ES2268711T3 - Polipeptidos y polinucleotidos relacionados con las subunidades alfa y beta de las glutamo deshidrogenasas y procedimientos de utilizacion. - Google Patents
Polipeptidos y polinucleotidos relacionados con las subunidades alfa y beta de las glutamo deshidrogenasas y procedimientos de utilizacion. Download PDFInfo
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Abstract
SE DESCRIBEN UNAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS Y NUCLEOTIDOS RELATIVOS A LA ENZIMA GLUTAMATO DESHIDROGENASA (GDH). LAS ENZIMAS GDH AQUI DESCRITAS SE DESCUBRIERON EN EL ALGA CHLORELLA SOROKINIANA EN FORMA DE SIETE DIFERENTES ISOENZIMAS INDUCIBLES. ESTAS ISOENZIMAS SE ENCUENTRAN EN LAS ALGAS COMO HEXAMEROS LOCALIZADOS EN CLOROPLASTOS COMPUESTOS DE SUBUNIDADES ALFA- Y BETA-. LAS PLANTAS TRANSFORMADAS CON SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LAS SUBUNIDADES ALFA- O BETA- MUESTRAN UNA MEJORA DE LAS PROPIEDADES ENZIMATICAS COMO, POR EJEMPLO, AUMENTO DEL CRECIMIENTO Y MEJORA DE LA TOLERANCIA A LA TENSION. UN HETEROHEXAMERO CON AMBAS SUBUNIDADES AL - Y BE - PUEDE TENER UNA RELACION DE ACTIVIDAD AMINACION:DESAMINACION MAS ELEVADA QUE LOS AL - Y BE - HOMOHEXAMEROS.
Description
Polipéptidos y polinucleótidos relacionados con
las subunidades alfa y beta de las glutamato deshidrogenasas y
procedimientos de utilización.
El nitrógeno inorgánico adquirido por las
plantas se convierte finalmente en amonio antes de ser asimilado en
el metabolismo del nitrógeno orgánico. Se ha postulado que un enzima
implicado en el proceso de asimilación es la glutamato
deshidrogenasa (GDH), un grupo de enzimas ubicuos presentes en casi
todos los organismos desde los microbios a los vegetales superiores
y animales [Srivastava, H.S., R.P. Singh, Phytochem.
26:597-610 (1987)]. La GDH cataliza la conversión
reversible del \alpha-cetoglutarato a glutamato
mediante una aminación reductora que utiliza como cofactor al
\beta-nicotinamida-adenina
dinocleótido reducido (NADH) o el
\beta-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
reducido (NADPH). La función de las GDH vegetales en la asimilación
del amonio en aminoácidos ha sido cuestionada desde el
descubrimiento de la senda glutamina sintetasa/glutamato sintasa
(GS/GOGAT) que se cree que es la senda preferida en la asimilación
del amonio en los vegetales superiores [Miflin, B.J., P.J. Lea
Phytochem, 15:873-885 (1976)].
La principal objeción a que la GDH tenga una
función importante en el metabolismo del nitrógeno de los vegetales
es su baja afinidad por el amonio que necesitaría concentraciones de
amonio intracelular elevadas para funcionar anabólicamente. Las
evidencias iniciales indicaban que la GDH es un enzima catabólico
que cataliza la desaminación del glutamato con solamente una función
anabólica parcial en la síntesis del glutamato [Wallgrove, J.C.,
N.P. Hall, A.C. Kendall, Plant Physiol.,
83:155-158 (1987)]. La función fisiológica de
grandes cantidades de GDH que se encuentran en diversos tejidos
vegetales y orgánulos todavía está poco esclarecida y las
condiciones bajo las que posiblemente la GDH podría tener una
función significativa en el metabolismo del carbono y el nitrógeno
no han sido
determinadas.
determinadas.
La mayoría de la GDH vegetal caracterizada hasta
la fecha se encuentra localizada en las mitocondrias; sin embargo,
se ha caracterizado una especie de GDH que difiere en múltiples
propiedades (p.ej., especificidad de cofactor, valores de K_{m},
localización en orgánulos y estabilidad térmica entre otras) a
partir de los cloroplastos de un alga verde unicelular Chlorella
sorokiniana. Se ha demostrado que las células de C.
sorokiniana poseen una GDH constitutiva, mitocondrial,
tetramérica específica del NAD (a partir de aquí designada
"NAD-GDH") Meredith, M.J., R.M. Gronostajski,
R.R. Schmidt. Plant Physiol., 61:967-974
(1978)] y siete isozimas de GDH, específicas de NADP, homo- y
heteroméricas, localizadas en los cloroplastos e inducibles por el
amonio (a partir de aquí designadas como
"NADP-GDH") (Prunkard, D.E. N.F. Bascomb, R.W.
Robinson, R.R. Schmidt, Plant Physiol.,
81:349-355 (1986); Bascomb, M.F., R.R. Schmidth,
Plant. Physiol., 83:75-84 (1903)]. Se ha
demostrado que las siete isozimas NADP-GDH
cloroplásticas tienen diferentes movilidades electroforéticas
durante PAGE-nativo, lo que puede ser consecuencia
de la formación de homo y heterohexámeros compuestos por diferentes
proporciones de \alpha- y \beta-subunidades
(53,5 y 52,3 kilodaltons, respectivamente).
Las células de chlorella cultivadas en
medio 1 a 2 mM en amonio acumulan solamente el]]
\alpha-homohexámero (Bascomb y Schmidt,
supra). La adición de concentraciones de amonio superiores
(3,4 a 29 mM) a células cultivadas en nitrato produjo la
acumulación tanto de la subunidad \alpha como de la \beta en las
holoenzimas NADP-GDH [Prunkard et al.,
supra; Bascom y Schmidt, supra; Bascomb, N.F., D.E.
Prunkard, R.R. Schmidt, Plant Physiol.,
83:85-91 (1987)]. Prunkard et al., (Prunkard
D.E., N.F. Bascomb, N.F. W.T. Molin, R.R. Schmidt, Plant
Physiol., 81:413-422 [1986]) demostraron que la
proporción de subunidades de la NADP-GDH y el patrón
de holoenzimas están influidos tanto por la fuente de carbono y
nitrógeno como por las condiciones de luz bajo las que se cultivan
las células.
Los homohexámeros \alpha- y
\beta-NADP-GDH purificados a
partir de las células de Chlorella tienen valores K_{m}
para el amonio notablemente diferentes; sin embargo, los valores de
la K_{m} para sus otros sustratos son muy semejantes. El
\alpha-homohexámero compuesto por seis
\alpha-unidades idénticas) que cataliza la
biosíntesis de glutamato está regulada alostéricamente por el NADPH
y posee una K_{m} para el amonio muy baja, comprendida entre 0,02
y 3,5 mM, dependiendo de la concentración de NADPH (Bascomb y
Schmidt, supra). El valor de K_{m} para el amonio del
\alpha-homohexámero es el valor K_{m} de amonio
más bajo publicado hasta la fecha para GDH de cualquier vegetal.
Por el contrario, el \beta-homohexámero (forma
catabólica) no es un enzima alostérico con un K_{m} para el amonio
de aproximadamente 75 mM. De tales estudios que implican los enzimas
purificados, se había postulado hasta la fecha que los
heterohexámeros tienen grados variables de afinidad para el amonio,
comprendidos entre los valores de K_{m} para los \alpha- y
\beta-homohexámeros. Sorprendentemente, sin
embargo, se ha descubierto que ciertos heterohexámeros pueden tener
una proporción de actividad aminante:desaminante superior a la de
cualquiera de los \alpha- o
\beta-homohexámeros.
Aunque las \alpha- y
\beta-subunidades tienen velocidades de
transformación in vivo diferentes (Bascomb et al.,
supra) y los homohexámeros correspondientes tienen valores de
K_{m} para el amonio notablemente diferentes, las \alpha- y
\beta-
subunidades provienen de proteínas precursoras de tamaños prácticamente idénticos (aproximadamente 58.000 Daltons) y se demostró que tienen mapas peptídicos muy semejantes (Prunkard et al., supra; Bascom and Schmidt, supra). Además, los anticuerpos policlonales preparados contra el \beta-homohexámero son capaces de inmunoprecipitar todos los isozimas NADP-GDH (Yeung et al., Anal. Biochem., 10:216-228 (1981); Bascomb et al., supra), pero no tienen reacción cruzada con el NAD-GDH mitocondrial.
subunidades provienen de proteínas precursoras de tamaños prácticamente idénticos (aproximadamente 58.000 Daltons) y se demostró que tienen mapas peptídicos muy semejantes (Prunkard et al., supra; Bascom and Schmidt, supra). Además, los anticuerpos policlonales preparados contra el \beta-homohexámero son capaces de inmunoprecipitar todos los isozimas NADP-GDH (Yeung et al., Anal. Biochem., 10:216-228 (1981); Bascomb et al., supra), pero no tienen reacción cruzada con el NAD-GDH mitocondrial.
Cock et al., [Plant Mol. Biol.,
17:17-27 (1991)], describen una secuencia de
nucleótidos que codifica la \beta-subunidad
madura completa de la glutamato-deshidrogenasa (GDH)
de Chlorella Sorokiniana y por lo menos el 98% de la
\alpha-subunidad madura. Dicho artículo también
proporciona pruebas genómicas de clonaje y de transferencia
Southern que indican que el genoma de C. sorokiniana
solamente posee un gen estructural para
NADP-GDH.
Los isozimas NADP-GDH
cloroplasticos codificados en el núcleo de C. sorokiniana son
las únicas secuencias de GDH localizadas en los cloroplastos
aisladas y caracterizadas de vegetales.
Se ha descubierto que las dos subunidades
maduras de los isozimas GDH de chlorella se generan mediante
el procesamiento específico de dos proteínas precursoras semejantes
codificadas en dos ARNm formados mediante el ensamblaje alternativo
de un pre-mARN derivado de un único gen nuclear.
Además, se ha identificado el lugar de corte y la secuencia del
péptido aminoterminal de las subunidades GDH funcionales
maduras.
Más específicamente, la presente invención
proporciona el aislamiento y la caracterización de dos ADNc de
tamaño completo de ARNm aislados a partir del alga verde unicelular
Chlorella sorokiniana. Los dos ADNc codifican las proteínas
precursoras (\alpha-precursor, 53,5 kD;
\beta-precursor, 57,85 kD) que son procesadas para
producir las \alpha- y \beta-subunidades
maduras (53,5 kD; 52,3 kD, respectivamente) que componen los
isozimas de hexaméricos activo de NADP-GDH. La
presente invención se refiere a un solo gen de
NADP-GDH que se ensambla de modo alternativo para
generar dos ARNm que codifican dos proteínas precursoras diferentes
de los cloroplastos. Tales proteínas precursoras se pueden procesar
a continuación para dar las subunidades \alpha y \beta maduras
de los isozimas de NADPH-GDH. También se describen
fragmentos de utilidad o mutantes de las secuencias de nucleótidos y
aminoácidos que retienen la actividad o utilidad dadas a conocer.
Por ejemplo, ciertos fragmentos de las secuencias de aminoácidos
proporcionadas en la presente memoria pueden ser de utilidad como
péptidos de tránsito, que proporcionan a la proteína la capacidad de
entrar y permanecer en ciertos compartimentos celulares. Las
secuencias de nucleótidos que se describen en la presente memoria, y
los fragmentos de tales secuencias de nucleótidos, pueden ser de
utilidad, por ejemplo, como cebadores en procesos de amplificación o
como sondas para hibridar a secuencias complementarias de interés.
Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos y los fragmentos de las
mismas tal como se describen en la presente memoria también pueden
ser de utilidad como marcadores del peso molecular o en la
identificación y establecimiento del grado de relación de otras
secuencias de nucleótidos, polipéptidos o isozimas relacionadas con
NADP-GDH.
La presente invención proporciona además
procedimientos con los que se puede alterar la asimilación de
nitrógeno inorgánico en el metabolismo del nitrógeno orgánico de
los vegetales superiores, mediante la expresión de la GDH de C.
sorokiniana o las GDH aisladas de otros organismos. Las
alteraciones en el metabolismo del nitrógeno pueden resultar en el
incremento en la asimilación de nitrógeno que, tal como se conoce en
la materia, puede afectar la composición del vegetal mediante un
efecto inverso sobre le metabolismo del carbono, p.ej., la
acumulación de hidratos de carbono. El objetivo de la presente
invención también se refiere a construcciones de ADN destinados a
la utilización en los procedimientos descritos. La presente
invención incluye la identificación de las secuencias
aminoterminales de \alpha- y \beta-subunidades
que se pueden ensamblar para formar isozimas
NADP-GDH, p.ej., la NADP-GDH
hexamérica nativa que se encuentra en los cloroplastos de C.
sorokiniana. Dicha precisa información del peso molecular se
puede utilizar para expresar NADP-GDH provista de
las propiedades cinéticas especiales de los homohexámeros \alpha-
y \beta-NADP-GDH cloroplásticos de
C. sorokiniana. La presente invención proporciona asimismo
células recombinantes u organismos, p.ej., cultivares o plantas
transgénicas que, mediante la expresión de los genes de las
secuencias de polinucleótidos descritas, con el fin de producir los
correspondientes polipéptidos, pueden tener un rendimiento superior,
mejores propiedades asimiladoras de nitrógeno que pueden
ventajosamente incrementar su tolerancia a la toxicidad por el
amonio, mejor tolerancia al estrés osmótico y mejor composición del
cultivar o vegetal.
La Figura 1 muestra un patrón de actividades de
NADP-GDH en homogeneizados de células sincronizadas
de C. sorokiniana cultivadas durante 240 minutos en medio con
29 mM amonio con luz continua. Se analizaron
espectrofotométricamente alícuotas de homogeneizados aclarados, de
células cosechadas a diferentes intervalos de tiempo, para
determinar actividades de aminación (\bullet), desaminación
(\circ) de NADP-GDH.
La Figura 2 muestra patrones de acumulación de
antígenos de NADP-GDH en células iluminadas
cultivadas en medio con 29 mM amonio durante 240 minutos. A tiempo
cero, se añadió amonio a las célula hijas de C. sorokiniana y
se cultivaron con iluminación. Las autorradiografías de las
transferencias Western se analizaron mediante densitometría láser
para determinar los niveles relativos de las \alpha- (\bullet) y
\beta-subunidades (\circ) de
NADP-GDH a lo largo de los 240 minutos del período
de inducción.
La SEC. ID nº 1, es el ADNc de la proteína
precursora de la \alpha-subunidad de una glutamato
deshidrogenasa específica para NADP.
La SEC. ID nº 2, es la secuencia de aminoácidos
deducida de la secuencia de polinucleótidos SEC. ID nº 1.
La SEC. ID nº 3 es el ADNc de la proteína
precursora de la \beta-subunidad de una glutamato
deshidrogenasa específica para NADP.
La SEC. ID nº 4 es la secuencia de aminoácidos
deducida del polinucleótido de SEC. ID nº 3.
La SEC. ID nº 5 es la secuencia
N-terminal de la \alpha-subunidad
de NADP-GDH.
La SEC. ID nº 6 es la secuencia
N-terminal de la \beta-subunidad
de NADP-GDH.
La SEC. ID nº 7 es la secuencia de ADNc en el
clon referido como pBGDc 53.
La SEC. ID nº 8 es un cebador que se hibrida a
las regiones conservadas de los pequeños ARNm de
NADP-GDH.
La SEC. ID nº 9 es un polinucleótido
poli(dT) utilizado como cebador adaptador según la presente
invención.
La SEC. ID nº 10 es un polinucleótido utilizado
como cebador según la presente invención.
La SEC. ID nº 11 es un polinucleótido utilizado
como cebador según la presente invención.
La SEC. ID nº 12 es un polinucleótido utilizado
como adaptador cebador según la presente invención.
La SEC. ID nº 13 es el polinucleótido inserto en
el clon referido como pRGDc 60.
La SEC. ID nº 14 es el polinucleótido inserto en
el clon designado como pRGDc 61.
La SEC. ID nº 15 es el polinucleótido utilizado
como un cebador según la presente invención.
La SEC. ID nº 16 es el polinucleótido inserto en
un clon designado como pGDc 63
La SEC. ID nº 17 es el polinucleótido inserto de
un clon designado como pGDc 64.
La SEC. ID nº 18 es el polinucleótido resultante
de la ligación de los fragmentos purificados correspondientes a los
insertos en los clones designados pBGDc 53 y pGDc 63, según la
presente invención.
La SEC. ID nº 19 es la secuencia de
polinucleótidos resultante de la ligación de los insertos
purificados de los clones designados pGDc 64 y pBGDc 53.
La SEC. ID nº 20 es un polinucleótido utilizado
como cebador según la presente invención.
La SEC. ID nº 21 es un polinucleótido utilizado
como cebador que se hibrida al extremo 3' de ADN molde según la
presente invención.
La SEC. ID nº 22 es un polinucleótido utilizado
como cebador según la presente invención.
La SEC. ID nº 23 es la secuencia de
polinucleótidos (ADNc) de la \alpha-subunidad de
la NADP-GDH madura procesada.
La SEC. ID nº 24 es la secuencia de aminoácidos
de la \alpha-subunidad de NADP-GDH
madura procesada.
La SEC. ID nº 25 es la secuencia de
polinucleótidos (ADNc) de la \beta-subunidad de
NADP-GDH madura procesada.
La SEC. ID nº 26 es la secuencia de aminoácidos
de la \beta-subunidad de NADP-GDH
madura procesada.
La presente invención proporciona a continuación
secuencias de polinucleótidos no descritas, por ejemplo, ADNc de las
proteínas precursoras de las \alpha- y
\beta-subunidades de la glutamato deshidrogenasa
NAD específica inducible por el amonio localizada en los
cloroplastos (a partir de aquí NADP-GDH) de
Chlorella sorokiniana. La secuencia de nucleótidos para las
proteínas precursoras de las \alpha- y
\beta-subunidades que forman la
NADP-GDH se muestran en las SEC. ID n^{os} 1 y 3,
respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducidas para las
proteínas precursoras de las \alpha- y
\beta-subunidades del enzima
NADP-GDH de Chlorella sorokiniana se muestran
en las SEC. ID n^{os} 2 y 4, respectivamente.
Los huéspedes E. coli que comprenden los
insertos de ADNc de la presente invención se depositaron en la
American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852 USA. A los cultivos se les asignaron los
siguientes números de acceso en el repositorio:
\newpage
| Cultivo | Número de acceso | Fecha del depósito |
| E. coli DH5\alpha \alpha-NADP-GDH SEC. ID nº 1 (+42 bp) | ATCC 69925 | 6 de Octubre 1995 |
| E. coli DH5\alpha \beta-NADP-GDH SEC. ID nº 1 (- 42 bp) | ATCC 69926 | 6 de Octubre 1995 |
El análisis automático de la secuencia de
aminoácidos identificó 20 y 10 aminoácidos aminoterminales de las
\alpha- y \beta-subunidades, respectivamente. La
alineación de las secuencias de péptidos de las \alpha- y
\beta-subunidades revela que las dos subunidades
son idénticas con excepción de una extensión de 11 aminoácidos
presente en la \alpha-subunidad más grande. Los
anticuerpos monoclonales generados contra la
\alpha-subunidad demostraron reconocer la
\beta-subunidad proporcionando pruebas adicionales
de que las dos subunidades son casi idénticas. La identificación de
los lugares únicos de procesamiento de las \alpha- y
\beta-subunidades en las proteínas precursoras
proporciona un mecanismo molecular para explicar las diferencias en
las propiedades cinéticas de los isozimas homohexaméricos de la
\alpha- y \beta- NADP-GDH.
Los datos mencionados anteriormente proveen
información aplicable a los vegetales genéticamente modificados con
una GDH específica provista de propiedades cinéticas favorables que
pueden influenciar tanto el metabolismo del nitrógeno como el del
carbono. Debido al elevado contenido en guanina/citosina los ADNc
son muy adecuados para la expresión heteróloga en los vegetales
superiores. La introducción de una cualquiera o de las dos
subunidades provistas de secuencias dirigidas a los cloroplastos o
con secuencias dirigidas a otros orgánulos en sistemas vegetales
heterólogos puede mejorar la asimilación de nitrógeno e influenciar
el equilibrio carbono/nitrógeno.
Se ha descubierto que la localización a los
cloroplastos está relacionada con, y puede depender de, el extremo
N-terminal de la proteína \alpha- o
\beta-precursora. La escisión del extremo
N-terminal de los precursores genera la proteína
madura. En consecuencia, el péptido de tránsito a los cloroplastos
comprende un péptido que forma, o es un fragmento activo de, el
extremo N-terminal escindido de la proteína
precursora. Los péptidos que tienen una secuencia semejante o
equivalente, o que tienen estructura terciaria o conformación
semejante a estos péptidos escindidos pueden funcionar asimismo
como péptidos de tránsito. El péptido de transición a los
cloroplastos comprende el fragmento activo del péptido
N-terminal escindido del
\alpha-precursor (un 40-mero) o
del \beta-precursor (un 37-mero).
Las secuencias de polinucleótidos que codifican los péptidos de
tránsito a los cloroplastos se pueden utilizar por un experto en la
materia para generar los péptidos de tránsito a los cloroplastos
utilizados con los péptidos descritos en la presente memoria, u
otros conocidos en la técnica.
La adición, eliminación o reemplazo del péptido
de tránsito a los cloroplastos asociado con una proteína, p.ej., el
enzima GDH, se puede utilizar para localizar la proteína según se
necesite, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por
ejemplo, se puede lograr la localización del enzima en un
cloroplasto de una célula mediante la inserción de un péptido de
transito a los cloroplastos en una secuencia de aminoácidos que
carece de dicho péptido de tránsito. Se pueden añadir péptidos de
tránsito específicos de la especie a los cloroplastos, o se pueden
reemplazar los ya existentes para optimizar la inserción en los
cloroplastos de una especie determinada. Además, la localización
dentro del cloroplasto de una proteína que se expresa en el
cloroplasto se puede lograr mediante la transformación directa del
plasto con las secuencias de polinucleótidos que codifican una
proteína expresada. De modo semejante, la eliminación de un péptido
de de tránsito a los cloroplastos o la producción de una proteína
recombinante que carece del péptido se puede utilizar para
secuestrar la proteína en un compartimento celular distinto de los
cloroplastos.
Las plantas transformadas que expresan el
\alpha-homohexámero pueden ser más tolerantes a la
toxicidad del amonio, asimilar el amonio con mayor eficacia y
responder más rápidamente al estrés osmótico que se encuentra en
los suelos transitoriamente salinos mediante el aporte de glutamato,
el precursor del osmoprotector prolina. La expresión de, por
ejemplo, el \beta-homohexámero o los
heterohexámeros GDH se puede utilizar con el fin de alterar la
velocidad de asimilación de nitrógeno, favoreciendo la acumulación
de carbohidratos en los frutos y otros órganos de
almacenamiento.
Inesperadamente, se descubrió que un hexámero
que comprende por lo menos una \alpha-subunidad y
por lo menos una \beta-subunidad, es decir, un
heterohexámero, puede tener una actividad ventajosa.
Específicamente, la proporción de actividad aminante:desaminante
(es decir, la capacidad biosintética para las síntesis de
glutamato) de un isozima NADP-GDH cloroplástico se
puede incrementar mediante la incorporación de tanto \alpha- como
\beta-subunidades a la proteína hexamérica en
lugar de utilizar un homohexámero que comprenda solamente \alpha-
o solamente \beta-subunidades. En una forma de
realización de la presente invención, puede ser ventajoso expresar
simultáneamente ADNc que codifican los dos tipos de subunidades en
la misma planta en diferentes proporciones/niveles con el fin de
obtener una proporción determinada de
\alpha-subunidades y
\beta-subunidades en el heterohexámero. Por
ejemplo, se ha descubierto que es preferible un heterohexámero de
NADP-GDH que tiene por lo menos una de las
subunidades en forma \beta para incrementar la proporción de
actividad aminante:desaminante. Un heterohexámero más preferido
tiene entre 2 y 5 \beta-subunidades. Tal velocidad
diferencial en la expresión de los dos ADNc se puede lograr
colocándolos bajo el control de promotores vegetales de diferente
potencia o bajo el mismo promotor que se ha modificado para generar
diferentes niveles de expresión. La utilización de este sistema de
isozima NADP-GDH de alga en la biotecnología de los
vegetales ofrece ventajas sobre los NADP-GDH de
organismos tales como bacterias, que contienen una sola forma del
enzima (es decir, no isozimas).
Se reconoce que los niveles de expresión de
ciertas proteínas recombinantes en las plantas transgénicas se
puede mejorar mediante el incremento de la expresión de trascriptos
de mARN estabilizados; y que, por el contrario, la detección de
tales transcriptos de estabilizados se puede utilizar para medir la
expresión de los productos de traducción (proteína). La baja
expresión de ARN de proteínas en las plantas y, por consiguiente, de
la baja expresión de proteínas, se puede resolver mediante la
utilización de un gen sintético mejorado que especifique la
proteína deseada del organismo origen del gen.
Por consiguiente, en una forma de realización de
la presente invención, las bacterias y plantas se pueden modificar
genéticamente para lograr los niveles de expresión deseados para las
nuevas proteínas con valor agrícola o comercial. Para proveer genes
de expresión incrementada en los vegetales, la secuencia de ADN del
gen se puede modificar para que comprenda los dones preferidos en
los genes muy expresados de los vegetales, para lograr un contenido
en los nucleótidos A + T sustancialmente como el encontrado en las
plantas y preferentemente para formar asimismo una secuencia
iniciadora de vegetal y para eliminar secuencias desestabilizadoras,
de poliadenilación inapropiada, de degradación y de terminación del
ARN y para evitar secuencias que constituyan estructuras
secundarias en horquilla y sitios de ensamblaje ADN. Por ejemplo,
en los genes sintéticos, los codones utilizados para especificar un
aminoácido determinado se pueden seleccionar en relación con la
distribución de frecuencias de utilización de codones empleada por
los genes muy expresados en las plantas para especificar dicho
aminoácido. Tal como aprecian los expertos en la materia, la
distribución de frecuencias de utilización de codones utilizada en
un gen sintético es un determinante del nivel de expresión.
Para los objetivos de la presente invención,
"frecuencia de utilización de los codones preferidos" se
refiere a la preferencia mostrada por una célula huésped específica
en la utilización de codones de nucleótidos para especificar un
aminoácido determinado. Para determinar la frecuencia de utilización
de un codón particular en un gen, el número de ocurrencias de dicho
codón en el gen se divide entre el número total de ocurrencias de
todos los codones utilizados para especificar el mismo aminoácido en
el gen. De modo semejante, la frecuencia de utilización de los
codones preferidos mostrada por una célula huésped se puede calcular
haciendo el promedio de la frecuencia de utilización de los codones
preferidos en un gran número de los genes expresados por la célula
huésped. Es preferible que dicho análisis se limite a genes de
expresión elevada en la célula huésped.
Cuando se sintetiza un gen para mejorar la
expresión en una célula huésped es deseable diseñar el gen de modo
que su frecuencia de utilización de codones se aproxime a la
frecuencia de utilización de los codones preferidos de la célula
huésped.
El porcentaje de desviación de la frecuencia de
utilización de codones preferidos de un gen sintético con respecto
a la utilizada por una célula huésped se calcula primero mediante la
determinación del porcentaje de desviación de la frecuencia de
utilización de un solo codón con respecto a la de la célula huésped,
seguido de la obtención del promedio de la desviación para todos
los codones. Tal como se define en la presente memoria dicho
cálculo incluye codones especiales (es decir, ATG y TGG). En
términos generales la desviación media general de utilización de
codones de un gen sintético relativa a la de la célula huésped se
calcula utilizando la siguiente ecuación:
A =
\sum\limits^{Z}_{n=1}\frac{\frac{X_{n}-Y_{n}}{X_{n}} \ x \
100}{Z}
en la que X_{n} = frecuencia de
utilización del codón n en la célula huésped;
Y_{n} = frecuencia de utilización del codón n en el gen sintético.
En la que n representa un codón individual que especifica un amino
ácido, el número total de codones es Z. La desviación general de la
frecuencia de utilización de codones, A, para todos los aminoácidos
preferentemente debe ser inferior a aproximadamente 25% y más
preferentemente inferior a aproximadamente el 10%. Por
consiguiente, se puede diseñar un gen de modo que su frecuencia de
distribución de utilización de codones se desvíe, preferentemente no
más del 25% de la de los genes vegetales de elevada expresión y,
más preferentemente, no más de aproximadamente el 10%. Además, se
considera el porcentaje de contenido G + C de la tercera base
degenerada (las monocotiledóneas parecen favorecer G + C en esta
posición, mientras que las dicotiledóneas no lo hacen). También se
reconoce que el nucleótido XCG (donde X es A, T, C o G) es el codón
menos preferido en las dicotiledóneas mientras que el codón XTA se
evita tanto en las dicotiledóneas como en las monocotiledóneas. Los
genes sintéticos de la presente invención preferentemente presentan
asimismo índices de evitación de los dobletes CG y TA próximos a
los del vegetal huésped elegido. Más preferentemente dichos índices
no se desvían de los del huésped por más de entre aproximadamente el
10 y el
15%.
El ensamblaje del gen de
NADP-GDH de la presente invención se puede realizar
utilizando procedimientos estándar en la materia. Un gen
estructural diseñado para una expresión incrementada en los
vegetales de la forma de realización preferida se puede ensamblar
enzimáticamente en un vector de ADN a partir de segmentos de
oligonucleótidos de doble cadena sintetizados químicamente. A
continuación se puede introducir el gen en la célula del vegetal
huésped y expresar mediante procedimientos conocidos en la materia.
Preferentemente, la proteína producida cuando se expresa el gen
sintético en los vegetales es funcionalmente equivalente a una
proteína nativa en que tiene una actividad aminante/desaminante
comparable o mejorada. Según la presente invención,
"funcionalmente equivalente" se refiere a identidad o casi
identidad de funciones. El producto de un gen sintético que tiene
por lo menos una propiedad relacionada con su actividad o función,
que es igual o semejante a una proteína natural se considera
funcionalmente equivalente a ésta. Se pueden realizar modificaciones
en la secuencia de nucleótidos de la región codificante para
alterar el contenido en A + T de la composición de bases del ADN de
un gen sintético para que refleje el encontrado normalmente en los
genes de las proteínas de expresión elevada nativas a la célula
huésped. Preferentemente el contenido en A + T del gen sintético es
sustancialmente igual al de dichos genes para las proteínas de
expresión muy elevada. En los genes que codifican proteínas
vegetales de expresión elevada, el contenido en A + T es de
aproximadamente el 55%. Es preferible que el gen sintético tenga un
contenido en A + T próximo a este valor y no suficientemente elevado
como para producir la desestabilización del ARN y, por
consiguiente, niveles inferiores de expresión de proteína. Más
preferentemente, el contenido en A + T no es superior a
aproximadamente el 60% y más preferentemente es de aproximadamente
el 55%. También, para la expresión final en las plantas, la
secuencia de nucleótidos del gen puede ser modificada
preferentemente para formar secuencias de inicio vegetales en el
extremo 5' de la región codificante. Además, preferentemente se
presta atención en asegurarse que se disponen lugares de restricción
únicos en posiciones estratégicas para permitir el ensamblaje
eficiente de los fragmentos de oligonucleótidos durante la
construcción del gen sintético y para facilitar las modificaciones
de nucleótidos subsiguientes. Como resultado de tales modificaciones
en la región codificante del gen nativo, el gen sintético preferido
se expresa en los vegetales a un nivel incrementado cuando se
compara con el observado de los genes estructurales naturales.
Se conoce que la utilización relativa de codones
sinónimos difiere entre las monocotiledóneas y las dicotiledóneas.
En general, el factor más importante para discriminar entre los
patrones de utilización de codones de las monocotiledóneas y
dicotiledóneas es el porcentaje G + C de la tercera base degenerada.
En las monocotiledóneas, 16 de 18 aminoácidos favorecen G + C en
esta posición, mientras que las dicotiledóneas solamente favorecen G
+ C en 7 de 18 aminoácidos.
En la soja y el maíz, el patrón de utilización
de codones del maíz se parece al de las monocotiledóneas en
general, mientras que el patrón de utilización de codones de la soja
es casi idéntico al patrón general de las dicotiledóneas.
Cuando se diseña un gen sintético que debe ser
expresado en vegetales, es preferible eliminar las secuencias que
interfieren con la eficacia de la expresión génica.
Se puede sintetizar un gen sintético con otros
fines además del de ganar un incremento en el nivel de expresión.
Por ejemplo, de acuerdo con la presente invención, una de las
secuencias de nucleótidos que codifican la
\alpha-subunidad o la
\beta-subunidad de la NADP-GDH se
puede modificar de tal modo que los productos se expresen de modo
diferencial, favoreciendo la expresión de una de las subunidades. Un
resultado de tal expresión diferencial es un heterohexámero que
comprende más de una de las subunidades que de la otra. La
modificación puede comprender la substitución de uno o más, pero no
todos, segmentos de oligonucleótidos utilizados para construir el
gen sintético por una región de la secuencia natural.
Preferentemente, la expresión diferencial de la secuencia de
nucleótidos que codifica las \alpha- y
\beta-subunidades de los polipéptidos de la
NADP-GDH se puede utilizar para producir un
heterohexámero que tenga por lo menos
una \beta-subunidad, más preferentemente entre dos y cinco \beta-subunidades, y más preferentemente tres \beta-subunidades.
una \beta-subunidad, más preferentemente entre dos y cinco \beta-subunidades, y más preferentemente tres \beta-subunidades.
La molécula de ADN recombinante que comprende
una secuencia de nucleótidos de la presente invención se puede
introducir en el tejido de las plantas mediante procedimientos
conocidos en la materia. El procedimiento utilizado para una especie
vegetal determinada o para un tipo específico de tejido vegetal
depende de las técnicas exitosas conocidas. A medida que se
desarrollan nuevos procedimientos para la inserción estable de genes
extraños en las células de las plantas y para la manipulación de las
células modificadas, los expertos en la materia serán capaces de
seleccionar de entre los procedimientos conocidos para lograr los
resultados deseados. Los procedimientos para introducir ADN
recombinante en los tejidos de los vegetales incluyen, pero sin
limitarse a la adquisición directa de ADN [Paszkowski, J. et
al., EMBO J., 3:2717 (1984), electroporación (Fromm, M. et
al., Proc. Natl. Acad. USA, 82:5824 (1985), microinyección
(Crossway, A. et al., Mol. Gen. Genet., 202:179 (1986), o
transferencia al tejido vegetal desde el Agrobacterium
tumefaciens mediante T-ADN. No parece existir
una limitación fundamental a la transformación de
T-ADN a la clase de huésped natural de
Agrobacterium. Se ha publicado la transformación con éxito
mediante T-ADN de las monocotiledóneas
[Hooykaas-Van Slogteren, G. et al., Nature
311:763 (1984)], las gimnospermas [Dandekar, A. et al.,
Biotechnology 5:587 (1987)] y las algas [Ausich, R., solicitud EPO
108.580]. En las siguientes referencias se describen los sistemas de
vectores de T-ADN representativos: An, G. et
al., EMBO J., 4:277 (1985); Herrera-Estrella,
L., et al., Nature 303:209 (1983);
Herrera-Estrella, L., et al,, EMBO J. 2:987
(1983); Herrera-Estrella, L., et al.,
Plant Genetic Engineering, New York: Cambridge University
Press, p 63 (1985). Una vez introducidas en el tejido vegetal, se
puede ensayar la expresión del gen estructural mediante uno
cualquiera de los procedimientos conocidos en la materia y se puede
medir la expresión como mARN transcrito o como proteína sintetizada.
Se conocen procedimientos para el cultivo in vitro de tejidos
vegetales y en múltiples casos, para la regeneración de plantas
enteras. Los procedimientos conocidos para transferir el complejo de
expresión introducido en cultivos de utilización comercial son
conocidos por los expertos en la materia.
En una de las formas de realización preferidas
la invención publicada en la presente memoria comprende la
expresión en células vegetales de un gen de la
NADP-GDH bajo el control de un promotor expresable
en vegetales, es decir, insertando el gen en T-ADN
bajo el control de un promotor expresable en vegetales e
introduciendo el T-ADN que contiene el inserto en
una célula vegetal utilizando procedimientos conocidos. Una vez que
se obtienen células vegetales expresan el gen bajo el control de un
promotor expresable en vegetales, se pueden generar tejidos
vegetales y plantas enteras a partir de estas utilizando
procedimientos y técnicas bien conocidas en la materia. Las plantas
regeneradas se reproducen entonces mediante procedimientos
convencionales y los genes introducidos se pueden transferir a
otras variedades y cultivares mediante procedimientos convencionales
de selección vegetal.
La introducción y expresión del gen de la
NADP-GDH se puede utilizar para mejorar, por
ejemplo, incrementar el rendimiento de un cultivo. Otras
utilizaciones de la invención, que explotan las propiedades de los
genes introducidos en las especies de vegetales serán evidentes
para los expertos en la materia.
También existen diferencias en la elección de
codones en los genes nucleares de los vegetales y en los
cloroplastos. Los cloroplastos difieren de los vegetales superiores
en que codifican solamente 30 especies de genes de ARNt. Debido a
que los cloroplastos tienen restringidos sus genes de ARNt, la
utilización de codones preferidos por las proteínas codificadas por
los cloroplastos parece más extrema. Sin embargo, se ha publicado
una correlación positiva entre el nivel de ARNt
iso-aceptantes para un aminoácido determinado y la
frecuencia con que se utiliza dicho codón en el genoma de los
cloroplastos [Pfitzinger et al., Nucl. Acids.
Res.,15:1377-1386 (1987)]. En general, el perfil de
codones de los cloroplastos se parece más de cerca al de los
organismos unicelulares, con un sesgo fuerte hacia la utilización
de A + T en la tercera base degenerada.
A continuación se dan ejemplos que ilustran los
procedimientos, que incluyen el mejor modo de poner en práctica la
presente invención. Estos ejemplos no se deben considerar
limitativos. Todos los porcentajes son en peso y todas las
proporciones de mezclas de disolventes son en volumen a menos que se
indique de otro modo.
Las \alpha- y \beta-isozimas
de glutamato deshidrogenasa cloroplástica utilizadas en los
experimentos siguientes se producen naturalmente por un organismo
caracterizado como Chlorella sorokiniana.
Para la caracterización cinética tanto de la
dirección aminante como desaminante, los \alpha- y
\beta-holoenzimas se purificaron a partir de
células que acumulaban solamente una forma de isozima homohexamérica
GDH.
Las células de C. sorokiniana
(UTEX-1230, University of Texas algal culture
collection; 3B2NA, Robert R. Schmidt, University of Florida,
Microbiology Cell Science Department) se cultivaron autotróficamente
tal como han descrito anteriormente Prunkard et al., en un
medio basal modificado. El medio modificado contiene en
concentraciones mM: CaCl_{2}, 0,34, K_{2}SO_{4}, 6,0;
KH_{2}PO_{4}, 18,4; MgCl_{2}, 1,5; en concentración \muM:
CoCl_{2}, 0,189; CuCl_{2}, 0,352; EDTA, 72; FeCl_{3}, 71,6;
H_{3}BO_{3}, 38,8; MnCl_{2}, 10,1; NH_{4}VO_{4}, 0,20;
(NH_{4})_{6}MO_{7}O_{24}, 4,19; NiCl_{2}, 0,19;
SnCl_{2}, 0,19; ZnCl_{2}, 0,734. El medio está suplementado con
1 mM NH_{4}Cl, 29 mM NH_{4}Cl o 29 mM KNO_{3} como fuente de
nitrógeno dependiendo de las condiciones experimentales. El medio
que contiene NH_{4}Cl se ajustó a pH 7,4 y el medio que contiene
KNO_{3} se ajustó a pH 6,8 con KOH después de esterilizado en
autoclave. Las células se suplieron con 2% (v/v) mezcla de
CO_{2}-aire y una intensidad de luz suficiente
para permitir la división celular en cuatro
generaciones.
generaciones.
Con el fin de purificar el
\alpha-isozima de glutamato deshidrogenasa, se
cultivaron células de C. sorokiniana con luz continua en
medio con 29 mM amonio en una cámara de plexiglás de 30 L tal como
se describió con anterioridad [Baker, A.L., R.R. Schmidt,
Biochem. Biophys. Acta, 74:75-83 (1963)]. Se
cosecharon las células a 4,0 OD_{640} mediante centrifugación a
30.000 rpm en una centrífuga Sharples y se lavaron dos veces en 10
mM Tris pH 8,5 a 4ºC. Las células precipitadas (130 g) se
almacenaron a -20ºC en frascos de centrífuga de 250 ml hasta su
utilización. La purificación de NADP-GDH se logró
utilizando un procedimiento modificado de Yeung et al.,
supra. Las modificaciones del proceso implicaron la
sustitución de gel de Sephadex G-200 (Pharmacia) por
gel G-150 en la columna de filtración y la adición
de NADP+ como estabilizador a una concentración final de 0,1 mM al
tampón de filtración por gel y a todos los tampones de
almacenamiento siguientes. Como modificación final, la etapa de
resina de afinidad de NADP+ se omitió y se sustituyó por una etapa
de PAGE preparativo no desnaturalizante [Miller, P.W., W.D. Dunn,
R.R. Schmidt, BioRad US/EG Bulletin (1987)].
La disolución de ensayo del enzima desaminante
GDH está compuesta de 44 mM Tris, 20,4 mM glutamato y 1,02 mM NADP+,
pH 8,8. La disolución de ensayo de aminación comprende 50 mM Tris,
25 mM \alpha-cetoglutarato, 0,357 mM NADPH y 0,356
M (NH_{4})_{2}SO_{4}, pH 7,4. Una unidad de actividad
enzimática es la cantidad de NADP-GDH necesaria para
reducir u oxidar 1,0 \mumol de NADP+ o NADPH por minuto a
38,5ºC.
Las fracciones de la columna de Sephadex
G-200 con actividad NADP-GDH se
juntaron y concentraron mediante filtración Diaflow. El enzima
soluble (68 mg) se protegió de la oxidación mediante la adición de
DTT a una concentración final 10 mM y se dializó durante 30 minutos
contra 28,8 mM Tris, 192 mM glicina, 2 mM DTT (pH 8,4). El
dializado se aclaró mediante centrifugación a 20.000 g durante 10
minutos a 4ºC y se combinó con 3 ml de 40% (peso/vol.) sacarosa y 1
ml de 0,02% azul de bromofenol.
Para PAGE no desnaturalizante preparativo, se
moldeó un gel de separación del 7% (peso/volumen, 28 acrilamida:
0,735 bis-acrilamida, pH 8,8) de 3 cm de altura, y
un gel de apilamiento del 2% de acrilamida (peso/volumen, 1,6
acrilamida: 0,4 bis-acrilamida, pH 6,6) de 2 cm de
altura en un tubo para geles de 28 mm ID Model 491 Prep Cell. Todas
los almacenamientos se pretrataron con la resina de lecho mixto
AG501-X8 para eliminar todo residuo de ácido
acrílico contaminante con el fin de evitar la
N-acilación in vitro de las proteínas durante
la electroforesis. La muestra de proteína se fraccionó por
electroforesis a 15 mA de corriente constante durante 20 minutos y
a continuación durante 3,5 horas a 30 mA de corriente constante. Se
recogieron fracciones de seis mililitros y se ensayaron para
determinar la actividad NADP-GDH desaminante y las
fracciones que contenía GDH se juntaron. El enzima en las fracciones
coleccionadas en 10 mM KPO_{4} (pH 6,2), 0,1 mM NADP+ se concentró
mediante ultrafiltración Diaflow a 1 mg/ml tal como se determinó por
el procedimiento de Bradford, utilizando BSA como estándar. La
preparación de enzima concentrada se almacenó a -20ºC. La pureza de
la preparación mediante teñido con plata para visualizar las
proteínas fraccionadas mediante PAGE-SDS en geles
del 10% (peso/volumen) Tris-Tricina [Schagger, H.,
G. von Jagow, Anal. Biochem.,166:368-379
(1987)]
El \beta-isozima de
NADP-GDH se purificó a partir de una mezcla de
células cultivadas durante 240 minutos en medio 1 mM amonio (14 g),
90 minutos en medio 1 mM amonio (6 g) y durante 20, 40, 60
y 80 minutos en medio 29 mM amonio (1 g/punto de tiempo) según
Bascomb y Schmidt, supra. El \beta-isozima
NADP-GDH se purificó parcialmente utilizando un
procedimiento modificado subescalado de Yeung et al.,
supra. Las columnas de intercambio iónico de DEAE sephacel
(pH 7,4 y pH 6) se subescalaron a 40 ml de volumen de lecho y se
utilizó un gradiente lineal de 400 ml de KCl (0 a 0,4 M) para eluir
las proteínas en fracciones de 3 ml. Las fracciones de la columna
de intercambio iónico de DEAE pH 6 que contienen
NADP-GDH se combinaron en dos grupos;
correspondientes con las mitades delanteras y traseras del pico de
actividad NADP-GDH. Las fracciones juntas por
separado se dializaron contra 10 mM KPO_{4} (pH 6,2), 2 mM DTT
durante 16 horas y se purificaron por afinidad utilizando gel de
afinidad NADP+ Type 3 (Pharmacia) tal como se describió
anteriormente (Bascomb y Schmidt, supra). El
NADP-GDH en las fracciones acumuladas se concentró
mediante ultrafiltración Diaflow a 2 mg/ml de proteína, tal como se
determinó mediante el procedimiento de Bradford [Bradford, M.M.,
Annal. Biochem., 72:248-254 (1976)] y se
almacenó a 4ºC hasta su utilización. Una vez fraccionadas las
proteínas mediante SDS-PAGE del 8% (peso/volumen)
Tris-Tricina se determinó la pureza de la
preparación mediante tinción con plata.
La Tabla 1 resume los valores K_{m}
determinados para la reacción de aminación de tanto el isozima
\alpha- como el \beta-homohexamérico
| Isoforma GDH | Sustrato | Valor K_{m} (mM) |
| \alpha-homohexámero | NADPH | 0,14 |
| NH4^{+} | 0,02-3,5 | |
| \alpha-cetoglutarato | 0,35^{\text{*}} | |
| \beta-homohexámero | NADPH | 0,14 |
| NH4^{+} | 77 | |
| \alpha-cetoglutarato | 12 | |
| *según Shatilov, V.R., W.L. Kretovich, Mol. Cell Biochem., 15:201-212 (1977) | ||
La Tabla 2 resume los valores de K_{m}
determinados para la reacción de desaminación de tanto el isozima
\alpha- como el \beta-homohexamérico.
| Isoforma GDH | Sustrato | Valor de K_{m} (mM) |
| \alpha-homohexámero | NADP^{+} | 0,04 |
| Glutamato | 38,2 | |
| \beta-homohexámero | NADP^{+} | 0,04 |
| Glutamato | 32,3 | |
Las actividades aminantes y desaminantes de la
mezcla de isozimas nativos NADP-GDH (heterohexámeros
compuestos de múltiples proporciones de \alpha- y
\beta-subunidades) se midieron también con niveles
saturantes de sustratos durante los 240 minutos del período de
inducción (Figura 1). Las actividades aminantes y desaminantes
mostraron retrasos de inducción iniciales de 20 y 40 minutos,
respectivamente. La actividad aminante incrementó rápidamente
durante los primeros 100 minutos, descendió abruptamente ente los
minutos 100 y 140 e incrementó abruptamente otra vez entre 140 y
240 minutos. Por el contrario, la actividad desaminante incrementó
de modo casi lineal durante la inducción después del retraso de
inducción inicial.
Durante los 240 minutos del período de inducción
en el medio con 29 mM amonio, también se examinaron los patrones de
acumulación de las \alpha- y \beta-subunidades
de la NADP-GDH de Chlorella sorokiniana en
isozimas mediante la utilización de un proceso de inmunodetección
por transferencia Western a continuación de una electroforesis en
geles de SDS poliacrilamida (ver la Figura 2). La
\beta-subunidad de NADP-GDH se
detectó a T_{0} e incrementó durante los primeros 40 minutos
seguido de un descenso gradual a lo largo del resto del período de
inducción. La \alpha-subunidad se detectó en los
primeros 20 minutos. Dicha subunidad se acumuló a poca velocidad
durante los primeros 80 minutos, mostró un incremento marcado
durante los 80 y 100 minutos y a continuación se acumuló de un modo
lineal a una velocidad más lenta durante el resto del período de
inducción. La transición desde que la
\beta-subunidad es la especie prominente hasta que
la \alpha-subunidad es prominente tuvo lugar entre
los 60 y 80 minutos.
El cociente de actividad aminante:desaminante y
el cociente de subunidades \alpha:\beta se calculó para
determinar si los cambios en la proporción de subunidades en la
mezcla de isozimas NADP-GDH se correlacionan con el
cociente de actividad aminante:desaminante predicho durante el
transcurso del período de inducción (Tabla 3). Sorprendentemente,
el mayor cociente aminante:desaminante se observó a los 60 minutos
cuando el cociente de las subunidades demostró que la
\beta-subunidad era el antígeno
NADP-GDH predominante, mientras que la
\alpha-subunidad fue la forma predominante cuando
el cociente de actividad aminante:desaminante era el más bajo. Este
último resultado no fue predecible por adelantado.
Anteriormente al presente descubrimiento, los
estudios cinéticos de los sustratos de los \alpha- y
\beta-homohexámeros purificados, el
\alpha-homohexámero, con su muy elevada afinidad
por el amonio (relativa a la del
\beta-homohexámero), se había asumido que era la
forma de isozima con la actividad aminante superior (es decir,
capacidad biosintética para la síntesis de glutamato). Los
resultados sugirieron que las subunidades individuales actuaban
independientemente con respecto a sus propiedades cinéticas en los
homo y heterohexámeros.
La comparación del cociente de actividad
aminante:desaminante con el cociente de subunidades \alpha:\beta
durante la inducción de 240 en medio 29 mM en amonio reveló una
correlación inesperada entre los máximos en estas proporciones
(Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo (minutos) | Actividad Am:Deam | Subunidades \alpha:\beta |
| 0 | 2,87 | 0,28 |
| 20 | 2,96 | 0,58 |
| 40 | 3,81 | 0,49 |
| 60 | 4,51 | 0,80 |
| 80 | 3,49 | 1,57 |
| 100 | 2,73 | 8,74 |
| 140 | 1,61 | 11,23 |
| 240 | 1,13 | 34,79 |
\vskip1.000000\baselineskip
El pico del cociente aminación:desaminación tuvo
lugar a los 60 minutos, tiempo en el que la
\beta-subunidad fue la prominente aunque no el
antígeno exclusivo, mientras que la
\alpha-subunidad fue prominente cuando el
cociente aminante:desaminante era inferior. Interesantemente, la
actividad aminante fue superior cuando se encontraban presentes las
dos subunidades, lo que sugiere que los heterohexámero(s),
formados mediante la combinación de de las \alpha- y
\beta-subunidades pueden tener una actividad
aminante superior que un homohexámero. Con base en que K_{m} del
\alpha-homohexámero purificado es muy inferior a
la del \beta-homomhexámero por el amonio, se
había predicho anteriormente que el
\alpha-homohexámero tendría una actividad aminante
superior que un heterohexámero cualquiera compuestos de las dos
subunidades (Bascomb y Schmidt, 1987).
Una alícuota de una preparación de
\alpha-subunidad de NADP-GDH
purificada (120 pmol) y una preparación parcialmente
purificada de \alpha-subunidad de
NADP-GDH (80 pmol) y
\beta-subunidad (50 pmol) se fraccionaron
mediante SDS-PAGE Tris-Tricina al 8%
(p/v) y se electrotransfirieron a una membrana de PVDF
(Immobilon-P^{SQ}, Millipore) tal como se
describen Plough et al., [Plough, M., A.L. Jensen, V.
Barkholt, Anal. Biochem., 181:33-39 (1989)].
Con el fin de evitar la acilación in vitro de los residuos
aminoterminales de la proteína, todas las disoluciones de
poliacrilamida utilizadas en PAGE se trataron con la resina de lecho
mixto AG501-X8 para eliminar el ácido acrílico
contaminante. Se utilizó un secuenciador de fase gaseosa modelo 470A
de Applied Biosistems Inc. para el análisis automatizado de la
secuencia de aminoácidos por degradación Edman. Los derivados
PTH-aa se identificaron mediante
RP-HPLC. El análisis de la secuencia de la proteína
electrotranferida lo proveyó el Interdisciplinary Center for
Biotechnology Research Protein Chemistry Core Facility de la
Universidad de Florida.
Se determinó la siguiente secuencia
N-terminal para la
\alpha-subunidad: AVSLEEQISAMDATTGDFTA (SEC. ID nº
5). Se determinó la siguiente secuencia N-terminal
par la \beta-subunidad (DATTGDFTAL (SEC. ID nº 6).
Estas secuencias son idénticas al ORF identificado en los dos ADNc
de NADP-GDH e indican la posición de los lugares de
escisión internos utilizados para eliminar la secuencia del péptido
de dirección a los cloroplastos. Las secuencias de los péptidos de
dirección a los cloroplastos (o péptidos de tránsito a los
cloroplastos) pueden ser de utilidad para dirigir a los
compartimentos celulares con estas u otras secuencias de
aminoácidos. Los polinucleótidos que codifican los péptidos de
tránsito a los cloroplastos se pueden utilizar con otras secuencias
de polinucleótidos para codificar péptidos de tránsito a los
cloroplastos.
Se resuspendió 1 a 10 (peso/volumen) un
precipitado de células de C. sorokiniana almacenado a -70ºC
en un tampón de disrupción de ARN; 0,1 M Tris (pH 8,5), 0,4 M LiCl.,
10 mM EGTA, 5 mM EDTA, 100 unidades/ml heparina sódica (Sigma, 100
unidades/mg) y 1 mM ácido aurintricarboxílico (Sigma). La suspensión
de células se centrifugó a 7000 g durante 5 minutos a 4ºC y se
descartó el sobrenadante. Se suspendió el precipitado de células 1
a 10 (peso/volumen) en tampón de disrupción de ARN y se rompió
haciéndolo pasar a través de una prensa French a una presión de
20.000 p.s.i. Se recogió el homogeneizado celular en un tubo cónico
desechable de 50 ml que contenía 0,05 veces el volumen de 20%
(peso/volumen) SDS, 0,05 veces el volumen de 0,5 M EDTA (pH 8),
200 \mug/ml proteinasa K y se incubó a temperatura ambiente
durante 15 minutos. Se añadió la mitad del volumen de fenol
equilibrado con tampón TE (Tris 10 mM; EDTA 1mM, pH 8,0) y después
de una incubación de 3 minutos se añadió medio volumen de
cloroformo:alcohol isoamilico (24:1, v/v) y se mezcló durante 10
minutos en un agitador con acción de muñeca. El homogeneizado
extraído se transfirió a un tubo Corex de 30 ml siliconizado y se
centrifugó a 1000 g durante 10 minutos a 4ºC. La fase acuosa
superior se recogió y se extrajo repetidamente con un volumen igual
de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1, v/v), tal como se describió
anteriormente, hasta que la interfase acuosa se hizo transparente.
Después de la extracción final, la fase acuosa se combinó con un
volumen igual de 2X tampón LiCl-Urea (4 M LiCl, 4 M
urea, 2 mM EDTA, 1 mM ácido aurintricarboxílico; Sigma) y se
precipitó el ARN en hielo durante 16 horas a 4ºC. el precipitado de
ARN se centrifugó a 4000 g durante 20 minutos a 4ºC y el
precipitado resultante se limpió una vez con tampón 1X
LiCl-urea y se centrifugó otra vez para precipitar
el ARN. El precipitado de ARN se disolvió en TE (pH 7,5) y se
cuantificó una alícuota espectrofotométricamente a 260 nm. Después
de la cuantificación, la fracción de mARN se aisló del ARN celular
total utilizando un equipo de columna spin de oligo(dT). Se
combinó el ARN poli(A)+ de cada preparación (50 \mug) y se
utilizó para la producción comercial de una genoteca de ADNc a
medida en \lambda Uni-ZAP XR de C.
sorokiniana (Stratagene Cloning System, Palo Alto, CA).
La genoteca \lambda ZAP amplificada, que
contiene 2 x 10^{10} pfu/ml, se plaqueó en veinte placas de petri
de 150 mm a 50.000 pfu por placa, cribado de un total de 1 x
10^{6} pfu. Las placas de fago se absorbieron para generar
duplicados en membranas circulares de 132 mm
Hybond-N y se trataron según el protocolo de
transferencia de placas de Amersham (1985, Amersham Internacional
plc, Arlington Heights, IL). Se prehibridaron las membranas en un
recipiente común en 20 ml de 2X PIPES (0,8 M NaCl, 20 mM PIPES, pH
6,5), 50% (peso/volumen) formamida, 0,5% (peso/volumen) SDS, 100
\mug/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cizalleado a
40ºC. Las membranas bloqueadas se hibridaron a 42ºC en diez bolsas
selladas térmicamente (cuatro membranas por bolsa) en tampón de
prehibridación que contiene 1 x 10^{6} cpm/membrana de la sonda de
ADNc de 242 bp de NADP-GDH HCR marcada con ^{32}P
en un agitador de laboratorio. Las membranas se limpiaron tres veces
en 200 ml de 0,1 X SSC, 0,1% (peso/volumen) SDS durante 20 minutos
por lavado a 50ºC. Las membranas por duplicado se envolvieron en
plástico y se expusieron a película Kodak X-Omat AR
a -70ºC durante 28 horas. Las placas de ADNc putativo de
NADP-GDH, detectadas en las membranas por duplicado,
se rasparon de la placa y se purificaron por plaqueado y selección
secundaria y terciaria con la sonda de la región conservada de 242
bp. Las colonias de fagos de ADNc putativos de
NADP-GDH, seleccionadas en el cribado inicial, se
combinaron y cribaron una segunda vez con un fragmento de Eco
RI/Bgl II de 130 bp de ADNc marcado con ^{32}P aislado del extremo
5' del clon de ADNc de NADP-GDH con el extremo 5'
más completo. Se subclonaron en pBluescript KS+ (Stratagene) diez
clones de NADP-GDH purificados por placa y se
transformaron en E. coli DH5\alpha F' (Bethesda Research
Laboratorios, BRL) mediante un protocolo de escisión in vivo
provisto por Stratagene. Todos los aislamientos de plásmidos se
realizaron tal como describen Kraft et al. (Kraft, R.,
J.Tardiff, K.S. Krauter, L.A.Leinwand, Biotechniques
6:544-547 (1988). El análisis de las secuencias
reveló que los 10 clones eran idénticos en el extremo 3' y diferían
en diferentes grados en el nivel de truncamiento en sus extremos 5'.
El clon más largo de ADNc con un extremo 3' completo designada
pBGDc 53 (SEC. ID nº 7) no fue lo suficientemente larga para
codificar cualquiera de las dos subunidades; por consiguiente, las
secuencias 5' terminales se determinaron mediante PCR RACE.
Las secuencias de ADNc
5'-terminales de NADP-GDH se
clonaron utilizando un proceso de PCR anclado para la amplificación
rápida de los extremos de ADNc [Frohman, M.A., en D.H.Gelford, J.J.
Snincky, T.J. White, eds, PCR Protocols, Academic Press, San
Diego, CA, pp28-38; Jain, R., R.H. Gorner, J.J.
Murtagh, Biotechniques 12:58-59 (1992)]. Una
mezcla de ARN poly(A)^{+}, utilizado en la síntesis
de la genoteca en \lambdaZAP se utilizó para clonar el extremo 5'
del mARN de NADP-GDH. Se combinaron cien nanogramos
de la mezcla de mARN con 10 ng de un cebador específico del gen
(5'-CTCAAAGGCAAGGAACTTCATG-3', SEC.
ID nº 8), diseñada para que se hibride con la región conservada de
los ARNm de NADP-GDH, se calentaron durante 5
minutos y se enfriaron en hielo. La síntesis de la primera cadena se
realizó utilizando la transcriptasa reversa Superscript^{TM} (BRL)
según los protocolos provistos por el fabricante. La reacción
terminada de la transcriptasa reversa se trató con una unidad de
ribonucleasa H durante 20 minutos a 37ºC, 5 minutos a 95ºC y se
extrajo una vez con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1, vol/vol).
El exceso de cebadores y dNTPs se eliminó mediante centrifugación a
2000 rpm a través de un tubo filterfuge Ultrafree-MC
(exclusión a 30.000 MW, Millipore) y el retenido se concentró en
10 \mul en un Savant Speedvac. Los productos de la síntesis de la
primera cadena se combinaron con 10 \mul de mezcla de cola
(tailing) (1X tampón de cola (Promega Corp.), 0,4 mM dATP, 10
unidades de deoxitranferasa Terminal) y se incubaron a 37ºC durante
10 minutos. La mezcla de reacción se calentó a 95ºC durante 5
minutos, se diluyó a 0,5 ml con TE (pH 8) y se utilizó con un
reservorio de ADNc. Una mezcla de 5 \mul del reservorio de ADNc, 5
\mul de tampón de polimerasa Vent^{TM} 10X (New England
Biolabs), 200 \muM cada uno de los dNTPs, 25 pmol de cebador
específico del gen (SEC. ID nº 8), 5 pmol de cebador adaptador de
poli(dT)
(5'-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)_{18}-3';
SEC. ID nº 9), 0,2 unidades del amplificador Perfectmatch^{TM}
para la ADN polimerasa (Stratagene) y 1 unidad de Vent^{TM}
polimerasa (NEB) en 50 \mul se amplificaron según Jain et
al., supra. Los productos de PCR se purificaron del
exceso de cebador mediante centrifugación a 2.000 rpm a través de
una unidad Ultrafree-MC. El retenido se recogió y
se sometió a dos ciclos más de amplificación utilizando un nuevo
cebador específico anidado del gen en cada ciclo
(5'-GGACGAGTACTGCACGC-3', SEC. ID nº
10; 5'-GATCTCGGTCAGCAGCTG-3', SEC.
ID nº 11, respectivamente) y un cebador adaptador
(5'-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3', SEC.
ID nº 12). Las amplificaciones por PCR se realizaron en un
termociclador Model 480 (Perkin-Elmer Cetus) y todos
los oligonucleótidos a la medida fueron sintetizados en las
instalaciones de síntesis de ADN de ICBR, Universidad de Florida. La
mezcla estándar de reacción de PCR comprendió 10 \mul de tampón
10X de polimerasa Vent^{TM}, 100 \muM de cada uno de los dNTP,
0,4 unidades de Perfectmatch^{TM}, 50 pmol de cada uno de los
cebadores, 1 unidad de ADN polimerasa Vent^{TM} en 100 \mul de
volumen de reacción. Los productos 5' de la RACE-PCR
se purificaron mediante geles, se subclonaron en el lugar SmaI de
pUC18 y se subclonaron en E. coli DH5\alpha para su
posterior caracterización. La PCR-RACE identificó
dos clones de ADNc 5', que se solapan con el clon pBGDc 53
anteriormente identificado, que difirieron en un inserto de 42 nt
identificado en uno de los clones designado
pRGDc 60 (SEC. ID nº 13) y que no se encuentra en el segundo ADNc designado pRGDc 61 (SEC. ID nº 14).
pRGDc 60 (SEC. ID nº 13) y que no se encuentra en el segundo ADNc designado pRGDc 61 (SEC. ID nº 14).
Mediante amplificación RT-PCR de
mARN se construyeron dos clones de ADNc adicionales en los que falta
el poliligador de PCR RACE, pero que contienen el
extremo-5' completo correspondiente a pRGDc 60 y 61,
utilizando las condiciones de reacción descritas anteriormente y el
par de cebadores específicos del gen
(5'-CTTTCTGCTCGCCCT
CTC-3', SEC. ID nº 15 y SEC. ID nº 11, anterior). Los dos productos de PCR se clonaron en el lugar SmaI de pBluescript SK+ (Stratagene) y se transformaron en E. coli DH5\alpha para más caracterización. El clon de ADNc que contenía el inserto de 42 nt se designó pGDc 63 (SEC. ID nº 16) mientras que el ADNc al que faltaba el inserto se designó pGDc 64 (SEC. ID nº 17).
CTC-3', SEC. ID nº 15 y SEC. ID nº 11, anterior). Los dos productos de PCR se clonaron en el lugar SmaI de pBluescript SK+ (Stratagene) y se transformaron en E. coli DH5\alpha para más caracterización. El clon de ADNc que contenía el inserto de 42 nt se designó pGDc 63 (SEC. ID nº 16) mientras que el ADNc al que faltaba el inserto se designó pGDc 64 (SEC. ID nº 17).
Se construyó un ADNc de NADP-GDH
de tamaño completo mediante el tratamiento de pGDc 63 y 64 con las
endonucleasas de restricción EcoR I/Apa LI y purificación mediante
gel de los fragmentos resultantes (264 bp; 222 bp, respectivamente).
Los fragmentos purificados mediante gel se ligaron al fragmento de
restricción purificado Apa LI/XhoI de pBGDc 53 y los productos de
ligación de tamaño completo (SEC. ID nº 18, SEC. ID nº 19) se
purificaron en un gel de agarosa y se utilizaron en las
subsiguientes reacciones de PCR.
Utilizando el producto purificado mediante gel
(SEC. ID nº 18), se realizó mutagénesis por PCR para eliminar la
señal de direccionamiento a los cloroplastos del ADNc de tamaño
completo dando ADNc que codifican específicamente las \alpha- y
\beta-subunidades maduras. Se diseñaron dos
conjuntos de pares de cebadores para sintetizar los genes de las
subunidades \alpha- y \beta-GDH.
Se diseñó el siguiente cebador con el fin de
añadir una metionina al extremo amino de la subunidad
\alpha-NADP-GDH madura y
procesada (alanina-41) para permitir la
inicialización de la traducción y generar un lugar NdeI 5' con
fines de subclonación:
5'-CATATGGCCGTCTCGCTGGAGGAG-3' (SEC.
ID nº 20). El siguiente segundo cebador se diseñó con el fin de
hibridarlo al extremo 3' del ADN molde en la posición 20 nt 3' del
codón de terminación TAA endógeno:
5'-GTTGGATTGCCGGTGAGCC-3'(SEC. ID nº
21).
El siguiente cebador se diseñó con el fin de
añadir metionina al extremo amino del la
\beta-subunidad procesada y madura
(aspartato-38) para permitir la iniciación de
traducción y para generar un lugar NdeI 5' con fines de subclonaje:
5'-CATATGGACGCCACCACCGGC-3' (SEC. ID
nº 22). El segundo cebador 3' utilizado en la amplificación
mediante PCR fue el cebador de extremo 3' (SEC. ID nº 21) descritos
para la amplificación de la \alpha-subunidad.
Las condiciones para los ciclos de PCR fueron
las siguientes: 95ºC, 50 segundos; 64ºC, 1 minuto; 72ºC, 1 minuto 35
segundos (30 ciclos). Los cebadores, dNTP, polimerasa Vent y las
concentraciones de otros componentes de la reacción fueron tal como
se describió anteriormente. Los productos de PCR del gen de la
subunidad \alpha- NADP-GDH de 1506 bp (SEC. ID nº
23) y del gen de la subunidad \beta- NADP-GDH de
1473 bp (SEC ID nº 25) se purificaron mediante geles y provistos del
nucleótido adenina colgante en el extremo 3' mediante la incubación
del fragmento purificado con 100 \muM dATP y polimerasa Taq
durante 15 minutos a 72ºC. Los productos de PCR modificados se
clonaron en el vector de clonaje PCRII T/A (Invitrogen) y se
transformaron en células competentes de E. coli. Los clones
portadores de los insertos se seleccionaron mediante selección de
colonias azules-blancas, se purificó el plásmido y
se digirió con Nde I/BamHI para seleccionar la orientación adecuada
en un segundo vector de clonaje. Los plásmidos seleccionados se
restringieron mediante NdeI y BamHI (lugar BamHI provisto por el
vector) y se clonaron en la dirección adecuada bajo el control del
promotor de la polimerasa T7 inducible por IPTG del vector de
expresión bacteriano pET 11a y pET 15b bacteriano de (Novagen)
linearizado con Nde I/BamHI y se transformaron en DH5\alpha. Los
transformantes se cribaron mediante análisis de restricción con Nde
I/BamHI y se seleccionaron los clones provistos de los ADNc de las
\alpha- y \beta-subunidades (SEC. ID nº 23;
SEC. ID nº 25), se purificó el plásmido y se transformó en E.
coli BL21(DE3) con el fin de expresar proteína.
Las células de E. coli BL21(DE)
transformadas con las construcciones pET
11a-\alpha-ADNc y pET
11a-\beta-ADNc se indujeron con
100 mM IPTG durante 1 hora. Los extractos de proteína extraídos de
las células inducidas se ensayaron enzimáticamente para determinar
actividad NADP-GDH y las proteínas desnaturalizadas
se fraccionaron mediante electroforesis en geles de SDS y se
visualizaron mediante tinción con azul coomassie. Las proteínas
expresadas por el ADNc de la \alpha-subunidad
madura (SEC. ID nº 23) y el ADNc de la
\beta-subunidad (SEC. ID nº 25) tiene la
secuencia de aminoácidos mostradas por las SEC. ID nº 24
(\alpha-subunidad) y la SEC. ID nº 26
(\beta-subunidad). Las unidades de GDH
recombinante se verificaron mediante la reactividad cruzada con
anticuerpos de conejo antiNADP-GDH de
Chlorella.
Chlorella.
En condiciones no optimizadas para una máxima
inducción, las células de E. coli, que poseen ADNc de
\alpha- y \beta-GDH y están inducidas por IPTG,
mostraron un incremento en la actividad de NADP-GDH
comprendido entre 60- y 7.000 veces relativo a los controles no
inducidos, respectivamente. Las \alpha- y \beta-
NADP-GDH están actualmente siendo analizadas para
verificar sus propiedades cinéticas y bioquímicas.
La sobre expresión y el ensamblaje de las GDH
cloroplásticas de C. sorokiniana en enzimas activos
proporciona la prueba de que las construcciones de ADN construidas
mediante PCR se transcriben y traducen en proteínas auténticas. Las
construcciones mencionadas anteriormente, a continuación se
utilizaron en la expresión citosólica de las GDH de alga en
vegetales transgénicos.
Un procedimiento para producir vegetales
genéticamente transformados que expresan niveles amplificados de
una GDH específica necesita la introducción de una molécula
recombinante de ADN de doble cadena en el genoma nuclear de una
célula vegetal. La molécula de ADN debe (1) contener un ADN
estructural para el enzima GDH que se debe introducir en la célula
vegetal; (2) disponer de un promotor que funciona en los vegetales
para regular la producción de secuencias de ARN de modo
constitutivo o tejido específico mediante el enzima ARN polimerasa;
y (3) disponer de una región 3'-no traducida que
funciona para inducir la terminación de la transcripción y la
adición de nocleótidos poliadenilados al extremo 3' del ARN. La
molécula de ARN primaria resultante a continuación se procesa en el
núcleo, un proceso que implica la eliminación de las secuencias
intrónicas y la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3'
del mARN.
Los promotores de utilidad en la presente
invención son los que pueden iniciar la transcripción de modo
constitutivo o de modo tejido específico en la que la producción o
catabolismo del glutamato son deseables. Un ejemplo de promotor
constitutivo de utilidad es el promotor amplificado CaMV 35S que
dirige la síntesis de ARN de un modo tejido específico. Los
promotores que causan la producción de GDH específicamente en
semillas, tallos, raíces, hojas o tipos celulares específicos en
tales tejidos son de utilidad en la presente invención. Por
ejemplo, el promotor específico de las semillas de la Phaseolina es
uno de tales promotores tejido específicos. Por consiguiente, los
promotores nativos específicos para maíz, trigo, centeno y arroz se
pueden obtener y utilizar en la presente invención así como también
como los promotores heterólogos de otros organismos que se ha
demostrado que funcionan de modo constitutivo/tejido específico.
Generalmente, la expresión óptima en las plantas
monocotiledóneas se obtiene cuando se inserta una secuencia de
intrón entre la secuencia de promotor y la secuencia del gen
estructural. Un ejemplo de tal secuencia intrónica es el intrón HSP
70 descrito en el documento WO 93/19189.
Las construcciones de ADN de la presente
invención pueden poseer una región 3' no traducida que funciona en
los vegetales para dirigir la adición de nucleótidos poliadenilados
al extremo 3' del ARN. Un ejemplo de región 3' no traducida
adecuada es la señal de poliadenilación del plásmido inductor de
tumores de Agrobacterium, es decir, el gen de la nopalina
sintetasa el gen (NOS).
Las construcciones de ADN de la presente
invención pueden opcionalmente contener secuencias directoras a los
plastos. Las secuencias directoras a los plastos dirigen la
importación de las proteínas a los plastos y se elimina durante la
importación. La secuencia directora a los plastos puede ser, de
manera no limitativa, el péptido nativo de dirección a cloroplastos
(CTP) identificado en ADNc de tamaño completo de la
NADP-GDH de C. sorokiniana que codifica las
proteínas precursoras. Una fusión de una secuencia directora a
plastos seleccionada y las secuencias de las subunidades \alpha-
y \beta-NADP-GDH maduras se puede
realizar mediante procedimientos estándar y ser utilizada en la
presente invención. Las subunidades de GDH que carecen de estas
secuencias de dirección se encuentran típicamente en el citoplasma
de la célula. Dicha localización citosólica del enzima puede ser de
utilidad en la captura de de amonio o glutamato compartimentalizado
en el citosol de la célula.
El gen GDH utilizado en las construcciones de
ADN de la presente invención puede ser cualquier gen GDH. No queda
limitado a los genes de GDH de C. sorokiniana descritos
anteriormente, aunque éstos son preferidos. Por ejemplo, se puede
utilizar un gen GDH de bacteria u hongo. Los ejemplos proporcionados
utilizan los genes \alpha- y \beta-GDH de C.
sorokiniana, pero no se deben interpretar como limitativos del
alcance de la presente invención en modo alguno. Los expertos en la
materia reconocerán que se puede utilizar otra multiplicidad de
genes así como también alteraciones a los genes y procedimientos
descritos en la presente invención sin apartarse del espíritu y
alcance de la presente invención. Por ejemplo, se puede implementar
la mutagénesis y el cribado estándar mediante procedimientos
conocidos en la materia para generar variantes mutantes que carecen
de la regulación mediante el cofactor NADPH.
Para ensayar la expresión de las subunidades de
GDH de C. sorokiniana y su ensamblaje en enzimas activos en
células de Zea mays, se construyeron vectores que contienen
el promotor CaMV E35S, la secuencia codificante de la
\alpha-subunidad madura (pMON2194) o la
\beta-subunidad (pMON21905), la región de
poliadenilación 3' no traducida NOS y la de resistencia a la
kanamicina para seleccionar en E. coli. Los genes de las
\alpha- y \beta-subunidades se aislaron como
fragmentos Xba I-EcoR I a partir de pET
11a-\alpha-ADNc y pET
11a-\beta-ADNc, respectivamente.
Se ligaron los genes GDH en la región portadora de resistencia a
kanamicina en el promotor Xba I-EcoR I E35S, NOS '3
de pMON22072 para dar pMON21904 y pMON21905. Las construcciones de
ADN se electroporaron en protoplastos de maíz y trigo según el
procedimiento de Sheen et al. (The plant cell Vol 3,
225-245).
Los precipitados de muestras de protoplastos
transformados con pMON21904 (\alpha-subunidad),
pMON21905 (\beta-subunidad) pMON21709 (ADN de
control kanamicina negativo) y no-ADN se
descongelaron en 0,2 ml de tampón de lisis de células GDH (Yeung
et al, supra) en hielo. Las células en cada suspensión
se homogeneizaron dos veces durante 30 segundos, se enfriaron en
hielo y se aclararon a 14.000 rpm durante 10 minutos. Los extractos
de las células se ensayaron en la dirección de desaminación a
38,5ºC según Yeung et al., supra. El contenido total
de los extractos celulares se determinó utilizando el ensayo de
microproteínas de BioRad según el protocolo de los fabricantes. Las
actividades se normalizaron contra el contenido total de proteína
para las comparaciones entre las diferentes preparaciones. Una
unidad de actividad de GDH se define como la cantidad de enzima
necesaria para reducir 1 \mumol de NADP por minuto a 38,5ºC.
Los protoplastos transformados con el vector
control pMON21709 (n = 3) o los protoplastos no transformados
(n = 3) no presentaron actividad detectable NADP-GDH detectable. Los protoplastos trasformados con pMON21904 (n = 3) expresaron 3,31 Unidades\cdotmg^{-1} de proteína con actividad GDH, mientras que los protoplastos trasformados por pMON21905 (n = 3) tuvieron 1,96 Unidades\cdotmg^{-1} proteína.
(n = 3) no presentaron actividad detectable NADP-GDH detectable. Los protoplastos trasformados con pMON21904 (n = 3) expresaron 3,31 Unidades\cdotmg^{-1} de proteína con actividad GDH, mientras que los protoplastos trasformados por pMON21905 (n = 3) tuvieron 1,96 Unidades\cdotmg^{-1} proteína.
El elevado nivel de actividad observado en los
protoplastos transformados con los genes de \alpha- y \beta-
NADP-GDH de C. sorokiniana expresados en el
citoplasma proporcionan pruebas de que las subunidades GDH se
expresan en sistemas vegetales heterólogos. Además, los niveles de
expresión demuestran que las subunidades se ensamblan en encimas
activos. Generalmente, resultaría evidente para los expertos en la
materia que las secuencias superfluas añadidas a las secuencias
descritas, o los fragmentos de las secuencias de nucleótidos o
aminoácidos descritos en la presente memoria, que resultan en
secuencias de polinucleótidos o aminoácidos que funcionan de modo
semejante o equivalente al de las secuencias descritas expresamente
en la presente memoria, se deben asimismo considerar parte de la
presente invención. Se pueden producir fácilmente y rutinariamente
mediante procedimientos conocidos en la materia, por ejemplo,
mediante la digestión controlada en el tiempo con la exonucleasa
Bal31 del ADN de tamaño completo, seguido de expresión de los
fragmentos resultantes y cribado de rutina de los productos de
expresión tal como se describe en los ejemplos anteriores. Además,
resultaría fácilmente evidente para los expertos en la materia que
las funciones, propiedades o utilidad de las secuencias descritas
pueden ser negadas mediante la inserción de mutaciones en las
secuencias mediante la utilización de procedimientos y técnicas
estándar. Tales mutaciones que, mediante implicación, sirven para
eliminar efectivamente la propiedad o función inherente a la
secuencia tal como se describió, se incluyen en la presente memoria
expresamente como parte de la presente invención. Por ejemplo, una
clara distinción entre las \alpha- y
\beta-subunidades de C. sorokiniana es la
secuencia de polipéptido de 11 aminoácidos en el extremo
N-terminal de la
\alpha-subunidad, pero que está ausente en la
\beta-subunidad. Dicha secuencia puede afectar la
afinidad, especificidad y modulación de los compuestos de amonio por
el enzima. Por consiguiente, sería evidente que la inserción (si se
encuentra ausente) o eliminación (si se encuentra presente) de la
secuencia apropiada, o su equivalente funcional, para producir una
diferencia en ciertas características de otros genes de GDH, o sus
productos, sería fácil de realizar por tales personas.
(1) Información General:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Información del solicitante:
| Nombre del solicitante(s): | University of Florida | |
| Dirección: | 223 Grinter Hall | |
| Ciudad: | Gainesville | |
| Estado/provincia: | Florida | |
| País: | US | |
| Código postal: | 32611 | |
| Número de teléfono: | (352) 392 8929 FAX: (352) 392 6600 |
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Título de la invención: Polipéptidos y polinucleótidos relacionados con las \alpha- y \beta-subunidades de las glutamato deshidrogenasas y procedimientos de utilización
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Número de las secuencias: 26
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- Dirección de correspondencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Remitente: Saliwanchik & Saliwanchik
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Calle: 2421 N.W. 41st Street, Suite A-1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Ciudad: Gainesville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Estado: Florida
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- País: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- Código postal: 32602
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- Forma legible por ordenador:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Tipo de medio: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Ordenador: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Software: PatentIn publicación # 1.0, versión # 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- Datos de la solicitud actual:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Numero de solicitud: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Fecha de solicitud:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Clasificación:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- Información del abogado/agente:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Nombre: Whitelock, Ted W.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Número de registro: 36.965
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Numero de referencia/certificado: UF155
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- Información de telecomunicaciones:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Teléfono: (904) 375 8100
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Telefax: (904) 372 5800
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 2140 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Nombre/código: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Localización: 33..1610
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC. ID nº 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 526 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 2099 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Nombre/código: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Localización: 33..1568
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 512 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Leu Glu Glu Gln Ile Ser Ala Met
Asp Ala Thr Thr Gly}
\sac{Asp Phe Thr Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ala Thr Thr Gly Asp Phe Thr Ala
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 1969 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCAAAGGCA AGGAACTTCA TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTCGACAT TCTAGACAGA ATTCGTGGAT CCTTTTTTTT TTTTTTTTTT
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACGAGTAC TGCACGC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCTCGGTC AGCAGCTG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTCGACAT TCTAGACAGA A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 367 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 325 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTTCTGCTC GCCCTCTC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 308 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 266 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 2137 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 2096 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATATGGCCG TCTCGCTGGG AGGAG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTGGATTGC CGGTGAGCC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATATGGACG CCACCACCGG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 1506 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Nombre/código: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Situación: 4..1464
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 487 aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 1473 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Nombre/código: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Localización: 4..1431
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información de SEC. ID nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 476 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC. ID nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Polinucleótido que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos
seleccionada de entre SEC. ID nº 2; SEC. ID nº 4; SEC. ID nº 24 y
SEC. ID nº 26 o un fragmento de la misma que presenta actividad
glutamato deshidrogenasa (GDH).
2. Polinucleótido que comprende una secuencia
de nucleótidos seleccionada de entre SEC. ID nº 1; SEC. ID nº 3;
SEC. ID nº 18; SEC. ID nº 19; SEC. ID nº 23 y SEC. ID nº 25; o un
fragmento de la misma que codifica un péptido que presenta
actividad GDH.
3. Polinucleótido según la reivindicación 2,
que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre
SEC. ID nº 1; SEC. ID nº 3; SEC. ID nº 23 y SEC. ID nº 25, o un
fragmento de la misma que codifica un péptido que presenta
actividad GDH.
4. Polinucleótido según la reivindicación 2,
que forma un gen quimérico capaz de expresión en células vegetales,
estando dicho polinucleótido unido funcionalmente a un promotor
expresable en vegetales y a una secuencia de poliadenilación
vegetal.
5. Polinucleótido según la reivindicación 2,
que comprende por lo menos una secuencias de nucleótidos que
codifica una subunidad alfa de NADP-GDH y por lo
menos una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad beta
de NADP-GDH.
6. Polinucleótido según la reivindicación 5,
en la que dicho polinucleótido comprende además un promotor para
dicho polinucleótido que codifica una subunidad alfa de
NADP-GDH y una subunidad beta de
NADP-GDH.
7. Polinucleótido según la reivindicación 6,
que comprende diferentes promotores para la subunidad alfa y para la
subunidad beta.
8. Polinucleótido según la reivindicación 6,
en el que dicho promotor tiene una actividad diferencial para las
subunidades alfa y beta.
9. Polinucleótido según la reivindicación 5,
que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre la
SEC. ID nº 1 y la SEC. ID nº 23 y una secuencia de nucleótidos
seleccionada de entre SEC. ID nº 3 y la SEC. ID nº 25.
10. Célula huésped transformada que comprende
un polinucleótido según la reivindicación 1.
11. Célula huésped transformada según la
reivindicación 10, en la que dicho polinucleótido comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada de entre SEC. ID nº 1, SEC. ID
nº 3; SEC. ID nº 23 y SEC. ID nº 25.
12. Procedimiento para modular el metabolismo
del nitrógeno en una célula vegetal, que comprende transformar
dicha célula vegetal para que comprenda un polinucleótido según la
reivindicación 1, y mantener dicha célula o descendientes de la
misma en condiciones en las que dicho polipéptido se expresa.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
en el que dicho polinucleótido tiene una secuencia de nucleótidos
que codifica por lo menos una subunidad alfa de
NADP-GDH y por lo menos una secuencia de nucleótidos
que codifica una subunidad beta de NADP-GDH.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
en el que dicho polinucleótido codifica un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC. ID
nº 2 y SEC. ID nº 24 y una secuencia de aminoácidos seleccionada de
entre SEC. ID nº 4 y SEC. ID nº 26.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en el que dicho polinucleótido se
encuentra unido funcionalmente a un promotor expresable en los
vegetales y a una secuencia de poliadenilación vege-
tal.
tal.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, en el que la asimilación de nitrógeno
inorgánico en nitrógeno orgánico es incrementada.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 16, en el que se incrementa el rendimiento de
las cosechas, o la asimilación de amonio, o la tolerancia al estrés
osmótico o la composición de la planta es alte-
rada.
rada.
18. Polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada de entre SEC. ID nº 2; SEC. ID nº 4; SEC.
ID nº 5; SEC. ID nº 6; SEC. ID nº 24 y SEC. ID nº 26 o un fragmento
de las mismas que presenta actividad GDH.
19. Polipéptido que comprende por lo menos una
subunidad alfa de NADP-GDH que comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC. ID nº 2 y SEC.
ID nº 24, o un fragmento de las mismas que presenta actividad GDH,
y por lo menos una subunidad beta de NADP-GDH.
20. Polipéptido según la reivindicación 19, en
la que la subunidad beta comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada de entre SEC. ID nº 4 y SEC. ID nº 26.
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| US20020062495A1 (en) * | 1998-05-01 | 2002-05-23 | Robert R. Schmidt | Novel polypeptides and polynucleotides relating to the a- and b-subunits of glutamate dehydrogenases and methods of use |
| US5879941A (en) * | 1995-10-06 | 1999-03-09 | University Of Florida | Polypeptides and polynucleotides relating to the α-and β-subunits of a glutamate dehydrogenase and methods of use |
| US5998700A (en) * | 1996-07-02 | 1999-12-07 | The Board Of Trustees Of Southern Illinois University | Plants containing a bacterial Gdha gene and methods of use thereof |
| CA2180786C (en) | 1996-07-02 | 2008-05-27 | David Lightfoot | Plants containing the gdha gene and methods of use thereof |
| US6653099B1 (en) | 1998-11-05 | 2003-11-25 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Plant UDP-glucose dehydrogenase |
| CA2372123C (en) * | 1999-05-13 | 2010-10-26 | Monsanto Technology Llc | Expression of sedoheptulose 1,7 bisphosphatase in transgenic plants |
| US6815580B1 (en) | 1999-05-13 | 2004-11-09 | Monsanto Technology Llc | Expression of the Chlorella sorokiniana sedoheptulose 1,7-bisphosphatase in transgenic plants |
| CN1137265C (zh) * | 2000-07-06 | 2004-02-04 | 中国科学院微生物研究所 | 一种提高植物氮素同化效率的方法 |
| US8022272B2 (en) | 2001-07-13 | 2011-09-20 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids |
| CN100537768C (zh) * | 2003-07-17 | 2009-09-09 | 味之素株式会社 | 氮限制条件下生长得以改善的植物的制备方法 |
| JP2005229823A (ja) * | 2004-02-17 | 2005-09-02 | Ajinomoto Co Inc | 休眠期間の短縮した植物、およびその作出法 |
| EP2163632A1 (en) | 2004-10-05 | 2010-03-17 | SunGene GmbH | Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression |
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| CN101155922A (zh) | 2005-02-09 | 2008-04-02 | 巴斯福植物科学有限公司 | 在单子叶植物中调控表达的表达盒 |
| BRPI0607378A2 (pt) | 2005-02-26 | 2010-03-23 | Basf Plant Science Gmbh | cassetes de expressço, seqÜÊncia nucleotÍdica isolada, vetor, cÉlula hospedeira transgÊnica ou organismo nço humano, cÉlula de planta ou planta transgÊnica, mÉtodos para identificar e/ou isolar uma seqÜÊncia nucleotÍdica reguladora da transcriÇço, para prover ou produzir um cassete de expressço transgÊnica, e para prover uma seqÜÊncia nucleotÍdica reguladora de transcriÇço sintÉtica, e, seqÜÊncia reguladora de transcriÇço sintÉtica |
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| CN101203611B (zh) | 2005-04-19 | 2013-08-14 | 巴斯福植物科学有限公司 | 控制基因表达的改良方法 |
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| EP2436769B1 (en) | 2006-06-07 | 2015-04-01 | Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. | Plant expression constructs and methods of utilizing same |
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| TWI356705B (en) * | 2007-10-25 | 2012-01-21 | Internat Chlorella Co Ltd | Extracts from chlorella sorokiniana |
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|---|---|---|---|---|
| SU958502A1 (ru) * | 1981-02-13 | 1982-09-15 | Ордена Ленина Институт Биохимии Им.А.Н.Баха | Способ выделени никотинамидадениндинуклеотид-глутаматдегидрогеназы из хлореллы |
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