ES2268178T3 - Cuantificacion de la actividad de una proteina quinasa individual. - Google Patents

Cuantificacion de la actividad de una proteina quinasa individual. Download PDF

Info

Publication number
ES2268178T3
ES2268178T3 ES03003524T ES03003524T ES2268178T3 ES 2268178 T3 ES2268178 T3 ES 2268178T3 ES 03003524 T ES03003524 T ES 03003524T ES 03003524 T ES03003524 T ES 03003524T ES 2268178 T3 ES2268178 T3 ES 2268178T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
peptide
protein kinase
substrate
activity
peptide substrate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES03003524T
Other languages
English (en)
Inventor
Said Goueli
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Promega Corp
Original Assignee
Promega Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Promega Corp filed Critical Promega Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2268178T3 publication Critical patent/ES2268178T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Un método de determinar la presencia o actividad de una proteína-quinasa seleccionada, que comprende: a. proporcionar un substrato peptídico que tenga un resto de unión conjugado al mismo; b. añadir una cantidad suficiente del sustrato peptídico de la etapa (a) a una disolución que contiene la proteína-quinasa seleccionada; c. incubar de la proteína-quinasa con el sustrato peptídico bajo condiciones en las que la proteína-quinasa seleccionada es activa durante un tiempo suficiente para formar un producto peptídico fosforilado; d. unir el substrato peptídico y el producto peptídico a una matriz de unión específicamente reactiva con el resto de unión, en donde la matriz tiene suficiente capacidad de unión y especificidad para el resto de unión para capturar esencialmente todo el substrato peptídico y el producto peptídico procedente de la disolución; y e. medir de la cantidad de producto peptídico.

Description

Cuantificación de la actividad de una proteína quinasa individual.
Campo de la invención
La invención se dirige a un proceso para proporcionar un protocolo de ensayo que mida la actividad enzimática. Más particularmente, la invención se dirige a un proceso para cuantificar de manera precisa y conveniente la actividad enzimática de proteína-quinasas y además, proporcionar un ensayo específico para proteína-quinasas individuales en presencia de otras proteína-quinasas.
Referencias citadas
Una bibliografía de las referencias citadas en esta aplicación se puede encontrar en la sección que precede a las reivindicaciones.
Descripción de la técnica anterior
Las enzimas son grandes proteínas que catalizan las reacciones en las células vivas. Las enzimas construyen o destruyen otras moléculas. Por ejemplo, las enzimas catalizan la síntesis de grasas a partir de ácidos grasos, forman azúcares complejos a partir de glucosa y fructosa, y ayudan en la formación de otras proteínas a partir de aminoácidos. Las enzimas también invierten el proceso de construcción mediante la ruptura de estructuras más complejas. Las enzimas son generalmente específicas a ciertos sustratos para sus reacciones. Por ejemplo, una enzima individual puede catalizar la reacción en donde sólo está involucrado un sustrato o puede actuar sobre un grupo de sustratos relacionados.
En personas sanas, la mayoría de las enzimas se encuentran dentro de las células. Sin embargo, algunas enfermedades producen la liberación de las enzimas desde las células muertas a la sangre. Entonces se pueden medir los niveles elevados de las enzimas. Un nivel anormal de enzimas en la sangre caracteriza ciertas condiciones médicas. Por ejemplo, un ensayo de enzima para niveles anormales de la enzima de creatina-quinasa en la sangre es apto como un medio de diagnóstico de enfermedad cardiaca. De manera semejante, enfermedades del hígado o de huesos se pueden diagnosticar al observar el incremento de los niveles de la fosfatasa alcalina en el torrente sanguíneo. El cáncer de próstata se diagnostica mediante los niveles elevados de fosfatasa ácida en el torrente sanguíneo.
Las enzimas se clasifican en grupos según el tipo general de reacción que catalizan. La presente invención se refiere a un grupo específico de enzimas denominadas transferasas, que catalizan la transferencia de un grupo desde un sustrato a otro. La presente invención está específicamente dirigida al subgrupo de las transferasas denominado proteína-quinasas.
La proteína-quinasa es un nombre genérico para todas las enzimas que transfieren un grupo fosfato a una proteína. Aproximadamente de tres a cuatro por ciento del genoma humano contiene información de transcripción para la formación de proteína-quinasa. En la actualidad, existen hasta 200 proteína-quinasas conocidas. Sin embargo, debido a que tres a cuatro por ciento del genoma humano es un código para la formación de proteína-quinasas, pueden existir varios miles de quinasas distintas y separadas en el cuerpo humano.
Las proteína-quinasas son enzimas que catalizan la transferencia del fósforo desde el trifosfato de adenosina (ATP, del inglés Adenosine Triphosphate) o el trifosfato de guanosina (GTP, del inglés Guanosine Triphospate) a una proteína objetivo para producir una proteína fosforilada y difosfato de adenosina (ADP, del inglés Adenosine Diphosphate) o difosfato de guanosina (GDP, del inglés Guanosine Diphosphate), respectivamente. ATP o GTP se hidroliza en primer lugar para formar ADP o GDP y fosfato inorgánico. El fosfato inorgánico se une entonces a la proteína objetivo. El sustrato de proteína que es objetivo de la quinasa puede ser una proteína estructural, localizada en el material de la membrana tal como una pared celular, u otra enzima que sea una proteína funcional.
Debido a su relevancia fisiológica, variedad y omnipresencia, las proteína-quinasas han llegado a ser una de las familias de enzimas más importantes y más ampliamente estudiadas en la investigación médica y bioquímica. Los estudios han mostrado que las proteína-quinasas son reguladores claves de muchas funciones celulares, incluyendo la transducción de señales, la regulación transcripcional, el mecanismo de la célula y la división celular. También se ha mostrado que varios oncogenes codifican las proteína-quinasas, sugiriendo que las quinasas juegan un papel en la oncogénesis.
Las proteína-quinasas a menudo se dividen en dos grupos en base a los residuos de aminoácidos que fosforilan. El primer grupo, denominado serina/treonina-quinasas, incluye las proteína-quinasas dependientes de la AMP cíclica y de la GMP cíclica, la proteína-quinasa dependiente de calcio y de fosfolípido, las proteína-quinasas dependientes de calcio y de la calmodulina, las caseína-quinasas, las proteína-quinasas del ciclo de la de división celular y otras. Estas quinasas son normalmente citoplasmáticas o asociadas con fracciones particulares de las células, posiblemente mediante proteínas de anclaje.
\newpage
El segundo grupo de quinasas, denominadas tirosina-quinasas son residuos de tirosina fosforilada. Están presentes en cantidades mucho menores pero juegan un papel igual de importante en la regulación de la célula. Estas quinasas incluyen varios receptores para moléculas tales como factores del crecimiento y hormonas, que incluyen el receptor del factor del crecimiento epidérmico, el receptor de la insulina, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y otros. Los estudios han indicado que muchas de las tirosina-quinasas son proteínas de transmembrana con sus dominios de receptores situados en el lado exterior de la célula y sus dominios de quinasa en el interior.
La fosforilación de las proteínas que contienen serina, treonina y tirosina por las quinasas es importante porque los productos de proteínas fosforiladas han sido implicados en una variedad de procesos celulares, que incluyen oncogénesis, transformación celular, crecimiento celular y exocitosis celular. En la actualidad, se desarrolla mucha experimentación involucrando a las quinasas que pueden inhibir el crecimiento del cáncer o promover la muerte de la célula cancerosa. Determinar la quinasa específica involucrada en inhibir del crecimiento del cáncer o en promocionar la muerte de la célula es importante para la sociedad. De este modo, son extremadamente importantes los avances en reconocer los niveles de la actividad de la quinasa.
Determinación de la actividad
Se hace una referencia a Robyt and White (1990) incorporado en la presente invención por referencia, para una descripción general de los métodos para determinar la actividad de una enzima. Robit y White definen la actividad de una enzima como la cantidad de reacción que una cierta cantidad de enzima producirá en un periodo específico de tiempo. La actividad se determina midiendo de la cantidad de producto producido o de la cantidad de sustrato usado por unidad de tiempo bajo condiciones de saturación o elevadas concentraciones del sustrato. Esto se lleva a cabo normalmente desarrollando un análisis químico del producto o del sustrato.
Los sustratos que son normalmente utilizados en un ensayo para la actividad de la quinasa específica incluyen caseina, que se aísla de la leche; histonas, aisladas de los terneros; fosfovitina, aislada de las yemas de huevo; y proteínas básicas de mielina, aisladas de médulas espinales de bovino. Estos sustratos se pueden fosforilar en un ensayo, suponiendo que se ha elegido la quinasa correcta. Los ensayos que utilizan estos sustratos para determinar la actividad de la quinasa son bien conocidos en la técnica anterior.
Detección Radiactiva de la Actividad de la Quinasa
La mayoría de los métodos actuales de medir la actividad de la proteína-quinasa se basan en el método de detección radiactiva. En estos métodos, una muestra que contiene la quinasa de interés se incuba con activadores y un sustrato en presencia de \tau-^{32}P-ATP o \tau-^{32}P-GTP. A menudo, se usa un sustrato general y barato tal como histona o caseina. Después de un periodo adecuado de incubación, se detiene la reacción y se coloca directamente una alícuota de la mezcla de reacción sobre un filtro que une el sustrato. Entonces el filtro se lava varias veces para eliminar el exceso de ATP libre marcado radiactivamente, y se mide la cantidad de fosfato radio marcado incorporado al sustrato mediante un contador de destellos. Este método se usa ampliamente y proporciona un método preciso para determinar la actividad de la proteína-quinasa en muestras purificadas y en bruto.
Badcook et al. (1991) también describe un ensayo que usa anticuerpos monoclonales y la tecnología de la inmunofluorescencia para la determinación de las actividades de la tirosina proteína-quinasa y de la fosfatasa de la tirosina proteína. El método se desarrollaba utilizando p56^{kk} o p60.
Budde et al. (1991) describe una técnica de ensayo que utiliza sustratos de peptídicos ácidos de proteína-quinasas. Esta tecnología usa el fósforo radiactivo colocado en el sustrato que va a ser estudiado. Después de la actividad de la quinasa, el fosfopéptido se lava mientras que se fijan el fósforo radiactivo individual, la ATP y la proteína.
Gopalakrishna et al. (1992) describe un método que utiliza los enfoques convencionales para medir la actividad de la proteína-quinasa. El método combina las etapas de incubación y filtraciones necesarias para determinar la actividad de la proteína-quinasa usando placas multilaminares con discos de filtración ajustados. En una referencia relacionada por Chakravarthy et al. (1990), la actividad de la quinasa C se mide usando sustratos peptídicos selectivos de la proteína-quinasa C (PKC) incorporando fósforo radiactivo al sustrato. La radiactividad se mide mediante un contador de destellos en fase líquida.
Determinación no Radiactiva de la Actividad de la Quinasa
Se ha desarrollado un método no radiactivo para detectar la actividad de la quinasa en el que la fosforilación de la tirosina se detecta usando anticuerpos de anti-fosfotirosina (Rijksen et al., 1991). Después de la incubación de la tirosina-quinasa con ATP no marcado y un sustrato adecuado, la mezcla de reacción se somete a un ensayo de transferencia de manchas (dot blot) sobre una membrana de difluoruro de polivinildieno (PVDF, del inglés polyvinyldene Diflouride). El alcance de la fosforilación se determina por reacción con el anticuerpo de anti-fosfotirosina, seguido de detección con un procedimiento de coloración de inmunogold. La cantidad de fosfotirosina presente se detecta con un densitómetro.
Una desventaja del método de transferencia de manchas (dot blot) es que está limitado para detectar las tirosina-quinasas. Los anticuerpos fosfotirosina se pueden producir debido al tamaño del antígeno. Los intentos para producir anticuerpos similares a la fosfoserina y fosfotreonina no han sido empleados de manera exitosa para ensayar proteínas que contiene fosfoserina y fosfotreonina. Además, el ensayo requiere varias etapas de incubación y lavado, tomando cada una de ellas una considerable cantidad de tiempo, lo que da como resultado un tiempo de realización del ensayo muy extenso. El resultado del ensayo es un punto coloreado sobre la superficie de transferencia. El punto coloreado puede limitar la eficacia del intervalo de la muestra del ensayo y puede requerir al usuario que cuantifique los resultados finales usando un densitómetro de barrido, que es un componente caro del equipo y que no está disponible en todos los laboratorios. El densitómetro debe tener un haz de dimensiones que cubra al menos la sección transversal del blanco de los puntos generados.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un método de determinar la presencia de la actividad de una proteína-quinasa seleccionada, que comprende conjugar un compuesto de unión a un sustrato peptídico formando un sustrato peptídico modificado; añadir una suficiente cantidad del sustrato peptídico modificado a una disolución que contiene la proteína-quinasa seleccionada; incubar de la proteína-quinasa con el sustrato peptídico modificado bajo condiciones en las que la proteína-quinasa es activa durante un tiempo suficiente para formar un producto peptídico modificado; y medir la actividad de la proteína-quinasa.
Además, la presente invención está dirigida a un kit para determinar la presencia o actividad de una proteína-quinasa seleccionada que comprende un recipiente que contiene un sustrato peptídico modificado que tiene una reactividad específica para la proteína-quinasa y se modifica mediante reacción química para permitir la cuantificación; e instrucciones para su uso.
La presente invención también está dirigida a un kit para determinar la presencia o actividad de tirosina-quinasa que comprende un recipiente que contiene un sustrato peptídico modificado elegido del grupo que consiste en péptido Promega G biotinilado (SEQ. ID. 7) y análogos y sus combinaciones; un recipiente que contiene una matriz de unión de biotina; e instrucciones para su uso.
La presente invención también está dirigida a un kit para determinar la presencia o actividad de serina-treonina-quinasas que comprende un recipiente que a su vez contiene un sustrato peptídico modificado elegido del grupo que consiste en péptido Promega A biotinilado (SEQ. ID. 1), péptido Promega B biotinilado (SEQ. ID. 2), péptido Promega C biotinilado (SEQ. ID. 3), péptido Promega D biotinilado (SEQ. ID. 4), péptido Promega E biotinilado (SEQ. ID. 5), péptido Promega F biotinilado (SEQ. ID. 6), péptido Promega G biotinilado (SEQ. ID. 7), péptido Promega H biotinilado (SEQ. ID. 8) y análogos y sus combinaciones; un recipiente que contiene una matriz de unión de biotina; e instrucciones para su uso.
Además, la presente invención está dirigida a un método para detectar la presencia o actividad de una proteína-quinasa seleccionada en un fluido corporal que comprende hacer reaccionar el fluido corporal con una cantidad suficiente de un sustrato peptídico biotinilado para formar un producto peptídico modificado bajo condiciones en las que la proteína-quinasa es activa durante un tiempo suficiente para formar el producto peptídico modificado en una cantidad tal que el producto peptídico modificado se puede detectar y medir la cantidad de producto peptídico modificado.
La presente invención hace posible un ensayo para una proteína-quinasa específica en presencia de otras proteína-quinasas en un extracto de tejido. Este tipo de ensayo es altamente deseable para los investigadores debido a que no se requiere la purificación de la proteína-quinasa específica objeto de estudio. De manera convencional, se requiere la purificación en el extracto para eliminar otras proteína-quinasas. Esta opción de larga duración se puede evitar usando la opción del sustrato peptídico biotinilado específico.
Además, se ayuda al investigador en determinar la expresión del nivel de la quinasa específica bajo varias condiciones fisiológicas con mínimas pérdidas en enzima, ya que se obvia la etapa de purificación. Esto significa que la actividad ensayada es una estimación precisa de la actividad total de la enzima estudiada.
Los sustratos peptídicos para varias proteína-quinasa tales como las proteína-quinasa dependientes de cAMP (PKA), las proteína-quinasas dependientes de cGMP (PKG), las proteína-quinasas dependientes de Ca^{2+}/fosfolípidos (PKC), las caseína-quinasas 1 y 2 (CK-1 y CK-2), los receptores del factor del crecimiento, los receptores del factor del no-crecimiento y las proteínas solubles que contienen una tirosina-quinasa activa, la proteína-quinasa dependiente del ciclo celular (proteína-quinasa p34cdc2), la proteína-quinasa S6, las proteína-quinasas multifuncionales (CAM) o dependientes de Ca^{2+}/calmodulina, la proteína-quinasa dependiente del ADN, y las quinasas de dominio terminal carboxilo (CDT) son sintetizadas de manera acostumbrada usando un protocolo de síntesis de péptidos que incorpora un aminoácido biotinilado en el N-terminal del péptido. De este modo, existen varias proteína-quinasas que se pueden ensayar mediante el presente procedimiento proporcionando la capacidad para hacer varios kits para su uso con varias proteína-quinasas.
El ensayo es muy rápido y normalmente se puede completar en menos de 10 minutos después de la finalización de la reacción. Esto es muy importante ya que los protocolos actuales requieren aproximadamente 2 horas para obtener los mismos objetivos.
\newpage
No se requiere equipo especial, más que el equipo estándar que está en la actualidad disponible en la mayoría de los laboratorios. El procedimiento no requiere disolventes orgánicos o inorgánicos especiales, tales como ácido fosfórico, ácido acético, acetona o etanol, encontrados en los protocolos de la técnica anterior.
La presente invención es susceptible de ser adaptada a un ensayo a gran escala que puede ser demandado por los grandes laboratorios o laboratorios farmacéuticos ocupados en la investigación de fármacos.
El coste de la presente invención es similar al coste de los ensayos de la técnica anterior. El incremento de coste previsto de avidina y del reactivo de biotinilante se puede compensar por la eliminación de los caros disolventes requeridos en otros ensayos.
Además, la presente invención elimina la necesidad del uso de un sistema de ensayo que requiere la electroforesis del gel para separar el péptido exógeno del sustrato endógeno. La electroforesis del gel separa las diferentes formas mono- y fosforiladas del sustrato que pueden ser útiles. Sin embargo, este método además complica la cuantificación de la transferencia de fosfato total.
A menudo se encuentran problemas al utilizar el ensayo de papel de unión de filtro de la técnica previa para unir fuertemente las moléculas positivas que están presentes en el extracto celular del tejido y que están fosforiladas. La presente invención solventa los problemas debido a que sólo se unen el sustrato y el producto ya que son los únicos componentes que están biotinilados.
La presente invención elimina la necesidad de cambiar la estructura primaria de la secuencia de consenso, que es el objetivo de la secuencia del aminoácido primario de la enzima que es analizada, mediante la adición adicional de residuos de arginina para mantener las secuencia primaria para la enzima que está presente in vivo. Los ensayos de la técnica anterior que utilizan un filtro de unión requerían que los sustratos contengan múltiples residuos de arginina lo que puede alterar la especificidad del sustrato de modo que el sustrato puede llegar a ser apto para otra quinasa. Un ejemplo de esta alteración está dada por la secuencia Arg-Arg-Arg-Tyr-Ser (una clave para las abreviaciones de los aminoácidos se encuentra en la Tabla 1) que está presente en el sustrato peptídico de CDT-quinasa Arg-Arg-Arg (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-pro-Ser)_{4} que podría ser reconocido por una proteína-quinasa dependiente de cAMP y otras quinasas que reconozcan esta secuencia.
La presente invención produce resultados con una elevada probabilidad de exactitud ya que virtualmente todas las moléculas peptídicas fosforiladas son capturadas por la matriz de unión fuerte revestida de avidina o estreptavidina. Por el contrario, las proteínas fosforiladas depositadas sobre el papel de fosfocelulosa se unen mediante una interacción electrostática que no es fuerte. De este modo, durante el proceso de lavado tienen lugar pérdidas de péptidos fosforilados.
Ahora se hace referencia en detalle a las realizaciones preferidas de la invención, los ejemplos de las mismas se ilustran en las figuras que se acompañan.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 es un gráfico que ilustra el efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad de la quinasa de PKA usando un sustrato Kemptido modificado. El péptido estaba presente a 100 \muM, y la enzima se analizó según se describe en el ejemplo 1.
La Fig. 2 es un gráfico que ilustra el efecto del incremento de la concentración del sustrato Kemptido biotinilado sobre la actividad de la proteína-quinasa de PKA. Dos unidades de Kemptido de PKA estaban presentes en la reacción. Los componentes remanentes de la reacción estaban presentes como se describen en el ejemplo 1.
La Fig. 3 es un gráfico que ilustra el análisis de la cinética del PKA con Kemptido como un sustrato a 2 unidades por reacción como se describe en el ejemplo 1.
La Fig. 4 es un gráfico que ilustra el efecto del inhibidor del péptido de PKA sobre su actividad de la proteína-quinasa como se describe en el ejemplo 1.
La Fig. 5 es un gráfico que ilustra la actividad de la proteína-quinasa de PKA en varios tejidos de rata como se describe en el ejemplo 2.
La Fig. 6 es un gráfico que ilustra el efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad de la quinasa de PKA usando la neurogranina _{(28-43)} biotinilada como sustrato tal como se describe en el ejemplo 3.
La Fig. 7 es un gráfico que ilustra el efecto del incremento de la concentración del sustrato de neurogranina _{(28-43)} biotinilada sobre la actividad de la proteína-quinasa de PKC como se describe en el ejemplo 3.
La Fig. 8 es un gráfico que ilustra el efecto del inhibidor de PKC sobre la actividad de PKC que usa la neurogra-
nina _{(28-43)} biotinilada como un sustrato como se describe en el ejemplo 3.
La Fig. 9 es una gráfico que ilustra el efecto de la actividad de la proteína-quinasa de PKC en el extracto de cerebro de rata y de una PKC particularmente pura como se describe en el ejemplo 4.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Para los propósitos de la presente invención, se aplican las siguientes definiciones:
Actividad de una enzima: La cantidad de producto(s) de reacción que una cierta cantidad de enzima que actuando sobre un sustrato producirá en un periodo de tiempo específico.
Péptido modificado: Una especie química compuesta de un péptido que posteriormente se hace reaccionar con un segundo resto químico, en este caso biotina, lo que permite al péptido ser monitorizado en virtud de las propiedades del segundo resto químico. El resto se puede referir como un segmento detector o cola de modificación.
Péptido: Un compuesto generalmente consistente de 2-30 aminoácidos sintéticos o que están presentes de modo natural que además, también se puede modificar incluyendo enlaces de modo covalente a los enlaces peptídicos del grupo alfa carbonilo de un primer aminoácido y el grupo amino alfa de un segundo aminoácido al eliminar una molécula de agua. Los aminoácidos pueden ser los aminoácidos que están presentes de manera natural o variantes sintetizadas de modo químico de tales aminoácidos o formas modificadas de estos aminoácidos que pueden ser alterados a partir de su estructura química básica mediante la adición de otros grupos químicos que se pueden encontrar que están unidos de manera covalente a ellos en los compuestos que aparecen de forma natural.
Fosforilación: La adición de un grupo fosfato a un sustrato.
Producto peptídico modificado: Una especie química que se forma por la acción de una enzima sobre un sustrato peptídico modificado, que ha sido alterado a parir del patrón de enlace original. Tales alteraciones pueden incluir la adición o eliminación de nuevas especies químicas al sustrato peptídico modificado. Los cambios particulares realizados sobre el sustrato peptídico modificado dependerán de la enzima particular que haya estado involucrada en la alteración del sustrato peptídico modificado. Ejemplos de un producto peptídico modificado puede incluir, pero no está limitado a, un producto, formado por incubación de un sustrato peptídico modificado con una proteína-quinasa bajo condiciones en las que la quinasa ha alterado el sustrato peptídico modificado mediante la adición de un grupo fosfato al péptido desde un donante de fosfato tal como ATP o GTP.
Requerimiento de secuencia: La propiedad de un enzima para reconocer y catalizar una reacción debido a la secuencia peptídica del sustrato.
Sustrato: La sustancia sobre la cual actúa una enzima.
Sustrato peptídico modificado: Un péptido modificado que se puede cambiar por la acción de una enzima. Tales cambios pueden incluir la adición o eliminación de especies químicas al péptido modificado. A menudo sería deseable diseñar un sustrato peptídico modificado particular para ensayar una enzima particular de interés. Un sustrato peptídico modificado potencial para la proteína-quinasa debe tener un aminoácido que pueda actuar como receptor de fosfato, tal como serina. La utilidad de un sustrato peptídico modificado potencial para ensayar una actividad enzimática en particular se puede determinar incubando el sustrato peptídico modificado potencial con la enzima bajo condiciones en las que la enzima se sabe que es activa y observando la velocidad con la que se genera un producto peptídico modificado.
La presente invención cuantifica las actividades de las enzimas de quinasa midiendo la cantidad de un sustrato peptídico modificado específico que ha sufrido una reacción por la enzima.
Quinasas
Las quinasas cuantificadas en la presente invención preferentemente usan ATP o GTP como donantes de fosfato y transfieren gamma fosfato desde la molécula a un aminoácido de serina, treonina o tiosina. Las proteína-quinasas se distinguen por su capacidad de fosforilar sustratos en secuencias discretas. Estas secuencias han sido determinadas por secuenciación de los aminoácidos alrededor de los sitios de fosforilación y son generalmente diferentes para cada proteína-quinasa. La secuencia de reconocimiento de cada sustrato es para un catalizador de quinasa específica.
El sitio de unión del sustrato en la quinasa se cree que existe en el dominio catalítico de la enzima. Este dominio es esencial para todas las proteína-quinasas. Normalmente contiene sobre 240 residuos y también contiene el sitio de unión de ATP o GTP de la quinasa.
\newpage
Medida de la Actividad
La actividad de una enzima se determina midiendo la cantidad de producto producido, es decir, producto peptídico modificado. La medida de la actividad de las enzimas se puede llevar a cabo por cuantificación de la cantidad del producto objeto de la reacción. La actividad de las proteína-quinasas de puede medir debido su capacidad de modificar los sustratos peptídicos específicos por adición de los grupos fosfatos a los sustratos peptídicos de la invención.
Incubación de la Enzima
La enzima se incuba bajo condiciones conocidas en la técnica con el sustrato peptídico modificado para formar los productos peptídicos modificados bajo condiciones en las que la enzima es activa. Cada una de las enzimas se ensaya normalmente a su pH óptimo, temperatura y otras condiciones.
Protocolo de Ensayo
Se ha desarrollado un protocolo de ensayo para determinar la actividad enzimática de varias proteína-quinasas en una manera específica, rápida y conveniente. El protocolo de ensayo tiene el propósito de ensayar proteína-quinasas individuales en presencia de una mezcla de otras proteína-quinasas. El ensayo de la enzima se puede agrupar en un formato de kit y se pueden proporcionar kits separados para la proteína-quinasa específica requerida. Además, este ensayo se puede adaptar a un formato de levado rendimiento.
Sustrato Peptídico
Un número de sustratos peptídicos especializados, incluyendo análogos y combinaciones de los sustratos peptídicos, se han desarrollado para su uso con el proceso descrito en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
1 
\newpage
Clave de Abreviación Aminoácido
Ala Alanina
Cys Cisteína
Asp Acido Aspártico
Glu Acido Glutámico
Phe Fenilalanina
Gly Glicina
His Histidina
Ile Isoleucina
Lys Lisina
Leu Leucina
Met Metionina
Asn Aspargina
Pro Prolina
Gln Glutamina
Arg Arginina
Ser Serina
Thr Treonina
Val Valina
Trp Triptófano
Tyr Tirosina
Los péptidos promega A-C contienen una secuencia favorable específica para las serina-treonina-quinasas. El péptido promega G forma un sustrato favorable para la tirosina-quinasa.
Mientras que el material presentado toma la ventaja de péptidos que son sintetizados químicamente in vitro y alguno de los mismos están disponible comercialmente, se debería hacer notar que la invención se puede desarrollar aislando un péptido a partir de una fuente natural que incluye la digestión de una proteína precursora superior o péptido y aislamiento del fragmento resultante apropiado mediante métodos bien conocidos en la técnica seguido de su unión a un segmento detector como se ha definido.
El ensayo utiliza un péptido marcado biotinilado que se requiere para la proteína-quinasa objeto de consideración. En contraste con los sustratos de proteína usados a menudo para los ensayos de proteína-quinasa, los péptidos se pueden diseñar para ser un sustrato selectivo para una quinasa en particular sintetizando un péptido que imite la secuencia de consenso reconocida por la enzima de interés. El péptido biotinilado se puede fosforilar por la respectiva proteína-quinasa bajo condiciones de fosfotransferasa óptimas por esta enzima en presencia de \tau-^{32}p-ATP. Debido a que los péptidos fosforilados y no fosforilados están biotinilados, se pueden capturar sobre una matriz de unión de biotina y el \tau-^{32}p-ATP libre remanente se puede eliminar mediante varios lavados.
La matriz de unión de biotina puede ser cualquier matriz que está unida covalentemente a moléculas de avidina o estreptavidina tales como discos de filtro, gránulos o una matriz soluble. FMC Corporation (Pine Brook, New Jersey) es un ejemplo de un fabricante de avidina y estreptavidina en matrices tales como sílice de Polivinilcarbonato (PVC) con estreptavidina unida, Láminas de Plástico Microporoso o Discos de 12,5 mm. Los péptidos capturados se pueden colocar en un espectrómetro de destellos líquido para determinar el ^{32}P incorporado al péptido y por lo tanto, la actividad de la proteína-quinasa de la enzima bajo consideración.
El principio básico de la modalidad del péptido biotinilado es conjugar los sustratos peptídicos para una proteína-quinasa específica con biotina a partir del cual el péptido biotinilado se puede usar como un sustrato para ensayar la enzima en cuestión. Después de la finalización de la reacción, los péptidos fosforilados y no fosforilados se depositan en forma de alícuotas sobre membranas de filtración revestidas de estreptavidina o avidina, láminas de formato ELISA o partículas magnéticas revestidas de avidina, en donde los péptidos se unen. El ATP libre se puede eliminar mediante un procedimiento de lavado y los péptidos libres de ATP que están unidos a los filtros, partículas, láminas se pueden entonces contar mediante un espectrómetro de destellos en fase líquida, y la actividad de la enzima se puede determinar a partir del ^{32}P incorporado. Un grupo de biotina puede unirse correctamente a un péptido y usarse como un sustrato para la medida de la actividad de la proteína-quinasa cuando se cumplen los siguientes criterios:
1.
El grupo de biotina debe estar unido covalentemente al grupo amino N-terminal y no a cualquier otro grupo amino presente de manera interna o C terminal del sustrato peptídico. Esto es esencial ya que la unión de una molécula de biotina de modo covalente a un grupo amino \varepsilon en una lisina interna dará como resultado una alteración de la carga global del péptido. De este modo, la eficacia del péptido como sustrato para algunas proteína-quinasas tales como quinasas de PKA, PKC y CAM puede resultar alterada.
\newpage
2.
La adición del resto de biotina al péptido no debería dar como resultado un impedimento estérico de la accesibilidad al sustrato peptídico a la enzima durante la investigación. Preferentemente, el enlace de la biotina de seis átomos de carbono al sustrato minimiza los impedimentos estéricos.
3.
Una matriz que puede unir el péptido biotinilado fosforilado debe ponerse a disposición de forma que la actividad de la proteína-quinasa en cuestión se pueda determinar midiendo la cantidad de producto peptídico radio-marcado. La agente de unión debería ser específico para el fosfopéptido modificado y cualquier proteína fosforilada u otro péptido presente en la muestra no deberían unirse a la matriz. De este modo, la actividad es proporcional a la cantidad de péptido biotinilado fosforilado unido.
4.
El exceso de \tau-^{32}P-ATP que no es usado en la reacción se debería eliminar en su totalidad. El objetivo es producir un bajo nivel de ruido de línea base y además, proporcionar un método rápido para ensayar la enzima en cuestión.
5.
La capacidad de unión de la matriz al péptido biotinilado debería ser lo suficientemente alta para usar una concentración de varias veces el valor de Km para el sustrato peptídico. Este requerimiento asegurará que la velocidad inicial de reacción sea lineal dentro de un tiempo razonable. Además, la velocidad inicial de reacción debería ser proporcional a la cantidad de la enzima en la reacción.
Para experimentos a pequeña escala, un disco de membrana de 25 mm de diámetro revestido con avidina se puede numeran con un lapicero. De manera alternativa, se puede usar un volumen conocido de partículas magnéticas revestidas con avidina en un tubo Eppendorf.
Ensayo de Quinasa
El ensayo de quinasa se lleva a cabo como se describe usando enzimas purificadas o extractos de tejidos como una fuente de enzimas y el péptido biotinilado como un sustrato en presencia de otros reactivos que se requieren para la reacción tales como tampón, cationes bivalentes tales como Mn^{2+}, Ca^{2+}, y Mg^{2+}, y \tau-^{32}P-ATP. Para algunas proteína-quinasas se pueden requerir otros cofactores tales como fosfolípidos o calmodulina. Después de la finalización de la reacción, se extrae una alícuota y se aplica directamente sobre los discos revestidos de avidina. Los discos se colocan en una baso de precipitados conteniendo una disolución 2M de NaCl para lavar el \tau-^{32}P-ATP libre. De manera alternativa, las alícuotas se pipetean en el interior de un tubo conteniendo partículas y se mezclan bien. El NaCl del baso de precipitados se puede cambiar 5 veces por minuto, lo que finaliza la operación en 5 minutos. Cuando se utilizan partículas, éstas se pueden lavar por medio de métodos convencionales para eliminar los componentes solubles de la reacción libres, incluyendo ATP y las proteínas endógenas.
El ensayo puede aumentarse de escala hasta un ensayo de alto rendimiento mediante una leve modificación de la matriz. Pueden usarse láminas recubiertas de estreptavidina conteniendo 24 ó 96 paredes. Las alícuotas, extraídas después de la finalización de la reacción de ensayo, se pipetean directamente sobre las paredes individuales más que sobre los discos individuales. A continuación, se lava toda la lámina enjuagando las paredes con una disolución 2M de NaCl. Se debe señalar que los sistemas de la técnica previa están disponibles para aplicar la mezcla de reacción completa sobre las paredes individuales. El lavado de las paredes se puede realizar con un sistema automático. Las láminas pueden ser entonces contadas usando un espectrómetro de destello en fase líquida tal como un Contador de Luminiscencia y de Destellos de Microláminas de Top Count fabricado por Packard Corporation en Meriden, Connecticut and Wallac, Inc., en Gaithersburg, Maryland. A continuación se muestran ejemplos no limitantes de ensayos utilizando la presente invención.
Proteína-quinasa Dependiente cAMP (PKA)
Cuando se investiga la proteína-quinasa dependiente de cAMP (PKA), se tiene conocimiento de que un sustrato peptídico que es específico para esta enzima está biotinilado en su grupo N-terminal. Un péptido modificado *-Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly (Péptido Promega A; SEQ. ID. 1) se sintetiza usando un sintetizador de péptidos. El péptido se ensaya mediante los métodos conocidos en la técnica para ser un sustrato para PKA a diferentes concentraciones; a saber, 0, 10, 20, 50 y 100 \muM con PKA purificado a varias disoluciones. La enzima utilizada en los estudios es la subunidad catalítica de PKA (#V5161, Promega Corporation, Madison, WI.) con una actividad específica de 50 pmol de ^{32}P transferidos a la caseina por \mum de enzima en 1 minuto a 37ºC o 10.000 pmol de ^{32}P transferidos al sustrato Kemptido Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly (Péptido Promega A; SEQ. ID. 1) por \mum de enzima por minuto a 37ºC.
Actividad de la Fosfotransferasa de las Proteína-quinasas
Este ensayo pone aprueba la determinación de la actividad de la fosfotransferasa de otras proteína-quinasas usando los correspondientes sustratos peptídicos biotinilados. Por ejemplo, para ensayar la actividad de la quinasa de la proteína-quinasa dependiente de Ca^{2+} y fosfolípido (PKC) se usa el péptido derivado de la neurogranina biotinilado *-Ala-Ala-Lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys (Péptido Promega B; SEQ. ID. 2) como un sustrato bajo condiciones óptimas para la actividad de la proteína-quinasa PKC.
Otros ensayos
Se pueden ensayar otras proteína-quinasas como se describe anteriormente para PKA y PKC, pero empleando los sustratos peptídicos apropiados y ensayándolos bajo las correspondientes condiciones de ensayo óptimas. Por ejemplo, el sustrato peptídico *-Asp-Asp-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg-Arg (Péptido Promega E; SEQ. ID. 5) se usa para ensayar la caseina-quinasa I (CK-1, del inglés casein kinase I). El péptido *-Arg-Arg-Arg-Glu-Glu-Glu-Thr-Glu-Glu-Glu (CK-2, del inglés casein kinase II) (Péptido Promega C; SEQ. ID. 3) se usa para ensayar la caseina-quinasa II (CK-2). El péptido *-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (Péptido Promega G; SEQ. ID. 7) se usa para ensayar la actividad de la tirosina-quinasa del receptor del factor del crecimiento epidermal activado (EGFR, del inglés Epidermal Growth Factor Receptor).
En cada caso, la actividad de la enzima de la proteína-quinasa objeto de estudio se ensaya usando el método que se desarrolló usando el derivado biotinilado del sustrato peptídico apropiado y la matriz de unión de estreptavidina, y seguidamente mediante el método del disco de fosfocelulosa usando el sustrato peptídico no modificado.
Las proteína-quinasas se ensayan bajo sus condiciones óptimas como se describe a continuación con la excepción de usar los sustratos peptídicos no modificados en la reacción y el procedimiento de procesado recomendado descrito en Casnellie, J. E., 1991. En resumen, la reacción se detiene mediante la extracción de alícuotas de 40 \mul y depositándolas en forma de gotas sobre un papel P81 (Whatman, Clifton, NJ). Los filtros se dejan caer inmediatamente en el interior de un baso de precipitados conteniendo ácido fosfórico al 0,5% y se dejan con una agitación ocasional del baso de precipitados durante 5 minutos. La disolución de ácido fosfórico se decanta y se añade una disolución nueva. Esta etapa se repite otra vez hasta un total de 4 veces, cada una de ellas durante 5 minutos. Los filtros se secan y se colocan en los viales de medición de destellos y se añaden 5 ml de fluido de medición de destellos. La actividad enzimática se determina como se describe anteriormente en el sistema de ensayo.
Para determinar la actividad de la proteína-quinasa para varias quinasas, se deben cumplir los siguientes criterios:
1.
El derivado biotinilado del péptido debería servir como un sustrato correcto y específico para la enzima en cuestión como el sustrato peptídico no modificado.
2.
La fosforilación del péptido biotinilado no debería afectar a su unión a la matriz de unión de avidina o a la matriz de unión de estreptavidina.
3.
La fosforilación del péptido biotinilado debería ser proporcional a la cantidad de enzima añadida y a ciertos periodos de tiempo del ensayo.
4.
Las proteínas fosforiladas no deberían unirse a la matriz a menos que estuvieran biotiniladas, es decir, sólo los péptidos biotinilados y fosforilados deberían unirse a la matriz.
5.
La matriz de unión de avidina o de unión a estreptavidina deberían tener suficiente capacidad de unión para los péptidos biotinilados añadidos a la matriz.
6.
Debería existir un medio para eliminar el exceso de \tau-^{32}P-ATP libre después de la finalización de la reacción.
Para alcanzar estos criterios, los péptidos se sintetizan de modo que sean sustratos específicos para varias proteína-quinasas (Kemp, B. E. and Pearson, R. B., 1991). Cada uno de estos péptidos contienen la secuencia de consenso requerida para la fosforilación para la correspondiente enzima. Normalmente es necesario tener estos péptidos unidos a aminoácidos básicos para impartir una carga(s) positiva al péptido de forma que se pueda unir al papel de fosfocelulosa cargado negativamente.
En la presente invención, los péptidos se modifican en una manera tal que se hace de ellos que se unan estrechamente a la matriz. El resto biotinilado se une al grupo NH_{2} terminal del sustrato peptídico vía una unión átomo de carbono-6.
Los péptidos modificados con biotina se sintetizan en un sintetizador de péptidos usando los procedimientos establecidos de síntesis para péptidos en fase sólida (Nova Biochem/Calbiochem, San Diego, California). El grupo de biotina se añade antes de la escisión del péptido de la resina. La identidad y pureza de los péptidos biotinilados se confirman mediante el análisis cuantitativo de aminoácidos, dos sistemas de disolventes en cromatografía líquida de alta presión (HPLC, del inglés High Pressure Liquid Chromatography), y espectrometría de masas mediante bombardeo de átomos acelerados (FAB, del inglés Fast Atom Bombardment).
Se investigan varios parámetros que puedan tener influencia o afectar a los resultados de este ensayo. Estos son el diámetro de los discos, la densidad de estreptavidina por disco, el nivel de sequedad de los discos, la concentración del sustrato peptídico modificado y la cantidad de enzima que puede ser usada.
El ensayo se lleva a cabo a 37ºC durante 5 minutos. Se observa un incremento proporcional de la actividad de la quinasa cuando se incrementa la cantidad de enzima presente.
Los discos de filtro en base de sílice se fabrican de forma que están unidos a avidina o estreptavidina. Se fabrican dos tamaños diferentes. Uno es de 25 mm (diámetro interno) y el otro era 12,5 mm de diámetro interno. Los filtros están unidos a 0,5, 1,0, ó 2,0 mg de estreptavidina o avidina. Los discos de 12,5 mm de diámetro con 0,5 mg de estreptavidina por disco dan los mejores resultados. Además, se ensayan varios niveles de sequedad tales como discos húmedos, discos secados 1 hora, discos secados 2 horas, y discos secados 2 semanas para determinar su aplicación en este ensayo. Esto se examina para asegurar que el ensayo es fácil para el usuario. Los resultados indican que los discos semi-húmedos además de los discos secos pueden usarse de manera satisfactoria en este ensayo.
La especificidad de este ensayo se examina de manera adicional usando un extracto de tejido como fuente de PKA. La linealidad de la incorporación de ^{32}P al péptido biotinilado también se estudia incrementando la concentración de sustrato.
Los resultados experimentales indican que la biotinilación de los sustratos peptídicos no afecta a la idoneidad del péptido como sustrato. Un mg de avidina (o estreptavidina) por disco de 25 mm (diámetro interno) (0,5 mg/disco de 12,5 mm (diámetro interno)) es suficiente para la unión de hasta 5 nmol de péptido biotinilado lo que da una concentración final de 200 \muM (volumen de reacción de 25 \muL). Esta concentración de péptido es suficiente para la mayoría de los propósitos requeridos. Ambas, la avidina y la estreptavidina pueden usarse para este ensayo, aunque debido al bajo coste de la estreptavidina, la mayoría de los estudios se desarrollan con estreptavidina.
Por último, se prueban todas las disoluciones de lavado para eliminar el ATP libre y la mejor línea de base se obtiene con una disolución de NaCl 2 M. De este modo, se usa esta disolución como disolución de lavado.
Para generar los datos, se llevaron a cabo las siguientes condiciones:
1.
Las reacciones se detuvieron con la disolución de terminación (2M de urea, 125 mM de EDTA, y 1% de SDS), y sobre los discos de 12,5 mm de unión a estreptavidina (0,5 mg de estreptavidina) o sobre las paredes de la lámina de 24 paredes se depositaron en forma de gotas alícuotas de 25 \muL.
2.
Los discos o paredes se enjuagaron o lavaron cinco veces con una disolución 2M de NaCl, cada una de ellas durante un minuto.
3.
Los discos o platos se secaron y se contaron usando un contador de destellos en fase líquida.
Kits
La presente invención también está dirigida a los kits que utilizan el proceso descrito. Un kit básico para cuantificar la actividad de una enzima incluye un recipiente que contiene un bio-reactivo, que es un sustrato peptídico modificado que tiene una reactividad específica al enzima, modificado por reacción química para permitir la cuantificación, e instrucciones para su uso.
El sustrato peptídico modificado suministrado en el kit incluye el compuesto adhesivo de biotina. El kit también contiene al menos un tampón que es compatible con la enzima seleccionada.
Un kit está dirigido a detectar específicamente la actividad de enzimas seleccionadas del grupo de serina-treonina-quinasas y tirosina-quinasas. El kit incluye un recipiente que contiene un sustrato peptídico modificado junto con el compuesto de unión de biotina. El sustrato de péptido modificado es específico para la enzima seleccionada.
Un kit está dirigido cuantificar la actividad de una enzima que se elige del grupo que consiste en quinasas. El kit básico incluye al menos un recipiente con un sustrato peptídico modificado que incluye el compuesto de unión a biotina. El sustrato de péptido modificado es específico para la enzima seleccionada.
El sustrato peptídico modificado en el kit puede ser uno de los siguientes péptidos, dependiendo del tipo de enzima que se ensaya según se ha explicado: Péptido Promega A (SEQ. ID. 1), Péptido Promega B (SEQ. ID. 2), Péptido Promega C (SEQ. ID. 3), Péptido Promega D (SEQ. ID. 4), Péptido Promega E (SEQ. ID. 5), Péptido Promega F (SEQ. ID. 6), Péptido Promega G (SEQ. ID. 7) y Péptido Promega H (SEQ. ID. 8). En la Tabla 1 se hace un referencia indicando los sustratos peptídicos modificados específicos para las enzimas seleccionadas.
Las instrucciones para uso también se incluyen. "Instrucciones para su uso" es una expresión concreta que describe la concentración de reactivo o al menos un parámetro del método de ensayo tal como la cantidad relativa de reactivo y de muestra que se deben dosificar, periodos de tiempo de mantenimiento para las dosis de reactivo/muestra, temperatura, condiciones del tampón y semejantes.
El kit también puede incluir una matriz de unión de biotinina unida a moléculas de avidina o estreptavidina tales como discos de filtración, gránulos, matrices solubles o láminas. La matriz de unión de biotinina se puede utilizar para unir el sustrato peptídico modificado y el producto peptídico modificado conteniendo la biotina.
\newpage
Las cantidades de los diferentes reactivos en los kits se pueden variar dependiendo de un número de factores, tales como la sensibilidad óptima del ensayo. Las instrucciones para su uso son aptas para hacer posible a un analista llevar a cabo el ensayo deseado.
Está dentro del alcance de esta invención proporcionar kits de ensayos de tipo manual o kits de ensayos para su uso en analizadores automáticos.
Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar las ventajas de la presente invención y ayudar a alguien habituado a su fabricación y uso de la misma. Los ejemplos no tienen la intención de forma alguna de limitar el alcance de la descripción o protección garantizada por la patente. Mientras que dan las descripciones precisas para los ensayos de las proteína-quinasa, debería quedar claro para alguien experto en la técnica que los resultados de la presente invención se pueden aplicar para el ensayo de una amplia variedad de enzimas seleccionadas.
Mientras que el material presentado se aprovecha de los péptidos que son sintetizados químicamente in vitro, y alguno de los cuales están disponibles comercialmente, se debería notar que la invención se puede desarrollar por aislamiento a un péptido a partir de una fuente natural.
Ejemplos
Los ensayos en estos ejemplos están basados en el uso de sustratos peptídicos biotinilados que son específicos para ciertas enzimas.
Ejemplo 1
Actividad de la Quinasa de la Proteína-Quinasa Dependiente de cAMP
La actividad de la quinasa de la proteína-quinasa dependiente cAMP (PKA) se llevó a cabo por duplicado de varias concentraciones de sustrato peptídico, en un volumen de reacción (50 \muL) conteniendo 40 mM de Tris HCl, pH 7,4, 20 mM MgCl_{2}, 100 \muM de \tau-^{32}P-ATP (actividad específica de 100-200 cpm/pmol), 100 \mug/ml de albúmina de suero bovino (BSA, del inglés Bovine Serum Albumin), y el sustrato peptídico biotinilado apropiado: *-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly (Péptido Promega A, SEQ. ID. 1, peso molecular de 998,4).
La reacción se inició mediante la adición de la cantidad apropiada de enzima (Promega #V5221) para dar lugar a 2 unidades de Kemptido y se incubó durante 0, 5, y 10 minutos a 37ºC (se define una unidad Kemptido como la cantidad de enzima requerida para catalizar la incorporación de 1 pmol de fosfato a un sustrato de Kemptido en un minuto). A periodos específicos de tiempo a la temperatura apropiada, se detuvo la reacción mediante la adición de 10 \muL de disolución finalizadora como se describe anteriormente.
Se extrajeron alícuotas de veinticinco \muL y se depositaron en forma de gotas en un disco de 12,5 mm de diámetro interno de unión a estreptavidina (0,5 mg de estreptavidina/disco) y se colocó en un baso de precipitados conteniendo una disolución 2M de NaCl. Después de un minuto de agitación suave del baso de precipitados a temperatura ambiente, se añadió una disolución nueva de NaCl. Este procedimiento de lavado se repitió 5 veces más durante un minuto cada una de ellas. Los discos se lavaron entonces una vez más con agua, se secaron y se colocaron en los viales del detector de destellos. Entonces se añadieron 5 ml de fluido de detección de destellos.
La actividad de la enzima se calculó determinando la radiactividad vía espectrometría de destellos en fase líquida. Para confirmar que la fosforilación estaba catalizada específicamente por la PKA, se incluyó en la reacción un inhibidor específico y potente de PKA (#V5681, Promega Corporation, Madison, WI.). Toda la actividad de la fosfotransferasa debería haberse inhibido por la adición del inhibidor.
Resultados Usando PKA Medido
La relación entre la velocidad de reacción (velocidad inicial de PKA) se determina mediante el protocolo y bajo las condiciones descritas anteriormente, y la cantidad de enzima en la reacción se muestra en la Fig. 1. Usando 100 \muM de sustrato peptídico modificado en la reacción se obtuvo una respuesta lineal en la actividad de la PKA al incrementar la cantidad de enzima en la reacción. La actividad de la enzima también se investigó con relación a la concentración de sustrato peptídico biotinilado.
Como se muestra en la Fig. 2, la curva de la cinética describe un comportamiento de saturación Michaelis-Menten típico (curva hiperbólica). La transformación de los mismos datos dio como resultado un valor de Km para el sustrato de 33 \muM, y un valor Vmax de 1,45 pmol/min como se ilustra en la Fig. 3. Valores similares se obtuvieron con el ensayo de papel de fosfocelulosa usando el Kemptido como sustrato, y como se ilustra en la Fig. 4 el valor de Km para el sustrato no modificado no era afectado por la biotinilación Kemp, B. E. and Pearson, R. B. 1991. La actividad de la proteína-quinasa era específica para la PKA ya que la adición de 50 \muM de inhibidor de PKA (PKI) redujo drásticamente la actividad de la enzima.
\newpage
Ejemplo 2
Actividad de la Quinasa de PKA en Tejidos de Rata
La actividad de la quinasa de PKA en varios tejidos de rata también se investigó usando el sustrato peptídico modificado y el protocolo de ensayo como se describe con anterioridad.
Como se ilustra en la Fig. 5, la actividad de la proteína-quinasa de PKA era de 2,2, 1,75, 3,2 y 1,9 nmol ^{32}P/min/mg de hígado, ovario, corazón, y cerebro de rata respectivamente, y era comparable a los obtenidos con el método del papel de fosfocelulosa y péptido no modificado. La incorporación de fosfato al sustrato modificado se eliminó completamente cuando se incluyó en la reacción 100 \muM de inhibidor de PKA (PKI). Así, la fosforilación del sustrato peptídico modificado, bajo las condiciones descritas con anterioridad y ensayadas con el protocolo, es catalizada por el PKA y no por otras proteína-quinasas presentes en el extracto del tejido.
Cualquier proteína(s) que sea fosforilada en la reacción y tenga una carga básica no se unirá a la matriz. Sólo el sustrato peptídico modificado fosforilado se une a la matriz. Así, la incorporación de fosfato usando el protocolo de ensayo refleja la verdadera incorporación del ^{32}P al sustrato peptídico. Este no es el caso con el método de ensayo con papel de fosfocelulosa en el que cualquier proteína básica del extracto que esté fosforilada se unirá al papel y dará como resultado una estimación por exceso de la actividad de la quinasa de la enzima.
Ejemplo 3
Actividad de la Proteína-Quinasa de la proteína-quinasa dependiente de Ca^{2+} y fosfolípido
La actividad de la proteína-quinasa de la actividad de la proteína-quinasa dependiente de Ca^{2+} y fosfolípido (PKC) se determinó de una manera similar a la descrita con anterioridad para la PKA, excepto en que el sustrato peptídico biotinilado era un derivado de neurogranina; denominada, neurogranina _{(28-43)} biotinilada Chen, S-J, et al., 1993.
El péptido se modificó mediante la adición de un resto que contiene biotina: *-Ala-Ala-Lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys (Péptido Promega B, SEQ. ID. 2, Peso Molecular es 2139,6), y se usó a una concentración de 100 \muM. La enzima (#V5261, promega Corporation) se diluyó 5X en 100 \mug/ml de BSA.
La actividad de la quinasa de la PKA se determinó en un volumen de reacción de 50 \muL consistente en 40 mM Tris. HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl_{2}, BSA a 100 \mug/ml, y 100 \muM de \tau-^{32}P-ATP (actividad específica de 100 cpm/pmol). La actividad se determinó en presencia y en ausencia de 100 \mug/ml de fosfatidilserina, 10 \mug/ml de diacilglicerol y 0,4 mM de cloruro cálcico. La reacción se inició con la adición de 5 \muL de la enzima y se incubó a 25ºC. Después de periodos de tiempo específicos, se detuvo la reacción mediante la adición de 10 \muL de disolución finalizadora (ver arriba). Alícuotas de veinticinco \muL se depositaron sobre los discos y los discos se procesaron tal como se describe con anterioridad para la PKA.
Resultados Usando el PKC Medido
La actividad del PKC obtenida también se comparó con la obtenida usando el sustrato peptídico no modificado y se ensayó mediante el método del papel de fosfocelulosa. Los resultados mostrados en la Fig. 6, usando una concentración de sustrato peptídico modificado de 100 \muM, indican que la actividad de la PKC era lineal al incrementar la cantidad de proteína de enzima en la reacción. De manera similar al trabajo presentado con la PKA, también se investigó el efecto de la concentración del sustrato en la actividad de la actividad de quinasa de PKC.
Se obtuvo una cinética Michaelis-Menten, es decir, una curva hiperbólica, como se ilustra en la Fig. 7, y la actividad de la enzima alcanzó un máximo alrededor de 100 \muM de sustrato modificado. Sin embargo, la actividad de la PKC era aproximadamente 6-7 veces mayor que su actividad cuando se ensayó con el método del papel de fosfocelulosa. El incremento en la actividad de la PKC en el sistema de ensayo puede ser debido a la unión aumentada y específica del producto peptídico fosforilado y también a la menor pérdida de producto peptídico fosforilado de la matriz durante el procedimiento de lavado. Esto demuestra que la actividad de la quinasa de la enzima se puede determinar exactamente usando del sistema de ensayo con la neurogranina _{(28-43)} biotinilada.
La actividad se inhibió por completo con el inhibidor peptídico de la PKC miristoilado específico como se ilustra en la Fig. 8. De este modo, 10-20 \muM de inhibidor era suficiente para inhibir la actividad de la quinasa de PKC, indicando que todo el ^{32}P incorporado al sustrato peptídico era catalizado vía PKC.
Ejemplo 4
Actividad de la Quinasa de PKC Usando Tejido de Rata
También se estudió la actividad de la quinasa de la PKC en el cerebro de rata usando los materiales y métodos del Ejemplo 3.
\newpage
Como se ilustra en la Fig. 9, la actividad de la PKC en una fracción enriquecida de un sobrenadante a elevadas revoluciones de extracto de cerebro de rata era de aproximadamente 500 pmol ^{32}P/mg/min, y que de la PKC parcialmente purificada era de 2200 pmol ^{32}P/mg/min.
Se entiende que la invención no está confinada a la construcción y a las disposiciones particulares ilustradas y descritas en la presente invención, sino que abarca sus formas modificadas y que están dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen a la bibliografía.
Bibliografía de las referencias citadas
Babcook, John, Julian Watts, Rudei Aebersold and Hermann J. Ziltener, 1991, "Automated Nonisotopic Assay for Protein-Tyrosine Kinase and Protein-Tyrosine Phosphatase Activities." Anal. Biochem., 196, 245-251.
Budde, Raymond J. A., John S. McMurray and Donald A. Tinker, 1992, "An Assay for Acidic Peptide Substrates of Protein Kinases." Anal. Biochem,, 200, 347-351.
Casnellie, J. E., 1991. "Assay of Protein Kinases Using Peptides with Basic Residues for Phosphocellulose Binding."Meth. Enzymol., 200: 115-120.
Chakravarthy, Balu R., Alexandra Bussey, James F. Whitfield, Marianna Sikorska, Ross e. Williams and Jon P. Durkin, 1991, "The Direct Measurement of Protein Kinase C (PKC) Activity in Isolated Membranes Using a Selective Peptide Substrate." Anal. Biochem., 196, 144-150.
Chen, S-J, Klann, E., Gower, M. C., Powell, C. M., Sessoms, J. S., and Sweatt, J. D., 1993. "Studies with Synthetic Peptide Substrates Derived from the Neuronal Protein Neurogranin Reveal Structural Determinants of Potency and Selectivity for Protein Kinase."C. Biochem., 32: 1032-1039.
Gopalakrishna, Rayudu, Zhen H. Chen, Usha Gundimeda, John C. Wilson and Wayne B. Anderson, 1992, "Rapid Filtration Assays for Protein Kinase C Activity and Phorbol Ester Binding Using Multiwell Plates with Fitted Filtration Disks." Anal. Biochem., 206, 24-35.
Kemp, B. E. and Pearson, R. B., 1991. "Design and Use of Peptide Substrates for Protein Kinases."Meth. Enzymol., 200: 121-134.
Rijksen, Gert, Brigit A. van Oirschot and Gerard E. J. Staal, 1991, "Nonradioactive Assays of Protein-Tyrosine Kinase Activity Using Anti-phosphotyrosine Antibodies." Methods in Enzymology, 200: 98-107.
Robyt, John F. and Bernard J. White, 1990, Biochemical Techniques - Theory and Practice, Waveland Press, Inc., Prospect Heights, IL, pp. 291-320.

Claims (20)

1. Un método de determinar la presencia o actividad de una proteína-quinasa seleccionada, que comprende:
a.
proporcionar un substrato peptídico que tenga un resto de unión conjugado al mismo;
b.
añadir una cantidad suficiente del sustrato peptídico de la etapa (a) a una disolución que contiene la proteína-quinasa seleccionada;
c.
incubar de la proteína-quinasa con el sustrato peptídico bajo condiciones en las que la proteína-quinasa seleccionada es activa durante un tiempo suficiente para formar un producto peptídico fosforilado;
d.
unir el substrato peptídico y el producto peptídico a una matriz de unión específicamente reactiva con el resto de unión, en donde la matriz tiene suficiente capacidad de unión y especificidad para el resto de unión para capturar esencialmente todo el substrato peptídico y el producto peptídico procedente de la disolución; y
e.
medir de la cantidad de producto peptídico.
2. Un método según la reivindicación 1, en donde el resto de unión en la etapa (a) es biotina.
3. Un método según la reivindicación 2, en donde el resto de biotina está conjugado al substrato peptídico tal que el resto de biotina no tiene como resultado un impedimento estérico entre el substrato peptídico y la proteína-quinasa.
4. Un método según la reivindicación 2 ó 3, en donde el resto de biotina está conjugado al substrato peptídico en su grupo amino N-terminal vía una unión de al menos 6 átomos de longitud.
5. Un método según cualquiera reivindicación precedente, que además comprende después de la etapa (d) y antes de la etapa (e), el lavado de la matriz.
6. Un método según cualquiera reivindicación precedente, en donde la matriz de unión de la etapa (d) incluye una proteína.
7. Un método según la reivindicación 6, en donde la proteína es avidina o estreptavidina o una combinación de las mismas.
8. Un método según cualquiera reivindicación precedente, en donde la matriz de unión comprende membranas, filtros, gránulos, discos, matrices solubles revestidos de proteínas o cualquiera de sus combinaciones.
9. Un método según cualquiera reivindicación precedente, en donde en la etapa (c), la proteína-quinasa seleccionada se incuba en presencia de un substrato peptídico biotinilado y de un marcador.
10. Un método según la reivindicación 9, en donde el marcador es un marcador radiactivo.
11. Un método según la reivindicación 10, en donde el marcador radiactivo es ^{32}P.
12. Un método según la reivindicación 11, en donde el producto peptídico se mide mediante un espectrómetro de destellos.
13. Un método según cualquiera reivindicación precedente, en donde el substrato peptídico es uno cualquiera de los de Números de Identificación de Secuencia: 1 a 8, que tiene un resto de biotina conjugado al mismo.
14. Un método según cualquiera reivindicación precedente, en donde la proteína-quinasa es una serina-treonina-quinasa o una tirosina-quinasa.
15. Un kit para determinar la presencia o actividad de una proteína-quinasa seleccionada que comprende:
un recipiente que contiene un sustrato peptídico que tiene un resto de unión conjugado al mismo, siendo el substrato peptídico capaz de reaccionar específicamente con la proteína-quinasa seleccionada.
16. Un kit según la reivindicación 15, que además comprende una matriz de unión, siendo la matriz de unión específicamente reactiva para unirse con el resto de unión.
17. Un kit según la reivindicación 15 ó 16, que además comprende un recipiente que tiene depositado en su interior un tampón que es compatible con la proteína-quinasa seleccionada.
18. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde el resto de unión es biotina.
19. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde la matriz de unión comprende avidina o estreptavidina o una combinación de las mismas.
20. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde el substrato peptídico es uno cualquiera de los de Números de Identificación de Secuencia 1 a 8.
ES03003524T 1994-03-04 1995-03-06 Cuantificacion de la actividad de una proteina quinasa individual. Expired - Lifetime ES2268178T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/208,573 US6348310B1 (en) 1994-03-04 1994-03-04 Quantitation of individual protein kinase activity
US208573 1994-03-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2268178T3 true ES2268178T3 (es) 2007-03-16

Family

ID=22775101

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03003524T Expired - Lifetime ES2268178T3 (es) 1994-03-04 1995-03-06 Cuantificacion de la actividad de una proteina quinasa individual.
ES95913593T Expired - Lifetime ES2204946T3 (es) 1994-03-04 1995-03-06 Cuantificacion de la actividad de una proteina-quinasa individual.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES95913593T Expired - Lifetime ES2204946T3 (es) 1994-03-04 1995-03-06 Cuantificacion de la actividad de una proteina-quinasa individual.

Country Status (8)

Country Link
US (3) US6348310B1 (es)
EP (2) EP0760678B9 (es)
JP (1) JPH10511260A (es)
AT (2) ATE333514T1 (es)
AU (1) AU2097595A (es)
DE (2) DE69531734T2 (es)
ES (2) ES2268178T3 (es)
WO (1) WO1995023612A1 (es)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6348310B1 (en) * 1994-03-04 2002-02-19 Promega Corporation Quantitation of individual protein kinase activity
WO1997039143A2 (en) * 1996-04-17 1997-10-23 Abbott Laboratories Methods for the identification of novel antifungal agents
US6335176B1 (en) * 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
US6406869B1 (en) 1999-10-22 2002-06-18 Pharmacopeia, Inc. Fluorescent capture assay for kinase activity employing anti-phosphotyrosine antibodies as capture and detection agents
US6720162B2 (en) * 2000-05-31 2004-04-13 Promega Corporation Assay for kinases and phosphatases
US20030162230A1 (en) * 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
US7067269B2 (en) * 2001-11-26 2006-06-27 Echelon Biosciences, Inc. Assaying apparatus, kit, and method for lipids and associated enzymes
US7037670B2 (en) * 2002-04-19 2006-05-02 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Peptide substrates for assay of extracellular signal-regulated protein kinase 1 and 2 activity
US7195884B2 (en) * 2002-07-19 2007-03-27 Promega Corp. Methods and kits for transferases
FR2846657B1 (fr) * 2002-11-05 2004-12-24 Servier Lab Nouveaux composes pyridopyrimidinone, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
WO2004081534A2 (en) * 2003-03-12 2004-09-23 Assay Designs, Inc. Phosphokinase assay
US7619059B2 (en) * 2003-07-29 2009-11-17 Life Technologies Corporation Bimolecular optical probes
US7727752B2 (en) * 2003-07-29 2010-06-01 Life Technologies Corporation Kinase and phosphatase assays
CA2445420A1 (en) * 2003-07-29 2005-01-29 Invitrogen Corporation Kinase and phosphatase assays
US20050272100A1 (en) * 2004-06-02 2005-12-08 Arthur Karlin Separation and quantification of biotinylated macromolecules
JP2007097448A (ja) * 2005-09-30 2007-04-19 Sysmex Corp 組織の性質判定用試薬キット
EP1946106A4 (en) * 2005-10-13 2009-04-08 Activesite Pharmaceuticals METHOD FOR IDENTIFYING INHIBITORS OF ENZYME ACTIVITY
KR101018003B1 (ko) * 2008-06-24 2011-03-02 한국원자력연구원 인산화 반응 측정용 바이오칩 및 이를 이용한 인산화 반응측정 방법
US9063156B2 (en) * 2009-06-12 2015-06-23 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time analytical methods and systems
HK1220759A1 (zh) 2013-03-15 2017-05-12 Hycor Biomedical Llc 用於进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统
CN103472052B (zh) * 2013-07-02 2015-08-26 南昌大学 一种多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA的制备方法及其激酶检测应用
EP4321165A3 (en) * 2013-12-27 2024-08-21 National University Corporation Tokyo Medical and Dental University Method for diagnosis of alzheimer's disease and frontotemporal lobar degeneration, diagnostic agent, therapeutic agent, and screening method for said agents
KR101430209B1 (ko) * 2014-03-06 2014-08-14 강원대학교산학협력단 단백질 키나아제 활성 측정 방법 및 이를 위한 키트
KR101683544B1 (ko) * 2014-12-19 2016-12-08 한양대학교 산학협력단 탈인산화 또는 인산화 효소 활성 검출용 조성물 및 검출 방법

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4594319A (en) 1984-03-19 1986-06-10 The University Of Tennessee Research Corp. Protein kinase enzyme AUT-PK 500 and a radioimmunoassay for detection of neoplasia
US4923802A (en) 1985-06-13 1990-05-08 Immunex Corporation Peptide substrates for the detection, characterization and purification of protein kinase C
ATE79635T1 (de) 1986-04-01 1992-09-15 Wako Pure Chem Ind Ltd Peptid-derivate und methode zur messung der wirksamkeit von physiologisch aktiven verbindungen, die dieselben als substraten benuetzen.
US4816450A (en) 1986-09-15 1989-03-28 Duke University Inhibition of protein kinase C by long-chain bases
US4937232A (en) 1986-09-15 1990-06-26 Duke University Inhibition of protein kinase C by long-chain bases
US5141852A (en) 1988-12-12 1992-08-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Assay of protein kinases with peptide substrates
US5235039A (en) * 1991-06-10 1993-08-10 Eli Lilly And Company Substrates for hiv protease
US5514778A (en) * 1993-07-01 1996-05-07 Eli Lilly And Company Anti-picornaviral agents
US6348310B1 (en) * 1994-03-04 2002-02-19 Promega Corporation Quantitation of individual protein kinase activity

Also Published As

Publication number Publication date
EP0760678B9 (en) 2004-05-19
ATE333514T1 (de) 2006-08-15
DE69535119T2 (de) 2007-02-08
EP0760678A1 (en) 1997-03-12
EP0760678A4 (en) 1999-02-24
ES2204946T3 (es) 2004-05-01
AU2097595A (en) 1995-09-18
US6066462A (en) 2000-05-23
EP1340816A3 (en) 2003-10-15
EP1340816A2 (en) 2003-09-03
US6753157B2 (en) 2004-06-22
WO1995023612A1 (en) 1995-09-08
US20020106701A1 (en) 2002-08-08
EP0760678B1 (en) 2003-09-10
US6348310B1 (en) 2002-02-19
DE69531734D1 (de) 2003-10-16
ATE249237T1 (de) 2003-09-15
DE69535119D1 (de) 2006-08-31
JPH10511260A (ja) 1998-11-04
EP1340816B1 (en) 2006-07-19
DE69531734T2 (de) 2004-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2268178T3 (es) Cuantificacion de la actividad de una proteina quinasa individual.
ES2329761T3 (es) Deteccion de peptidos.
JP5476559B2 (ja) リン酸化酵素の新規基質ポリペプチド
Volkmer Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology
AU744707B2 (en) Cyclic peptide libraries and methods of use thereof to identify binding motifs
EP1492882B1 (en) Methods and reagents for assaying protein kinase activity
US20080318246A1 (en) Deeply quenched enzyme sensors
ES2230496T3 (es) Procedimiento para determinar la especificidad de sustrato de una actividad enzimatica y dispositivo para ello.
Szymczak et al. Combining SAMDI mass spectrometry and peptide arrays to profile phosphatase activities
WO2016010961A1 (en) Enzyme occupancy assay
US7846746B2 (en) Methods of analysis and labeling of protein-protein interactions
US8349576B2 (en) eEF2K assays for identifying compounds that inhibit eEF2K activity
Viht et al. Fluorometric TLC assay for evaluation of protein kinase inhibitors
US20100075297A1 (en) Photosensitive polypeptide and methods of their production and use
JP2008289374A (ja) タンパク質キナーゼの新規基質ポリペプチド
Martin et al. A colorimetric enzyme‐linked on‐bead assay for identification of synthetic substrates of protein tyrosine kinases
Allen Development and application of technologies to study individual kinase substrate relationships
CN114137213A (zh) 一种体外检测ogt酶活性的方法
Senevirathne Development Of Kinase Catalyzed Biotinylation To Study Phosphoproteomics
Hertz et al. Current Protocols in Chemical Biology
AU2002338651A1 (en) Methods of analysis and labeling of protein-protein interactions
KR20100113748A (ko) 방사선 ｔｌｃ 이미지 스캐너를 이용하여 바이오 칩에서의 인산화 반응을 측정하는 방법
WO2011158863A1 (ja) タンパク質キナーゼの新規基質ペプチド