ES2265989T3 - Ensayo de helicasa electroquimioluminiscente. - Google Patents

Ensayo de helicasa electroquimioluminiscente. Download PDF

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Abstract

Un método de ensayo electroquimioluminiscente para detectar actividad helicasa en una muestra, método que comprende (a) combinar la muestra con un primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que comprende un marcador electroquimioluminiscente e hibridado con un segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria; (b) incubar la muestra y los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos hibridados de la etapa (a) bajo condiciones en las que la helicasa presente en la muestra pueda deshibridar el primer y segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico; (c) capturar el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin hibridar; y (d) medir la electroquimioluminiscencia del primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico capturada.

Description

Ensayo de helicasa electroquimioluminiscente.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a ensayos que utilizan electroquimioluminiscencia para la detección de actividad helicasa. Por lo tanto, la invención proporciona un ensayo de helicasa que es rápido, sensible y adecuado para el rastreo con un rendimiento alto de actividad helicasa en general y, especialmente, de inhibidores potenciales de helicasa. Los inhibidores de helicasa representan una clase de agentes farmacológicos útiles para el tratamiento de enfermedades.
Antecedentes de la invención ADN Helicasas
Las ADN helicasas son enzimas que están implicadas en todos los aspectos del metabolismo de los ácidos nucleicos (Lohman y Bjornson, Annu. Rev. Biochem., 1996, 65, 169-214; Matson, S. W., Progress in Nuclear Acid Research and Molecular Biology, 1991, 40, 289-326). La forma estable de la mayoría de los ADN in vivo es el ADN helicoidal de cadena doble. Los ADN de cadena única se requieren para la replicación, reparación, recombinación y conjugación del ADN. Con el fin de formar ADN de cadena única a partir de uno de doble cadena, el ADN dúplex debe estar al menos parcialmente desenrollado y separado. El proceso de desenrollamiento de ADN dúplex estables está catalizado por ADN helicasas que utilizan la energía procedente de la hidrólisis de nucleósido 5'-trifosfatos (NTP). Las enzimas helicasas se translocan a lo largo del ADN para desenrollar (deshibridar) las cadenas del dúplex a una velocidad que puede ser tan alta como 500-1.000 pb/s.
Las ADN helicasas se han identificado en diferentes procariotas, eucariotas, bacteriófagos y virus. La mayoría de los organismos codifican múltiples helicasas. Por ejemplo, E. coli codifica al menos 12 helicasas diferentes (Matson, et al., BioEssays, 1994, 16,13-22) y S. cerevisiae codifica al menos seis formas de helicasa (Li, et al., Chromosoma, 1992, 102, S93-S99). Aunque estas ADN helicasas desempeñan muchas funciones diferentes en el metabolismo del ADN, ahora es evidente que la actividad helicasa es la función centrada en desenrollar el ADN dúplex. Debido a la función esencial de las helicasas para el metabolismo celular, estas enzimas representan dianas importantes para desarrollar agentes terapéuticos.
Ensayos de Helicasa
Se han desarrollado muchos tipos de ensayo para evaluar el proceso de desenrollamiento de ácidos nucleicos dúplex por helicasas. Uno de dichos ensayos evalúa la sensibilidad de ADN dúplex marcado frente a nucleasas específicas de cadena única, tal como S1 o exonucleasa I, que resulta en la producción de ADNss durante el desenrollamiento (Palas et al., J. Biol. Chem., 1990 265:3447). También se ha utilizado la microscopía electrónica para visualizar directamente las regiones de ADN desenrolladas por proteínas tales como la enzima recBCD, proteína rep, helicasas I y II de E. coli, y antígeno T de SV40 (Runyon et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,1990, 87:6383).
El ensayo más habitual para determinar la actividad helicasa in vitro utiliza electroforesis (Venkatesan et al., J. Biol. Chem., 1982, 257, 12426; Matson, et al., J. Biol. Chem., 1983, 258, 14017). La enzima helicasa desenrolla ADN dúplex rindiendo ADN de cadena única. Los productos de esta reacción se resuelven en un gel de poliacrilamida o agarosa. Un marcador radiactivo en el ADN permite la visualización y la cuantificación directa de los resultados.
Un ensayo espectrofotométrico continuo desarrollado para estudiar la actividad helicasa de la enzima recBCD utiliza una proteína que se une a ADNss, bien la proteína SSB de E. coli (proteína que se une a ADN de cadena única) o la proteína del gen 32 del fago T4, como molécula informadora (Roman et al., Biochemistry, 1989, 28:2863). Cuando el ADNds se desenrolla, la proteína SSB se une al ADNss formado, lo que resulta en la desactivación de su fluorescencia intrínseca. En las Patentes de EEUU. 4.568.649, 5.705.344 y 5.747.247 se describen ensayos de helicasa adicionales.
Se ha utilizado un sistema de ensayo de centelleo por proximidad para detectar actividad helicasa del virus de la hepatitis C utilizando la proteína NS3 purificada mediante una columna de inmunoafinidad (Kyono et al, Analytical Biochemistry, 1998, 257:120).
Cada uno de los ensayos descritos anteriormente tiene determinadas limitaciones que se refieren a su sensibilidad, número de etapas requerido para llevar a cabo el ensayo, y/o el número limitado de muestras que puede ensayarse. Obviamente, dichos métodos no pueden adaptarse fácilmente a los formatos de rastreo de medicamentos muy sensibles y con rendimientos altos. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un ensayo de helicasa sencillo y a la vez sensible que pueda llevarse a cabo con rendimientos altos. La presente invención soluciona estos obstáculos, y proporciona un ensayo de helicasa que es rápido, sensible y adecuado para un rastreo con rendimientos altos de inhibidores potenciales de helicasa.
Ensayos de Electroquimioluminiscencia
La electroquimioluminiscencia es luz generada cuando se aplica un voltaje bajo a un electrodo, desencadenando de esta manera una reacción cíclica de oxidación y reducción de un ion metálico de rutenio unido en un quelato de tris-(bipiridina). Esta tecnología tiene una aplicabilidad amplia en la detección de analitos microbiológicos, bioquímicos y químicos (Bruno et al., 1997, Rec. Res. Devel. In Micro. 1:25).
Se han desarrollado marcadores electroquimioluminiscentes para ADN (Kenten et al., 1991, Clin. Chem. 37:1626; Kenten et al., 1992, Clin. Chem. 38:873; marcador Origen®, Origen® Fosforamidita y TAG Fosforamidita disponibles en IGEN Inc., Rockville, MD), y se han utilizado para la detección de productos de la reacción en cadena de la polimerasa (Schutzbank et al., 1995, J. Clin. Microbiol., 33:2023). Blackburn et al, 1991, Clinical Chemistry,. 37:1534 describe su utilización en inmunoensayos así como en la detección de productos de la reacción en cadena de la polimerasa. Se ha mostrado que estos ensayos son rápidos y eficaces para la detección de productos amplificados por PCR.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un ensayo de helicasa que es rápido, sensible y adecuado para el rastreo con rendimientos altos de inhibidores potenciales de helicasa. Los inhibidores de helicasa representan una clase de agentes farmacológicos útiles para el tratamiento de enfermedades.
Por lo tanto, en una primera realización, la presente invención proporciona un método de ensayo electroquimioluminiscente para detectar actividad helicasa en una muestra, método que comprende
(a)
combinar la muestra con un primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que comprende un marcador electroquimioluminiscente e hibridado con un segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria;
(b)
incubar la muestra y los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos hibridados de la etapa (a) bajo condiciones en las que la helicasa presente en la muestra pueda deshibridar el primer y segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico;
(c)
capturar el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin hibridar; y
(d)
medir la electroquimioluminiscencia del primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico capturada.
La helicasa puede ser una helicasa humana o patógena. Preferiblemente, la helicasa es una helicasa fúngica, viral, bacteriana o parasítica.
Puede utilizarse cualquier método para capturar el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin hibridar. En una serie de etapas preferida, entre las etapas (b) y (c) anteriores, los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos sin hibridar se incuban con un tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria al primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico y que comprende un ligando de captura, bajo condiciones en las que el primer y tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico puedan hibridar. Después, el primer y tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico hibridados pueden capturarse con un receptor de captura que une el ligando de captura. El receptor de captura puede estar en la superficie de perlas magnéticas. En una realización preferida, el ligando de captura es biotina y el receptor de captura es avidina. El marcador electroquimioluminiscente preferido es un quelato de rutenio.
En otra realización, la presente invención se refiere a un método para detectar en una muestra un agente que modula la actividad helicasa que comprende
(a)
combinar la muestra, una helicasa y un primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que comprende un marcador electroquimioluminiscente e hibridado con un segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria, formando de esta manera una mezcla;
(b)
incubar la mezcla de la etapa (a) bajo condiciones en las que la helicasa pueda deshibridar el primer y segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico en ausencia de la muestra;
(c)
capturar el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin hibridar; y
(d)
medir la electroquimioluminiscencia del primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico capturada.
En una realización preferida, el agente es un inhibidor de la actividad helicasa. La helicasa puede ser una helicasa humana o patógena. Preferiblemente, la helicasa es una helicasa fúngica, viral, bacteriana o parasítica.
Puede utilizarse cualquier método para capturar el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin hibridar. En una serie de etapas preferida, entre las etapas (b) y (c) anteriores, los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos sin hibridar se incuban con un tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria al primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico y que comprende un ligando de captura, bajo condiciones en las que el primer y tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico puedan hibridar. Después, el primer y tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico hibridados pueden capturarse con un receptor de captura que une el ligando de captura. El receptor de captura puede estar en la superficie de perlas magnéticas. En una realización preferida, el ligando de captura es biotina y el receptor de captura es avidina. El marcador electroquimioluminiscente preferido es un quelato de rutenio.
En otra realización más, la invención proporciona kits para la detección electroquimioluminiscente de la actividad helicasa. Dichos kits comprenden
(a)
un primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que comprende un marcador electroquimioluminiscente;
(b)
un segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria al primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico;
(c)
una helicasa y/o perlas magnéticas adecuadas para facilitar la detección de la electroquimioluminiscencia.
En un aspecto, el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico se hibrida previamente con el segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico. Los kits según la invención pueden comprender además un tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria al primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico y que comprende un ligando de captura. Bajo dichas circunstancias, el kit incluirá, generalmente, un receptor de captura capaz de unir el ligando de captura. En una realización preferida, el receptor de captura está en la superficie de perlas magnéticas. En una realización más preferida, el ligando de captura es biotina y el receptor de captura es avidina.
Descripción breve de las figuras
Figura 1: Cuantificación radiométrica de la actividad helicasa de DnaB de E. coli.
Un oligonucleótido de 60 pb se marcó con ^{32}P en el extremo 3'. Después, se hibridó un oligonucleótido complementario de 60 pb con el nucleótido marcado. Se añadieron diferentes cantidades de helicasa DnaB, como se indica, y las mezclas de reacción se incubaron a 37ºC durante 30 min. Se añadió EDTA para parar la reacción, y las muestras se separaron en un gel PAGE y se detectaron mediante autorradiografía. El carril 8 contiene una muestra hervida para mostrar la separación de ADNss y ADNds. El carril 9 sólo contiene ADNss marcado.
Figura 2: Esquema del Ensayo de Centelleo por Proximidad (SPA) para la cuantificación de la actividad helicasa utilizando oligonucleótidos marcados radiactivamente con ^{3}H y ADNss de M13.
Figura 3: Desenrollamiento de sustratos marcados con ^{3}H utilizando diferentes cantidades de helicasa DnaB. Las cuentas por minuto (cpm) se representan como función de la cantidad de helicasa DnaB añadida en cada reacción.
Figura 4: Gráfico de barras de la actividad helicasa de DnaB utilizando el ensayo SPA.
Figura 5: Esquema del Ensayo de Desactivación de la Fluorescencia en Tiempo Resuelto para la cuantificación de la actividad helicasa utilizando oligonucleótidos marcados radiactivamente con Eu y oligonucleótidos complementarios marcados con Rodamina.
Figura 6: Desenrollamiento de sustratos hibridados utilizando diferentes cantidades de helicasa DnaB. La cantidad de Fluorescencia liberada a partir de ADNds sin desenrollar se representa como función de la cantidad de helicasa DnaB añadida en cada reacción.
Figura 7: Esquema del ensayo de electroquimioluminiscencia (ECL) para la cuantificación de la actividad helicasa utilizando oligonucleótidos marcados con Rutenio y ADNss de M13.
Figura 8: Señal electroquimioluminiscente generada por el desenrollamiento de sustratos de cadena doble utilizando diferentes cantidades de helicasa DnaB. La señal de ECL se representa como función de la cantidad de helicasa añadida a la reacción.
Descripción detallada de la invención
Ventajosamente, la presente invención proporciona un método de ensayo electroquimioluminiscente para detectar actividad helicasa, y un método para identificar moduladores de la actividad helicasa. Por lo tanto, la presente invención proporciona un ensayo rápido y sensible para inhibidores potenciales de helicasa que es adecuado para el rastreo con un rendimiento alto. La invención también proporciona kits para utilizarse en la identificación de la actividad helicasa, y el rastreo de moduladores potenciales de la actividad helicasa. Dichos kits incluyen cantidades medidas previamente de los componentes utilizados en los métodos descritos.
Debido a que las helicasas son necesarias para una amplia variedad de funciones celulares incluyendo el crecimiento, las enfermedades diana sólo están limitadas por el hecho de que la enfermedad o progresión de la enfermedad esté sujeta a la inhibición mediante la modulación de la actividad de una o más helicasas específicas. Como tales, las enfermedades diana incluyen infecciones virales, bacterianas y fúngicas, enfermedades metabólicas, enfermedades genéticas, disfunciones del crecimiento y regulación celulares, tales como neoplasia, inflamación, hipersensibilidad, etc. Las enfermedades diana pueden ser afecciones de plantas, especialmente de cultivos agrícolas, o de animales, especialmente ganado, animales domésticos y seres humanos.
Los distintos aspectos de la invención se mostrarán con mayor detalle en las secciones siguientes. Se pretende que esta organización en distintas secciones facilite la comprensión de la invención, y no se pretende de ningún modo que la limite.
Definiciones
Los términos definidos siguientes se utilizan a lo largo de la presente especificación, y deben ser de utilidad para entender el alcance y la práctica de la presente invención.
En una realización específica, el término "alrededor" o "aproximadamente" significa en el intervalo de un 20%, preferiblemente un 10%, y más preferiblemente un 5% de un determinado valor o intervalo.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, los artículos "un" y "una" significan uno/a o más; por lo tanto, "una helicasa" incluye los ensayos en los que están implicadas una o más helicasas, tales como rastreos simultáneos de inhibidores de distintas helicasas.
Un "ácido nucleico" es un compuesto polimérico que comprende subunidades unidas covalentemente denominadas nucleótidos. Ácido nucleico incluye ácido polirribonucleico (ARN) y ácido polidesoxirribonucleico (ADN), pudiendo ser ambos de cadena única o de cadena doble. ADN incluye ADNc, ADN genómico, ADN sintético, y ADN semi-sintético.
Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a la forma polimérica del éster fosfato de los ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o de los desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN") o a cualquiera de los análogos fosfoéster de éste, tales como los fosforotioatos y tioésteres, ya sea en forma de una cadena única o de una hélice de cadena doble. Son posibles las hélices ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN de doble cadena. El término molécula de ácido nucleico, y en particular molécula de ADN o ARN, se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a ninguna forma terciaria concreta. Por lo tanto, este término comprende el ADN de cadena doble hallado, entre otras, en las moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas. En la exposición de la estructura de determinadas moléculas de ADN de cadena doble, las secuencias pueden describirse en la presente memoria según el acuerdo habitual de proporcionar únicamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADN no transcrita (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga a la del ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que se ha sometido a una manipulación molecular biológica.
Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" con otra molécula de ácido nucleico, tal como un oligonucleótido, un ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma de cadena única de la molécula del ácido nucleico puede hibridarse con la otra molécula de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la disolución. Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "astringencia" de la hibridación. Las condiciones de baja astringencia en la hibridación corresponden a una T_{m} de 55º, por ejemplo, 5x SSC, 0,1% SDS, 0,25% leche, y sin formamida; ó 30% formamida, 5x SSC, 0,5% SDS. Las condiciones de astringencia moderadas en la hibridación corresponden a una T_{m} mayor, por ejemplo, 40% formamida, con 5x ó 6x SCC. Las condiciones de astringencia altas en la hibridación corresponden a la T_{m} más alta, por ejemplo, 50% formamida, 5x ó 6x SCC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la astringencia de la hibridación, son posibles uniones erróneas entre las bases. La astringencia apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementariedad, variables muy conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de T_{m} para los híbridos de los ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a la T_{m} mayor) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el orden siguiente: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para los híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han obtenido ecuaciones para calcular la T_{m} (véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 9.50-0-51). Para la hibridación de ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de las uniones erróneas se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., 11.7-11.8). Preferiblemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos de aproximadamente 10 nucleótidos; preferiblemente al menos de aproximadamente 15 nucleótidos; y, más preferiblemente, la longitud es al menos de aproximadamente 20 nucleótidos;
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Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico, generalmente al menos de 18 nucleótidos, que es hibridable con un ácido nucleico complementario. Los oligonucleótidos pueden marcarse, por ejemplo, con nucleótidos marcados con ^{32}P o con nucleótidos que se han conjugado covalentemente con un marcador, tal como biotina o quelato de rutenio. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan de manera sintética, preferiblemente en un sintetizador de ácidos nucleicos. De acuerdo con esto, los oligonucleótidos pueden prepararse con enlaces fosfoéster análogos que no están presentes en la naturaleza, tales como enlaces tioéster, etc.
"Avidina" incluye cualquier proteína o polipéptido capaz de unirse con gran afinidad a la biotina. La estreptavidina es uno de dichos ejemplos de avidina.
Una "helicasa" es cualquier proteína o polipéptido que tiene la capacidad de desenrollar (deshibridar) un dúplex de ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos complementarias.
Ensayos de Helicasa
Los métodos definidos por la presente invención implican formar una mezcla de un primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que comprende un marcador electroquimioluminiscente e hibridado con un segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria.
El primer y segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico hibridados pueden ser ARN o ADN, lineal o circular, dependiendo de la especificidad de la helicasa diana. Además, pueden utilizarse otros ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos o análogos estructurales siempre que proporcionen un sustrato activo para la actividad helicasa diana. Los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos pueden tener cualquier longitud adecuada para las condiciones y requerimientos del ensayo. Por ejemplo, para asegurar la especificidad de la helicasa por el sustrato y minimizar la renaturalización no específica se requiere una región mínima de complementariedad entre el primer y segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico, típicamente al menos aproximadamente 12, más típicamente al menos aproximadamente 18 y preferiblemente al menos aproximadamente 24 pares de bases continuos. Puede existir una diferencia de tamaño entre las cadenas. Los tamaños se seleccionan para facilitar el ensayo y para proporcionar resultados del ensayo estadísticamente significativos; frecuentemente los tamaños diferirán en al menos uno o dos órdenes de magnitud. En general, las longitudes óptimas se determinan fácilmente de forma empírica.
Los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos pueden tener cualquier secuencia que proporcione un sustrato conveniente para las(s) helicasa(s) diana. Los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos pueden ser complementarias a lo largo de la longitud total de al menos uno de los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos o pueden existir regiones de no complementariedad en el extremo 5' y/o 3' de la región complementaria. La introducción de estas regiones no complementarias en el extremo 5' y/o 3' proporciona horquillas moleculares que rinden sustratos mejores para algunas helicasas. Generalmente, los vectores convenientemente replicados, por ejemplo, fagos o fragmentos de restricción de éstos, proporcionan una fuente económica de ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos. Generalmente, los ensayos son compatibles con la presencia de proteínas que se unen al ADN, tales como histonas. Habitualmente es ventajoso incluir diferentes sustratos potenciales, por ejemplo, ácidos nucleicos de cadena doble de diferentes tamaños, secuencia, proteínas complejantes, etc., para mejorar la probabilidad de detectar helicasas sensibles al sustrato.
El primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico comprende un marcador electroquimioluminiscente detectable. La electroquimioluminiscencia es luz generada cuando se aplica un voltaje bajo a un electrodo, desencadenando de esta manera una reacción de oxidación y reducción cíclica del marcador. Según la presente invención puede utilizarse cualquier marcador electroquimioluminiscente capaz de dicha oxidación/reducción cíclica y de generar luz. El marcador preferido es ion metálico de rutenio unido en un quelato de tris-(bipiridina). Se han desarrollado marcadores electroquimioluminiscentes específicos para ADN (Kenten et al., 1991, Clin. Chem. 37:1626; Kenten et al., 1992, Clin. Chem. 38:873; marcador Origen®, Origen® fosforamidita y TAG fosforamidita, IGEN Inc., Rockville, MD) y son los más preferidos para la presente invención.
Según la presente invención puede analizarse cualquier helicasa patógena (es decir, cualquier helicasa capaz de actuar de manera perjudicial para un organismo o célula anfitriona). Las células con crecimiento rápido (por ejemplo, en una neoplasia) pueden ser la diana de inhibidores de helicasas humanas, especialmente de helicasas replicativas. Además, se utilizan helicasas selectivas para patógenos o específicas para identificar agentes farmacológicos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades infecciosas. En especial, las helicasas fúngicas, virales, bacterianas y parasíticas proporcionan dianas urgentes desde un punto de vista médico para identificar inhibidores mediante los presentes métodos. Alternativamente, pueden utilizarse distintas helicasas o un panel que comprende un intervalo preseleccionado de diferentes helicasas para maximizar el alcance del ensayo.
Las helicasas patógenas preferidas se obtienen a partir de agentes significativamente infecciosos desde un punto de vista médico tales como hongos, tales como especies de Aspergillus, Candida; bacterias tales como Staphylococcus (por ejemplo, aureus), Streptococcus (por ejemplo, pneumoniae), Clostridia (por ejemplo, perfringens), Neisseria (por ejemplo, gonorrhoeae), Enterobacteriaceae (por ejemplo, coli), Helicobacter (por ejemplo, pylori), Vibrio (por ejemplo, cholerae), Capylobacter (por ejemplo, jejuni), Pseudomonas (por ejemplo, aeruginosa), Haemophilus (por ejemplo, influenzae), Bordetella (por ejemplo, pertussis), Mycoplasma (por ejemplo, pneumoniae), Ureaplasma (por ejemplo, urealyticum), Legionella (por ejemplo, pneumophila), Spirochetes (por ejemplo, Treponema, Leptospira y Borrelia), Mycobacteria (por ejemplo, tuberculosis, smegmatis), Actinomycies (por ejemplo, israelii), Nocardia (por ejemplo, asteroides), Chlamydia (por ejemplo, trachomatis), Rickettsia, Coxiella, Ehrilichia, Rochalimaea, Brucella, Yersinia, Fracisella, y Pasteurella; protozoos tales como esporozoos (por ejemplo, Plasmodia), rizópodos (por ejemplo, Entamoeba) y flagelados (Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas Giardia, etc.); y virus tales como virus (+) ARN (los ejemplos incluyen Picornavirus, por ejemplo, polio; Togavirus, por ejemplo, rubella; Flavivimse, por ejemplo, HCV; y Coronavirus), virus (-) RNA (los ejemplos incluyen Rhabdovirus, por ejemplo VSV; Paramyxovirus, por ejemplo, RSV; Orthomyxovirus, por ejemplo, influenza; Bunyavirus y Arenavirus), virus ADNds (Reovirus, por ejemplo), virus ARN a ADN ,es decir, Retrovirus, por ejemplo VIH, y determinados virus ADN a ARN tales como virus de la Hepatitis B.
La helicasa puede purificarse a partir de una fuente natural o puede ser recombinante. Habitualmente la helicasa se proporciona en forma al menos parcialmente purificada. En el presente ensayo puede utilizarse sólo una fracción de la helicasa suficiente para la actividad helicasa. Las fracciones capaces de proporcionar la especificidad de unión y la afinidad requeridas son identificadas y producidas fácilmente por el experto en la técnica utilizando métodos moleculares y bioquímicos generales, véanse, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª Ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith y Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY, N.Y., 1992) u otros conocidos en la técnica.
Los métodos de la presente invención requieren capturar el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin hibridar producido por la actividad helicasa presente en el ensayo. Puede utilizarse cualquier método para capturar el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin hibridar. En una serie de etapas preferida, el primer y segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin hibridar se incuban con un tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria al primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico y que comprende un ligando de captura, bajo condiciones en las que el primer y tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico puedan hibridar. Después, el primer y tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico hibridados pueden capturarse con un receptor de captura que une el ligando de captura. El receptor de captura puede estar en la superficie de perlas magnéticas con el fin de facilitar directamente la detección de la electroquimioluminiscencia.
El proceso del ensayo de la presente invención puede utilizarse conjuntamente con cualquier combinación o sistema de captura ligando-receptor que capture específicamente el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin afectar la detección de la electroquimioluminiscencia. Los ejemplos de combinaciones adecuadas de ligando-receptor incluyen anticuerpos y sus antígenos correspondientes. Otro sistema ligando-receptor puede estar compuesto por proteína A e inmunoglobulinas, o una fracción Fc de éstas. Los sistemas de captura adicionales con los que se puede utilizar la presente invención incluyen: (1) lecitinas-oligosacáridos o glicoproteínas; (2) biotina-avidina; (3) receptor de hormona-hormona; (4) enzima-sustrato o cofactor; (5) ARN-ADN; y (6) ADN-ADN. Debe entenderse que en la presente invención cualquiera de los elementos puede servir como el ligando o el receptor. En una realización preferida, el ligando de captura es biotina y el receptor de captura es avidina. La preparación de oligonucleótidos biotinilados y de perlas magnéticas recubiertas con avidina está descrita en Kenten et al., 1991 (Clin. Chem. 37:1626) y Kenten et al., 1992 (Clin. Chem. 38:873).
La presente invención es especialmente adecuada para rastrear agentes candidatos respecto a su capacidad para modular la actividad helicasa, especialmente su actividad inhibitoria. La invención es adecuada para un rastreo con un rendimiento alto de medicamentos de una biblioteca de agentes candidatos. Los agentes candidatos obtenidos a partir de una biblioteca engloban varias clases químicas, aunque típicamente son compuestos orgánicos; preferiblemente compuestos orgánicos pequeños. Las bibliotecas pueden comprender compuestos obtenidos sintética y/o naturalmente. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos y biomoléculas orgánicas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorios. Alternativamente, están disponibles o se producen fácilmente bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, de plantas y animales. Además, se pueden modificar fácilmente bibliotecas producidas natural o sintéticamente mediante medios químicos, físicos, y bioquímicos convencionales. Además, pueden someterse agentes farmacológicos conocidos a modificaciones químicas dirigidas o al azar, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc., para producir análogos estructurales. El agente se proporciona en diluciones seriadas estándar o en una cantidad determinada por analogía con moduladores conocidos.
Típicamente, el presente ensayo incluye habitualmente reactivos adicionales tales como sales, tampones, etc., para facilitar o maximizar la actividad helicasa. Además, pueden utilizarse reactivos que reducen la desnaturalización no específica o de fondo o que mejoran de otra manera la eficacia del ensayo, tales como inhibidores de proteasas, inhibidores de nucleasas, agentes antimicrobianos, proteínas de unión a ADN de cadena única, etc.
La presente invención puede entenderse mejor por referencia a los Ejemplos siguientes no limitantes, que se proporcionan a modo ejemplar de la invención.
Ejemplos Técnicas generales de biología molecular
Los métodos utilizados tradicionalmente en biología molecular, tales como extracciones preparativas de ADN plasmídico, centrifugación de ADN plasmídico en un gradiente de cloruro de cesio, electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, purificación de fragmentos de ADN mediante electroelución, extracción de proteínas con fenol o fenol/cloroformo, precipitación de ADN con etanol o isopropanol en un medio salino, transformación en Escherichia coli, y semejantes, son muy conocidos para un experto en la técnica y están descritos ampliamente en la bibliografía [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; (2^{a} Ed. 1989); Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nueva York, 1987).
Los vehículos de clonación convencionales incluyen plásmidos del tipo pBR322 y pUC y fagos de la serie M13. Éstos pueden obtenerse comercialmente (Bethesda Research Laboratories o New England Biolabs).
Para la ligación, los fragmentos de ADN pueden separarse según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, extraerse con fenol o con una mezcla de fenol/cloroformo, precipitarse con etanol y después incubarse en presencia de la ligasa de ADN del fago T4 (Biolabs) según las recomendaciones del distribuidor.
El relleno de los extremos 5' protuberantes puede llevarse a cabo con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli (Biolabs) según las especificaciones del distribuidor. La destrucción de los extremos 3' protuberantes se lleva a cabo en presencia de la ADN polimerasa del fago T4 (Biolabs) utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' protuberantes se lleva a cabo mediante un tratamiento controlado con la nucleasa S1.
Puede llevarse a cabo mutagénesis dirigida in vitro mediante oligodesoxinucleótidos sintéticos según el método desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] utilizando el kit distribuido por Amersham.
Puede llevarse a cabo la amplificación enzimática de los fragmentos de ADN mediante la técnica de PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction (Reacción en Cadena catalizada por la Polimerasa), Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. y Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] utilizando un "ciclador térmico de ADN" (Perkin Elmer Cetus) según las especificaciones del fabricante.
La verificación de las secuencias de los nucleótidos puede llevarse a cabo mediante el método desarrollado por Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] utilizando el kit distribuido por Amersham.
Los ADN plasmídicos pueden purificarse mediante el Sistema de Purificación de Plásmidos Qiagen según las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 1
Ensayo de helicasa tradicional
Un oligonucleótido de 60 pb (5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3’; SEQ ID NO:1) se marca con ^{32}P utilizando la polinucleótido quinasa de T4 y después se hibrida con un oligonucleótido complementario de 60 pb sin marcar. Se mezclaron el sustrato hibridado y diferentes cantidades de helicasa DnaB [Reha-Krantz et al. J. Biol. Chem. 253 (1978) 4043-4050; LeBowitz et al. J. Biol. Chem. 261 (1986) 4738-4748] en tampón de ensayo (400 mM Hepes pH 7,4, 5 mM DTT, 2 mg/ml BSA, 12,5 mM MgCl_{2}, y 6,25 mM ATP) y se incubaron a 37ºC durante 30 min. La reacción se paró mediante la adición de 0,5 M EDTA y después se añadieron 2,5 mg de Proteinasa K a cada reacción para liberar cualquier oligonucleótido que permanece unido a la helicasa DnaB. Después, las muestras se corrieron en un gel TBE al 15%. Las cadenas de ADN únicas y dobles se diferenciaron mediante autorradiografía.
Utilizando el ensayo de helicasa tradicional, la DnaB de E.coli fue capaz de deshibridar sustratos dúplex para rendir cadenas únicas de ADN (Figura 1). Sin embargo, para liberar ADN de cadena única de los ADN dúplex mediante este método, se requieren al menos 0,75 ug de DnaB para desenrollar completamente 175 fmoles de sustratos con ADN dúplex. Por lo tanto, este método es largo y la sensibilidad es baja.
Ejemplo 2
Ensayo enzimático de helicasa mediante el Ensayo de Centelleo [^{3}H] por Proximidad (SPA)
El Ensayo de Centelleo por Proximidad (SPA) está descrito en la Figura 2. Este ensayo utiliza un oligonucleótido marcado con ^{3}H que está hibridado con un ADN de cadena única de M13 (ADNss de M13). Como resultado de la actividad helicasa, el oligonucleótido marcado con ^{3}H se deshibrida del ADNss de M13. El oligonucleótido liberado puede entonces hibridarse con un segundo oligonucleótido biotinilado. Este complejo se captura mediante perlas SPA recubiertas con estreptavidina. Debido a su gran proximidad a las perlas SPA, el complejo es capaz de estimular el centelleo en las perlas, lo que resulta en un incremento de la señal. Los oligonucleótidos marcados que permanecen unidos a la disolución de ADNss de M13 libre no estimulan el centelleo.
Se obtuvo un kit de ensayo de helicasa mediante SPA de Amersham Life Science. El ensayo se llevó a cabo según las instrucciones proporcionadas con pequeñas modificaciones tal como se describe más adelante. Se hibrida un oligonucleótido marcado con [^{3}H] con un ADN de M13 de cadena única (ADNss de M13) para formar sustratos dúplex parciales. La helicasa DnaB y los sustratos dúplex se mezclaron en el tampón de ensayo y se incubaron a 37ºC durante 45 min. La reacción se para con la adición de EDTA. Después, se hibrida un oligonucleótido biotinilado complementario con el oligonucleótido marcado radiactivamente liberado del ADNss de M13. El complejo se captura mediante perlas SPA recubiertas con estreptavidina por incubación a temperatura ambiente durante 15 min, y se cuenta la señal radiactiva.
La titulación de la helicasa DnaB (Figura 3) indica que la actividad óptima puede obtenerse utilizando 0,16 µg de helicasa DnaB. La actividad helicasa disminuye cuando se utilizan menos de 0,16 \mug de DnaB, lo que sugiere que no hay suficiente helicasa como para desenrollar los ADN dúplex. Sin embargo, cuando se utilizan más de 0,16 \mug de helicasa DnaB en cada reacción, la actividad helicasa también disminuye. Esto puede ser el resultado de la unión no específica del exceso de helicasa a ADN de cadena única liberado de los sustratos con ADN dúplex, impidiendo de esta manera al oligonucleótido complementario biotinilado unirse a estos productos con ADN de cadena única. Bajo las condiciones óptimas del ensayo, la mejor relación señal a ruido es aproximadamente 10 veces (véase la Figura 4). La actividad helicasa de DnaB es el 95% de la actividad máxima posible, tal y como se determina mediante la señal generada a partir de productos liberados de sustratos con ADN dúplex hervidos y desnaturalizados. Aunque este método es rápido y ofrece la posibilidad de evaluar un gran número de muestras, es desventajoso debido a los altos costes y a la generación de desechos radiactivos significativos.
Ejemplo 3
Ensayo de helicasa por desactivación de la fluorescencia
Se ha estudiado un ensayo de desactivación de la fluorescencia (Figura 5). En este ensayo están presentes sondas marcadas con Europio y Rodamina como un dúplex con la fluorescencia desactivada. Después de la adición de una helicasa, los sustratos con ADN dúplex se deshibridan para rendir dos cadenas únicas de ADN. Los oligonucleótidos marcados con Europio Lance liberados a partir de los sustratos dúplex dan lugar a señales de fluorescencia en tiempo resuelto.
Se marcó un oligonucleótido de 60 pb (5'-GT GAC GAT CCC GCA AAA GCG GCC TTT AAC TCC CTG CAA GCC TCA GCG ACC GAA TAT ATC G-3'; SEQ ID NO:2) con Europio Lance en su extremo 5'. Un oligonucleótido (5'-T TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC CA-3'; La SEQ ID NO: 3) con una región complementaria a la SEQ ID NO:2 se marcó con Rodamina en su extremo 5'. Estas sondas marcadas con Eu y Rh se mezclaron en una proporción de 1:2 y se hibridaron para formar sustratos en forma de Y. En el tampón de ensayo se mezclaron diferentes cantidades de helicasa DnaB y 50 fmoles de los sustratos marcados con fluorescencia y se incubaron a 37ºC durante 45 min. La reacción se para mediante la adición de EDTA. Se registraron las señales de fluorescencia generadas por los Eu-oligonucleótidos liberados a partir de los sustratos con ADN dúplex.
La titulación de la helicasa DnaB (Figura 6) indica que la actividad máxima requiere al menos 1,25 \mug de helicasa DnaB, y que la señal respecto al ruido es aproximadamente 4 veces. Conjuntamente, estos resultados muestran que la sensibilidad de este método es baja.
Ejemplo 4
Ensayo de helicasa por electroquimioluminiscencia
En la Figura 7 se muestra un ensayo de helicasa por electroquimioluminiscencia (ECL). Se marcan oligonucleótidos cortos con un quelato metálico de Rutenio y se hibridan con ADN de cadena única de M13. Después de la adición de la helicasa, los oligonucleótidos marcados se liberan a partir de los ADN dúplex, y están disponibles para hibridarse con un segundo oligonucleótido complementario marcado con biotina. Los complejos resultantes se capturan mediante perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. La perla/complejo se canaliza a través de una célula de flujo y se captura en un electrodo mediante un campo magnético. Se aplica voltaje al electrodo y se determinan las señales de ECL generadas a partir de los marcadores de Rutenio utilizando un detector de electroquimioluminiscencia, tal como un Analizador Origen (IGEN Inc., Rockville, MD).
Un oligonucleótido de 60 pb (5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3'; SEQ ID NO: 4) o un oligonucleótido de 30 pb (5'-GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3'; SEQ ID NO:5) se marca con rutenio en el extremo 5' (Kenten et al., Clin. Chem. 38 (1992) 873-879), y se resuspende en tampón TE (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH=7,4) hasta una concentración madre final de 25 pmoles/\muL. Se disuelve ADNss de M13mp18 en TE a una concentración de 0,183 pmoles/mL. Se mezclan concentraciones iguales de ADNss de M13mp18 y oligonucleótidos en tampón de hibridación (10 mM Tris HCl, 0,3 M NaCl, 30 mM Na Citrato, pH 8,5). Después, la disolución se incuba a 100ºC durante 2 minutos, y se enfría hasta temperatura ambiente. Se mezclan veinticinco fmoles de sustratos dúplex (ADNss de M13 hibridado con el oligonucleótido 30 ó 60) con 25ng de helicasa DnaB de E. coli en tampón de ensayo (40 mM Hepes pH 7,4, 0,5 mM DTT, 0,2 mg/ml BSA, 8 mM MgCl_{2}, 5 mM ATP). La mezcla de reacción se incuba a 37ºC durante 45 minutos. A esta reacción se añaden 125 fmoles de un oligonucleótido biotinilado (5'-GGT GAC GAT CCC GCA AAA GCG GCC TTT AAC AGC-3'; SEQ ID NO:6) complementario a las SEQ ID NOS: 4 y 5 en 0,5 M EDTA, y la reacción se incuba a 37ºC durante 15 minutos. La biotinilación se lleva a cabo utilizando el Kit Biotin-ON^{TM} Fosforamidato de Clontech (PT1402-1) utilizando el procedimiento proporcionado con el kit. La adenina de la posición 31 en la SEQ ID NO:6 recibió la marca de biotina. Finalmente, se añaden 20 \mug de perlas magnéticas con estreptavidina en un volumen total de 0,25 ml de tampón TE, y la disolución se incuba durante 15 minutos mientras se agita. La señal de ECL se registra utilizando un Analizador Origen (IGEN Inc., Rockville, MD) utilizando las condiciones sugeridas por el fabricante.
Los datos de la titulación de la helicasa DnaB indican que sólo se requieren 25ng de enzima para deshibridar 25 fmoles de sustratos dúplex, y que la relación señal a ruido es aproximadamente 30 veces (véase la Figura 8). Los experimentos adicionales demuestran que, en general, la relación señal a ruido es al menos 30 veces, y tan alta como 40 veces. Este método de detección muestra una sensibilidad y reproducibilidad significativas si se compara con todos los métodos descritos previamente (véase la Tabla 1).
TABLA 1 Resumen de los ensayos SPA, Desactivación de la Fluorescencia y ECL
Reactivo Requerido
Sensibilidad Sustrato Helicasa Sensibilidad
Ensayo Detección (S/N) (fmol) (ug) Disminuida^{a}
SPA Radiactividad \sim10 50 0,16 \sim19
Desactivación Fluorescencia \sim4 50 1,25 \sim375
ECL Luminiscencia \sim30 25 0,025
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Respecto a ECL. Calculada multiplicando la sensibilidad incrementada (S/N) por la cantidad disminuida necesaria de helicasa \end{minipage}
La sensibilidad del ensayo de electroquimioluminiscencia es al menos 7 veces mayor que la del ensayo de desactivación de la fluorescencia y 3 veces mayor que la del ensayo SPA. En resumen, la sensibilidad es aproximadamente 18 veces mejor que la del ensayo SPA, y aún mayor cuando se compara con el ensayo de fluorescencia. La cantidad de enzima necesaria para la detección por electroquimioluminiscencia disminuye 6 veces respecto al ensayo SPA y 50 veces respecto al ensayo de desactivación. Los sustratos utilizados en el ensayo de electroquimioluminiscencia se reducen 2 veces si se compara con los ensayos SPA y de desactivación. El ensayo de electroquimioluminiscencia permite una detección de la actividad helicasa rápida y sensible, y puede formatearse fácilmente para un rastreo con un rendimiento alto. El método es genérico y es adecuado para cualquier enzima que tenga actividad helicasa.
<110> Zhang, Litao
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Harrison, Richard K. 
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<120> ENSAYO DE HELICASA POR ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA
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<130> A3617-EEUU
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<140>
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<141>
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<160> 6
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido utilizado en el ensayo tradicional de helicasa
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<400> 1
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tttttttttt tttttttttt ttttttttt gttaaaggcc gcttttgcgg gatcgtcacc 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido utilizado en el ensayo de helicasa por desactivación de la fluorescencia
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ggtgacgatc ccgcaaaagc ggcctttaac agc 
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33 
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Claims (23)

1. Un método de ensayo electroquimioluminiscente para detectar actividad helicasa en una muestra, método que comprende
(a)
combinar la muestra con un primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que comprende un marcador electroquimioluminiscente e hibridado con un segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria;
(b)
incubar la muestra y los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos hibridados de la etapa (a) bajo condiciones en las que la helicasa presente en la muestra pueda deshibridar el primer y segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico;
(c)
capturar el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin hibridar; y
(d)
medir la electroquimioluminiscencia del primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico capturada.
2. El ensayo electroquimioluminiscente según la reivindicación 1, en el que la helicasa es una helicasa humana o patógena.
3. El ensayo electroquimioluminiscente según la reivindicación 2, en el que la helicasa patógena es una helicasa fúngica, viral, bacteriana o parasítica.
4. El ensayo electroquimioluminiscente según la reivindicación 1, que comprende entre las etapas (b) y (c),
(i)
incubar los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos sin hibridar con un tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria al primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico y que comprende un ligando de captura, bajo condiciones en las que el primer y tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico puedan hibridar; e
(ii)
incubar el primer y tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico hibridados de la etapa (i) con un receptor de captura que une el ligando de captura.
5. El ensayo electroquimioluminiscente según la reivindicación 4, en el que el ligando de captura es biotina y el receptor de captura es avidina.
6. El ensayo electroquimioluminiscente según la reivindicación 4, en el que el receptor de captura está en la superficie de perlas magnéticas.
7. El ensayo electroquimioluminiscente según la reivindicación 6, en el que el ligando de captura es biotina y el receptor de captura es avidina.
8. El ensayo electroquimioluminiscente según la reivindicación 1, en el que el marcador electroquimioluminiscente es un quelato de rutenio.
9. Un método para detectar en una muestra un agente que modula la actividad helicasa, método que comprende
(a)
combinar la muestra, una helicasa y un primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que comprende un marcador electroquimioluminiscente e hibridado con un segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria, formando de esta manera una mezcla;
(b)
incubar la mezcla de la etapa (a) bajo condiciones en las que la helicasa pueda deshibridar el primer y segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico en ausencia de la muestra;
(c)
capturar el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico sin hibridar; y
(d)
medir la electroquimioluminiscencia del primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico capturada.
10. El método según la reivindicación 9, en el que el agente es un inhibidor de la actividad helicasa.
11. El método según la reivindicación 9, en el que la helicasa es una helicasa humana o patógena.
12. El método según la reivindicación 11, en el que la helicasa patógena es una helicasa fúngica, viral, bacteriana o parasítica.
13. El método según la reivindicación 9, que comprende entre las etapas (b) y (c),
(i)
incubar los ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos sin hibridar con un tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria al primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico y que comprende un ligando de captura, bajo condiciones en las que el primer y tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico puedan hibridar; e
(ii)
incubar el primer y tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico hibridados de la etapa (i) con un receptor de captura que une el ligando de captura.
14. El método según la reivindicación 13, en el que el ligando de captura es biotina y el receptor de captura es avidina.
15. El método según la reivindicación 13, en el que el receptor de captura está en la superficie de perlas magnéticas.
16. El método según la reivindicación 15, en el que el ligando de captura es biotina y el receptor de captura es avidina.
17. El método según la reivindicación 9, en el que el marcador electroquimioluminiscente es un quelato de rutenio.
18. Un kit para la detección electroquimioluminiscente de actividad helicasa que comprende
(a)
un primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que comprende un marcador electroquimioluminiscente;
(b)
un segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria al primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico;
(c)
una helicasa.
19. El kit según la reivindicación 18, en el que el primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico está hibridado con el segundo ácido nucleico o molécula de ácido nucleico.
20. El kit según la reivindicación 18, que comprende además un tercer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico complementaria al primer ácido nucleico o molécula de ácido nucleico y que comprende un ligando de captura.
21. El kit según la reivindicación 20, que comprende además un receptor de captura.
22. El kit según la reivindicación 21, en el que el receptor de captura está en la superficie de perlas magnéticas.
23. El kit según la reivindicación 22, en el que el ligando de captura es biotina y el receptor de captura es avidina.
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