ES2268376T3 - Etiqueta proteica que comprende un dominio de biotinilacion y procedimiento para aumentar la solubilidad y determinar el estado de plegamiento. - Google Patents
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Abstract
Uso de un resto etiqueta que comprende un dominio de biotinilación para aumentar la solubilidad de una proteína de interés mediante la unión de dicho resto etiqueta al extremo N-terminal o C-terminal de dicha proteína de interés.
Description
Etiqueta proteica que comprende un dominio de
biotinilación y procedimiento para aumentar la solubilidad y
determinar el estado de plegamiento.
Esta invención se refiere al uso de la proteína
transportadora de carboxilbiotina (BCCP) como proteína marcadora de
plegamiento y potenciadora de la solubilidad proteica en la captura
en superficie orientada de productos de genes expresados de forma
heteróloga.
La expresión de proteínas humanas en sistemas
heterólogos, tales como bacterias, levaduras, células de insecto o
células de mamífero, puede dar lugar a la producción de proteínas
incorrectamente plegadas que da como resultado la formación de
agregados insolubles o un bajo rendimiento de proteínas expresadas
debido a que las proteínas sin plegar se dirigen al proteosoma. En
todos los procedimientos de proteínas funcionales es esencial la
producción de proteínas correctamente plegadas o nativas, y a menudo
es necesario mucho trabajo para optimizar la expresión de proteínas
individuales. Sin embargo, muchas áreas de la bioquímica de
proteínas suponen trabajar con bibliotecas o grupos de proteínas de
tamaño tal que la optimización de la expresión individual y de las
condiciones de purificación para cada proteína es poco factible. Por
tanto, existe una necesidad no cubierta en la técnica de reactivos,
protocolos y metodologías que faciliten la multiplicidad de estos
procesos.
Las etiquetas de afinidad son un procedimiento
conveniente de purificación e inmovilización de proteínas
recombinantes. Las etiquetas de hexahistidina (6 aminoácidos (aa);
Quiagen/Roche), la proteína de unión a maltosa de Escherichia
coli ("MBP", 300 aa; New England Biolabs) y la
glutatión-S-transferasa de
Schistosoma japonicum (GST, 220 aa; Amersham Pharmacia
Biotech/Novagen) son eficaces, pero tienen la desventaja de que
proteínas heterólogas del huésped interaccionan con las matrices de
afinidad usadas para la purificación de las proteínas de fusión.
Esto da lugar a preparaciones de proteína no pura y, a menudo, es
necesaria una etapa adicional de limpieza. Adicionalmente, la
afinidad relativamente baja de estas proteínas por sus ligandos da
lugar a la disociación o "lixiviación" de las proteínas de
fusión a partir de superficies en las cuales están inmovilizadas.
Estas interacciones reversibles se aprovechan durante las
purificaciones basadas en resina con las resinas en formatos de
columna o discontinuo en el que, debido a las altas concentraciones
locales de ligando, las proteínas disociadas se vuelven a unir
rápidamente, incluso se eluyen rápidamente con el ligando libre. Por
el contrario, la inmovilización de proteínas en superficies planas,
tales como placas de microvaloración o micromatrices, por ejemplo,
biochips, requiere que permanezcan unidas y no sean lixiviadas del
sustrato durante el almacenamiento y uso. Así, no son óptimas las
etiquetas de baja afinidad como las usadas para la purificación (por
ejemplo, etiquetas de MBP, GST y hexahistidina). Frecuentemente, se
emplean estrategias de inmovilización covalente, tales como la unión
de proteínas purificadas a través de restos de lisina superficiales
a grupos químicos amino-reactivos. Se acepta
generalmente que esto da lugar a la reducción de la actividad de la
proteína.
En contraste con las interacciones no covalentes
de baja afinidad descritas anteriormente, la interacción de la
biotina con estreptavidina, avidina o neutravidina muestra algunas
de las afinidades más altas conocidas en biología, con constantes de
equilibrio de disociación de 10^{-15} M (afinidad varios órdenes
de magnitud superior a las interacciones MBP-amilosa
o GST-glutatión). Aunque sigue siendo una
interacción más débil que el acoplamiento covalente, las proteínas
biotiniladas unidas a una superficie derivatizada con estreptavidina
muestran una disociación despreciable. Esta interacción proporciona,
por tanto, un medio mejorado para la unión de proteínas a una
superficie plana para aplicaciones tales como matrices proteicas y
ensayos de inmunoabsorción ligados a enzima (ELISA).
La biotina puede unirse químicamente a proteínas
(por ejemplo, usando biotina activada con NHS) o a través de
dominios de proteínas fusionadas genéticamente que se biotinilan
in vivo. Los vectores "FinPoint™" de Promega están
diseñados para facilitar la creación de fusiones con el dominio de
biotinilación (que es un fragmento de la proteína transportadora de
carboxilbiotina (BCCP) de la metilmalonil-CoA
carboxil transferasa de Propionibacterium freudenreichii
shermanii [Patente de EE.UU. 5.252.466]). Esta proteína tiene el
40% de homología con la BCCP de E. coli. Este sistema permite
la producción de fusiones BCCP-proteína capaces de
ser biotiniladas in vivo o in vitro mediante la
biotina ligasa, que permite usar la interacción muy específica
biotina-estreptavidina para la captura en
superficie. Además del dominio BCCP, Avidity Inc. [Patente de EE.UU.
5.932.433] ha comercializado péptidos cortos seleccionados por
despliegue de fagos capaces de ser biotinilados en un resto
lisina.
En este documento, los inventores describen una
nueva aproximación por la que la BCCP de E. coli se fusiona
por el extremo N o C-terminal a una pareja proteica.
Además de la función de permitir la inmovilización orientada de la
proteína de fusión a superficies compatibles de micromatrices
derivatizadas con avidina, estreptavidina o neutravidina, los
inventores describen nuevas funciones no descritas previamente de
BCCP que facilitan en gran medida la creación de bibliotecas de
proteínas humanas plegadas, de mamíferos, hongos, vegetales o
microbianas expresadas de forma soluble en sistemas heterólogos.
Los factores que determinan la solubilidad de
las proteínas recombinantes no se entienden bien y, por tanto, el
diseño racional de la solubilidad y del aumento de expresión de las
proteínas recombinantes es sólo posible hasta un grado limitado. Sin
embargo, fusionando proteínas solubles que se expresan bien al
extremo N-terminal de una proteína, ambas
propiedades pueden mejorar en gran medida en comparación con la
expresión de las ORF aisladas. Los ejemplos incluyen MBP, GST y
tiorredoxina (Trx, 109 aa; Novagen). Se piensa que un posible
mecanismo de acción es el reclutamiento de chaperonas hacia el
polipéptido naciente y la sobreexpresión conjunta de chaperonas
puede dar lugar al aumento de la producción de proteína soluble.
Algunas proteínas de fusión pueden purificarse a continuación a
través de su dominio de la proteína de fusión (por ejemplo, resina
de amilosa para MBP o resina de glutatión para GST). Aunque la
etiqueta Trx no se ha usado para la purificación de proteínas, puede
mejorar la solubilidad de muchas proteínas diana y parece catalizar
la formación de puentes disulfuro en el citoplasma de mutantes trx B
de E. coli.
Los inventores han determinado que la adición de
BCCP al extremo N-terminal o
C-terminal de una proteína aumenta la solubilidad de
la proteína de fusión y, en el caso de la adición al extremo
N-terminal al menos, aumenta la proporción de clones
en una biblioteca que expresa proteínas codificadas (con respecto a
una biblioteca que no ha sido modificada para codificar también una
etiqueta BCCP). Adicionalmente, el dominio BCCP se biotinila in
vivo. Esto es particularmente útil cuando se intenta la
purificación de multiplicidad de proteínas para la fabricación de
matrices proteicas, ya que las proteínas pueden purificarse
simultáneamente a partir de lisados celulares e inmovilizarse en una
única etapa a través de la alta afinidad y de la especificidad
mostrada por una superficie de estreptavidina. Los inventores
denominan a esta purificación e inmovilización simultáneas
"captura en superficie".
Se ha demostrado previamente que la fusión de
proteínas indicadoras (con una actividad que pueda analizarse) al
extremo C-terminal de las parejas proteicas permite
el control del plegamiento de la pareja. Ejemplos destacables de
sistemas indicadores conocidos en la técnica utilizan la proteína
fluorescente verde (GFP), la cloranfenicol acetil transferasa (CAT),
la \beta-galactosidasa y la complementación
\alpha de la \beta-galactosidasa.
Los inventores han determinado que la adición de
BCCP al extremo N-terminal o
C-terminal de una proteína permite el control del
plegamiento de la proteína de fusión mediante la medida del grado de
biotinilación in vivo. Esto puede medirse mediante
procedimientos de transferencia convencionales, usando PAGE en
presencia de SDS o lisis de colonias in situ y transferencia
de muestras a una membrana, seguido por la detección de las
proteínas biotiniladas usando un conjugado de estreptavidina, tal
como estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. De
forma importante, la adición de biotina al dominio BCCP permite la
purificación mediante captura en superficie como se describe
anteriormente.
De este modo, en un primer aspecto, la invención
proporciona el uso de un resto etiqueta que comprende un dominio de
biotinilación, para aumentar la solubilidad de una proteína de
interés mediante la unión de dicho resto etiqueta al extremo
N-terminal o C-terminal de dicha
proteína de interés.
Un resto etiqueta que comprende un dominio de
biotinilación como se define en este documento es una secuencia de
aminoácidos que comprende una proteína o dominio proteico que es
capaz de ser biotinilado o al cual puede unirse un grupo biotina. De
acuerdo con el primer aspecto de la invención, la etiqueta es
altamente soluble en el citoplasma de la célula huésped en la que se
expresa como etiqueta unida a una proteína de interés.
Esencialmente, el dominio de biotinilación de la
invención es una proteína o dominio proteico que tiene estructura
secundaria y terciaria y que se biotinila in vivo
postraduccionalmente. Generalmente, la estructura secundaria y
terciaria de la proteína o del dominio es esencial para el
reconocimiento y, por tanto, la biotinilación por la biotina ligasa
de la célula huésped en la cual tiene lugar la expresión de la
etiqueta.
Preferiblemente el dominio de biotinilación de
la etiqueta comprende la secuencia de la BCCP de E. coli
(proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (ACCB), Nº de acceso a la
base de datos Swiss-Prot P02905), cuya secuencia de
nucleótidos y de aminoácidos es:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Alternativamente, pueden usarse otras secuencias
que codifican BCCP conocidas en la técnica como el dominio de
biotinilación de la invención, por ejemplo otras proteínas BCCP de
la base de datos Swiss-Prot:
BCCA MYCLE (P46392)
Cadena alfa de la
acetil-/propionil-coenzima A carboxilasa [incluye:
biotina carboxilasa (EC 6.3.4.14); proteína transportadora de
carboxilbiotina (BCCP)] {GEN: BCCA o ML0726 o B1308_C1_129} -
Mycobacterium leprae
\vskip1.000000\baselineskip
BCCA MYCTU (P46401)
Cadena alfa de la
acetil-/propionil-coenzima A carboxilasa [incluye:
biotina carboxilasa (EC 6.3.4.14); proteína transportadora de
carboxilbiotina (BCCP)] {GEN: ACCA1 o BCCA o RV2501C o MT2576 o
MTCY07A7.07C}- Mycobacterium tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP ANASP (Q06881)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (BCCP). {GEN: ACCB}-
Anabaena sp. (cepa PCC 7120)
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP ARATH (Q42533)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa, precursor del cloroplasto
(BCCP). {GEN: CAC1 o BCCP1 o AT5G16390 o MQK4.12}- Arabidopsis
thaliana (oruga)
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP BACSU (P49786)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (BCCP). {GEN: ACCB o FABE}-
Bacillus subtilis
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP CHLMU (Q9PKR5)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (BCCP). {GEN: ACCB o
TC0399}-
Chlamydia muridarum
Chlamydia muridarum
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP CHLPN (Q9Z901)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (BCCP). {GEN: ACCB o CPN0183
o CP0585}- Chlamydia pneumoniae (Chlamydophila
pneumoniae)
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP CHLTR (O84125)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (BCCP). {GEN: ACCB o
CT123}-
Chlamydia trachomatis
Chlamydia trachomatis
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP CYACA (O19918)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (BCCP). {GEN: ACCB}-
Cyanidium caldarium [cloroplasto]
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP ECOLI (P02905)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (BCCP). {GEN: ACCB o FABE o
B3255 o Z4615 o ECS4127}- Escherichia coli, Escherichia
coli O157:H7
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP HAEIN (P43874)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (BCCP). {GEN: ACCB o FABE o
HI0971}- Haemophilus influenzae
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP LYCES (P05115)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (BCCP) (fragmento)-
Lycopersicon esculentum (tomate)
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP PORPU (P51283)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de
acetil-CoA carboxilasa (BCCP). {GEN: ACCB}-
Porphyra purpurea [cloroplasto]
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP PROFR (P02904)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
metilmalonil-CoA carboxil transferasa
(transcarboxilasa, subunidad 1.3S)- Propionibacterium
freudenreichii shermanii
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP PSEAE (P37799)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa (BCCP). {GEN: ACCB o FABE
o
PA4847}- Pseudomonas aeruginosa
PA4847}- Pseudomonas aeruginosa
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP SOYBN (Q42783)
Proteína transportadora de carboxilbiotina de la
acetil-CoA carboxilasa, precursor de cloroplasto
(BCCP). {GEN:
ACCB-1} - Glycine max (soja)
ACCB-1} - Glycine max (soja)
\vskip1.000000\baselineskip
BCCP STRMU (P29337)
Proteína transportadora de carboxilbiotina
(BCCP)- Streptococcus mutans
\vskip1.000000\baselineskip
También se incluyen dentro del alcance de la
invención los dominios de biotinilación codificados por o que
comprenden en secuencias artificiales, por ejemplo, en los que uno o
más aminoácidos han sido alterados mediante sustitución
conservadora. Estas secuencias pueden diseñarse racionalmente o
derivarse de las secuencias de BCCP dadas anteriormente mediante
procedimientos conocidos en la técnica. Es esencial que estas
secuencias tengan una estructura secundaria y terciaria que permitan
que la secuencia artificial sea reconocida y biotinilada por una
enzima biotina ligasa.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
el uso de un resto etiqueta que comprende un dominio de
biotinilación, para determinar el estado de plegamiento de una
proteína de interés mediante la unión de dicho resto etiqueta al
extremo N-terminal o C-terminal de
dicha proteína de interés.
En este segundo aspecto, el resto etiqueta que
comprende un dominio de biotinilación según se define en este
documento es una proteína o dominio proteico que se biotinila de
forma condicional mediante una enzima biotiniladora, por ejemplo, la
biotina ligasa expresada en la célula huésped en la que tiene lugar
la expresión o la biotina ligasa aplicada exógenamente, por ejemplo,
usada para biotinilar proteínas en un extracto libre de células.
Esencialmente, el dominio puede biotinilarse sólo a través del
reconocimiento de la estructura plegada del dominio por la enzima,
de modo que el dominio en forma lineal, mal plegado o agregado, por
ejemplo, en cuerpos de inclusión, no está biotinilado. El
plegamiento de la etiqueta y su consiguiente biotinilación depende
del correcto plegamiento del N-terminal de la
proteína hacia el C-terminal de la etiqueta y
viceversa.
En un tercer aspecto la invención proporciona un
procedimiento para aumentar la solubilidad de una proteína de
interés cuando se expresa en una célula huésped que comprende las
etapas de:
- a)
- unir una primera molécula de ácido nucleico que codifica un resto etiqueta que comprende un dominio de biotinilación a una segunda molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés para formar una construcción de modo que el resto etiqueta en el producto expresado de las moléculas de ácido nucleico primera y segunda combinadas comprenda dicho resto etiqueta localizado en el extremo N-terminal o C-terminal de dicha proteína de interés,
- b)
- expresar dicha construcción en una célula huésped.
En un cuarto aspecto la invención proporciona un
procedimiento para determinar el estado de plegamiento de una
proteína de interés que comprende las etapas de:
- a)
- unir una primera molécula de ácido nucleico que codifica un resto etiqueta que comprende un dominio de biotinilación a una segunda molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés para formar una construcción, de modo que el resto etiqueta en el producto expresado de las moléculas de ácido nucleico primera y segunda combinadas se localice en el extremo N-terminal o C-terminal de dicha proteína de interés;
- b)
- expresar dicha construcción en una célula huésped en condiciones tales que sólo un dominio de biotinilación plegado correctamente presente en dicho resto etiqueta se ligue con biotina.
- c)
- determinar el estado de plegamiento de la proteína de interés que comprende dicho resto etiqueta mediante la presencia o ausencia de un grupo biotina en la proteína expresada a partir de dicha construcción.
Los usos del primer y segundo aspectos de la
invención y los procedimientos del tercer y cuarto aspectos de la
invención se llevan a cabo preferiblemente de forma múltiple sobre
más de una proteína de interés. Por ejemplo, en el que la proteína
de interés está codificada por una molécula de ácido nucleico que
forma parte de una biblioteca que comprende dos o más secuencias
codificadoras diferentes y, opcionalmente, en el que diferentes
secuencias codificadoras se modifican para que contengan el resto
etiqueta y se expresen en paralelo.
Por lo tanto, en un quinto aspecto la invención
proporciona una biblioteca de proteínas plegadas en la que cada
proteína tiene un resto etiqueta en el extremo
N-terminal o C-terminal que
comprende un dominio de biotinilación que se biotinila
enzimáticamente. Estas bibliotecas pueden generarse usando técnicas
conocidas en la técnica. De forma útil, la biblioteca puede
generarse usando la metodología COVET descrita en el documento WO
01/57198.
Estas bibliotecas pueden organizarse sobre un
sustrato sólido, por ejemplo a través de la inmovilización al
sustrato mediante, por ejemplo, un enlace
estreptavidina-biotina mediante la etiqueta BCCP
presente en las proteínas de la biblioteca. Las proteínas pueden ser
proteínas solubles plegadas.
En un sexto aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para hacer dicha biblioteca de proteínas plegadas,
caracterizado por:
- a)
- proporcionar una biblioteca de dos o más secuencias codificadoras diferentes, de modo que cada secuencia codificadora comprende una segunda molécula de ácido nucleico respectiva que codifica una proteína de interés;
- b)
- modificar dichas secuencias codificadoras diferentes mediante la unión de una primera molécula de ácido nucleico, cuya primera molécula de ácido nucleico codifica un resto etiqueta que comprende un dominio de biotinilación a 5' ó 3' y en fase con la segunda molécula de ácido nucleico de cada miembro de dicha biblioteca para formar una construcción de modo que los productos expresados de la primera y segunda moléculas de ácido nucleico combinadas comprenden cada uno dicho resto etiqueta localizado en el extremo N o C-terminal de cada proteína de interés; y
- c)
- expresar dichas construcciones en paralelo en la célula huésped en condiciones tales que el dominio de biotinilación presente en el resto etiqueta de cada construcción expresada se liga in vivo con biotina cuando está correctamente plegado.
En algunas realizaciones, puede lisarse dicha
célula huésped y pueden purificarse simultáneamente dichas
construcciones a partir de los lisados celulares e inmovilizarse
sobre un soporte sólido por medio de dichos dominios biotinilados
para formar una matriz.
Los inventores han determinado también que la
adición del ADN que codifica una etiqueta BCCP en 5' y en fase con
genes de interés en una biblioteca tiene el efecto de aumentar
significativamente el número de proteínas codificadas de interés que
se expresan a partir de esta biblioteca en comparación con una
biblioteca que codifica las mismas proteínas, pero que carece de la
secuencia codificadora de la etiqueta BCCP. Estas diferencias de
expresión relativa entre bibliotecas "etiquetadas" y "no
etiquetadas" pueden detectarse o medirse cualitativamente, por
ejemplo, usando técnicas de inmunotransferencia tipo Western
conocidas en la técnica.
De este modo, en un séptimo aspecto, la
invención proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico que
codifica un resto etiqueta que comprende un dominio de biotinilación
para aumentar la proporción de clones en una biblioteca que expresan
la proteína de interés codificada por cada uno de dichos clones a
niveles detectables, por ejemplo, según se mide por
inmunotransferencia tipo Western convencional, mediante la unión de
dicha molécula de ácido nucleico que codifica dicha etiqueta en 5' y
en fase con el gen que codifica dicha proteína de interés en cada
uno de los clones.
Por consiguiente, en un octavo aspecto, la
invención proporciona un procedimiento para aumentar la proporción
de clones en una biblioteca que expresan la proteína de interés
codificada por cada uno de dichos clones en una célula huésped a
niveles detectables, que comprende las etapas de:
\newpage
- a)
- unir una primera molécula de ácido nucleico que codifica un resto etiqueta que comprende un dominio de biotinilación en 5' y en fase con una segunda molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína de interés en un miembro clonal de dicha biblioteca para formar una construcción de modo que el resto etiqueta en el producto expresado de la primera y segunda moléculas de ácido nucleico combinadas comprenda dicho resto etiqueta localizado en el extremo N-terminal de dicha proteína de interés
- b)
- expresar dicha construcción en una célula huésped.
Las características preferidas de cada aspecto
de la invención son como se define para cada uno de los otros
aspectos, cambiando lo que se deba cambiar.
Aunque las etiquetas, procedimientos y
bibliotecas de la invención son especialmente adecuados para
facilitar la expresión y purificación/inmovilización paralelas de
proteínas codificadas por una biblioteca de secuencias (mediante un
procedimiento común de solubilización y purificación de las
proteínas de interés), la invención también puede aplicarse a otras
metodologías conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede usarse una
etiqueta N-terminal o C-terminal
según la invención (por ejemplo, BCCP) para aumentar tanto la
expresión como la solubilidad proteica en:
- \bullet
- Producción de vacunas
- \bullet
- Producción de proteínas terapéuticas
- \bullet
- Producción de antígenos usados para la generación de anticuerpos monoclonales o policlonales, producción de anticuerpos monoclonales o anticuerpos de cadena única
- \bullet
- Producción de enzimas
- \bullet
- Descubrimiento de dianas de fármacos mapeando interacciones celulares proteína-proteína del "interactoma"
- \bullet
- Validación de dianas de fármacos mediante la generación de dianas proteicas de fármacos que incluyen, pero no exclusivamente, cinasas, fosfatasas, receptores celulares o proteasas para estudios de selección, enzimáticos y/o toxicológicos y cualquier otro análisis bioquímico.
Ahora se describirá la invención con más detalle
mediante los siguientes ejemplos no limitantes que se refieren a las
figuras adjuntas en las cuales:
La Figura 1 muestra los datos de la
inmunotransferencia tipo Western de colonias usando el conjugado
estreptavidina-HRP como sonda. Los clones que
expresan en fase GFP-BCCP que emiten fluorescencia
verde también están biotinilados. La última fila son clones que
portan pMSC301 (sin la secuencia del gen bccp en el plásmido)
y la señal obtenida es la señal de fondo de la AccB biotinilada
endógena. La penúltima fila son los clones portadores de pMSC302
(que sobreexpresan accB). El resto de clones negativos
(fusiones fuera de fase o vectores que habían vuelto a ligarse que
no emitían fluorescencia verde y no estaban biotinilados).
La Figura 2 muestra los datos de la
inmunotransferencia tipo Western de colonias usando el conjugado
estreptavidina-HRP como sonda. Los clones que
expresan en fase GST-GFP-BCCP que
emiten fluorescencia verde también están biotinilados. También se
muestra la proteína GST-BCCP como señal positiva de
biotinilación. El control negativo son los clones que portan pMSC301
(sin la secuencia del gen bccp en el plásmido) y la señal
obtenida es la señal de fondo de la AccB biotinilada endógena. El
control positivo es el clon portador de pMSC302 (que sobreexpresa
accB). El resto de clones negativos (fusiones fuera de fase o
vectores que habían vuelto a ligarse que no emitían fluorescencia
verde y no estaban biotinilados).
La Figura 3 muestra el análisis mediante
inmunotransferencia tipo Western del extracto proteico de células
que expresan GFP-BCCP. La señal obtenida a
aproximadamente 37 kDa es la Mr esperada de
GFP-BCCP. Otra señal que aparece a 18 kDa es la de
la proteína AccB biotinilada endógena, observada también en los
carriles negativos para GFP-BCCP. Como se esperaba,
la señal de 18 kDa es más fuerte cuando no se expresa la proteína
biotinilada recombinante.
Carriles 1, 2 y 3: Extracto proteico de los
clones portadores de pGFP-BCCP, que expresan la
proteína GFP-BCCP intacta.
Carriles 4, 5 y 6: Extracto proteico de los
clones portadores de pMSC301A, B y C, respectivamente, usados como
control negativo en el experimento.
La Figura 4 muestra el análisis por
inmunotransferencia tipo Western de los extractos proteicos de las
células que expresan GST-GFP-BCCP y
GST-BCCP. Se observan las proteínas biotiniladas con
la Mr esperada (63 kDa para
GST-GFP-BCCP y 37 kDa para
GST-BCCP). En todos los carriles está presente la
señal de 18 kDa de la AccB endógena.
Los carriles 1, 2 y 4 son extractos proteicos de
células que expresan
GST-GFP-BCCP.
El carril 3 es el extracto proteico de las
células que expresan GFP-BCCP como control positivo
en este experimento.
Carriles 5 y 6: Extracto proteico de los clones
portadores de pMSC301A y B como controles negativos en la
transferencia.
Carriles 7 y 8: Extractos proteicos de las
células que expresan GST-BCCP.
La Figura 5 muestra una inmunotransferencia tipo
Western de colonias usando estreptavidina-HRP como
sonda para la biotinilación de BCCP en la proteína de fusión. Todos
los clones que estaban marcados por emitir fluorescencia verde al
ser excitados a una longitud de onda de 365 nm, también estaban
biotinilados (señal positiva por encima del fondo). Las intensidades
de las señales positivas varían según el fenotipo verde. El aumento
de la sensibilidad de detección usando el conjugado
estreptavidina-HRP, permite seleccionar pocos clones
adicionales.
La Figura 6 muestra los resultados de la
expresión proteica del grupo de genes humanos clonados en el vector
Avi-Tag
pQE82L-GFP-biotina. Se usaron
colonias individuales resistentes a la ampicilina para inocular 1 ml
de medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina
(LB-Amp) y se cultivaron durante toda la noche a
37ºC con agitación. Al día siguiente se hizo una dilución 1:100 en
medio LB-Amp recién preparado y se cultivaron las
células a 37ºC hasta una DO_{600} de 0,6 a 1,0. A continuación se
añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y se continuó el
crecimiento a 30ºC durante 4 horas. A continuación, se tomaron 10
\mul del cultivo celular y se analizaron mediante
inmunotransferencia tipo Western del PAGE al 4-20%
en presencia de SDS con estreptavidina conjugada con HRP. Los
números marcados de cada carril hacen referencia al nºB de la Tabla
1. Los marcadores de peso molecular son: aprotina (7,6 kDa),
lisozima (18,4 kDa), inhibidor de la tripsina de soja (32,5 kDa),
anhidrasa carbónica (45,7 kDa), BSA (78 kDa),
B-galactosidasa (132 kDa) y miosina (216 kDa).
La Figura 7 muestra los resultados de la
expresión proteica del grupo de genes humanos clonados en el vector
que expresa BCCP, pMD004. Se usaron colonias individuales
resistentes a ampicilina para inocular 1 ml de medio LB que contenía
100 \mug/ml de ampicilina (LB-Amp) y se cultivaron
durante toda la noche a 37ºC con agitación. Al día siguiente se hizo
una dilución 1:100 en medio LB-Amp recién preparado
y las células se cultivaron a 37ºC hasta una DO_{600} de 0,6 a
1,0. Se añadió a continuación IPTG a una concentración final de 1 mM
y se continuó el crecimiento a 30ºC durante 4 horas. A continuación
se tomaron 10 \mul del cultivo celular y se analizaron mediante
inmunotransferencia tipo Western del PAGE al 4-20%
en presencia de SDS con estreptavidina conjugada con HRP. Los
números marcados de cada carril hacen referencia al nº B de las
Tablas 1 y 2. Los marcadores de peso molecular son: aprotina (7,6
kDa), lisozima (18,4 kDa), inhibidor de la tripsina de soja (32,5
kDa), anhidrasa carbónica (45,7 kDa), BSA (78 kDa),
B-galactosidasa (132 kDa) y miosina (216 kDa).
La Figura 8 muestra los mapas plasmídicos de
pMD002 y pMD004.
La Figura 9 muestra un mapa plasmídico de
pIFM101A/B/C
La Figura 10 muestra el sitio de clonación del
plásmido pIFM101A
La Figura 11 muestra el sitio de clonación del
plásmido pIFM101B
La Figura 12 muestra el sitio de clonación del
plásmido pIFM101C
Ejemplo
1
La secuencia de ADN que codifica la región
codificadora completa de la acetil-CoA carboxilasa
se amplificó mediante PCR a partir del ADN genómico de las células
XL 1-Blue (Stratagene) usando los siguientes
cebadores específicos de genes.
accbsen1: 5'
GATGGATCCGATATTCGTAAGATTAAAAAACTGATCG 3' con el sitio
BamHI en el extremo 5'.
bccpcompl: 5'
GATGAGCTCAAGCTTTTACTCGATGACGACCAGCGGCTCGTC 3' que contiene
los sitios
SacI y HindIII.
SacI y HindIII.
La amplificación por PCR se realizó usando la
polimerasa Pwo (Roche) usando las condiciones de ciclos
convencionales (5 min a 94ºC; 30 s a 94ºC; 1 min a 64ºC; 1 min a
72ºC; 30 ciclos; 5 min a 72ºC).
La secuencia génica amplificada por PCR se clonó
en los sitios BamHI y SacI del vector de expresión
pQE-80 de E. coli (Qiagen) en fase con la
etiqueta de hexahistidina en el extremo N-terminal
para formar el plásmido pMSC302. La identidad de la secuencia génica
se confirmó mediante mapeo de restricción y secuenciación del ADN.
La secuencia de ADN que corresponde al dominio
C-terminal de AccB, conocida como proteína
transportadora de carboxilbiotina (BCCP), se amplificó mediante PCR
usando el mismo cebador complementario que anteriormente y un nuevo
cebador sentido.
bccpsenl: 5'
GATCTGCAGGGCTCCGCAGCAGCGGAAATCAGTGGTCACATCG 3' que contiene
el sitio PstI para la clonación y dos codones adicionales
para glicina y serina.
El vector pQE-80 se volvió a
diseñar para delecionar la secuencia de ADN de la etiqueta de
hexahistidina, añadir sitios de clonación adicionales (NotI y
SfiI) y tener tres fases de lectura diferentes desde el ATG
inicial (pMSC301A/B/C). Esto se realizó mediante PCR inversa usando
los grupos de cebadores; pQEcomp1: 5'P
CATAGT
TAATTTCTCCTCTTTAATGAATTCTG 3'; pQEsen1: 5' GCGGCCGCGGCCATTACGGCCGGATCCGCATGCGA
GCTCGG TACCCCC 3'; pQEsen2: 5' G + pQEsen1; pQEsen3: 5' GC + pQEsen1 para las fases de lectura A, B y C, respectivamente. La PCR se realizó usando la polimerasa Pwo (2 min a 94ºC; 30 s a 94ºC; 1 min a 63,5ºC; 6 min a 72ºC; 25 ciclos; 10 min a 72ºC).
TAATTTCTCCTCTTTAATGAATTCTG 3'; pQEsen1: 5' GCGGCCGCGGCCATTACGGCCGGATCCGCATGCGA
GCTCGG TACCCCC 3'; pQEsen2: 5' G + pQEsen1; pQEsen3: 5' GC + pQEsen1 para las fases de lectura A, B y C, respectivamente. La PCR se realizó usando la polimerasa Pwo (2 min a 94ºC; 30 s a 94ºC; 1 min a 63,5ºC; 6 min a 72ºC; 25 ciclos; 10 min a 72ºC).
La secuencia del gen bccp se clonó en los
sitios PstI-HindIII de los vectores pMSC301A, B y C
para generar pMSC30IA, B, C/BCCP.
La secuencia de ADN que codifica GFPuv
(Clontech) se amplificó mediante PCR usando el grupo de cebadores
pQEGFPsen1: 5' GGGCCGGTGGCAGCGCGAGTAAAGGAG AAGA ACTTITCACTGG
3' (con medio sitio SmaI y una región enlazadora) y
pQEGFPcomp1: 5' GATCTGCAGGGTACCGGATCCTTTGTAGAGCTCATCCATGCC 3'
(con los sitios PstI, KpnI y BamHI). El
producto amplificado por PCR se clonó en los sitios
SmaI-PstI de
pMSC301A, B y C/BCCP en fase con la secuencia de ADN que codifica el extremo N-terminal de BCCP (GFP-BCCP) para generar los vectores pMSC303A, B y C.
pMSC301A, B y C/BCCP en fase con la secuencia de ADN que codifica el extremo N-terminal de BCCP (GFP-BCCP) para generar los vectores pMSC303A, B y C.
La construcción plasmídica pMSC303B se cortó con
la enzima de restricción NotI, los extremos cohesivos se
hicieron romos rellenándolos con la reacción de polimerasa T4 (NEB),
se cortó con la enzima de restricción SmaI y se volvió a
ligar (el plásmido se denominó pGFP-BCCP).
Los vectores pMSC301A/BCCP y pMSC303A se
cortaron con la enzima de restricción NotI, los salientes se
hicieron romos usando la ADN polimerasa T4, se cortaron con la
enzima de restricción SmaI y se usaron para clonar el
fragmento de ADN que codifica GST formando las construcciones
plasmídicas pGST-BCCP y
pGST-GFP-BCCP, respectivamente. La
secuencia de ADN que codifica GST se amplificó mediante PCR usando
los cebadores; GSTsen01: 5' TCCCCTATACTAGGTTATTGG 3' y GSTcompexoN:
5' GGGCGTCACGA TGAATTCCCGGG 3' y pGEX-2T (Pharmacia)
como molde.
Los sitios de clonación NotI y
SfiI de los vectores pMSC303A, B y C se sustituyeron por el
sitio de restricción compatible con el saliente de SfiI,
DraIII para generar los vectores pIFM101A, B y C. Esto se
realizó mediante PCR inversa usando los cebadores, DrasenA: 5'
CACTTAGTGGGATCCGCATGCGAGCTCGGTACCCC 3'; DrasenB: 5' G + DrasenA;
DrasenC: GA + DrasenA. El cebador complementario usado fue pQEcomp1
como se ha descrito anteriormente. Las condiciones de la PCR usadas
fueron las mismas que anteriormente.
Un grupo de deleciones anidadas encajadas en los
extremos 3' de los ADNc de corazón humano (Clontech) se clonaron en
los sitios DraIII-SmaI de los vectores pIFM101A, B y C
para formar el plásmido
pX-GFP-BCCP.
La secuencia correcta de ADN de todas las
construcciones usadas en el estudio se confirmó mediante
secuenciación.
Se usó la metodología COVET para generar el
grupo de deleción que es el tema de las solicitudes de patente
números GB0020357.0, USSN 60/247995 y WO 01/57198. Brevemente,
\sim100 ng de la biblioteca de plásmidos molde (biblioteca de ADNc
de corazón humano en pDNR-LIB de Clontech) se
amplificó mediante PCR usando los cebadores específicos de vector
SP5sentido: 5' ATGCTCATGAGGCCGGCCGGGAATTC GGCCATTACG
GCCGG 3' con los sitios FseI y SfiI y
SP3complementario: 5' GTCTAGAAAGCTTCTCGAGGGCCG 3', para incorporar
de forma óptima dTTP alfa-fosfotioato
(\alpha-S-dTTP; Amersham). La
reacción de PCR se realizó usando 50 pmol de cada cebador, 2,5
unidades de polimerasa termoestable (sin actividad exonucleasa 3' a
5', por ejemplo, la polimerasa Taq), un tampón convencional y la
mezcla de desoxinucleótidos trifosfato: dATP 200 \muM, dGTP 200
\muM, dCTP 200 \muM, dTTP 100 \muM,
\alpha-S-dTTP 100 \muM. Los
productos amplificados por PCR se purificaron usando los kits de
limpieza de PCR QIAquick (Qiagen) y se sometieron a digestión con
FseI para producir un saliente de nucleótidos 3' que protege
el extremo 5' del ADNcd de la posterior hidrólisis por la
exonucleasa III (NEB). La digestión con la exonucleasa III se
realizó usando las condiciones convencionales y la presencia de
enlaces fosfotioato internucleótido bloqueaba cualquier hidrólisis
adicional. Esto generaba un grupo anidado de deleciones 3' de hebras
codificantes. Se usó la nucleasa de judía mungo (New England
Biolabs) para eliminar el ADNcs de la hebra complementaria y, por
tanto, hacer romos los ADNcd en preparación para la clonación
direccional tras la digestión adicional con SfiI. Estas
inserciones, tras el fraccionamiento por tamaño mediante
electroforesis en gel de agarosa, se clonaron en los sitios
DraIII y SmaI de los vectores pIFM101A, B y C. A
continuación, los productos ligados se usaron para transformar
células XL1-Blue (Stratagene).
Las cepas XL1-Blue o
XL10-Gold de E. coli (Stratagene) se usaron
como células huéspedes y se transformaron (electroporación o
procedimiento químico) usando diversas construcciones plasmídicas.
La mezcla de transformación se sembró en placas a una dilución
apropiada sobre una membrana de nitrocelulosa colocada sobre Agar LB
que contenía carbenicilina a 100 \mug/ml. Después de incubar
durante toda la noche a 30ºC las membranas se transfirieron a Agar
LB que contenía IPTG 400 \muM y carbenicilina, y se incubaron
durante otras 4-5 horas a 30ºC. La actividad GFP de
los clones se evaluó visualizando los clones a una longitud de onda
de 365 nm del transiluminador UV. Las membranas se procesaron
detectando BCCP o GFP biotiniladas. Para analizar las proteínas
mediante inmunotransferencia tipo Western se indujo la fase
semilogarítmica en los cultivos (densidad óptica a 600 nm de 0,5 a
0,6) añadiendo 400 \muM de IPTG al cultivo y continuó el
crecimiento de las células durante otras 3-4 horas a
30ºC. Al final del periodo de inducción, las células se recogieron,
las proteínas se resolvieron en un gel en gradiente del
10-20% en presencia de SDS (Invitrogen), se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubó con
diversos anticuerpos o estreptavidina.
La biotinilación de BCCP se detectó incubando
con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de
rábano picante (HRP) (Amersham) las transferencias de colonias (como
se describe) o las inmunotransferencias tipo Western como se conoce
en la técnica.
Los clones se cuadricularon automáticamente, o
la mezcla de transformación se sembró en placas, sobre una membrana
de nitrocelulosa (Amersham) colocada sobre una placa de agar LB que
contenía carbenicilina. Tras incubar durante toda la noche a 30ºC,
la membrana se colocó sobre una placa de LB agar nueva que contenía
carbenicilina e IPTG (400 \muM). La placa se incubó durante otras
4-5 horas a 30ºC. Las colonias de la membrana se
sometieron a lisis alcalina y la membrana se bloqueó antes de la
adición de la sonda. La membrana se coloca primero en dos hojas de
papel Whatmann 3 empapadas previamente con NaOH 0,5 (M), NaCl 1,5
(M) durante 10 min. La membrana se neutraliza colocándola sobre
hojas de Whatmann 3 empapadas con TrisHCl 1 (M), pH 7,5, NaCl 1,5
(M) durante 5 min, dos veces. Entonces, la membrana se transfiere
sobre hojas Whatmann 3 empapadas en PBS-T (0,1%) con
SDS al 1% durante 10 min. A continuación la membrana se lava
extensamente en PBS-T para asegurar que todos los
restos celulares se han eliminado. La transferencia está entonces
lista para ser procesada de la misma manera que una
inmunotransferencia tipo Western.
El conjugado estreptavidina-HRP
se usó a una dilución de 1:4.000 y la señal se detectó mediante
quimioluminiscencia usando el sistema ECL de Amersham.
La fluorescencia verde de GFP se visualizó
mediante excitación de las colonias a una longitud de onda de 365 nm
usando un transiluminador.
Se usó un anticuerpo monoclonal
anti-GST (Sigma) como sonda inmune para detectar la
expresión de GST. El anticuerpo se usó a una dilución de (1:3.000) y
la señal inmunorreactiva se detectó usando el sistema ECL de
Amersham.
Las figuras 1 y 2 muestran los datos de las
inmunotransferencias tipo Western de colonias usando como sonda
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Sólo la
correcta fusión en fase de
GST-GFP-BCCP,
GST-BCCP y GFP-BCCP daba fuertes
señales significativamente positivas por encima del fondo general de
la AccB biotinilada endógena. Las fusiones fuera de fase, resultado
de la estrategia de clonación usada, no daban lugar a señales
positivas. Todas y sólo las proteínas de fusión biotiniladas
(GST-GFP-BCCP y
GFP-BCCP) emitían fluorescencia verde cuando se
excitaban a 365 nm. La fluorescencia es indicativa del plegamiento
correcto de la proteína de fusión y este resultado demuestra que las
proteínas con BCCP plegadas correctamente como pareja de fusión en
C-terminal es un sustrato activo para la proteína
biotina ligasa (BLP). Las figuras 3 y 4 muestran que las proteínas
biotiniladas tiene el peso molecular esperado, lo que confirma que
las proteínas están intactas y sin digerir proteolíticamente.
\newpage
Los ADNc de corazón humano se encajaron en los
extremos 3' para eliminar de este modo el codón de terminación de
las ORF usando una digestión controlada con Exonucleasa III (NEB).
Este grupo de deleción anidada 3' se clonó a continuación en los
vectores pIFM101A, B y C (véanse las Figuras 9 a 12). La biblioteca
de las fusiones resultantes para GFP-BCCP estará
dentro o fuera de fase. Las proteínas de fusión en fase cuando se
expresan como proteínas correctamente plegadas emiten fluorescencia
verde con luz ultravioleta a 365 nm (GFP es un marcador visual de
plegamiento) y también estaban biotilinadas. La figura 5 muestra una
inmunotransferencia tipo Western de colonias incubada con un
conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano
picante. Los valores positivos (significativamente por encima del
fondo) son aquellos que se marcaban de verde cuando se visualizaban
a 365 nm. Sólo 4 de 36 estaban biotinilados pero no se veían verdes.
Esto podría ser debido al hecho de que el procedimiento de detección
usado para la biotinilación de BCCP es mucho más sensible que la
detección visual de fluorescencia verde.
En este experimento muchas de las proteínas de
fusión estarían en fase con GFP-BCCP, pero no
emitirían fluorescencia verde ya que no se habrían plegado
correctamente y son insolubles. Los datos de la inmunotransferencia
tipo Western con estreptavidina-HPR con un conjunto
de complejos proteicos de fusión (Figura 5) muestran que sólo cuando
las proteínas de fusión se pliegan correctamente o son solubles,
según se evaluó mediante la fluorescencia verde de GFP, el dominio
BCCP de la proteína de fusión está biotilinado. Estas observaciones
demuestran que la biotinilación de BCCP en la proteína de fusión es
un marcador de fusión como lo es la fluorescencia verde de la GFP.
Puesto que se conoce en la técnica que GFP es un indicador fiable
del plegamiento correcto, entonces, estos resultados demuestran que
la biotinilación de BCCP también es un indicador fiable del
plegamiento correcto.
Ejemplo
2
Vectores. Los plásmidos
pQE82L-GFP-biotina y pMD004 (Figura
8) se construyeron mediante técnicas convencionales (T. Maniatis y
col (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Press) y ambos están compuesto de un vector esqueleto pQE82L
(Qiagen), con una etiqueta RGS-His seguida de la
secuencia "Avi-Tag" o del dominio de la
proteína BCCP, respectivamente, seguido de un sitio de clonación
múltiple. Codifican el represor lacl^{q} para una regulación
estrecha del promotor T5 y cuando se cortan con SmaI y
Notl liberan los fragmentos rellenos GFP o p53 para dar los
vectores listos para la clonación del gen insertados en un extremo
romo 5' fosforilado y un extremo cohesivo 3' NotI.
Producción de inserciones génicas. Se
eligieron dominios de proteínas humanas y los genes correspondientes
se amplificaron por PCR a partir de las bibliotecas de ADNc. Los
cebadores sentido fosforilados en 5' están compuestos de los
primeros 24 pb del inicio de la secuencia relevante, empezando con
un codón completo. Algunos de los cebadores sentido son más largos,
incorporando una G o una C en el extremo 3'. Los cebadores
complementarios de los 24 últimos pb de la secuencia relevante (más
larga si es necesario para incorporar una G o una C en el extremo
5') que entonces se adjunta al inicio del molde cebador
complementario (TGATAGAAGAGCGGCCGC). El cebador complementario
final podría ser el complemento inverso de éste. Este cebador da
lugar al codón de iniciación de todas las fusiones definidas y
seguidas de un sitio NotI para la clonación en el vector
etiquetado en el extremo N-terminal descrito
anteriormente. Se mezclaron dos cebadores de ADNc a una
concentración final de 10 ng/\mul. Estos eran a) biblioteca
plasmídica de ADNc de corazón humano (Life Technologies) y b)
biblioteca plasmídica de ADNc de células HeLa (Invitrogen). Todos
los cebadores se reconstituyeron en agua destilada a 100
pmoles/\mul. Se preparó una mezcla patrón (sin cebadores) a partir
de: molde (10 \mug), tampón de la polimerasa PWO con sulfato de
magnesio (concentración final 1x), dNTP (concentración final de 5
mM), polimerasa PWO (2,5 unidades), dimetilsulfóxido (concentración
final al 10%) y agua destilada hasta un volumen final de 48 \mul
por reacción. La mezcla patrón se alicuotó en placas de PCR de 96
pocillos (Eppendor) y se añadió 1 \mul de cada cebador en hielo.
Las condiciones fueron las siguientes: 3 min a 94, a continuación 30
seg a 94, 30 seg a 59, 2 min a 72 (32 ciclos) y finalmente, 7 min a
72. Los productos se analizaron en geles de agarosa al 2%/TBE y se
purificaron usando columnas de purificación para PCR Qiaquick
(Qiagen). El ADNcd limpio se digirió con NotI en una mezcla
patrón de digestión y se limpió una vez más.
Ensayo de Hoescht 33258. Para cuantificar
el ADNcd en la preparación de clonación, se estableció una curva
patrón de corto intervalo de un producto de PCR limpio no
relacionado a 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0 ng/100 \mul en
colorante Hoescht a 1:1.000 (patrón a 1 mg/ml)/1xTNE (Tris 10 mM,
EDTA 1 mM, NaCl 0,2 M, pH 7,4). Se añadió 1 \mul de producto de
cada PCR experimental a 99 \mul de Hoescht/TNE a 1:1.000, se
mezclaron en placas de microvaloración de 96 pocillos de pared negra
y fondo claro (Corning) y se leyó la fluorescencia a 365/465 nm. Se
dibujó la curva patrón y se calculó el contenido de ADNdc de cada
"preparación insertada" en ng/\mul.
Clonación de las inserciones en
pQE82L-GFP-biotina o pMD004. Las
inserciones se ligaron a las preparaciones del vector a una relación
molar aproximada de 3:1 (inserción:vector). Los ligamientos se
realizaron en una placa de PCR de 96 pocillos con el kit de
ligamiento rápido de ADN (Roche). Los ligamientos (2 \mul de cada
uno) se usaron para transformar 30 \mul de células
Supercompetentes Gold-XL1 (Stratagene), según el
protocolo, en una placa de PCR de 96 pocillos de pared delgada. Tras
un choque térmico, se añadieron las transformaciones a 300 \mul de
medio SOC precalentado en placas de 96 pocillos profundos y se
agitaron a 37ºC durante 45 minutos. Se sembraron sobre placas 200
\mul de cada una y se incubaron durante toda la noche a 37ºC. Se
usaron para cada ligamiento aproximadamente 0,02 pmoles del vector.
Los clones resistentes a la ampicilina se analizaron mediante PCR de
colonias para comprobar el tamaño correcto de la inserción y se
tomaron los clones positivos para un análisis de expresión.
Expresión de la proteína. Se usaron
colonias individuales resistentes a ampicilina para inocular 1 ml de
medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina
(LB-Amp) y se cultivaron durante toda la noche a
37ºC con agitación. Al día siguiente se hizo una dilución 1:1000 en
medio LB-Amp nuevo y se cultivaron las células a
37ºC hasta una DO_{600} de 0,6 a 1,0. A continuación se añadió
IPTG a una concentración final de 1 mM y se continuó el crecimiento
a 30ºC durante 4 horas. Se tomaron después 10 \mul del cultivo
celular y se analizaron mediante inmunotransferencia tipo Western
del PAGE al 4-20% en presencia de SDS como se
describe y se incubó con estreptavidina conjugada con HRP.
Para comprobar que el dominio BCCP puede ayudar
al plegamiento de la proteína, se clonó un grupo definido de 49
proteínas humanas en los sitios SmaI/NotI de dos
vectores diferentes:
pQE82L-GFP-biotina o pMD004 (Figura
8). La expresión de proteínas a partir de estas construcciones daba
lugar a proteínas expresadas con un corto péptido etiqueta (19 aa)
en el extremo N-terminal (compuesto de una secuencia
hexahistidina seguido de la secuencia "Avi-Tag"
(www.avidity.com; patente de EE.UU.: 5.932.433) para
pQE82L-GFP-biotina o como fusiones
del extremo C-terminal de la proteína BCCP de E.
coli (pMD004). Se observó una proporción satisfactoria
significativamente mayor para la producción de proteínas solubles
cuando las proteínas se expresaban como fusiones con la proteína
BCCP (véanse las Figuras 6 y 7), como se resume en la Tabla 1. Por
ejemplo, cuando se fusionaban con el dominio BCCP, el 98% de las
proteínas se expresaban en forma soluble en comparación con cuando
se expresaban en ausencia del dominio BCCP, cuando sólo se podía
observar el 48% de la expresión, del que el 81% era soluble. La
observación de que se expresa un mayor número total de clones a
partir del vector pMD004 en comparación con la expresión del
pQE82L-GFP-biotina no puede
explicarse mediante la "regla del extremo amino" donde los
aminoácidos del extremo N-terminal pueden ser
cruciales para determinar su dirección hacia el proteosoma para la
degradación (Rao H, Uhlmann F, Nasmyth K, Varshavsky A. (2001)
Nature, 410, 955-9), ya que los 12
aminoácidos del extremo N-terminal de ambas
construcciones son idénticos. La explicación más probable es que las
construcciones expresadas con un dominio BCCP
N-terminal ayudan al plegamiento de las proteínas
antes del extremo 5', lo que previene la dirección de las proteínas
plegadas incorrectamente al proteosoma. Esto también se ve apoyado
por la observación de que se expresaban más proteínas de forma
soluble cuando se expresaban después del extremo 3' de BCCP en
comparación con la expresión del vector
pQE82L-GFP-biotina. El mecanismo por
el cual BCCP ayuda al plegamiento de dominios proteicos después del
extremo 3' podría ser el reclutamiento de chaperonas o el aumento de
la solubilidad general de la proteína de fusión.
Los resultados presentados en este documento
indican claramente que el dominio BCCP puede aumentar el número
total de clones que expresan proteína soluble cuando se expresa como
una fusión en el extremo N-terminal de la proteína
diana. Además, el resultado indica que el dominio BCCP puede
aumentar la solubilidad de una proteína de interés. La estrecha
correlación observada entre la biotinilación y la solubilidad de
fusiones expresadas demuestra que la biotinilación de BCCP actúa
como un marcador de plegamiento cuando se fusiona al extremo
N-terminal de una proteína de interés. Además, la
capacidad de la proteína BCCP para ser biotinilada proporciona un
medio altamente específico para capturar la proteína en una
superficie de estreptavidina.
Se eligieron proteínas y se clonaron las
inserciones génicas correspondientes en el
pQE-GFP-biotina (vector 1) o en el
BCCP pMD004 (vector 2) dando lugar a fusiones con el extremo
C-terminal de un péptido
hexahistidina-Avi-Tag o una proteína
hexahistidina-BCCP. Sólo se compararon las
inserciones clonadas en ambos vectores en términos de expresión de
proteínas. Claves para la tabla: ^{1}Número de codificación
interno: ^{2}Número de acceso a la base de datos de proteínas
(www.oca.ebi.ac.uk). ^{3}Longitud del gen de ADN en pares de
bases. ^{4}Tamaño de la proteína en aminoácidos (aa) cuando se
expresa como fusión con BCCP. ^{5}Tamaño de la proteína en
kilodalton (kda) cuando se expresa como fusión con BCCP.
^{6}Región de ORF clonada (aa). C: clonado pero sin expresión; H:
que expresa de una proteína positiva para hexahistidina en una
inmunotransferencia tipo Western de un PAGE en presencia de SDS; B:
que expresa de una proteína positiva para biotina en una
inmunotransferencia tipo Western de un PAGE en presencia de SDS, S:
que expresa proteína soluble.
Claims (23)
1. Uso de un resto etiqueta que comprende un
dominio de biotinilación para aumentar la solubilidad de una
proteína de interés mediante la unión de dicho resto etiqueta al
extremo N-terminal o C-terminal de
dicha proteína de interés.
2. Uso de un resto etiqueta que comprende un
dominio de biotinilación para determinar el estado de plegamiento de
una proteína de interés mediante la unión de dicho resto etiqueta al
extremo N-terminal o C-terminal de
dicha proteína de interés.
3. Uso de una molécula de ácido nucleico que
codifica un resto etiqueta que comprende un dominio de biotinilación
para aumentar la proporción de clones en una biblioteca que expresan
la proteína de interés codificada por cada uno de dichos clones a
niveles detectables mediante la unión de dicha molécula de ácido
nucleico que codifica dicha etiqueta en 5' y en fase con el gen que
codifica dicha proteína de interés en cada uno de dichos clones.
4. Un procedimiento para aumentar la solubilidad
de una proteína de interés cuando se expresa en una célula huésped
caracterizado por:
a) unir una primera molécula de ácido nucleico
que codifica un resto etiqueta que comprende un dominio de
biotinilación a una segunda molécula de ácido nucleico que codifica
dicha proteína de interés para formar una construcción de modo que
el resto etiqueta en el producto expresado de las moléculas de ácido
nucleico primera y segunda combinadas se localiza en el extremo
N-terminal o C-terminal de dicha
proteína de interés; y
b) expresar dicha construcción en una célula
huésped.
5. Un procedimiento para determinar el estado de
plegamiento de una proteína de interés caracterizado
por:
a) unir una primera molécula de ácido nucleico
que codifica un resto etiqueta que comprende un dominio de
biotinilación a una segunda molécula de ácido nucleico que codifica
dicha proteína de interés para formar una construcción de modo que
el resto etiqueta en el producto expresado de las moléculas de ácido
nucleico primera y segunda combinadas se localiza en el extremo
N-terminal o C-terminal de dicha
proteína de interés;
b) expresar dicha construcción en una célula
huésped en condiciones tales que sólo un dominio de biotinilación
plegado correctamente presente en dicho resto etiqueta se liga con
biotina; y
c) determinar el estado de plegamiento de la
proteína de interés que comprende dicho resto etiqueta mediante la
presencia o ausencia de un grupo de biotina en la proteína expresada
a partir de dicha construcción.
6. Un procedimiento para aumentar la proporción
de clones en una biblioteca que expresan la proteína de interés
codificada por cada uno de dichos clones en una célula huésped a
niveles detectables, caracterizado por:
a) unir una primera molécula de ácido nucleico
que codifica un resto etiqueta que comprende un dominio de
biotinilación en 5' y en fase con una segunda molécula de ácido
nucleico que codifica dicha proteína de interés en un miembro clonal
de dicha biblioteca para formar una construcción de modo que el
resto etiqueta en el producto expresado de la primera y segunda
moléculas de ácido nucleico combinadas comprende dicho resto
etiqueta localizado en el extremo N-terminal de
dicha proteína de interés; y
b) expresar dicha construcción en una célula
huésped.
7. El uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, caracterizado porque dicha proteína de
interés está codificada por una molécula de ácido nucleico que forma
parte de una biblioteca que comprende dos o más secuencias
codificadoras diferentes.
8. El uso según la reivindicación 7,
caracterizado porque dichas secuencias codificadoras
diferentes se modifican para contener dicho resto etiqueta y se
expresan en paralelo.
9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1, 2, 7 u 8, caracterizado porque dicho dominio de
biotinilación es la Proteína Transportadora de Carboxilbiotina
(BCCP).
10. El uso de la reivindicación 9, en el que
dicha BCCP es BCCP de E. coli.
11. Un procedimiento según la reivindicación 4 o
la reivindicación 5, caracterizado porque dicha proteína de
interés está codificada por una molécula de ácido nucleico que forma
parte de una biblioteca que comprende dos o más secuencias
codificadoras diferentes.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque dichas secuencias codificadoras
diferentes se han modificado para contener dicho resto etiqueta y se
expresan en paralelo.
13. Un procedimiento según las reivindicaciones
4, 5, 11 ó 12, caracterizado porque dicho dominio de
biotinilación es BCCP.
14. Un procedimiento según la reivindicación 13,
en el que dicha BCCP es BCCP de E. coli.
15. Una biblioteca de proteínas plegadas en la
que cada proteína tiene un resto etiqueta en el extremo N o
C-terminal que comprende un dominio de biotinilación
que esta biotinilado enzimáticamente.
16. Una biblioteca según la reivindicación 15,
en la que dichas proteínas se inmovilizan sobre un sustrato sólido
mediante dicho dominio biotinilado para formar una matriz.
17. Una biblioteca según la reivindicación 16,
caracterizada porque dicho sustrato sólido comprende una
superficie de estreptavidina.
18. Una biblioteca según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, caracterizada porque dicho dominio
de biotinilación es BCCP.
19. Una biblioteca según la reivindicación 18,
en la que dicha BCCP es BCCP de E. coli.
20. Un procedimiento para hacer una biblioteca
de proteínas plegadas según cualquiera de las reivindicaciones 15 a
19, caracterizado por:
a) proporcionar una biblioteca de dos o más
secuencias codificadoras diferentes, comprendiendo cada secuencia
codificadora una segunda molécula de ácido nucleico respectiva que
codifica una proteína de interés;
b) modificar dichas secuencias codificadoras
diferentes uniendo una primera molécula de ácido nucleico, cuya
primera molécula de ácido nucleico codifica un resto etiqueta que
comprende un dominio de biotinilación en 5' ó 3' y en fase con la
segunda molécula de ácido nucleico de cada miembro de dicha
biblioteca para formar una construcción de modo que los productos
expresados de las moléculas de ácido nucleico primera y segunda
combinadas comprendan cada uno dicho resto etiqueta localizado en
los extremos N o C-terminal de cada proteína de
interés; y
c) expresar dichas construcciones en paralelo en
una célula huésped en condiciones tales que el dominio de
biotinilación presente en el resto etiqueta de cada construcción
expresada se liga in vivo con biotina cuando se pliega
correctamente.
21. Un procedimiento según la reivindicación 20,
que comprende adicionalmente lisar dicha célula huésped y purificar
e inmovilizar simultáneamente dichas construcciones expresadas a
partir de los lisados celulares sobre un soporte sólido mediante
dichos dominios biotinilados para formar una matriz.
22. Un procedimiento según la reivindicación 21,
en el que dicho sustrato sólido comprende una superficie de
estreptavidina.
23. Una biblioteca de moléculas de ácido
nucleico que codifican una biblioteca de proteínas plegadas según
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizada
porque cada secuencia codificadora se modifica para incorporar un
resto etiqueta que comprende un dominio de biotinilación en el
extremo N-terminal o C-terminal de
la proteína codificada.
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