ES2269976T3 - Agonistas del receptor 2 del factor de liberacion de la corticotropina. - Google Patents

Abstract

Un péptido no nativo que comprende la secuencia: IVLSLDVPIGLLQILLEQEKX21RAAREQATTNARILARV en donde X21 se selecciona de A y Q, o variantes del mismo que tienen al menos 97% de identidad con la secuencia, siendo dichas variantes agonistas del CRF2R.

Description

Agonistas del receptor 2 del factor de liberación de la corticotropina.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de nuevos péptidos, y ácidos nucleicos que codifican los mismos, para tratar trastornos modulados por CRF_{2}R.

Antecedentes de la invención Receptores del factor liberador de la corticotropina (CRFR) y ligandos

Existen al menos dos receptores del CRF (factor liberador de la corticotropina) identificados hasta la fecha (CRF_{1}R y CRF_{2}R) que pertenecen a la clase de los receptores acoplados a la proteína G (GPCR). La activación agonista de los CRF_{1}R o CRF_{2}R conduce a la activación de la adenilatociclasa por G_{\alpha s}. La adenilatociclasa cataliza la formación de AMPc que, a su vez, tiene múltiples efectos incluyendo la activación de la proteína cinasa A, la liberación de calcio intracelular y la activación de la proteína cinasa activada por mitógenos (MAP cinasa). En otros estudios, la mejora de la síntesis intracelular de inositol trifosfato, tras la activación agonista de los receptores del CRF, sugiere que los CRFR también se acoplan a la proteína G_{\alpha q}.

Se han clonado CRF_{1}R y CRF_{2}R de humanos, ratas, ratones, pollos, vacas, bagres, ranas y ovejas. Cada CRF_{1}R y CRF_{2}R tiene un único patrón de distribución. En humanos se han clonado tres isoformas, alfa, beta y gamma, del receptor CRF_{2}R. Se han identificado homólogos de CRF_{2}R alfa y beta en ratas.

Se conocen diversos ligandos/agonistas de los CRFR e incluyen factor liberador de corticotropina (u hormona, CRF, CRH), urocortina I, urocortina II (o péptido relacionado con stresscopina), urocortina III (o stresscopina), urotensina I, sauvagina y otros péptidos relacionados. El factor liberador de corticotropina se une y activa los CRF_{1}R y CRF_{2}R. El CRF es un modulador principal de las respuestas corporales frente al estrés. Este péptido de 41 aminoácidos preside una colección de procesos neuronales, endocrinos e inmunológicos como regulador principal del eje hormonal hipotálamo-pituitario-suprarrenal (eje HPA). Además, existe una considerable homología secuencial entre todos los ligandos conocidos del CRFR. Además, se han identificado dos ligandos selectivos del CRF_{2}R, la urocortina II (o péptido relacionado con la stresscopina) y la urocortina III (stresscopina). Se han identificado estos péptidos en numerosas especies de mamíferos y peces. Por ejemplo, Mso y col., en Nature Medicine, VSI. 7, núm. 5, mayo 2001, págs. 605-611, describen la stresscopina humana, análogos de la misma de pez globo y Meirselectividad para CRF_{2}R.

Farmacológicamente, los receptores del CRF se pueden distinguir de los no receptores del CRF a través del uso de agonistas y antagonistas selectivos del receptor. Estos agonistas y antagonistas selectivos, junto con los ratones con el CRFR anulado, han sido útiles para determinar el receptor del CRF que media en una respuesta biológica particular.

El papel del CRF_{1}R ha sido bastante bien establecido. Los ratones con ablación del gen CRF_{1}R (CRF_{1}R desactivado) demuestran una respuesta al estrés disminuida y un reducido comportamiento ansiogénico. El CRF_{1}R es un mediador principal del eje HPA. Específicamente, el CRF que se libera del hipotálamo y se transporta a la pituitaria anterior a través del sistema portal hipotalámico-hipofisiario interactúa con el CRF_{1}R presente en las células localizadas en la pituitaria anterior. La activación agonista del CRF_{1}R da lugar a la liberación de ACTH de las células de la pituitaria anterior a la circulación sistémica. La ACTH liberada se une al receptor de la ACTH presente en las células localizadas en la corteza suprarrenal, ocasionando la liberación de hormonas suprarrenales incluyendo corticosteroides. Los corticosteroides median en numerosos efectos incluyendo, aunque no de forma limitativa, la supresión del sistema inmune a través de un mecanismo que implica atrofia tímica y esplénica. Así, la activación del CRF_{1}R da lugar indirectamente a la regulación negativa del sistema inmunológico a través de la activación del eje HPA.

El papel del CRF_{2}R no está tan bien establecido. Los ratones con ablación del gen CRF_{2}R (CRF_{2}R desactivado) demuestran una menor o reducida ingesta de alimentos después de la estimulación con urocortina, falta de vasodilatación, pero una respuesta al estrés normal. Los experimentos con CRF_{2}R demuestran que el CRF_{2}R es responsable de los efectos hipotensores/vasodilatadores de los agonistas del CRFR y de la reducción de la ingesta de alimentos observada tras el tratamiento de ratones con agonistas del CRFR.

Atrofia e hipertrofia muscular esquelética

Asimismo, el CRF_{2}R está relacionado con la modulación de la atrofia muscular esquelética y la inducción de la hipertrofia. El músculo esquelético es un tejido plástico que se adapta fácilmente a los cambios de cada demanda fisiológica por necesidades de trabajo o metabólicas. La hipertrofia se refiere a un incremento de la masa muscular esquelética mientras que la atrofia muscular esquelética se refiere a una disminución de la masa muscular esquelética. La atrofia muscular esquelética aguda se puede deber a diversas causas incluyendo, aunque no de forma limitativa: desuso debido a cirugía, reposo en cama o rotura de huesos; denervación/daño nervioso debido a lesión de la médula espinal, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa; uso de glucocorticoides para condiciones no relacionadas; septicemia debida a infecciones u otras causas; limitación de nutrientes debido a enfermedad o inanición; y viaje espacial. La atrofia muscular esquelética se produce durante procesos biológicos normales aunque, en ciertas situaciones médicas, este proceso biológico normal da lugar a un nivel debilitante de atrofia muscular. Por ejemplo, la atrofia muscular esquelética aguda presenta una limitación significativa para la rehabilitación de pacientes de inmovilizaciones incluyendo, aunque no de forma limitativa, los inmovilizadores que acompañan un procedimiento ortopédico. En tales casos, el período de rehabilitación necesario para corregir la atrofia muscular esquelética es a menudo mayor que el período de tiempo necesario para reparar la lesión original. Dicha atrofia de desuso aguda es un problema particular en las personas mayores que pueden sufrir ya de déficits básicos relacionados con la edad en la función y masa muscular, porque dicha atrofia puede conducir a incapacidad permanente y mortalidad prematura.

La atrofia muscular esquelética también puede dar lugar a condiciones crónicas como caquexia por cáncer, inflamación crónica, caquexia por sida, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), insuficiencia cardiaca congestiva, trastornos genéticos, p. ej., distrofias musculares, enfermedades neurodegenerativas y sarcopenia (pérdida muscular asociada con la edad). En estas condiciones crónicas, la atrofia muscular esquelética puede conducir a una pérdida prematura de movilidad, añadiéndose por tanto a la morbilidad relacionada con enfermedades.

Se sabe poco con respecto a los procesos moleculares que controlan la atrofia o hipertrofia del músculo esquelético. Aunque el disparador inicial de la atrofia muscular esquelética es diferente para los diversos eventos iniciadores de atrofia, ocurren varios cambios bioquímicos comunes en la fibra muscular esquelética afectada, incluyendo un descenso de la síntesis de proteínas y un aumento de la degradación de proteínas, y cambios en las isoenzimas de proteínas enzimas contráctiles y metabólicas característicos de un intercambio muscular lento (metabolismo muy oxidante/isoformas de proteínas contráctiles lentas) a rápido (metabolismo muy glicolítico/isoformas de proteínas contráctiles rápidas). Los cambios del músculo esquelético adicionales que ocurrirán incluyen la pérdida de vasculatura y el remodelado de la matriz extracelular. Tanto el intercambio lento como el intercambio rápido muscular muestran atrofia en condiciones apropiadas, con la correspondiente pérdida muscular dependiendo de los estímulos o condiciones de atrofia específicos. En gran medida, todos estos cambios se regulan coordenadamente y se activan o desactivan en función de los cambios en las necesidades fisiológicas y metabólicas.

Los procesos por los que ocurre atrofia o hipertrofia se conservan a través de las especies de mamíferos. Muchos estudios han demostrado que los mismos procesos moleculares, celulares y fisiológicos se producen durante la atrofia tanto en roedores como en humanos. Así, los modelos de atrofia muscular esquelética en roedores se han utilizado con éxito para comprender y predecir respuestas de atrofia en humanos. Por ejemplo, la atrofia inducida por diversos medios tanto en roedores como en humanos da lugar a cambios similares en la anatomía muscular, el área de sección transversal, la función, el tipo de fibra de intercambio, la expresión de las proteínas contráctiles y la histología. Además, se ha demostrado que diversos agentes regulan la atrofia muscular esquelética en roedores y humanos. Estos agentes incluyen esteroides anabólicos, hormona del crecimiento, factor de crecimiento I de tipo insulina, agonistas beta adrenérgicos y agonistas del CRF_{2}R. En su conjunto, estos datos demuestran que la atrofia muscular esquelética resulta de mecanismos comunes tanto en roedores como en humanos.

Aunque se ha mostrado que algunos agentes regulan la atrofia muscular esquelética y han sido aprobados para su uso en humanos con esta indicación, estos agentes tienen efectos adversos no deseables tales como hipertrofia del músculo cardiaco, neoplasia, hirsutismo, androgenización femenina, morbilidad y mortalidad aumentada, daños hepáticos, hipoglicemia, dolor musculoesquelético, aumento del turgor de los tejidos, taquicardia y edema. Actualmente, no existen tratamientos muy eficaces y selectivos para la atrofia muscular esquelética aguda o crónica. Por lo tanto, sigue siendo necesario identificar otros agentes terapéuticos para tratar la atrofia muscular esquelética.

Distrofias musculares

Las distrofias musculares abarcan un grupo de trastornos musculares hereditarios y progresivos que se distinguen clínicamente por la distribución selectiva de la debilidad muscular esquelética. Las dos formas más comunes de distrofia muscular son las distrofias de Duchenne y de Becker, que resultan de la herencia de una mutación del gen de la distrofina, que está situado en el locus Xp21. Otras distrofias incluyen, aunque no de forma limitativa, distrofia muscular del cinturón de las extremidades originado por la mutación de múltiples locus genéticos incluyendo los locus de la calpaína p94, adhalina, \gamma-sarcoglican y \beta-sarcoglican; distrofia muscular fascioscapulohumeral (Landouzy-Dejerine), distrofia miotónica y distrofia muscular de Emery-Dreifuss. Los síntomas de la distrofia muscular de Duchenne que ocurre casi exclusivamente en hombres, incluyen marcha de pato, caminar en puntillas, lordosis, caídas frecuentes y dificultad para subir escaleras. Los síntomas comienzan a la edad de 3 a 7 años con la mayoría de los pacientes confinados a una silla de ruedas al cabo de 10-12 años y muchos mueren a la edad de aproximadamente 20 años debido a complicaciones respiratorias. El tratamiento actual de la distrofia muscular de Duchenne incluye la administración de prednisona (un fármaco corticosteroide) que, aunque no cura, ralentiza la disminución de fuerza muscular y retrasa la incapacidad. Se cree que los corticosteroides, tales como la prednisona, actúan bloqueando la activación e infiltración celular inmune que son precipitados por daños en las fibras musculares resultantes de la enfermedad. Desgraciadamente, el tratamiento con corticosteroides también da lugar a atrofia muscular esquelética que niega algunas de las ventajas potenciales del bloqueo de la respuesta inmune de estos pacientes. Por tanto, sigue siendo necesario identificar agentes terapéuticos que ralenticen el daño a las fibras musculares y retrasen la presentación de incapacidad en pacientes con distrofias musculares, pero que causen daños menores de atrofia muscular esquelética que las terapias actuales.

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Sumario de la invención

La presente invención proporciona péptidos aislados, según la reivindicación 1, que son agonistas del CRF_{2}R. Específicamente, la invención proporciona un péptido aislado, según la reivindicación 1, o ácido nucleico que codifica dicho péptido, que son de tipo CRF, urocortina I, urocortina II, urocortina III, sauvagina, urotensina I o derivados de péptidos relacionados. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz y segura de un péptido aislado de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona además un conjunto o kit que comprende un péptido aislado en forma de dosis unitaria e instrucciones de uso.

La administración de un péptido, o ácido nucleico que codifica dicho péptido, composición farmacéutica o kit de la presente invención a un sujeto en necesidad del mismo es eficaz para el tratamiento de trastornos modulados por CRF_{2}R, tales como atrofia o desgaste muscular. La invención también proporciona un anticuerpo específico para los péptidos de la presente invención. Finalmente, la invención proporciona el uso de un péptido de la presente invención, o ácido nucleico que codifica dicho péptido, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno modulado por CRF_{2}R en un sujeto en necesidad del mismo.

Descripción de la lista de secuencias

La Tabla 1 describe diversas proteínas y secuencias de fragmentos de proteínas que se unen con receptores del CRF. Estas secuencias seleccionadas se incluyen con su correspondiente número o números de acceso Genbank o Derwent y la especie animal considerada, así como los números de acceso de las secuencias de nucleótidos relacionadas que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o casi idénticas. Estas secuencias conocidas y nuevas de la invención se presentan detalladamente en la lista de secuencias

TABLA 1

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2

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Descripción de la invención Glosario de términos

La siguiente es una lista de definiciones de términos usados en la presente memoria.

"Agonista" es cualquier compuesto, incluyendo, aunque no de forma limitativa, anticuerpos, que activa un receptor. Por ejemplo, los agonistas del CRFR incluyen, aunque no de forma limitativa, CRF, urocortina, urocortina II, urocortina III, urotensina I, sauvagina y análogos relacionados.

"Anticuerpo", en sus diversas formas gramaticales, significa moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión de antígenos que une específicamente un antígeno. En la presente memoria, "anticuerpo aislado" significa un anticuerpo que ha sido parcial o completamente separado de proteínas y moléculas orgánicas naturales con las que está asociado de forma natural.

"Afinidad de unión" significa la tendencia de un ligando a interactuar con un receptor y está relacionada inversamente con la constante de disociación de una interacción específica de ligando del CRF-CRFR. La constante de disociación se puede medir directamente mediante técnicas estándares de unión por saturación, competencia o cinética o indirectamente mediante técnicas farmacológicas que implican ensayos funcionales y puntos finales.

"Anticuerpo quimérico" significa un anticuerpo que contiene elementos estructurales de dos o más moléculas de anticuerpos diferentes, es decir, de especies animales diferentes. Los anticuerpos quiméricos incluyen, aunque no de forma limitativa, los anticuerpos conocidos como "anticuerpos humanizados" que incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos quiméricos generados mediante la técnica conocida como injerto de regiones determinantes de la complementariedad.

"CRF" significa factor liberador de la corticotropina que es igual que hormona liberadora de la corticotropina (CRH). Los péptidos de tipo CRF ilustrativos incluyen CRF r/h y CRF ovinos (véase la patente US-4.415.558), y similares.

"Análogo del CRF" significa sustancias que actúan como ligandos de los CRFR. Se pueden obtener análogos del CRF adecuados de diversas especies de vertebrados e incluyen, aunque no de forma limitativa, sustancias tales como sauvagina (véase, p. ej., la patente US-4.605.642), urotensina (véanse, p. ej., las patentes US-4.908.352 y US-4.533.654), urocortina II de ratón, péptido relacionado con la urocortina humana (Reyes, T.M. y col., Proc. Nat'l Acad Sci 98:2843-2848 [2001]), urocortina (véase, p. ej., el documento WO 97/00063), urocortina II humana (péptido relacionado con la stresscopina), urocortina III humana (stresscopina), URP 1 de pez globo, URP II de pez globo, urotensina I y los análogos del CRF descritos en las patentes US-4.415.558; US-4.489.163; US-4.594.329; US-4.605.642; US-5.109.111; US-5.235.036; US-5.278.146; US-5.439.885; US-5.493.006; US-5.663.292; US-5.824.771; US-5.844.074 y US-5.869.450. Los análogos del CRF específicos incluyen hUcnI (urocortina I humana, AF038633 [GB]); hUroII (urocortina II humana o péptido relacionado con la stresscopina) (AF320560); hUroIII (urocortina III humana o stresscopina, AF361943); hCRF (factor liberador de la corticotropina humana) (V00571[GB]); oCRF (factor liberador de la corticotropina ovina, E00212 [GB]); Svg (sauvagina, P01144 [SP]).

"Agonista del CRFR" significa un compuesto o molécula que tiene la capacidad de activar los CRF_{1}R, CRF_{2}R o ambos.

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"CRFR" significa los CRF_{1}R o CRF_{2}R. El término "CRFR" también incluye proteínas truncadas y/o mutadas en donde se han eliminado o modificado regiones de la molécula receptora que no son necesarias para la unión o señalización del ligando.

"CRF_{1}R" significa cualquier isoforma del CRF_{1}R de cualquier especie animal. El CRF_{1}R ha sido denominado anteriormente CRF-RA, PC-CRF, CRF, (Perrin, M.H., y col. Endocrinology 133:3058-3061 [1993], Chen, R., y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8967-8971 [1993], Chang, C-P. y col., Neuron 11:1187-1195 [1993], Kishimoto, T., y col., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 92:1108-1112 [1995] y Vita, N. y col., FEBS Lett. 335: 1-5 [1993]) o receptor de la CRH.

La definición del CRF_{1}R incluye, aunque no de forma limitativa, aquellos receptores para los que la secuencia del ADNc o genómica que codifica el receptor ha sido depositada en una base de datos de secuencias. Estas secuencias incluyen los números de acceso: X72304, E11431, L23332, I92584, T37068, T28968, Q81952, L23333, NM_004382, AF180301, T28970, L25438, L24096, I92586, Q81954, AH006791, NM_007762, X72305, AF054582, Y14036, AF229359, AF229361, AB055434 y L41563. Las secuencias de nucleótidos y proteínas de estos receptores se pueden obtener de las bases de datos GenBank o Derwent.

"CRF_{2}R" significa cualquier isoforma del CRF_{2}R de cualquier especie animal. El CRF_{2}R ha sido también denominado HM-CRF, CRF-RB, (Kishimoto, T., y col., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 92:1108-1112 [1995] y Perrin, M. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2969-2973 [1995]).

La definición del CRF_{2}R incluye, aunque no de forma limitativa, aquellos receptores para los que la secuencia del ADN que codifica el receptor ha sido depositada en una base de datos de secuencias. Estas secuencias incluyen los números de acceso: U34587, E12752, NM_001883, T12247, T66508, AF011406, AF019381, U16253, T12244, T28972, U17858, NM_009953, Y14037 y AF229360. Las secuencias de nucleótidos y proteínas de estos receptores se puede obtener de las bases de datos GenBank o Derwent.

"Inhibir" significa bloquear parcial o completamente un proceso o actividad particular. Por jemplo, un compuesto inhibe la atrofia muscular esquelética si evita parcial o totalmente la atrofia muscular.

"Péptido aislado" significa que una molécula de tipo péptido se dice que ha sido "aislada" cuando se emplean métodos físicos, mecánicos o químicos para eliminar el péptido de los constituyentes celulares que normalmente están asociados con la proteína. El experto en la técnica utiliza métodos de depuración estándar para obtener un péptido aislado.

"Ácido nucleico aislado" significa que una molécula de tipo ácido nucleico está prácticamente separada de las moléculas de ácido nucleico contaminadas que codifican otros polipéptidos. Las técnicas de depuración e identificación de secuencias son conocidas en la técnica.

En la presente memoria, se dice que dos secuencias de ADN están "asociadas operativamente" si la naturaleza del enlace entre ambas secuencias del ADN (1) no da lugar a la introducción de una mutación con cambio del marco de lectura, (2) no interfiere en la capacidad de una región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes o (3) no interfiere en la capacidad para que la transcripción del ARN correspondiente sea traducida en una proteína. Por ejemplo, una secuencia codificante y secuencias reguladoras están asociadas operativamente cuando están unidas covalentemente de tal manera que la transcripción de la secuencia codificante se sitúa bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Por tanto, una región promotora está asociada operativamente con una secuencia codificante cuando la región promoora es capaz de efectuar la transcripción de dicha secuencia del ADN de manera que la transcripción resultante pueda ser traducida en el péptido deseado.

"Agonista selectivo" significa que el agonista generalmente tiene una actividad mayor, preferiblemente significativamente mayor, hacia un cierto receptor o receptores en comparación con otros receptores, sin ser completamente inactivo con respecto a otros receptores.

"Identidad de secuencia" u "Homología" en el nivel de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos se determina mediante análisis de BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica) utilizando el algoritmo empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Altschul y col. [1997] Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 y Karlin y col. [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268) que están concebidas para la búsqueda de similitud de secuencias. El enfoque utilizado por el programa BLAST es considerar primero segmentos similares, con espacios (no contiguos) o sin espacios (contiguos) entre una secuencia desconocida (query) y una secuencia de la base de datos y, a continuación, evaluar el significado estadístico de todas las coincidencias identificadas para, finalmente, resumir todas aquellas coincidencias que satisfagan un umbral de trascendencia seleccionado previamente. Véase un estudio sobre las cuestiones básicas en la búsqueda de similitudes de bases de datos de secuencias en Altschul y col. (1994) Nature Genetics 6, 119-129. Los parámetros de búsqueda de histogramas, descripciones, alineaciones, estimación (es decir, el umbral de trascendencia estadística de las coincidencias del informe frente a las secuencias de la base de datos), límite, matriz y filtro (baja complexidad) están configurados por defecto. La matriz de puntuación por defecto utilizada por los programas blastp, blastx, tblastn y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff y col. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), recomendada para las secuencias desconocidas de más de 85 nucleótidos o aminoácidos de longitud.

En blastn, la matriz de puntuación está establecida por las relaciones entre M (es decir, la puntuación obtenida para un par de residuos coincidentes) y N (es decir, la puntuación de castigo para residuos no coincidentes), en donde los valores por defecto de M y N son +5 y -4, respectivamente. Se ajustaron cuatro parámetros blastn del siguiente modo: Q=10 (castigo de creación de espacios); R=10 (castigo de extensión de espacios); wink=1 (genera coincidencias textuales en cada posición de parpadeo a lo largo de la secuencia desconocida) y gapw=16 (ajusta la anchura de la ventana en la que se generan las alineaciones con espacios). La configuración equivalente de los parámetros de Blastp eran Q=9; R=2; wink=1 y gapw=32. Una comparación de secuencias del programa Bestfit, disponible en la versión 10.0 del paquete GCG, utiliza los parámetros de ADN GAP=50 (castigo de creación de espacios) y LEN=3 (castigo de extensión de espacios) y los ajustes equivalentes para la comparación de proteínas son GAP=8 y LEN=2.

"Hipertrofia muscular esquelética" significa un aumento de la masa muscular esquelética, de la función muscular esquelética o de ambas.

"Atrofia muscular esquelética" significa lo mismo que "desgaste muscular" y significa una disminución de la masa muscular esquelética, de la función muscular esquelética o de ambas.

Al describir la estructura y función de proteínas, se hace referencia a aminoácidos que comprenden la proteína. También se puede hacer referencia a los aminoácidos utilizando sus abreviaturas convencionales, a saber: A = Ala = alanina; T = Thr = treonina; V = Val = valina; C = Cys = cisteína; L = Leu = leucina; Y = Tyr = tirosina; I = Ile = isoleucina; N = Asn = asparagina; P = Pro = prolina; Q = Gln = glutamina; F = Phe = fenilalanina; D = Asp = ácido aspártico; W = Trp = triptofán; E = Glu = ácido glutámico; M = Met = metionina; K = Lys = lisina; G = Gly = glicina; R = Arg = arginina; S = Ser = serina; H = His = histidina. La letra Z = Glx = ácido pirrolidona carboxílico se utiliza para indicar ácido glutámico N-terminal o glutamina que ha formado una lactama cíclica interna. Esto se ha descrito en la lista de secuencias de la función "MODIFIED_RES", cuando procede. La letra B se utiliza en la memoria descriptiva para designar naftilalanina, una modificación de alanina en determinados péptidos y se ha indicado en la lista de secuencias de la "función variada" en la lista de secuencias en las secuencias de péptidos, cuando ocurre. "Ac" se ha utilizado para indicar un extremo de NH_{2} acetilado modificado en la memoria descriptiva y se ha descrito en la función "MODIFIED_RES", cuando procede. Los péptidos de la invención también se han modificado para que tengan un grupo amida en el extremo carboxi. Esto se ha indicado en la lista de secuencias en la función "MODIFIED_RES". Para designar una deleción o la ausencia de un aminoácido en el contexto del homólogo natural, a lo largo de la aplicación se ha utilizado "-" o "nada".

Salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente el experto en la técnica de química de proteínas, farmacología o biología molecular. Los métodos, materiales y ejemplos descritos en la presente memoria no se consideran limitativos. Se pueden utilizar otros métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la realización de prácticas o ensayos de la presente invención.

Péptidos

La presente invención abarca péptidos no nativos aislados según se expone en la reivindicación 1.

La presente invención también abarca variantes de los péptidos descritos. En la presente memoria, "variantes" significa aquellos péptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 97%, preferiblemente 98% y con máxima preferencia 99%, con la secuencia del aminoácido nativo respectivo. No se considerará que las proteínas de fusión o las extensiones, deleciones o inserciones de tipo N-terminal, C-terminal o internas afectan la homología.

Uso de los péptidos de la invención como agonistas del CRF_{2}R

Los péptidos de la invención son útiles para tratar diversas enfermedades, trastornos o condiciones moduladas por CRF_{2}R o por la actividad del CRF_{2}R. En la presente memoria, los términos "enfermedad", "trastorno" y "condición" se utilizan indistintamente. En la presente memoria, un trastorno descrito por los términos "modulado por CRF_{2}R" o "modulado por la actividad del CRF_{2}R" se refiere a un trastorno, condición o enfermedad donde la actividad del CRF_{2}R es un medio eficaz de aliviar el trastorno o una o más de las manifestaciones biológicas de la enfermedad o del trastorno o que interfiere en uno o más puntos de la cascada biológica que conduce al trastorno o al responsable del trastorno subyacente o alivia uno o más de los síntomas de la enfermedad. Por lo tanto, los trastornos sometidos a "modulación" incluyen aquellos para los cuales: (1) la falta de actividad del CRF_{2}R es una "causa" de dicho trastorno o de una o más de las manifestaciones biológicas donde la actividad ha sido alterada genéticamente por infección, por irritación, por estímulo interno o por cualquier otra causa; (2) la enfermedad o trastorno o la manifestación o manifestaciones observables de la enfermedad o trastorno se alivian por la actividad del CRF_{2}R (la falta de actividad del CRF_{2}R no necesita estar relacionada causalmente con la enfermedad o trastorno o con las manifestaciones observables de los mismos); (3) la actividad del CRF_{2}R interfiere con parte de la cascada bioquímica o celular que da lugar o está relacionada con la enfermedad o trastorno. En este sentido, la actividad del CRF_{2}R altera la cascada, controlando así la enfermedad, condición o trastorno.

En una realización de la invención, los péptidos de la presente invención tienen una actividad agonista del CRF_{1}R inexistente o únicamente débil. Por lo tanto, los péptidos de la presente invención son especialmente útiles para el tratamiento de trastornos modulados por CRF_{2}R. Uno de tales trastornos modulados por CRF_{2}R es la atrofia muscular esquelética. La atrofia muscular esquelética puede ser inducida por cirugía, reposo en cama, rotura de huesos; denervación/daño nervioso debido a lesión de la médula espinal; enfermedad autoinmune; enfermedad infecciosa; uso de glucocorticoides para condiciones no relacionadas; septicemia debida a infecciones u otras causas; limitación de nutrientes debido a enfermedad o inanición; caquexia por cáncer; inflamación crónica; síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA); caquexia; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), insuficiencia cardiaca congestiva, sarcopenia y trastornos genéticos; p. ej., distrofias musculares, enfermedades neurodegenerativas.

En otra realización, el tratamiento de un trastorno modulado por CRF_{2}R da lugar a un aumento de masa y función esquelética. Las enfermedades y condiciones que afectan la masa y función esquelética incluyen, aunque no de forma limitativa, atrofia o desgaste muscular esquelético incluyendo atrofia/desgaste resultante del desuso debido a enfermedad, cirugía, reposo en cama o accidente; daño nervioso debido a lesión de la médula espinal, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa; uso de glucocorticoides para condiciones no relacionadas; septicemia debida a infecciones u otras causas; limitación de nutrientes debido a enfermedad o inanición; y viaje espacial: y atrofia/desgaste crónico incluyendo caquexia por cáncer, inflamación crónica, caquexia por sida, EPOC, insuficiencia cardiaca congestiva, trastornos genéticos, p. ej., distrofias musculares, enfermedades neurodegenerativas y sarcopenia (pérdida muscular asociada a la edad).

En otra realización aún, el tratamiento de un trastorno modulado por CRF_{2}R incluye trastornos que afectan a huesos. Las enfermedades y condiciones que afectan a huesos incluyen, aunque no de forma limitativa, pérdida ósea resultante de desuso debido a enfermedad, cirugía, reposo en cama o accidente; daño nervioso debido a lesión de la médula espinal, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa; uso de glucocorticoides para condiciones no relacionadas; septicemia debida a infecciones u otras causas; limitación de nutrientes debido a enfermedad o inanición; y viaje espacial. También se incluye la pérdida ósea relacionada con la edad y con hormonas (osteoporosis).

En otra realización aún, el tratamiento de un trastorno modulado por CRF_{2}R incluye trastornos que afectan al corazón o al sistema circulatorio incluyendo de forma no exclusiva hipertensión, insuficiencia cardiaca congestiva, daño cardiaco resultante de ataque al corazón, lesión por isquemia-reperfusión, apoplejía, migraña, pérdida de memoria, enfermedad de Alzheimer, demencia y similares.

En otra realización aún, el tratamiento de un trastorno modulado por CRF_{2}R incluye trastornos que afectan las articulaciones incluyendo de forma no exclusiva artritis, en particular osteoartritis y artritis reumatoide.

En otra realización aún, el tratamiento de un trastorno modulado por CRF_{2}R incluye enfermedades metabólicas incluyendo obesidad y diabetes.

En otra realización aún, el tratamiento de un trastorno modulado por CRF2R incluye: reducción del dolor; reducción del hinchamiento; reacciones alérgicas; alergias; reducción de la temperatura corporal; supresión del apetito; insuficiencia cardiaca congestiva; estrés y ansiedad; alteración de niveles bajos no deseables de secreción de hormona adrenocorticotrópica ("ACTH"); control de las funciones de apetito, nivel de alerta y cognitivas y prevención de los efectos a largo plazo del estrés, tales como trastornos de ansiedad, anorexia nerviosa y depresión melancólica.

El término "tratamiento" significa en la presente memoria que, como mínimo, la administración del péptido de la presente invención alivia un trastorno modulado por CRF_{2}R en un mamífero, preferiblemente en un humano. Por tanto, el término "tratamiento" incluye: prevenir que ocurra un trastorno modulado por CRF_{2}R en un mamífero, especialmente cuando el mamífero está predispuesto a adquirir el trastorno modulado por CRF_{2}R, pero aún no ha sido diagnosticado con la enfermedad; evitar el trastorno modulado por CRF_{2}R y/o aliviar o corregir el trastorno modulado por CRF_{2}R. En la medida en la que los métodos de la presente invención están destinados a prevenir el trastorno modulado por CRF_{2}R, se entiende que el término "prevenir" no requiere que el trastorno modulado por CRF_{2}R sea impedido completamente (véase Webster's Ninth Collegiate Dictionary). El término "prevenir" en la presente memoria se refiere más bien a la capacidad del experto en la técnica de identificar la población que es susceptible a trastornos modulados por CRF_{2}R, de manera que la administración de los péptidos y kits de la presente invención pueda ocurrir antes de que se presenten los síntomas del trastorno modulado por CRF_{2}R. La población de riesgo de un trastorno modulado por CRF_{2}R es fácilmente identificable. Por ejemplo, la población que corre el riesgo de desarrollar distrofia muscular se puede determinar identificando las mutaciones genéticas características del trastorno. Por ejemplo, como se ha dicho anteriormente, las distrofias de Duchenne y Becker resultan de la herencia de una mutación del gen de la distrofia, que está situado en el locus Xp21. Aquellos individuos de una población que posean estas mutaciones corren el riesgo de desarrollar distrofia muscular. Por tanto, la población de pacientes es identificable y podría recibir la administración de una composición o dosis unitaria en forma de un kit de la presente invención antes de la progresión de la enfermedad. Por tanto, se podría "prevenir" la progresión de la atrofia o desgaste muscular en tales individuos.

Moléculas de ácido nucleico

La presente invención además proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos de la presente invención, preferiblemente en forma aislada. En la presente memoria, "ácido nucleico" se define como el ARN o ADN que codifica un péptido de la presente invención según se ha definido anteriormente o es complementario a una secuencia de ácido nucleico que codifica dichos péptidos. Específicamente están contempladas las moléculas de ADN genómico, ADNc, ARNm y antisentido, así como los ácidos nucleicos basados en cadenas principales alternativas o que incluyen bases alternativas, ya sean derivados de fuentes naturales o sintéticos.

La presente invención además proporciona un fragmento de una molécula de ácido nucleico codificador. En la presente memoria, un fragmento de una molécula de ácido nucleico codificante se refiere a una pequeña parte de la secuencia codificante de proteínas entera. El tamaño del fragmento vendrá determinado por el uso previsto. Por ejemplo, si el fragmento se selecciona para que codifique una parte activa de un péptido de la presente invención, el fragmento tendrá que ser lo suficientemente grande para codificar las regiones funcionales del péptido.

Los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico codificantes de la presente invención (es decir, oligonucleotidos sintéticos), que se utilizan como sondas o cebadores específicos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o para sintetizar secuencias de genes que codifican péptidos de la invención, pueden sintetizarse fácilmente mediante técnicas químicas, por ejemplo, el método del fosfotriester de Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191 (1981) o utilizando métodos de síntesis automatizada. Además, se pueden preparar fácilmente segmentos de ADN mayores mediante métodos conocidos, tales como síntesis de un grupo de oligonucleótidos que definen varios segmentos modulares del gen, seguidos por ligación de oligonucleótidos para construir el gen modificado completo.

Las moléculas de ácido nucleico codificantes de la presente invención también se pueden modificar de tal manera que contengan un marcado detectable para fines de diagnóstico o investigación. En la técnica se conocen diversos marcados que se pueden utilizar fácilmente con las moléculas codificantes descritas en la presente memoria. Los marcados adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, biotina, nucleótidos radiomarcados y similares. Un experto en la técnica puede emplear fácilmente cualquiera de dichos marcados para obtener variantes marcadas de las moléculas de ácido nucleico de la invención.

Preparación de péptidos o líneas celulares que expresan péptidos

Los péptidos de la presente invención se pueden preparar para diversos usos incluyendo, aunque no de forma limitativa, su uso como reactivos farmacéuticos para el tratamiento de trastornos modulados por CRF_{2}R. Resultará claro para el experto en la técnica que, en ciertas realizaciones de la invención, serán más útiles los péptidos purificados mientras que, en otras realizaciones, serán más útiles las líneas celulares que expresan los péptidos.

Dado que los péptidos de la invención son polipéptidos cortos, el experto en la técnica reconocerá que los péptidos de la presente invención se pueden sintetizar mediante síntesis directa, más que por medios recombinantes, utilizando técnicas conocidas en la técnica. Véase Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg (1984); y por medio de síntesis en fase sólida, véanse, p. ej., Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-54 (1963); Barany y col., Int. J. Peptide Protein Res., 30:705-739 (1987); y la patente US-5.424.398.

Por ejemplo, los péptidos se pueden sintetizar con un sintetizador automático modelo 433 de Applied Biosystem, Inc. (ABI) o un sintetizador de reactores múltiples (modelo Symphony™) de Protein Technology, Inc (PTI). En cuanto a los péptidos sintetizados con el sintetizador de ABI, todos los reactivos se adquieren de ABI (excepto la piperidina, que se adquiere de Aldrich). Los aminoácidos Fmoc se adquieren de ABI (excepto el Fmoc-L-Pyr, que se adquiere de Chem-Impek). Las resinas de tipo rink-amida se adquieren de Nova Chemicals. Se utiliza una química FastMoc estándar de 0,1 mmol con acoplamiento simple. El protocolo químico Fmoc general para la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) incluye: 1) escindir los grupos de protección del Fmoc con piperidina; 2) activar el grupo carboxilo de los aminoácidos y 3) acoplar los aminoácidos activados al terminal amino de la cadena peptídica unida a la resina para formar enlaces peptídicos. Los aminoácidos se activan con 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HBTU). Se disuelve un aminoácido protegido seco de un cartucho (1,0 mmol) en una solución de HBTU, N,N-diisopropiletilamina (DIEA) y 1-hidroxibenzotriazola (HOBt) en N,N-dimetilformamida (DMF) con N-metilpirrolidona (NMP) adicional añadida. El aminoácido Fmoc activado se forma casi instantáneamente y la solución se transfiere directamente al vaso de reacción. La etapa de desproteger el Fmoc se supervisa y controla mediante mediciones de conductividad. La cadena peptídica se construye sobre una resina de tipo rink-amida puesto que se necesita la amida C-terminal. El producto final se lava extensamente con NMP y diclorometano (DCM).

En cuanto a los péptidos sintetizados con el sintetizador múltiple de PTI, todos los aminoácidos Fmoc se adquieren de NovaBiochem (excepto Fmoc-Pyr que se adquiere de Chem-Impex). Para las síntesis se utilizan protocolos de síntesis de Fmoc de 0,05 mmol estándares. Se disuelven los aminoácidos Fmoc (0,4 mmol) en una solución de HBTU (200 mM), N-metilmorfolina (NMM, 0,4 M) y N,N-dimetilformamida (DMF) con N-metilpirrolidona (NMP) adicional añadida. El aminoácido Fmoc activado se forma casi instantáneamente y la solución se transfiere directamente al vaso de reacción. La etapa de desprotección del Fmoc se realiza dos veces. La cadena peptídica se construye sobre una resina de tipo rink-amida puesto que se necesita la amida C-terminal. El producto de síntesis final se lava extensamente con NMP y diclorometano (DCM).

Se desprotegen los péptidos recién sintetizados. Se descargan del sintetizador las resinas que contienen péptidos sintetizados y se secan brevemente al aire. Utilizando 1,5-2,0 ml de la mezcla de disociación (que comprende 95% de ácido trifluoroacético [TFA], 2,5% de etanoditiol, 2,5% de tioanisol, 2,5% de fenol [W/V] en agua) durante 4 horas a temperatura ambiente, los péptidos se escinden de la resina y, al mismo tiempo, los grupos de protección de la cadena lateral [O-t-butilo (OtBu) para Asp, Glu, Tyr, Thr y Ser; pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc) para Arg,
t-butoxicarbonilo (Boc) para Trp y Lys; tritilo (Trt) para His, Asn y Gln] se eliminan en la condición de desprotección. La solución de disociación se separa de la resina mediante filtración. El filtrado se diluye a continuación con 15 ml de agua. Se llevan a cabo seis series de extracción de éter para limpiar el producto de tipo péptido. El péptido se liofiliza y almacena a -20ºC antes de su purificación.

Los péptidos desprotegidos se purifican y caracterizan. El polvo de péptido se disuelve en una solución al 50% de ácido acético y se inyecta en una columna Vydac C-8 de 1,0 cm de diámetro interno y 25 cm de longitud con un tamaño de partículas de 5 \mum y un tamaño de poros de 300 \ring{A} para la purificación. Se utiliza un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de Beckman System Gold con detector ultravioleta de doble longitud de onda (220 nm y 280 nm). Se programa un gradiente lineal de acetonitrilo y se introduce en la columna para separar el producto de tipo péptido de otras sustancias. Se recoge la elución en un colector de fracciones Pharmacia y las fracciones de separación individuales fueron sometidas a HPLC analítica y MALDI-TOF MS (espectroscopía de masas por tiempo de vuelo con desorción/ionizacion mediante láser asistida por matriz) para su caracterización y para asegurar su identidad y pureza.

También se contempla el uso de tecnología del ADN recombinante para la preparación de los péptidos o de las líneas celulares que expresan estos péptidos. Tales métodos recombinantes son muy conocidos en la técnica. Los métodos para generar moléculas de ADNr se conocen en la técnica, por ejemplo, véase Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Para expresar los péptidos recombinantes de la presente invención, se prepara un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés bajo el control de uno o más elementos reguladores. La secuencia de ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la presente invención se puede deducir de las secuencias de péptidos que se tratan o reivindican en la presente memoria.

La molécula de ácido nucleico aislada que codifica el péptido de interés se puede ligar en un vector de expresión adecuado mediante métodos conocidos en la técnica. Los sistemas de vector de expresión-huésped que se pueden utilizar para los fines de la invención incluyen, aunque no de forma limitativa: microorganismos tales como bacterias (p. ej., E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófago, ADN plásmido o ADN cósmido recombinante que contienen secuencias de nucleótidos que codifican péptidos de la presente invención; levadura (p. ej., Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención; sistemas celulares de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (p. ej., plásmido Ti) que contienen secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención, o sistemas celulares de mamíferos (p. ej., COS, CHO, HEK293, NIH3T3) que albergan elementos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (p. ej., promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., LTR del retrovirus) y que también contienen secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención.

En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar diversos vectores de expresión de forma ventajosa en función del uso previsto del péptido que se expresa. Por ejemplo, cuando se precisa una gran cantidad de dicha proteína, resultan deseables los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína. El experto en la técnica puede generar tales elementos de vector y purificar las proteínas mediante diversas metodologías incluyendo tecnologías de purificación selectiva, tales como columnas selectivas de proteínas de fusión y columnas de anticuerpos, y tecnologías de purificación no selectiva.

En un sistema de expresión de proteínas de insectos, se utiliza el baculovirus AcNPV (virus de la polihedrosis nuclear A. californica) como vector para expresar genes extraños en las células de S. frugiperda. En este caso, las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención están clonados en regiones no esenciales del virus y sometidas al control de un promotor del AcNPV. Los virus recombinantes se utilizan después para infectar las células en las que se ha expresado el gen insertado y la proteína se purifica mediante una de las muchas técnicas conocidas por el experto en la materia.

En las células huésped de mamíferos, se pueden utilizar diversos sistemas de expresión basados en virus. La utilización de estos sistemas de expresión a menudo requiere la creación de señales de inicio específicas en los vectores para conseguir la traducción eficaz de las secuencias de nucleótidos insertadas. Esto es especialmente importante si la parte de la secuencia de nucleótidos utilizada no contiene la señal de inicio endógena. La ubicación de esta señal de inicio, enmarcada en la región codificante de la secuencia de nucleótidos insertada, así como la adición de elementos mejoradores de la transcripción y la traducción, y la purificación de la proteína recombinante, se consiguen mediante una de las muchas metodologías conocidas por el experto en la técnica. También es importante, en el caso de las células huésped de los mamíferos, la selección de un tipo de célula adecuado que sea capaz de realizar las modificaciones postraduccionales necesarias de la proteína recombinante. Tales modificaciones, por ejemplo, escisión, forforilacion, glicosilación, acetilación, etc., requieren la selección de la célula huésped adecuada que contiene las enzimas modificadoras. Tales células huésped incluyen, aunque no de forma limitativa, CHO, HEK293, NIH3T3, COS, etc. y son conocidas por el experto en la técnica.

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Para la expresión alta a largo plazo de las proteínas recombinantes, se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, se pueden manipular por ingeniería las líneas celulares que expresan de manera estable los péptidos de la presente invención. El experto en la técnica puede generar una línea celular que exprese de manera estable los péptidos de la presente invención siguiendo métodos conocidos, tales como electroporación, transfección con fosfato cálcico o transfección mediada por liposomas. Esto se lleva a cabo normalmente transfectando células que utilizan vectores de expresión que contienen elementos adecuados de control de expresión (p. ej., secuencias promotoras, secuencias mejoradoras, secuencias terminadoras de la transcripción, sitios de poliadenilación, sitios iniciadores de la traducción, etc.), un marcador seleccionable y el gen de interés. El marcador seleccionable puede estar contenido en el mismo vector, como el gen de interés, o en un vector separado, que se cotransfecta con el vector que contiene la secuencia que codifica el péptido. El marcador seleccionable del vector de expresión puede conferir resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el vector en sus cromosomas y crezcan para formar focos que, a su vez, se pueden clonar y expandir en líneas celulares. De forma alternativa, el vector de expresión puede permitir la selección de la célula que expresa el marcador seleccionable utilizando un atributo físico del marcador, es decir, la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) permite seleccionar las células que expresan el marcador utilizando el método de clasificación por activación celular fluorescente (FACS).

El experto en la técnica puede seleccionar un tipo de célula apropiado para la transfección con el fin de permitir la selección de las células en las que la secuencia de interés ha sido integrada con éxito. Por ejemplo, cuando el marcador seleccionable es timidincinasa del virus herpes simplex, hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa o adenina fosforribosiltransferasa, el tipo de células apropiado sería respectivamente tk, hgprt o aprt. O se pueden utilizar células normales cuando el marcador seleccionable es dhfr, gpt, neo o hygro, que confieren resistencia al metotrexato, ácido micofenólico, G-418 o higromicina, respectivamente.

Preparación de anticuerpos

La invención también abarca marcadores que reconocen selectivamente uno o más epítopos de los péptidos de la presente invención. Tales anticuerpos incluyen, p. ej., anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')_{2}, moléculas producidas utilizando una genoteca de expresión Fab, anticuerpos humanos (policlonales o monoclonales) producidos en ratones transgénicos y fragmentos de unión de epítopos de cualquiera de los anteriores.

Los anticuerpos se pueden utilizar junto con técnicas de terapia genética para evaluar, por ejemplo, la expresión de los péptidos de la presente invención en células o directamente en tejidos de los pacientes en donde estos genes se han introducido.

Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar diversos animales huéspedes inyectándoles los péptidos de la presente invención, fragmentos de anticuerpos antipéptidos, anticuerpos análogos antipéptidos o inmunogénicos de los mismos mediante los métodos conocidos en la técnica. Para la preparación de un anticuerpo antiidiotipo, el inmunógeno es un anticuerpo antipéptido o anticuerpo análogo antipéptido. La producción de anticuerpos antiidiotipos se describe, por ejemplo, en la patente US-4.699.880. Los animales huéspedes adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, conejos, ratones, cabras, ovejas y caballos. Las técnicas de inmunización son conocidas en la técnica. Se pueden purificar anticuerpos policlonales a partir del suero de los animales inmunizados o se pueden generar anticuerpos monoclonales mediante métodos conocidos en la técnica. Estas técnicas incluyen, aunque no de forma limitativa, las conocidas técnicas del hibridoma de Kohler y Milstein, las técnicas del hibridoma de célula B humana y la tecnología del hibridoma del VEB. Los anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgE, IgM, IgA y IgD que contienen cadenas ligeras kappa o lambda. Las técnicas para producir y usar anticuerpos quiméricos son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes US-5.807.715, US-4.816.397, US-4.816.567, US-5.530.101, US-5.585.089, US-5.693.761, US-5.693.762, US-6.180.370 y US-5.824.307.

Ensayos para determinar la selectividad del CRF_{2}R

La actividad farmacológica y selectividad de los péptidos de la presente invención se puede determinar utilizando los procedimientos de ensayo publicados. Véase, p. ej., el documento WO 02/069908. Dado que los CRF_{2}R y CRF_{1}R son proteínas homólogas, es de esperar que una determinada proporción de agonistas del CRF_{2}R también funcionarán como agonistas del CRF_{1}R. Según se ha indicado anteriormente, la activación del CRF_{1}R induce la activación del eje HPA puesto que una producción mayor de corticosteroides conduce a atrofia muscular esquelética. En la mayoría de los casos en los que es deseable un aumento de masa o función muscular, no es deseable activar el eje HPA. Al seleccionar un péptido útil para el tratamiento de un trastorno modulado por CRF_{2}R, que no está relacionado con distrofia muscular, es preferible que el péptido sea selectivo para el CRF_{2}R. Preferiblemente, el péptido presenta una selectividad 10 veces mayor para el CRF_{2}R que para el CRF_{1}R (es decir, es 10 veces más activo contra el CRF_{2}R que contra el CRF_{1}R), más preferiblemente 100 veces mayor sensibilidad y con máxima preferencia 1.000 veces mayor sensibilidad o más. Como han demostrado los estudios publicados, una ventaja de la terapia con corticosteroides en el tratamiento de distrofias musculares, es que puede ser ventajoso que un agonista del CRF_{2}R conserve cierto nivel de agonismo del CRF_{1}R cuando se utiliza para tratar distrofias musculares. Por lo tanto, para el tratamiento de distrofias musculares, es preferible un péptido de menor selectividad que active tanto el CRF_{2}R como el CRF_{1}R, en un intervalo de concentración similar. Preferiblemente, el péptido es 100 veces más selectivo para el CRF_{2}R que para el CRF_{1}R, más preferiblemente 10 veces más selectivo y con máxima preferencia no más selectivo, para el CRF_{2}R que para el CRF_{1}R (es decir, la actividad del compuesto candidato es prácticamente similar para los CRF_{2}R y CRF_{1}R). También en este caso, puede ser más preferible que el péptido sea agonista total para el CRF_{2}R y agonista parcial para el CRF_{1}R. Por tanto, dicho péptido debería incorporar un límite del grado máximo de elevación del cortisol y del potencial para la atrofia muscular, mientras que el efecto contra la atrofia modulado a través del CRF_{2}R podría mejorarse incrementando la dosis. El experto en la técnica debería ser capaz de determinar fácilmente si un péptido es un agonista total o parcial de los CRF_{1}R o CRF_{2}R utilizando los métodos conocidos en la técnica.

Puesto que resulta deseable discriminar la unión al CRF_{2}R de la del CRF_{1}R, los ensayos descritos anteriormente se pueden realizar utilizando una célula o membrana de una célula que exprese únicamente el CRF_{2}R o se pueden realizar con una fuente recombinante del CRF_{2}R. Las células que expresan ambos CRFR se pueden modificar utilizando recombinación de homólogos para inactivar o deshabilitar de otro modo el gen CRF_{1}R. De forma alternativa, si la fuente del CRFR contiene más de un tipo de CRFR, la señal de fondo producida por el receptor que no es de interés se debe sustraer de la señal obtenida en el ensayo. La respuesta de fondo se puede determinar mediante diversos métodos, incluyendo eliminación de la señal del CRFR que no es de interés utilizando antisentidos, anticuerpos o antagonistas selectivos. Los antagonistas de los CRFR conocidos incluyen, aunque no de forma limitativa, antalarmina (selectivo para CRF_{1}R), antisauvagina-30 (selectivo para CRF_{2}R) y astresina (no selectivo para CRF_{1}R/CRF_{2}R).

Para determinar si un péptido activa el CRF_{2}R y/o CRF_{1}R, los ensayos se basan de forma típica en células; sin embargo, se conocen ensayos exentos de células que pueden diferenciar la unión agonista y antagonista según se ha descrito anteriormente. Los ensayos basados en células incluyen las etapas de poner las células que expresan el CRF_{1}R o CRF_{2}R en contacto con un péptido de la presente invención o controlar y medir la activación de los CRFR midiendo la expresión o actividad de componentes de los caminos de transducción de las señales de los CRFR.

Según se ha descrito en el apartado de antecedentes de la invención, los CRFR actúan acoplándose a través de diferentes caminos incluyendo G_{\alpha s}, G_{\alpha q} o G_{\alpha i}, según el tipo de célula. Se piensa que la activación agonista del CRFR permite que el receptor transmita señales a través de cualquiera de estos caminos, siempre que estén presentes los componentes de camino necesarios en el tipo de célula particular. Así, para comprobar la activación del CRFR de un péptido particular de la presente invención, el ensayo puede utilizar cualquiera de los caminos de transducción de señales para la lectura, incluso aunque el tipo de célula relevante para el tratamiento, in vivo, se acople al CRFR para la atrofia muscular esquelética a través de un camino diferente. Cualquier experto en la técnica podría reconocer que un ensayo sería eficaz para identificar agonistas de tipo péptido útiles independientemente del camino por el que se haya medido la activación del receptor. Los ensayos para medir la activación de estos caminos de señalización son conocidos en la técnica.

Por ejemplo, tras entrar en contacto con un péptido de la presente invención, se pueden preparar lisados celulares y analizar la inducción de AMPc. El AMPc se induce en respuesta a la activación de G_{\alpha s}. Dado que la proteína G_{\alpha s} se activa por receptores distintos a los CRFR y dado que un péptido de prueba puede ejercer su efecto a través de los CRFR o por otro mecanismo, son pertinentes dos comparaciones de control para determinar si el péptido aumenta los niveles de AMPc a través de la activación de un CRFR. Un control compara el nivel de AMPc de las células puestas en contacto con el péptido y el nivel de AMPc de las células puestas en contacto con un compuesto de control (es decir, el vehículo en el que el péptido se disuelve). Si el péptido aumenta los niveles de AMPc con respecto al compuesto de control, esto indica que el péptido aumenta la proteína AMPc mediante algún mecanismo. El otro control compara los niveles de AMPc de una línea celular que expresa el CRFR y de una línea celular que es prácticamente igual pero que no expresa el CRFR, habiendo tratado ambas líneas celulares con el péptido. Si el péptido eleva los niveles de AMPc de la línea celular que expresa el CRFR con respecto a la línea celular que no expresa CRFR, esto es una indicación de que el péptido eleva la proteína AMPc a través de la activación de los CRFR.

En un ejemplo, la inducción de AMPc se mide con el uso de elementos de ADN que contienen los elementos que responden a AMPc enlazados con cualquiera de los genes indicadores que se pueden introducir en células que expresan los CRFR. Tales genes indicadores incluyen, aunque no de forma limitativa, cloramfenicol acetil transferasa (CAT), luciferasa, glucuronida sintetasa, hormona del crecimiento, proteínas fluorescentes (p. ej., proteína fluorescente verde) o fosfatasa alcalina. Después de exponer las células al péptido, se puede cuantificar el nivel de expresión del gen indicador para determinar la capacidad del péptido para aumentar los niveles de AMPc y así determinar la capacidad del péptido para activar el CRFR.

Las células útiles en este ensayo son las mismas que en el ensayo de unión al CRFR descrito anteriormente, salvo que las células utilizadas en los ensayos de activación expresan preferiblemente un receptor funcional que da una respuesta al factor CRF o a uno o más análogos del CRF estadísticamente importante. Además de utilizar células que expresan CRFR de longitud total, se pueden modificar por ingeniería células que expresan CRFR que contienen el dominio de unión del ligando del receptor acoplado a elementos indicadores, o modificado físicamente para contenerlos o para interactuar con proteínas señalizadoras. Por ejemplo, un CRFR de tipo salvaje o fragmento de CRFR se puede fusionar a una proteína G dando lugar a la activación de la proteína G fusionada tras la unión agonista a la parte de CRFR de la proteína de fusión. Siefert, R. y col., Trends Pharmacol. Sci., 20: 383-389 (1999). Las células deberían además poseer preferiblemente un número de características, según la lectura, para maximizar la respuesta inductiva por CRF o el análogo de CRF, por ejemplo, para detectar una inducción fuerte de un gen indicador CRE, sería ventajoso (a) un nivel natural bajo de AMPc; (b) proteínas G capaces de interactuar con CRFR; (c) un alto nivel de adenililciclasa; (d) un alto nivel de proteína cinasa A; (e) un bajo nivel de fosfodiesterasas y (f) un alto nivel de proteína de unión al elemento que responde a AMPc. Para aumentar la respuesta a CRF o a un análogo de CRF, las células huésped podrían ser modificadas por ingeniería para expresar una cantidad mayor de factores favorables o una cantidad menor de factores desfavorables. Además, se podrían eliminar los caminos alternativos para la inducción del indicador CRE para reducir los niveles basales.

Ensayos para determinar la actividad farmacológica

La actividad farmacológica de los péptidos de la presente invención se puede determinar utilizando los procedimientos de ensayo publicados. Por ejemplo, los modelos de atrofia e hipertrofia muscular esquelética incluyen tanto modelos de cultivo de células in vitro como modelos animales in vivo de atrofia muscular esquelética.

Los modelos in vitro de atrofia muscular esquelética son conocidos en la técnica. Tales modelos se describen, por ejemplo, en Vandenburgh, H.H., In Vitro, 24:609-619 (1988), Vandenburgh, H.H. y col., J. Biomechanics, 24 Suppl 1:91-99 (1991), Vandenburgh, H.H y col., In Vitro Cell. est. Biol., 24(3):166-174 (1988), Chromiak, J.A., y col., In Vitro Cell. est. Biol. Anim., 34(9):694-703 (1998), Shansky, J., y col., In Vitro Cell. est. Biol. Anim., 33(9):659-661 (1997), Perrone, C.E. y col., J. Biol. Chem., 270(5):2099-2106 (1995), Chromiac, J.A. y Vandenburgh, H.H., J. Cell. Physiol., 159(3):407-414 (1994), y Vandenburgh, H.H. y Karlisch, P., In Vitro Cell. est. Biol., 25(7):607-616 (1989).

En la técnica se conocen diversos modelos animales para la atrofia muscular esquelética, tales como los descritos en las siguientes referencias: Herbison, G.J., y col. Arch. Phys. Med. Rehabil., 60:401-404 (1979), Appell, H-J. Sports Medicine 10:42-58 (1990), Hasselgren, P-O. y Fischer, J.E. World J. Surg., 22:203-208 (1998), Agbenyega, E.T. y Wareham, A.C. Comp. Biochem. Physiol., 102A:141-145 (1992), Thomason, D.B. y Booth, F.W. J. - Physiol., 68:1-12 (1990), Fitts, R.H., y col. J. Appl. Physiol., 60:1946-1953 (1986), Bramanti, P., y col. Int. J. Anat. Embryol. 103:45-64 (1998), Cartee, G.D. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci., 50:137-141 (1995), Cork, L.C., y col. Prog. Clin. Biol. Res., 229:241-269 (1987), Booth, F.W. y Gollnick, P.D. Med. Sci. Sports Exerc., 15:415-420 (1983), Bloomfield, S.A. Med. Sci. Sports Exerc., 29:197-206 (1997). Los animales preferidos para estos modelos son ratones y ratas. Estos modelos incluyen, por ejemplo, modelos de atrofia inducida por desuso tales como miembros escayolados o inmovilizados de otro modo, suspensión de miembros traseros, inmovilización completa del animal o situaciones de gravedad reducida. Los modelos de atrofia inducida por daños nerviosos incluyen, por ejemplo, compresión nerviosa, eliminación de secciones de nervios que estimulan músculos específicos, aplicación de toxinas a nervios e infección de nervios con agentes infecciosos víricos, bacterianos y eucarióticos. Los modelos de atrofia inducida por glucocorticoides incluyen aplicación de dosis que inducen a atrofia de glucocorticoides exógenos a animales y estimulación de la producción de corticosteroides endógenos, por ejemplo, por aplicación de hormonas que activar el eje hipotálamo-pituitario-suprarrenal (HPA). Los modelos de atrofia inducida por septicemia incluyen, por ejemplo, inoculación de organismos que inducen a septicemia tales como bacterias, tratamiento del animal con compuestos inmunoactivadores, tales como extracto de pared celular bacteriana o endotoxina, y punción de paredes intestinales. Los modelos de atrofia inducida por caquexia incluyen, por ejemplo, inoculación de un animal con células tumorigénicas con potencial para formar caquexia, infección de un animal con agentes infecciosos (tales como virus que causan sida) que dan lugar a caquexia y tratamiento de un animal con hormonas o citoquinas tales como CNTF, TNF, IL-6, IL-1, etc. que inducen a caquexia. Los modelos de atrofia inducida por insuficiencia cardiaca incluyen la manipulación de un animal de manera que se produce insuficiencia cardiaca con atrofia muscular esquelética concomitante. Los modelos de atrofia inducida por enfermedades neurodegenerativas incluyen modelos de animales autoinmunes tales como los modelos resultantes de la inmunización de un animal con componentes neuronales. Los modelos de atrofia inducida por distrofia muscular incluyen modelos inducidos genéticamente de forma natural o artificial de distrofia muscular tales como la mutación del gen de la distrofina que ocurre en los ratones Mdx.

Los modelos animales de hipertrofia muscular esquelética incluyen, por ejemplo, modelos de uso elevado de músculos de las extremidades debido a la inactivación del miembro opuesto, reponderación seguida de un evento que induce a atrofia por desuso, reutilización de un músculo atrofiado por daño nervioso transitorio, uso elevado de músculos selectivos debido a inactivación de un músculo sinérgico (p. ej., hipertrofia compensatoria), utilización elevada de un músculo debido a carga elevada colocada en el músculo e hipertrofia resultante de la eliminación del glucocorticoide tras atrofia inducida por glucorcorticoide. Los modelos de atrofia animal preferidos incluyen el modelo de atrofia por denervación del nervio ciático, el modelo de atrofia inducida por glucocorticoides y el modelo de atrofia por desuso de pata escayolada.

El modelo de atrofia por denervación del nervio ciático implica anestesiar el animal y eliminar quirúgicamente un pequeño segmento del nervio ciático derecho o izquierdo, p. ej., en ratones, el nervio ciático se aísla aproximadamente en el punto medio a lo largo del fémur y se elimina un segmento de 3-5 mm. Esto denerva la musculatura del miembro posterior inferior dando lugar a atrofia de estos músculos. De forma típica, la estimulación del bíceps crural se mantiene intacta para proporcionar movimiento satisfactorio de la rodilla y ambulación prácticamente normal. De forma típica, en los animales no tratados, la masa muscular de los músculos denervados se reduce 30-50% diez días después de la denervación. Después de la denervación, se administran péptidos de prueba, p. ej., por inyección o por infusión continua, p. ej., mediante el implante de una minibomba osmótica (p. ej., Alzet, Palo Alto, CA), para determinar su efecto sobre la atrofia muscular esquelética inducida por denervación. En distintos momentos después de la denervación, los animales se eutanasian y, rápidamente, se diseccionan los músculos de las patas inferiores, tanto de las patas denervadas como de las patas no denervadas; los músculos, limpios de tendones y tejido conjuntivo, se pesan. Se analiza el grado de atrofia de los músculos afectados, por ejemplo, midiendo la masa muscular, el área de sección transversal del músculo, el área de sección transversal de la fibra muscular o el contenido de proteínas contráctiles.

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El modelo de atrofia inducida por glucocorticoides implica la administración de un glucocorticoide al animal de ensayo, p. ej., 1,2 mg/kg/día de dexametasona en el agua de beber. De forma típica, en los animales no tratados, la masa muscular se reduce 30-50% diez días después de la administración de dexametasona. De forma concominante, o después de la administración de glucocorticoides, se administran péptidos de prueba, p. ej., mediante infusión continua, para determinar su efecto sobre la atrofia muscular esquelética inducida por glucocorticoides. En diversos momentos después de la administración de glucocorticoides, se analiza el grado de atrofia de los músculos afectados según se ha descrito anteriormente para el modelo de denervación.

El modelo de atrofia por desuso de pata escayolada implica el escayolado de una pata posterior de un animal desde la rodilla hasta el pie. De forma típica, la masa muscular se reduce 20-40% diez días después del escayolado. Después del escayolado, se administran péptidos de prueba mediante inyección o por infusión continua mediante el implante de una minibomba osmótica (p. ej., Alzet, Palo Alto, CA), para determinar su efecto sobre la atrofia muscular esquelética inducida por escayolado de pata. En varios momentos después del escayolado, se analiza el grado de atrofia de los músculos afectados según se ha descrito anteriormente para el modelo de denervación.

La actividad ósea de los péptidos de la invención se puede demostrar convenientemente utilizando un ensayo concebido para comprobar la capacidad de los compuestos de la invención para aumentar el volumen, la masa o la densidad óseas. Un ejemplo de tales ensayos es el ensayo con ratas ovariectomizadas.

En el ensayo con ratas ovariectomizadas, se ovariectomizan ratas adultas de seis meses y, transcurridos dos meses, se administra de forma subcutánea un compuesto de prueba una vez al día. Al finalizar el estudio, se puede medir la masa y/o densidad ósea mediante absorciometría de rayos X de doble energía (DXA), tomografía computerizada periférica cuantitativa (pQCT) o tomografía microcomputerizada (mCT). De forma alternativa, se puede utilizar histomorfometría estática o dinámica para medir el aumento de volumen o formación ósea.

Composiciones

Otro aspecto de esta invención son composiciones que comprenden: (a) una cantidad segura y eficaz de un péptido de la presente invención y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se utilizan técnicas de formulación farmacéutica estándares, tales como las técnicas descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., última edición.

Una "cantidad segura y eficaz" significa una cantidad del péptido de la invención suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de la condición que se va a tratar, pero suficientemente baja para evitar efectos adversos serios (tales como toxicidad, irritación o respuesta alérgica) en un animal, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un humano, en necesidad del mismo, proporcional a una relación ventaja/riesgo razonable, cuando se utiliza de la manera de esta invención. La "cantidad segura y eficaz" específica variará, obviamente, en función de factores tales como la condición particular que se va a tratar, la condición física del sujeto, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si existe), la forma farmacéutica específica que debe ser utilizada, el vehículo utilizado, la solubilidad del péptido de la presente invención y el régimen de dosificación deseado para la composición. El experto en la técnica puede utilizar las siguientes referencias para determinar una "cantidad segura y eficaz" según la presente invención. Spilker B., Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., Nueva York, 1984, págs. 7-13, 54-60; Spilker B., Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., Nueva York, 1991, págs. 93-101; Craig C., y R. Stitzel, eds., Modern Pharmacology, 2ª ed., Little, Brown and Co., Boston, 1986, págs. 127-33; T. Speight, ed., Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3ª ed., Williams and Wilkins, Baltimore, 1987, págs. 50-56; R. Tallarida, R. Raffa y P. McGonigle, Principles in General Pharmacology, Springer-Verlag, Nueva York, 1988, págs. 18-20.

Además del péptido de la presente invención, las composiciones de la presente invención contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", en la presente memoria, significa uno o más diluyentes de carga o sustancias encapsulantes sólidos o líquidos compatibles que son adecuados para ser administrados a un animal, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un humano. La expresión "compatible", en la presente memoria, significa que los componentes de la composición pueden ser mezclados con el péptido de la invención, y entre sí, de forma que no exista una interacción que pudiera reducir básicamente la eficacia farmacéutica de la composición en condiciones ordinarias de uso. Los vehículos farmacéuticamente aceptables deben, lógicamente, presentar una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja como para resultar adecuados para ser administrados al animal, preferiblemente al mamífero y más preferiblemente al humano que deba ser tratado.

Algunos ejemplos de sustancias que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables o componentes de los mismos son: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y metilcelulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; lubricantes sólidos, tales como ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato cálcico; aceites vegetales, tales como aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles, tales como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico; emulsionantes, tales como los Tweens®; agentes humectantes, tales como laurilsulfato sódico; agentes colorantes; agentes saborizantes; espesantes, estabilizadores; antioxidantes; conservantes; agua exenta de pirógenos; solución salina isotónica y soluciones tamponadoras de tipo fosfato.

La elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso junto con el compuesto de la invención viene prácticamente determinada por la forma de administración del péptido.

Si el péptido de la invención es inyectable, el vehículo farmacéuticamente aceptable es solución salina fisiológica estéril, con un agente suspensor coloidal hemocompatible cuyo pH se ha regulado a aproximadamente 7,4.

En particular, los vehículos farmacéuticamente aceptables para la administración sistémica incluyen azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato cálcico, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, soluciones tampón fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y agua exenta de pirógenos. Los vehículos preferidos para administración parenteral incluyen propilenglicol, etil oleato, pirrolidona, etanol y aceite de sésamo. Preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable para composiciones de administración parenteral comprende al menos aproximadamente un 90% en peso de la composición total.

Las composiciones de la presente invención se proporcionan preferiblemente en formas de dosificación unitarias. En la presente memoria, una "forma de dosificación unitaria" es una composición de esta invención que contiene una cantidad de un péptido de fórmula (I) que es adecuada para ser administrada a un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano, en una dosis única, según las buenas prácticas médicas. Estas composiciones contienen preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg (miligramos) a aproximadamente 1.000 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 500 mg y aún más preferiblemente de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, de un péptido de fórmula (I).

Las composiciones de esta invención pueden presentar cualquiera de las múltiples formas adecuadas, por ejemplo, para la administración oral, rectal, tópica, nasal, ocular o parenteral. Dependiendo de la vía de administración deseada, puede elegirse entre los diferentes vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica. Estos incluyen cargas, diluyentes, hidrótropos, agentes tensioactivos y sustancias encapsulantes sólidas o líquidas. Pueden incluirse productos farmacéuticamente activos opcionales que no interfieran prácticamente con la actividad agonista del CRF_{2}R de los péptidos de fórmula (I). La cantidad de vehículo utilizado con el péptido de fórmula (I) es suficiente para proporcionar una cantidad práctica de material para la administración por dosis unitaria del péptido de fórmula (I). Las técnicas y composiciones para elaborar formas farmacéuticas útiles en los métodos de esta invención se describen en las siguientes referencias: Modern Pharmaceutics, capítulos 9 y 10 (Banker & Rhodes, editores, 1979); Lieberman y col., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (1981); y Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2ª edición (1976).

Pueden utilizarse diferentes formas de dosificación orales, incluidas formas sólidas como comprimidos, cápsulas, gránulos o polvos a granel. Estas formas orales comprenden una cantidad segura y eficaz, habitualmente al menos aproximadamente 5%, preferiblemente de aproximadamente 25% a aproximadamente 50%, del péptido. Los comprimidos pueden tratarse mediante compresión, trituración, recubrimiento entérico, recubrimiento con azúcar, recubrimiento pelicular o compresión múltiple, y pueden contener aglutinantes, lubricantes, diluyentes, disgregantes, colorantes, agentes saborizantes, fluidificantes y agentes fundentes adecuados. Las formas farmacéuticas líquidas orales incluyen soluciones acuosas, emulsiones, suspensiones, soluciones y/o suspensiones reconstituidas a partir de gránulos no efervescentes y preparaciones efervescentes reconstituidas a partir de gránulos efervescentes, que contienen disolventes, conservantes, emulsionantes, agentes suspensores, diluyentes, edulcorantes, agentes fusionantes, agentes colorantes y agentes saborizantes adecuados.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para preparar formas farmacéuticas unitarias para administración oral son bien conocidos en la técnica. Los comprimidos comprenden de forma típica adyuvantes farmacéuticamente compatibles convencionales tales como diluyentes inertes como el carbonato cálcico, el carbonato sódico, el manitol, la lactosa y la celulosa; aglutinantes tales como el almidón, la gelatina y la sacarosa; disgregantes tales como el almidón, el ácido algínico y la croscarmelosa; lubricantes tales como el estearato de magnesio, el ácido esteárico y el talco. Pueden utilizarse agentes deslizantes tales como dióxido de silicio para mejorar las características de flujo de la mezcla en polvo. Pueden añadirse agentes colorantes, tales como los colorantes FD&C, para mejorar el aspecto. Los edulcorantes y los agentes aromatizantes, tales como el aspartamo, la sacarina, el mentol, el peppermint y los aromas de fruta son adyuvantes útiles para comprimidos masticables. Las cápsulas comprenden de forma típica uno o más de los diluyentes sólidos descritos anteriormente. La selección de los componentes vehículos depende de consideraciones secundarias tales como el sabor, el coste y la estabilidad durante el almacenamiento, que no son críticas para los fines de la presente invención y pueden ser fácilmente realizadas por el experto en la técnica. En general, la formulación incluirá el péptido e ingredientes inertes que permiten la protección del entorno del estómago y liberan el material biológicamente activo en el intestino.

El péptido de fórmula (I) se puede modificar químicamente para que resulte eficaz la administración oral del derivado. Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de al menos un resto de la molécula de proteína en sí, en donde dicho resto permite (a) la inhibición de la proteólisis y (b) la absorción en la corriente sanguínea del estómago o intestino. También es deseable el aumento de la estabilidad global de la proteína y el aumento del tiempo de circulación en el cuerpo. Los ejemplos de tales restos incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, caboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliprolina. Newmark y col., J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982). Otros polímeros que se podrían utilizar son poli-1,3-dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Para usos farmacéuticos, según se ha indicado anteriormente, son preferidos los restos de polietilenglicol.

El lugar de liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el duodeno, el yeyuno o el íleon) o el intestino grueso. El experto en la técnica dispone de formulaciones que no se disolverán en el estómago, sino que liberarán el material en el duodeno o en otra parte del intestino. Preferiblemente, la liberación evitará efectos deletéreos del entorno estomacal, bien protegiendo el péptido (o variante) bien por liberación del material biológicamente activo más allá del entorno estomacal, tal como en el intestino.

Para asegurar la total resistencia gástrica, se prefiere un recubrimiento impermeable de pH de al menos 5,0. Los ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que se utilizan como recubrimientos entéricos son trimelitato de acetato de celulosa (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de poli(acetato de vinilo) (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S y goma laca. Estos recubrimientos se pueden utilizar como películas mezcladas.

Las composiciones orales también incluyen soluciones líquidas, emulsiones, suspensiones y similares. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para preparar estas composiciones son bien conocidas en la técnica. Los componentes de vehículos típicos para jarabes, elixires, emulsiones y suspensiones incluyen etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, sacarosa líquida, sorbitol y agua. Para una suspensión, los agentes suspensores típicos incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, Avicel® RC-591, tragacanto y alginato sódico; los agentes humectantes típicos incluyen lecitina y polisorbato 80; y los conservantes típicos incluyen metil paraben y benzoato sódico. Las composiciones líquidas orales también pueden contener uno o más componentes tales como los edulcorantes, agentes aromatizantes y colorantes descritos anteriormente.

Las composiciones de la presente invención también pueden incluir otros agentes activos. En el documento WO 99/15210 se incluyen ejemplos no limitativos de agentes activos.

Otras composiciones útiles para conseguir una administración sistémica de los compuestos de la invención incluyen formas farmacéuticas sublinguales, bucales, supositorios, nasales y pulmonares. Estas composiciones comprenden de forma típica una o más sustancias de carga solubles tales como sacarosa, sorbitol y manitol; y aglutinantes tales como goma arábiga, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa y hidroxipropil metilcelulosa. También pueden incluir los agentes deslizantes, lubricantes, edulcorantes, colorantes, antioxidantes y aromatizantes descritos anteriormente.

Las composiciones de esta invención también pueden administrarse por vía tópica al sujeto, p. ej., mediante aplicación directa o dispersión de la composición sobre la epidermis o el tejido epitelial del sujeto, o por vía transdérmica mediante un "parche". Un ejemplo de un aplicador de parches adecuado se describe en el documento WO 02/47593. Este tipo de composiciones incluyen, por ejemplo, lociones, cremas, soluciones, geles y sólidos. Estas composiciones tópicas comprenden preferiblemente una cantidad segura y eficaz, habitualmente al menos aproximadamente 0,1%, y preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, del péptido. Los vehículos adecuados para la administración tópica preferiblemente permanecen sobre la piel en forma de película continua y no se despegan de allí ni por el efecto de la perspiración ni de la inmersión en agua. Generalmente el vehículo es de naturaleza orgánica y capaz de haber dispersado o disuelto en él al péptido. El vehículo puede incluir emolientes, emulsionantes, espesantes, disolventes farmacéuticamente aceptables y similares.

Métodos de administración

Esta invención también proporciona el uso de un péptido según la invención para la elaboración de un medicamento para tratar trastornos modulados por CRF_{2}R en un sujeto humano o animal, mediante la administración de una cantidad segura y eficaz de un péptido a dicho sujeto. Tales trastornos han sido descritos anteriormente.

Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas de forma tópica o sistémica. La aplicación sistémica incluye cualquier método para introducir un péptido de fórmula (I) en los tejidos del cuerpo, p. ej., por administración intra-articular (especialmente para el tratamiento de la artritis reumatoide), intratecal, epidural, intramuscular, transdérmica, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, nasal, pulmonar, sublingual, rectal y oral.

La dosis específica del péptido que debe administrarse, la duración del tratamiento y la elección de la vía (tópica o sistémica) para el tratamiento constituyen factores interdependientes. La dosificación y el régimen de tratamiento también dependerán de estos factores al igual que el péptido específico utilizado, la indicación del tratamiento, la capacidad del péptido para alcanzar las concentraciones inhibitorias mínimas en el sitio del tejido que precisa tratamiento, las características personales del sujeto (tales como el peso), el cumplimiento con el régimen de tratamiento y la presencia y gravedad de cualquier efecto adverso del tratamiento.

Se puede utilizar la administración tópica para suministrar el péptido sistémicamente o para tratar un sujeto de forma local. Las cantidades del péptido que se han de administrar de forma tópica dependen de factores tales como la sensibilidad cutánea, el tipo y situación del tejido a tratar, la composición y el vehículo a administrar (si lo hubiera), el péptido específico a administrar, así como el trastorno específico a tratar y la extensión de los efectos sistémicos deseados (comparados con los efectos localizados).

Los péptidos de la presente invención pueden dirigirse a localizaciones específicas en donde se precisa tratamiento utilizando ligandos redireccionados. Por ejemplo, para centrar un péptido para tratar distrofia muscular, el péptido se conjuga con un anticuerpo o fragmento del mismo que es inmunorreactivo con un marcador muscular esquelético tal cual se entiende generalmente en la técnica. El ligando redireccionado también puede ser un ligando adecuado para un receptor que esté presente en el músculo esquelético. Puede utilizarse cualquier ligando redireccionado que reaccione de forma específica con un marcador por el tejido objetivo previsto. Los métodos para unir el compuesto de la invención al ligando redireccionado son bien conocidos y similares a los que se describen más adelante para la unión al vehículo.

Un péptido de fórmula (I) se puede administrar mediante una liberación controlada. Por ejemplo, el péptido se puede administrar utilizando infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas, inyección subcutánea de liberación sostenida que contiene un material biodegradable u otros modos de administración. En una realización, se puede utilizar una bomba Langer y col., eds., Medical Applications of Controlled Release, CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald y col., Surgery, 88:507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989). En otra realización, se pueden utilizar materiales poliméricos. Langer, 1974, supra; Sefton, 1987, supra; Smolen y col., eds., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, N.Y. (1984); Ranger y col., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); véase también Levy y col., Science, 228:190 (1985); During y col., Ann. Neurol., 25:351 (1989); Howard y col., J. Neurosurg., 71:105 (1989). En otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada junto al blanco terapéutico siendo así necesaria únicamente una fracción de la dosis sistémica. Véase, p. ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, págs. 115-138 (1984). En otra realización, un sistema de suministro de fármacos basado en polímeros en el que los fármacos se administran desde sistemas de polímeros o lípidos. Estos sistemas suministran un fármaco mediante tres mecanismos generales: (1) difusión de las especies de fármacos desde o a través del sistema; (2) una reacción química o enzimática que conduce a la degradación del sistema o escisión del fármaco del sistema; y (3) activación del disolvente, a través de osmosis o hinchamiento del sistema. Los sistemas adecuados se describen en artículos de revistas: Langer, Robert, "Drug delivery and targeting", Nature: 392 (Supp):5-10 (1996); Kumar, Majeti N. V., "Nano and Microparticles as Controlled Drug Delivery Devices", J Pharm Pharmaceut Sci, 3(2):234-258 (2000); Brannon-Peppas, "Polymers in Controlled Drug Delivery", Medical Plastics and Biomaterials, (Nov. 1997). Véanse también, Langer, 1990, supra; Treat y col., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); Langer, Science, 249:1527-1533 (1990). Los sistemas adecuados pueden incluir: sistema de suministro de fármaco Atrigel™ de Atrix Labs; DepoFoam™ de SkyPharma; hidrogeles basados en polietilenglicol de Infimed Therapeutics, Inc.; sistemas de suministro de fármacos solubilizantes ReGel™, SQZGel™ oral, HySolv™ y ReSolv™ de MacroMed; ProGelz™ de ProGelz' Products; y ProLease™ inyectable de Alkermes.

En lo anteriormente expuesto, lógicamente, los péptidos de la invención pueden ser administrados solos o como mezclas y las composiciones pueden incluir también otros fármacos o excipientes adicionales según resulte adecuado para la indicación.

Terapia genética

Se pueden utilizar vectores de expresión para introducir los ácidos nucleicos de la invención en una célula como parte de terapia genética. Tales vectores generalmente tienen sitios de restricción convenientes situados cerca de la secuencia promotora para facilitar la inserción de secuencias de ácido nucleico. Se pueden preparar casetes de transcripción que comprenden una región de inicio de transcripción, el gen de interés o un fragmento del mismo y una región terminadora de la transcripción. Los casetes de transcripción se pueden introducir en diversos vectores, p. ej., plásmidos, de retrovirus, de lentivirus, de adenovirus y similares, donde los vectores se pueden mantener en las células de forma transitoria o estable, normalmente durante un período de al menos aproximadamente un día, más normalmente durante un período de al menos aproximadamente dos días a varias semanas.

Las proteínas y ácidos nucleicos de la invención se pueden introducir en tejidos o células huésped mediante diversas rutas, incluyendo por infección viral, microinyección o fusión de vesículas. También se puede utilizar la inyección presurizada para administración intramuscular, como describen Furth y col., Anal. Biochem., 205:365-368 (1992). El ADN se puede recubrir sobre micropartículas de oro y administrar intradérmicamente mediante un dispositivo de bombardeo de partículas o "pistola de genes" según se describe en la bibliografía. Veáse, p. ej., Tang y col., Nature 356:152-154 (1992), donde se recubren microproyectiles de oro con ADN y se bombardean en células cutáneas.

Kits

Los péptidos de la presente invención pueden estar incorporados en un kit para prevenir o tratar un trastorno modulado por CRF_{2}R que comprende: (a) un péptido de fórmula (I) en forma de dosis unitaria y (b) instrucciones de uso. Tales kits incluyen preferiblemente diversas dosis unitarias. Tales kits pueden incluir una lámina que tiene orientaciones de dosificación en función del uso previsto. Un ejemplo de tales kits es un envase de burbuja o blíster. Los envases de burbuja o blísters son conocidos en la industria del envasado y ampliamente utilizados para envasar formas farmacéuticas en dosis unitarias. Si se desea, se puede proporcionar una ayuda de memoria, por ejemplo, en forma de números, letras u otro marcado o con un calendario insertado, que designa los días del programa de tratamiento en los que se pueden administrar las dosis. El documento WO 01/45636 describe un ejemplo de un kit. Los programas de tratamiento se incluyen en el ámbito de los expertos en medicina. Ejemplos no limitativos incluyen una vez al día, a la semana, cada quince días, al mes o cada dos meses.

Ejemplo Ejemplo 1

La sauvagina y otros agonistas no selectivos del CRFR generalmente no son eficaces para tratar trastornos modulados por CRF_{2}R porque estos agonistas pueden activar también el CRF_{1}R, ocasionando así efectos adversos no deseables.

La tabla 2 refleja una comparativa de unión al CRF de fragmentos de secuencias nativas de urocortina I humana (hUcnI), urocortina II humana (hUroII), urocortina III humana (hUroIII), factor liberador de corticotropina humana (hCRF), corticotropina ovina (oCRF) y sauvagina (Svg) designados con los SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10 y 11, respectivamente.

TABLA 2

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Ejemplo 2 La tabla 3 refleja una comparativa de unión al CRF de diversas realizaciones de la invención. TABLA 3

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Ejemplo 3 Eficacia aumentada in vivo

Los péptidos de la presente invención presentan disponibilidad biológica extendida, especialmente en condiciones de dosificación baja, en comparación con secuencias nativas conocidas, p. ej., el fragmento de péptido UroII (SEQ ID N°: 4).

La semivida de un péptido en un sujeto se puede determinar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de muestras de suero recogidas del sujeto en diversos momentos después de la administración del péptido. El experto en la técnica debería saber cómo seleccionar los tampones de elución apropiados para la HPLC basada en las propiedades físico-químicas de un péptido determinado.

Un ejemplo no limitativo de un estudio in vivo para determinar la eficacia se describe en la presente memoria. Se administra un péptido de fórmula (I) por vía intravenosa (IV) (1.000 \mug/kg) y subcutánea (SC) (1.000 \mug/kg) a ratones. Después de la administración, se obtienen muestras de sangre en diversos momentos (IV = 0, 2, 10, 30 min y 1, 2, 4 y 6 h; y SC = 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, y 6 h) en tubos microcentrífugos que contienen heparina sódica. Las muestras de sangre se procesan para obtener plasma que se almacena a -70ºC hasta ser analizado.

Se preparan patrones de plasma. El día del análisis, se prepara una solución desoxidante de un péptido de fórmula (I), que cubre un intervalo de concentración de 50 ng/ml a 100 \mug/ml, en metanol mediante dilución serial de una solución madre metanólica de péptido de fórmula (I) a 1 mg/ml preparada previamente. De manera similar, se prepara la solución desoxidante de patrón interno (ISTD), isótopo estable marcado h-Unc-II, por dilución serial de una solución madre de ISTD a 1 mg/ml almacenada, para obtener una concentración final de 5 \mug/ml el día del análisis. Se preparan patrones de plasma de trabajo que cubren un intervalo de masa de 0,5 a 100 ng añadiendo 10 \mul de la solución desoxidante de péptido de fórmula (I) adecuada en tubos que ya contienen 10 \mul de una solución de ISTD a 5 \mug/ml, 100 \mul de agua de adición y 100 \mul de plasma de rata sin aditivos. Se preparan los patrones de trabajo para su análisis según se describe a continuación.

Se preparan muestras para control de la calidad (QC). Se prepara una solución madre QC a nivel de 50 ng/ml añadiendo 25 \mul de una solución desoxidante de un péptido de fórmula (I) a 1 \mug/ml en 475 \mul de plasma de rata heparinizado y sin aditivos contenido en un vial de plástico. Se preparan muestras QC de trabajo añadiendo 100 \mul de la solución madre QC (50 ng/ml) en tubos que ya contienen 10 \muL de una solución de ISTD a 5 \mug/ml y 100 \mul de agua de adición. Se preparó la muestra QC de trabajo para su análisis según se describe a continuación.

Se preparan muestras de estudio. El día del análisis, se descongelan las muestras a temperatura ambiente y se añade una alícuota de la muestra a un tubo que ya contiene 10 \mul de una solución de ISTD a 5 \mug/ml, 100 \mul de agua de adición y una alícuota de plasma de rata heparinizada y sin aditivos. El volumen de la muestra y del plasma de rata sin aditivos es tal que el volumen total de plasma es igual a 100 \mul.

Se preparan los patrones de trabajo, las muestras QC de trabajo y las muestras de estudio para su análisis añadiendo 400 \mul de acetonitrilo en tubos que contienen cada una de las muestras, para después taponar, agitar, centrifugar y aislar el sobrenadante. Se seca una alícuota (300 \mul) del sobrenadante bajo N_{2} y se reconstituye en 50 \mul de metanol/agua (50/50).

Los patrones de trabajo, muestras QC de trabajo y muestras de estudio preparados se analizan mediante separación de gradientes por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC), para introducir seguidamente la muestra a través de ionización por electrospray (ESI) con detección de espectroscopía de masas/espectroscopía de masas (MS/MS) utilizando control de la reacción seleccionada (SRM) en el modo de iones positivos. Se controla la h-Unc-II y el ISTD de un canal SRM.

Las soluciones de dosis del estudio de farmacocinética se diluyen con metanol y analizan mediante RP-HPLC con detección ultravioleta. Las concentraciones del péptido de fórmula (I) en las soluciones de dosis se calculan mediante interpolación de una curva de regresión lineal construida a partir de patrones conocidos.

<110> The Procter & Gamble Company

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Isfort, Robert J

\hskip1cm

Mazur, Wieslaw A

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<120> Agonistas del receptor 2 del factor liberador de la corticotropina

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<130> 8847M/CA

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<140> EP 03703867.6

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<141> 16-01-2003

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<150> US 60/349.117

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<151> 16-01-2002

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/376.337

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<151> 29-04-2002

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<150> US 60/388.895

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<151> 14-06-2002

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<150> US 60/411.988

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<151> 19-09-2002

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<160> 15

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<170> Versión patentada 3,1

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<210> 1

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\sa{Asp Asn Pro Ser Leu Ser Ile Asp Leu Thr Phe His Leu Leu Arg Thr}

\sac{Leu Leu Glu Leu Ala Arg Thr Gln Ser Gln Arg Glu Arg Ala Glu Gln}

\sac{Asn Arg Ile Ile Phe Asp Ser Val}

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<210> 2

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ACETILACIÓN

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (38)..(38)

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<223> AMIDACIÓN

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<400> 2

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\sa{Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu}

\sac{Glu Gln Glu Lys Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala}

\sac{Arg Ile Leu Ala Arg Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\sa{Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu}

\sac{Glu Gln Ala Arg Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala}

\sac{Arg Ile Leu Ala Arg Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\sa{Thr Lys Phe Thr Leu Ser Leu Asp Val Pro Thr Asn Ile Met Asn Leu}

\sac{Leu Phe Asn Ile Ala Lys Ala Lys Asn Leu Arg Ala Gln Ala Ala Ala}

\sac{Asn Ala His Leu Met Ala Gln Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\sa{Ser Glu Glu Pro Pro Ile Ser Leu Asp Leu Thr Phe His Leu Leu Arg}

\sac{Glu Val Leu Glu Met Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Gln Gln Ala His}

\sac{Ser Asn Arg Lys Leu Met Glu Ile Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ovis sp

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\sa{Ser Gln Glu Pro Pro Ile Ser Leu Asp Leu Thr Phe His Leu Leu Arg}

\sac{Glu Val Leu Glu Met Thr Lys Ala Asp Gln Leu Ala Gln Gln Ala His}

\sac{Ser Asn Arg Lys Leu Leu Asp Ile Ala}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Phyllomedusa sauvagei

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Glx Gly Pro Pro Ile Ser Ile Asp Leu Ser Leu Glu Leu Leu Arg Lys}

\sac{Met Ile Glu Ile Glu Lys Gln Glu Lys Glu Lys Gln Gln Ala Ala Asn}

\sac{Asn Arg Leu Leu Leu Asp Thr Ile}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ACETILACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (38)..(38)

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<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu}

\sac{Glu Gln Glu Lys Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala}

\sac{Arg Ile Leu Ala Arg Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (38)..(38)

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<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\sa{Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu}

\sac{Glu Gln Ala Lys Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala}

\sac{Arg Ile Leu Ala Arg Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (38)..(38)

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<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\sa{Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu}

\sac{Glu Gln Ala Lys Gln Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala}

\sac{Arg Ile Leu Ala Arg Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (38)..(38)

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<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\sa{Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu}

\sac{Glu Gln Glu Arg Gln Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala}

\sac{Arg Ile Leu Ala Arg Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (38)..(38)

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<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\sa{Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu}

\sac{Glu Gln Glu Lys Gln Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala}

\sac{Arg Ile Leu Ala Arg Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (38)..(38)

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<223> AMIDACIÓN

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<400> 13

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\sa{Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu}

\sac{Glu Gln Glu Arg Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala}

\sac{Arg Ile Leu Ala Arg Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (38)..(38)

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<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\sa{Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu}

\sac{Glu Gln Glu Lys Gln Glu Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala}

\sac{Arg Ile Leu Ala Arg Val}

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<210> 15

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (38)..(38)

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<223> AMIDACIÓN

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<400> 15

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\sa{Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu}

\sac{Glu Gln Glu Lys Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala}

\sac{Arg Ile Leu Ala Arg Val}

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Claims (8)

1. Un péptido no nativo que comprende la secuencia:

IVLSLDVPIGLLQILLEQEKX_{21}RAAREQATTNARILARV

en donde X_{21} se selecciona de A y Q,

o variantes del mismo que tienen al menos 97% de identidad con la secuencia, siendo dichas variantes agonistas del CRF2R.

2. El péptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia:

IVLSLDVPIGLLQILLEQEKX_{21}RAAREQATTNARILARV

en donde X_{21} se selecciona de A y Q.

3. Un péptido según las reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en donde X_{21} es A.

4. El uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para fabricar un medicamento para prevenir o tratar un trastorno modulado por CRF2R.

5. El uso según la reivindicación 3, en donde el trastorno modulado por CRF2R es atrofia muscular esquelética o distrofia muscular.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Un anticuerpo aislado específico para un péptido según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2.

8. Una composición farmacéutica que comprende:

a)

una cantidad segura y eficaz de un péptido según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2; y

b)

un vehículo farmacéuticamente aceptable.