ES2265948T3 - Terapia para el cancer. - Google Patents
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Abstract
El uso de un agente inmunoterapeutico en conjunción con un agente restrictivo de crecimiento del tumor, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de mamíferos con avanzados o grandes tumores pesados, en donde el agente restrictivo de crecimiento del tumor potencia la actividad del agente inmunoterapeutico y es uno de ácido 5, 6-dimetilxantenona-4- acético (DXMAA) y ácido flavona acético (FAA) y en donde el agente inmunoterapeutico incluye una T-célula co-estimulatoria de células de adhesión de moléculas (CAM) o un vector de expresión mamífero que contiene DNA el cual codifica una T- célula co-estimulatoria CAM, en la cual el CAM es B7.1.
Description
Terapia para el cáncer.
Esta invención está dirigida al uso de agentes
terapéuticos en combinación para combatir el cáncer. En particular
está dirigida a la combinación de agentes terapéuticos los cuales
son efectivos contra avanzados grandes y pesados tumores.
Los cánceres avanzados y grandes tumores pesados
son refractarios al tratamiento con agentes terapéuticos. Sin
embargo, estos mismos agentes pueden ser efectivos contra tumores
más pequeños, cuyo uso no consigue la completa erradicación de
grandes tumores pesados. Los grandes tumores pueden continuar
creciendo sin restricción o su reaparición no es reconocida por el
sistema inmune del cuerpo.
Además, los tumores adquieren funciones
defensivas y de sobrevivencia las cuales limitan la eficacia de los
agentes terapéuticos y/o de la propia respuesta inmune del cuerpo.
Por razones desconocidas los grandes tumores pesados parecen ya sea
perjudicar o retardar la respuesta citotóxica
anti-tumor de los linfocitos T. En la
inmunoterapia, la transferencia de genes de células T
co-estimulatorias de células de adhesión de
moléculas es efectiva solo contra tumores muy pequeños y se genera
solo una pequeña inmunidad sistémica anti-tumor.
Es un objetivo de la presente invención entregar
una combinación terapéutica que pueda por lo menos parcialmente
superar la resistencia de los grandes tumores pesados a la
inmunoterapia, o al menos entregar al público una alternativa útil
en el tratamiento del cáncer.
En consecuencia, la invención proporciona el uso
de un agente inmunoterapéutico en combinación con un agente
restrictivo de crecimiento del tumor, para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de mamíferos con avanzados o
grandes tumores pesados, en donde el agente restrictivo de
crecimiento del tumor potencia la actividad del agente
inmunoterapéutico y es uno del ácido
5,6-dimetilxantenona-4-acético
(DXMAA) y ácido flavona acético (FAA, flavone acetic acid). Y en
donde el agente inmunoterapéutico comprende una célula T
co-estimulatoria de células de adhesión de moléculas
(CAM) o un vector de expresión mamífero que contiene DNA el cual
codifica una célula T co-estimulatoria CAM, en donde
la CAM es B7.1.
Como se usa mas arriba, el término agente
inmunoterapéutico significa una preparación la cual cuando es
administrada al paciente resulta en una respuesta inmune sistémica
anti-tumor.
Preferiblemente, la preparación contendrá DNA y
típicamente, el agente inmunoterapéutico será una formulación
farmacéuticamente aceptable de DNA para ser inyectada en el tumor en
uno o mas sitios para así conferir propiedades en el tejido tumoral
que generen una respuesta inmunitaria sistémica
anti-tumor.
Como se usa mas arriba, el término "agente
restrictivo de crecimiento del tumor" significa un agente que
restringe o previene que el tumor crezca en un paciente reduciendo
el flujo sanguíneo hacia el tumor, incluyendo por inhihiting o
previniendo angiogenesic. Así como un agente puede tener también
otras actividades anti-tumorales/inmunorreguladoras
además de reducir el flujo sanguíneo.
El agente inmunoterapéutico contendrá DNA
codificando una célula T co-estimulatoria de células
de adhesión de moléculas (CAM), en un adecuado vector de expresión.
El CAM será B7.1.
El agente restrictivo de crecimiento del tumor
es ácido acético flavone (FAA), o un análogo de
xantenona-4 ácido acético (XAA). El análogo de XAA
(5’ 5,6-dimetilxantenona-4-ácido
acético (DMXAA).
Preferiblemente, el agente inmunoterapéutico es
administrado antes de la administración del agente restrictivo de
crecimiento del tumor. Mejor aun, el agente inmunoterapéutico es
administrado de 12 a 48 horas antes de la administración del agente
restrictivo de crecimiento del tumor. Más preferiblemente, la
administración del agente terapéutico ocurre aproximadamente 24
horas antes de la administración del agente restrictivo de
crecimiento del tumor.
En realizaciones anteriores, el uso de la
presente invención puede incluir además la administración de otro
agente restrictivo de crecimiento del tumor. Este agente puede ser
un agente que interrumpa la expresión o actividad de
hipoxia-inducida factor-1
(HIF-1). Esto se puede lograr convenientemente a
través de una terapia anti-sensación.
\newpage
Mientras la invención es ampliamente definida
mas arriba, aquellas personas expertas en la técnica apreciarán
además que no sea limitado y que también incluya realizaciones de la
cual la siguiente descripción entrega ejemplos. Además, la presente
invención será mejor entendida en referencia a los dibujos que
acompañan en los cuales:
Figura 1. Combinando las drogas DMXAA o FAA con
B7.1 inmunogen se genera una potente inmunidad sistémica
anti-tumor, mientras las monoterapias son
inefectivas. (A) La transferencia del gen CAM es incapaz de causar
el rechazo de grandes tumores. Tumores establecidos de 0.5 cm de
diámetro fueron inyectados con liposomas DOTAP conteniendo 60
\mug de B7.1, B7.2, ICAM-1,
MAdCAM-1, y VCAM-1 cDNA. Animales de
control recibieron 60 \mug de vector pCDM8 vacío, o liposomas. La
transferencia de genes de cada CAM hace más lento el crecimiento del
tumor, pero últimamente los tumores crecieron sin dificultad, y a
los animales hubo que practicarles eutanasia. (B) Combinando las
drogas DMXAA o FAA con inmunogen B7.1 se erradican grandes tumores.
Animales portadores de tumores de 0.6-0.8 cm fueron
inyectados i.p con DMXAA o FAA a 300 mg/Kg y 25 mg/Kg por peso
corporal, en un volumen de 0.01 ml/g de peso corporal,
respectivamente. Para animales recibiendo tratamientos combinados,
los tumores fueron inyectados con liposomas DOTAP conteniendo 60
\mug de B7.1 cDNA y DMXAA o FAA fueron administradas 24 horas
después. Los animales de control recibieron 60 \mug de vector
pCDMB vacío, o solo liposomas, como es indicado. El tamaño (cm) de
los tumores fue monitoreado durante 42 días después de la
transferencia de genes. A los ratones se les practicaba eutanasia
si los tumores alcanzaban más de 1 cm de diámetro (denotado por
pequeñas flechas verticales). El experimento fue repetido dos
veces. Los ratones que fueron curados de sus tumores fueron puestos
a prueba nuevamente (flecha vertical larga) después de 42 días con
10^{6} células tumorales parentales, y ratones monitoreados para
reaparición de tumores por más de 22 días. (C) Fotografía de ratones
con tumores establecidos y tratados. La ilustración es un ratón
portador de un gran tumor EL-4 (0.8 cm)
establecido, y ratones portadores de tumores de tamaño similar 8 y
29 días después de seguir un tratamiento con la combinación de B7.1
y DMXAA.
Figura 2. Combinando inmunoterapia B7.1 con
terapia DMXAA se genera un incremento en la actividad CTL, la cual
puede ser transferida adoptivamente para erradicar tumores. (A)
Comparación de actividad de tumor CTL generado por los diferentes
regimenes de tratamiento. Splenocitos fueron removidos de animales
que "llevaban 21 días siguiendo" diferentes regimenes de
tratamiento, y fueron probados para actividad citólica contra
células tumorales EL-4. El porcentaje de
citotoxicidad es planeado en contra de varios efectos del objetivo,
relación (E:T). Los animales de control recibieron vectores pCDM8
vacíos o solo liposomas. El inserto ilustra la actividad citólica
de splenocitos recolectados de animales 42 días antes del
tratamiento con B7.1-DMXAA y 22 días después (día
64) siguiendo una nueva prueba con células tumorales parentales
EL-4. (B) erradicación de tumores establecidos por
una transferencia adoptiva de CTL anti-tumor de
ratones tratados. Splenocitos (2 x 10^{8}) transferidos
adoptivamente a través de una inyección
intra-tumoral e i.p desde ratones tratados de
control a ratones receptores portadores de tumores establecidos
(\sim 0.6 cm de diámetro). Cada barra representa la media + DS
de los resultados de 5 ó 6 ratones.
Figura 3. La inmunidad
anti-tumor es largamente medida por CD8+ células T y
células NK. Tumores de (\sim 0.6 cm de diámetro) fueron
establecidos en ratones, y la contribución de subconjuntos de
leucocitos a la terapia de combinación fue examinada por bloqueo de
anticuerpos cuatro días antes del tratamiento y cada día alternado
para la duración del experimento, mAbs fue administrado contra (a)
CD4 (GK1.5 mAb); (b) células NK (PK136 mAb); (c) CD8
(53-6.72 mAb); (d) CDS y células NK; (e) CD4, CD8, y
células NK; y (f) CD4 y CDS. Cada panel (a-f)
incluye un experimento de control en el cual el
anti-leucocito que bloquea mAb(s) fue
sustituido con igG de rata. Los ratones fueron asesinados si los
tumores alcanzaban más de 1 cm de diámetro (denotado por las
flechas verticales). Cada barra representa la media+ DS de los
resultados de 5 ó 6 ratones.
Figura 4. La terapia de combinación obvia el
reducido rango de dosis de reactivo terapéutico que se requiere
para una terapia efectiva. Tumores (\sim 0.5 cm de diámetro)
fueron establecidos luego de 17 días, e inyectados con diferentes
cantidades de B7.1 cDNA (90-180 \mug).
Veinticuatro horas más tarde, DMXAA fue administrado vía
intraperitoneal a 25 mg/Kg de peso corporal (grupo superior), y 18
mg/Kg (grupo inferior). Cada barra representa la media+ DS de los
resultados de 5 ó 6 ratones.
Figura 5. El mecanismo de muerte de la célula
tumoral en respuesta a la terapia B7.1 versus DMXAA es diferente.
Secciones de tumores establecidos fueron preparadas después de 7 y
21 días de tratamiento coloreadas por el análisis TUNEL para
células apoptóticas (células verde fluorescente mostrando núcleos
condensados fragmentados), y contrastadas con propidio ionizado
(naranjo) para revelar células necróticas, x 100. Las ilustraciones
son secciones representativas (a) 7 días después del tratamiento
B7.1; (b) 21 días después del tratamiento B7.1; (c) 7 días luego de
la terapia de combinación B7.1-DMXAA; (d) 7 días
después de la administración de DMXAA; y (e) 7 días después de la
inyección de un vector de control vacío. La célula tumoral apoptosis
en respuesta a la monoterapia B7.1 fue seguida de necrosis como fue
revelado por la apoptótica (Al) e índices (q) necróticos (NI), en
tanto que la monoterapia DMXAA no fue precedida por células
tumorales apoptosis en el tiempo que fueron examinadas.
Figura 6. Las terapias de ataque vascular y B7.1
inducen a la sobre regulación de las proteínas "heat shock"
del tumor. La detección Immunohistoquimica de hsp70 expresión en
tumores 7 días después de la administración de (a) DMXAA, x 40; (b)
combinación de B7.1-DMXAA, x 40; (c) monoterapia
B7.1, x 40; (d) combinación de B7.1-DMXAA, x 60;
(e) vector vacío, x 60; y (f) secciones como en (b) fueron
coloreadas también con un IgG control de ratas como anticuerpo
primario.
Figura 7. El tratamiento de un solo nódulo
tumoral conduce a la erradicación de múltiples y distantes nódulos
tumorales. Un solo gran tumor (\sim 0.5 cm de diámetro) fue
establecido en un solo flanco, y cuatro tumores mas pequeños de
\sim 0.2 cm de diámetro en el otro flanco. La transferencia de
genes de B7-1 cDNA de plasmad de expresión en el
tumor de gran tamaño, seguido por terapia sistémica DMXAA condujo
al rechazo de los cinco tumores. Los ratones permanecieron libres
de tumores por 35 días. Por cualquier razón, si el tumor inyectado
no fuera más grande que los nódulos tumorales no inyectados,
entonces el crecimiento del tumor fue solo retardado.
Figura 8. Inyección intratumoral (IT) de
B7-1 seguida de una inyección intratumoral de DMXAA.
La dosis normal de DMXAA (25 mg/Kg) fue inyectada. La
administración intraperitoneal (IP) de DMXAA fue incluida como
control. Las flechas abiertas indican tumores erradicados y las
flechas cerradas señalan animales a los que se les practicó
eutanasia.
Figura 9. La terapia antisensación
HIF-1\alpha bajorregula la expresión de
HIF-1 y VEGF, e inhibe la formación de vasos
sanguíneos tumorales. (A) Baja-regulación de
HIF-1 y VEGF a través de terapia antisensación
HIF-1\alpha. Tumores de 0.1 cm de diámetro fueron
inyectados con liposomas DOTAP que contenían ya sea un vector (a,
c), o antisensación HIF-1\alpha cDNA (b, d). Las
ilustraciones son secciones representativas del tumor preparadas 4
días después de la transferencia de genes, coloreadas café mAbs
contra HIF-1\alpha (a, b), y VEGF (c, d). (B) La
terapia antisensación HIF-1\alpha bloquea la
formación de nuevos vasos sanguíneos tumorales. (a) Las
ilustraciones son Secciones preparadas de tumores de 4 cm de
diámetro inyectadas 4 días antes ya sea con un vector vacío
(pcDNA3), o con HIF-1\alpha antisensación. Células
endoteliales dentro de Secciones fueron coloreadas con el
anti-CD31 mAb, revelando vasos sanguíneos tumorales
(ejemplos señalados por flechas). (C) Medición de la densidad de
vasos sanguíneos. Los vasos sanguíneos coloreados con el
anti-CD31 mAb fueron contados en campos de
selección aleatoria para registrar la principal densidad de vasos en
los tumores.
Figura 10. Las monoterapias que utilizan la
terapia anti-angiogénico antisensación
HIF-1\alpha, y B7-1-
inmunoterapia mediada, son solo efectivas contra pequeños tumores.
Tumores establecidos de aproximadamente 0.1 (a) y 0.4 (b) cm de
diámetro, fueron inyectados en el día 0 con liposomas DOTAP
conteniendo ya sea B7-1 cDNA;
HIF-1\alpha antisensación cDNA; o vector vacío en
el caso de animales de control. Los tamaños (cm) de los tumores
fueron registrados después de la transferencia de genes. La
regresión completa del tumor se denota por las flechas verticales.
A los ratones se les practicó eutanasia si los tumores alcanzaban
más de 1 cm de diámetro (denotado por estre-
llas).
llas).
Figura 11. La combinación de terapia
antisensación HIF-1\alpha con inmunoterapia B7.1
ocasiona el rápido rechazo de grandes tumores. Los tumores de 0.4
cm de diámetro fueron inyectados con liposomas DOTAP que contenían
DNA B7-1, seguido 48 horas mas tarde ya sea por un
antisensación (aHF) o sensación (sHF) HIF-1\alpha
cDNA. Los animales de control recibieron un vector vacío. Los
tamaños (cm) de los tumores fueron registrados después de la
transferencia de genes. A los ratones se les practicó eutanasia si
los tumores alcanzaban más de 1 cm de diámetro (denotado por
estrellas). La regresión completa del tumor se denota por las
flechas verticales. Los ratones sanados fueron puestos a prueba
nuevamente con 1 x 10^{6} células tumorales parentales pero no
desarrollaron tumores durante los 2 meses en que fueron monitoreados
(registros no mostrados).
Figura 12. Muestra los resultados logrados
usando triple tratamiento (DMXAA + B7.1 + terapia antisensación
HIF-1), versus otros regimenes de tratamientos como
se muestra. El triple tratamiento provoca la más rápida
erradicación del tumor. Anti-reactivos administrados
solos o juntos con cualquier otro no fueron efectivos. I.T. =
intra-tumoral; LP. =
intra-peritoneal.
Como se reseña mas arriba en términos generales,
la presente invención proporciona un uso de acuerdo a la
reivindicación 1 para la fabricación de medicamentos para el
tratamiento de pacientes con avanzados o densos tumores
pesados.
Se ha visto que el crecimiento avanzado de un
tumor es acompañado por la habilidad de los tumores de adquirir
mecanismos desconocidos a través de los cuales ellos pueden resistir
la respuesta inmune sistémica anti-tumor del
cuerpo. Aunque la administración de agentes quimioterapéuticos u
otros medios de terapia de cáncer pueden causar inicialmente una
regresión en el crecimiento del tumor, la respuesta inmune del
cuerpo es incapaz de prevenir o limitar la reaparición de tejido
tumorgénico que no haya sido erradicado del cuerpo.
Los solicitantes han determinado ahora que
combinando métodos de inmunoterapia con métodos de quimioterapia
demostraron previamente ser efectivos en el tratamiento a largo
plazo de avanzados o densos tumores pesados. La regresión de los
tumores está combinada con la estimulación de una poderosa respuesta
inmune sistémica anti-tumoral.
Los dos agentes terapéuticos empleados operan de
manera sinérgica para proporcionar un efecto combinado que excede
lo predecible para las propiedades conocidas de cada uno.
La optimizada transferencia de la célula T
co-estimulatoria de células de adhesión de molécula
(CAM), incluyendo B7.1, B7.2, y xenogeneica: (formas humanas del
integrin ligands) VCAM-1, MAdCAM-1,
y ICAM-1 han sido mostrados para ocasionar un
rápido y completo rechazo a pequeños tumores establecidos. Se genera
una prolongada inmunidad sistémica anti-tumor,
mientras otras células de adhesión de moléculas como el
E-cad herin humano que tiene solo una débil
habilidad para disminuir el crecimiento del tumor. Sin embargo, la
inmunoterapia mediada-CAM es problemática ya que es
efectiva solo contra tumores pequeños y genera solo una débil
inmunidad sistémica anti-tumor. Los grandes tumores
pesados son capaces de ya sea perjudicar o retardar la generación de
linfocitos T citotóxicos anti-tumor (CTL) volviendo
a los tumores resistentes a la inmunoterapia.
Los agentes anticáncer ácido flavona acético
(FAA) y 5,6-dimetilxantenona-4-ácido
acético (DMXAA) causan reducciones iniciales en el tamaño del tumor
cuando son administrados, pero posteriormente los tumores crecen sin
restricción, y ambos reactivos generan una débil e inefectiva
respuesta CTL anti-tumor. DMXAA y FAA parecen
ejercer sus actividades anti-tumor a través de
varios caminos incluyendo la reducción de flujo sanguíneo hacia el
tumor conduciendo a necrosis hemorrágica y la inducción de
múltiples factores inmunomodulatorios incluyendo citokinas, oxido
nítrico y la activación de células de naturaleza asesina. Sin
embargo, ningún agente es capaz de generar la deseada inmunidad
sistémica anti-tumor, y ellos son inefectivos contra
grandes tumores pesa-
dos.
dos.
Los descubrimientos hechos por los solicitantes
en que la administración de estos agentes en combinación es
efectiva tanto para erradicar avanzados o grandes tumores como para
generar una inmunidad sistémica anti-tumor es por
lo tanto sorprendente y representativa de un significativo avance en
el tratamiento del cáncer.
El agente inmunoterapéutico puede ser, o
incluir, DNA (usualmente cDNA) codificando AF065896). Tales cDNA’s
pueden ser sintetizados u obtenidos del comercio u otras fuentes.
B7.1 puede ser proporcionada por Dr P Linsley,
Bristol-Myers-Squibb, Seattle,
Washington, EEUU.
En preferidas realizaciones de la invención, el
agente inmunoterapéutico será administrado en la forma de un vector
de expresión mamífero. Mientras cualquiera de tales vectores están
disponibles para ser seleccionados por el experto, el vector típico
incluye plasmid de expresión tales como el pCDNA3 y el pCDM8. y
vectores adenoviral y bases-retroviral (tales como
pLXSNand pLNCX).
Alternativamente, el agente inmunoterapéutico
puede ser administrado directamente, en una forma que no sea un
vector de expresión mamífero, esto es, no es esencial que el agente
inmunoterapéutico sea administrado usando terapia de genes. Por
ejemplo, proteínas CAM co-estimulatorias de células
T que podrían ser unidas a la superficie de la célula podría ser
administrada sistemáticamente.
El agente restrictivo de crecimiento del tumor
será FAA, o un análogo funcional de XAA; DMXAA.
HIF-1 es un factor de
transcripción responsable de la sensación de hipoxia y de encender
hypoxia-inducible en genes que estimulan la
producción de vasos sanguíneos tumorales. Así, en una preferida
realización, una administración usada incluida de la administración
del agente inmunoterapéutico B7.1 o un vector de expresión
codificándolo, en combinación con la administración de un vector de
expresión codificando una versión anti-sensación
de
HIF-1.
HIF-1.
El agente inmunoterapéutico y el agente
restrictivo de crecimiento del tumor deben ser administrados de
cualquier manera adecuada, usando las formulaciones para cada
agente ya conocidos en la técnica. La forma de administración y
dosis requerida dependerá del agente inmunoterapéutico y agente
restrictivo de crecimiento del tumor elegidos en particular para
ser usados en la presente invención.
Por ejemplo, cuando el agente restrictivo de
crecimiento del tumor es DMXAA, el DMXAA es preferiblemente
administrado a la menor dosis que sea efectiva. En una
particularmente preferida realización, DMXAA es inyectado
directamente en el tejido tumoral. Los solicitantes han encontrado
también en esta observación que la inyección de DMXAA directamente
en el tumor puede reducir la dosis efectiva requerida.
Los solicitantes han descubierto también un
ulterior agente restrictivo de crecimiento del tumor
(particularmente un agente anti-angiogénico) que
puede ser administrado convenientemente además del agente
inmunoterapéutico y un primer agente restrictivo de crecimiento del
tumor, para proporcionar un efecto terapéutico adicional. Por
ejemplo, en una realización preferida de la invención, la
administración de un vector de expresión codificando el agente
inmunoterapéutico B7.1 y el agente restrictivo de crecimiento del
tumor DMXAA es combinado con una terapia
anti-sensación contra HIF-1.
También, cuando el agente restrictivo de
crecimiento del tumor es DMXAA y éste es inyectado directamente en
el tumor, se prefiere que un reactivo
anti-augiogénico menos tóxico sea administrado
simultánea y sistemáticamen-
te.
te.
Aspectos de la invención serán ahora descritos
con referencia a la siguiente sección experimental la cual es solo
un ejemplo.
Ratones hembra C57BL/6, de 6-9
semanas de edad, fueron obtenidas de la Unidad de Recurso Animal,
Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de
Auckland. El linfosoma thymic EL-4 y las células
carcinoma de pulmón de ratón Lewis (LLC) (H-2b)
fueron adquiridas en la Colección Americana de Cultivo Tipo
(Rockville, MD). Estas líneas de células fueron cultivadas in
Vitro a 37ºC en un medio DMEM (Gibco BRL) suplementadas con 10%
de suero fetal de becerro 50 U/ml de penicilina/estreptomicina, 2 mM
L-glutamina, 1 mM piruvato.
Modelo Experimental de Tumor. Los tumores
fueron establecidos a través de inyecciones subcutáneas de 2 x
10^{5} y célula en el flanco izquierdo de los ratones, y
determinado el crecimiento a través de la medición de dos diámetros
perpendiculares. A los animales se les practicó eutanasia cuando los
tumores alcanzaron más de 1 cm de diámetro, en concordancia con la
Aprobación de Ética Animal (Universidad de Auckland). Los tumores
EL-4 y LLC alcanzaron 0.6-0.9 cm de
diámetro después de aproximadamente 21 y 14 días respectivamente.
Unos experimentos incluyeron 5 ó 6 ratones para tratamiento grupal,
y cada experimento fue repetido al menos una vez.
Administración de Análogos. FAA y DMXAA.
FAA fue donado por el Departamento de Salud y Servicios Humanos,
Síntesis de medicamentos & Laboratorio químico, Instituto
Nacional del Cáncer, Bethesda EEUU. La sal de sodio de DMXAA fue
sintetizada en el Centro de Investigación de la Sociedad del Cáncer
de Auckland, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud,
Universidad de Auckland. Las soluciones de FAA y DMXAA en 5% (w/v)
de bicarbonato de sodio y agua, respectivamente, fueron preparadas
frescas para cada experimento y protegidas de la luz. FAA y DMXAA
fueron inyectados i.p a 300 mg/Kg y 25 mg/Kg de peso corporal en un
volumen de 0.01 ml/g de peso corporal, respectivamente.
Transferencia de Genes B7.1.
Complementariamente codifica DNA humado completo
VCAM-1 fue adquirido en Sistemas R&D, Abingdon,
Reino Unido; B7-2 humano (Freeman et al,
1993) fue suministrado por Dr G. Freeman, Dana Farber del
Instituto del Cáncer, Boston, MD. ICAM-1 humano, fue
donado por Dr J. Ni, Ciencias del Genoma Humano Inc., Rockville,
MD; B7.1 de ratón (Chen et al, 1992) fue donado por Dr P.
Linsley, Bristol-Myers-Squibb,
Seattle, WA. Hemos reportado previamente la clonación y
caracterización de MAdCAM-1 cDNA humano (Leung et
al, 1996). Los vectores de expresión CAM pCDM8 fueron
preparados a través del gradiente de centrifugación de cesio
clorhídrico, y diluidos a 600 Pg/ml en una solución de 5% glucosa
en 0.01% Triton X-100. Ellos fueron mezclados en una
proporción de 1:3 (wt:wt) con liposomas catiónicos DOTAP
(Boehringer Mannheim., Alemania). Los tumores fueron inyectados con
100 \mul de DNA (60 \mug/complejos de liposomas, al menos que se
descomponga.
Combinando Inmunoterapia Mediada B7.1.
con ataque vascular mediado FAA/DMXAA. Los tumores de 0.6 a 0.9 cm
de diámetro, fueron inyectados en múltiples sitios con 100 \mul de
DNA (60 \mug)/complejos de liposoma, Veinticuatro horas después,
fue administrado DMXAA o FAA i.p como se describe mas arriba. Los
ratones tratados que se mantuvieron libres de tumores fueron
puestos a prueba nuevamente seis semanas después de la
administración de FAA o DMXAA y B7.1, por inyección s.c de células
EL-4 y células LLC (0.1 ml) en el flanco opuesto
(flanco derecho).
Medición de Generación de CTL
Anti-Tumor. Splenocitos fueron cosechados 21 y
42 días después de una transferencia inicial de genes y 22 días
después de un cambio de células tumorales parentales. Fueron
incubados a 37°C con células objetivo EL-4
graduadas en la razón E:T en 96 buenos platillos de fondo redondo.
Luego de cuatro horas de incubación, fueron recolectados 50 \mug
de suspensión, y lysis fue medida usando el Kit de ensaye Cito
Toxico 96 (Promega, Madison, WI, EEUU). Controles de antecedente
para objetivos y efectos de células lysis no especificadas fueron
incluidos. Luego de los antecedentes de sustracción, el porcentaje
de célula lysis fue calculado usando la fórmula: 100 x
(effectors-experimentales
espontáneos-objetivos espontáneos objetivos/máximos
objetivos espontáneos.
Transferencia Adoptiva de CTL
Anti-tumor. La transferencia adoptiva de
splenocitos anti-tumor fue como se describió
previamente (Kanwar et al, 1999). En resumen, los splenocitos
obtenidos de ratones con 21 días de terapia fueron resuspendidos en
una solución salina balanceada de Hank conteniendo 1% de FCS, y
estimuladas con 5 PHA \mug/ml y 100 U/ml de recombinant Mouse
IL-2 por 4 a 5 días. Los animales portadores de
tumores de 0.6 cm de diámetro recibieron ambas inyecciones
intra-tumorales e i.p. de 2 x 10^{8} de
splenocitos cultivados.
Agotamiento de Subconjuntos de
Leucocitos. Los ratones fueron agotados de CD8+, y CD4+ células
T y células NX a través de inyecciones i.p. e i.v. 4 días antes de
la transferencia de genes, y cada día alternativo después con 300
Pg (0.1 ml) del 53-6.72 (anti-CD8),
Gk1.5 (anti-CD4), y PK136 (anti-NK)
mAbs. Rat IgG (Sigma, USA) fue usado como un anticuerpo de control.
Los anticuerpos fueron una fracción de sulfato de amonio de
acetate, con al menos 1:2,000 por FACS (Becton Dickinson & Co.,
CA, EEUU) splenocitos coloreados. Agotamiento de subconjuntos
individuales de leucocitos resultaron ser efectivos(as) en
mas de un 90% como fue determinado por el análisis FACScan. De
secreciones de hibridomas mAbs de rata contra ratón CD8
(53-6.72 mAb), CD4 (Gk1.5 mAb), y células NK (PK136
mAb) fueron adquiridas desde la Colección Americana de Cultivo Tipo,
Rockville, MD, EEUU.
Detección In Situ de células
Apoptóticas. Los tumores fueron extirpados y congelados
inmediatamente en hielo seco, almacenados a -70ºC y preparadas
secciones seriales de 6 \mum de espesor. La coloración TUNEL fue
preparada usando un kit de detección in situ de apoptosis de
Boehringer, Mannheim, Alemania. En resumen, secciones congeladas
fueron fijadas con una solución de paraformaldehido (PBS en 4%, pH
7,4), y permeabilizadas con una solución conteniendo 0.1% Triton
x-100 y 0.1% de citrato de sodio. Luego de
lavarlas, fueron incubadas con 20 \mul de reactivo TUNEL por 60
minutos a 37°C, y examinadas bajo microscopio fluorescente. Algunas
laminas fueron contrastados con yoduro de propidio (P1; Sigma, CA,
USA) para distinguir células necróticas de aquellas apoptosis
bajoraguladas. Secciones adyacentes fueron contrastadas con
haematoxilina y preparadas y montadas. El número total de células
apoptóticas o necróticas fueron contadas. El índice de apoptóticas
(AI) o índice necrótico (NI) fue calculado como sigue:
Al o N1 = número de células apoptóticas o
necróticas x 100/número total de células nucleadas.
Inmunohistología. Los tumores fueron
extirpados al séptimo día de administración de agentes terapéuticos
y controles, inmediatamente congelados en hielo seco, almacenados a
-70°C, en isopentame, y preparadas secciones de 10 \mum de
espesor. Las secciones fueron montadas en laminas revestidas de
poly L-lysine, y peroxidasas endógenas bloquedas
por lámianas incubadas por 30 minutos en metanol 0.3%
H_{2}O_{2}. Las Secciones fueron coloreadas con
anti-Hsp70 mAb de ratón (anticuerpo
SPA-810; Biotecnologías StressGen Corp., Victoria,
Canadá) usando un kit de inmunodetección
mouse-on-mouse ABC Elite peroxidasa
kit (Laboratorios Vector, Burlingame, CA, EEUU). Ellos fueron
desarrollados con SIGMA FAST DAB (3,3’-diaminobenzidina
tetrahidrocloridio) con tabletas de metal CoCl_{2} mejoradas, y
contrastados con haematoxilina y eosina. Como control, el anticuerpo
primario fue sustituido con IgG de rata (Sigma, EEUU).
Análisis Estadístico. Todos los
experimentos llevados a cabo "en vivo" fueron repetidos a lo
menos una vez obteniéndose resultados similares. Los resultados
fueron expresados como valores principales + desviación Standard, y
un test (t) de estudiantes fue usado para evaluar la importancia
estadística. Un valor de p < 0.05 denota importancia
estadística, mientras que p < 0.001 denota resultados que son muy
significativos
La Monoterapia de Genes CAM es Incapaz de
Restringir el Crecimiento de Grandes Tumores. Las células
EL-4 (2 x 10^{5}) implantadas subcutáneamente en
los ratones crecen rápidamente, formando un tumor sólido de 1 cm de
diámetro dentro de 4 semanas. Hemos demostrado previamente que los
pequeños tumores EL-4 (0.1-0.3 cm
de diámetro) transferidos in situ con B7.1, B7.2,
VCAM-1, y ICAM-1 cDNA fallaron en su
crecimiento, y los ratones permanecieron libres de tumores por a lo
menos dos meses (Kanwar et al, 1999). En contraste, como se
muestra en la Figura 1a, grandes tumores (> 0.5 cm) son
refractarios al tratamiento en respuesta al B7.1 y varios otros
CAMs co-estimuladores. El crecimiento del tumor se
hace mas lento, pero últimamente el tumor crece sin
restricciones.
DMXAA Y FAA son Incapaces de Restringir el
Crecimiento de Grandes Tumores. La administración sistémica de
dosis óptimas de DMXAA y FAA para ratones portadores de grandes
tumores EL-4 (0.6-0.8 CM de
diámetro) conduce a una importante reducción en el tamaño de los
tumores (Fig. 1b), acompañado de una marcada necrosis del tumor
(remítase mas abajo). DMXAA fue el más potente de los dos agentes,
causando que los tumores se encogieran a 0.1-0.2 cm
en un periodo de 3 semanas, mientras los tumores de animales
tratados con FAA fueron reducidos a 0.2-0.4 cm de
diámetro. De cualquier forma, los tumores empiezan a crecer sin
restricción desde el día 28 y los animales tuvieron que ser
sacrificados durante la sexta semana.
Terapia Combinada a través de Entrega
Cronometrada de B7.1 Y DMXAA/FAA Erradica Grandes Tumores. Hemos
planteado la hipótesis de que la administración simultanea del
vector de expresión B7.1 pCDM y DMXAA/FAA podría perjudicar la
inmunidad mediada anti-tumor CAM, como células
tumorales necróticas y moribundas no serían capaces de expresar
adecuadamente el B7.1. Esta idea entrega correcto, desde tumores
establecidos (0.6-0.8 cm de diámetro) fueron
tratados primero con B7.1 para estimular la inmunidad
anti-tumor, y DMXAA y FAA fueron administrados un
día después para retardar el crecimiento del tumor. Notablemente,
los tumores disminuyeron rápidamente en respuesta a la combinación
de B7.1 y DMXAA acompañado de necrosis masiva, tal que para la
tercera semana de tratamiento los tumores habían desaparecido
completamente (Figura 1b). Los tumores gruesos de animales tratados
con DMXAA-B7.1 tomaron la apariencia de herida que
sanó rápidamente formando una costra que eventualmente calló,
dejando una piel perfectamente sana. Distinto al tratamiento B7.1,
el cual deja lo que parece ser un núcleo fibrótico palpable, los
tumores situados en animales tratados DMXAA-B7.1
fueron curados completamente (Fig. 1c). Resultados similares fueron
obtenidos con la combinación FAA y B7.1, aunque los tumores no
desaparecieron completamente hasta la sexta semana.
Terapia Combinada Genera Potente y Prolongada
Actividad Citolítica de Células T de
Tumor-Específico. La actividad
anti-tumor CTL de splenocitos obtenida de ratones
tratados, 21 días después de la transferencia de genes, fue
significativamente (p< 0.001) aumentada en animales tratados con
la combinación de B7.1 y DMXAA, y mejoran ligeramente con la
combinación de B7.1 (Fig. 2a). En contraste DMXAA y FAA solo fueron
effectors muy pobres, aunque ellos incrementaron la producción de
CTL por sobre lo que se vio en vectores vacíos y liposomas de
control.
Los animales curados previamente con terapia de
combinación rechazaron completamente la prueba sustancial de 1 x
10^{7} células tumorales parentales para los 40 días que fueron
monitoreados (Fig. 1b, Tabla 1). Ambas terapias
DMXAA-B7.1 y FAA-B7.1 entregaron
protección completa, indicando que una potente inmunidad sistémica
anti-tumor ha sido conseguida. La actividad
anti-tumor CTL sigue siendo bastante fuerte después
de 42 días de tratamiento inicial con DMXAA-B7.1, y
fue estimulada más tarde siguiendo la nueva prueba con células
tumorales parentales (Fig. 2a).
Hemos reportado previamente que la transferencia
adoptiva de splenocitos, de ratones cuyos tumores han sido tratados
con B7.1, conduce a la erradicación de tumores en receptores (Kanwar
et al, 1999). En concordancia, la transferencia adoptiva de
2 x 10^{8} splenocitos desde ratones tratados con
B7.1-DMXAA y B7.1-FAA a recipientes
portadores de tumores establecidos EL-4 (hasta 0.8
cm de diámetro) resultaron en una rápida y completa regresión del
tumor (Fig. 2b). Los tumores mayores a 0.8 cm de diámetro fueron
refractarios a tal tratamiento. En contraste, splenocitos de
ratones tratados con DMXAA o vectores vacíos no demostraron
actividad anti-tumoral detectable.
Composición de la Población de Leucocitos
Effectors. Los estudios de bloqueo de anticuerpos "en
Vivo" revelaron que el rechazo primario de los tumores en
respuesta a cualquiera de las terapias combinadas
DMXAA-B7.1 o FAA-B7.1 fue muy
dependiente de la presencia de CD8 + células T y células NK, pero
solo parcialmente dependiente de CD4 + células T. El agotamiento
simultaneo de ya sea de CD8+ células T y células NK; CD4+ y CD8+
células T; o CD4+/CD8+ células T y células NK, deterioraron
severamente la inmunidad anti-tumor conduciendo a un
rápido crecimiento de tumor (Fig. 3).
Inmunidad Anti-tumor es
Tumor-Específico. Resultados similares a los
indicados mas arriba han sido obtenidos con el débilmente
immunogénico LLC. Así, la terapia de combinación
B7.1-DMXAA curó completamente a los ratones de LLC
subcutáneo, y generó una inmunidad sistémica
anti-tumor, que protegió a todos los ratones contra
prueba con 1 x 10^{5} de células tumorales parentales y 80% de
los ratones contra una prueba con 1 x 10^{7} células tumorales
(Tabla 1). De cualquier forma, los ratones curados de tumores
EL-4 fueron incapaces de resistir una prueba de 1 x
10^{4} de células LLC, y viceversa los ratones curados de LLC no
fueron protegidos contra una prueba con x 10^{4} de células
EL-4; demostrando que la inmunidad
anti-tumor es tumor-específico.
Efecto de la Dosis de Genes. Ambos, FAA
y DMXAA tienen un inusual comportamiento umbral en el cual un rango
muy reducido de dosis altas (22.5-25 mg/Kg de peso
corporal) son activas y aceptables en términos de toxicidad
(Baguley et al, 1993; Pedley et al. 1996). Luego,
hemos reportado previamente que el B7.1 y otros
co-estimulatorios CAMs demuestran un efecto
restrictivo de dosificación de genes tal como el plasmid de
expresión de transferencia de genes de 60 \mug de B7.1/ pCDM8 es
óptima, mientras menores o mayores cantidades son mucho menos
efectivas (Kanwar et al, 1999). Para investigar si una alta
dosis de genes afectará a la terapia de combinación, los tumores
fueron inyectados con cantidades de plasmid (90-180
\mug) de B7.1/pCDM8 seguido de una administración de una dosis
óptima de DMXAA (25 mg/Kg) (Fig. 4a). Todos los ratones rechazaron
rápidamente a sus tumores, y una nueva prueba de
2 x 10^{5} de células parentales. Así, se consigue un resultado idéntico con un rango amplio de dosis del gen terapéutico y una óptima dosis de DMXAA. En contraste, cuando la concentración de DMXAA fue menor a la óptima, un efecto de la dosificación de genes es claramente evidente, tal como solo ese plasmid de expresión de grandes cantidades (180 \mug)
de B7.1/ pCDM8 pudo generar una efectiva inmunidad anti-tumor (Fig. 4b).
2 x 10^{5} de células parentales. Así, se consigue un resultado idéntico con un rango amplio de dosis del gen terapéutico y una óptima dosis de DMXAA. En contraste, cuando la concentración de DMXAA fue menor a la óptima, un efecto de la dosificación de genes es claramente evidente, tal como solo ese plasmid de expresión de grandes cantidades (180 \mug)
de B7.1/ pCDM8 pudo generar una efectiva inmunidad anti-tumor (Fig. 4b).
Mecanismos para B7.1 y DMXAA para la
Mediación de Regresión del Tumor. Hemos reportado previamente
que la inmunidad mediada CAM anti-tumor es
acompañada por un aumento de actividad CTL envolviendo ambos el
desempeño y vías Fast ligand, sugiriendo que las células
EL-4 son blanco para ser sometidas a un mediación de
inmunidad programada para la muerte de células (Kanwar et
al, 1999). Esta idea fue confirmada por la coloración TUNEL de
secciones de tumor preparadas 7, 14 y 21 días después de la
transferencia de genes B7.1. Las secciones fueron contrastadas con
PI, el cual contenía solo DNA de células necróticas, permitiendo que
se distinguieran las células necróticas versus las apoptóticas. La
inmunoterapia B7.1 fue acompañada por marcadas apoptosis de células
tumorales (verde fluorescente) en el día 7, cuyo máximo fue 14 días
después de la transferencia de genes, y fueron reemplazadas en el
día 21 marcada necrosis (anaranjado fluorescente) (Fig. 5a, b y f).
En contraste, hubo un predominio de células necróticas en secciones
del tumor de los ratones tratados con DMXAA, había muy pocas
células apoptóticas presentes (Fig. 5d). Sorprendentemente, la
terapia de combinación incrementó el número de células apoptóticas
en comparación con la monoterapia B7.1 (Fig. 5c), mientras mantenía
el mismo grado de necrosis observado con la monoterapia DMXAA. Los
tumores no tratados no mostraron signos de necrosis y las células
apoptóticas estaban ausentes (Fig. 5e).
Hemos planteado la hipótesis de que el pequeño
aumento en la generación de CTL en respuesta al DMXAA puede ser un
efecto indirecto, causado por la generación de CTL en respuesta a
proteínas "heat shock" sobre-reguladas de
células de tumor fatigadas y moribundas. En efecto, las proteínas
"heat shock" 70 fue consistentemente encontrado
sobre-regulada en las células tumorales ya sea
rodeando o en la cercanía de vasos sanguíneos (Fig. 6). Asimismo,
hsp70 fue sobre-regulada en tumores tratados con
B7.1, aunque no necesariamente en la cercanía de vasos sanguíneos.
En contraste no hubo señal de expresión de elevación de bsp70 en
tumores tratados solo con vector vacío.
\newpage
| Tabla: 1 Terapia combinada induce a inmunidad específica de tumor | |||||
| Células | Ratones probados | Dosis probada | Incidencia | Comienzo del | Tiempo de sacrificio |
| tumorales | con células | en el tumor | tumor (días) | (días)^{b} (tamaño | |
| Inyectadas | tumorales | tamaño <0.2 cm | del tumor <1.0 cm) | ||
| 1 X 10^{4} | 0/6 | - | - | ||
| EL4 | 1 X 10^{5} | 0/6 | - | - | |
| 1 X 10^{7} | 0/6 | - | - | ||
| EL4 | |||||
| 1 X 10^{4} | 5/5 | 16-24 | 35 \pm 4.2 | ||
| 1 X 10^{5} | 5/5 | 14-20 | 30 \pm 5.1 | ||
| LLC | 1 X 10^{7} | 5/5 | 14-19 | 29 \pm 4.3 | |
| 1 X 10^{4} | 0/6 | - | - | ||
| LLC | 1 X 10^{5} | 0/6 | - | - | |
| 1 X 10^{7} | 1/6 | - | 29 | ||
| LLC | |||||
| 1 X 10^{4} | 5/5 | 18-26 | 38 \pm 6.1 | ||
| EL-4 | 1 X 10^{5} | 5/5 | 16-22 | 36 \pm 6.1 | |
| 1 X 10^{7} | 5/5 | 16-24 | 33 \pm 4.5 | ||
| ^{a} Los tumores fueron establecidos con células tumorales EL4 o LLC inyectados intratumoralmente con DNA B 7.1. | |||||
| Veinticuatro horas después DMXAA fue administrado i.p. y luego de veinte un días los animales fueron probados | |||||
| ^{b} Los valores representan la media \pm DS calculado para 5 o 6 ratones por grupo |
Los tumores EL-4 de 0.1 cm de
diámetro fueron establecidos en ratones C57BL/6 e inyectados con
DNA/liposoma vehículo e transferencia conteniendo 100\mug de
HIF-1\alpha pcDNA3B antisensación plasmid DNA. El
análisis Immunohistoquimico de Secciones de tumores preparados dos
días después de la transferencia de genes, reveló que la terapia
antisensación resultó en la casi completa inhibición de
HIF-1 expresando un crecimiento endógeno de los
tumores (Figura 9A). El crecimiento del tumor durante 4 semanas
siguiendo la transferencia de genes (Figura 10a). El patrón de
crecimiento fue comparado con un ratón tratado con 100 \mug de
vector de control vacío. Los tumores crecieron rápidamente en el
grupo de control llegando a 1 cm de tamaño de en los
14-17 días siguientes a la transferencia de genes,
por cuanto, los tumores tratados con el
anti-sensación HIF-1\alpha plasmid
retrocedieron completa y rápidamente dentro de una semana de
transferencia de genes. Los ratones permanecieron libres de tumor
por el periodo posterior de 21 días durante los cuales ellos fueron
monitoreados.
Hemos demostrado anteriormente que los tumores
se vuelven refractarios a la inmunoterapia una vez que ellos
alcanzan 0.3 cm de diámetro. ^{1} Para determinar si la terapia
antisensación HIF-1\alpha era similarmente
ineficaz contra grandes tumores, el tumor EL-4 de
0.4 cm de diámetro se estableció, y trató con 100 \mug
anti-sensación HIF-1\alpha de
plasmid de expresión. Como se muestra en la figura 10b, ninguno de
los ratones rechazó sus tumores, aunque había una significativa (p
< 0.01) inhibición del crecimiento del tumor. Eventualmente,
todos los tumores llegan a 1 cm de diámetro dentro de las dos
semanas, y a los ratones hubo que practicarles eutanasia
Aquí consideramos la posibilidad que un
reactivo anti-HIF-1\alpha pueda
ser un adecuado anti-angigénico sustituto para
DMXAA en terapia combinada. Como se hizo referencia
previamente^{1}, el gen transferido de un B7-1
plasmid de expresión en pequeños tumores (0.1 cm de diámetro)
(Figura 10a) llevo a la completa erradicación del tumor dentro de
una semana después de la transferencia de genes. No hubo una
diferencia significativa entre el patrón de crecimiento de los
tumores tratados con B7-1 y antisensación
HIF-1\alpha (p >0.05). En contraste, grandes
tumores (0.4 cm de diámetro) fueron refractarios del tratamiento
(figura 10b), como ha sido el caso con terapia antisensación
HIF-1\alpha. La falla en la terapia
B7-1 no es el resultado de una pobre eficiencia
transfección como la transferencia de genes B7-1 que
llevo a la expresión de B7-1 en 90% de células
tumorales, como se hizo referencia en trabajos anteriores^{1}.
para terapia combinada, los tumores de 0.4 cm de diámetro fueron
inyectados primero como DNA de liposoma, complejos que contenían 100
\mug de B7-1, seguido 48 mas tarde por 100
\mug antisensación HIF-1\alpha plasmid. La
terapia de gen combinada lleva a completar la regresión del tumor
dentro de 10 días y el ratón permanece libre de tumores por tres
semanas (figura 11). Para determinar si la inmunidad sistémica
anti-tumor ha sido generada, el ratón sanado fue
puesto a prueba nuevamente con 1 x 10^{6} células tumorales
parentales. Dicho ratón resistió la prueba, y permaneció libre de
tumor por al menos 2 meses.
Como un control, la inmunoterapia
B7-1 fue combinada con una expresión plasmid
codificando el HIH-1\alpha cDNA fragmento
insertado en pcDNA3 en un sentido de orientación en marcado
contraste con los anteriores resultados, sensación
HIF-1\alpha no podría aumentar la eficacia
terapéutica de B7-1 (figura 11), produciendo
resultados que no eran estadísticamente (p > 0.05) diferentes
del ratón de control tratado con vector vacío.
Dado que HIF-1\alpha
antisensación bajo-regula la expresión de
HIF-1\alpha en EL-4 células
tumorales, buscábamos determinar si la expresión de efectores
descendientes tal como VEGF fue abolida. La expresión VEGF fue
específicamente reducida en respuesta al antisensación
HIF-1\alpha (figura 9A compara c y d), resultando
en una estadísticamente significativa (p< 0.01) 30% de reducción
en la densidad de vasos del tumor (figura 9B y C), comparado con el
tratamiento desdeñado con vector vacío. Además los vasos sanguíneos
del tumor presentes después de la terapia antisensación
HIF-1\alpha eran mas pequeños y pobremente
formados.
Ratones machos C57BL/6 de 6-8
semanas de edad, fueron obtenidos de la Unidad de Recursos
Materiales, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud,
Universidad de Auckland, Auckland. El linfoma thymic
EL-4, el cual es de origen C57BL/6
(H-2b), fue adquirido desde el Colección Americana
de Cultivo Tipo (Rockville, MD, EEUU). Fue cultivado a 37ºC en un
medio DMEM (Gibco BRL, Isla Grand, NY, EEUU), suplementado con 10%
de suero fetal de becerro, 50 U/ml de penicilina/estreptomicina, 2
mM L-glutamina, 1 mM piruvato.
Un fragmento 320bp de cDNA codificando el
extremo 5’ de HIF-\alpha (nucleótidos 152 a 454;
GenBank AF003698) fue producido a través de PCR usando el clon
IMAGE 851237 como una plantilla y los dos primarios (5’ GGG GAT CCT
CTG GAC TTG TCT CTT TC3’ y 5’ GGG CTC GAG TAA CTG ATG GTG AGC CTC
3’). El fragmento fue clonado en el pGEMT (Corporación Promega), y
luego sub clonadas en el pcDNA3 (Compañía Invitrogen) a BamHI y
sitios XhoI en orientación sensitiva, y en el pcDNA3B a XhoI y
sitios BamHI en una orientación antisensación. El vector de
expresión pcDNA3B es idéntico al pcDNA3, excepto el polylinker que
es revertido (Lehnert et al., sin publicar). El plasmid de
expresión B7-1-pCDMB, el cual
contiene un 1.2 kb fragmento de cDNA codificado de ratón de largo
completo B7-1 que fue construido desde un clon de
cDNA entregado por Dr P Linsley,
Bristol-Myers-Squibb, Seattle, WA,
EEUU.
Plásmidos modificados fueron diluidos en una
solución de ``5% de glucosa en 0.01% de Triton x-100
en una proporción de 1:3 (wt:wt) con liposomas catiónicos DOTAP
(Bachringer Mannheim, Mannheim, Alemania), el cual es un vehículo
de transacción eficiente. ^{1}Las concentraciones finales de
plasmid fueron de 1 mg/ml. Los tumores fueron establecidos a través
de una inyección de 2 x 10^{5} de células tumorales
EL-4 en el flanco derecho de los ratones, y el
crecimiento determinado a través de la medición de dos diámetros
perpendiculares. Los animales fueron asesinados cuando los tumores
alcanzaron más de 1 cm de diámetro, de acuerdo con la Aprobación de
Ética Animal (Universidad de Auckland). Los tumores alcanzaron 0.1
cm y 0.4 cm de diámetro luego de aproximadamente
14-18 días, y fueron inyectados con 100 ul de
plasmid de expresión (100 \mug). Para tratamientos de combinación,
fueron entregados reactivos en un tiempo acostumbrado, como es
descrito mas arriba para terapia de combinación de
B7-1/DMXAA. Así B7-1 cDNA fue
inyectado primero, seguido por cDNA de HIF antisensación 48 horas
después. Los vectores vacíos sirvieron como reactivos de control.
Los ratones curados fueron puestos a prueba 3 semanas después de la
desaparición de los tumores a través de la inyección subcutánea de 1
x 10^{6} células EL-4 en el flanco opuesto
(flanco izquierdo). Todos los experimentos incluyeron seis ratones
por grupo, y cada experimento fue repetido al menos una vez. Los
resultados fueron expresados como valores principales \pm
desviación Standard, y un test de estudiantes fue usado
para la evaluación de la importancia estadística. Un valor menor que 0.05 (p < 0.05) denota importancia estadística.
para la evaluación de la importancia estadística. Un valor menor que 0.05 (p < 0.05) denota importancia estadística.
Crio-secciones de tumores (10
\mum) fueron preparadas dos días después de la transferencia de
genes, tratadas con acetona enjuagadas con PBS, y bloqueadas con 2%
de BSA por 2 horas. Las secciones soportaron una incubación de una
noche cualquiera un anti-B7-1 mAb de
hámster (1G10, Pharmingen, San Diego, CA, EEUU), ratón
anti-ratón HIF-1a mAb (H1a67, Novus
Biológicas, Inc., Litleton, CO, EEUU), o contra anticuerpos de
conejo policlonados VEGF (Ab-1, Corporación
Laboratorio Visión; CA, EEUU). Ellos fueron incubados posteriormente
por 30 minutos con anticuerpos secundarios apropiados, utilizando
el Kit rápido Universal VECTASTAIN (Laboratorios Vector,
Burlingame, CA, EEUU); y desarrollado con Sigma FAST DAB
(3,3’diaminobenzidina tetrahidrocloridio) y tabletas mejoradas de
CoCl_{2} (Sigma). Las secciones fueron contrastadas con
hematoxilina de Mayer montadas, y examinadas por microscopio.
El método para la evaluación de vascularidad fue
como se describe. ^{33}En resumen, 10-\mum
secciones fueron cortadas de tumores congelados frescos a los
cuatro días después de la transferencia de genes. Laminas fueron
inmunocoloreadas con el anticuerpo anti-CD31, MEC
13.3 (Pharmingen, CA, EEUU), como anteriormente. Los vasos
sanguíneos coloreados con el anti-CD31 mAb fueron
contados en campos de selección aleatoria.
Así, en conformidad con la presente invención,
la aplicación ha entregado un medicamento para la terapia del
cáncer el cual representa un avance significativo sobre
acercamientos previos en términos de erradicación de avanzados y
grandes tumores. El avance representado por la presente invención es
particularmente notable donde el agente inmunoterapéutico es
administrado en un periodo apropiado anterior a la administración
del agente de restricción de crecimiento del tumor. Estos
resultados m completa erradicación de grandes tumores pesados y la
generación de una potente inmunidad sistémica
anti-tumor.
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Claims (7)
1. El uso de un agente inmunoterapéutico en
conjunción con un agente restrictivo de crecimiento del tumor, para
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de mamíferos
con avanzados o grandes tumores pesados, en donde el agente
restrictivo de crecimiento del tumor potencia la actividad del
agente inmunoterapéutico y es uno de ácido
5,6-dimetilxantenona-4-acético
(DXMAA) y ácido flavona acético (FAA) y en donde el agente
inmunoterapéutico incluye una T-célula
co-estimulatoria de células de adhesión de moléculas
(CAM) o un vector de expresión mamífero que contiene DNA el cual
codifica una T-célula
co-estimulatoria CAM, en la cual el CAM es
B7.1.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual el agente restrictivo de crecimiento del tumor es ácido
5,6-dimetilxantenona-4-acético
(DXMAA).
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual el agente restrictivo de crecimiento del tumor es ácido
flavona acético (FAA).
4. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación
precedente, en el cual el mamífero es un humano.
5. Uso como se reivindica en cualquier
reivindicación precedente, en el cual el medicamento es formulado
para la administración del agente inmunoterapéutico antes de la
administración del agente restrictivo de crecimiento del tumor.
6. Uso como se reivindica en reivindicación 5,
en el cual el medicamento es formulado para la administración del
agente inmunoterapéutico de 12 a 24 horas antes de la administración
del agente restrictivo de crecimiento del tumor.
7. Uso como se reivindica en cualquier
reivindicación precedente, en el cual el medicamento además incluye
un agente adicional restrictivo de crecimiento del tumor.
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