales. Tinción DAPI de núcleos celulares (panel izquierdo); hallada una regulación positiva de la expresión de CD71 en tejido tumoral (panel derecho).

Fig. 22: Efecto de IFN-\gamma sobre la supervivencia de las células del músculo liso (del inglés, SMC) en cultivo. Análisis de citometría de flujo de apoptosis espontánea (paneles A y C) e inducida por H_{2}O_{2} (paneles B y D). Las células fueron sometidas a una tinción doble con Anexina V marcada con FITC y PI (yoduro de propidio) a las 6 h del tratamiento con 100 \mumol/l de H_{2}O_{2}. Se muestra un análisis representativo de cinco experimentos independientes.

Fig. 23: El efecto de una mutación nula en el receptor de IFN-\gamma sobre el desarrollo de la neoíntima en un modelo de reestenosis de ratón. (A-D) se muestran microfotografías representativas de secciones de arterias carótidas de ratón procedentes de ratones wild type (wt) y ratones IFN-\gammaR^{-/-} knockout (ko) para la arteria no tratada (control) y la arteria contralateral ligada (ligada) a las cuatro semanas de la ligación. Se utilizó el procedimiento de tinción de van Giesson. Las barras representan una longitud de 100 \mum. (E) Los datos procedentes de 16 ratones wild type y 11 ratones
IFN-\gammaR^{-/-} se muestran como media \pm EEM (barras) y se analizan mediante el test-t para muestras independientes. La escala proporciona el grosor de la media y la en \mum. Columnas abiertas: animales control antes y después de la ligación de carótida; columnas llenas: animales knockout antes y después de la ligación de carótida. El área sombreada indica el grosor de la neoíntima.

Fig. 24: Diagrama de flujo del análisis SSH realizado con células individuales o pequeñas muestras celulares.

Fig. 25: cribado de colonias mediante transferencia Southern blot utilizando como sondas un driver y un tester marcados. Los carriles 1 a 9 corresponden a colonias obtenidas tras la sustracción. La colonia #4 fue identificada como ESE1, un factor de transcripción específico del epitelio. M = marcador de peso molecular.

Fig. 26: expresión diferencial de ESE1 en células tumorales analizadas mediante PCR y electroforesis en gel. Carriles 1 a 4, células individuales de cáncer de mama; 5 a 7, médula ósea de donantes sanos. M = marcador de peso molecular.

A partir de ahora se describirá la invención en referencia a los siguientes ejemplos biológicos que son meramente ilustrativos y no deben entenderse como una limitación del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1

Generación y amplificación global de los cDNA de células individuales

La cantidad de mRNA procedente de células individuales es demasiado baja para su utilización directa en el análisis de transcriptoma basado en arrays. El límite de detección para las aproximaciones de marcaje directo se describió en un RNA total a partir de 50.000 células (10 \mug) (Mahadevappa, Nat. Biotechnol, 17, 1134-1136 (1999)). Mediante un paso de amplificación linear, este número podría reducirse hasta 1000 células (Luo, Nat. Med., 5, 117-122 (1999)), lo cual está todavía muy lejos de ser aplicable en el estudio de células micrometastásicas. Por esta razón es necesaria la transcripción inversa de mRNA y la amplificación del cDNA. El desarrollo de un procedimiento de amplificación global y no sesgado resulta clave. Este enfoque consiste, de manera simplificada, en cuatro pasos básicos: (1) aislamiento del mRNA sobre un soporte sólido recubierto con oligo-dT, (2) síntesis de cDNA utilizando cebadores aleatorios que contengan una región flanqueante 5'-oligo-dC (o dG), (3) reacción de adición de cola en 3' con dGTP (o dCTP) generando una región flanqueante 3'-oligo-dG, seguido de (4) amplificación basada en cebador único utilizando un cebador que hibride con las regiones flanqueantes oligo-dG (o -dC) de las moléculas de cDNA. Fue necesario eliminar el tRNA y el rRNA para poder completar estos cuatro pasos básicos y obtener una elevada sensibilidad y fiabilidad en la síntesis de cDNA, la adición de una cola en 3' y la amplificación por PCR.

Además, las concentraciones de cebadores aleatorios para la síntesis de cDNA eran de 2000 a 8000 veces mayores que en los enfoques basados en oligo-dT anteriormente descritos (Brady, Methods Enzymol., 225, 611-623 (1993), Trumper, Blood, 81, 3097-3115 (1993)), que empleaban 10 nM de cebadores para síntesis de cDNA. Se procesaron y aislaron individualmente veinte células de carcinoma de colon HT29 (ATCC: HTB-38). Tras la lisis celular en tampón de síntesis de cDNA que contenía el detergente Igepal, se formaron grupos de cinco células y se sometieron a transcripción inversa con cuatro concentraciones diferentes de cebadores para síntesis de cDNA aleatorios. La síntesis de cDNA fue sometida a ensayo para cada concentración mediante RT-PCR específica de gen. La fig. 1a muestra que unas concentraciones mayores de cebadores aleatorios para la síntesis de cDNA conllevan unos mayores índices de detección de transcritos específicos (p. ej. k-ras). Por lo tanto, el exceso de cebador, puesto que es un competidor efectivo de la posterior reacción de adición de cola y de amplificación, preferiblemente se eliminó antes de realizar ambos pasos. Asimismo, unas concentraciones elevadas de dNTP mejoraban la síntesis de cDNA pero interferían con la posterior reacción de adición de cola y era necesario eliminarlos. El tampón estándar de adición de cola con cacodilato interfería con la ulterior PCR y fue reemplazado por un tampón KH_{2}PO_{4} de baja fuerza iónica (Nelson, Methods Enzymol., 68, 41-50 (1979). La captura de mRNA sobre microesferas magnéticas recubiertas de oligo-dT proporcionó un manejo simple durante los pasos de aislamiento de mRNA y de intercambio de tampón. A continuación se describe brevemente y ejemplifica el aislamiento de células individuales, el aislamiento de mRNA, la síntesis de cDNA y la adición de cola en 3'.

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Se aislaron células tumorales a partir de médula ósea del modo descrito (Klein, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 96, 4494-4499 (1999)). Resumiendo, se tiñeron muestras viables de médula ósea durante 10 min con 10 \mug/ml de anticuerpo monoclonal 3B10-C9 en presencia de suero AB al 5% para evitar uniones inespecíficas. Se detectaron células positivas para 3B10 con anticuerpo de cabra conjugado con B-ficoeritrina anti IgG de ratón (The Jackson Laboratory) y se transfirieron a tubos de PCR en hielo. Se añadieron microesferas de oligo-dT, se lisaron las células en 10 \mul de tampón de lisis (Dynal), los tubos fueron rotados durante 30 min para capturar mRNA. Se añadieron 10 \mul de tampón 1 de lavado de cDNA (Dynal) que contenía Igepal al 0,5% (Sigma) y el mRNA unido a las microesferas se lavó en tampón 2 de lavado de cDNA (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl_{2}, 10 mM DTT, complementado con Tween-20 al 0,5% (Sigma)), se transfirió a un tubo nuevo y se lavó de nuevo en tampón 1 de lavado de cDNA para eliminar cualquier rastro de LiDS y DNA genómico. El mRNA fue sometido a transcripción inversa con Superscript II Reverse Transcriptase (Gibco BRL) utilizando los tampones proporcionados por el fabricante complementados con 500 \muM de dNTP, Igepal al 0,25%, 30 \muM de cebador Cfl5c8 (5'-(CCC)_{5} GTC TAG ANN (N)_{6}-3') y 15 \muM de CFL5cT (5'-(CCC)_{5} GTC TAG ATT (TTT)_{4} TVN, a 44ºC durante 45 min. Durante la reacción las muestras fueron rotadas para evitar la sedimentación de las microesferas. El cDNA se mantuvo unido a las microesferas paramagnéticas a través del mRNA y se lavó una vez en el tampón de lavado de colas (50 mM KH_{2}PO_{4}, pH 7,0, 1 mM DTT, 0,25% Igepal). Las microesferas se resuspendieron en tampón de adición de cola (10 mM KH_{2}PO_{4}, pH 7,0, 4 mM MgCl_{2}, 0,1 mM DTT, 200 \muM GTP) y los híbridos de cDNA-mRNA se desnaturalizaron a 94ºC durante 4 min, se enfriaron en hielo, se les añadieron 10 U de TdT (MBI-Fermentas) y se incubaron a 37ºC durante 60 min o 37ºC, 60 min y a 22ºC durante toda la noche. Tras la inactivación de la enzima de adición de cola (70ºC, 5 min), se añadió mezcla PCR-Mix I que consistía en 4 \mul de tampón I (Roche, Taq Long Template), formamida desionizada al 3% (Sigma) en un volumen de 35 \mul. Las sondas se calentaron a 78ºC en el ciclador de PCR (Perkin Elmer 2400), se añadió la PCR Mix II, con dNTP en una concentración final de 350 \muM, cebador CP2 (5'-TCA-GAA-TTC-ATG-CCC-CCC-CCC-CCC-CCC-3', concentración final de 1,2 \muM) y 5 Unidades de la Poly-Mix de DNA (Roche, Taq Long Template) en un volumen de 5 \mul para un procedimiento de inicio en caliente. Se realizaron 40 ciclos a 94ºC, 15 s, 65ºC, 30ºC, 68ºC, 2 min para los primeros 20 ciclos y una elongación de 10 s del tiempo de extensión en cada ciclo durante los 20 ciclos restantes, y un paso de extensión final a 68ºC, 7 min. Estas condiciones de amplificación por PCR difieren en gran medida de Brail, Mut. Res. Genomics, 406, 45-54 (1999). La temperatura de hibridación según Brail solo es de 42ºC durante 2 min en contraste con los 65ºC aplicados en este ejemplo del método de la invención.

La eficiencia de adición de colas así como la sensibilidad de la posterior PCR de secuencias con colas de poli-dA y poli-dG se evaluó utilizando un fragmento de cDNA definido con una cola de homopolímero tanto de poli-dA como de poli-dT. Los fragmentos con colas de poli-(dA) y poli-(dG) se diluyeron y luego se amplificaron mediante PCR utilizando cantidades iguales de cebadores poli(dT) y poli(dC), respectivamente. En estos experimentos se encontró que los cebadores poli-C unidos a colas de poli-G tenían al menos 100 veces más sensibilidad que los cebadores poli-T sobre colas de poli-dA (Fig. 1b, compárense los carriles 1,2 a 3,4)

Se compararon diversos cebadores de síntesis de cDNA que compartían la misma región flanqueante poli-dC en combinación con hexámeros aleatorios (N6), octámeros (N8), oligo-dT (dT)_{15} individuales o en combinación. Todos funcionaban bien y de manera fiable. Los mejores resultados se obtuvieron con una combinación de cebadores poli-dC -N8 y poli-dC-(dT)_{15} (datos no mostrados).

La mejora más destacable se obtuvo cuando se utilizó solamente un cebador (Fig. 1c) para la PCR global en lugar de dos (Fig. 1d). El cebador de síntesis de cDNA estaba formado por un hexámero aleatorio 3' y una región flanqueante que era o un tramo poli-dC (CFl5c) o una secuencia flanqueante de las cuatro bases (Fl4N6). Se realizaron ensayos con dos cebadores de unión a poli-dC en combinación con un cebador adicional de unión a la secuencia complementaria Fl4 (Fig. 1c). La utilización de un cebador adicional (FL4) a los cebadores de unión a poli-dC (CP2, CP3) evitó la amplificación (Fig. 1c, carriles 1,2 y 4,5). Esto se debe probablemente a las concentraciones de cebador necesarias para una sensibilidad óptima. La utilización de solamente el cebador CP2 dio como resultado la amplificación de una gran variedad de moléculas de cDNA (0,2-3 kB). Incluso el cDNA altamente diluido (1:200) todavía era suficiente para la amplificación global (Fig. 1d).

Ejemplo II

Análisis del transcriptoma de células individuales: especificidad, reproductibilidad, sensibilidad y adecuación del análisis de arrays de cDNA

A través del protocolo optimizado de síntesis, adición de colas y amplificación de cDNA se analizaron células individuales aisladas de líneas celulares en cultivo. Se ha ensayado satisfactoriamente un total de 100 células individuales para la expresión de \beta-actina y EF1-\alpha mediante PCR específica de gen (datos no mostrados). Los cDNA para genes "housekeeping" se encontraron en un número de copias por célula suficiente para ser relativamente independientes de la región utilizada para la amplificación específica en la PCR secundaria. Para los transcritos menos abundantes, se percibió que el tamaño de la secuencia codificante escogida determinaba los índices de detección. La sensibilidad más elevada se obtuvo con una separación entre los dos cebadores de menos de 200 pb (datos no mostrados).

Se realizaron ensayos para determinar la adecuación de los productos de amplificación por PCR de células individuales a los análisis de arrays de cDNA. Con este fin, el cDNA obtenido se marcó con Dig (Digoxigenina). El Dig-UTP se incorporó mediante PCR. Para realizar el perfil de expresión se utilizaron 0,1-1 \mul de los fragmentos originales de cDNA amplificado por PCR para la reamplificación en presencia de dUTP marcado con digoxigenina (Boehringer Mannheim), dig-dUTP 50 \muM, dTTP 300 \muM y otros dNTP a una concentración final de 350 \muM. Las condiciones de reamplificación eran esencialmente las descritas anteriormente; las modificaciones fueron la utilización de 2,5 Unidades de la Poli Mix de DNA. Desnaturalización inicial a 94ºC durante 2 min seguida de 12 ciclos a 94ºC, 15 s, 68ºC, 3 min y un tiempo de extensión final de 7 min. Se detectaron transcritos específicos utilizando 1 \mul de una dilución 1/10 de la PCR original hasta un volumen final de 10 \mul.

La especificidad de la hibridación de las sondas marcadas con digoxigenina se describe en la Tabla 1, donde se muestra el patrón de expresión de genes de células individuales de diferente origen histogenético. Las células eran: MCF7 (número de ATCC HTB-22), A431 (número de ATCC CRL 1555), K-562 (número de ATCC CCL-243), JY (International Histocompatibility Workshop: IHW9287). Solo las células MCF-7 y A431 expresaron los genes de citoqueratina, marcadores de su origen epitelial, mientras que la célula K562 de eritroleucemia y la JY célula B transformada por EBV expresaron genes de origen hematopoyético, incluyendo CD33, CD37, CD38 y cadena ligera kappa en la célula B. Además, los genes MAGE específicos de testículo y de tumor tuvieron un alto grado de expresión en todas las células cancerosas a excepción de la célula B transformada víricamente. Estos datos muestran que los productos de amplificación por PCR de una célula individual sirven para los análisis de arrays de cDNA y proporcionan patrones de expresión génica de células individuales específicos de tipos celulares.

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TABLA 1 Expresión de genes histogenéticamente informativos por células individuales derivadas de tejidos diferentes TABLA I

	MCF-7	A431	K562	JY
Actina	+	+	+	+
EF-1a	+	+	+	+


CK7	+	+	-	-
CK10	-	+	-	-
CK13	-	+	-	-
CK18	+	+	-	-
CK19	+	+	-	-
EGP	+	+	-	-


CD33	-	-	+	+
CD37	-	-	+	+
CD38	-	-	+	-
Kappa	-	-	-	+
Vimentina	-	+	+	-


\alpha-6 Integrina	+	-	-	-
\beta-1 Integrina	+	-	-	-
\beta-2 Integrina	-	-	-	+
\beta-4 Integrina	-	-	+	-
\beta-7 Integrina	-	-	-	+
FAK	+	-	-	-


Mage 1	+	-	+	-
Mage 2	+	+	+	-
Mage 3	+	-	+	-
Mage 6	+	-	+	-
Mage 12	+	+	+	-

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Se aislaron células individuales en cultivo, se sintetizó y amplificó cDNA y este se híbrido en un array de genes histogenéticamente informativos. Las células provenían de las siguientes líneas celulares: MCF-7 (cáncer de mama), A431 (carcinoma epidermoide), K562 (leucemia mieloide crónica) y JY (línea de células B transformadas por el virus de Epstein-Barr).

Para poder evaluar la reproducibilidad, se comparó el patrón de expresión de cuatro células MCF-7 utilizando un array de cDNA de Generación 4 con 110 genes diferentes (Tabla 2). Los arrays de cDNA hechos a medida se prepararon de la siguiente manera. Los cDNA se amplificaron por PCR con cebadores específicos de gen de cDNA humano, los productos de amplificación por PCR se purificaron en gel y se colocaron 15 ng de DNA por producto de amplificación sobre membranas de nylon (Boehringer) utilizando un dispositivo robótico de colocación BioGrid (Biorobotics). A los macroarrays de DNA se les denominó Generación 4 y Generación 5 (véase a continuación).

Generación de filtro 4: los genes colocados fueron:

Nombre de proteína	Nombre HUGO	Nombre de proteína	Nombre HUGO

Citoqueratina 7	KRT7	slap	SLA
Citoqueratina 8	KRT8	p21	CDKN1A
Citoqueratina 10	KRT10	p68
Citoqueratina 13	KRT13	p27	CDKN1B
Citoqueratina l8	KRT18	Eck	EPHA2
Citoqueratina l9	KRT19	P33	ING1
Citoqueratina 20	KRT20	B61	EFNA1
Emmprin II	BSG	p53 III	TP53
MT1-MMP	MT1-MMP	E-Cad	CDH1
MT2-MMP	MT2-MMP	p53 IV	TP53
MT3-MMP	MT3-MMP	P-Cad	CDH3
MT4-MMP	MT4-MMP	p57	CDKN1C
TIMP1	TIMP1	N-Cad	CDH2
TIMP2	TIMP2	Ciclina D	CCND1
TIMP4	TIMP4	c-myc I	MYC
MMP1	MMP1	Gas1	GAS1
uPA	PLAU	c-myc II	MYC
Receptor de uPA	PLAUR	Ki-67	MK167
PaI1	PAI1	RB	RB1
PAI2	PAI2	b-Actina	ACTB
Catepsina B	CTSB	HTK	TK1
Catepsina D	CTSD	EF-la	EEF1A1
CatepsinaL	CTSL	RAD51	RAD51
Estromalisina 1	MMP3	A20	TNFAIP3
Estromalisina 3	MMP11	Nck	NCK1
Gelatinasa A	MMP2	BCL-2	BCL2
Gelatinasa B	MMP9	pBS
Matrilisina	MMP7	GAPDH	GHPDH
Cistatina 1	CSTA	hEST	TERT
Cistatina 2	CSTB	Mage 1	MAGEA1
Cistatina 3	CST3	TSP-1	THBS1
ADAM 8	ADAM8	Mage 3	MAGEA3
ADAM 9	ADAM9	mrp-1	ABCC1
ADAM 10	ADAM10	Mage 4	MAGEA4
ADAM 11	ADAM11	mdr-1	ABCB1
ADAM 15	ADAM15	Mage 6	MAGEA6
ADAM 20	ADAM20	DEP-1	PTPRJ
ADAM 21	ADAM21	Mage 12	MAGEA12
TACE	ADAM17	PTP-\mu	PTPRM
a4-Integrina	ITGA4	Mage1F	MAGEA1
a5-Integrina	ITGA5	Creatina Quinasa	CKM

(Continuación)

Nombre de proteína	Nombre HUGO	Nombre de proteína	Nombre HUGO

a6-Integrina	ITGA 6	Mage2F	MAGEA2
av-Integrina	ITGAV	Mage4F	MAGEA4
GFP		Mage 3F	MAGEA3
beta-Actina	ACTB	Mage 12F	MAGEA12
b1-Integrina	ITGB1	CD 16	FCGR3A
b2-Integrina	ITGB2	TGF-a	TGFA
b3-Integrina	ITGB3	CD33	CD33
b4-Integrina	ITGB4	TGF-b	TGFB1
b5-Integrina	ITGB5	CD34	CD34
b7-Integrina	ITGB7	VEGF	VEGF
p15	CDKN2B	CD37	CD37
Fak	PTK2	IGF-I	IGF1
p16	CDKN2A	CD38	CD38
Ramp-1		kappa	IGKC
CD40	CD40	TGF-b R.II	TGFBR1
Ramp-2		lambda	IGLC1
CD45 II	PTPRL	IGF-RI	IGFR1
EMM I	BSG	Vimentina	VIM
CD83	CD83	IGF-RII	IGFR2
GFP		EGP-1	M4S1
pBS		MUC18	MCAM
erb B2	ERBB2	DP-I	DSP
TCR	TCRA	PHRIP	PHLDA1
TGF-b Rec.I	TGFBR1	CEA	CEA
		EF-1a	EEF1A1

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TABLA 2 Genes expresados en común y diferencialmente de cuatro células MCF-7 individuales

4/4	3/4	2/4	1/4
EF-la	CK19	Beta-4-Integrina	CK10
GAPDH	TIMP-1	Beta-5-Integrina	CK13
b-Actina	Catepsina B	P53	ADAM 9
CK7	Catepsina D	Creatina	ADAM 15
		Quinasa
CK8	Catepsina L		ADAM17 (TACE)
CK18	ADAM 10		p16
CK20	c-myc		p21
Alfa			p27
6-Integrina
Beta1-Integrina			p33
Fak			ki-67
EMMPRIN			hTK
u-PAR			E-cadherina
Matrilisina			IGF-R I
Ciclina D1			IGF-R II
Eck			TGF-beta
EpCAM			VEGF
Mrp-1			DP-I
PHRIP

Heterogeneidad de la expresión génica de células individuales derivadas del mismo clon celular. Se analizaron cuatro células MCF-7 aisladas de un cultivo celular mediante el análisis de expresión génica de células individuales. Aparecen listados los transcritos que se detectaron en las cuatro células individuales (4/4), en tres de cuatro (3/4), en dos de cuatro (2/4) y en una de cuatro (1/4). En todas las células se detectaron 13/45 (39%) de genes expresados. El 61% de los genes solo se puedo encontrar en una porción de las cuatro células. Hubo 63 genes negativos para todas las células ensayadas.

Se expresaron 46 genes (42%) en por lo menos una célula y 63 (58%) fueron negativos para las cuatro células. Dieciocho de los 46 (39%) genes expresados se detectaron en las cuatro células mientras que los restantes 29 (61%) se encontró que estaban expresados heterogéneamente. Con el fin de evaluar si esta heterogeneidad se debía a la variación intercelular o si es un artefacto de la técnica, se realizó un ensayo para comprobar si la disparidad también se observaba con el cDNA de una célula A431 individual que se dividió para dos amplificaciones por PCR separadas. En un primer experimento, se llevaron a cabo PCR específicas de gen con los productos de PCR amplificados globalmente obtenidos a partir de un 50% de cDNA de célula individual (Fig. 2). Para comparar, se diluyó el cDNA aislado de una colección de 500.000 células A431 hasta un punto tal que la intensidad de la banda \beta-actina era similar a la obtenida con el 50% del cDNA de célula individual. Tras 32 ciclos y con una cantidad de cDNA correspondiente a unas 10.000 células, la señal de \beta-actina de la colección control y del 50% del cDNA de célula individual alcanzó la fase de meseta de la amplificación. Como se muestra en la Figura 2, la variación entre las dos mitades de cDNA de la misma célula era muy baja. En dos experimentos independientes, cada mitad (a+b) de seis células A431 proporcionó bandas de \beta-actina de intensidad similar.

Con el fin de comprobar la fiabilidad de la amplificación global del cDNA, se llevó a cabo una segunda amplificación por PCR específica de secuencia génica. Dado que se sabe que la eficiencia de la amplificación por PCR específica de gen depende de la secuencia del cebador, se analizó la amplificación de transcritos de MAGE, que son muy exigentes en lo que al diseño de cebador se refiere (Kufer, W098/46788 (1998); Serrano, Int. J. Cáncer 83, 664-669 (1999)). El nivel de expresión de MAGE determinado mediante una PCR específica de secuencia era sistemáticamente menor que el de la \beta-actina. La abundancia relativa de transcritos de MAGE en muestras de célula individual dividida tras una amplificación por PCR global del cDNA (Fig. 2, carriles 2-4 y 6-8) era comparable a la de la muestra control de cDNA no amplificado proveniente de colecciones de células (Fig. 2, +). En cuatro de cada seis casos, los resultados fueron idénticos para ambas mitades del cDNA. La falta de cualquier transcrito MAGE en la mitad celular 7a y 8b indica muy probablemente una distribución desigual de los cDNA entre las dos mitades.

La amplificación independiente de secuencia observada es característica del cebador poli-dC, que contiene quince residuos de citosina y por tanto introduce sitios de unión de cebador con un contenido en CG-igual de elevado. Las condiciones experimentales adecuadas para este cebador, es decir, una elevada temperatura de hibridación (65ºC) en presencia de formamida desnaturalizante al 3%, provocaron una reproducibilidad considerable y no introdujeron cambios cuantitativos importantes en el transcriptoma de célula individual.

Se marcaron productos de amplificación de los cDNA de células individuales divididas y, como control, del cDNA de una colección de 5.000 células y se hibridaron con un array de cDNA que comprendía 193 genes diferentes. La mayoría de transcritos se pudieron detectar con ambas mitades de los productos de amplificación de células individuales (Tabla 3).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Patrones de expresión génica de células individuales divididas, previamente a la PCR global, en dos colecciones de cDNA comparados con una colección de cDNA de 5000 células

1

2

Los cDNA de dos células individuales se dividieron previamente a la amplificación por PCR y se compararon con una colección de cDNA derivado de 5000 células. Todos los cDNA se amplificaron mediante PCR global y se analizaron mediante hibridación con un array de cDNA. Los perfiles de expresión génica de las mitades correspondientes (1.1 y 1.2; 2.1 y 2.2) están yuxtapuestos a la colección celular (+). Los genes están clasificados según la intensidad de señal (a mayor oscuridad, mayor intensidad) y la detección en ambas mitades de la misma célula. Se utilizó el filtro Generación 5. Los nombres de los genes y proteínas aparecen listados a continuación (para la preparación de dicho filtro Generación 5, véase la descripción anterior del filtro Generación 4).

Generación de filtro 5

Proteína	HUGO
A20	TNFAIP3
a4-Int	ITGA4
a5-Int	ITGA5
A6-Int	ITGA6
ADAM10	ADAM10
ADAM15	ADAM15
ADAM21	ADAM21
ADAM9	ADAM9
Auto-Ag	SHGC-74292
av-Int	ITGAV
Axl	AXL
b1-Int	ITGB1
b2-Int	ITGB2
b3-Int	ITGB3
b4-Int	ITGB4
b5-Int	ITGB5
B61	EFNA1
b7-Int	ITG7
BA46	MFGE8
BAG1	BAG1
b-Actina	ACTB
b-Caseina	CSN2
Bcl-2	BCL2
Bcl-xl	BCL2L1
b-micro	MSMB
BTG-3/ANA	BTG3
Calmodulina	CALM1

(Continuación)

Proteína	HUGO
Catepsina B	CTSB
Catepsina D	CTSD
Catepsina L	CTSL
CD16	FCGR3A
CD24	CD24
CD33	CD33
CD34	CD34
CD37	CD37
CD38	CD38
CD40	TNFRSF5
CD44	CD44
CD45	PTPRC
CD83	CD83
CEA	CEA
CK10	KRT10
CK13	KRT13
CK18	KRT18
CK19	KRT19
CK7	KRT7
CK8	KRT8
Claud1	CLDN1
Claud3	CLDN3
Claud7	CLDN7
c-myc	MYCBP
Ciclina D1	CCND1
Cistatina A	CSTA
Cistatina B	CSTB
Decoy-R2	TNFRSF10D
Decoy-R3	TNFRSF6B
DEP-1	PTPRJ
DP-1	DSP

(Continuación)

Proteína	HUGO
E2F6	E2F6
E-Cad	CDH1
Eck	EPHA2
EF1a	EEF1A1
EGP1	M4S1
Emmprin	BSG
EPC-1	PEDF
erbB2	ERBB2
Ese1b/ELF3	ELF3
Fak	PTK2
FGFR1	FGFR1
FGFRII	FGFR2
Gadd45	GADD45A
GAPDH	GHPDH
Gas1	GAS1
Gas6	GAS6
GFP
hEST	TERT
Hevin	HEVIN
HTK	TK1
ICAM	ICAM
IGF RI	IGFR1
IGF RII	IGFR2
Kappa	IGKC
Ki67	MKI67
KIA169
Lambda	IGLC1
Lot1/hZAC	Hs.75825
Mage1	MAGEA1
Mage12	MAGEA12
Mage2f	MAGEA2

(Continuación)

Proteína	HUGO
Mage4	MAGEA4
MAT8	PLML
Mdr-1	ABCB1
MLN62	TRAF4
MLN64 TRAF4
mrp-1	ABCC1
MT1-MMP	MT1-MMP
Muc 18	MCAM
N-Cad	CDH2
Nck	NCK1
p15	CDKN2B
p16	CDKN2A
p21	CDKN1A
P27	CDKN1B
p33	ING1
P53III	TP53 (III)
P53IV	TP53 (IV)
P57	CDKN1C
p68
PAI-2	PAI2
pBS
P-Cad	CDH3
Fosfolipasa	PLD1
Frip	PHLDA1
PIP	PIP
Prohibitina	PHB
Homeo. espec. de próstata	Hs.73189
Transglu. espec. de próstata	TGM4
Uro. espec. de próstata	UPK3
Protimosina alfa	PTMA
PSA	KLK3

(Continuación)

Proteína	HUGO
PTHrP
PTP-\mu	PTPRM
RB	RB1
rfx-1	RFX1
Slap	SLA
Estromalisina 1	MMP3
survivina	API4
TACE	ADAM17
TCR	TCRA
TGF-alfa	TGFA
TGF-beta	TGFB1
TGFB-RI	TGFBR1
TGFB-RII	TGFBR2
TIE-2/TeK	TEK
TIG3	RARRES3
Timp1	TIMP1
TMP21	TMP21
TSP-1	THBS1
Tubulina-a	TUBA
Ubiquitina	UB
uPA	PLAU
Upa-R	PLAUR
Vimentina	VIM
VLDLR	VLDLR
ZNF217	ZNF217
	Hs 46452

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Se obtuvo un total de 148 señales para las cuatro mitades de cDNA. De estas, 95 (64%) se encontraron en las mitades correspondientes mientras que 53 (36%) solo se encontraron en una mitad. De las 53 señales positivas individuales, 46 (87%) representaban transcritos de muy baja abundancia, con 26 (49%) no detectables y 20 (37%) expresados solo débilmente en la colección de células control. Hubo siete genes (AXL, BAG1, BCL2L1 SHGC-74292, B61, TGFBR2 y ABCC1) que se detectaron exclusivamente en la colección de muestra, aunque con una señal relativamente débil. Por el contrario, hubo 33 genes que solo se encontraron en los experimentos de mitades celulares pero no en el control. La intensidad de señal de ambas mitades era bastante similar, teniendo el 55% y el 76% de las señales la misma intensidad en las mitades correspondientes. Las señales que no eran idénticas en dos mitades correspondientes pueden provenir de una distribución no aleatoria de fragmento de cDNA previa a la PCR. Particularmente, los transcritos presentes en un número de copias bajo (<10) pueden estar sujetos a este efecto de la distribución que, sin embargo, puede no obtenerse si las muestras no se dividen.

Ejemplo III

Análisis combinado del genoma y del transcriptoma de células individuales

Recientemente se ha descrito un método de análisis de hibridación genómica comparativa (HGC) de células individuales (SCOMP) (Klein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4494-4499 (1999)). Utilizando este método se puede identificar de forma inequívoca una célula tumoral a través de sus aberraciones cromosómicas. Por tanto se intentó aislar tanto el mRNA como el DNA genómicos de la misma célula. Se lisaron células individuales aisladas en 10 \mul de tampón de lisis (Dynal) y se rotaron los tubos durante 30 min para capturar mRNA. Se añadieron 10 \mul de tampón 1 de lavado de cDNA (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl_{2}, 10 mM DTT, complementado con 0,5% de Igepal (Sigma)) y se lavó el mRNA unido a las microesferas en tampón 2 de lavado de cDNA (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl_{2}, 10 mM DTT, complementado con Tween-20 al 0,5% (Sigma)), se transfirió a un tubo nuevo y se lavó de nuevo en tampón 1 de lavado de cDNA para eliminar cualquier traza de LiDS o de DNA genómico. El mRNA fue sometido a transcripción inversa con Superscript II Reverse Transcriptase (Gibco BRL) utilizando los tampones proporcionados por el fabricante complementados con 500 \muM de dNTP, Igepal al 0,25%, 30 \muM de cebador Cfl5c8 (5'-(CCC)_{5} GTC TAG ANN (N)_{8}-3') y 15 \muM de CFL5cT (5'-(CCC)_{5} GTC TAG ATT (TTT)_{4} TVN, a 44ºC durante 45 min. Durante la reacción las muestras fueron rotadas para evitar la sedimentación de las microesferas. Los cebadores utilizados y mencionados en la Fig. 1 c y d eran Cfl5cN6 (5'-(CCC)_{5} GTC TAG ANN (N)_{6}-3') Y FL4N6 5'-TTT CTC CTT AAT GTC ACA GAT CTC GAG GAT TTC (N)_{6}-3'). El cDNA se mantuvo unido a las microesferas paramagnéticas a través del mRNA y se lavó una vez en el tampón de lavado de colas (50 mM KH_{2}PO_{4}, pH 7,0, 1 mM DTT, Igepal al 0,25%). Las microesferas se resuspendieron en tampón de adición de cola (10 mM KH_{2}PO_{4}, pH 7,0, 4 mM MgCl_{2}, 0,1 mM DTT, 200 \muM GTP) y los híbridos de cDNA-mRNA se desnaturalizaron a 94ºC durante 4 min, se enfriaron en hielo, se les añadieron 10 U de TdT (MBI-Fermentas) y se incubaron a 37ºC durante 60 min o 37ºC, 60 min y a 22ºC durante toda la noche. Tras la inactivación de la enzima de adición de cola (70ºC, 5 min), se añadió mezcla PCR-Mix I que consistía en 4 \mul de tampón I (Roche, Taq Long Template), formamida desionizada al 3% (Sigma) en un volumen de 35 \mul. Las sondas se calentaron a 78ºC en el ciclador de PCR (Perkin Elmer 2400), se añadió la PCR Mix II, con dNTP en una concentración final de 350 \muM, cebador CP2 (5'-TCA-GAA-TTC-ATG-CCC-CCC-CCC-CCC-CCC-3', concentración final de 1,2 \muM) y 5 Unidades de la Poly-Mix de DNA (Roche, Taq Long Template) en un volumen de 5 \mul para un procedimiento de inicio en caliente. Se realizaron 40 ciclos a 94ºC, 15 s, 65ºC, 30 ^{0}C, 68ºC, 2 min para los primeros 20 ciclos y una elongación de 10 s del tiempo de extensión en cada ciclo durante los 20 ciclos restantes, y un paso de extensión final a 68ºC, 7 min. Los cebadores de PCR utilizados en la Fig. 1c fueron: CP3 (5'-GCT GAA GTG GCG AAT TCC GAT GCC (C)_{12}-3') y FL4 (5'-CTC CTT AAT GTC ACA GAT CTC GAG GAT TTC-3').

Se recogieron los sobrenadantes de la lisis celular y de todos los pasos de lavado (tampón de lavado de cDNA 1 y 2) del aislamiento de mRNA (volumen total de 60 \mul). Tras la transferencia a un tubo silanizado, el DNA genómico se precipitó con etanol durante toda la noche a -20ºC en presencia de 20 \mug de glicógeno (Roche). Todos los pasos posteriores se realizaron del modo publicado (Klein, (1999), loc. cit.).

Una de las preocupaciones principales era que la precipitación incompleta del DNA genómico acabara provocando pérdidas de DNA, como se ha visto con deleciones cromosómicas en células cancerosas. Sin embargo, experimentos realizados con células con un cariotipo definido mostraron claramente que o el DNA celular se perdía por completo (30% de los casos) o bien precipitaba completamente (70%) (datos no mostrados). La recuperación completa de DNA genómico puede deberse al hecho de que los cromosomas interfásicos se encuentran entrelazados en gran medida de manera que o precipitan todos o no precipita ninguno. Probablemente, la pérdida de todo el DNA se introduzca con el cambio de tubos de reacción durante la separación de DNA y mRNA genómicos. En la figura 3 se muestran los cariotipos de dos células normales y dos células de cáncer de mama MCF-7 cuyo DNA se había precipitado como se ha mostrado. Los perfiles de las dos células normales no mostraron ninguna desviación significativa de la línea media mientras que las múltiples aberraciones genómicas de las dos células MCF-7 eran prácticamente idénticas. Por esta razón es posible distinguir inequívocamente células positivas para EpCAM malignas de células positivas para EpCAM normales de la médula ósea a través de su fenotipo genómico. Esto es de especial importancia ya que la expresión de EpCAM no es prueba suficiente para la identidad (maligna) de una célula o células tumorales en muestras de médula ósea. Es importante destacar que los donantes sanos también mostraron un 0,5-5\textperthousand de células positivas para 3B10-C9 (3B10-C9, Prof. Judy Johnson, Institute for Immunology, Munich), un anticuerpo monoclonal anti EpCAM de gran afinidad, cuando se determinó por inmunofluorescencia.

Ejemplo IV

Expresión génica relacionada con la actividad en tres células micrometastásicas

Se aislaron células tumorales individuales de tres pacientes con tumores y estadios de enfermedad diferentes. El primer paciente (C) tenía unos antecedentes de diez años de carcinoma cervical y se presentó con un resultado sospechoso en la radiografía de tórax. Al segundo paciente (L) se le había diagnosticado recientemente un adenocarcinoma pulmonar clasificado post-operación como de fase pT2, N3, M0. La muestra de médula ósea se obtuvo durante la anestesia previa a la operación. La tercera muestra fue aspirada de la cresta pélvica de una paciente de 31 años con cáncer de mama (B) cuya enfermedad se encontraba en la fase pT1a, pN1a (1/18), M0. Esta paciente recibió altas dosis de quimioterapia (ADQ) debido a una recidiva, a la gradación histológica G3 y al hallazgo de una célula positiva para citoqueratina en la médula ósea. La muestra de médula ósea se tomó un mes después de la finalización del tratamiento con ADQ. Se llevó a cabo una SCOMP con las tres células y mostró múltiples aberraciones cromosómicas verificando el origen canceroso de las células (Tabla 4).

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TABLA 4 Aberraciones genómicas de células positivas para 3B10-C9 aisladas de la médula ósea de tres pacientes con carcinoma cervical (C), cáncer de pulmón (L) y cáncer de mama (B)

Célula

lp

lq

2p

2q

3p

3q

4p

4q

5p

5q

6p

6q

C

G

G/L

L

G

L

G

L

G

B

G

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Célula	7p	7q	8p	8q	9p	9q	10p	10q	11p	11q
C						L	G
L	G	G	L	G	L		L		L	G
B					L	L			L	L

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Célula	12p	12q	13q	14q	15q	16p	16q	17p	17q	18p	18q
C		L		L			L			G
L			L		L	L	G	L	L
B	G	G		G

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Célula	19p	19q	20p	20q	21p	21q	22p	22q	Xp	Xq	Y
C			L	L				L
L						G			G	G
B									G	G

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Resumen de los datos de la HGC obtenidos de las tres células micrometastásicas. Se proporcionan las pérdidas (L) y ganancias (G) en el brazo corto (p) y largo (q) de cada cromosoma en cada célula.

La célula del paciente B, que presentaba la enfermedad menos avanzada, mostró la menor cantidad de cambios cromosómicos (Fig. 4).

Se aisló mRNA de las tres células y se generaron muestras para SCAGE como se ha descrito antes. A modo de control, el procedimiento se llevó a cabo sin la adición de una célula. Se hibridaron los productos de amplificación de cDNA a filtros "Clontech Cáncer 1.2" y a arrays nuevos (Axxima A6, Martinsreid) comprendiendo un total de 1.300 genes.

La hibridación no radioactiva a filtros de nylon se llevó a cabo de la siguiente manera:

Se colocaron 15 ng de los diferentes fragmentos amplificados por PCR y fragmentos de cDNA subclonados en filtros de nylon cargados positivamente de Axxima AG, Martinsried. Los filtros se prehibridaron durante toda la noche en presencia de 50 \mug/ml de DNA de E. coli y 50 \mug/ml de DNA pBS en 6 ml de tampón "Dig-easy Hyb" (Roche Biochemicals). Se mezclaron 9 \mug de productos de PCR marcados de células individuales con 100 \mug de DNA de esperma de arenque, 300 \mug de DNA genómico de E. coli y 300 \mug, se desnaturalizó durante 5 min a 94ºC, se añadió a 6 ml de tampón de hibridación "Dig-easy" y se híbrido durante 36 horas. Los lavados de astringencia se realizaron de acuerdo con el protocolo de hibridación con digoxigenina Roche añadiendo dos lavados de astringencia finales en 0,1x SSC x-0,1% SDS durante 15 min a 68ºC. La detección de las sondas unidas al filtro se llevó a cabo según el protocolo de sistema de detección de digoxigenina proporcionado por el equipo (Roche).

Solamente hubo que excluir tres genes del análisis debido a que se obtuvo una señal en al menos uno de los controles negativos. Estos genes eran: proteína de unión a VHL, caspasa 10, TGF-\beta y hemoglobina \alpha. El número de señales positivas osciló entre 5,3% (70/1313), 7,0% (92/1313) y 11,8% (155/1313) en células de los pacientes B, C y L respectivamente. Estos números eran considerablemente menores que los correspondientes a células individuales de carcinoma en cultivo in vitro con las que se obtuvo señales con el 10-20% de los genes (datos no mostrados). Las tres células tumorales expresaron genes de los que se sabe que desempeñan un papel en la regulación de la proliferación, replicación o detención del crecimiento (Fig. 5; Tab. 5).

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TABLA 5 Genes bajo regulación positiva implicados en el estatus del ciclo celular en las células C, L y B

Papel en el ciclo celular	C	B	L
Reguladores	RFC3	RFC3	RFC3
positivos
	LIG1	LIG1
	STK12	STK12
	P2G4	P2G4
	RFC2	RFC2
	ADPRT	ADPRT
	S100A4	S100A4


	CCNA	CDC25
	(ciclina A)
	MKI67 (Ki-67)	VRK2
	CENPF	DYRK4
	D123	PRIM1
	PIN1	PRKDC (DNA-PK)
	EB1	CHD3
	CDC27HS
	CALM1
	UBL1
	TOP2A
	HMGIY
	HDAC3
	RBBP4
Reguladores		CDKN1A (P21)	CDKN1A (P21)
negativos
		ING1	ING1
		DDIT1 (GADD45)	CDKN2A (P16)

Las células C y B expresaron varios reguladores positivos del ciclo celular, mientras que solo las células B y L expresaron inhibidores del ciclo celular.

La célula C expresó el mayor número de genes importantes para la progresión del ciclo celular, incluidos los ciclina A (CCNA), EB1, RC2, P2G4, PIN1, RBBP4 y CENPF. Dado que la mayor parte de estos genes se encuentran fuertemente regulados en la transcripción y sus mRNA se ven rápidamente degradados a medida que avanza la división celular, su expresión no indica solamente que la célula C estaba involucrada en el ciclo sino que también se puede capturar de manera fiable en esta actividad mediante SCAGE. La célula B expresó una serie de genes importantes para la replicación y para la inhibición del ciclo celular. El patrón de transcritos sugiere que la célula se encontraba en un estado de reparación de DNA. La coexpresión de GADD45 (DDIT1) y p21 (CDKN1A) es indicativa de la detención del crecimiento (Smith, Science, 266, 1376-1380 (1994)). Del mismo modo, la expresión de reguladores positivos del ciclo celular como DNA-PK, RFC2, LIG1, ADPRT y PRIM1 se ha involucrado en el proceso de reparación de DNA (Lindahl, Science, 286, 1897-1905 (1999); Barnes, Cell, 69, 495-503 (1992); Mossi, Eur. J. Biochem., 254, 209-216 (1998); Lee, Mol. Cell Biol. 17; 1425-1433 (1997)). Ya que esta célula sobrevivió a altas dosis de quimioterapia alquilante y genotóxica, su perfil de expresión puede interpretarse como si se obviara su reentrada en el ciclo celular. La expresión de genes proapoptóticos como caspasa-6 y BAD, que solo se encontraron en esta célula, apoya esta interpretación. Sin embargo, la expresión de survivina (API4) puede neutralizar la realización de apoptosis en esta célula (Fig. 5; Tab. 5).

El transcriptoma obtenido de la célula L mostró rasgos compatibles con su participación en la diseminación y en la TEM. A pesar de que la expresión génica de la célula L no se parecía a la de una célula en ciclo celular o en reparación de DNA (véase más arriba) sus 84 genes expresados diferencialmente se encuentran principalmente implicados en la reorganización del citoesqueleto, la adhesión celular y la actividad proteolítica extracelular (Tab. 6; Fig. 6).

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TABLA 6 Genes regulados positivamente en la célula L indicativos de un fenotipo invasivo

organización	adhesión	actividad proteolítica
del citoesqueleto
Citoqueratina 2	Integrina alfa 3	Catepsina B
Citoqueratina 6	Integrina alfa v	Catepsina D
Citoqueratina 7	Integrina beta 2	Catepsina L
Citoqueratina 8	Integrina beta 3	MMP7
Citoqueratina 10	Integrina beta 7	MT1-MMP
Citoqueratina 13, 15, 17		MT2-MMP
Citoqueratina 18	Citohesina 1	uPA
Citoqueratina 19	Quinasa de adhesión focal	UPA-R
Vimentina	Desmogleína 2	ADAM 8
Beta-actina	E-cadherina	ADAM 15
	CD9	ADAM 17
RhoA		Bicunina
RhoB
Rho-GDI2		Cistatina 2
A-raf		EMMPRIN
RAP-1A
Cdc42
Rac1
P160 ROCK
quinasa tipo Ste20


Beta-catenina

El presente estudio analizó por primera vez la actividad celular de células tumorales individuales derivadas de la médula ósea de pacientes con cáncer. La célula C procedía de un paciente con carcinoma cervical con una presentación de metástasis pulmonar tras un periodo de latencia de diez años. Esta célula se encontró en proliferación. La célula B procedía de la médula ósea de un paciente con cáncer de mama que presentaba un cáncer primario relativamente pequeño y que había recibido altas dosis de quimioterapia debido a la evidente agresividad de su tumor. Esta célula mostró relativamente pocos cambios genómicos y concretos, lo cual resulta de particular interés por lo que respecta a los cambios genómicos necesarios para la diseminación. Además, esta célula tiene que haber sobrevivido a cuatro ciclos de una quimioterapia habitual, que consiste en Epirubicina y Taxol, además de un régimen de altas dosis de quimioterapia con participación de agentes alquilantes. El perfil de expresión obtenido es diagnóstico de detención del crecimiento y de reparación en marcha del DNA.

El transcriptoma de la célula L fue el más informativo en lo que respecta al proceso de diseminación. Esta célula, detectada en un paciente con cáncer bronquial sin metástasis clínicamente manifiesta, expresó muchos genes que codifican proteínas implicadas en la migración e invasión activas. Se encontró la expresión de la mayor parte de la cascada de activación del sistema uPA formado por la catepsina B, D, L, el receptor de uPA y uPA en sí mismo. Igualmente, en esta célula estuvieron regulados positivamente los genes implicados en la organización de filopodios, lamelipodios y fibras de estrés, los miembros de la familia Rho RhoA y B, Rac1, Cdc42 y p160 rock, y los genes que codifican varias moléculas de adhesión. Su citoesqueleto parecía estar sufriendo una remodelación como muestra la expresión de gran cantidad de citoqueratinas y de vimentina, un marcador de TEM.

Cabe destacar que el número de transcritos en células individuales aisladas a partir de líneas celulares en cultivo era considerablemente menor que el correspondiente a las células tumorales procedentes de pacientes. Esta diferencia puede deberse a un control de la transcripción in vivo más firme que puede disminuir de intensidad cuando las células se cultivan en cultivos celulares, por ejemplo por un aumento de desmetilación de DNA. Por lo tanto, el análisis de expresión de especímenes ex-vivo puede ser mucho más informativo que los estudios sobre líneas celulares. Hasta el momento, el número mínimo de células que se ha utilizado para el análisis de arrays de cDNA es del orden de 1.000 células (Luo (1999), loc. cit.). La sensibilidad de la hibridación en array puede aumentarse aún más con la utilización de fragmentos de cDNA inmovilizados mayores (la longitud de los fragmentos en los arrays Clontech es de unas 209 pb), y la cantidad de información obtenida con la utilización de chips de vidrio de mayor densidad y complejidad. Aunque el presente estudio analizó solamente 1.300 genes, hay que tener en cuenta que hasta el momento solo se ha descrito la expresión de nueve proteínas en el caso de células metastásicas. Estas proteínas son: ErbB2; receptor de transferrina, MHC clase I, EpCAM, ICAM-1, placoglobina, Ki-67, p120 y receptor de uPA /CD87 (Pantel, J. Natl. Canc. Inst. 91, 1113-1124 (1999)).

El método aquí descrito tiene un potencial en el estudio de la expresión génica a través de células raras en muchos otros campos (como se muestra a continuación; por ejemplo, en la investigación de tejido reestenótico humano). Se podría llevar a cabo, por ejemplo, la investigación de la expresión génica regulada espacial y temporalmente en la embriogénesis y el análisis de células madre y células diferenciadas en tejidos adultos. El análisis de células individuales representaría un avance considerable en la comprensión de la proliferación atípica, la metaplasia, las lesiones preneoplásicas y los carcinomas in situ.

Una sinopsis de las aberraciones genómicas y los perfiles de expresión de la misma célula pueden revelar las diferentes posibilidades de genotipos y fenotipos en una población de células tumorales.

Altas dosis de quimioterapia, la cirugía y enfoques de tratamiento antiangiogénicos permiten dirigirse hacia células en rápida división y masas tumorales grandes pero no son efectivos a la hora de eliminar células residuales, lo que conduciría a una enfermedad residual mínima. Los tratamientos adyuvantes, como las aproximaciones basadas en anticuerpos (Riethmuller, J. Clin. Oncol, 16, 1788-1794 (1998)), todavía se basan en la identificación de proteínas diana en el tumor primario. Ahora, la aproximación aquí mostrada proporciona una oportunidad de descubrir dianas para una enfermedad residual mínima mediante el análisis directo de las células micrometastásicas.

Ejemplo v

Expresión de genes aberrantes en tejido reestenótico humano

El método antes descrito se empleó también detectar genes expresados diferencialmente en tejido reestenótico humano.

Un elevado índice de reestenosis está limitando de forma significativa el éxito de la angioplastia coronaria transluminal percutanea (ACTP) con posterior implantación de stent como tratamiento frecuente de enfermedades ateroscleróticas. A pesar de que se han identificado varios mecanismos celulares y moleculares en el desarrollo de reestenosis intra-stent, todavía son escasas las dianas específicas para una prevención terapéutica efectiva de la reestenosis. En este estudio se identificaron genes expresados diferencialmente en especímenes microscópicos de aterectomía de reestenosis intra-stent humanos. La inmunohistoquímica mostró que el material reestenótico consistía principalmente en células del músculo liso (SMC) con escasos infiltrados de células mononucleares. Se amplificaron muestras de cDNA preparadas a partir de un espécimen reestenótico (n=10) y, como control, a partir de la íntima y la media de arterias musculares sanas (n=10) utilizando un nuevo protocolo de reacción en cadena de la polimerasa y se hibridaron a un array de cDNA para la identificación de genes expresados diferencialmente. La expresión de desmina y de factor inhibidor del crecimiento derivado de la mama se encontraba regulada negativamente, mientras que la expresión de proteína de unión a FK506 12 (FKBP12), trombospondina-1, prostaglandina G/H sintasa-1 y la proteína B de shock térmico de 79 kDa se encontraba regulada positivamente con una elevada significación estadística en neoíntima humana. Utilizando inmunohistoquímica se vio que FKBP12, un regulador negativo de la señalización de TGF-\beta, también estaba regulado de forma positiva a nivel de proteínas en la neoíntima proporcionando así una explicación para el efecto terapéutico del ligando de FKBP12 rapamicina en el tratamiento de un modelo de reestenosis
porcino.

Con la finalidad de conocer mejor los sucesos transcripcionales y de señalización que dirigen la migración, la proliferación y la síntesis de matriz extracelular de las células del músculo liso, se empleó un cribado de expresión génica diferencial utilizando tecnología de arrays de cDNA con sondas generadas a partir de especímenes microscópicos de tejido reestenótico humano. La fuerza de esta tecnología radica en la capacidad de estudiar en una muestra la expresión de cientos de genes simultáneamente (Kurian, (1999) J. Pathol 187:267-271). Un impedimento previo para la utilización de este método fue la necesidad de microgramos de mRNA o cRNA de muestras normalmente formadas por 10^{6}-10^{7} células. En nuestro caso se empleó la nueva tecnología, como se ha descrito aquí antes, lo que permitió la generación de productos de amplificación de cDNA representativos de una célula individual o de un número reducido de células en cantidades suficientes para una hibridación en array de cDNA exhaustiva.

Diez especímenes de cada media neointimal y quiescente para la expresión de 2.435 genes de función conocida. A pesar de que la expresión de genes "housekeeping" en tejido reestenótico y tejido normal era ampliamente comparable, cerca del 10% de los genes estudiados mostraron un nivel de expresión aumentado o disminuido. El presente estudio se centró en genes seleccionados que se han asociado previamente con la reestenosis. La expresión de desmina y factor inhibidor del crecimiento derivado de la mama (MDGI) se reguló negativamente de forma seleccionada mientras que la expresión de prostaglandina G/H sintasa-1 (COX-1), trombospondina-1 (TSP-1), proteína de choque térmico 70 B (hsp70B) y proteína de unión a FK506 12 (FKBP12) se encontró regulada positivamente en hiperplasia de neoíntima humana. Todos estos resultados se confirmaron mediante PCR específica de gen. Para estudiar la importancia de la expresión génica aumentada en la neoíntima, se investigó si unos niveles aumentados de mRNA se ven reflejados en un nivel proteico aumentado. Como se ha ejemplificado con FKBP12 utilizando inmunohistoquímica, realmente se encontró una marcada sobreexpresión de este regulador de la señalización de TGF-\beta en tejido reestenótico. Este estudio muestra que la tecnología de arrays de cDNA se puede utilizar para identificar de manera fiable genes expresados diferencialmente en tejido humano sano y enfermo, incluso en el caso de que solo esté disponible una pequeña cantidad de material.

El grupo de estudio de reestenosis intra-stent estaba formado por 13 pacientes a los que se practicó procedimientos separados de aterectomía mediante aterectomía con dispositivo de corte en hélice (X-sizer, Endicor) en el stent vuelto a estrechar, entre 4 y 23 meses tras la implantación primaria de stent. Todos los pacientes dieron consentimiento informado al procedimiento y recibieron, como tratamiento estándar, 15.000 unidades de heparina antes de la intervención, seguido 1.000 unidades/h de infusión de heparina intravenosa durante las primeras 12 h tras la retirada de la vaina. A todos los pacientes se les administró 500 mg de ácido acetilsalicílico por vía intravenosa antes de la cateterización. El tratamiento postintervencional antitrombótico consistió en ticlopidina (250 mg bds) y ácido acetilsalicílico (100 mg bds) a lo largo del estudio.

La preparación de muestras se llevó a cabo de la siguiente manera:

Los especímenes de aterectomía se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido tras el vaciado de la lesión y se conservaron en nitrógeno líquido hasta que se realizó la preparación de mRNA del modo descrito.

Para la histología e inmunohistoquímica del tejido reestenótico intra-stent de arterias coronarias (n=3), se fijaron las muestras en paraformaldehído al 4% y se incluyeron en parafina del modo descrito.

El grupo control estaba formado por 5 especímenes de arterias musculares del tubo gastrointestinal de cinco pacientes diferentes y 5 especímenes de arterias coronarias de tres pacientes diferentes a los que se había trasplantado el corazón. Los especímenes control se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Previamente a la preparación de mRNA, se prepararon media e íntima de las arterias control y se examinaron en busca de cambios ateroscleróticos mediante inmunohistoquímica. En el caso de que no hubiera cambios ateroscleróticos en la morfología vascular, los especímenes (aprox. 1x1 mm) se utilizaron como muestras control sanas y la preparación mRNA y cDNA se realizó del modo descrito.

Para la inmunohistoquímica de FKBP12, se obtuvieron especímenes de neoíntima de arterias carótidas reestenóticas (n=2) por aterectomía y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido tras la extracción. Se montaron secciones seriadas de 3 \mum congeladas de las muestras sobre portaobjetos para DAKO ChemMate^{TM} Capillary Gap Microscope (100 \mum).

La preparación de mRNA y amplificación de cDNA se llevó a cabo de la siguiente manera:

Los especímenes de vasos quiescentes o tejido reestenótico intra-stent se congelaron rápidamente y se conservaron en nitrógeno líquido hasta la realización de la preparación de mRNA y síntesis de cDNA. El tejido congelado se molió en nitrógeno líquido y el polvo congelado se disolvió en tampón de lisis/unión (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, LiDS al 1%, 5 mM ditiotreitol (DTT)) y se homogeneizó hasta obtener una lisis completa. El lisado se centrifugó durante 5 min a 10.000 g a 4ºC para eliminar los residuos celulares. El mRNA se preparó utilizando el equipo Dynbeads® mRNA Direct Kit^{TM} (Dynal, Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Enseguida, se añadió el lisado a 50 \mul por muestra de Oligo (dT)_{25} Dynabeads prelavados, y el mRNA se híbrido mediante la rotación en un mezclador durante 30 min a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y se lavó dos veces el complejo Oligo (dT)_{25} Dynabeads/mRNA con tampón de lavado que contenía Igepal (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 75 mM KCl, 10 mM DTT, Igepal al 0,25%) y una vez con tampón de lavado que contenía Tween-20 (50 mM Tris-HCL, pH 8,0, 75 mM KCl, 10 mM DTT, Tween-20 al 0,5%).

El cDNA se amplificó por PCR utilizando el procedimiento descrito anteriormente. La síntesis de la primera cadena de cDNA se llevó a cabo como una síntesis de cDNA en fase sólida. Para la reacción de transcripción inversa se utilizó el cebado aleatorio con cebadores hexanucleotídicos. Se realizó la transcripción inversa de cada uno de los mRNA en un volumen de reacción de 20 \mul con tampón 1x First Strand (Gibco), DTT 0,01 M (Gibco), Igepal al 0,25%, cebador CFL5c 50 \muM [5'-(CCC)_{5} GTC TAG A (NNN)_{2}-3'], dNTP 0,5 mM para cada uno (MBI Fermentas) y 200 U de Superscript II (Gibco), y se incubaron a 44ºC durante 45 min. Se llevó a cabo una posterior reacción de adición de colas en un volumen de reacción de 10 \mul que contenía MgCl_{2} 4 mM, DTT 0,1 mM, dGTP 0,2 mM, KH_{2}PO_{4} 10 mM y 10 U de desoxinucleótido transferasa terminal (MBI Fermentas). La mezcla se incubó durante 24 min a
37ºC.

El cDNA se amplificó por PCR en un volumen de reacción de 50 \muL con 1 x tampón 1 (Expand™ Long Template PCR Kit, Boehringer Mannheim), formamida desionizada al 3%, cebador CP2 1,2 \muM [5'-TCA GAA TTC ATG (CCC)_{5}-3'], dNTP 350 \muM y 4,5 U de DNA-Polimerase-Mix (Expand^{TM} Long Template PCR Kit, Roche Diagnostics, Mannhein). La reacción PCR se realizó durante 20 ciclos siguiendo los siguientes parámetros de ciclo: 94ºC durante 15 s, 65ºC durante 0,30 min, 68ºC durante 2 min; duranre otros 20 ciclos con: 94ºC durante 15 s, 65ºC durante 30 s, 68ºC durante 2,30 + 0,10/ciclo min; 68ºC durante 7 min; 4ºC hasta el final.

Se marcaron 25 ng de cada cDNA con Digoxigenina-11-dUTP (Dig-dUTP) (Roche Diagnostics) durante la PCR. Esta reacción se realizó en un volumen de reacción de 50 \muL con 1x tampón 1, cebador CP2 120 \muM, formamida desionizada al 3%, dTTP 300 \muM, dATP 350 \muM, dGTP 350 \muM, dCTP 350 \muM, Dig-dUTP 50 \muM y 4,5 U de DNA-Polimerase-Mix. Los parámetros del ciclo fueron: un ciclo: 94ºC durante 2 min; 15 ciclos: 94ºC durante 15 s, 63ºC durante 15 s, 68ºC durante 2 min; 10 ciclos: 94ºC durante 15 s, 68ºC durante 3 min + 5 s/ciclo; un ciclo: 68ºC, 7 min, 4ºC hasta el final.

La hibridación de arrays de cDNA Clontech con sondas de cDNA marcadas con dUTP se llevó a cabo de la siguiente manera:

Los arrays de cDNA se prehibridaron en solución DigEASYHyb (Roche Diagnostics) que contenía 50 mg/l de DNA genómico de E. coli digerido en DNAsa I (Roche Diagnostics), 50 mg/l de DNA de plásmido pBluescript y 15 mg/l de DNA de esperma de arenque (Life Technologies) durante 12 h a 44ºC para reducir el ruido de fondo al bloquear los sitios de unión no-específica de ácido nucleico sobre la membrana. Se híbrido la solución de hibridación con un array de cDNA comercializado con genes seleccionados importantes para la respuesta al cáncer, cardiovascular y al estrés (Clontech). Cada molde de cDNA se desnaturalizó y se añadió a la solución de prehibridación a una concentración de 5 \mug/ml de cDNA marcado con Dig-dUTP. La hibridación se llevó a cabo durante 48 horas a
44ºC.

Posteriormente se aclararon los "blots" una vez en 2x SSC/0,1% SDS y una vez en 1 x SSC/0,1% l SDS a 68ºC, seguido de un lavado de 15 min en 0,5x SSC/0.1% SDS y dos lavados de 30 min en 0,1x SSC/0,1% SDS a 68ºC. Para la detección del cDNA marcado con Dig hibridado con el array, se utilizó el equipo Dig Luminescent Detection Kit (Boehringer, Mannheim) como se describe en el manual de usuario. Para la detección de la señal quimioluminiscente se expusieron los arrays a películas quimioluminiscentes durante 30 min a temperatura ambiente. La cuantificación de los datos de los arrays se llevó a cabo mediante el cribado de las películas y el análisis con programas informáticos de visualización de arrays (Imaging Research Inc., St. Catharines, Canada). Se eliminó el ruido de fondo y se normalizaron las señales a los nueve genes "housekeeping" presentes en cada filtro situando la media de las señales de expresión de los genes "housekeeping" en 1 y el ruido de fondo en 0. En un estudio piloto, se analizaron mediante RT-PCR seis clones enriquecidos con una de las dos sondas.

Los resultados de los estudios experimentales se describen como valores medios de expresión de los diez especímenes examinados del estudio o grupo control. Las diferencias entre los dos grupos de pacientes se analizaron mediante el test de Wilcoxon (SPSS versión 8.0). Se consideró significativo un valor p menor de 0,03.

Se confirmó una selección de señales de hibridación diferencial mediante PCR utilizando cebadores específicos de gen. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando 2,5 ng de cada cDNA en un volumen de reacción de 25 \mul que contenía lx tampón de PCR (Sigma), dNTP 200 \muM, 0,1 \muM de cada cebador y 0,75 U de Taq Polimerasa (Sigma). Se utilizaron los siguientes cebadores: desmina, 5'-ACG ATT CCC TGA TGA GGC AG-3' y 5'-CCA TCT TCA CGT TGA GCA GG-3'; trombospondina-1, 5'-CTG AGA CGC CAT CTG TAG GCG GTG-3' y 5'-GTC TTT GGC TAC CAG TCC AGC AGC-5'; factor inhibidor del crecimiento derivado de la mama, 5'-AAG AGA CCA CAC TTG TGC GG-3' y 5'-ATT GTG GTG CTG AGT CGA GG-5'; prostaglandina G/H sintasa-1, 5'-CGG TGT CCA GTT CCA ATA CC-3' y 5'-CCC CAT AGT CCA CCA ACA TG-3'; FKBP12, 5'-ATG CCA CTC TCG TCT TCG AT-3' y 5'-GGA ACA TCA GGA AAA GCT CC-3'; proteína de shock térmico 70B, 5'-TAC AAG GCT GAG GAT GAG GC-3' y 5'-CTT CCC GAC ACT TGT CTT GC-3' y \beta-actina, 5'-CTA CGT CGC CCT GGA CTT CGA GC-5' y 5'-GAT GGA GCC GCC GAT CCA CAC GG-3'. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio (0,5 \mug/ml de solución de agarosa) en tampón TAE (20 mM Tris/HCl, 10 mM ácido acético, 1 mM EDTA).

La inmunohistoquímica se llevó a cabo de la siguiente manera:

La inmunohistoquímica para el tipado celular se realizó sobre secciones incluidas en parafina de tres especímenes de neoíntima procedente de reestenosis intra-stent coronaria y, para la detección de FKBP12, sobre secciones congeladas de cuatro especímenes de neoíntima procedente de reestenosis carotídea. Se montaron secciones de 3 \mum seriadas sobre portaobjetos DAKO ChemMate^{TM} Capillary Gap Microscope (100 \mum), se calentaron a 65ºC durante toda la noche, se desparafinizaron y se deshidrataron según los protocolos estándar. Para la extracción de antígenos, se hirvieron los especímenes durante 4 min en una olla a presión en tampón citrato (10 mM, pH 6,0). La peroxidasa endógena se bloqueó con H_{2}O_{2}/metanol al 1% durante 15 minutos. La unión inespecífica del anticuerpo primario se redujo mediante la preincubación de los portaobjetos con leche desnatada en polvo al 4% en diluyente de anticuerpos (DAKO, Dinamarca). Se realizó una inmunotinción a través de la técnica de la estreptavidina-peroxidasa utilizando el equipo ChemMate Detection Kit HRP/Red Rabbit/Mouse (DAKO, Dinamarca) según la descripción del fabricante. Los procedimientos se llevaron a cabo en un sistema de tinción automática DAKO TechMate^{TM} 500 Plus. Los anticuerpos primarios antiactina del músculo liso (M0635, DAKO, Dinamarca; 1:300), CD3 (A0452, DAKO, Dinamarca; 1:80), MAC387 (E026, Camón, Alemania; 1:20) y FKBP12 (SA-218, Biomol, Alemania, 1:20) se diluyeron en diluyente de anticuerpo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la contratinción nuclear con hematoxilina, los portaobjetos se deshidrataron y se les colocó un cubreobjetos Pertex (Medite,
Alemania).

Para la inmunohistoquímica de FKBP12, se montaron secciones congeladas seriadas de 3 \mum del espécimen de neoíntima procedente de reestenosis carotídea sobre portaobjetos DAKO ChemMate^{TM} Capillary Gap Microscope (100 \mum).

Se obtuvieron los siguientes resultados:

(a) La composición celular de material reestenótico intra-stent vaciado

Se analizaron inmunohistoquímicamente muestras representativas obtenidas del tratamiento con x-sizer de una hiperplasia neointimal para determinar su composición celular. El tejido reestenótico analizado se eliminó a través del vaciado con x-sizer de arterias coronarias más de dos meses tras la ACTP y la implantación del stent. Con este procedimiento se generó una cantidad de tejido muy pequeña que contenía unas 300-10.000 células estimadas. La figura 7A muestra una tinción de E.-van Giesson de una sección obtenida de una muestra pequeña de material reestenótico vaciado. Con este procedimiento de tinción las fibras de colágeno se tiñen de rojo, la fibrina se tiñe de amarillo y el citoplasma de las células del músculo liso se tiñe de un marrón amarillo oscuro. La mayor parte del volumen de material vaciado estaba formado por fibras de colágeno desorganizadas del tipo de la matriz extracelular teñidas de un rojo claro. La tinción amarilla de fibrina era prácticamente indetectable. Eran frecuentes las células con núcleos en forma de huso y un citoplasma teñido de amarillo/marrón. La immunotinción con un anticuerpo anti \alpha-actina del músculo liso (Fig. 7B), además de su gran abundancia en material reestenótico, reafirmó su identidad como células del músculo liso. En esta figura se muestra el patrón de tinción de una sección de un espécimen completo como el que se utiliza para los análisis de expresión génica. Como se describe más adelante, estas muestras también dieron lugar a una fuerte señal de mRNA de \alpha-actina específica de músculo liso (véase la Fig. 8). Estos resultados apoyan los obtenidos en estudios previos (Komatsu, (1998), Circulation 98:224-233; Strauss (1992), J. Am. Coll. Cardiol. 20:1465-1473; Kearney (1997), Circulation 95:1998-2002) demostrando así que el tipo celular principal encontrado en la neoíntima deriva de células del músculo liso. Como se describe en los trabajos publicados, también se pudieron identificar infiltrados mononucleares en algunas áreas de espécimen de tejido reestenótico vaciado (datos no mostrados). Estos infiltrados estaban principalmente constituidos por macrófagos y, en menor medida, por linfocitos T. No se pudieron detectar linfocitos B en el tejido reestenótico utilizando un anticuerpo anti CD20 para la tinción inmunohistoquímica (datos no mostrados).

(b) Expresión de genes específicos en muestras microscópicas de tejido humano

Con el fin de mantener de manera óptima los niveles de mRNA in situ, inmediatamente tras su cosecha se congelaron especímenes control y reestenóticos en nitrógeno líquido y se lisaron cuidadosamente, como se ha descrito antes. Después de la amplificación por PCR del cDNA sintetizado, la cantidad de cDNA amplificado se midió con un ensayo dot blot y se halló que se encontraba entre 200-300 ng/\mul. La calidad de cada muestra de cDNA amplificado se ensayó mediante PCR específica de gen utilizando cebadores que detectan cDNA para la \beta-actina, la \alpha-actina de células del músculo liso y el factor de elongación EF-1\alpha ubicuo. La figura 8 muestra un resultado representativo con material procedente del paciente B y con media control procedente del donante b. En ambos especímenes, las señales de PCR de tamaño correcto de los genes "housekeeping" \beta-actina y EF-1\alpha eran detectables en cantidades equivalentes (compárense los carriles 1 y 2 con los carriles 4 y 5) Además, para cada espécimen se obtuvieron señales de \alpha-actina como marcador de células del músculo liso (carriles 3 y 6). Estos resultados muestran que la preparación de mRNA, la síntesis de cDNA y la amplificación por PCR de cDNA es factible con muestras microscópicas humanas de reestenosis.

(c) Perfiles comparativos de expresión génica utilizando muestras microscópicas de tejido humano

Para identificar mRNA expresados diferencialmente en especímenes reestenóticos frente a especímenes sanos, durante la amplificación por PCR se marcaron los cDNA con dUTP marcado con digoxigenina, como se ha descrito anteriormente. Este marcador permite una detección basada en la quimioluminiscencia y altamente sensible de las señales de hibridación de arrays de cDNA en películas fotográficas. Los filtros de nylon con arrays de cDNA se prehibridaron con DNA genómico de E. coli digerido en DNAsa I y con DNA de plásmido pBluescript digerido en DNAsa I. Este procedimiento se utilizó para reducir al máximo la unión inespecífica de DNA con el array. Cada sonda marcada se híbrido con tres arrays de cDNA comerciales diferentes, lo que permitió el análisis de la expresión de un total de 2.435 genes conocidos. La figura 9 muestra un patrón de hibridación representativo obtenido con un array utilizando sondas preparadas a partir de tejido reestenótico del paciente B (panel A) y media del donante b (panel B). De una forma coherente con el análisis específico de gen mostrado en la Figura 8, se obtuvieron señales de hibridación comparables con el control positivo de cDNA genómico humano situado en los carriles inferiores de la derecha del array y con los puntos de cDNA de diversos genes "housekeeping" (véase, por ejemplo, los puntos D). Si se omitía un espécimen biológico de la síntesis de cDNA y de las reacciones de amplificación por PCR, casi no se obtenían señales de hibridación (Fig. 9, panel C), lo cual mostraba que las señales de hibridación prácticamente derivaban solo de las muestras añadidas y no de contaminaciones de DNA en los reactivos o materiales
utilizados.

Un análisis visual de los patrones de hibridación permitía una identificación rápida de una serie de señales que son diferentes en tejido sano y tejido enfermo (por ejemplo las señales A, B y C en las figs. 9A y B). Consecuentemente, las muestras de tejidos reestenóticos dieron más señales que los tejidos control. Las señales de hibridación obtenidas tras la utilización de tres arrays de cDNA diferentes con 10 muestras de paciente con reestenosis y 10 muestras de media normal se cuantificaron mediante el análisis densitométrico de películas fotográficas y los datos se recopilaron electrónicamente para su posterior análisis estadístico. Los niveles de expresión de 53 de los 2.435 genes se muestran en la figura 10, donde un valor gris corresponde a la intensidad de señal, como se muestra en la leyenda de la figura. Para la mayoría de los genes mostrados se evidencia una considerable variación de la expresión génica, lo que puede reflejar diferencias genéticas y fisiológicas de pacientes y donantes. Para el posterior análisis y verificación mediante PCR específica de gen, solo se tuvieron en cuenta los genes que mostraron una expresión diferencial con una diferencia estadística de al menos p=0,03 en el test de Wilcoxon. Seis de estos genes se destacan en la lista (Fig. 10). Se encontró que un total de 224 genes de los 2435 conocidos estaba regulado diferencialmente en la neoíntima con una elevada significación estadística. Su análisis exhaustivo y con detalle se publicará en otro lugar. Ocho genes "housekeeping" mostraron unas intensidades de señal muy similares en las 20 muestras (Fig. 10, parte inferior), lo que es indicativo de una calidad de muestras comparables.

(d) Validación de datos de arrays de cDNA mediante PCR específica de gen

Seis genes regulados diferencialmente y un gen housekeeping de la lista representada en la Figura 10 se seleccionaron para la validación de señales de hibridación a través de PCR utilizando cebadores específicos de gen. Todas las señales de PCR obtenidas tenían el tamaño predicho. La señal de \beta-actina (abajo) mostró una intensidad muy similar en las 20 muestras, lo que confirma que la calidad de las muestras era igual. Al comparar las señales de PCR específica de gen (Fig. 11) con las señales de hibridación obtenidas de arrays de cDNA (Fig. 11) se halló que 135 de 140 señales coincidían en cuanto a la intensidad. Esto corresponde a una fidelidad del 96% de las señales de hibridación de los arrays de cDNA, lo que demuestra que el enfoque de realización de perfiles de expresión génica aquí empleado es comparable a la PCR específica de gen por lo que respecta a la calidad y a la sensibilidad.

(e) Expresión de genes aberrantes en tejido reestenótico humano

La desmina, un marcador mesenquimático, se encontró fuertemente expresada en la media control, mientras que solo se encontraron señales débiles en el espécimen reestenótico (Figs. 10 y 11). La desmina es un marcador para las SMC, que se encuentra altamente expresado en SMC quiescentes y diferenciadas. Su expresión está reducida en las SMC desdiferenciadas y proliferativas, p. ej. en SMC de placas ateroscleróticas (Ueda, (1991), Circulation 83:1327-1332). Una regulación negativa de desmina en tejido reestenótico implica que las células en forma de huso del material reestenótico sean SMC desdiferenciadas y proliferativas. Por el contrario, TSP-1, una proteína de la matriz extracelular importante en la activación de TGF-\beta y en la migración y proliferación de SMC (Yehualaeshet (1999), Am. J. Pathol. 155:841-851; Scott (1988), Biochem. Biophys. Res. Commun. 150;278-286), sufre una marcada regulación positiva en la mayoría de especímenes neointimales respecto a las muestras control. Los genes COX1, hsp70B inducida por estrés y FKBP12 de expresión ubicua estaban regulados positivamente de manera significativa en prácticamente toda la hiperplasia neointimal y casi sin expresar, si lo llegaban a estar, en el espécimen control (Figs. 10 y 11). El supresor tumoral MDGI estaba fuertemente expresado en músculo liso quiescente mientras que se encontró muy poca expresión en unas pocas muestras de hiperplasia neointimal. Ninguna de las lesiones reestenóticas expresó desmina (0/0) comparado con el 100% de los controles (10/10); solo el 30% (3/10) de los especímenes neointimales expresó muy levemente MDGI, mientras que éste estuvo estuvo altamente expresado en el 80% (8/10) de los controles. Por otro lado, TSP-1 (7/10), COX-1 (9/10), hsp70B (8/10) y FKBP12 (101/10) estuvieron regulados positivamente de manera significativa en especímenes neointimales frente a los control (TSP-1 [0/10], hsp70B [0/10], COX-1 [0/10], FKBP12 [1/10]).

(f) La expresión proteica de FKBP12 está regulada positivamente en tejido reestenótico humano

La regulación positiva de los niveles de mRNA no indica necesariamente un nivel elevado de proteína. De entre los genes que estaban regulados positivamente en neoíntima humana, FKBP12 es particularmente interesante puesto que es un regulador de la señalización de TGF-\beta y una diana para los fármacos FK506 y rapamicina. El efecto terapéutico de la rapamicina en modelos de roedor (Gallo (1999), Circulation 99:2164-2170)de reestenosis se conoce muy poco pero puede estar relacionado con cambios en el nivel de expresión de FKBP12. Utilizando un anticuerpo específico para FKBP12, se analizó la expresión de la proteína en tejido reestenótico humano de reestenosis carotídea (n=3) y tejido control (n=3). Como se muestra en la Figura 12, se detectó un aumento de proteína FKBP12 en el citoplasma de SMC de lesiones reestenóticas identificadas por sus núcleos en forma de huso (Fig. 12B y D). A pesar de que no se podía detectar FKBP12 en las SMC control de media sana (Fig. 12C), se halló una tinción distintiva en las SMC de neoíntima (Fig. 12D). Cabe resaltar que especialmente las células del músculo liso situadas en la zona limítrofe la neoíntima y la media sana de vasos reestenóticos expresaron altos niveles de Proteína FKBP12 (Fig. 11B).

Ejemplo VI

Caracterización del transcriptoma de tejido reestenótico humano

La expresión de 2.435 genes de función conocida (véase el Ejemplo V) se investigó en especímenes de aterectomía de 10 pacientes con reestenosis intra-stent, células hemáticas de 10 pacientes, especímenes de arteria coronaria normal de 11 donantes y células del músculo liso de arteria coronaria humana en cultivo. 224 genes expresados diferencialmente en neoíntima y tejido control con una elevada significación estadística (p<0,03) se pueden agrupar de la siguiente forma: (1) genes solo expresados en neoíntima; (2) genes expresados tanto en neoíntima como en células del músculo liso proliferativas; (3) genes expresados tanto en neoíntima como en muestras de sangre; y (4) genes expresados en tejido control pero prácticamente nada en neoíntima. El transcriptoma de neoíntima humana mostró cambios significativos relacionados con la proliferación, apoptosis, inflamación, reorganización del citoesqueleto y remodelación tisular. Además, se identificaron en la neoíntima 32 genes regulados positivamente que están relacionados con la señalización de interferón-\gamma.

En el presente estudio se analizó la expresión de 2.435 genes humanos de función conocida en 10 especímenes de íntima/media neointimal y 11 especímenes de íntima/media quiescente. Mientras que la expresión de genes "housekeeping" en tejido reestenótico y normal era en gran parte comparable, una enorme cantidad de genes (n=224) mostraron un nivel de expresión aumentado o disminuido. El patrón de expresión génica en neoíntima mostró la respuesta proliferativa anticipada con la inducción de genes expresados principalmente en fase G1/S, cambios del fenotipo del músculo liso (de SMC contráctiles a sintéticas) y cambios en la síntesis de proteínas de la matriz extracelular. Además, se observó un patrón de expresión proinflamatorio caracterizado por la presencia de marcadores de macrófagos y linfocitos T y por la expresión de numerosos genes con funciones conocidas en la respuesta celular a IFN-\gamma. En las SMC de neoíntima humana se halló una sobreexpresión de proteína IRF-1, un factor de transcripción fundamental en la señalización de IFN-\gamma.

Las características clínicas de los pacientes del grupo de estudio de este Ejemplo se presentan en la tabla 7.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7 Datos clínicos de 13 pacientes

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Todos los especímenes de aterectomía se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido tras el vaciado de la lesión, y conservados en nitrógeno líquido hasta que se lleva a cabo la preparación de mRNA de la forma antes descrita.

El grupo control estaba formado por 5 especímenes de arterias musculares del intestino de cinco pacientes y 6 especímenes de arterias coronarias de tres pacientes a los que se había practicado un trasplante de corazón. Los especímenes control se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Previamente a la preparación de mRNA, se prepararon media e íntima de las arterias. Una pequeña porción del espécimen (aprox. 1 mm^{3}) se lisó inmediatamente, mientras que el resto se examinó histológicamente en busca de cambios ateroscleróticos. Los especímenes en que no se encontraban cambios ateroscleróticos detectables de la morfología se utilizaron como muestras control "sanas" y la preparación de mRNA y cDNA se realizó de la forma descrita.

El tejido neointimal de las arterias carótida (n=3) y femoral (n=3) se generó mediante aterectomía en la reestenosis e inmediatamente después de la extracción se congeló en nitrógeno líquido. Para la evaluación histológica e inmunohistoquímica del tejido reestenótico intra-stent de las arterias coronarias (n=3) y de la neoíntima de las arterias periféricas reestenóticas (n=6), las muestras se fijaron en paraformaldehído al 4% y se incluyeron en parafina como ya se ha descrito.

Las muestras de sangre se obtuvieron inmediatamente después de la revascularización del vaso reestenótico. Se recogieron muestras de sangre de 8 ml en 35 ml de "Trireagent Blood" (MBI Fermentas, Alemania) y posteriormente se congelaron a -80ºC hasta que se llevó a cabo la preparación de RNA como se describe en el protocolo del fabricante. Se disolvió 1 \mug del RNA total de las células hemáticas en 1000 \mul de tampón de lisis/unión y la síntesis de mRNA y de cDNA se preparó de la forma antes descrita.

El cultivo celular se llevó a cabo de la siguiente manera:

Se obtuvieron células primarias del músculo liso de arteria coronaria (CASMC) humana a partir de CellSystems (St. Kathrinen, Alemania) y se cultivaron en medio de cultivo para células del músculo liso (CellSystems, St. Kathrinen, Alemania) con un contenido de suero fetal bovino al 5% (CellSystems, St. Kathrinen, Alemania) a 37ºC en una atmósfera húmeda de CO_{2} al 5%. Las células CASMC se utilizaron en experimentos entre los pasos 2 y 4. Para la síntesis de cDNA en CASMC proliferativas, estas se lavaron tres veces en tampón fosfato salino frío y posteriormente se lisaron 1x10^{4} células en 1000 \mul de Tampón de lisis/unión antes de la preparación de mRNA de la forma antes descrita.

La determinación de patrones de expresión génica se llevó a cabo de la siguiente manera:

La preparación de mRNA, la síntesis de cDNA, la amplificación por PCR y el marcaje de sondas, la hibridación con arrays de cDNA y el análisis de datos de las muestras se realizaron como se ha descrito anteriormente, en particular en el Ejemplo V. Las sondas de cDNA obtenidas se hibridaron con arrays de cDNA Human 1.2, Cáncer 1.2, Cardiovascular y Stress (Clontech, Heidelberg, Alemania) con un total de 2.435 genes de función conocida. Existía una redundancia de genes de aproximadamente el 20% entre los arrays de cDNA. Para el análisis de muestras microscópicas de tejido humano hasta el nivel de una célula individual, se utilizó el nuevo método de síntesis de cDNA y amplificación por PCR aquí descrito (véanse los ejemplos I a V).

La cuantificación de datos de los arrays se llevó a cabo mediante el cribado de las películas y el análisis con programas informáticos de visualización de arrays (Imaging Research Inc., St. Catharines, Canada). Se eliminó el ruido de fondo y se normalizaron las señales de los nueve genes "housekeeping" presentes en cada filtro, situando la media de las señales de expresión de los genes "housekeeping" en 1 y el ruido de fondo en 0. Para la representación logarítmica mostrada en la Figura 1, los valores se multiplicaron por 1000. Un valor medio \geq0,05 en la media de todas las muestras de un grupo se consideró una señal positiva. Las diferencias en el nivel medio de expresión según un factor de 2,5 entre el grupo de estudio y el control se continuaron analizando estadísticamente.

Los resultados del análisis experimental se proporcionan como valores medios de expresión de los diez especímenes examinados del grupo de estudio o de los once especímenes examinados del grupo control. Las diferencias entre los grupos de pacientes y donantes se analizaron con el test de Wilcoxon (SPSS versión 8.0). Solo se consideró una expresión diferencial de los genes entre los dos grupos si sus valores p en el Test de Wilcoxon eran <0,03 y si se observaba una expresión diferencial en al menos 5 de cada 10 muestras de un grupo de estudio, mientras que en el otro grupo ésta se observaba en 0 de cada 10; o al menos 7 de cada 10 muestras en un grupo, mientras que en el otro se trataba de 3 de cada 10, como máximo.

La inmunohistoquímica se llevó a cabo de la siguiente manera:

La inmunohistoquímica se realizó con secciones incluidas en parafina de tres especímenes de neoíntima de reestenosis coronaria intra-stent, 3 especímenes de neoíntima de arteria femoral y 3 especímenes de neoíntima carotídea. Se montaron secciones seriadas de 3 \mum sobre portaobjetos DAKO ChemMate^{TM} Capillary Gap Microscope (100 \mum), se calentaron a 65ºC durante toda la noche, se desparafinaron y se deshidrataron según los protocolos habituales.

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Para la eliminación del antígeno, se hirvieron los especímenes durante 4 minutos en una olla a presión en tampón citrato (10 mMol, pH 6,0). La peroxidasa endógena se bloqueó mediante H_{2}O_{2}/metanol al 1% durante 15 minutos. La unión inespecífica de los anticuerpos primarios se redujo con la preincubación de los portaobjetos con 4% leche desnatada en polvo al 4% en diluyente de anticuerpos (DAKO, Dinamarca). Se realizó una immunotinción a través de la técnica de la estreptavidina-peroxidasa utilizando el equipo ChemMate Detection Kit HRP/Red Rabbit/Mouse (DAKO, Dinamarca) según la descripción del fabricante. Los procedimientos se llevaron a cabo en un sistema de tinción automática DAKO TechMate^{TM} 500 Plus. Los anticuerpos primarios antiactina del músculo liso (M0635, DAKO, Dinamarca; 1:300), CD3 (A0452, DAKO, Dinamarca; 1:80), MAC387 (E026, Camón, Alemania; 1:20) e IRF-1 (sc-497, Santa Cruz, EE.UU.) se diluyeron en diluyente de anticuerpo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la contratinción nuclear con hematoxilina, los portaobjetos se deshidrataron y se les colocó un cubreobjetos Pertex (Medite, Alemania).

Se obtuvieron los siguientes resultados:

(a) Expresión génica diferencial en neoíntima humana

Un total de 1.186 genes (48,7%) de 2.435 produjeron señales detectables de hibridación en arrays de cDNA con muestras de neoíntima y control sobre un rango de nivel de expresión 20 veces superior (Fig. 13A). De estos, 352 genes (14,5%) parecían estar expresados diferencialmente entre las muestras reestenóticas y control según un factor >2,5. Sin embargo, los niveles de expresión variaban considerablemente entre muestras individuales (véase, p. ej., Fig. 15). Por lo tanto, se empleó un análisis estadístico para identificar aquellos genes que están expresados diferencialmente entre los grupos de estudio y control con una elevada significación (véase el apartado de Métodos). De este modo, se identificaron 224 genes (9,6%) que estaban expresados diferencialmente, según un factor de al menos 2,5, entre el grupo de estudio de reestenosis y el grupo control con una significación en el Test de Wilcoxon de p<0,03. De estos genes, 167 (75%) estaban sobreexpresados y 56 (25%) infraexpresados en el grupo de estudio de reestenosis comparado con el grupo control (Fig. 13B).

Además de la significación estadística, la validez de los datos de expresión estuvo reafirmada por una redundancia del 20% de elementos de cDNA en los cuatro arrays utilizados. De esta manera, en experimentos de hibridación independientes, se determinó un número sustancial de señales de hibridación en duplicados o triplicados. En la Fig. 16 (arriba) se muestran cuatro ejemplos de determinación de duplicados que mostraron un elevado grado de reproductibilidad. Como otra validación de señales de hibridación, se seleccionaron 38 de los genes expresados diferencialmente para el análisis por PCR de muestras de cDNA utilizando cebadores específicos de gen. Se pudieron verificar señales de hibridación para 35 (92%) de 38 genes mediante PCR específica de gen, que produjo señales del tamaño y cantidad relativa predichos (datos no mostrados). Estos datos muestran que el enfoque de arrays de cDNA empleado es comparable a la PCR específica de gen por lo que respecta a la calidad y la sensibilidad. Por último, de entre los 224 genes expresados de forma aberrante en neoíntima, en trabajos publicados ya se ha descrito la expresión de 112 en neoíntima, SMC, fibroblastos, células endoteliales o mesénquima (Fig. 14 marcados con "#").

En lo que concierne a la expresión en neoíntima, los 224 genes regulados de forma aberrante se clasificaron en cuatro subgrupos (Fig. 14). El grupo I contiene 62 genes que estaban sobreexpresados en neoíntima y no muy expresados, o no de forma detectable, en vasos control, CASMC o células hemáticas (Fig. 14A). El grupo II lo integran 43 genes que están expresados de forma similar en neoíntima y CASMC, lo que sugiere que esta agrupación de genes en neoíntima contaba con la intervención de SMC proliferativas (Fig. 14B). El grupo III incluye 62 genes que están expresados de forma similar en neoíntima y células hemáticas, lo que sugiere que esta agrupación de genes en neoíntima contaba con la intervención de células hemáticas infiltradas (Fig. 14C). Este concepto viene apoyado por la expresión en el grupo III del mayor número de genes relacionados con la inflamación de los cuatro grupos. Por último, el grupo IV incluye 56 genes que están regulados negativamente en neoíntima comparado con el grupo control (Fig. 14D). Más adelante se tratará la expresión aberrante en neoíntima de genes seleccionados en el contexto de la función génica.

En resumen, los siguientes genes expresados diferencialmente se han detectado en neoíntima humana:

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Por ejemplo, se encontró que 17 de los genes expresados diferencialmente en neoíntima humana codifican reguladores transcripcionales. Los niveles de mRNA para 14 factores de transcripción se indujeron en neoíntima y 3 mostraron una expresión reducida (Fig. 15). Algunos factores de transcripción del primer grupo previamente se han relacionado con la proliferación y apoptosis de SMC, como HMG-1, E2F1, IRF-1 o Fli-1, y con la señalización proinflamatoria en neoíntima humana, como IRF-1, IRF-7 y ReIB. Los siguientes factores de transcripción estuvieron bajo regulación positiva: E2F1, receptor alfa relacionado con estrógeno, su proteína de dominio elk-3, oncogén fli-1, HMG-1, factor 1 de regulación de interferón, factor 7 de regulación de interferón, ISGF3-gamma, factor 1 relacionado con el receptor nuclear, RELB, factor de transcripción Spi-B, oncogén va, proteína relacionada con v-erbA y receptor de vitamina Q; mientras que los siguientes estaban bajo regulación negativa: proteína homeobox HOXB7, proteína 1 de respuesta a crecimiento temprano, factor de respuesta sérica.

En la expresión de factores de transcripción de la familia Ets parecen ocurrir cambios sorprendentes. Mientras Spi-B, el oncogén fli y el represor de Ets Elk-3 estaban inducidos en neoíntima, el factor de transcripción Ets Egr-1 estaba reprimido (Figs. 14 y 15).

Además, una serie de genes implicados en el control o la mediación de las respuestas proliferativas estaban expresados diferencialmente entre los grupos de neoíntima y los control. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-A y genes del angiotensinógeno, cuyos productos actúan sobre las SMC como mitógenos, estaban expresados exclusivamente en la neoíntima (Fig. 14). Se sabe que la insulina regula positivamente a la angiotensina y que esta última induce la expresión de PDGF-A en las SMC. Varios genes, de los que se sabe su expresión con la transición G1/S del ciclo celular, se encontraron regulados positivamente en neoíntima, lo que se puede interpretar como signo de proliferación en curso. Estos incluyen el factor de transcripción E2F1, la proteína A de replicación de 70 kDa, el producto de oncogen Pim-1 y la geranilgeranil transferasa. Además, se observó la regulación positiva de la histona H4 (regulada en el ciclo celular), que es expresada en las fases G/S1 y S del ciclo celular lo cual indicaba la proliferación en curso en la neoíntima humana. Evidentemente, la reprogramación del crecimiento celular en neoíntima condujo a la inducción de varios genes en neoíntima que codifican proteínas con funciones en diferentes vías de transducción de señal, incluidos los receptores de la superficie celular EDG1, EDG-4, receptor de insulina y purinoceptor 5 P2X, y otras proteínas de señalización como la proteína ribosómica S6 quinasa II alfa 1, farnesiltransferasa, fosfolipasa C beta 2, proteína 2 unida a receptor de factor de crecimiento y las pequeñas proteínas G CDC42, RhoG, p21-Rac2 y RaIB. La enzima farnesiltransferasa cataliza la lipidación posttraducción esencial de Ras y de otras proteínas G de transducción de señal. Las proteínas G, como p21-Rac2, CDC42 y RhoG, desempeñan papeles fundamentales en las vías de transducción de señal que desembocan en la migración y proliferación celular. De igual forma, la producción estimulada por el agonista de 1,4,5-trifosfato (IP3) por parte de la fosfolipasa C beta 2 en el músculo liso requiere la activación de las proteínas G, y Rac y CdC42 activadas se asocian con PI 3 quinasa, que desempeña un papel importante en la activación de la p70 S6 quinasa. La p70 S6 quinasa (p70S6K) es un regulador importante de la progresión del ciclo celular para la entrada en la fase G1 y para la continuación hacia la fase S en respuesta a factores de crecimiento y mitógenos. Está implicada en múltiples vías de transducción de señal relacionadas con factores de crecimiento de las que se conoce que desempeñan papeles fundamentales en la formación de la neoíntima, como la angiotensina, la endotelina y el PDGF. Acorde con la regulación positiva de la p70 S6 quinasa, se halló una regulación positiva significativa de la proteína de unión a FK506 (FKBP) 12 a nivel de mRNA (Fig. 14) y de proteína en la neoíntima.

Se observó que una serie de genes que codifican inhibidores de la progresión del ciclo celular se expresaban en media quiescente pero estaban bajo una significativa regulación negativa en neoíntima (Fig. 14). Entre estos estaban CIP1, p16-INK4, metalotioneína, TGF-beta3, factor inhibidor del crecimiento derivado de la mama, FrzB y las subunidades beta y gamma de Gadd45.

Además, se encontró una regulación positiva en neoíntima humana de genes que codifican proteínas con función proapoptótica, como caspasa-1, DAP-1 y ligando de APO-2, así como una regulación positiva de genes que codifican proteínas con función antiapoptótica, como BAG-1, proteína A1 relacionada con BCL-2 y el receptor Trail 3 (Fig. 14).

Finalmente, el transcriptoma de neoíntima humana mostró una regulación positiva de 32 genes relacionados con la señalización de IFN-\gamma (Fig. 16). El receptor alfa de IFN-\gamma se expresó en neoíntima, CASMC proliferativas y, en menor grado, en células hemáticas; mientras que el receptor beta de IFN-\gamma se expresó principalmente en los especímenes de neoíntima. Asimismo, se observó una regulación positiva de Pyk2.

En neoíntima humana se halló una regulación positiva de los genes regulados por IFN-\gamma para caspasa-1, caspasa-8 y DAP-1. Sin embargo, los mRNA para las proteinas antiapoptóticas BAG-1, Pim-1 (ambas reguladas por IFN-\gamma) y la proteína A1 relacionada con BCL-2 también estaban bajo regulación positiva en neoíntima frente al control (Fig. 14).

En neoíntima humana se encontraron activados numerosos genes con funciones en las respuestas inflamatorias. Los patrones génicos proinflamatorios provenían de la infiltración de células inflamatorias como macrófagos y linfocitos T (p. ej., CD 11b, CD3) (Fig. 14C) o de SMC neointimales (p. ej., prostaglandina G/H sintasa 1 , fosfolipasa A2, proteína 70 de shock térmico, receptor de anafilatoxina C5a, receptor de IFN-\gamma) (Fig. 14A y B).

Hay que prestar especial atención a la expresión selectiva de CD40 en neoíntima (Fig. 14A). CD40 es un miembro de la familia de receptores de TNF que inicialmente se describió en la superficie de las células B.

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Se observaron los siguientes cambios en el citoesqueleto, la matriz extracelular y la adhesión celular en neoíntima:

Una regulación positiva de conexiona 43 y de citoqueratina-18 en neoíntima, como se ve en CASMC proliferativas (Fig. 14B, panel superior), mientras que la expresión de desmina estaba fuertemente reducida en neoíntima (Fig. 14D, panel superior).

A pesar de que se redujo la transcripción de diferentes subtipos de colágeno y tenascina en neoíntima (Fig. 14D, panel superior), la expresión de trombospondina-1 y versican estaba regulada positivamente (Fig. 14B, panel superior).

Una serie de genes que codifican las moléculas de adhesión, incluidas P-selectina, ICAM2 y cadherina16, se hallaron altamente expresados en neoíntima pero no en SMC, células hemáticas o vasos control (Fig. 14A, panel superior). Una serie de otras moléculas de adhesión estaban expresadas de forma similar en neoíntima, SMC en cultivo (Fig. 14B) y células hemáticas (Fig. 14C). Parece que la neoíntima regula negativamente la expresión de ciertas moléculas de adhesión que normalmente están expresadas en la media/íntima arteriales, como las integrinas \alpha7B, \alpha3 o MUC18.

Ejemplo VII

Genes de la vía de señalización de IFN-\gamma bajo regulación positiva

Como se ha mostrado anteriormente, se investigó la expresión de 2.435 genes de función conocida en especímenes de aterectomía de 10 pacientes con reestenosis intra-stent, células hemáticas de 10 pacientes, especímenes de arteria coronaria normal de 11 donantes y células en cultivo del músculo liso de arteria coronaria humana y se identificaron 224 genes que eran expresados diferencialmente en neoíntima y tejido control con una elevada significación estadística (p<0,03). En particular, en neoiritima se identificaron 32 genes regulados positivamente que están relacionados con la señalización de interferón-\gamma.

El receptor alfa de IFN-\gamma era expresado en neoíntima, CASMC proliferativas y, en menor grado, en células hemáticas; mientras que el receptor beta de IFN-y era principalmente expresado en especímenes de neoíntima.

La señalización de IFN-\gamma tiene lugar a través de un receptor de alta afinidad que contiene una cadena de receptor \alpha y \beta. Curiosamente, las células TH1 utilizan una modificación del receptor para conseguir un estado resistente a IFN-\gamma (Pernis, Science 269 (1995), 245-247). La diferencia específica de subtipo en la activación de la vía de señalización de IFN-\gamma entre las células T auxiliares de tipo 1 y tipo 2 se debe a la falta del receptor \beta de IFN-\gamma en las células T de tipo 1. Por lo tanto, los datos aquí presentados permitirían argumentar que un receptor de IFN-\gamma de alta afinidad que contenga ambas cadenas está principalmente expresado en las células del músculo liso de la neoíntima.

De forma coherente con una activación de la señalización de IFN-\gamma, se encontró la regulación positiva en neoíntima de dos factores de transcripción que son esenciales para la señalización de IFN: IRF-1 y ISGF3\gamma (p48).

Se sabe que estos factores de transcripción están bajo regulación positiva en la transcripción por IFN-\gamma (Der, Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1998), 15623-15628) y que ambos representan un papel clave en la señalización de IFN-\gamma (Matsumoto, Biol. Chem. 380 (1999), 699-703; Kimuar, Genes Cells 1 (1996), 115-124; Kirchhoff, Nucleic Acids Res. 21 (1993), 2881-2889; Kano, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257 (1999), 672-677). Asimismo, se observó una regulación positiva de la tirosina quinasa Pyk2, de la que se ha demostrado que desempeña un importante papel en la transducción de señal por angiotensina en SMC (Sabri, Circ. Res. 83 (1998), 841-851). IFN-\gamma activa de forma selectiva a Pyk2 y la inhibición de Pyk2 en células NIH 3T3 da lugar a una fuerte inhibición de la activación inducida por IFN-\gamma de MAPK y STAT1 (Takaoka, EMBO J. 18 (1999), 2480-2488).

Un evento esencial en la inhibición de crecimiento inducida por IFN-\gamma y en la apoptosis es la inducción de caspasas (Dai, Blood 93 (1999), 3309-3316). Se ha demostrado que IRF-1 induce la expresión de caspasa-1 provocando la apoptosis en SMC vasculares (Horiuchi, Hypertension 33 (1999), 162-166), y que las SMC apoptóticas y los macrófagos se colocalizan con caspasa-1 en aterosclerosis (Geng, Am. J. Pathol. 147 (1995), 251-266). En estos estudios se halló una regulación positiva de los genes regulados por IFN-\gamma de la caspasa-1, caspasa-8 y DAP-1 en neoíntima humana. Sin embargo, los mRNA de las proteínas antiapoptóticas BAG-1, Pim-1 (ambas reguladas por IFN-\gamma) y de la proteína A1 relacionada con BCL2 también estaban regulados positivamente en neoíntima frente al control (Fig. 16), lo que apoya el concepto de que la proliferación y la apoptosis tienen lugar de forma simultánea en la neoíntima humana con una preponderancia de la proliferación.

La regulación coordinada de los genes cuyos productos actúan en diferentes pasos en el proceso neointimal constituyó un tema recurrente en nuestro análisis de la expresión génica. En cuanto a la vía de IFN-\gamma, no solo se indujeron los genes para el receptor completo, los principales factores de transcripción y los componentes de la vía de transducción de señal (Dap-1, BAG-1, Pim-1, proteína inducible por IFN-\gamma, proteína 9-27 inducible por IFN) sino también varios genes diana de la vía de IFN-\gamma, como CD40, CD13 y trombospondina-1 (Fig. 16).

La agrupación de genes regulados por IFN-\gamma se expresó en los especímenes de neoíntima, pero algunos de los genes importantes, como IRF-1, también se expresaron en muestras de sangre. Para identificar el tipo celular que participaba de forma predominante en el patrón regulado de IFN-\gamma, se tiñeron secciones congeladas de especímenes de neoíntima procedentes de reestenosis intra-stent coronaria (n=3) y de reestenosis de arterias periféricas (n=6) con anticuerpos específicos para IRF-1. Se esocogió esta proteína porque es un componente esencial de la vía de transducción de señal de IFN-\gamma (Kimura, loc. cit.) y se expresó de forma coordinada con los otros genes de la agrupación (Fig. 16). El análisis inmunohistoquímico reveló una intensa tinción nuclear y citoplasmática de IRF-1 en SMC neointimales de una reestenosis carotídea (Fig. 17) y de reestenosis coronaria intra-stent (Fig. 18), identificadas por sus núcleos en forma de huso y por la tinción con el marcador de células del músculo liso \alpha-actina (Fig. 18). La tinción nuclear de IRF-1 en reestenosis intra-stent (Fig. 18) indicó que el factor de transcripción IRF-1 también está activado. Las SMC en media control de arterias carótidas no mostró tinción de IRF-1 (Fig. 17). Las células CD3-positivas eran mucho menos abundantes en el espécimen (Fig. 18) que las SMC (Fig. 18), lo que indica que las SMC contribuyeron en su mayor parte a la expresión aumentada de IRF-1 en neoíntima humana.

La presencia de IFN-\gamma en lesiones ateroscleróticas humanas está bien establecida (Ross, N., Engl. J. Med. 340 (1999), 115-128) aunque su función todavía no se conoce. Mientras I FN-\gamma inhibe la proliferación e induce la apoptosis en SMC in vitro (Horiuchi, loc. cit.; Warner, J., Clin. Invest. 83 (1989), 1174-1182), la ausencia de IFN-\gamma reduce la hiperplasia intimal en modelos de ratón de ateroma y de arteriosclerosis asociada al trasplante (Gupta, J. Clin. Invest. 99 (1997), 2752-2761 ; Raisanen-Sokolowski, Am. J. Pathol. 152 (1998), 359-365). Acorde con esta observación, se demostró que IFN-\gamma induce la arteriosclerosis en ausencia de leucocitos en tejidos arteriales humanos y porcinos mediante su inserción en la aorta de ratones inmunodeficientes (Tellides, Nature 403 (2000), 207-211).

El papel de los linfocitos T infiltrados en neoíntima de reestenosis intra-stent todavía no se ha estudiado. En este estudio se mostró que las células CD3-positivas se pueden detectar mediante inmunobioquímica en 3 de cada 4 muestras de neoíntima (véase la Fig. 18), y se obtuvo una señal de hibridación específica de CD3 en arrays de cDNA en 7 de cada 10 especímenes de neoíntima (Fig. 18). También se observaron patrones de expresión relacionados con IFN-\gamma en muestras negativas para CD3 examinadas por cualquier método lo que sugiere que la citocina podría actuar en neoíntima de forma paracrina a una cierta distancia sin necesidad de una infiltración masiva de células T.

A pesar de que se sabe que las células T y la citocina proinflamatoria IFN-\gamma desempeñan un papel importante en la aterosclerosis (Ross, loc. cit.), su papel en el desarrollo de la neoíntima es muy desconocido. Los datos aquí proporcionados sugieren un papel importante de IFN-\gamma en la fisiopatología de la hiperplasia neointimal.

Ejemplo VIII

Preparación de una línea celular sustitutiva

Una línea celular sustitutiva para una célula o tejido patológicamente modificados puede prepararse según los pasos que se describen a continuación:

a) Definición del patrón de expresión génica/transcriptoma del tejido enfermo

Es posible obtener especímenes microscópicos de tejido enfermo por aterectomía, vaciado, biopsia, disección por láser de tejido enfermo o disección quirúrgica macroscópica de tejido enfermo. Una vez adquiridos, los especímenes microscópicos se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido y se conservan en nitrógeno líquido hasta que se lleva a cabo la preparación de mRNA para así preservar el estatus in vivo de los transcriptomas de las muestras.

Las células de estas muestras expresan un conjunto particular de genes lo que se ve reflejado en la presencia de moléculas de mRNA diferentes a diversas concentraciones. La totalidad de las moléculas de mRNA y sus cantidades relativas en una muestra clínica dada es lo que denominamos el transcriptoma. Se espera que el transcriptoma de un tejido enfermo sea diferente del de un tejido sano. Las diferencias están relacionadas con la expresión regulada positiva o negativamente de genes implicados en la causa, el mantenimiento o la indicación del estado enfermo del tejido. El análisis del transcriptoma está característicamente limitado por el número de elementos de cDNA que lleva un array en particular.

La preparación y amplificación de mRNA se lleva a cabo de acuerdo con el método de la invención aquí descrito anteriormente.

En concreto, los especímenes microscópicos de tejido enfermo se congelan rápidamente y se conservan en nitrógeno líquido hasta que se lleva a cabo la preparación de mRNA y síntesis de cDNA como ya se ha descrito antes. El tejido congelado es molido en nitrógeno líquido y el polvo congelado disuelto en tampón de lisis según el procedimiento de preparación de RNA. Se centrifuga el lisado durante 5 min a 10.000 g a 4ºC para eliminar los residuos celulares. El RNA se puede preparar en forma de RNA total o de mRNA, como ya se ha descrito en (Schena, Science 270 (1995), 467-470), en Current Protocols, en el Clontech manual for the Atlas cDNA Expression Arrays o como se describe en (Spirin, Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 40 (1999), 3108-3115), como se describe en (Chee, Science 274 (1996), 610-614; Alon, Proc. Natl. Acad. Sci. 96 (1999), 6745-6750; Fidanza, Nucleosides Nucleotides 18 (1999), 1293-1295; Mahadevappa, Nat. Biotechnol. 17 (1999), 1134-1136; Lipshutz, Nat. Genet. 21 (1999), 20-24) para los arrays de Affymetrix o como describe Qiagen.

La preparación y marcaje del cDNA se puede realizar como describe Clontech o Affymetrix en el manual de usuario para los equipos de arrays de hibridación o como se describe en (Spirin, loc. cit.; Chee, loc. cit.; Alon, loc. cit.; Fidanza, loc. cit.; Mahadevappa, loc. cit.; Lipshutz, loc. cit.). Además, es posible utilizar cDNA amplificado. La preparación de productos de amplificación de cDNA y el marcaje del cDNA amplificado se puede llevar a cabo como se ha descrito antes o como describe Spirin (loc. cit.).

El cDNA marcado obtenido se puede emplear en ensayos de hibridación. La hibridación del cDNA marcado y el análisis de datos se pueden realizar bajo las condiciones descritas en el manual de usuario del AtlasTM cDNA Expression Arrays User Manual de Clontech o en el manual del fabricante de Affymetrix o como se describe en (Spirin, loc. cit.; Chee, loc. cit.; Alon, loc. cit.; Fidanza, loc. cit.; Mahadevappa, loc. cit.; Lipshutz, loc. cit.).

b) Definición del patrón de expresión génica / transcriptoma del tejido control

Para identificar patrones de expresión génica específicos de enfermedades, el patrón de expresión génica del tejido enfermo se puede comparar con el material control de donantes sanos. Este último, en el caso de material de aterectomía, puede ser media o íntima sana de arterias no elásticas, es decir, musculares. En el caso de biopsias de miocardio o biopsias renales, se puede utilizar tejido control sano recogido en el transcurso de la operación. Además, es posible analizar el patrón de expresión génica de células de tejido colindante no afectado o de células infiltradas, como las células hemáticas. El transcriptoma se puede determinar a partir de líneas celulares humanas en cultivo del mismo tipo, basándose en la caracterización celular de un tejido mediante el análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpos para proteinas de marcaje celular. (Ejemplo: las arterias dan positivo para células del músculo liso y células endoteliales; consecuentemente los transcriptomas se obtienen a partir de células humanas endoteliales y del músculo liso en cultivo).

La preparación y amplificación de mRNA se puede realizar como ya se ha descrito antes y de acuerdo con el método de la presente invención. El cDNA obtenido (marcado) puede utilizarse en ensayos de hibridación como se ha descrito antes.

c) Determinación de un conjunto relevante de genes específicos de enfermedad

Para determinar patrones de expresión génica específicos de enfermedad se debe comparar primero el patrón de expresión génica del tejido enfermo con el patrón de expresión génica del tejido control sano. Para realizar esto es necesario comparar el valor medio de expresión de un número suficiente de especímenes enfermos (p. ej., 10) y el mismo número de especímenes control. La expresión relativa de los genes que entre estos dos grupos presenten una diferencia en el índice de expresión > a 2,5 veces se debe analizar en un grupo: debería haber >5/10 positivos en un grupo si hay 0/10 en el otro, o al menos 7/10 en un grupo si hay como máximo 3/10 positivos en el otro grupo. Además, estos datos deben analizarse estadísticamente para definir genes con una p<0,05 mediante, p. ej., el Test de Wilcoxon como se describe en el manual de SPSS 8.0.

A los genes seleccionados en base a su sobre o infraexpresión significativa según un factor de 2,5 se les denomina como regulados de forma aberrante en el tejido enfermo, o como genes relacionados con enfermedades. Entonces, los genes relacionados con enfermedades se agrupan según las funciones de las proteínas codificadas. Algunos ejemplos son los genes que codifican proteínas de la vía de señalización, citocinas, quimiocinas, hormonas, sus receptores, proteínas específicas de células infiltradas; o proteinas involucradas en la matriz extracelular, la adhesión, migración o división celulares o el paro del ciclo celular. Del mismo modo se pueden identificar genes de función desconocida, disponibles a partir de las bases de datos EST públicas, como relacionados con enfermedades.

d) Cribado en busca de una línea celular con un transcriptoma lo más parecido al del tejido enfermo

Es posible descubrir fármacos que pueden regular potencialmente la expresión de genes enfermos mediante el cribado de grandes bibliotecas de sustancias químicas o biológicas. Para poder identificar estos fármacos, debe estar disponible una línea celular de cribado que refleje fielmente el transcriptoma del tejido enfermo y debe estarlo en grandes cantidades para la realización de un cribado de fármacos exhaustivo. Además, se necesita información de cómo el candidato a fármaco debe alterar al transcriptoma de la línea celular que tiene las características del transcriptoma del tejido enfermo. Esta información se obtiene a partir del transcriptoma del tejido control sano. El fármaco debe ser capaz de restablecer las características de un transcriptoma "sano". Se debe utilizar una línea celular humana que sea lo más similar posible al origen celular del tejido enfermo, por ejemplo, células del músculo liso de arteria coronaria para aterectomía, células HepG2 para enfermedades hepáticas, células renales para nefropatías o cardiomioblastos para cardiomiopatías. Las células se deben cultivar bajo las condiciones estándar descritas en el manual del fabricante, como los manuales de ATCC.

El análisis del transcriptoma/patrón de expresión génica se puede realizar como se ha descrito para el tejido enfermo y el control, y se debe comparar el patrón de expresión génica con el patrón de expresión génica del tejido enfermo y el sano. Para generar una línea celular de cribado sustitutiva, se debe seleccionar la línea celular que muestre un transcriptoma lo más similar posible al transcriptoma enfermo.

e) Adaptación de una línea celular para imitar un transcriptoma/patrón de expresión génica enfermo

Con el fin de generar una línea celular de cribado sustitutiva para el tejido enfermo, puede ser necesario adaptar el transcriptoma de la línea celular seleccionada al transcriptoma del tejido enfermo. Por un lado, esto se puede conseguir mediante la incubación de la línea celular con compuestos como citocinas o hormonas, de las que está demostrado que desempeñan un papel importante en el patrón de expresión génica del tejido enfermo. Igualmente, estos compuestos se pueden identificar mediante el análisis del transcriptoma del tejido enfermo, como se ha ejemplificado con neoíntima, donde se obtuvieron pruebas de un rol del interferón-gamma. En lugar de la adición de compuestos relevantes para la enfermedad, la línea celular de cribado puede condicionarse mediante el cocultivo con otros tipos celulares relevantes para la fisiopatología de la enfermedad. Estas células pueden ser, por ejemplo, células inflamatorias, como macrófagos o células T, que migran dentro del tejido enfermo y, a través de la liberación de factores o del contacto célula-célula, contribuyen al patrón de expresión génica específico de enfermedad. En cada caso, el análisis del transcriptoma de la línea sustitutiva debe identificar la adición óptima para generar un patrón de expresión específico de enfermedad.

Los compuestos que pueden utilizarse para la adaptación del transcriptoma de una línea celular sustitutiva al estado enfermo incluyen citocinas, factores de crecimiento, compuestos de pequeño tamaño molecular (fármacos) o péptidos y peptidomiméticos. Las líneas celulares que se pueden utilizar para esta adaptación comprenden líneas celulares monocíticas humanas, como la U937, la THP-1 o la Monomac-6, o líneas de células T humanas como la Jurkat.

Para el cribado farmacológico se seleccionan las condiciones de cocultivo/tratamiento que lleven a una línea celular sustitutiva hacia un estado lo más cercano posible al transcriptoma enfermo.

A continuación, un ejemplo específico ilustrará la preparación de un sustitutivo. En concreto, se prepara una célula (línea) sustitutiva para tejido reestenótico siguiendo los siguientes pasos:

a) Adquisición de tejido reestenótico intra-stent Pacientes

El grupo de estudio de reestenosis intra-stent constaba de 13 pacientes a los que se practicó procedimientos separados de aterectomía mediante X-sizer en el stent vuelto a estrechar, entre 4 y 23 meses después de la primera implantación de stent. Todos los pacientes dieron consentimiento informado al procedimiento y recibieron, como tratamiento estándar, 15.000 unidades de heparina antes de la intervención seguidas de una infusión intravenosa de heparina, 1.000 unidades/h durante las primeras 12 h después de la retirada de la vaina. A todos los pacientes se les administró 500 mg de ácido acetilsalicílico por vía intravenosa antes de la cateterización. El tratamiento postintervencional antitrombótico consistió en ticlopidina (250 mg bds) y ácido acetilsalicílico (100 mg bds) a lo largo del estudio.

Preparación de muestras

Los especímenes de aterectomía se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido tras el vaciado de la lesión y se conservaron en nitrógeno líquido hasta que se realizó la preparación de mRNA del modo descrito. Para la histología e inmunohistoquímica del tejido reestenótico intra-stent de arterias coronarias (n=3), se fijaron las muestras en paraformaldehído al 4% y se incluyeron en parafina del modo descrito.

Caracterización morfológica de tejido reestenótico

La inmunohistoquímica para el tipado celular se realizó sobre secciones incluidas en parafina de tres especímenes de neoíntima procedente de reestenosis intra-stent coronaria y, para la detección de FKBP12, sobre secciones congeladas de cuatro especímenes de neoíntima procedente de reestenosis carotídea. Se montaron secciones seriadas de 3 \mum sobre portaobjetos DAKO ChemMate^{TM} Capillary Gap Microscope (100 \mum), se calentaron a 65ºC durante toda la noche, se desparafinizaron y se deshidrataron según los protocolos estándar. Para la extracción de antígenos, se hirvieron los especímenes durante 4 min en una olla a presión en tampón citrato (10 mM, pH 6,0). La peroxidasa endógena se bloqueó con H_{2}O_{2}/metanol al 1% durante 15 minutos. La unión inespecífica del anticuerpo primario se redujo mediante la preincubación de los portaobjetos con leche desnatada en polvo al 4% en diluyente de anticuerpos (DAKO, Dinamarca). Se realizó una immunotinción a través de la técnica de la estreptavidina-peroxidasa utilizando el equipo ChemMate Detection Kit HRP/Red Rabbit/Mouse (DAKO, Dinamarca) según la descripción del fabricante. Los procedimientos se llevaron a cabo en un sistema de tinción automática DAKO TechMate^{TM} 500 Plus. Los anticuerpos primarios antiactina del músculo liso (M0635, DAKO, Dinamarca; 1:300), CD3 (A0452, DAKO, Dinamarca; 1:80), MAC387 (E026, Camon, Alemania; 1:20) y FKBP12 (SA-218, Biomol, Alemania, 1:20) se diluyeron en diluyente de anticuerpo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la contratinción nuclear con hematoxilina, los portaobjetos se deshidrataron y se les colocó un cubreobjetos Pertex (Medite, Alemania).

La composición celular de material reestenótico Intra-stent vaciado

Se analizaron inmunohistoquímicamente muestras representativas obtenidas del tratamiento con x-sizer de una hiperplasia neointimal para determinar su composición celular. La figura 7A muestra una tinción de E.-van Giesson de una sección obtenida de una muestra pequeña de material reestenótico vaciado. Con este procedimiento de tinción las fibras de colágeno se tiñen de rojo, la fibrina se tiñe de amarillo y el citoplasma de las células del músculo liso se tiñe de un marrón amarillo oscuro. La mayor parte del volumen de material vaciado estaba formado por fibras de colágeno desorganizadas del tipo de la matriz extracelular teñidas de un rojo claro. La tinción amarilla de fibrina era prácticamente indetectable. Las células con núcleos en forma de huso y un citoplasma teñido de amarillo/marrón eran frecuentes. La immunotinción con un anticuerpo anti \alpha-actina del músculo liso (Fig. 7B), además de su gran abundancia en material reestenótico, reafirmó su identidad como células del músculo liso. En esta figura se muestra el patrón de tinción de una sección de un espécimen completo como el que se utiliza para los análisis de expresión génica. Como se describe más adelante, estas muestras también dieron lugar a una fuerte señal de mRNA de \alpha-actina específica de músculo liso (véase la Fig. 8). Estos resultados apoyan los obtenidos en estudios previos (Kearney, Circulation 95 (1997), 1998-2002; Komatsu, Circulation 98 (1998), 224-233; Strauss, J. Am. Coll. Cardiol. 20 (1992), 1465-1473) demostrando así que el tipo celular principal encontrado en la neoíntima deriva de células del músculo liso. Como se describe en los trabajos publicados (Kearney, loc. cit.; Komatsu, loc. cit.; Strauss, loc. cit.), también se pudieron identificar infiltrados mononucleares en algunas áreas de espécimen de tejido reestenótico vaciado. Estos infiltrados estaban principalmente constituidos por macrófagos y, en menor medida, por linfocitos T. No se pudieron detectar linfocitos B en el tejido reestenótico utilizando un anticuerpo anti CD20 para la tinción inmunohistoquímica.

b) Análisis del transcriptoma de material reestenótico

El análisis del transcriptoma de neoíntima se realizó utilizando el método de amplificación de mRNA descrito anteriormente.

Preparación de mRNA

Se congelaron rápidamente especímenes microscópicos de tejido enfermo y se conservaron en nitrógeno líquido hasta que se llevó a cabo la preparación de mRNA y la síntesis de cDNA. El tejido congelado se molió en nitrógeno líquido y el polvo congelado se disolvió en tampón de lisis/unión (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, LiCl 500 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0, 1% LiDS, ditiotreitol (DTT) 5 mM) y se homogeneizó hasta obtener una lisis completa. El lisado se centrifugó durante 5 min a 10.000 g a 4ºC para eliminar los residuos celulares. El mRNA se preparó utilizando el equipo Dynbeads® mRNA Direct Kit^{TM} (Dynal, Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Enseguida se añadió el lisado a 50 \mul por muestra de Oligo (dT)_{25} Dynabeads prelavados y el mRNA se híbrido mediante la rotación en un mezclador durante 30 min a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y se lavó dos veces el complejo Oligo (dT)_{25} Dynabeads/mRNA con tampón de lavado que contenía Igepal (Tris-HCl 50mM, pH 8,0, KCl 75 mM, DTT 10 mM, Igepal al 0,25%) y una vez con tampón de lavado que contenía Tween-20 (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, KCl 75 mM, DTT 10 mM, Tween-20 al 0,5%).

Preparación de CDNA amplificado

El cDNA es amplificado por PCR utilizando el procedimiento de Klein et al. (C. Klein et al.). La síntesis de la primera cadena de cDNA se llevó a cabo como una síntesis de cDNA en fase sólida. Para la reacción de transcripción inversa se utilizó el cebado aleatorio con cebadores hexanucleotídicos. Se realizó la transcripción inversa de cada uno de los mRNA en un volumen de reacción de 20 \mul con 1x tampón First Strand (Gibco), DTT 0,01 M (Gibco), Igepal al 0,25%, cebador CFL5c 50 \muM [5'-(CCC)_{5} GTC TAG A (NNN)_{2}-3'], dNTP 0,5 mM para cada uno (MBI Fermentas) y 200 U de Superscript II (Gibco), y se incubaron a 44ºC durante 45 min. Se llevó a cabo una posterior reacción de adición de colas en un volumen de reacción de 10 \mul que contenía MgCl_{2} 4 mM, DTT 0,1 mM, dGTP 0,2 mM, KH_{2}PO_{4} 10 mM y 10 U de desoxinucleótido transferasa terminal (MBI Fermentas). La mezcla se incubó durante 24 min a 37ºC.

El cDNA se amplificó por PCR en un volumen de reacción de 50 \muL con 1 x tampón 1 (Expand™ Long Template PCR Kit, Boehringer Mannheim), formamida desionizada al 3%, cebador CP2 120 \muM [5'-TCA GAA TTC ATG (CCC)_{5}-3'], dNTP 350 \muM y 4,5 U de DNA-Polimerase-Mix (Expand^{TM} Long Template PCR Kit, Roche Diagnostics, Mannhein). La reacción PCR se realizó durante 20 ciclos siguiendo los siguientes parámetros de ciclo: 94ºC durante 15 s, 65ºC durante 0:30 min, 68ºC durante 2 min; durante otros 20 ciclos con: 94ºC durante 15 s, 65ºC durante 30 s, 68ºC durante 2:30 + 0:10/ciclo min; 68ºC durante 7 min; 4ºC hasta el final.

Expresión de genes específicos en muestras microscópicas de tejido humano

Con el fin de preservar de forma óptima los niveles de mRNA in situ, los especímenes reestenóticos y control se congelaron inmediatamente tras ser recogidos en nitrógeno líquido y se lisaron cuidadosamente como se describe en los Materiales y Métodos. Tras la amplificación por PCR del cDNA sintetizado se midió la cantidad del cDNA amplificado mediante un ensayo dot blot y se halló que se encontraba entre 200-300 ng/\mul. La calidad de cada muestra de cDNA amplificado se enasyó mediante PCR específica de gen utilizando cebadores de detección de los cDNA para \beta-actina, \alpha-actina de células del músculo liso y el factor de elongación ubicuo EF-1\alpha. La figura 8 muestra un resultado representativo con material del paciente B y media control del donante b. En ambos especímenes se pudieron detectar señales de PCR del tamaño correcto de los genes "housekeeping" \beta-actina y EF-1\alpha en cantidades equivalentes (compárense los carriles 1 y 2 con los carriles 4 y 5). Además, de cada espécimen se obtuvieron señales de \alpha-actina como marcador de células del músculo liso (carriles 3 y 6). Estos resultados muestran que la preparación de mRNA, la síntesis de cDNA y la amplificación por PCR de cDNA son factibles con muestras microscópicas de reestenosis humana.

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Marcaje con Dig-dUTP de sondas de cDNA

Se marcaron 25 ng de cada cDNA con Digoxigenina-11-dUTP (Dig-dUTP) (Roche Diagnostics) durante la PCR. Esta reacción se realizó en 50 \muL de volumen de reacción con lx tampón 1, cebador CP2120 \muM, formamida desionizada al 3%, dTTP 300 \muM, dATP 350 \muM, dGTP 350 \muM, dCTP 350 \muM, Dig-dUTP 50 \muM y 4,5 U de DNA-Polimerase-Mix. Los parámetros del ciclo fueron: un ciclo: 94ºC durante 2 min; 15 ciclos: 94ºC durante 15 s, 63ºC durante 15 s, 68ºC durante 2 min; 10 ciclos: 94ºC durante 15 s, 68ºC durante 3 min + 5 s/ciclo; un ciclo: 68ºC, 7 min, 4ºC hasta el final.

Hibridación de arrays de cDNA Clontech con sondas de cDNA marcadas con dUTP

Los arrays de cDNA se prehibridaron en solución DigEASYHyb (Roche Diagnostics) que contenía 50 mg/l de DNA genómico de E. coli digerido en DNasel (Roche Diagnostics), 50 mg/l de DNA de plásmido pBluescript y 15 mg/l de DNA de esperma de arenque (Life Technologies) durante 12 h a 44ºC para reducir el ruido de fondo al bloquear los sitios de unión no-específica de ácido nucleico sobre la membrana. La solución de hibridación se híbrido con arrays de cDNA comercializados con genes seleccionados importantes para la respuesta al cáncer, cardiovascular y al estrés (Clontech). Cada molde de cDNA se desnaturalizó y se añadió a la solución de prehibridación a una concentración de 5 \mug/ml de cDNA marcado con Dig-dUTP. La hibridación se llevó a cabo durante 48 horas a 44ºC.

Posteriormente se enjuagaron los "blots" una vez en 2x SSC/0,1% SDS y una vez en 1 x SSC/0,1% l SDS a 68ºC seguido de un lavado de 15 min en 0,5x SSC/0,1% SDS y dos lavados de 30 min en 0,1x SSC/0,1% SDS a 68ºC. Para la detección del cDNA marcado con Dig hibridado con el array, se utilizó el equipo Dig Luminescent Detection Kit (Boehringer, Mannheim) como se describe en el manual de usuario. Para la detección de la señal quimioluminiscente se expusieron los arrays a películas quimioluminiscentes durante 30 min a temperatura ambiente. La cuantificación de los datos de los arrays se llevó a cabo mediante el cribado de las películas y el análisis con programas informáticos de visualización de arrays (Imaging Research Inc., St. Catharines, Canada). Se eliminó el ruido de fondo y se normalizaron las señales a los nueve genes "housekeeping" presentes en cada filtro situando la media de las señales de expresión de los genes "housekeeping" en 1 y el ruido de fondo en 0.

Cada sonda marcada se híbrido con tres arrays de cDNA comerciales diferentes lo que permitió el análisis de la expresión de un total de 2.435 genes conocidos. La figura 9 muestra un patrón de hibridación representativo obtenido con un array utilizando sondas preparadas a partir de tejido reestenótico del paciente B (panel A) y media del donante b (panel B). De una forma coherente con el análisis específico de gen mostrado en la Figura 8, se obtuvieron señales de hibridación comparables con el control positivo de cDNA genómico humano situado en los carriles inferiores de la derecha del array y con los puntos de cDNA de diversos genes "housekeeping" (véase, por ejemplo, los puntos D). Si se omitía un espécimen biológico de la síntesis de cDNA y de las reacciones de amplificación por PCR, casi no se obtenían señales de hibridación (Fig. 9, panel C), lo cual mostraba que las señales de hibridación prácticamente derivaban solo de las muestras añadidas y no de contaminaciones de DNA en los reactivos o materiales utilizados.

Análisis de datos

La cuantificación de los datos de array se realizó mediante el cribado de las películas y el análisis con programas informáticos de visualización de arrays (Imaging Research Inc., St. Catharines, Canada). Se eliminó el ruido de fondo y las señales se normalizaron a los nueve genes "housekeeping" presentes en cada filtro situando la media de las señales de expresión de los genes "housekeeping" en 1 y el ruido de fondo en 0. Para la presentación logarítmica mostrada en las figuras 13A y 13B, los valores se multiplicaron por 1000. Un valor medio >0,05 en la media de todas las muestras de un grupo se consideró como una señal positiva. Las diferencias en el nivel de expresión medio según un factor >2,5 entre los grupos de estudio y control se continuaron analizando estadísticamente.

c) Elección del tejido control

Dado que el principal componente celular de la neoíntima consiste en las células del músculo liso, se tomó media y media/íntima de arterias coronarias sanas o, ya que las arterias coronarias pertenecen a las arterias no elásticas sino musculares, arterias musculares como tejido control.

El grupo control estaba formado por 6 especímenes de arterias coronarias provenientes de tres pacientes diferentes a los que se había practicado un trasplante de corazón. Además, se tomaron como control 5 especímenes de arterias musculares del tubo gastrointestinal de cinco pacientes diferentes porque las arterias coronarias son histológicamente arterias musculares. Los especímenes control se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Previamente a la preparación de mRNA, se prepararon la media e íntima de las arterias control y, mediante procesos inmunohistoquímicos, se examinaron los posibles cambios ateroscleróticos. Si no había cambios ateroscleróticos de la morfología vascular, los especímenes (aprox. 1x1 mm) se utilizaron como muestras control sanas y la preparación de mRNA y cDNA y el análisis del transcriptoma se llevó a cabo de la forma antes descrita para tejido neoíntimal.

d) Definición del perfil de expresión génica específico de neoíntima

Un total de 1.186 genes (48,7%) de 2.435 produjeron señales detectables de hibridación en arrays de cDNA con muestras de neoíntima y control sobre un rango de nivel de expresión 20 veces superior (Fig. 13A). De estos, 352 genes (14,5%) parecían estar expresados diferencialmente entre las muestras reestenóticas y control según un factor >2,5. Sin embargo, los niveles de expresión variaban considerablemente entre muestras individuales (véase, p. ej., Fig. 9). Por lo tanto, se empleó un análisis estadístico para identificar aquellos genes que están expresados diferencialmente entre los grupos de estudio y control con una elevada significación (véase aquí arriba). De este modo, se identificaron 224 genes (9,6%) que estaban expresados diferencialmente, según un factor de al menos 2,5, entre el grupo de estudio de reestenosis y el grupo control con una significación en el Test de Wilcoxon de p<0,03. De estos genes, 167 (75%) estaban sobreexpresados y 56 (25%) infraexpresados en el grupo de estudio de reestenosis comparado con el grupo control (Fig. 13B).

e) Elección de una línea celular sustitutiva

La neoíntima humana está formada por una población celular heterogénea. Por esta razón se intentó relacionar los patrones de expresión génica diferenciales estadísticamente relevantes encontrados en neoíntima con patrones en los que finalmente han contribuido células hemáticas periféricas de los pacientes y CASMC humanas en cultivo, es decir, las células que se encuentran con más frecuencia en el tejido reestenótico (Komatsu, loc. cit.). Por lo que respecta a la expresión en la neoíntima, los 224 genes regulados de forma aberrante se clasificaron en cuatro subgrupos (Fig. 14). El grupo I contiene 62 genes que estaban sobreexpresados en neoíntima y no muy expresados, o no de forma detectable, en vasos control, CASMC o células hemáticas (Fig. 14A). El grupo II lo integran 43 genes que estaban expresados de forma similar en neoíntima y CASMC, lo que sugiere que esta agrupación de genes en neoíntima contaba con la intervención de SMC proliferativas (Fig. 5B). El grupo III incluye 62 genes que están expresados de forma similar en neoíntima y células hemáticas, lo que sugiere que esta agrupación de genes contaba en neoíntima con la intervención de células hemáticas infiltradas (Fig. 14C). Este concepto viene apoyado por la expresión en el grupo III del mayor número de genes relacionados con la inflamación de los cuatro grupos. Por último, el grupo IV incluye 56 genes que están regulados negativamente en neoíntima comparado con el grupo control (Fig. 14D).

Regulación positiva de genes relacionados con IFN-\gamma en Neoíntima

Una característica sorprendente del transcriptoma de la neoíntima humana es la aparentemente coordinada regulación positiva de 32 genes relacionados con la señalización de IFN-\gamma (Fig. 16). El receptor alfa de IFN-\gamma estaba expresado en neoíntima, CASMC proliferativas y, en menor medida, en células hemáticas; mientras que el receptor beta de IFN-\gamma estaba expresado principalmente en los especímenes de neoíntima. De forma coherente con una activación de la señalización de IFN-\gamma, se encontró la regulación positiva en neoíntima de dos factores de transcripción que son esenciales para la señalización de IFN: IRF-1 y ISGF3\gamma (p48)(Figs. 14, 15, 16). Se sabe que estos factores de transcripción están bajo regulación positiva en la transcripción por IFN-\gamma, y que ambos son actores clave en la señalización de IFN-\gamma. Asimismo, se observó una regulación positiva de la tirosina quinasa Pyk2 (Fig. 16), de la que se ha demostrado que desempeña un importante papel en la transducción de señal por angiotensina en SMC (Sabri, Circ. Res. 83 (1998), 841-851). IFN-\gamma activa de forma selectiva a Pyk2 y la inhibición de Pyk2 en células NIH 3T3 da lugar a una fuerte inhibición de la activación inducida por IFN-\gamma de MAPK y STAT1. Un evento esencial en la inhibición de crecimiento inducida por IFN-\gamma y en la apoptosis es la inducción de caspasas (Dai, Blood 93 (1999), 3309-3316). En estos estudios se halló una regulación positiva de los genes regulados por IFN-\gamma de la caspasa-1, caspasa-8 y DAP-1 en neoíntima humana. Sin embargo, los mRNA de las proteinas anti-apoptóticas BAG-1, Pim-1 (ambas reguladas por IFN-\gamma) y de la proteína A1 relacionada con BCL2 también estaban regulados positivamente en neoíntima frente al control (Fig. 16), lo que apoya el concepto de que la proliferación y la apoptosis tienen lugar de forma simulténea en la neoíntima humana con una preponderancia de la proliferación.

La agrupación de genes regulados por IFN-\gamma se expresó en los especímenes de neoíntima, pero algunos de los genes importantes, como IRF-1, también se expresaron en muestras de sangre. Para identificar el tipo celular que participaba de forma predominante en el patrón regulado de IFN-\gamma, se tiñeron secciones congeladas de especímenes de neoíntima procedentes de reestenosis intra-stent coronaria (n=3) y de reestenosis de arterias periféricas (n=6) con anticuerpos específicos para IRF-1. Se esocogió esta proteína porque es un componente esencial de la vía de transducción de señal de IFN-\gamma (Kimura, Genes Cells 1 (1996), 115-124) y se expresó de forma coordinada con los otros genes de la agrupación (Fig. 17). El análisis inmunohistoquímico reveló una intensa tinción nuclear y citoplasmática de IRF-1 en SMC neointimales de una reestenosis carotídea (Fig. 17B) y de reestenosis coronaria intra-stent (Fig. 18C), identificadas por sus núcleos en forma de huso y por la tinción con el marcador de células del músculo liso \alpha-actina (Fig. 18B). La tinción nuclear de IRF-1 en reestenosis intra-stent (Fig. 18C) indicó que el factor de transcripción IRF-1 también está activado. Las SMC en media control de arterias carótidas no mostró tinción de IRF-1 (Fig. 17B). Las células CD3-positivas eran mucho menos abundantes en el espécimen (Fig. 18C) que las SMC (Fig. 18D), lo que indica que las SMC contribuyeron en su mayor parte a la expresión aumentada de IRF-1 en neoíntima humana.

\newpage

Definición de las condiciones de cultivo para adaptar el perfil del transcriptoma al del tejido reestenótico: IFN-\gamma

Para adaptar el perfil transcripcional de las células en cultivo del músculo liso de arteria coronaria humana
(CASMC) (Clonetics) al de la neoíntima, se estimularon las CASMC con IFN-g y se realizó el análisis del transcriptoma de la forma antes descrita. Las CASMC se tuvieron en cultivo como se describe en el manual del fabricante en medio de cultivo hasta alcanzar una confluencia del 50%. A continuación, las células se estimularon con 1000 U/ml de IFN-\gamma (R&D, Alemania) durante 18 horas a 37ºC. Las células se lavaron dos veces en PBS y la preparación de RNA, la síntesis y amplificación de cDNA y el análisis del transcriptoma se realzaron de la forma antes descrita.

Como se muestra en la Fig. 19, el patrón de expresión génica de IFN-\gamma específico de neoíntima se pudo generar mediante la incubación de CASMC con 1000 U/ml IFN-\gamma.

Definición del transcriptoma/patrón de expresión génica de neoíntima tras la incubación con un antagonista de IFN-\gamma

Se incubaron especímenes microscópicos de tejido reestenótico intra-stent con un antagonista de IFN-\gamma durante diferentes periodos de tiempo y se realizó el análisis del transcriptoma de la forma descrita. El transcriptoma de la neoíntima tratada se comparó con el transcriptoma de la neoíntima no tratada y del tejido control sano para medir el efecto terapéutico de los antagonistas de IFN-\gamma.

Definición del transcriptoma/patrón de expresión génica de neoíntima tras la incubación con rapamicina

En los trabajos publicados se ha demostrado que la rapamicina, un ligando de la proteína FKBP12 intracelular, inhibe la migración y proliferación de las células del músculo liso y es capaz de reducir la hiperplasia neointimal en un modelo porcino de reestenosis. Se encontró un transcriptoma específico para evaluar el efecto terapéutico de la rapamicina como una regulación positiva significativa de FKBP12 en la neoíntima. Dado que las CASMC proliferativas sobreexpresan FKBP12 como la neoíntima, esta línea celular puede utilizarse como una línea celular sustitutiva potencial para neoíntima con respecto a los efectos terapéuticos de la rapamicina. Por lo tanto, en un primer paso se incubaron CASMC con 100 ng/ml de rapamicina (Sigma) durante 24 horas y el análisis del transcriptoma se realizó para poder hacer un seguimiento del efecto terapéutico. A continuación, se incubaron con rapamicina los especímenes microscópicos de tejido reestenótico intra-stent y el análisis del transcriptoma se realizó de la forma antes descrita. El transcriptoma/patrón de expresión génica de las CASMC tratadas con rapamicina se comparó con el transcriptoma de neoíntima tratada con rapamicina para medir la efectividad de las CASMC como línea celular sustitutiva para neoíntima. Los genes supresores tumorales y los genes inhibidores de la proliferación estaban regulados positivamente en dichas CASMC; por tanto se puede considerar que dichas CASMC son un verdadero sustitutivo para neoíntima.

Ejemplo IX

Expresión proteica regulada positivamente de Emmprin y receptor de transferrina en células tumorales

El análisis del transcriptoma de células individuales micrometastásicas derivadas de pacientes con diferentes estadios de enfermedad y de tumor reveló una expresión regulada positivamente de genes implicados en la regulación del ciclo celular, la organización del citoesqueleto, la adhesión y la actividad proteolítica. Se encontró una expresión potenciada del mRNA de Emmprin mediante hibridación en array en 10 de 26 células micrometastásicas de médula ósea de pacientes con cáncer de mama y de próstata, lo que indica un fenotipo invasivo de estas células. EMMPRIN (inductor de metaloproteinasa de la matriz extracelular, CD147) es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas que está presente en la superficie de las células tumorales y estimula los fibroblastos adyacentes a producir metaloproteinasas de la matriz (MMP; Guo, J. Biol. Chem. 272 (1997), 24-27 y Sameshima, Cancer Lett. 157 (2000), 177-184 y Li, J. Cell Physiol. 186 (2001), 371-379). Los resultados se controlaron mediante PCR específica de gen y mostraron una sensibilidad similar comparado con la hibridación en array. Utilizando una sonda específica de Emmprin diferente para la hibridación en array, el mensaje de Emmprin se detectó incluso en 16 muestras de 26 (61%). Estos resultados enfatizan la sensibilidad del diseño del array para detectar los transcritos del cDNA cebado aleatoriamente de una célula individual.

Con el fin de correlacionar la regulación positiva de la expresión de Emmprin en células tumorales (no solo en mRNA sino también a nivel de proteína), se prepararon portaobjetos a partir de células de médula ósea de pacientes con cáncer de la forma descrita anteriormente (Pantel, Lancet 347 (1996), 649-653). Los portaobjetos se bloquearon utilizando suero AB humano al 10% en PBS durante 20 min. Se realizó un cribado de un millón de células de médula ósea de cada muestra en busca de la presencia de células positivas para citoqueratina, que es un marcador de células epiteliales. Se llevó a cabo un procedimiento de tinción doble empleando el anticuerpo MEM 6/2 específico de EMMPRIN (Koch, Int. Immunol. 11 (1999), 777-86) y un anticuerpo A45 B/B3 conjugado con biotina que reacciona con varios miembros de la familia de las citoqueratinas. Las incubaciones con anticuerpos fueron las siguientes: MEM 6/2, 45 min, 5 \mug/ml; Z259 y complejo APAAP de acuerdo con las instrucciones del fabricante (DAKO). Los portaobjetos se lavaron 3 x 3 min. en PBS entre todas las incubaciones de anticuerpo. Antes de la adición del fragmento A45 B/B3-biotina F (ab)_{2}, se realizó un paso de bloqueo adicional con suero murino al 10% en PBS durante 20 min. El conjugado A45 B/B3-biotina (2 \mug/ml; 45 min.) se detectó mediante estreptavidina-Cy3 (1,2 \mug/ml; 15 min; Jackson laboratories). Tras el lavado, se utilizó FAST-BLUE (Sigma) como sustrato para la fosfatasa alcalina (10-30 min). El procedimiento se llevó a cabo con controles isotipo iguales para todos los portaobjetos. EMMPRIN se detectó en el 82% de las 140 células tumorales positivas para citoqueratina derivadas de 68 pacientes con cáncer de mama, próstata y pulmón (Tab. 8 y Fig. 20). Solo en dos aspirados todas las células citoqueratina-positivas detectadas (n=4) fueron negativas para EMMPRIN.

TABLA 8 Expresión proteica de EMMPRIN (EMM) en células tumorales citoqueratina-positivas (CK+) de médula ósea diseminadas

Número de	Número de pacientes	Número total de	Células	Número de pacientes
pacientes	con células CK+	células CK+	CK+/EMM+	con células con doble
				positivo
68	11/68 (16%)	140	115/140 (82%)	9/11 (82%)

Además de Emmprin, también se evaluó la expresión del receptor de transferrina (CD71) en células tumorales a nivel proteico. El análisis del transcriptoma de seis biopsias pequeñas procedentes de cánceres de pulmón de células no pequeñas y cinco biopsias de mucosa control de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica mostró que la intensidad de señal de CD71 era muy diferente entre el tejido normal y el tumoral (Tabla 9).

TABLA 9 Intensidades de señal del cDNA para el receptor de transferrina en la hibridación en array

Biopsias de tumor	Biopsias de mucosa normal
Bio6	Bio9	Bio10	Bio11	Bio1G	Bio11G	Bio2	Bio3G	Bio5G	Bio6G	Bio14
0	2464	11768	4012	0	5496	0	0	0	100	0

La expresión diferencial se ensayó en criosecciones de biopsia de tumor Bio10 y una biopsia de mucosa normal (Bio6G). La unión inespecífica se bloqueó con suero AB al 10% en PBS durante 20 minutos, y la incubación con anticuerpo conjugado con CD71-PE (ficoeritrina) (Caltag) se realizó durante 45 minutos. Para el control se utilizó un anticuerpo anti CD4-PE. No se observó tinción alguna del anticuerpo CD4 en ninguna muestra de tejido. El anticuerpo CD71-PE tiñó de forma selectiva las regiones epiteliales de la biopsia de tumor, mientras que la mucosa normal fue negativa para la expresión del receptor de transferrina (Fig. 21).

Ejemplo X

Efecto antiapoptótico de IFN-\gamma sobre células del músculo liso

El efecto de IFN-\gamma sobre la supervivencia de SMC proliferativas en cultivo se analizó mediante citometría de flujo. Para llevarlo a cabo, se obtuvieron células primarias humanas del músculo liso coronario a partir de CellSystems (Alemania) y se cultivaron en medio de cultivo para células del músculo liso (CellSystems) que contenía un 5% de suero fetal bovino (CellSystems) a 37ºC en una atmósfera húmeda de CO_{2} al 5%. Las SMC se utilizaron entre los pasos 2 y 4. El tratamiento con 1000 U/ml de rh-IFN-\gamma (R&D Systems) duró 16 h. Para la inducción de la muerte celular, se incubaron las SMC a 37ºC durante 1 h en HBSS que contenía 100 \mumol/l de H_{2}O_{2} y 100 \mumol/l de sulfato ferroso. A continuación, las células se mantuvieron en cultivo con medio de cultivo nuevo durante 8 h. Las células se marcaron con Anexina V marcada con FITC (Roche Diagnostics) y con yoduro de propidio (PI), según las instrucciones del fabricante. Se analizaron 10 eventos con un citómetro de flujo (Becton Dickinson).

El análisis por citometría de flujo reveló un efecto antiapoptótico de IFN-\gamma sobre las SMC (Fig. 22). El análisis FACS tras la doble tinción con PI y Anexina V marcada con FITC mostró una reducción de la apoptosis espontánea del 10% al 6% tras el tratamiento con IFN-\gamma. El efecto se acentuó tras la inducción de apoptosis con H_{2}O_{2}en las SMC. El tratamiento con IFN-\gamma redujo el número de células apoptóticas del 54% al 27%. Estos resultados muestran claramente que IFN-\gamma ejerce un efecto antiapoptótico sobre las SMC.

Ejemplo XI

Efecto inhibidor de IFN-\gamma sobre la formación de neoíntima en un modelo murino para reestenosis

Para examinar el remodelamiento proliferativo vascular tras una ligación carotídea, se utilizó el modelo murino de cese de flujo sanguíneo (Kumar, Circulation 96 (1997), 4333-4342). Este modelo se caracteriza por la proliferación vascular de SMC en respuesta a la ligación de la arteria carótida común cerca de la bifurcación. Para investigar el efecto de una mutación nula en el receptor de IFN-\gamma sobre el desarrollo de neoíntima en un modelo murino de reestenosis, se utilizaron ratones IFN-\gammaR^{-/-} knockout. Se anestesiaron ratones 129/svJ macho adultos (N=16) y ratones IFN-\gammaR^{-/-} (n=11) mediante inyección intraperitoneal de una solución de xilacina (5 mg/kg peso corporal) y ketamina (80 mg/kg peso corporal) y se ligó la arteria carótida izquierda común cerca de la bifurcación. Pasadas cuatro semanas, se volvió a anestesiar a los animales, se les sacrificó y se les fijó durante 3 min mediante percusión con paraformaldehído al 4% en 0,1 mol/l de tampón de fosfato sódico (pH 7,3). Tras la excisión de las arterias carótidas izquierdas, se fijaron los vasos mediante inmersión en etanol al 70%. Las arterias carótidas se incluyeron en parafina y se cortaron secciones seriadas (% \mum de grosor).

Se realizó un análisis morfométrico de cortes transversales con tinción de van Giesson a una distancia de 600 \mum del lugar de ligación. Se analizaron imágenes digitalizadas de los vasos utilizando el software de análisis de imagen SCION image 4.0.2. El grosor de la media se obtuvo como la diferencia de diámetro entre la lámina elástica externa y la interna, y el grosor de la neoíntima como la diferencia entre la lamina elástica interna y el diámetro luminal. Los datos del análisis morfométrico se muestran como media \pm EEM para los dos grupos de ratón y se analizan con el test t para muestras independientes. Se consideró significativo un valor p < 0,05. Todos los análisis se realizaron utilizando el paquete estadístico SPSS (versión 8.0).

Cuatro semanas después de la ligación se observó un engrosamiento considerable de la pared debido a la proliferación de la media y a la formación de neoíntima en 16 ratones wild type (Fig. 23). En 11 ratones IFN-\gammaR^{-/-} el engrosamiento medial e neointimal se vio reducido significativamente, lo que se muestra como media \pm EEM y se analizó mediante el test t para muestras independientes. Correspondiendo a la reducción de respuestas proliferativas, 11 ratones IFN-\gammaR^{-/-} tenían un diámetro luminal del segmento carotídeo tratado significativamente mayor que los ratones wild type (108 \pm 15 \mum frente a 91 \pm 24 \mum y p=0,033).

Ejemplo XII

Análisis de hibridación sustractiva y supresora (SSH)

SSH es un método nuevo y altamente efectivo para la generación de bibliotecas de cDNA sustraído. La hibridación sustractiva de cDNA ha constituido una aproximación potente para la identificación y aislamiento de los cDNA de genes expresados diferencialmente (Duguin, Nucl. Acid. Res. 18 (1990), 2789-2792; Hara, Nucl. Acid. Res. 19 (1991), 7097-7104 y Hendrick, Nature (London) 308 (1984), 149-153). En general, se lleva a cabo la hibridación del cDNA de una población (tester) con un exceso de mRNA (cDNA) de otra población (driver), y la posterior separación de la fracción no hibridada (target) de las secuencias comunes hibridadas. Se utiliza la SSH para amplificar de forma selectiva fragmentos de cDNA diana (expresados diferencialmente) y suprimir simultáneamente la amplificación del DNA no diana. El método se basa en la PCR de supresión: las repeticiones terminales largas invertidas pueden suprimir de forma selectiva la amplificación de secuencias no deseadas en el procedimiento de PCR cuando están unidas a fragmentos de DNA. El problema de diferencias en la abundancia de mRNA se soluciona con un paso de hibridación que iguala la abundancia de secuencias durante el transcurso de la sustracción. Es necesaria una ronda de hibridación sustractiva que conduce a un enriquecimiento en 1000 veces de los cDNA expresados diferencialmente (para revisión véanse
Diatchenko, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 6025-30 y Diatchenko, Methods Enzymol. 303 (1999), 349-80).

Se introdujeron varias modificaciones en el protocolo estándar de SSH para el análisis de la expresión génica diferencial de un número de células muy bajo (Fig. 24). 1) los productos de amplificación de mRNA generados según el método descrito en esta solicitud de patente se habían sometido a transcripción inversa y se había amplificado utilizando cebadores CP2; 2) los productos de amplificación de mRNA generados según el método descrito en esta solicitud de patente forman ellos mismos estructuras "panlike"; 3) introducción de un sitio de reconocimiento de enzima de restricción (p. ej. EcoRI) en el cebador CP2.

a) Materiales y Métodos

Oligonucleótidos

cebador de síntesis de cDNA:

CP2:

5'-TCA GAA TTC ATG CCC CCC CCC CCC CCC C-3'

(ID SEC NÚM.: 14)

Adaptadores

Adaptador 1 (A1)

\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Eco 44 I: \+ 5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG
CGG CTC GCC CGG GCA GG-3'\+\cr  \+ \+ (ID SEC NÚM.:
31)\cr  Eco 12 I:  \+ 5'-AAT TCC TGC
CCG-3'\+\cr  \+ \+ (ID SEC NÚM.:
32)\cr}

\newpage

Adaptador 2 (A2)

\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Eco 43 II: \+ 5'-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG
TCG CGT GGT GCG GAG GGC G-3'\+\cr  \+ \+ (ID SEC
NÚM.: 33)\cr  Eco 12 II: \+ 5'-AAT TCG CCC
TCC-3'\+\cr  \+ \+ (ID SEC NÚM.:
34)\cr}

Cebadores para PCR

P1-30:	5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG-3'	(ID SEC NÚM.:35)
P2-30:	5'-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG TCG CGT-3'	(ID SEC NÚM.: 36)
P1-33:	5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CTC-3'	(ID SEC NÚM.: 37)
P2-33:	5'-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG TCG CGT GGT-3'	(ID SEC NÚM.: 38)
PN1-30:	5'-CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CTC GCC-3'	(ID SEC NÚM.: 39)
PN2-30:	5'-GTG AAG ACG ACA GAA AGG TCG CGT GGT GCG-3'	(ID SEC NÚM.: 40)

Preparación del driver

Para la detección de transcritos expresados diferencialmente en células tumorales micrometastásicas comparado con células de médula ósea normal, se preparó el driver a partir de muestras de médula ósea procedentes de donantes sanos. A partir de tres donantes de médula ósea, el RNA total se aisló utilizando protocolos estándar. Entonces se añadió el RNA correspondiente a 300.000 células de médula ósea a 30 \mul de microesferas Dynal y se llevó a cabo el protocolo de amplificación de mRNA.

La cinética de hibridación se mejoró con la digestión de 5 \mug de driver con 50 unidades de enzima de restricción Rsa I en una reacción de 50 \mul con 0,75 x tampón NEB1 (New England Biolabs) durante 90 min. La muestra fue desalinizada con una columna Microcon 10 (Millipore).

Preparación del tester

El tester digerido con Eco RI se preparó en 50 \mul utilizando 50 U de EcoRI. Una mezcla de cuatro células individuales aisladas de cuatro pacientes diferentes de cáncer de mama se seleccionó como tester. Tras la digestión con EcoRI, el tester se diluyó hasta una concentración de 100 ng/\mul en agua. Posteriormente, se ligó una sonda a 5 \mul de adaptador Al (ID SEC NÚM.: 31, ID SEC NÚM.: 32) y otra al adaptador A2 (ID SEC NÚM.: 33, ID SEC NÚM.: 34) (50 \muM) en dos reacciones de ligación independientes de 10 \mul a 15ºC durante toda la noche, utilizando 5 unidades de T4 DNA ligasa (Roche). La reacción de ligación se inactivo mediante la adición de 2 \mul de EDTA 0,1 M y el calentamiento durante 5 min a 70ºC.

Hibridación sustractiva

1 \mul de driver (500 ng) se añadió a cada uno de los dos tubos que contenían 2 \mul de cDNA tester (unos 18 ng) ligados al adaptador A1 (ID SEC NÚM.: 31, ID SEC NÚM.: 32) y ligados al adaptador A2 (ID SEC NÚM.: 33, ID SEC NÚM.: 34) en tampón de hibridación (1 M NaCl, 50 mM Hepes, 1 mM CTAB). La solución se cubrió con aceite mineral, se desnaturalizó 1 min a 98ºC y entonces se dejó hibridar durante 10-14 horas a 68ºC.

Tras la primera hibridación, ambas muestras se mezclaron entre sí y se añadieron unos 150 ng de driver desnaturalizado por calor en 1,5 \mul de tampón de hibridación. La muestra se dejó para hibridar durante 10-14 horas. La hibridación se detuvo añadiendo 200 \mul de tampón de dilución (Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM) y calentando durante 7 min a 68ºC.

Amplificación por PCR

Para cada sustracción se llevaron a cabo dos reacciones de amplificación por PCR en un volumen de 25 \mul. La primera PCR se realizó en tampón 1 de Taq long template (Roche) con 1 \mul de cDNA sustraído diluido, 1 \mul de cebador de PCR P1-30 (ID SEC NÚM.: 35) (8 \muM), 1 \mul de cebador P2-30 (ID SEC NÚM.: 36) (8 \muM) y 0,4 mM de dNTP. La Taq polimerasa se añadió según un procedimiento de inicio en caliente. El ciclador de PCR se estableció en 75ºC durante 7 min (relleno de los extremos); se realizaron 27 ciclos (94 ºC, 30 s; 66ºC, 30 s; 72ºC, 1,5 min) y una extensión final a 72ºC durante 7 min. Los productos de PCR se diluyeron 10 veces en agua y se utilizó 1 \mul para una PCR secundaria realizada según el protocolo antes descrito, pero utilizando los cebadores de PCR PN1-30 (ID SEC NÚM.: 39) y PN2-30 (ID SEC NÚM.: 40) y 12 ciclos (94ºC, 30 s; 68ºC, 30 s; 72ºC, 1,5 min). Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel sobre un gel de agarosa del 1,5%.

Clonación y análisis del cDNA sustraído

Los productos de la PCR secundaria se ligaron en la pGEM-Teasy, un sistema de clonación T/A (Promega). Una vez seleccionados los clones con X-GaI/IPTG/ampicilina, se cribaron insertos por PCR utilizando los cebadores PN1-30 (ID SEC NÚM.: 39) y PN2-30 (ID SEC NÚM.: 40). La expresión diferencial se verificó mediante análisis Southern blot de los insertos amplificados utilizando como sondas tester y driver marcados. El marcaje de las muestras de driver y tester era idéntico al marcaje para el análisis de arrays.

Los clones con hibridación diferencial se sometieron a la preparación de plásmidos utilizando el equipo QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) y se secuenciaron. La búsqueda de homología de ácidos nucleicos se llevó a cabo utilizando el programa BLAST (NCBI).

Resultados

La amplificación por PCR se realizó con conjuntos de cebadores de diferente longitud (30 nucleótidos: P1-30 (ID SEC NÚM.: 35), P2-30 (ID SEC NÚM.: 36); y 33 nucleótidos: P1-33 (ID SEC NÚM.: 37) y P2-33 (ID SEC NÚM.: 38)), dando lugar ambos a resultados comparables. Los cebadores más preferibles son los formados por 30 nucleótidos (P1-30 (ID SEC NÚM.: 35) y P2-30 (ID SEC NÚM.: 36)). Los cebadores más pequeños con 22 nucleótidos (Clontech) como los descritos por Diatchenko (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996)) no funcionaron en la reacción de PCR. Tras la sustracción, las colonias se cribaron mediante PCR y los productos se sometieron a electroforesis en gel y blotting. El tester y el driver marcados se hibridaron sobre el blot como se muestra en un ejemplo en la Fig. 25. La colonia núm. 4 se identificó como un factor de transcripción descrito como un gen específico del epitelio (Oettgen, Genomics 445, (1997) 456-457; Oettgen, Mol. Cell. Biol. 17 (1997), 4419-4433) y Oettgen, Genomics 55 (1999), 358-62). Este resultado se confirmó mediante PCR utilizando las muestras a partir de las cuales se habían preparado el driver y el tester (Figura 26).

<110> Micromet GmbH

\vskip0.400000\baselineskip

<120> amplificación de mRNA

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<130> D 1688 PCT

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<140>

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<141>

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<160> 30

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 17

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<220>

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<223> n=a, c, t o g

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<400> 1

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccccccccc cnnnnnn

\hfill

17

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, c, t o g

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttatacgga tatccnnnnn n

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, c, t o g

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatgatcta gataggtaca agtcnnnnnn

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, c, t o g

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtagcagc cgtctagacg tcnnnnnn

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, c, t o g

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttttttt ttctgtagca gccgtctaga cgtcnnnnnn

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, c, t o g

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttctcctta atgtcacaga tctcgaggat ttcnnnnnn

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, c, t o g

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccccccccc ccccggtcta gannnnnn

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, c, t o g

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccccccccc cccccgtcta gannnnnn

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, c, t o g

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccccccccc cccccgtcta gannnnnnnn

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccccccccc cccccgtcta gatttttttt tttttttvn

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acggttatgga tccccccccc cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagaattca tgcccccccc cccc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagaattca tgcccccccc cccccc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagaattca tgcccccccc ccccccc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgaagtgg cgaattccga tgcccccccc cccccc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccttaatg tcacagatct cgaggatttc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgattccct gatgaggcag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatcttcac gttgagcagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgagacgcc atctgtaggc ggtg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtctttggct accagtccag cagc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagagaccac acttgtgcgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatgtggtgc tgagtcgagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtgtccag ttccaatacc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccatagtc caccaacatg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgccactct cgtcttcgat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaacatcag gaaaagctcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacaaggctg aggatgaggc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttcccgaca cttgtcttgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacgtcgcc ctggacttcg agc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatggagccg ccgatccaca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Un método para la amplificación del mRNA de una muestra, que comprende los siguientes pasos:

i. generación de cDNA a partir de RNA poliadenilado utilizando por lo menos un cebador que hibride con este RNA poliadenilado y que contenga un extremo 5' poli(C) o 5' poli(G), estando la concentración de este cebador en un intervalo de 10 a 60 \muM;

ii.(ab) adición en el extremo 3' del cDNA generado de una cola de poli(G) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(C), o de una cola de poli(C) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(G); o bien

ii.(b) adición en el extremo 3' del cDNA generado de una cola de poli(G) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(C), o una cola de poli(C) cuando en el paso i. se empleó un cebador o cebadores con un extremo 5' poli(G) utilizando una RNA ligasa, independientemente de la presencia o ausencia de cebador, cebadores o dNTP en exceso; y

(iii) amplificación del cDNA con cola mediante un cebador que hibride con la cola o colas generadas en el paso ii(ab) o ii(b).

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho "al menos un cebador" del paso "i" es un cebador aleatorio, un cebador oligo(dT) o una combinación de los mismos.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho cebador aleatorio contiene un oligonucleótido aleatorio hexamérico u octamérico.

4. El método de las reivindicaciones 2 o 3, en el que dicho cebador aleatorio tiene una secuencia de las mostradas en los ID SEC Núms.: 1 o del 7 al 9.

5. El método de la reivindicación 2, en el que dicho cebador oligo(dT) tiene la secuencia mostrada en el ID SEC NÚM.: 10.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el cebador del paso "iii" contiene un tramo de al menos 10, preferiblemente al menos 12 y más preferiblemente al menos 15 nucleótidos capaces de hibridar con la cola o colas generadas en el paso "ii(ab)" o "ii(b)".

7. El método de la reivindicación 6, en el que dicho cebador tiene la secuencia descrita en ID SEC Núms.: 11, 12, 13, 14 o 15.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho RNA poliadenilado está unido a un soporte sólido.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho soporte sólido es una microesfera, una membrana, un filtro, un pocillo, un chip o un tubo.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicha microesfera es una microesfera magnética, una microesfera de látex o una microesfera de metal coloide.

11. El método de la reivindicación 9 o 10, en el que dicha microesfera contiene un tramo oligo(dT).

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho mRNA proviene de un tejido, un número reducido de células o una célula individual.

13. El método de la reivindicación 12, en el que dicho número reducido de células está en el intervalo entre 10^{6} y 2 células.

14. El método de la reivindicación 12 o 13, en el que dicho tejido, células o célula individual es de origen animal o vegetal.

15. El método de la reivindicación 14, en el que dicho animal es un humano.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que dicho tejido, número reducido de células o célula individual es un tejido fijado químicamente, un número reducido de células fijadas químicamente o una célula individual fijada químicamente.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que dicho tejido, número reducido de células o célula individual provienen de un fluido corporal o de un tejido sólido.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 que también comprende un paso "iv" en el que el cDNA amplificado generado es aún más modificado.

19. El método de la reivindicación 18, en el que dicha modificación comprende la introducción de sistemas de detección.

20. El método de la reivindicación 19, en el que dichos sistemas de detección comprenden la introducción de análogos nucleotídicos acoplados a uno o varios cromóforos, colorantes fluorescentes, radionucleótidos, biotina o DIG.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el cDNA amplificado obtenido está unido a un soporte sólido.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que todos los pasos, o algunos individualmente, se llevan a cabo en un tampón sin cacodilato.

23. El método de la reivindicación 22, en el que dicho tampón sin cacodilato es un tampón fosfato.

24. El método de la reivindicación 23, en el que dicho tampón fosfato es un tampón de KH_{2}PO_{4}.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que la muestra proviene de una célula o un tejido cuya identidad genética ha sido definida por hibridación genómica comparada.

26. Un método para la identificación de genes expresados diferencialmente en una muestra de ensayo, que comprende los siguientes pasos:

(a) proporcionar una muestra de ensayo y una muestra control que contengan cada una RNA poliadenilado;

(b) utilizar los pasos del método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 con dichas muestras de ensayo y control; y

(c) comparar el cDNA amplificado obtenido de dicha muestra de ensayo con el cDNA amplificado obtenido de dicha muestra control.

27. Un método para la identificación de un candidato a fármaco para la prevención o el tratamiento de un trastorno patológico o una alteración patológica, que comprende los siguientes pasos:

(a) poner en contacto una muestra que contenga RNA poliadenilado con dicho candidato a fármaco;

(b) utilizar los pasos del método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 con dicha muestra; y

(c) detectar la presencia, ausencia, incremento o disminución de genes concretos expresados en dicha muestra, cuando la correlación de dichas presencia, ausencia, incremento o disminución con la presencia del candidato a fármaco califica a dicho candidato a fármaco como un fármaco.

28. Un método para la detección in vitro de un trastorno patológico o una vulnerabilidad respecto a un trastorno patológico en un sujeto, que comprende los siguientes pasos:

(a) proporcionar una muestra que contenga RNA poliadenilado de dicho sujeto;

(c) detectar un trastorno patológico o una vulnerabilidad respecto a un trastorno patológico basándose en la presencia, ausencia, incremento, disminución o cantidad de un gen, o varios, expresado en dicha muestra.

29. Un equipo que al menos contiene un cebador seleccionado a partir del grupo de los ID SEC Núms.: 1 y del 7 al 15.