ES2229687T3 - Promotores constitutivos de maiz. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos para un promotor que es capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona entre: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 1; b) una secuencia de nucleótidos depositada como Nº de Acceso de la ATCC 207123; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 40 nucleótidos contiguos de la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 1; d) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de a), b) o c); e) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% con una secuencia indicada en a) o b).
Description
Promotores constitutivos de maíz.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular de las plantas y, más particularmente, a la
regulación de la expresión de genes en plantas.
La expresión de secuencias de ADN heterólogas en
un hospedador vegetal depende de la presencia de un promotor unido
operativamente que es funcional dentro del hospedador vegetal. La
elección de la secuencia promotora determinará cuándo y dónde se
expresa la secuencia de ADN heteróloga dentro del organismo. De esta
manera, cuando se desea una expresión continua a lo largo de todas
las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. Por
el contrario, cuando se desea la expresión génica en respuesta a un
estímulo, los elementos reguladores elegidos son promotores
inducibles. En cualquier caso, pueden incluirse secuencias
reguladoras adicionales cadena arriba y/o cadena abajo de la
secuencia promotora central en construcciones de expresión de
vectores de transformación para producir niveles variables de
expresión constitutiva o inducible de secuencias de nucleótidos
heterólogas en una planta transgénica.
A menudo, es deseable tener la expresión
constitutiva de una secuencia de ADN en todas las células de un
organismo. Por ejemplo, podría conseguirse una mayor resistencia de
una planta a la infección por patógenos transportados por el
substrato y por el aire, por medio de la manipulación genética del
genoma de la planta para que contuviera un promotor constitutivo
unido operativamente a un gen de resistencia a patógenos heterólogo
de tal forma que se expresaran proteínas de resistencia a patógenos
de manera continua a lo largo de todos los tejidos de la planta.
Como alternativa, podría ser deseable inhibir la
expresión de una secuencia de ADN nativa dentro de los tejidos de
una planta para conseguir un fenotipo deseado. En este caso, tal
inhibición podría conseguirse con la transformación de la planta
para que contuviera un promotor constitutivo unido operativamente a
una secuencia de nucleótidos antisentido, de tal forma que la
expresión constitutiva de la secuencia antisentido produjera un
transcrito de ARN que interfiriera con la traducción de la ARNm de
la secuencia de ADN nativa.
De esta manera, se necesita el aislamiento y la
caracterización de promotores constitutivos que puedan servir como
regiones reguladoras para la expresión constitutiva de secuencias de
nucleótidos heterólogas de interés para la manipulación genética de
plantas con la intención de que presenten rasgos fenotípicos
específicos.
Se proporcionan composiciones y métodos para
regular la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una
planta.
La invención también proporciona una molécula de
ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos para
un promotor que es capaz de iniciar la transcripción constitutiva en
una célula vegetal, donde dicha secuencia de nucleótidos se
selecciona entre:
a) una secuencia de nucleótidos que comprende la
secuencia indicada en la SEC ID Nº: 1;
b) una secuencia de nucleótidos depositada como
número de acceso de la ATCC 207123;
c) una secuencia de nucleótidos que comprende al
menos 40 nucleótidos contiguos de la secuencia indicada en la SEC
Nº: 1;
d) una secuencia de nucleótidos que híbrida en
condiciones rigurosas con una secuencia de a), b) o c); y
e) una secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad de secuencia de al menos un 70% con la secuencia indicada
en a) o b).
La invención también proporciona una construcción
de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención
unida a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.
La invención también proporciona un vector que
comprende la construcción de ADN de acuerdo con la invención.
La invención también proporciona una célula
hospedadora que tiene incorporada de manera estable en su genoma la
construcción de ADN de acuerdo con la invención.
Se proporciona una composición que comprende una
nueva secuencia de nucleótidos para un promotor vegetal
constitutivo, más particularmente un promotor aislado a partir del
gen de maíz que codifica la histona H2B. Se proporciona un método
para expresar constitutivamente una secuencia de nucleótidos
heteróloga en una planta usando la secuencia promotora descrita en
este documento. El método comprende transformar una célula vegetal
con un vector de transformación que comprende una secuencia de
nucleótidos heteróloga unida operativamente al promotor vegetal de
la presente invención y regenerar una planta transformada de manera
estable a partir de la célula vegetal transformada.
La invención también proporciona una célula
vegetal o una planta transformada de manera estable con una
construcción de ADN de acuerdo con la invención y una semilla de tal
planta.
La figura 1 muestra el vector plasmídico PHP3953
que comprende el gen GUS unido operativamente al promotor de
ubiquitina. Se reclonaron fragmentos de promotor de la presente
invención en este plásmido en lugar del promotor de ubiquitina, y el
ADN plasmídico resultante se pudo usar en estudios de transformación
para ensayar la actividad del promotor.
La composición de la presente invención es una
molécula de ácido nucleico que comprende una nueva secuencia de
nucleótidos para un promotor vegetal, más particularmente el
promotor constitutivo para el gen de maíz que codifica la histona
H2B. En Joanin P. et al Plant Molecular Biology, 1992, 20,
páginas 581-558, se proporciona la secuencia de
nucleótidos que codifica dos histonas de maíz H2B.
La secuencia de nucleótidos para este promotor se
indica en la SEC ID Nº: 1. En particular, la presente invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de ADN depositada
en un hospedador bacteriano como el número de acceso de la ATCC
207123, y variantes y fragmentos de la misma. El promotor para este
gen de maíz se aisló a partir de la región 5' no traducida que
flanqueaba su sitio de inicio de la transcripción respectivo. Los
métodos para el aislamiento de regiones promotoras son bien
conocidos en la técnica. El método específico usado para obtener el
promotor de la presente invención se describe en el ejemplo 1
presentado a continuación.
Un plásmido que contiene la secuencia de
nucleótidos del promotor de la invención se ha depositado en la
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, y se le
ha asignado el nº de acceso 207123. Este depósito se mantendrá bajo
los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del
Procedimiento en Materia de Patentes.
La invención incluye una composición de ácido
nucleico aislada o substancialmente purificada. Una molécula de
ácido nucleico "aislada" o "purificada", o una porción
biológicamente activa de la misma, carece substancialmente de otro
material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas
recombinantes, o carece substancialmente de precursores químicos u
otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente.
Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" carece de
secuencias (preferiblemente secuencias codificantes de proteínas)
que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir,
secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico)
en el ADN genómico del organismo del que procede el ácido nucleico.
Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido
nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb,
3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que
flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN
genómico de la célula de la que procede el ácido nucleico.
Por "promotor" se entiende una región
reguladora de ADN que normalmente comprende una caja TATA capaz de
dirigir la ARN polimerasa II para que inicie la síntesis de ARN en
el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia
codificante particular. Un promotor también puede comprender otras
secuencias de reconocimiento colocadas generalmente cadena arriba o
en posición 5' con respecto a la caja TATA, denominadas elementos
promotores cadena arriba, que influyen sobre la velocidad de inicio
de la transcripción. Se reconoce que habiendo identificado la
secuencia de nucleótidos para la región promotora descrita en este
documento, está dentro del estado de la técnica el aislamiento e
identificación de otros elementos reguladores en la región 5' no
traducida cadena arriba de la región promotora particular
identificada en este documento. De esta manera, la región promotora
descrita en este documento puede comprender además elementos
reguladores cadena arriba que confieren expresión específica de
tejidos de cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga unida
operativamente a la secuencia promotora descrita. Véase, en
particular, la Patente Australiana Nº
AU-A-77751/94 y las Patentes de
Estados Unidos Nº 5.466.785 y 5.635.618.
La secuencia promotora de maíz de la presente
invención, cuando se monta dentro de una construcción de ADN de tal
manera que el promotor esté unido operativamente a una secuencia de
nucleótidos heteróloga de interés, permite la expresión constitutiva
de la secuencia de nucleótidos heteróloga en las células de una
planta transformada de manera estable con esta construcción de ADN.
Por "secuencia de nucleótidos heteróloga" se entiende una
secuencia que no se produce de manera natural con la secuencia
promotora. Aunque esta secuencia de nucleótidos es heteróloga a la
secuencia promotora, puede ser homóloga o nativa o heteróloga o
extraña para el hospedador vegetal. Por "constitutivo" se
entiende la expresión en las células a lo largo de toda la planta la
mayor parte del tiempo y en la mayoría de los tejidos.
La secuencia promotora aislada de la presente
invención puede clasificarse como un promotor constitutivo fuerte.
En general, por "promotor débil" se entiende un promotor que
dirige la expresión de una secuencia codificante a bajo nivel. Por
"bajo nivel" se entienden niveles de aproximadamente 1/10.000
transcritos a aproximadamente 1/100.000 transcriptos y a
aproximadamente 1/500.000 transcriptos. A la inversa, un promotor
fuerte dirige la expresión de una secuencia codificante a un alto
nivel, o de aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100
transcritos y a aproximadamente 1/1.000 transcritos.
La secuencia de nucleótidos para el promotor
constitutivo de la presente invención puede ser la secuencia natural
o cualquier secuencia que tenga una homología substancial. Por
"homología substancial" se entiende una secuencia que presenta
una equivalencia funcional y estructural substancial con la
secuencia nativa o natural. Cualquier diferencia funcional o
estructural entre secuencias substancialmente homólogas no afecta a
la capacidad de la secuencia para funcionar como promotor como se
describe en la presente invención. De esta manera, cualquier
secuencia que tenga una homología de secuencia substancial con la
secuencia de un promotor constitutivo particular de la presente
invención dirigirá la expresión constitutiva de una secuencia de
nucleótidos heteróloga unida operativamente. Dos secuencias de
nucleótidos promotoras se consideran substancialmente homólogas
cuando tienen una homología de secuencia de al menos aproximadamente
un 50%, de un 60% a un 70%, generalmente de aproximadamente un 80%,
y preferiblemente de aproximadamente un 85%, 90% y hasta un 98%.
Las secuencias substancialmente homólogas de la
presente invención incluyen variantes de las secuencias descritas,
tales como las resultantes de mutagénesis de localización dirigida,
así como secuencias obtenidas sintéticamente. En la técnica son bien
conocidos métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencias de
nucleótidos. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad.
Sci. Estados Unidos 82:488-492; Kunkel
et al. (1987) Methods Enzymol.
154:367-382; Patente de Estados Unidos Nº 4.873.192;
Walker et al., eds. (1983) Techniques in Molecular
Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las
referencias citadas en estos documentos. De esta manera, la
secuencia de nucleótidos promotora de la invención incluye tanto las
secuencias naturales como mutantes y forma derivadas sintéticamente.
Generalmente, las variantes de secuencias de nucleótidos de la
invención tendrán una identidad de secuencia de al menos
aproximadamente un 50%, de un 60% a un 70%, generalmente de
aproximadamente un 80%, y preferiblemente aproximadamente de un 85%,
90% y hasta 98% con su secuencia de nucleótidos nativa
respectiva.
La presente invención también incluye fragmentos
de la secuencia de nucleótidos promotora descrita en este documento.
Por "fragmento" se entiende una porción de la secuencia de
nucleótidos promotora. Los fragmentos de una secuencia de
nucleótidos promotora pueden retener su actividad biológica. De esta
manera, por ejemplo, puede utilizarse menos que la secuencia
promotora entera descrita en este documento para dirigir la
expresión de una secuencia de nucleótidos unida operativamente de
interés, tal como una secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína heteróloga. Está dentro de la experiencia en la técnica
determinar si tales fragmentos reducen los niveles de expresión o
alteran la naturaleza de la expresión, es decir, la expresión
constitutiva. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de
nucleótidos promotora que son útiles como sondas de hibridación
generalmente no retienen su actividad biológica.
Las moléculas de ácido nucleico que son
fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora comprenden al
menos 40, 45, 50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550,
600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500,
1.600 ó 1.700 nucleótidos, o hasta el número de nucleótidos
presentes en una secuencia de nucleótidos promotora de longitud
completa descrita en este documento (es decir, 1392 para la SEC ID
Nº: 1). Generalmente, los fragmentos de una secuencia promotora que
retienen su actividad biológica comprenden al menos 40 nucleótidos
contiguos, preferiblemente al menos 50 nucleótidos contiguos, más
preferiblemente al menos 75 nucleótidos contiguos, y aún más
preferiblemente al menos 100 nucleótidos contiguos de la secuencia
de nucleótidos promotora particular descrita en este documento. Las
longitudes de fragmento preferidas dependen del objetivo y también
variarán dependiendo de la secuencia promotora particular.
Las secuencias de nucleótidos de tales fragmentos
normalmente comprenderán la secuencia de reconocimiento TATA de la
secuencia promotora particular. Tales fragmentos pueden obtenerse
usando enzimas de restricción para escindir la secuencia de
nucleótidos promotora natural descrita en este documento;
sintetizando una secuencia de nucleótidos a partir de la secuencia
natural de la secuencia de ADN promotora; o puede obtenerse por
medio del uso de tecnología de PCR. Véase, en particular, Mullis
et al. (1987) Methods Enzymol.
155:335-350, y Erlich, ed. (1989) PCR
Technology (Stockton Press, Nueva York). Las composiciones de la
presente invención incluyen variantes de estos fragmentos de
promotores, tales como las obtenidas por mutagénesis de localización
dirigida.
La secuencia de nucleótidos promotora descrita
puede usarse para aislar secuencias promotoras homólogas en otras
especies vegetales. En la técnica están disponibles métodos para la
hibridación de secuencias de ácido nucleico. Pueden aislarse
secuencias promotoras de otras plantas de acuerdo con técnicas bien
conocidas basándose en su homología de secuencia con las secuencias
promotoras indicadas en este documento. En estas técnicas, se usa
todo o parte de la secuencia de nucleótidos conocida como una sonda
que hibrida selectivamente con otras secuencias de nucleótidos
promotoras presentes en una población de fragmentos de ADN genómico
clonado o fragmentos de ADNc (es decir, bibliotecas genómicas o de
ADNc) procedentes de un organismo elegido.
Para obtener otras secuencias promotoras
homólogas, puede usarse la secuencia de nucleótidos promotora o
pueden usarse porciones de la misma como sondas capaces de hibridar
específicamente con secuencias promotoras correspondientes. Para
conseguir una hibridación específica en una diversidad de
condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y que
preferiblemente tienen una longitud de al menos aproximadamente 10
nucleótidos, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 20
nucleótidos. Tales sondas pueden usarse para amplificar las
secuencias promotoras de interés procedentes de un organismo elegido
por los procesos bien conocidos de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Esta técnica puede usarse para aislar secuencias
promotoras adicionales a partir de un organismo deseado o como un
ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias
promotoras en un organismo.
Tales técnicas incluyen selección de bibliotecas
de ADN cultivadas en placas por hibridación (placas o colonias;
véase, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular
Cloning; A Laboratory Manual (2 ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Plainview, Nueva York) y amplificación por PCR
usando cebadores oligonucleotídicos (véase, por ejemplo, Innis et
al., eds. (1990) PCR Protocols, a Guide to Methods and
Applications, Academic Press, Nueva York).
Por ejemplo, la hibridación de tales secuencias
puede realizarse en condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad
media o incluso en condiciones rigurosas (por ejemplo, condiciones
representadas por una rigurosidad de lavado de formamida al
35-40% con solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% y
SSPE 1x a 37ºC; condiciones representadas por una rigurosidad de
lavado de formamida al 40-45% con solución de
Denhardt 5x, SDS al 0,5% y SSPE 1x a 42ºC; y condiciones
representadas por una rigurosidad de lavado de formamida al 50% con
solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% y SSPE 1x a 42ºC,
respectivamente) al ADN que codifica la secuencia promotora descrita
en este documento en un ensayo de hibridación convencional. Véase
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
Nueva York). En general, las secuencias homólogas que son secuencias
promotoras e hibridan con la secuencia promotora descrita en este
documento tendrán una homología de al menos un 70%, e incluso de un
80%, 85%, 90%, 95% o mayor con la secuencia descrita. Es decir, la
similitud de las secuencias puede variar, compartiendo una similitud
de secuencia de al menos aproximadamente un 70% e incluso de
aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95% y 98%.
Las siguientes expresiones se usan para describir
las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos: (a)
"secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación",
(c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de
secuencia" y (e) "identidad substancial".
(a) Como se usa en este documento, "secuencia
de referencia" es una secuencia definida usada como base para una
comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser una
subserie o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo,
tal como un segmento de un ADNc o secuencia génica de longitud
completa, o el ADNc o secuencia génica completa.
(b) Como se usa en este documento, "ventana de
comparación" hace referencia a un segmento contiguo y específico
de una secuencia polinucleotídica, donde la secuencia
polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender
adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la
secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones)
para una alineación óptima de las dos secuencias. En general, la
ventana de comparación tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos
contiguos, y opcionalmente puede tener una longitud de 30, 40, 50,
100 o más nucleótidos. Los especialistas en la técnica entenderán
que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia
debido a la inclusión de huecos en la secuencia polinucleotídica,
típicamente se introduce una penalización de hueco y se resta del
número de acoplamientos.
En la técnica se conocen métodos para la
alineación de secuencias con fines comparativos. Una alineación
óptima de secuencias con fines comparativos puede realizarse por
medio del algoritmo de homología local de Smith et al. (1981)
Adv. Appl. Math. 2:482; por medio del algoritmo de alineación
de homología de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol.
48:443; por medio de la búsqueda del método de similitud de Pearson
et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444; por
medio de la aplicación informatizada de estos algoritmos,
incluyendo, pero sin limitación: CLUSTAL en el programa PC/Gene de
Intelligenetics, Mountain View, California; GAP, BESTFIT, BLAST,
FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics,
Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison,
Wisconsin; el programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins et
al. (1988) Gene 73:237-244 (1988);
Higgins et al. (1989) CABIOS
5:151-153; Corpet et al. (1988) Nuc.
Acids Res. 16:10881-90; Huang et al.
(1992) Computer Applications in the Biosciences
8:155-65, y Person et al. (1994) Meth.
Mol. Biol. 24:307-331; los métodos de alineación
informática preferidos también incluyen los algoritmos BLASTP,
BLASTN y BLASTX (véase Altschul et al. (1990) J. Mol.
Biol. 215:403-410). La alineación también se
realiza a menudo por inspección y alineación manual.
(c) Como se usa en este documento, "identidad
de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias
de ácido nucleico hace referencia a los restos en las dos secuencias
que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima
sobre una ventana de comparación específica.
(d) Como se usa en este documento, "porcentaje
de identidad de secuencia" significa el valor determinado por
comparación de dos secuencias alineadas óptimamente sobre una
ventana de comparación, donde la porción de la secuencia
polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender
adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la
secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones)
para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se
calcula determinando el número de posiciones en las que existe una
base de ácido nucleico idéntica en las dos secuencias para producir
el número de posiciones acopladas, dividiendo el número de
posiciones acopladas por el número total de posiciones en la ventana
de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para producir
el porcentaje de identidad de secuencia.
(e) (i) La expresión "identidad substancial"
de secuencias polinucleotídicas significa que un polinucleótido
comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al
menos un 70%, preferiblemente de al menos un 80%, más
preferiblemente de al menos un 90% y aún más preferiblemente de al
menos un 95% en comparación con una secuencia de referencia, usando
uno de los programas de alineación descritos y usando parámetros
convencionales.
Otra indicación de que las secuencias de
nucleótidos son substancialmente idénticas es si dos moléculas
hibridan entre sí en condiciones rigurosas. En general, las
condiciones rigurosas se seleccionan de manera que la temperatura
sea aproximadamente 5ºC-aproximadamente 20ºC menor
que el punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia
específica a unos valores definidos de intensidad iónica y pH. La
T_{m} es la temperatura (a unos valores definidos de intensidad
iónica y pH) a la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una
sonda con la que se acopla perfectamente. Típicamente, son
condiciones de lavado rigurosas aquellas en las que la concentración
de sal es aproximadamente 0,02 molar a pH y la temperatura es de al
menos aproximadamente 50, 55 ó 60ºC.
Las secuencias de nucleótidos para el promotor
constitutivo descrito en la presente invención, así como sus
variantes y fragmentos, son útiles en la manipulación genética de
cualquier planta cuando se montan dentro de una construcción de ADN
de tal forma que la secuencia promotora esté unida operativamente
con una secuencia de nucleótidos heteróloga cuya expresión
constitutiva se va a controlar para conseguir una respuesta
fenotípica deseada. Por "unida operativamente" se entiende que
la transcripción o traducción de la secuencia de nucleótidos
heteróloga está bajo la influencia de la secuencia promotora. De
esta manera, las secuencias de nucleótidos para los promotores de la
invención se proporcionan en cassettes de expresión junto con
secuencias de nucleótidos heterólogas para la expresión en la planta
de interés. Se reconoce que la secuencia promotora de la invención
también puede usarse con la secuencia codificante nativa para
aumentar o reducir la expresión de la secuencia codificante nativa,
dando como resultado de esta manera un cambio en el fenotipo de la
planta transformada.
Tales cassettes de expresión comprenderán una
región de inicio de la transcripción que comprende la secuencia de
nucleótidos promotora de la presente invención, o variantes o
fragmentos de la misma, unida operativamente a la secuencia de
nucleótidos heteróloga cuya expresión se va a controlar por medio
del promotor constitutivo descrito en este documento. Tal cassette
de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de
restricción para la inserción de la secuencia de nucleótidos bajo la
acción reguladora de la transcripción de las regiones reguladoras.
El cassette de expresión también puede contener genes marcadores
selectivos.
Para aumentar los niveles de transcripción,
pueden utilizarse potenciadores en combinación con las regiones
promotoras de la invención. Los potenciadores son secuencias de
nucleótidos que actúan aumentando la expresión de una región
promotora. Los potenciadores se conocen en la técnica e incluyen la
región potenciadora de SV40, el elemento potenciador 35S y
similares.
El cassette transcripcional incluirá en la
dirección 5' a 3' de la transcripción, una región de inicio de la
transcripción y la traducción, una secuencia de nucleótidos
heteróloga de interés, y una región de terminación de la
transcripción y la traducción funcional en plantas. La región de
terminación puede ser nativa con la región de inicio de la
transcripción que comprende una de las secuencias de nucleótidos
promotoras de la presente invención, puede ser nativa con la
secuencia de ADN de interés, o puede proceder de otra fuente. A
partir del plásmido Ti de A. tumefaciens se pueden adquirir
regiones de terminación convenientes, tales como las regiones de
terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Véase
también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet.
262:141-144; Proudfoot (1991) Cell
64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes
Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990)
Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al.
(1990) Gene 91:151-158; Ballas et al.
(1989) Nuc. Acids. Res. 17;7891-7903; Joshi
et al. (1987) Nuc. Acid. Res.
15:9627-9639.
El cassette de expresión que comprende la
secuencia promotora de la presente invención unida operativamente a
una secuencia de nucleótidos heteróloga también puede contener al
menos una secuencia de nucleótidos adicional para introducir un gen
por cotransformación en el organismo. Como alternativa, la secuencia
o secuencias adicionales pueden proporcionarse en otro cassette de
expresión.
Cuando sea apropiado, la secuencia de nucleótidos
heteróloga cuya expresión está bajo el control de la secuencia
promotora de la presente invención y cualquier secuencia de
nucleótidos adicional puede optimizarse para aumentar la expresión
en la planta transformada. Es decir, estas secuencias de nucleótidos
pueden sintetizarse usando codones preferidos en plantas para
conseguir una mejor expresión. En la técnica están disponibles
métodos para sintetizar secuencias de nucleótidos preferidas en
plantas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº
5.380.831 y 5.436.391, y Murray et al. (1989) Nuc. Acids.
Res. 17:477-498.
Se sabe que otras modificaciones de secuencia
adicionales mejoran la expresión génica en un hospedador celular.
Éstas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de
poliadenilación falsas, señales de sitios de ayuste de
exón-intrón, repeticiones de tipo transposón, y
otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales
para la expresión génica. El contenido de G-C de la
secuencia de nucleótidos heteróloga puede ajustarse a niveles medios
para un hospedador celular dado, como se calcula por referencia a
genes conocidos expresados en la célula hospedadora. Cuando sea
posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm
secundarias de horquilla previstas.
Los cassettes de expresión pueden contener
adicionalmente secuencias líder 5' en la construcción del cassette
de expresión. Tales secuencias líder pueden actuar para mejorar la
traducción. En la técnica se conocen líderes de la traducción e
incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, el líder de EMCV
(región 5' no codificante de encefalomiocarditis)
(Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat.
Acad. Sci. Estados Unidos 86:6126-6130);
líderes de potyvirus, por ejemplo, líder de TEV (Virus del Grabado
del Tabaco) (Allison et al. (1986)); líder de MDMV (Virus del
Mosaico Enanizante del Maíz) (Virology
154:9-20); proteína de unión a la cadena pesada de
inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak y Sarnow (1991) Nature
353:90-94); líder no traducido del ARNm de la
proteína de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA
4) (Jobling y Gehrke (1987) Nature
325:622-625); líder del virus del mosaico del tabaco
(TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA,
páginas 237-256); y líder del virus de las manchas
cloróticas del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991)
Virology 81:382-385). Véase también
Della-Cioppa et al. (1987) Plant
Physiology 84:965-968. También pueden utilizarse
otros métodos conocidos para aumentar la traducción y/o la
estabilidad del ARNm, por ejemplo, intrones y similares.
En los casos en los que es deseable que el
producto expresado constitutivamente de la secuencia de nucleótidos
heteróloga se dirija a un orgánulo particular tal como el
cloroplasto o la mitocondria, o se secrete en la superficie celular
o extracelularmente, el cassette de expresión puede contener además
una secuencia codificante para un péptido de tránsito. Tales
péptidos de tránsito son bien conocidos en la técnica e incluyen,
pero sin limitación, el péptido de tránsito para la proteína de
transporte de acilo, la subunidad pequeña de RUBISCO, la EPSP
sintasa vegetal y similares.
En la preparación del cassette de expresión, los
diversos fragmentos de ADN pueden manipularse para proporcionar las
secuencias de ADN en la orientación apropiada y, cuando sea
apropiado, en la fase de lectura apropiada. Para este fin, pueden
emplearse adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN
o pueden estar implicadas otras manipulaciones para proporcionar
sitios de restricción convenientes, la eliminación del ADN
superfluo, la eliminación de sitios de restricción, o similares.
Para este fin pueden estar implicadas técnicas tales como
mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción,
templado, resubstituciones, por ejemplo, transiciones y
transversiones.
El cassette de expresión que comprende la
secuencia promotora particular de la presente invención unida
operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés
puede usarse para transformar cualquier planta. De esta manera,
pueden obtenerse plantas, células vegetales, tejidos vegetales,
semillas y similares, modificados genéticamente. Los protocolos de
transformación pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula
vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, a la que se
dirige la transformación. Los métodos adecuados de transformación de
células vegetales incluyen microinyección (Crossway, et al.
(1986) Biotechniques 4:320-334),
electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad.
Sci. Estados Unidos 83:5602-5606),
transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee et
al. (1988) Biotechnology 6:915-921),
transferencia génica directa (Paszkowski et al. (1984)
EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración de
partículas balísticas (véase, por ejemplo, Sanford et al.
Patente de Estados Unidos 4.945.050; Tomes et al. (1995) en
Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. Fundamental Methods,
ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y
McCabe et al. (1988) Biotechnology
6:923-926). Véase también Weissinger et al.
(1988) Annual Rev. Genet. 22:421-477; Sanford
et al. (1987) Particulate Science and Technology
5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988)
Plant. Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe
et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926
(soja); Datta et al. (1990) Biotechnology
8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988)
Biotechnology 6:559-563 (maíz); Klein et
al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444
(maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology
8:833-839; Hooydaas-Van Slogteren y
Hooykaas (1984) Nature (Londres)
311:763-764; Bytebier et al. (1987) Proc.
Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84:5345-5349
(Liliaceae); De Wet et al. (1985) en The Experimental
Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman et al.
(Longman, Nueva York), páginas 197-209 (polen);
Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports
9:415-418; y Kaeppler et al. (1992) Theor.
Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada
por fibras); D'Halluin et al.(1992) Plant Cell
4:1495-1505 (electroporación); Li et al.
(1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y
Christou y Ford (1995) Annals of Botany
75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996)
Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz a
través de Agrobacterium tumefaciens).
Las células que se han transformado pueden
dejarse crecer hasta convertirse en plantas de acuerdo con formas
convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986)
Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas
después pueden desarrollarse y polinizarse con la misma cepa
transformada o con cepas diferentes, teniendo el híbrido resultante
la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada
identificada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar
que la expresión constitutiva de la característica fenotípica
deseada se mantiene y se hereda de manera estable y después se
recogen las semillas para asegurar que se ha conseguido la expresión
constitutiva de la característica fenotípica deseada.
La secuencia de nucleótidos del promotor y los
métodos descritos en este documento son útiles para regular la
expresión constitutiva de cualquier secuencia de nucleótidos
heteróloga en una planta hospedadora para variar el fenotipo de la
planta. Son de interés diversos cambios fenotípicos, incluyendo la
modificación de la composición de ácidos grasos de una planta, la
alteración del contenido de aminoácidos de una planta, la alteración
del mecanismo de defensa frente a patógenos de una planta, y
similares. Estos resultados pueden conseguirse proporcionando la
expresión de productos heterólogos o aumentando la expresión de
productos endógenos en plantas. Como alternativa, los resultados
pueden conseguirse proporcionando una reducción de la expresión de
uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o
co-factores, en la planta. Estos cambios dan como
resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada.
Los genes de interés reflejan intereses
comerciales e intereses implicados en el desarrollo de cultivos. Los
cultivos y los mercados de interés cambian, y según se van abriendo
a nuevos mercados mundiales las naciones en desarrollo, también
surgen nuevos cultivos y tecnologías. Además, según vaya aumentando
nuestra compresión de rasgos y características agrícolas tales como
el rendimiento y la heterosis, cambiará la elección de genes para la
transformación de acuerdo con esto. Las categorías generales de los
genes de interés incluyen, por ejemplo, los genes implicados en
información, tales como dedos de cinc, los implicados en
comunicación, tales como quinasas, y los implicados en gestión
interna tales como proteínas de choque térmico. Ciertas categorías
más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que
codifican rasgos importantes para características agrícolas,
resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a
herbicidas, esterilidad, características del grano, y productos
comerciales. Los genes de interés incluyen, en general, los
implicados en el metabolismo de aceite, almidón, carbohidratos o
nutrientes, así como los que afectan al tamaño del grano, la carga
de sacarosa y similares.
Ciertos rasgos importantes desde el punto de
vista agrícola tales como el contenido de aceite, almidón y
proteínas pueden alterarse genéticamente de manera adicional usando
métodos de cultivo tradicionales. Las modificaciones incluyen el
aumento del contenido de ácido oleico, aceites saturados e
insaturados, el aumento de los niveles de lisina y azufre, la
disposición de aminoácidos esenciales, y también la modificación del
almidón. En las solicitudes de Patente de Estados Unidos con Nº de
Serie 08/838.763, presentada el 10 de abril de 1997, de la que
procede el documento WO 94/16078, publicado el 21 de julio de 1994;
08/824.379, presentada el 26 de marzo de 1997, de la que procede el
documento WO 96/38562 publicado el 5 de diciembre de 1996;
08/824.382 presentada el 26 de marzo de 1997 de la que procede el
documento WO 96/38563 publicado el 5 de diciembre de 1996; y en la
Patente de Estados Unidos Nº 5.703.409, se describen modificaciones
de la proteína hordotionina. Otro ejemplo es la proteína de semillas
rica en lisina y/o azufre codificada por albúmina 2S de soja
descrita en el documento de Estados Unidos con el Nº de Serie
08/618.911, presentado el 20 de marzo de 1996, del que procede el
documento WO 97/35023 publicado el 25 de septiembre de 1997, y el
inhibidor de quimiotripsina de cebada, Williamson et al.
(1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyas
descripciones se incorporan en este documento como referencia.
Pueden obtenerse derivados de la secuencia
codificante por mutagénesis de localización dirigida para aumentar
el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido
codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido de alto
contenido de lisina de cebada (BHL) procede del inhibidor de
quimiotripsina de cebada, documento PCT/US97/20441, presentado el 31
de octubre de 1997, que se incorpora en este documento como
referencia. Otras proteínas incluyen proteínas vegetales ricas en
metionina tales como las procedentes de semillas de girasol (Lilley
et al. (1989) Proceedings of the World Congress on
Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs,
ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign,
Illinois), pág. 497-502; incorporado en este
documento como referencia)); maíz (Pedersen et al. (1986)
J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988)
Gene 71:359; incorporándose ambos en este documento como
referencia); y arroz (Musumura et al. (1989) Plant. Mol.
Biol. 12:123). Otros genes importantes desde el punto de vista
agrícola codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento,
factores de almacenamiento en semillas, y factores de
transcripción.
Los genes de resistencia a insectos pueden
codificar resistencia a plagas que dejan un gran rastro de
rendimiento, tales como el gusano de las raíces, el gusano cortador,
el perforador del maíz europeo y similares. Tales genes incluyen,
por ejemplo, genes de proteínas tóxicas de Bacillus
thuringiensis (Patentes de Estados Unidos Nº 5.366.892;
5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; Geiser et al.
(1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme et al. (1994)
Plant Mol. Biol. 24:825) y similares.
Los genes que codifican rasgos de resistencia a
enfermedades incluyen genes de destoxificación, tales como contra
fumonosina (Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de
Serie 08/484.815, presentada el 7 de junio de 1995, de la que
procede el documento WO 96/06175 publicado el 29 de febrero de
1996); genes de avirulencia (avr) y de resistencia a enfermedades
(R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et
al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al.
(1994) Cell 78:1089); y similares.
Los rasgos de resistencia a herbicidas pueden
incluir genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan
inhibiendo la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular
los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de la
acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a
tal resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que
codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción
de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por
ejemplo, el gen bar) u otros genes similares conocidos en la
técnica. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta,
el gen nptII codifica resistencia a los antibióticos
kanamicina y geneticina, y el gen ALS codifica resistencia al
herbicida clorsulfuron.
También pueden codificarse genes de esterilidad
en un cassette de expresión y proporcionar una alternativa a la
despendonación física. Los ejemplos de genes usados de tales maneras
incluyen genes preferidos en tejidos masculinos y genes con
fenotipos de esterilidad masculina tales como QM, descritos en la
Patente de Estados Unidos Nº 5.583.210. Otros genes incluyen
quinasas y los que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo
gametofítico masculino o femenino.
La calidad del grano se refleja en rasgos tales
como niveles y tipos de aceites, saturados e insaturados, calidad y
cantidad de aminoácidos esenciales, y niveles de celulosa. En el
maíz, las proteínas de hordotionina modificadas descritas en las
Solicitudes de Patente de Estados Unidos con Nº de Serie 08/838.763
presentada el 10 de abril de 1997 de la que procede el documento WO
94/10678 publicado el 21 de julio de 1994; 08/824.379 presentada el
26 de marzo de 1997 de la que procede el documento WO 96/38562
publicado el 5 de diciembre de 1996; 08/824.382 presentada el 26 de
marzo de 1997 de la que procede el documento WO 96/38563 publicada
el 5 de diciembre de 1996; y en la Patente de Estados Unidos Nº
5.703.409 expedida el 30 de diciembre de 1997, proporcionan
descripciones de modificaciones de proteínas para fines
deseados.
Los rasgos comerciales también pueden codificarse
en un gen o genes que puedan aumentar, por ejemplo, almidón para la
producción de etanol, o proporcionar la expresión de proteínas. Otro
uso comercial importante de plantas transformadas es la producción
de polímeros y bioplásticos tales como los descritos en la Patente
de Estados Unidos Nº 5.602.321 expedida el 11 de febrero de 1997.
Genes tales como B-cetotiolasa, PHBasa
(polihidroxibutirato sintasa) y acetoacetil-CoA
reductasa (véase Schubert et al. (1988) J. Bacteriol.
170:5837-5847) facilitan la expresión de
polihidroxialcanoatos (PHA).
Los productos exógenos incluyen enzimas y
productos vegetales así como los procedentes de otras fuentes
incluyendo procariotas y otros eucariotas. Tales productos incluyen
enzimas, co-factores, hormonas y similares. Puede
aumentarse el nivel de proteínas, particularmente proteínas
modificadas que tienen una mejor distribución de aminoácidos para
mejorar el valor nutriente de la planta. Esto se consigue por medio
de la expresión de proteínas que tienen un mayor contenido de
aminoácidos.
De esta manera, la secuencia de nucleótidos
heteróloga unida operativamente al promotor constitutivo descrito en
este documento puede ser un gen estructural que codifica una
proteína de interés. Los ejemplos de tales genes heterólogos
incluyen, pero sin limitación, genes que codifican proteínas que
confieren resistencia a condiciones de estrés abiótico, tales como
sequía, temperatura, salinidad y toxinas tales como pesticidas y
herbicidas, o a condiciones de estrés biótico, tal como el ataque
por hongos, virus, bacterias, insectos y nematodos, y el desarrollo
de enfermedades asociadas con estos organismos.
Como alternativa, la secuencia de nucleótidos
heteróloga unida operativamente al promotor constitutivo descrito en
este documento puede ser una secuencia antisentido para un gen
diana. Por "secuencia de nucleótidos de ADN antisentido" se
entiende una secuencia que está en orientación inversa a la
orientación normal 5' a 3' de esa secuencia de nucleótidos. Cuando
se suministra dentro de una célula vegetal, la expresión de la
secuencia de ADN antisentido previene la expresión normal de la
secuencia de nucleótidos de ADN para el gen diana. La secuencia de
nucleótidos antisentido codifica un transcrito de ARN que es
complementario y capaz de hibridar con el ARN mensajero (ARNm)
endógeno producido por la transcripción de la secuencia de
nucleótidos de ADN para el gen diana. En este caso, la producción de
la proteína nativa codificada por el gen diana se inhibe para
conseguir una respuesta fenotípica deseada. De esta manera, las
secuencias promotoras descritas en este documento pueden unirse
operativamente a secuencias de ADN antisentido para reducir o
inhibir la expresión de una proteína nativa en la planta.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Se aisló la región promotora para el gen de maíz
que codificaba la histona H2B a partir de plantas de maíz y se
clonó. Este gen se seleccionó como una fuente de un promotor
constitutivo basándose en la expresión espacial y del desarrollo de
su producto génico. El método para su aislamiento se describe a
continuación.
Las histonas se clasifican basándose en su papel
en la estructura de la cromatina. La histona H2B es una de cuatro
histonas que contribuyen al núcleo del nucleosoma. De las histonas
nucleares H2A, H2B, H3 y H4, la H2B es la menos conservada entre
especies. En el maíz existe en forma de múltiples variantes
codificadas por una familia multigénica grande. Las histonas H2B de
maíz se expresan constitutivamente a un alto nivel en tejidos
meristemáticos a lo largo de toda la planta. La nueva secuencia
promotora para el gen de maíz que codifica una de estas histonas H2B
se indica en la SEC ID Nº:1.
El procedimiento para el aislamiento del promotor
se describe en Manual de Usuario para el kit Genome Walker vendido
por Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California. Se extrajo
ADN genómico de la línea de maíz A63 triturando hojas de plántulas
de 10 días de edad en nitrógeno líquido, y el ADN se preparó como se
describe por Chen y Dellaporta (1994) en The Maize Handbook,
ed. Freeling y Walbot (Springer-Verlag, Berlín). Se
añadió RNasa A a 10 \mug/ml y después se incubo a 37ºC durante 1
hora. El ADN después se extrajo con una vez con
fenol-cloroformo y después con cloroformo, después
se precipitó con etanol y se resuspendió en TE (Tris 10 mM pH 8,0,
EDTA 1 mM). El ADN después se usó exactamente como se describe en el
Manual de Usuario de Genome Walker (Clontech
PT3042-1 versión PR68687). En resumen, el ADN se
digirió por separado con los enzimas de restricción DraI, EcoRV,
PvuII, ScaI y StuI, todos ellos cortadores de extremos romos.
Después se unieron adaptadores Genome Walker a los extremos del ADN
sometido a restricción. El ADN resultante se denomina
DL1-DL5, respectivamente.
Para el aislamiento de regiones promotoras
específicas, se diseñaron dos cebadores específicos de genes no
solapantes (normalmente con una longitud de 27 pb) a partir de las
secuencias de abundantes EST en la base de datos Pioneer/HGS. Los
cebadores se diseñaron para amplificar la región cadena arriba de la
secuencia codificante, es decir, la región 5' no traducida y la
región promotora del gen elegido. A continuación se proporcionan las
secuencias de los cebadores. La primera vuelta de PCR se realizó en
cada muestra de ADN (DL1-5) con el cebador de
Clontech AP1 (secuencia
5'-gtaatacgactcactatagggc-3'; SEC ID
Nº:2) y el cebador específico de gen (gsp)1 con la siguiente
secuencia:
secuencia de la histona H2B gsp1:
5'-cgcgggctcctcctccgccggcttctt-3'
(SEC ID Nº:3).
La PCR se realizó en un aparato de ciclos
térmicos modelo PTC-100 con HotBonnet de MJ Research
(Watertown, Massachusetts) usando reactivos suministrados con el kit
Genome Walker. Se usaron los siguientes parámetros de ciclo: 7
ciclos de 94ºC durante 2 segundos, después 72ºC durante 3 minutos,
seguido de 32 ciclos de 94ºC durante 2 segundos y 67ºC durante 3
minutos. Finalmente, las muestras se mantuvieron a 67ºC durante 4
minutos y después a 4ºC hasta el análisis adicional.
Como se describe en el Manual de Usuario, el ADN
de la primera vuelta de PCR después se diluyó y se usó como
plantilla en una segunda vuelta de PCR usando el cebador Clontech
AP2 (secuencia
5'-actatagggcacgcgtggt-3'; SEC ID
Nº: 4) y el cebador específico de gen (gsp)2 con la
siguiente secuencia:
secuencia de histona H2B gsp2:
5'gggcttcttctcggccttgggcgccat-3' (SEC ID Nº: 5).
Los parámetros de ciclo para la segunda vuelta
fueron: 5 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, después 72ºC durante 3
minutos, seguido de 20 ciclos de 94ºC durante 2 segundos y 67ºC
durante 3 minutos. Finalmente, las muestras se mantuvieron a 67ºC
durante 4 minutos y después se mantuvieron a 4ºC. Aproximadamente 10
\mul de cada reacción se procesaron en un gel de agarosa al 0,8% y
se escindieron bandas (normalmente de 500 pb o mayores), se
purificaron con el kit Sephaglas BandPrep (Pharmacia, Piscataway,
New Jersey) y se clonaron en el vector pCR2.1 de TA (Invitrogen, San
Diego, California). Los clones se secuenciaron para la verificación
y después el ADN mini-prep se diluyó 1:30 en agua y
1 \mul se amplificó con el cebador específico de gen (gsp)3
(secuencias mostradas más adelante) y el cebador AP2 de Clontech con
los siguientes parámetros de ciclo: cinco ciclos de 94ºC durante 2
segundos, 46ºC durante 30 segundos, 72ºC durante ? minutos, seguido
de 20 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, después 67ºC durante 3
minutos y después 67ºC durante 4 minutos, y mantenido a 4ºC.
secuencia de histona H2B gsp3:
5'-gaccatggtgtcgtgtggatccgatgcggctgct-3'
(SEC ID Nº: 6).
Diez \mul del ADN amplificado resultante se
procesaron en un gel de agarosa al 0,8%, se purificaron con
Sephaglas y se clonaron en el vector de TA PCR2.1. Las secuencias
finales se determinaron en los plásmidos resultantes.
Se usó un ensayo de expresión génica transitoria
para ensayar los ADN clonados con respecto a la actividad promotora.
Los promotores se reclonaron en el plásmido PHP3953 (figura 1)
digerido con BglII y SphI o con BglII y PvuII para retirar el
promotor de ubiquitina. Los nuevos fragmentos promotores se
insertaron en lugar del promotor de ubiquitina de forma que la
región 5' no traducida de la ubiquitina y el intrón estuvieran entre
el promotor de ensayo y el gen indicador GUS.
Se realizaron experimentos con embriones
inmaduros, esencialmente en la superficie del escutelo. Se aislaron
embriones de maíz GS3 inmaduros a partir de las espigas
9-11 días después de la polinización usando un
escalpelo. Antes del aislamiento de los embriones, las espigas
polinizadas se esterilizaron superficialmente con un microdetergente
y una mezcla de blanqueador comercial al 25%, y después se lavaron
con 3 cambios de H_{2}O estéril. Los embriones inmaduros aislados
(1,4-1,7 mm) se pusieron en medio de bombardeo y se
alinearon en una rejilla diana en la preparación para el
bombardeo.
Los embriones inmaduros después se transformaron
por el método biolístico de partículas de tungsteno (Tomes et
al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture:
Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips
(Springer-Verlag, Berlin); Koziel et al.
(1993) Bio/Technology 11:194-200) usando un
sistema de liberación de partículas de alta presión (Biolistic
Particle Delivery System Model PDS-100 por DuPont).
En los embriones inmaduros de maíz se bombardeó ADN plasmídico que
comprendía una secuencia promotora de la invención unida
operativamente al gen GUS. Después del cultivo durante 40 horas, los
embriones bombardeados se tiñeron con solución de tinción
X-Gluc (McCabe et al. (1988)
Bio/Technology 6(87):923-926) durante
12 horas a 37ºC en la oscuridad. Después se midió la actividad GUS,
usando el promotor de ubiquitina como control, contando las manchas
azules después de la tinción con respecto a la actividad GUS como se
describe en otras partes de este documento (véase Jefferson (1987)
Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405). En la tabla
1 se muestran los datos de expresión transitoria.
| Gen | Nº de manchas azules | Promedio |
| Ubiquitina (control) | 395, 155, 307, 416 | 318 |
| histona H2b | 2127, 2826, 2830 | 2594 |
La actividad promotora de la secuencia promotora
para los genes de la histona H2B fue significativamente más fuerte
que la del promotor de ubiquitina, indicando que es como un promotor
constitutivo fuerte.
Se bombardearon embriones de maíz inmaduros GS3
con un plásmido que contenía la secuencia promotora unida
operativamente al gen GUS más un plásmido que contenía el gen
marcador selectivo PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene
70:25-37) que confiere resistencia al herbicida
Bialaphos. La transformación se realizó como se describe en el
ejemplo 1. Véanse en el apéndice los ejemplos de bombardeo (560Y),
selección (560R), regeneración en medio que contiene hormonas (288J)
y medio sin hormonas (272V).
Un día después del bombardeo, los embriones se
transfirieron desde el medio de bombardeo a un medio de selección
que contenía 3 mg/litro de Bialaphos y se subcultivaron en medio de
selección cada dos semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de
selección, los clones de callos resistentes a la selección se
transfirieron a medio que contenía hormonas para iniciar la
regeneración de las plantas. Después de la maduración somática de
los embriones (2-4 semanas), los embriones somáticos
bien desarrollados se transfirieron a un medio para la germinación y
se transfirieron a la sala de cultivo iluminada. Aproximadamente
7-10 días después, las plántulas en desarrollo se
transfirieron a un medio sin hormonas en tubos durante
7-10 días hasta que las plántulas estuvieron bien
establecidas. Las plantas después se transfirieron a insertos en
bandejas (equivalentes a macetas de 2,5 pulgadas (6,35 cm)) que
contenían substrato para macetas y se dejaron crecer durante 1
semana en una cámara de crecimiento, posteriormente se dejaron
crecer 1-2 semanas más en el invernadero y después
se transfirieron a 600 macetas clásicas (1,6 galones (7,27 litros))
y se cultivaron hasta que fueron maduras.
La actividad promotora en los tejidos vegetales
transformados se evaluó midiendo la expresión de GUS. Se pusieron
muestras de tejidos vegetales en los pocillos de grupos de cultivo
de células de 12 pocillos y se tiñeron con solución de tinción
X-Gluc durante 12 horas a 37ºC en la oscuridad.
Después se puntuó la tinción GUS en las muestras. La puntuación de
la tinción GUS variaba de 0 (negativa) a 6 (máxima). Estas
puntuaciones de tinción sirvieron como una medición del nivel de
expresión de GUS. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Para el promotor de H2B se han evaluado seis
sucesos de transformación. En general, cinco de seis sucesos dieron
una puntuación correspondiente a una expresión de GUS fuerte en
plantas de maíz, y un suceso dio una puntuación correspondiente a
una expresión media. La expresión de GUS fue particularmente fuerte
en hoja, raíz y espiga macho, teniendo estos tejidos puntuaciones de
tinción GUS de 5-6 en todos los sucesos. La
expresión de GUS en la cáscara y en el estigma fue ligeramente
menor, teniendo estos dos tejidos principalmente puntuaciones de
tinción de 4-5. Se realizó una tinción de GUS con
granos con el suceso TC7394 y tuvo una puntuación correspondiente a
una expresión fuerte. En general, H2B es un promotor fuerte en
embriones de maíz, callo y en diferentes tejidos.
Como control se usó el promotor de ubiquitina. Se
han evaluado cinco sucesos de transformación. En general, dos
sucesos dieron una puntuación correspondiente a una expresión de GUS
fuerte y tres dieron una puntuación correspondiente a una expresión
débil. Se encontró expresión de GUS en todos los tejidos vegetales,
incluyendo hoja, raíz, cáscara, estigma y espiga masculina. Al
presentar esos sucesos de transformación una expresión fuerte, GUS
se expresó en todos los tejidos diferentes, teniendo principalmente
los tejidos puntuaciones de tinción de 4-5. Con los
sucesos de transformación que mostraron una expresión débil, GUS se
expresó en hoja, raíz y espiga masculina, teniendo esos tejidos
principalmente puntuaciones de tinción de 1-3. Había
muy poca expresión de GUS en tejidos de cáscara y estigma en los
sucesos de transformación que presentaban una expresión débil.
| Promotores | Suceso | Expresión de GUS | PCR de GUS |
| H2B | TC4703 | fuerte | na |
| TC4701 | fuerte | na | |
| TC4694 | fuerte | na | |
| TC7392 | mediana | positiva | |
| TC7394 | fuerte | positiva | |
| TC7396 | fuerte | positiva | |
| ubi | TC7390 | fuerte | positiva |
| TC7386 | fuerte | positiva | |
| TC7387 | débil | positiva | |
| TC7388 | débil | positiva | |
| TC7389 | débil | positiva |
APÉNDICE
272
V
| Ingrediente | Cantidad | Unidad |
| D-I H_{2}O | 950,000 | ml |
| Sales MS (GIBCO 11117-074) | 4,300 | g |
| Myo-Inositol | 0,100 | g |
| Solución madre de vitaminas MS \alm{2} | 5,000 | ml |
| Sacarosa | 40,000 | g |
| Bacto-Agar @ | 6,000 | g |
| Indicaciones: | ||
| @ = Añadir después de enrasar | ||
| Disolver los ingredientes en D-I H_{2}O purificada en secuencia | ||
| Ajustar a pH 5,6 | ||
| Enrasar con D-I H_{2}O purificada después de ajustar el pH | ||
| Esterilizar y enfriar a 60ºC. | ||
| \begin{minipage}[t]{150mm} \alm{2} = Disolver 0,100 g de ácido nicotínico; 0,020 g de tiamina.HCl; 0,100 g de piridoxina.HCl; y 0,400 g de glicina en 875,00 ml de D-I H_{2}O purificada en secuencia.\end{minipage} | ||
| \begin{minipage}[t]{150mm} Enrasar con D-I H_{2}O purificada. Dividir en porciones de 400 ml. La tiamina.HCl y la piridoxina.HCl están en un desecador oscuro. Almacenar durante un mes, a menos que se produzca contaminación o precipitación y después preparar la solución madre fresca.\end{minipage} | ||
| Volumen total (L) = 1,00 |
288
J
| Ingrediente | Cantidad | Unidad |
| D-I H_{2}O | 950,000 | ml |
| Sales MS | 4,300 | g |
| Myo-Inositol | 0,100 | g |
(Continuación)
| Ingrediente | Cantidad | Unidad |
| Solución madre de vitaminas MS \alm{2} | 5,000 | ml |
| Zeatina 0,5 mg/ml | 1,000 | ml |
| Sacarosa | 60,000 | g |
| Gelrite @ | 3,000 | g |
| Ácido indolacético 0,5 mg/ml # | 2,000 | ml |
| Ácido Abscísico 0,1 mM | 1,000 | ml |
| Bialaphos 1 mg/ml # | 3,000 | ml |
| Indicaciones: | ||
| @ = Añadir después de enrasar | ||
| Disolver los ingredientes en D-I H_{2}O purificada en secuencia | ||
| Ajustar a pH 5,6 | ||
| Enrasar con D-I H_{2}O purificada después de ajustar el pH | ||
| Esterilizar y enfriar a 60ºC. | ||
| Añadir 3,5 g/l de Gelrite para la biología celular. | ||
| \begin{minipage}[t]{150mm} \alm{2} = Disolver 0,100 g de ácido nicotínico; 0,020 g de tiamina.HCl; 0,100 g de piridoxina.HCl; y 0,400 g de glicina en 875,00 ml de D-I H_{2}O purificada en secuencia.\end{minipage} | ||
| \begin{minipage}[t]{150mm} Enrasar con D-I H_{2}O purificada. Dividir en porciones de 400 ml. La tiamina.HCl y la piridoxina.HCl están en un desecador oscuro. Almacenar durante un mes, a menos que se produzca contaminación o precipitación y después preparar la solución madre fresca.\end{minipage} | ||
| Volumen total (L) = 1,00. |
560
R
| Ingrediente | Cantidad | Unidad |
| Agua D-I, filtrada | 950,000 | ml |
| Sales Basales CHU (N6) (SIGMA C-1416) | 4,000 | g |
| Mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511 | 1,000 | ml |
| Tiamina.HCl 0,4 mg/ml | 1,250 | ml |
| Sacarosa | 30,000 | g |
| 2,4-D 0,5 mg/ml | 4,000 | ml |
| Gelrite @ | 3,000 | g |
| Nitrato de plata 2 mg/ml # | 0,425 | ml |
| Bialaphos 1 mg/ml # | 3,000 | ml |
| Indicaciones: | ||
| @ = Añadir después de enrasar | ||
| # = Añadir después de esterilizar y enfriar a temperatura | ||
| Disolver los ingredientes en D-I H_{2}O en secuencia | ||
| Ajustar a pH 5,8 con KOH | ||
| Enrasar con D-I H_{2}O | ||
| Esterilizar y enfriar a temperatura ambiente. | ||
| Volumen total (l) = 1,00 |
560
Y
| Ingrediente | Cantidad | Unidad |
| Agua D-I, filtrada | 950,000 | ml |
| Sales Basales CHU (N6) (SIGMA C-1416) | 4,000 | g |
| Mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511 | 1,000 | ml |
| Tiamina.HCl 0,4 mg/ml | 1,250 | ml |
| Sacarosa | 120,000 | g |
| 2,4-D 0,5 mg/ml | 2,000 | ml |
| L-Prolina | 2,880 | g |
| Gelrite @ | 2,000 | g |
| Nitrato de plata 2 mg/ml # | 4,250 | ml |
| Indicaciones: | ||
| @ = Añadir después de enrasar | ||
| # = Añadir después de esterilizar y enfriar a temperatura | ||
| Disolver los ingredientes en D-I H_{2}O en secuencia | ||
| Ajustar a pH 5,8 con KOH | ||
| Enrasar con D-I H_{2}O | ||
| Esterilizar y enfriar a temperatura ambiente. | ||
| ** Esterilizar en autoclave menos tiempo debido a la mayor cantidad de sacarosa ** | ||
| Volumen total (l) =1,00 |
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
mencionadas en la memoria descriptiva indican el nivel de los
especialistas en la técnica a los que se refiere esta invención.
Aunque la invención anterior se ha descrito con
cierto detalle de forma ilustrativa y con ejemplos para facilitar su
comprensión, será evidente que pueden ponerse en práctica ciertos
cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
<110> PIONEER HI-BRED
INTERNATIONAL, INC.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Promotores de Maíz Constitutivo
\vskip0.400000\baselineskip
<130> N80441
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
1999-02-25
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 99909638.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/076, 075
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-02-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaatacgac tcactatagg gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de PCR específico de gen de maíz
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgggctcc tcctccgccg gcttctt
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de PCR específico de gen de maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactatagggc acgcgtggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcttcttc tcggccttgg gcgccat
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de PCR específico de gen de maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatggtg tcgtgtggat ccgatgcggc tgct
\hfill34
Claims (13)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
tiene una secuencia de nucleótidos para un promotor que es capaz de
iniciar la transcripción en una célula vegetal, donde dicha
secuencia de nucleótidos se selecciona entre:
a) una secuencia de nucleótidos que comprende la
secuencia indicada en la SEC ID Nº: 1;
b) una secuencia de nucleótidos depositada como
Nº de Acceso de la ATCC 207123;
c) una secuencia de nucleótidos que comprende al
menos 40 nucleótidos contiguos de la secuencia indicada en la SEC ID
Nº: 1;
d) una secuencia de nucleótidos que hibrida en
condiciones rigurosas con una secuencia de a), b) o c);
e) una secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad de secuencia de al menos un 70% con una secuencia indicada
en a) o b).
2. Una construcción de ADN que comprende una
secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 unida operativamente
a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.
3. Un vector que comprende la construcción de ADN
de la reivindicación 2.
4. Una célula hospedadora que tiene incorporado
de manera estable en su genoma la construcción de ADN de la
reivindicación 2.
5. Un método para expresar constitutivamente una
secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta, comprendiendo
dicho método transformar una célula vegetal con una construcción de
ADN como se define en la reivindicación 2.
6. Un método de la reivindicación 5, donde dicha
planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.
7. El método de la reivindicación 6, donde dicha
monocotiledónea es maíz.
8. Una célula vegetal transformada de manera
estable con una construcción de ADN como se define en la
reivindicación 2.
9. Una planta transformada de manera estable con
una construcción de ADN como se define en la reivindicación 2.
10. Una célula vegetal de la reivindicación 8
donde dicha célula vegetal procede de una monocotiledónea o de una
dicotiledónea.
11. Una planta de la reivindicación 9, donde
dicha planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.
12. Una célula vegetal de la reivindicación 10, o
una planta de la reivindicación 11, donde dicha monocotiledónea es
maíz.
13. Semilla de la planta de la reivindicación 9,
11 ó 12 que comprende una construcción de ADN de la reivindicación
2.
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