ES2271449T3 - Compuestos para inmunoterapia y diagnostico de la tuberculosis. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado: (i) que comprende una secuencia de aminoácidos de Mycobacterium tuberculosis de SEC ID Nº 107; o (ii) que consiste en una porción inmunogénica de la misma.

Description

Compuestos para inmunoterapia y diagnóstico de la tuberculosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la detección, el tratamiento y la prevención de la infección producida por Mycobacterium tuberculosis. La invención se refiere con mayor particularidad a polipéptidos que comprenden un antígeno de Mycobacterium tuberculosis o a una porción u otra variante del mismo y al uso de tales polipéptidos para el diagnóstico y la vacunación contra la infección por Mycobacterium tuberculosis.

Antecedentes de la invención

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica que por lo general es causada por la infección con Mycobacterium tuberculosis. Es una enfermedad más importante en países en desarrollo, como así también un problema creciente en áreas desarrolladas en el mundo, con aproximadamente 8 millones de nuevos casos y 3 millones de muertes cada año. Aunque la infección puede ser asintomática durante un período considerable de tiempo, la enfermedad mayormente se manifiesta como una inflamación aguda de los pulmones, produciendo fiebre y una tos improductiva. Si no se inicia un tratamiento, por lo general se producen serias complicaciones y luego la muerte.

Aunque en general la tuberculosis puede controlarse aplicando un extenso tratamiento de antibióticos, tal tratamiento no es suficiente para prevenir la difusión de la enfermedad. Los individuos infectados pueden no presentar síntomas pero contagiar durante algún tiempo. Además, aunque resulta crítico el cumplimiento con el tratamiento, es difícil monitorear el comportamiento del paciente. Algunos pacientes no completan el curos del tratamiento, lo que puede dar lugar a un tratamiento no efectivo y el desarrollo de resistencia a los fármacos.

Para inhibir la difusión de la enfermedad, se requiere una vacunación efectiva y un diagnóstico exacto y temprano de la enfermedad. En la actualidad, la vacunación con bacterias vivas es el método más eficiente para inducir la inmunidad protectora. La micobacteria más común empleada a este fin es el Bacillus Calmette-Guerin (BCG), una cepa no virulenta de Mycobacterium bovis. De todos modos, la seguridad y eficacia de la BCG representa una fuente de controversia y en algunos países, tales como en los Estados Unidos, no se vacuna al público en general. Usualmente se obtiene el diagnóstico empleando una prueba en piel, que incluye la exposición intradérmica a la tuberculina PPD (derivado de proteína purificada). Las respuestas de las células T antígeno-específicas producen una induración que puede medirse en el sitio de inyección a las 48-72 horas luego de la inyección, lo que indica la exposición a antígenos micobacterianos. Sin embargo, la sensibilidad y la especificidad continuaron siendo un problema con esta prueba, no pudiendo distinguirse los individuos vacunados con BCG de los individuos infectados.

Aunque se ha demostrado que los macrófagos actúan como los principales efectores de la inmunidad contra M. tuberculosis, las células T son los principales inductores de tal inmunidad. El papel esencial que desempeñan las células T en la protección contra la infección causada por M. tuberculosis es ilustrado por la frecuencia con la que se presenta M. tuberculosis en pacientes con SIDA, debido a la merma de células T CD4 asociada a la infección del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Las células T CD4 reactivas al Mycobacterium demostraron ser potentes productoras de interferón-gamma (IFN-\gamma), el que a su vez, se demostró que desencadena los efectos anti-micobacterianos de macrófagos en ratones. Mientras que el papel desempeñado por el IFN-\gamma en humanos es menos claro, se demostró en estudios que la 1,25-dihidroxi-vitamina D3, ya sea sola o en combinación con IFN-\gamma o el factor-alfa de necrosis tumoral, activa a los macrófagos humanos para inhibir la infección causada por M. tuberculosis. Además, se sabe que el IFN-\gamma estimula a los macrófagos humanos a producir 1,25-dihidroxi-vitamina D3. De modo similar, se demostró que IL-12 interviene en estimular la resistencia a la infección de M. tuberculosis. Para una revisión de la inmunología de la infección causada por M. Tuberculosis, véase Chan y Kaufmann en Tuberculosis: Pathogenesis, Protection y Control, Bloom (ed.), ASM Press, Washington, DC, 1994.

Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de mejores vacunas y de métodos para prevenir, tratar y detectar la tuberculosis. La presente invención satisface estas necesidades y además provee otras ventajas relacionadas.

Síntesis de la invención

Expuesto en forma resumida, esta invención provee compuestos y su uso para prevenir y diagnosticar tuberculosis. En un aspecto, se proveen polipéptidos que comprenden un antígeno soluble de M. tuberculosis o consisten en una porción inmunogénica del mismo.

En un aspecto relacionado, el polipéptido comprende un antígeno de M. tuberculosis o consiste en una porción inmunogénica del mismo, donde el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN indicada en la SEC ID Nº 106, y secuencias de ADN que hibridizan a una secuencia complementaria a la indicada en la SEC ID Nº 106 en condiciones de rigurosidad moderada.

En aspectos relacionados, se proveen asimismo las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos anteriores, los vectores de expresión que comprenden estas secuencias de ADN y las células hospedantes transformadas o transfectadas con tales vectores de expresión.

En otro aspecto, la presente invención provee proteínas de fusión que comprenden un primer y un segundo polipéptido de la invención o, en forma alternativa, un polipéptido de la invención y un antígeno conocido de M. tuberculosis.

Dentro de otros aspectos, la presente invención provee composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los polipéptidos anteriores, o una molécula de ADN que codifica tales polipéptidos, y un vehículo fisiológicamente aceptable. La invención asimismo provee vacunas que comprende uno o más de los polipéptidos descritos previamente y un intensificador no específico de respuesta inmune, junto con vacunas que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican tales polipéptidos y un intensificador no específico de respuesta inmune.

En otro aspecto más, se revelan métodos para inducir la inmunidad protectora en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una cantidad efectiva de uno o más de los polipéptidos anteriores.

En otros aspectos de esta invención, se proveen equipos de diagnóstico para detectar tuberculosis en un paciente. Los métodos revelados comprenden poner en contacto células dérmicas de un paciente con uno o más de los polipéptidos anteriores y detectar una respuesta inmune en la piel del paciente. Los equipos de diagnóstico comprenden uno o más de los polipéptidos anteriores en combinación con un aparato apto para poner en contacto el polipéptido con las células dérmicas de un paciente.

Estos y otros aspectos de la presente invención se esclarecerán con referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.

Breve descripción de las figuras e identificadores de secuencias

Las Figuras 1A y B ilustran la estimulación de la proliferación y la producción de interferón-\gamma en células T derivadas de un primero y un segundo donante inmunes a M. tuberculosis-, respectivamente, por los antígenos de 14 Kd, 20 Kd y 26 Kd que se describen en el Ejemplo 1.

La Figura 2 ilustra la estimulación de la proliferación y la producción de interferón-\gamma en células T derivadas de un individuo inmune a la M. tuberculosis por los polipéptidos representativos TbRa3 y TbRa9.

SEC ID Nº 1 es la secuencia de ADN de TbRa1.

SEC ID Nº 2 es la secuencia de ADN de TbRa10.

SEC ID Nº 3 es la secuencia de ADN de TbRa11.

SEC ID Nº 4 es la secuencia de ADN de TbRa12.

SEC ID Nº 5 es la secuencia de ADN de TbRa13.

SEC ID Nº 6 es la secuencia de ADN de TbRa16.

SEC ID Nº 7 es la secuencia de ADN de TbRa17.

SEC ID Nº 8 es la secuencia de ADN de TbRa18.

SEC ID Nº 9 es la secuencia de ADN de TbRa19.

SEC ID Nº 10 es la secuencia de ADN de TbRa24.

SEC ID Nº 11 es la secuencia de ADN de TbRa26.

SEC ID Nº 12 es la secuencia de ADN de TbRa28.

SEC ID Nº 13 es la secuencia de ADN de TbRa29.

SEC ID Nº 14 es la secuencia de ADN de TbRa2A.

SEC ID Nº 15 es la secuencia de ADN de TbRa3.

SEC ID Nº 16 es la secuencia de ADN de TbRa32.

SEC ID Nº 17 es la secuencia de ADN de TbRa35.

SEC ID Nº 18 es la secuencia de ADN de TbRa36.

SEC ID Nº 19 es la secuencia de ADN de TbRa4.

SEC ID Nº 20 es la secuencia de ADN de TbRa9.

SEC ID Nº 21 es la secuencia de ADN de TbRaB.

SEC ID Nº 22 es la secuencia de ADN de TbRaC.

SEC ID Nº 23 es la secuencia de ADN de TbRaD.

SEC ID Nº 25 es la secuencia de ADN de AAMK.

SEC ID Nº 26 es la secuencia de ADN de TbL-23.

SEC ID Nº 27 es la secuencia de ADN de TbL-24.

SEC ID Nº 28 es la secuencia de ADN de TbL-25.

SEC ID Nº 29 es la secuencia de ADN de TbL-28.

SEC ID Nº 30 es la secuencia de ADN de TbL-29.

SEC ID Nº 31 es la secuencia de ADN de TbH-5.

SEC ID Nº 32 es la secuencia de ADN de TbH-8.

SEC ID Nº 33 es la secuencia de ADN de TbH-9.

SEC ID Nº 34 es la secuencia de ADN de TbM-1.

SEC ID Nº 35 es la secuencia de ADN de TbM-3.

SEC ID Nº 36 es la secuencia de ADN de TbM-6.

SEC ID Nº 37 es la secuencia de ADN de TbM-7.

SEC ID Nº 38 es la secuencia de ADN de TbM-9.

SEC ID Nº 39 es la secuencia de ADN de TbM-12.

SEC ID Nº 40 es la secuencia de ADN de TbM-13.

SEC ID Nº 41 es la secuencia de ADN de TbM-14.

SEC ID Nº 42 es la secuencia de ADN de TbM-15.

SEC ID Nº 43 es la secuencia de ADN de TbH-4.

SEC ID Nº 44 es la secuencia de ADN de TbH-4-FWD.

SEC ID Nº 45 es la secuencia de ADN de TbH-12.

SEC ID Nº 46 es la secuencia de ADN de Tb38-1.

SEC ID Nº 47 es la secuencia de ADN de Tb38-4.

SEC ID Nº 48 es la secuencia de ADN de TbL-17.

SEC ID Nº 49 es la secuencia de ADN de TbL-20.

SEC ID Nº 50 es la secuencia de ADN de TbL-21

SEC ID Nº 51 es la secuencia de ADN de TbH-16.

SEC ID Nº 52 es la secuencia de ADN de DPEP.

SEC ID Nº 53 es la secuencia de aminoácidos deducida de DPEP.

SEC ID Nº 54 es la secuencia de proteína de DPV antígeno N-terminal.

SEC ID Nº 56 es la secuencia de proteína de AAMK antígeno N-terminal.

SEC ID Nº 60 es la secuencia de proteína de DPEP antígeno N-terminal.

SEC ID Nº 63 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa1.

SEC ID Nº 64 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa10.

SEC ID Nº 65 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa11.

SEC ID Nº 66 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa12.

SEC ID Nº 67 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa13.

SEC ID Nº 68 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa16.

SEC ID Nº 69 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa17.

SEC ID Nº 70 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa18.

SEC ID Nº 71 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa19.

SEC ID Nº 72 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa24.

SEC ID Nº 73 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa26.

SEC ID Nº 74 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa28.

SEC ID Nº 75 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa29.

SEC ID Nº 76 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa2A.

SEC ID Nº 77 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa3.

SEC ID Nº 78 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa32.

SEC ID Nº 79 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa35.

SEC ID Nº 80 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa36.

SEC ID Nº 81 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa4.

SEC ID Nº 82 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa9.

SEC ID Nº 83 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRaB.

SEC ID Nº 84 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRaC.

SEC ID Nº 85 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRaD.

SEC ID Nº 87 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbAAMK.

SEC ID Nº 88 es la secuencia de aminoácidos deducida de Tb38-1.

SEC ID Nº 89 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-4.

SEC ID Nº 90 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-8.

SEC ID Nº 91 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-9.

SEC ID Nº 92 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-12.

SEC ID Nº 93 es the secuencia de aminoácidos de Tb38-1 péptido 1.

SEC ID Nº 94 es the secuencia de aminoácidos de Tb38-1 péptido 2.

SEC ID Nº 95 es the secuencia de aminoácidos de Tb38-1 péptido 3.

SEC ID Nº 96 es the secuencia de aminoácidos de Tb38-1 péptido 4.

SEC ID Nº 97 es the secuencia de aminoácidos de Tb38-1 péptido 5.

SEC ID Nº 98 es the secuencia de aminoácidos de Tb38-1 péptido 6.

SEC ID Nº 101 es la secuencia de ADN de DPV.

SEC ID Nº 102 es la secuencia de aminoácidos deducida de DPV.

SEC ID Nº 103 es la secuencia de ADN de ESAT-6.

SEC ID Nº 104 es la secuencia de aminoácidos deducida de ESAT-6.

SEC ID Nº 105 es la secuencia de ADN de TbH-8-2.

SEC ID Nº 106 es la secuencia de ADN ofTbH-9FL.

SEC ID Nº 107 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-9Fl.

SEC ID Nº 108 es la secuencia de ADN de TbH-9-1.

SEC ID Nº 109 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-9-1.

SEC ID Nº 110 es la secuencia de ADN de TbH-9-4.

SEC ID Nº 111 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-9-4.

SEC ID Nº 112 es la secuencia de ADN de Tb38-1F2 IN.

SEC ID Nº 113 es la secuencia de ADN de Tb38-2F2 RP.

SEC ID Nº 114 es la secuencia de aminoácidos deducida de Tb37-FL.

SEC ID Nº 115 es la secuencia de aminoácidos deducida de Tb38-IN.

SEC ID Nº 116 es la secuencia de ADN de Tb38-1F3.

SEC ID Nº 117 es la secuencia de aminoácidos deducida de Tb38-1F3.

SEC ID Nº 118 es la secuencia de ADN de Tb38-1F5.

SEC ID Nº 119 es la secuencia de ADN de Tb38-1F6.

SEC ID Nº 120 es la secuencia de aminoácidos deducida N-terminal de DPV.

SEC ID Nº 126 es la secuencia de aminoácidos deducida N-terminal de DPEP.

SEC ID Nº 129 es la secuencia de proteína del antígeno DPPD N-terminal.

SEC ID Nº 130-133 son las secuencias de proteínas de cuatro fragmentos de bromuro de cianógeno DPPD.

SEC ID Nº 134 es la secuencia de proteína N-terminal del antígeno XDS.

SEC ID Nº 135 es la secuencia de proteína N-terminal del antígeno AGD.

SEC ID Nº 136 es la secuencia de proteína N-terminal del antígeno APE.

SEC ID Nº 137 es la secuencia de proteína N-terminal del antígeno XYI.

Descripción detallada de la invención

Como se indicó previamente, la presente invención por lo general está dirigida a composiciones y usos de las mismas para prevenir, tratar y diagnosticar la tuberculosis. Las composiciones de la presente invención incluyen polipéptidos que comprenden al menos un antígeno de M. tuberculosis o consisten en una porción inmunogénica del mismo. Los polipéptidos dentro del alcance de la presente invención incluyen, pero sin constituir limitación alguna, antígenos inmunogénicos solubles de M. tuberculosis. Un "antígeno soluble de M. tuberculosis" es una proteína proveniente de M. tuberculosis que está presente en el filtrado del cultivo de M. tuberculosis. Como se emplea aquí, el concepto "polipéptido" comprende cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud total (es decir, antígenos), donde los residuos de aminoácidos se unen por uniones peptídicas covalentes. Así, un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de uno de los antígenos anteriores puede consistir por completo en la porción inmunogénica, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivar del antígeno nativo de M. tuberculosis o pueden ser heterólogas y tales secuencias pueden ser (pero no necesariamente) inmunogénicas.

"Inmunogénico," como se emplea aquí, se refiere a la capacidad de lograr una respuesta inmune (p. ej., celular) en un paciente, tal como un humano y/o en una muestra biológica. En particular, los antígenos que son inmunogénicos (o porciones inmunogénicas de los mismos u otras variantes de tales antígenos) son capaces de estimular la proliferación celular, la producción de interleuquina-12 y/o la producción de interferón-\gamma en muestras biológicas que comprenden una o más células seleccionadas del grupo de células T, células NK, células B y macrófagos, donde las células se derivan de un individuo inmune a M. tuberculosis. Los polipéptidos que comprenden uno o más antígenos de M. tuberculosis o que consisten en una porción inmunogénica del mismo, pueden generalmente usarse para detectar tuberculosis o para inducir la inmunidad protectora contra la tuberculosis en un paciente.

Las composiciones y métodos de esta invención asimismo abarcan variantes de los polipéptidos anteriores. Una "variante," como se emplea aquí, es un polipéptido que difiere del antígeno nativo sólo en sustituciones y/o modificaciones conservadoras, de modo tal que se retiene la capacidad del polipéptido de inducir una respuesta inmune. Tales variantes pueden generalmente identificarse modificando una de las secuencias polipeptídicas anteriores y evaluando las propiedades inmunogénicas del polipéptido modificado usando, por ejemplo, los procedimientos representativos descritos aquí.

Una "sustitución conservadora" es una en la cual un aminoácido esta sustituido por otro aminoácido que presenta propiedades similares, de modo tal que un especialista en la técnica de la química de los péptidos podría esperar que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no se modificó sustancialmente. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservadores: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Las variantes pueden asimismo (o en forma alternativa) ser modificadas, por ejemplo, mediante la supresión o adición de aminoácidos que ejercen una mínima influencia sobre las propiedades inmunogénicas, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse a una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige la transferencia de la proteína de modo co-traduccional o post-traduccional. El polipéptido puede asimismo conjugarse a un conector u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (p. ej., poli-His), o para aumentar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, puede conjugarse un polipéptido a una región Fc de inmunoglobulina.

En un aspecto relacionado, se revelan polipéptidos de combinación. Un "polipéptido de combinación" es un polipéptido que comprende al menos uno de los polipéptidos inmunogénicos anteriores o que consiste en una porción inmunogénica de los mismos, y una o más secuencias inmunogénicas de M. tuberculosis adicionales, que se unen mediante un enlace peptídico para dar una única cadena de aminoácidos. Las secuencias pueden unirse directamente (o sea sin intervención de aminoácidos) o pueden unirse por medio de una secuencia de enlace (p. ej., Gly-Cys-Gly) que no disminuye significativamente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos componentes.

En general, los antígenos de M. tuberculosis y las secuencias de ADN que codifican tales antígenos pueden prepararse usando cualquiera de una variedad de procedimientos. Por ejemplo, pueden aislarse antígenos solubles del filtrado del cultivo de M. tuberculosis mediante procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica, incluyendo intercambio aniónico y cromatografía en fase reversa. Los antígenos purificados son luego evaluados respecto de su capacidad de lograr una respuesta inmune apropiada (p. ej., celular) usando, por ejemplo, los métodos representativos que se describen aquí. Los antígenos inmunogénicos pueden luego ser parcialmente secuenciados usando técnicas tales como la química tradicional de Edman. Véase, Edman y Berg, Eur. J. Biochem. 80:116-132, 1967.

Los antígenos inmunogénicos pueden asimismo producirse de modo recombinante usando una secuencia de ADN que codifica el antígeno, que fue insertada en un vector de expresión y expresada en un hospedante apropiado. Las moléculas de ADN que codifican antígenos solubles pueden aislarse al seleccionar una biblioteca de expresión de M. tuberculosis apropiada con anti-sueros (p. ej., de conejo) producidos específicamente contra antígenos de M. tuberculosis solubles. Las secuencias de ADN que codifican antígenos que pueden ser solubles o no, pueden identificarse mediante la selección de una biblioteca de expresión apropiada de ADN genómico de M. tuberculosis con sueros obtenidos de pacientes infectados con M. tuberculosis. Tales selecciones pueden generalmente realizarse usando técnicas bien conocidas para los especialistas en la técnica, tales como las descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Las secuencias de ADN que codifican antígenos solubles pueden obtenerse asimismo al seleccionar un ADNc apropiado de M. tuberculosis ADNc o una biblioteca de ADN genómico respecto de secuencias de ADN que hibridizan a oligonucleótidos degenerados derivados de secuencias parciales de aminoácidos de antígenos solubles aislados. Las secuencias degeneradas de oligonucleótidos a usarse en tal selección pueden diseñarse y sintetizarse, y llevarse a cabo la selección tal como se describe (por ejemplo) en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (y las referencias aquí citadas). Puede también emplearse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los oligonucleótidos anteriores en métodos bien conocidos en la técnica, para aislar una sonda de ácido nucleico de un ADNc o una biblioteca genómica. Luego puede realizarse el análisis de la biblioteca usando la sonda aislada.

En forma alternativa, pueden seleccionarse directamente las bibliotecas genómicas o de ADNc derivadas de M. tuberculosis utilizando células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) o líneas de células T o clones derivados de uno o más individuos inmunes a M. tuberculosis. En general, las PBMC y/o células T para el uso en tales estudios, pueden prepararse como se describe a continuación. Las selecciones directas de bibliotecas pueden generalmente realizarse mediante el ensayo de pools de proteínas recombinantes expresadas respecto de su capacidad de inducir la proliferación y/o de producir interferón-\gamma en células T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis. En forma alternativa, los potenciales antígenos de células T pueden seleccionarse en primer lugar basándose en la reactividad del anticuerpo, como se describió previamente.

Sin tener en cuenta el método de preparación, los antígenos (y porciones inmunogénicas de los mismos) que se describieron aquí (que pueden ser solubles o no) tienen la capacidad de inducir una respuesta inmunogénica. Más específicamente, los antígenos tienen la capacidad de inducir la proliferación y/o la producción de citoquinas (o sea, producción de interferón-\gamma y/o interleuquina-12) en células T, células NK, células B y/o macrófagos derivados de un individuo inmune a M. tuberculosis. La selección del tipo de célula para su uso en la evaluación de una respuesta inmunogénica frente a un antígeno dependerá naturalmente de la respuesta deseada. Por ejemplo, la producción de interleuquina-12 se evalúa del mejor modo usando preparaciones que contienen células B y/o macrófagos. Un individuo inmune a M. tuberculosis es uno que se considera resistente al desarrollo de tuberculosis debido a que presenta una efectiva respuesta de células T a M. tuberculosis (es decir, sustancialmente no presenta síntomas de enfermedad). Puede identificarse a tales individuos con una prueba de piel intradérmica de respuesta fuertemente positiva (es decir, una induración mayor que aproximadamente 10 mm de diámetro) frente a proteínas de la tuberculosis (PPD) y una ausencia de cualquier signo o síntoma de la enfermedad tuberculosa. Pueden prepararse células T, células NK, células B y macrófagos derivados de individuos inmunes a M. tuberculosis usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, puede emplearse una preparación de PBMC (es decir, células mononucleares sanguíneas periféricas) sin separación posterior de células componentes. Las PBMC pueden prepararse generalmente, por ejemplo, usando la centrifugación por densidad mediante Ficoll™ (Winthrop Laboratories, NY). Las células T para utilizar en los ensayos que se describieron aquí pueden asimismo purificarse directamente a partir de PBMC. En forma alternativa, puede emplearse una línea enriquecida de células T reactiva frente a proteínas micobacterianas, o clones de células T reactivos a proteínas micobacterianas individuales. Tales clones de células T pueden generarse, por ejemplo, cultivando las PBMC de individuos inmunes a M. tuberculosis con proteínas micobacterianas durante un período de 2-4 semanas. Esto permite la expansión de sólo las células T específicas de proteína micobacteriana, dando lugar a una línea que se compone solamente de tales células. Estas células pueden luego clonarse y estudiarse con proteínas individuales, usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica, para definir con mayor exactitud la especificidad de células T individuales. En general, se consideran inmunogénicos los antígenos que resultan positivos en ensayos de proliferación y/o de producción de citoquinas (es decir, producción de interferón-\gamma y/o interleuquina-12) realizados utilizando células T, células NK, células B y/o macrófagos derivados de un individuo inmune a M. tuberculosis. Tales ensayos pueden realizarse, por ejemplo, usando los procedimientos representativos que se describen a continuación. Las porciones inmunogénicas de tales antígenos pueden identificarse usando ensayos similares y pueden estar presentes dentro de los polipéptidos descritos aquí.

Se evalúa la capacidad de un polipéptido (p. ej., un antígeno inmunogénico o una porción u otra variante del mismo) de inducir la proliferación celular al poner en contacto las células (p. ej., células T y/o células NK) con el polipéptido y midiendo la proliferación de las células. En general, la cantidad de polipéptido que es suficiente para la evaluación de aproximadamente 10^{5} células oscila desde alrededor de 10 ng/ml a alrededor de 100 ug/ml y de preferencia es aproximadamente 10 ug/ml. La incubación del polipéptido con células se realiza habitualmente a 37ºC durante aproximadamente seis días. Después de la incubación con el polipéptido, las células se prueban respecto de una respuesta proliferativa, que puede evaluarse mediante métodos conocidos por los especialistas en la técnica,,tales como exponer las células a un pulso de timidina radio-marcada y medir la incorporación del marcador en el ADN celular. En general, se considera que un polipéptido que produce al menos un incremento triple en la proliferación respecto de la basal (es decir, la proliferación observada para células cultivadas sin polipéptido) es capaz de inducir la proliferación.

La capacidad de un polipéptido de estimular la producción de interferón-\gamma y/o interleuquina-12 en células puede evaluarse poniendo en contacto las células con el polipéptido y medir el nivel de interferón-\gamma o interleuquina-12 producido por las células. En general, la cantidad de polipéptido suficiente para la evaluación de aproximadamente 10^{5} células oscila desde alrededor de 10 ng/ml a alrededor de 100 ug/ml y de preferencia es aproximadamente 10 ug/ml. El polipéptido puede, pero no es imprescindible, estar inmovilizado sobre un soporte sólido, tal como una perla o una microesfera biodegradable, tal como las que se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 4.897.268 y 5.075.109. La incubación del polipéptido con las células se realiza habitualmente a 37ºC durante aproximadamente seis días. Después de la incubación con el polipéptido, las células se analizan para determinar interferón-\gamma y/o interleuquina-12 (o una o más subunidades de la misma), que pueden evaluarse por métodos conocidos por los especialistas en la técnica, tales como un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) o en el caso de la subunidad P70 de IL-12, un bioensayo, tal como un ensayo para medir la proliferación de células T. En general, un polipéptido que da lugar a la producción de al menos 50 pg de interferón-\gamma por ml de sobrenadante cultivado (que contiene 10^{4}-10^{5} células T por ml) se considera con capacidad de estimular la producción de interferón-\gamma. Un polipéptido que estimula la producción de al menos 10 pg/ml de la subunidad P70 de IL-12 y/o al menos 100 pg/ml de la subunidad P40 de IL-12 por 10^{5} macrófagos o células B (o por 3 x 10^{5} PBMC) se considera capaz de estimular la producción de IL-12.

En general, los antígenos inmunogénicos son aquellos antígenos que estimulan la proliferación y/o producción de citoquinas (es decir, la producción de interferón-\gamma y/o interleuquina-12) en células T, células NK, células B y/o macrófagos derivados de al menos aproximadamente un 25% de individuos inmunes a M. tuberculosis. Entre estos antígenos inmunogénicos, pueden distinguirse los polipéptidos que presentan propiedades terapéuticas superiores basándose en la magnitud de las respuestas en los ensayos anteriores y basándose en el porcentaje de individuos en los cuales se observan las respuestas. Además, los antígenos que presentan propiedades terapéuticas superiores no estimularán la proliferación y/o producción de citoquinas in vitro en células derivadas de más de aproximadamente 25% de individuos que no son inmunes a M. tuberculosis, eliminando de este modo las respuestas que no se deben específicamente a células que responden a M. tuberculosis. Aquellos antígenos que inducen una respuesta en un elevado porcentaje de preparaciones de células T, células NK, células B y/o de macrófagos de individuos inmunes a M. tuberculosis (con una baja incidencia de respuestas en preparaciones de células de otros individuos) poseen propiedades terapéuticas superiores.

Pueden asimismo identificarse antígenos con propiedades terapéuticas superiores, basándose en su capacidad de reducir la gravedad de la infección por M. tuberculosis en animales experimentales, cuando se administran como una vacuna. Se describen en detalle a continuación preparaciones de vacunas adecuadas para el uso en animales experimentales. Puede determinarse la eficacia basándose en la capacidad del antígeno de proporcionar al menos aproximadamente un 50% de reducción en recuentos de bacterias y/o al menos aproximadamente una reducción del 40% de la mortalidad tras la infección experimental. Los animales adecuados para los experimentos incluyen ratones, cobayos y primates.

En general se identifican los antígenos que presentan propiedades de diagnóstico superiores basándose en la capacidad de lograr una respuesta en una prueba de piel intradérmica realizada en un individuo con tuberculosis activa, pero no en un ensayo realizado en un individuo que no está infectado con M. tuberculosis. Las pruebas de piel que se pueden realizar en general como se describe a continuación, considerándose positivas con una respuesta de induración de al menos 5 mm.

Las porciones inmunogénicas de los antígenos que se describieron aquí pueden prepararse e identificarse usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como aquellas resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3d ed., Raven Press, 1993, pp. 243-247 y las referencias allí citadas. Tales técnicas incluyen el análisis de porciones de polipéptido del antígeno nativo respecto de propiedades inmunogénicas. Los ensayos representativos de proliferación y producción de citoquinas descritos aquí, pueden generalmente emplearse en estas selecciones. Una porción inmunogénica de un polipéptido es una porción que, dentro de tales ensayos representativos, genera una respuesta inmune (p. ej., la proliferación, producción de interferón-\gamma y/o interleuquina-12) que es sustancialmente similar a aquella generada por el antígeno de longitud total. En otras palabras, una porción inmunogénica de un antígeno puede generar al menos aproximadamente un 20%, y de preferencia aproximadamente un 100% de la proliferación inducida por el antígeno de longitud total en el ensayo modelo de proliferación que se describe aquí. Una porción inmunogénica puede asimismo o en forma alternativa, estimular la producción de al menos aproximadamente un 20%, y de preferencia aproximadamente un 100% del interferón-\gamma y/o la interleuquina-12 inducidos por el antígeno de longitud total en el ensayo modelo que se describe aquí.

Pueden generarse porciones y otras variantes de antígenos de M. tuberculosis por medios sintéticos o recombinantes. Los polipéptidos sintéticos que presentan menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y en general menos de aproximadamente 50 aminoácidos, pueden generarse empleándose técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, tales polipéptidos pueden sintetizarse utilizando cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles en el mercado, tal como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, donde los aminoácidos se agregan en forma secuencial a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. Se dispone en el mercado del equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos de proveedores tales como Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA, y pueden operarse según las instrucciones del fabricante. Las variantes de un antígeno nativo pueden prepararse generalmente usando técnicas estándar de mutagénesis, tales como mutagénesis de oligonucleótidos dirigida a sitios específicos. Se puede asimismo eliminar secciones de la secuencia de ADN usando técnicas estándar para permitir la preparación de polipéptidos truncados.

Los polipéptidos recombinantes que contienen porciones y/o variantes de un antígeno nativo pueden prepararse fácilmente a partir de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido usando una variedad de técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas adecuados hospedante/vector que secretan proteína recombinante en el medio de cultivo, pueden en primer lugar concentrarse usando un filtro disponible en el mercado. Después de la concentración, puede aplicarse el concentrado a una matriz de purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, pueden usarse uno o más pasos de HPLC de fase reversa, para continuar purificando una proteína recombinante.

Puede emplearse cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los especialistas en la técnica para expresar polipéptidos recombinantes de esta invención. Puede lograrse la expresión en cualquier célula hospedante apropiada que fue transformada o transfectada con un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que codifica un polipéptido recombinante. Las células hospedantes adecuadas incluyen células procariotas, de levadura y eucariotas superiores. Preferentemente, las células hospedantes empleadas son E. coli, levadura o una línea celular de mamíferos, tal como COS o CHO. Las secuencias de ADN expresadas de este modo pueden codificar antígenos naturales, porciones de antígenos naturales u otras variantes de los mismos.

En general, sin tener en cuenta el método de preparación, los polipéptidos revelados aquí se preparan en forma sustancialmente pura. Preferentemente, los polipéptidos son al menos aproximadamente 80% puros, de mayor preferencia al menos aproximadamente 90% puros y de máxima preferencia al menos aproximadamente 99% puros. En determinadas formas de realización preferidas, que se describen en detalle a continuación, los polipéptidos sustancialmente puros se incorporan a composiciones farmacéuticas o vacunas para el uso en uno o más de los métodos que se revelan aquí.

En otras formas de realización específicas, la presente invención revela polipéptidos que comprenden al menos una porción inmunogénica de un antígeno de M. tuberculosis (o una variante de tal antígeno), que puede o no ser soluble, que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos codificadas por (a) la secuencia de ADN de SEC ID Nº 106; (b) secuencias de ADN sustancialmente homólogas a una secuencia de (a).

En las formas de realización específicas indicadas previamente, los antígenos de M. tuberculosis antígenos incluyen variantes que son codificadas por las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas a una o más de las secuencias de ADN que se indican específicamente aquí. Una "homología sustancial," como se emplea aquí, se refiere a secuencias de ADN que tienen la capacidad de hibridizar en condiciones de moderada rigurosidad. Las condiciones de moderada rigurosidad incluyen el prelavado en una solución de 5X SSC, 0,5% SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); realizando la hibridación a 50ºC-65ºC, 5X SSC, hasta el día siguiente o en el caso de homología de especies cruzadas una homología a 45ºC, 0,5X SSC; seguida de un doble lavado a 65ºC durante 20 minutos, cada vez con 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contiene 0,1% SDS). Tales secuencias de hibridación de ADN también se incluyen en el alcance de esta invención, como lo son las secuencias de nucleótidos que debido a la degeneración del código genético, codifican un polipéptido inmunogénico que es codificado por una secuencia de ADN que hibridiza.

En un aspecto relacionado, la presente invención provee proteínas de fusión que comprenden un primer y un segundo polipéptido de la invención o, en forma alternativa, un polipéptido de la presente invención y un antígeno conocido de M. tuberculosis, tal como el antígeno de 38 kD que se describió previamente o ESAT-6 (SEC ID Nº 103 y 104), junto con variantes de tales proteínas de fusión. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden asimismo incluir un péptido conector entre el primer y el segundo polipéptido.

Se construye una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de la presente invención usando técnicas de ADN recombinante conocidas para ensamblar secuencias separadas de ADN que codifican el primer y el segundo polipéptido en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de una secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido es ligado, con o sin un péptido conector, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido, de modo tal que el marco de lectura de las secuencias se encuentran en fase para permitir la traducción del ARNm de las dos secuencias de ADN para dar una proteína de fusión individual que retiene la actividad biológica de ambos, el primero y el segundo polipéptido.

Puede emplearse una secuencia peptídica conectora para separar el primer y el segundo polipéptido mediante una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundaria y terciaria. Tal secuencia peptídica conectora es incorporada a una proteína de fusión usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Las secuencia peptídicas conectoras adecuadas pueden elegirse basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación flexible extendida; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interactuar con epítopes funcionales del primer y segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos cargados o hidrofóbicos que puedan reaccionar con los epítopes funcionales de los polipéptidos. Las secuencias peptídicas conectoras preferidas contienen residuos Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos neutros cercanos, tales como Thr y Ala pueden asimismo usarse en la secuencia conectora. Las secuencias de aminoácidos que pueden ser útiles para emplearse como conectoras incluyen aquellas reveladas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; Patente Estadounidense Nº 4.935.233 y Patente Estadounidense Nº 4.751.180. La secuencia conectora puede ser de una longitud de 1 a alrededor de 50 aminoácidos. No se requieren secuencias peptídicas cuando los primeros y segundos polipéptidos presentan regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales, que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica.

Las secuencias de ADN ligadas están conectadas operativamente a elementos regulatorios transcripcionales o traduccionales adecuados. Los elementos regulatorios responsables de la expresión de ADN se ubican sólo en 5' respecto de la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De modo similar, los codones de detención requeridos para finalizar las señales de terminación de traducción y transcripción sólo están presentes en 3' respecto de la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.

En otro aspecto, la presente invención revela métodos para usar uno o más de los polipéptidos anteriores o proteínas de fusión (o moléculas de ADN que codifican tales polipéptidos) para inducir la inmunidad de protección contra la tuberculosis en un paciente. Como se emplea aquí, se denomina "paciente" a cualquier animal de sangre caliente, de preferencia un humano. Un paciente puede sufrir una enfermedad o puede estar libre de una enfermedad y/o infección detectable. En otras palabras, puede inducirse la inmunidad protectora para prevenir o tratar la tuberculosis.

En este aspecto, el polipéptido, la proteína de fusión o la molécula de ADN por lo general está presente en una composición farmacéutica y/o una vacuna. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más polipéptidos, cada uno de los cuales puede contener una o más de las secuencias anteriores (o variantes de la misma), y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o más de los polipéptidos anteriores y un intensificador no específico de la respuesta inmune, tal como un adyuvante o un liposoma (en el cual se incorpora el polipéptido). Tales composiciones farmacéuticas y vacunas pueden asimismo contener otros antígenos de M. tuberculosis, ya sea incorporados en un polipéptido de combinación o presentes dentro de un polipéptido separado.

En forma alternativa, una vacuna puede contener ADN que codifica uno o más polipéptidos como se describió previamente, de modo que el polipéptido es generado in situ. En tales vacunas, el ADN puede estar presente dentro de una variedad de sistemas de liberación conocidos para los especialistas en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nucleicos, sistemas de expresión bacterianos y virales. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados incluyen las secuencias necesarias de ADN para la expresión en el paciente (tal como un promotor y una señal de terminación adecuados). Los sistemas de liberación bacterianos incluyen la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmelte-Guerrin) que expresa una porción inmunogénica del polipéptido en su superficie celular. En una forma de realización preferida, puede introducirse el ADN usando un sistema de expresión viral (p. ej., vaccinia u otro virus pox, retrovirus o adenovirus), que puede incluir el uso de un virus competente de replicación no patogénico (defectuoso). Las técnicas para incorporar el ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidas para los especialistas en la técnica. El ADN puede asimismo ser "desnudo," como se describió, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 y fue revisado por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. La integración del ADN desnudo puede aumen-
tarse al aplicar el ADN sobre perlas biodegradables, que son transportadas de modo eficiente al interior de las células.

En un aspecto relacionado, una vacuna de ADN como se describió previamente, puede administrarse en forma simultánea con o en forma secuencial con un polipéptido de la presente invención o un antígeno de M. tuberculosis conocido, tal como el antígeno de 38 kD que se describió previamente. Por ejemplo, la administración de ADN que codifica un polipéptido de la presente invención, ya sea "desnudo" o en un sistema de liberación como se describió previamente, puede ser seguida de la administración de un antígeno a fin de aumentar los efectos inmunes de protección de la vacuna.

Las vías y la frecuencia de administración, así como también la dosificación, variarán de un individuo a otro y puede igualar a las usadas habitualmente en la inmunización empleando BCG. En general, las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden administrarse por inyección (p. ej., intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), intranasal (p. ej., por aspiración) o por vía oral. Pueden administrarse entre 1 y 3 dosis durante un período de 1-36 semanas. Preferentemente, se administran 3 dosis en intervalos de 3-4 meses, y luego pueden administrarse luego periódicamente vacunaciones de refuerzo. Para pacientes individuales pueden ser apropiados protocolos alternativos. Una dosis adecuada es una cantidad de polipéptido o ADN, el que al administrarse como se describió previamente, es capaz de producir una respuesta inmune en un paciente inmunizado que sea suficiente para proteger al paciente de la infección con M. tuberculosis durante al menos 1-2 años. En general, la cantidad de polipéptido presente en una dosis (o producida in situ por el ADN en una dosis) oscila desde alrededor de 1 pg a alrededor de 100 mg por kg de hospedante, habitualmente desde alrededor de 10 pg a alrededor de 1 mg, y de preferencia desde alrededor de 100 pg a alrededor de 1 ug. El monto de dosis adecuadas variará con el peso del paciente, pero habitualmente oscilará desde alrededor de 0,1 ml a alrededor de 5 ml.

Aunque cualquier vehículo adecuado conocido para los especialistas en la técnica puede emplearse en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Para administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo de preferencia comprende agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o una solución reguladora. Para administración oral puede emplearse cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Las microesferas biodegradables (p. ej., galáctido poliláctico) puede asimismo emplearse como vehículo para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Se revelan microesferas biodegradables adecuadas, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nº 4.897.268 y 5.075.109.

En las vacunas de esta invención puede emplearse cualquiera de una variedad de adyuvantes para aumentar de modo no específico la respuesta inmune. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno de un catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador no específico de respuestas inmunes, tal como el lípido A, Bordatella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los adyuvantes adecuados pueden obtenerse en el mercado, como el adyuvante incompleto de Freund y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories) y el adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Otros adyuvantes adecuados incluyen alumbre, microesferas biodegradables, lípido A monofosforilo y quil A.

En otro aspecto, esta invención revela métodos para usar uno o más de los polipéptidos que se describieron antes para diagnosticar tuberculosis usando una prueba de piel. Como se emplea aquí, una "prueba de piel" es cualquier ensayo realizado directamente en un paciente, en el cual se mide una reacción de hipersensibilidad del tipo retardado (DTH) (tal como tumefacción, enrojecimiento o dermatitis) luego de una inyección intradérmica de uno o más polipéptidos como se describió previamente. Tal inyección puede realizarse usando cualquier dispositivo apto para poner en contacto el polipéptido o los polipéptidos con células dérmicas del paciente, tal como una jeringa de tuberculina o jeringa de 1 ml. Preferentemente, la reacción se mide al menos 48 horas después de la inyección, de mayor preferencia 48-72 horas.

La reacción DTH es una respuesta inmune mediada por células, que es mayor en pacientes que han estado expuestos previamente al antígeno de prueba (p. ej., la porción inmunogénica del polipéptido empleado, o una variante del mismo). La respuesta puede medirse visualmente usando una regla. En general, una respuesta que es mayor que aproximadamente 0,5 cm en diámetro, de preferencia mayor que aproximadamente 1,0 cm en diámetro, es una respuesta positiva, indicativa de una infección con tuberculosis, que puede haberse manifestado o no como enfermedad activa.

Los polipéptidos de esta invención de preferencia se formulan para su uso en una prueba de piel, como composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido y un vehículo fisiológicamente aceptable, como se describió previamente. Tales composiciones habitualmente contienen uno o más de los polipéptidos anteriores en una cantidad que oscila desde alrededor de 1 ug a alrededor de 100 ug, de preferencia desde alrededor de 10 ug a alrededor de 50 ug en un volumen de 0,1 ml. Preferentemente, el vehículo empleado en tales composiciones farmacéuticas es una solución salina con conservantes apropiados, tales como fenol y/o Tween 80™.

En una forma de realización preferida, un polipéptido empleado en una prueba de piel es de suficiente tamaño, de modo tal que permanece en el sitio de inyección durante la duración del período de reacción. En general, es suficiente un polipéptido que presenta una longitud mínima de 9 aminoácidos. El polipéptido también de preferencia es degradado por los macrófagos dentro de unas horas siguientes a la inyección para permitir la presentación a células T. Tales polipéptidos pueden contener repeticiones de una o más de las secuencias anteriores y/u otras secuencias inmunogénicas o no inmunogénicas.

Los siguientes Ejemplos se brindan a modo de ilustración, sin implicar limitación alguna.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación y caracterización de polipéptidos del filtrado del cultivo de M. tuberculosis

Este ejemplo ilustra la preparación de polipéptidos solubles de M. tuberculosis provenientes de filtrado de cultivo. Salvo que se indique de otro modo, todos los porcentajes en el siguiente ejemplo son de peso en volumen.

Se cultivó M. tuberculosis (ya sea H37Ra, ATCC Nº 25177, o H37Rv, ATCC Nº 25618) en un medio GAS estéril a 37ºC durante catorce días. El medio luego se filtró al vacío (dejando el grueso de las células) a través de un filtro de 0,45 u dentro de un frasco estéril de 2,5 l. Luego se filtró el medio a través de un filtro de 0,2 u. en un frasco estéril de 4 l y se agregó NaN_{3} al filtrado del cultivo hasta una concentración de 0,04%. Luego los frascos se ubicaron en un ambiente frío a 4ºC.

Se concentró el filtrado del cultivo colocando el filtrado en un recipiente de 12 l que se había sometido a autoclave y suministrando el filtrado a una celda de agitación de 400 ml de Amicon que se había enjuagado con etanol y presentaba una membrana de 10.000 kDa de MWCO. Se mantuvo la presión a 60 psi usando gas nitrógeno. Este procedimiento redujo el volumen de 12 l a aproximadamente 50 ml.

Se dializó el filtrado del cultivo en bicarbonato de amonio al 0,1% usando una membrana de éster de celulosa de 8.000 kDa de MWCO, con dos recambios de la solución de bicarbonato de amonio. Luego se determinó la concentración de proteína mediante un ensayo BCA disponible en el mercado (Pierce, Rockford, IL).

El filtrado del cultivo dializado luego se liofilizó, y los polipéptidos se resuspendieron en agua destilada. Se dializaron los polipéptidos contra 1,3-bis[tris(hidroximetil)-metilamino]propano 0,01 mM, pH 7,5 (solución reguladora de Bis-Tris propano), las condiciones iniciales para la cromatografía de recambio de aniones. Se realizó el fraccionamiento usando la cromatografía de profusión de gel en una columna de intercambio aniónico POROS 146 II Q/M de 4,6 mm x 100 mm (Perseptive BioSystems, Framingham, MA) equilibrada en solución reguladora de Bis-Tris propano 0,01 mM, pH 7,5. Los polipéptidos se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-0,5 M en el sistema de la solución reguladora anterior. El eluyente de columna se monitoreó a una longitud de onda de 220 nm.

Los pools de polipéptidos que eluyeron de la columna de intercambio iónico se dializaron contra agua destilada y se liofilizaron. El material resultante se disolvió en ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) pH 1,9 en agua, y los polipéptidos se purificaron en una columna Delta-Pak C18 (Waters, Milford, MA) con tamaño de poro de 300 Angstrom, tamaño de partícula 5 micrones (3,9 x 150 mm). Los polipéptidos se eluyeron de la columna con un gradiente lineal del regulador de dilución de 0-60% (0,1% TFA en acetonitrilo). El caudal fue de 0,75 ml/minuto y el eluyente de HPLC se monitoreó a 214 nm. Se recolectaron las fracciones que contenían los polipéptidos eluídos para maximizar la pureza de las muestras individuales. Se obtuvieron aproximadamente 200 polipéptidos purificados.

Los polipéptidos purificados luego se analizaron respecto de la capacidad de inducir la proliferación de células T en preparaciones de PBMC. Las PBMC de donantes de los que se tenía conocimiento eran positivos en la prueba de piel PPD y cuyas células T demostraron proliferar en respuesta a PPD, y proteínas solubles en bruto de MTB, se cultivaron en un medio que comprendía RPMI 1640 suplementado con suero humano unificado al 10% y 50 ug/ml de gentamicina. Se agregaron polipéptidos purificados por duplicado a concentraciones de 0,5 a 10 ug/ml. Al cabo de seis días de cultivo en placas de fondo redondo de 96 pocillos con un volumen de 200 ul, se extrajeron 50 ul de medio de cada pocillo para determinar los niveles de IFN-\gamma, como se describe a continuación. Luego se pulsaron las placas con 1 uCi/pocillo de timidina tritiada durante otras 18 horas, se recolectó y se determinó la captación de tritio usando un contador de centelleo a gas. Se consideraron positivas las fracciones que generaron proliferación en ambas réplicas tres veces mayores que la proliferación observada en células cultivadas en medio solo.

Se midió el IFN-\gamma utilizando un ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA). Se recubrieron las placas de ELISA con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a IFN-\gamma humano (PharMingen, San Diego, CA) en PBS durante cuatro horas a temperatura ambiente. Luego se bloquearon los pocillos con PBS que contenía 5% (p/V) de leche en polvo desgrasada durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavaron las placas seis veces en PBS/0,2% TWEEN-20 y se diluyeron las muestras 1:2 en medio de cultivo en las placas ELISA, se incubó hasta el día siguiente a temperatura ambiente. Las placas se lavaron nuevamente y se agregó a cada pocillo un suero de IFN-\gamma anti-humano de conejo policlonal diluído 1:3000 en PBS/10% normal de cabra. Luego se incubaron las placas durante dos horas a temperatura ambiente, se lavaron y se agregó peroxidasa de rábano picante acoplada con IgG anti-conejo (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en una dilución 1:2000 en PBS/5% de leche en polvo desgrasada. Después de otras dos horas de incubación a temperatura ambiente, se lavaron las placas y se agregó el sustrato TMB. Se detuvo la reacción luego de 20 min con ácido sulfúrico 1 N. Se determinó la densidad óptica a 450 nm usando 570 nm como una longitud de onda de referencia. Se consideraron positivas las fracciones que generaron en ambas réplicas una DO dos veces mayor que la DO media de células cultivadas en medio solo, más 3 desviaciones estándar.

Para la secuenciación, se secaron los polipéptidos en forma individual sobre filtros de fibra de vidrio tratados Biobrene™ (Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA). Los filtros con polipéptidos se cargaron en un secuenciador de proteínas Perkin Elmer/Applied BioSystems Division Procise 492. Los polipéptidos se secuenciaron desde el amino terminal y se utilizó química de Edman tradicional. La secuencia de aminoácidos se determinó para cada polipéptido al comparar el tiempo de retención del derivado de aminoácidos PTH con los estándares de los derivados PTH apropiados.

Al utilizar el procedimiento que se describió previamente, se aislaron antígenos que presentan las siguientes secuencias N-terminales:

(a)

Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Xaa-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu; (SEC ID Nº 54)

(c)

Ala-Ala-Met-Lvs-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg; (SEC ID Nº 56)

(g)

Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Pro-Ala; (SEC ID Nº 60) y

donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

Se aislaron antígenos solubles adicionales del filtrado del cultivo de M. tuberculosis del siguiente modo. Se preparó filtrado del cultivo de M. tuberculosis como se describió previamente. Luego de la diálisis contra solución reguladora de Bis-Tris propano, a un valor de pH 5,5, se realizó el fraccionado usando cromatografía de intercambio aniónico en una columna Poros QE de 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems) equilibrada en solución reguladora de Bis-Tris propano a un valor de pH 5,5. Los polipéptidos se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-1,5 M en el sistema de la solución reguladora anterior con un caudal de 10 ml/min. El eluyente de la columna se monitoreó a una longitud de onda de 214 nm.

Las fracciones eluídas de la columna de intercambio iónico se reunieron y se sometieron a una cromatografía de fase reversa usando una columna Poros R2 de 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems). Los polipéptidos se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de 0-100% de acetonitrilo (0,1% TFA) con un caudal de 5 ml/min. El eluyente se monitoreó a 214 nm.

Las fracciones que contenían los polipéptidos eluídos se liofilizaron y resuspendieron en 80 ul de TFA acuoso al 0,1% y luego se sometieron a cromatografía de fase reversa en una columna Vydac C4 4,6 x 150 mm (Western Analytical, Temecula, CA) con un gradiente lineal de 0-100% de acetonitrilo (0,1% TFA) con un caudal de 2 ml/min. El eluyente se monitoreó a 214 nm.

La fracción con actividad biológica se separó en un pico mayor más otros componentes menores. La transferencia Western de este pico a una membrana de PVDF reveló tres bandas principales con los pesos moleculares 14 Kd, 20 Kd y 26 Kd. Se determinó que estos polipéptidos presentan las siguientes secuencias N-terminales, respectivamente:

(j)

Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser; (SEC ID Nº 134)

(k)

Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp; (SEC ID Nº 135) y

(l)

Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly; (SEC ID Nº 136)

donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

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Utilizando los ensayos que se describieron previamente, se demostró que estos polipéptidos inducen la proliferación y la producción de IFN-\gamma en preparaciones de PBMC. En las Figuras 1A y B se muestran los resultados de tales ensayos usando preparaciones de PBMC de un primer y un segundo donante, respectivamente.

Las secuencias de ADN que codifican los antígenos denominados (a), (c) y (g) anteriores se obtuvieron al analizar una biblioteca genómica de M. tuberculosis utilizando oligonucleótidos degenerados marcados en el extremo con ^{32}P correspondientes a la secuencia N-terminal y que contiene un sesgo del codón de M. tuberculosis. El análisis realizado utilizando una sonda correspondiente al antígeno (a) anterior identificó un clon que presenta la secuencia provista en SEC ID Nº 101. El polipéptido codificado por SEC ID Nº 101 se provee en la SEC ID Nº 102. El análisis realizado utilizando una muestra correspondiente al antígeno (g) anterior identificó un clon que presenta la secuencia provista en SEC ID Nº 52. El polipéptido codificado por SEC ID Nº 52 se provee en SEC ID Nº 53. El análisis realizado con una muestra correspondiente al antígeno (c) identificó un clon que presenta la secuencia provista en SEC ID Nº 25.

Se compararon las secuencias de aminoácidos anteriores con secuencias de aminoácidos conocidas en el banco de genes usando el sistema ADN STAR. En la base de datos revisada se encontraron alrededor de 173.000 proteínas, y es una combinación de las bases de datos suiza, PIR junto con secuencias de proteínas traducidas (Versión 87). No se detectaron homologías significativas con las secuencias de aminoácidos para los antígenos (a)-(g) y (l).

Se encontró que la secuencia de aminoácidos para el antígeno (j) es homóloga con una proteína de M. tuberculosis conocida traducida de una secuencia de ADN. Según el mejor conocimiento de los autores de la invención, no se ha demostrado previamente que esta proteína posea la actividad estimuladora de células T. Se encontró que la secuencia de aminoácidos para el antígeno (k) estaba relacionada con una secuencia de M. leprae.

En los ensayos de proliferación y de IFN-\gamma que se describieron previamente, utilizando los tres donantes positivos de PPD, se presentan los resultados de antígenos representativos en la Tabla 1:

TABLA 1 Resultados de los ensayos de proliferación de pbmc e IFN-\gamma

Secuencia	Proliferación	IFN-\gamma
(a)	+	-
(c)	+++	+++
(g)	+++	+++

En la Tabla 1, las respuestas de las que resulta un índice de estimulación (IE) que varía entre 2 y 4 (en comparación con las células cultivadas en el medio solo) se consideraron como +, un IE de 4-8 o 2-4 con una concentración de 1 ug o menor se calificó como ++ y un IE mayor de 8 se consideró como +++. Se encontró que el antígeno de la secuencia (i) presenta un elevado IE (+++) para un donante y un menor IE (++ y +) para los otros dos donantes en ambos ensayos, de proliferación e IFN-\gamma. Estos resultados indican que estos antígenos son capaces de inducir la proliferación y/o de producir interferón-\gamma.

Ejemplo 2 Uso de sueros de pacientes para aislar antígenos de M. tuberculosis

Este ejemplo ilustra el aislamiento de antígenos a partir de lisados de M. tuberculosis realizando la detección con suero de individuos infectados con M. tuberculosis.

Se agregó H37Ra desecado de M. tuberculosis (Difco Laboratories) a una solución de NP40 al 2%, y en forma alternada se homogeneizó y sonicó tres veces. La suspensión resultante se centrifugó a 13.000 rpm en tubos de microcentrífuga y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrones. El filtrado se combinó con perlas de Macro Prep DEAE (BioRad, Hércules, CA). Las perlas se lavaron de modo extensivo con Tris 20 mM pH 7,5 y se eluyeron las proteínas unidas con NaCl 1M. El NaCl 1M eluído se dializó hasta el día siguiente contra Tris 10 mM, pH 7,5. La solución dializada se trató con DNasa y RNasa a 0,05 mg/ml durante 30 min. a temperatura ambiente y luego con \alpha-D-manosidasa, 0,5 U/mg a un valor de pH 4,5 durante 3-4 horas a temperatura ambiente. Luego de volver a un valor de pH 7,5, el material se fraccionó a través de FPLC sobre una columna Bio Scale-Q-20 (BioRad). Se combinaron las fracciones en nueve pools, se concentraron en una Centriprep 10 (Amicon, Beverley, MA) y luego se seleccionaron por transferencia Western respecto de la actividad serológica utilizando un pool sérico de pacientes infectados con M. tuberculosis que no fue inmunorreactivo con otros antígenos de la presente invención.

La fracción más reactiva se corrió en SDS-PAGE y se transfirió a PVDF. Se cortó una banda de aproximadamente 85 Kd dando la secuencia:

(m)

Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val; (SEC ID Nº 137)

donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

Al comparar esta secuencia con las del banco de genes descritos previamente, no se revelaron homologías significativas con secuencias conocidas.

Ejemplo 3 Preparación de secuencias de ADN que codifican antígenos de M. tuberculosis

Este ejemplo ilustra la preparación de secuencias de ADN que codifican antígenos de M. tuberculosis al analizar una biblioteca de expresión de M. tuberculosis con suero obtenido de pacientes infectados con M. tuberculosis, o con anti-sueros empleados contra antígenos solubles de M. tuberculosis.

A. Preparación de antígenos solubles de M. tuberculosis usando anti-sueros de conejo

Se aisló ADN genómico de la cepa H37Ra de M. tuberculosis. El ADN se cortó al azar y se utilizó para construir una biblioteca de expresión utilizando el sistema de expresión Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA). Se generaron anti-sueros de conejo contra proteínas secretoras de las cepas H37Ra, H37Rv y Erdman de M. tuberculosis al inmunizar un conejo con sobrenadante concentrado de los cultivos de M. tuberculosis. Específicamente, el conejo en primer lugar se inmunizó en forma subcutánea con 200 ug de antígeno de proteína en un volumen total de 2 ml que contenía 10 ug de dipéptido de muramilo (Calbiochem, La Jolla, CA) y 1 ml de adyuvante de Freund incompleto. Cuatro semanas más tarde el conejo fue reforzado por vía subcutánea con 100 ug de antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Finalmente, se inmunizó el conejo por vía endovenosa cuatro semanas más tarde con 50 ug de antígeno de proteína. Los anti-sueros se usaron para analizar la biblioteca de expresión, tal como se describió en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Se purificaron placas de bacteriófagos que expresan antígenos inmunorreactivos. Se rescató el fagémido de las placas y se dedujeron las secuencias nucleotídicas de los clones de M. tuberculosis.

Se purificaron treinta y dos clones. De éstos, 25 representan secuencias que no habían sido previamente identificados en M. tuberculosis humano. Se expresaron los antígenos recombinantes y se utilizaron antígenos purificados en los análisis inmunológicos que se describieron en el Ejemplo 1. Las proteínas se indujeron por IPTG y se purificaron mediante elución con gel, como se describe en Skeiky et al., J. Exp. Med. 181: 1527-1537, 1995. Se proveyeron secuencias representativas de moléculas de ADN identificadas en esta selección en las SEC ID Nos. 1-25. Las correspondientes secuencias de aminoácidos predichas se muestran en la SEC ID Nº 63-87.

Al comparar estas secuencias con secuencias conocidas el banco de genes usando las bases de datos que se describieron previamente, se encontró que los clones, que se denominan de aquí en adelante TbRA2A, TbRA16, TbRA18, y TbRA29 (SEC ID Nº 76, 68, 70, 75) muestran cierta homología con las secuencias que se identificaron previamente en Mycobacterium leprae pero no en M. tuberculosis. Se habían identificado previamente TbRA11, TbRA26, TbRA28 y TbDPEP (SEC ID Nº 65, 73, 74, 53) en M. tuberculosis. No se encontraron homologías significativas con TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRA13, TbRA17, TbRa19, TbRA29, TbRA32, TbRA36 y los clones superpuestos TbRA35 y TbRA12 (SEC ID Nº 63, 77, 81, 82, 64, 67, 69, 71, 75, 78, 80, 79, 66). El clon TbRa24 se superpone con el clon TbRa29.

Los resultados de los ensayos de proliferación de PBMC y de interferón-\gamma realizados en antígenos recombinantes representativos, y utilizando preparaciones de células T de varios pacientes diferentes inmunes a M. tuberculosis, se presentan en las Tablas 2 y 3 respectivamente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2 Resultados de la proliferación de PBMC para antígenos solubles representativos

1

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TABLA 3 Resultados de producción de interferón-\gamma en PBMC para antígenos solubles representativos

2

3

En las Tablas 2 y 3, las respuestas que dieron un índice de estimulación (IE) que varía entre 1,2 y 2 (en comparación con células cultivadas en el medio solo) se consideraron como \pm, un IE de 2-4 se consideró como +, así como un IE de 4-8 o 2-4 a una concentración de 1 ug o menor se consideró como ++ y un IE mayor que 8 se consideró como +++. Además, el efecto de la concentración sobre la proliferación y la producción de interferón-\gamma se muestra para dos de los antígenos anteriores en la Figura adjunta. Para ambas, la proliferación y la producción de interferón-\gamma, se calificó a TbRa3 como ++ y a TbRa9 como +.

Estos resultados indican que estos antígenos solubles pueden inducir la proliferación y/o la producción de interferón-\gamma en células T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis.

B. Uso de sueros de pacientes para identificar secuencias de ADN que codifican antígenos de M. tuberculosis

Se analizó una biblioteca de ADN genómico que se describió previamente y una biblioteca de H37Rv adicional, usando pools de sueros obtenidos de pacientes con tuberculosis activa. A fin de preparar la biblioteca H37Rv, se aisló la cepa H37Rv de ADN genómico de M. tuberculosis, se sometió a la digestión parcial de Sau3A y se utilizó para construir una biblioteca de expresión utilizando el sistema de expresión Lambda Zap (Stratagene, La Jolla, Ca). Se utilizaron para la selección de la expresión, tres diferentes pools de sueros, donde cada uno contenía sueros obtenidos de tres individuos con enfermedad pulmonar o pleural activa. Los pools se denominaron TbL, TbM y TbH, con respecto a la reactividad relativa con el lisado H37Ra (o sea, TbL = reactividad baja, TbM = reactividad media y TbH = reactividad alta) en ambos formatos: ELISA e inmunotransferencia. Asimismo se empleó un cuarto pool de sueros de siete pacientes con tuberculosis pulmonar activa. Todos los sueros carecieron de reactividad aumentada con la proteína recombinante H37Ra de unión a fosfato de 38 kD de M. tuberculosis.

Todos los pools se pre-adsorbieron con lisado de E. coli y se usaron para analizar las bibliotecas de expresión H37Ra y H37Rv, como se describió en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Se purificaron las placas de bacteriófagos que expresan antígenos inmunorreactivos. Se rescató el fagémido de estas placas y se dedujeron las secuencias nucleotídicas de los clones de M. tuberculosis.

Se purificaron treinta y dos clones. De éstos, 31 representaban secuencias que no habían sido previamente identificadas en M. tuberculosis humano. Las secuencias representativas de las moléculas de ADN identificadas se proveen en la SEC ID Nº 26-51 y 105. De éstas, TbH-8 y TbH-8-2 (SEC ID Nº 105) son secuencias no contiguas de ADN del mismo clon, y TbH-4 (SEC ID Nº 43) y TbH-4-FWD (SEC ID Nº 44) son secuencias no contiguas del mismo clon. Se muestran las secuencias de aminoácidos para los antígenos identificados de aquí en adelante como Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9, y TbH-12, en las SEC ID Nº 88-92. Al comparar estas secuencias con secuencias conocidas en el banco de genes usando las bases de datos que se identificaron previamente, no se revelaron homologías significativas con TbH-4, TbH-8, TbH-9 y TbM-3, aunque se encontraron leves homologías con TbH-9. Se encontró que TbH-12 es homóloga con una proteína antigénica de 34 kD identificada previamente en M. paratuberculosis (Ace. Nº S28515). Se encontró que Tb38-1 se ubica 34 pares de bases corriente arriba del marco de lectura abierto para el antígeno ESAT-6 que se identificó previamente en M. bovis (Ace. Nº U34848) y en M. tuberculosis (Sorensen et al., Infec. Immun 63:1710-1717, 1995).

Las sondas derivadas de Tb38-1 y TbH-9, ambas aisladas de una biblioteca de H37Ra, se utilizaron para identificar clones en una biblioteca de H37Rv. Tb38-1 hibridizó con Tb38-lF2, Tb38-1F3, Tb38-1F5 y Tb38-1F6 (SEC ID Nº 112, 113, 116, 118, y 119). (Las SEC ID Nº 112 y 113 son secuencias no contiguas del clon Tb38-1F2.) Se dedujeron dos marcos de lectura abiertos en Tb38-1F2; uno corresponde a Tb37FL (SEC ID Nº 114), el segundo, una secuencia parcial, puede ser la homóloga de Tb38-1 y se denomina Tb38-IN (SEC ID Nº 115). La secuencia de aminoácidos deducida de Tb38-1F3 se presenta en la SEC ID Nº 117. Una muestra de TbH-9 identificó tres clones en la biblioteca H37Rv: TbH-9-FL (SEC ID Nº 106), que puede ser la homóloga de TbH-9 (R37Ra), TbH-9-1 (SEC ID Nº 108), y TbH-9-4 (SEC ID Nº 110), todas las cuales son secuencias sumamente relacionadas con TbH-9. Las secuencias de aminoácidos deducidas para estos tres clones, se presentan en las SEC ID Nº 107, 109 y 111.

Los resultados de los ensayos de células T obtenidos con Tb38-1, ESAT-6 y otros antígenos recombinantes representativos se presentan respectivamente en las Tablas 4A, B y 5, a continuación:

TABLA 4A Resultados de la proliferación de PBMC para antígenos representativos

4

TABLA 4B Resultados de la producción interferon-\gamma en PBMC para antígenos representativos

5

TABLA 5 Resumen de respuestas de células t a antígenos representativos

6

7

Estos resultados indican que ambos, los antígenos de M. tuberculosis de la invención y ESAT-6, pueden inducir la proliferación y/o la producción de interferón-\gamma en células T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis. Según el mejor conocimiento de los autores de la invención, no se ha demostrado previamente que ESAT-6 estimule las respuestas inmunes humana.

Se construyó un conjunto de seis péptidos superpuestos que cubren la secuencia de aminoácidos del antígeno Tb38-1 usando el método que se describió en el Ejemplo 4. Las secuencias de estos péptidos, a las que se denomina en adelante pep1-6, se brindan en la SEC ID Nº 93-98, respectivamente. Los resultados de los ensayos de células T utilizando estos péptidos, se muestran en las Tablas 6 y 7. Estos resultados confirman la existencia y ayudan a localizar los epítopes de células T dentro de Tb38-1 con la capacidad de inducir la proliferación y la producción de interferón-\gamma en células T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis.

TABLA 6 Resultados de la proliferación de pbmc para antígenos TB38-1

8

TABLA 7 Resultados de la producción de interferon-\gamma en pbmc para antígenos TB38-1

9

Ejemplo 4 Purificación y caracterización de un polipéptido a partir de un derivado de proteína purificada de tuberculina

Se aisló un polipéptido de M. tuberculosis del derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD) del siguiente modo.

Se preparó PPD tal como se publica con leves modificaciones (Seibert, F. et al., Tuberculin purified protein derivative. Preparation and analyses of a large quantity for standard. The American Review de Tuberculosis 44:9-25, 1941).

Se cultivó la cepa Rv de M. tuberculosis durante 6 semanas en un medio sintético en frascos rodantes a 37ºC. Luego se calentaron a 100ºC las botellas que contenían el cultivo bacteriano en vapor de agua durante 3 horas. Los cultivos se filtraron hasta esterilizarlos usando un filtro de 0,22 u y la fase líquida se concentró 20 veces utilizando una membrana de corte de 3 kD. Las proteínas se precipitaron una vez con una solución de sulfato de amonio al 50% y ocho veces con una solución de sulfato de amonio al 25%. Las proteínas resultantes (PPD) se fraccionaron mediante cromatografía líquida de fase reversa (RP-HPLC) utilizando una columna C18 (7,8 x 300 mM; Waters, Milford, MA) en un sistema de HPLC Biocad (Perseptive Biosystems. Framingham, MA). Se eluyeron las fracciones de la columna con un gradiente lineal a partir de 0-100% de solución reguladora (0,1% de TFA en acetonitrilo). El caudal fue de 10 ml/minuto y el eluyente se monitoreó a 214 nn y 280 nn.

Se recolectaron seis fracciones, se secaron, se suspendieron en PBS y se ensayaron en forma individual en cobayos infectados con M. tuberculosis para la inducción de la reacción de hipersensiblidad de tipo retardado (DTH). Se encontró que una fracción induce una fuerte reacción DTH y se fraccionó posteriormente mediante RP-HPLC en una columna C18 Vydac microperforada (Cat. Nº 218TP5115) en un HPLC modelo 172 de Perkin Elmer/Applied Biosystems Division. Las fracciones se eluyeron con un gradiente lineal a partir de solución reguladora 5-100% (0,05% TFA en acetonitrilo) con un caudal de 80 ul/minuto. El eluyente se monitoreó a 215 nm. Se recolectaron ocho fracciones y se controlaron respecto de la inducción de DTH en cobayos infectados con M. tuberculosis. Se encontró que una fracción induce una fuerte reacción DTH de aproximadamente 16 mm de induración. Las otras fracciones no inducen una DTH detectable. La fracción positiva fue sometida a electroforesis en gel de SDS-PAGE y se encontró que contiene una única banda de proteína de un peso molecular aproximado de 12 kD.

Este polipéptido, al que se denomina en adelante DPPD, se secuenció a partir del extremo amino terminal utilizando un secuenciador de proteínas de Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Procise 492, como se describió previamente y demostró tener la secuencia N-terminal que se muestra en la SEC ID Nº 129. La comparación de esta secuencia con secuencias conocidas del banco de genes, tal como se describió previamente, no reveló nuevas homologías. Se aislaron cuatro fragmentos de bromuro de cianógeno de DPPD y se encontró que poseen las secuencias que se muestran en SEC ID Nº 130-133.

Se ensayó la capacidad del antígeno DPPD para estimular PBMC humanas para proliferar y para producir IFN-\gamma, tal como se describió en el Ejemplo 1. Tal como se demuestra en la Tabla 8, se encontró que el DPPD estimula la proliferación y permite la producción de grandes cantidades de IFN-\gamma; más que las obtenidas mediante el PPD comercial.

TABLA 8 Resultados de los ensayos de proliferación e interferón-\gamma para DPPD

Donante de PBMC	Estimulador	Proliferación (CPM)	IFN-\gamma (DO_{450})
A	medio	1,089	0,17
	PPD (comercial)	8,394	1,29
	DPPD	13,451	2,21
B	medio	450	0,09
	PPD (comercial)	3,929	1,26
	DPPD	6,184	1,49

TABLA 8 (continuación)

Donante de PBMC	Estimulador	Proliferación (CPM)	IFN-\gamma (DO_{450})
C	medio	541	0,11
	PPD (comercial)	8,907	0,76
	DPPD	23,024	>2,70

Ejemplo 5 Síntesis de polipéptidos sintéticos

Los polipéptidos pueden sintetizarse en un sintetizador de péptidos Millipore 9050 utilizando la química FMOC con activación de HPTU (hexafluorofosfato de O-Benzotriazol-N,N,N’,N’-tetrametiluronio). Puede unirse una secuencia Gly-Cys-Gly al extremo amino-terminal del péptido a fin de brindar un método de conjugación o marcado del péptido. La escisión de los péptidos del soporte sólido puede realizarse utilizando la siguiente mezcla de ruptura: ácido trifluoroacético:etanoditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3). Luego de escindir durante 2 horas, se puede producir la precipitación de los péptidos en metil-t-butil-éter frío. Los pellets de péptidos pueden luego disolverse en agua que contiene 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) y liofilizarse previo a la purificación mediante HPLC de fase reversa C18. Puede usarse un gradiente de 0%-60% de acetonitrilo (que contiene 0,1% de TFA) en agua (que contiene 0,1% de TFA) para eluir los péptidos. Después de la liofilización de las fracciones puras, pueden caracterizarse los péptidos utilizando espectrometría de masa por electroaspersión y mediante análisis de aminoácidos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTES: Corixa Corporation

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(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTOS Y MÉTODOS PARA INMUNOTERAPIA Y DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 117

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(iv)

DOMICILIO DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: SEED and BERRY LLP

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(B)

CALLE: 6300 Columbia Center. 701 Fifth Avenue

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(C)

CIUDAD: Seattle

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(D)

ESTADO: Washington

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(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 98104-7092

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Floppy disk

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(B)

COMPUTADORA: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-_DOS/MS-_DOS

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(D)

PROGRAMA: PetentIn Release #1.0. Version #1.30

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(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 27 de AGOSTO de 1996

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE LEGAL:

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(A)

NOMBRE: Maki. David J.

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(B)

NÚMERO DE LEGAJO: 31.392

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 210121.411PC

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: (206) 622-4900

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(B)

TELEFAX: (206) 682-6031

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 766 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

10

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:

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(A)

LONGITUD: 752 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

11

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 813 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

12

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 447 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

13

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 604 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

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14

\newpage

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 633 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

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16

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1362 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

17

\newpage

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1458 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:

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19

20

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 862 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 622 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1200 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1155 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1771 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1058 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 542 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 913 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1872 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1482 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 876 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1021 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 321 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 373 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 352 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 580 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 160 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 272 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 317 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 182 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

STRANDEONESS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 308 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 267 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 189 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 851 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 33:

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 254 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 34:

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 408 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 181 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 36:

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 290 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCCAGTGG CATGGNGGGT GTCAGTGGAA GCAT

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 155 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 39:

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGCGTTCA CGGGGCGCCG GGGACCGGGC AGCCCGGNGG GGCCGGGGGG TGG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 132 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 132 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

60

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 702 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 298 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 44:

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1058 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 327 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 170 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 127 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 81 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 149 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 50:

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 355 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 999 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 52:

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 332 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

72

73

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Val Asp Ala Val Ile Asn Thr Thr Xaa Asn Tyr Gly Gln Val}

\sac{Val Ala Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Met Lys Pro Arg Thr Gly Asp Gly Pro Leu Glu Ala Ala Lys}

\sac{Glu Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro Thr Ala Ala Ala Ala Pro Pro}

\sac{Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 187 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 63:

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 148 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 64:

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC 10 NO: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 230 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 65:

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 132 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 67:

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 163 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 68:

79

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 344 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 69:

80

81

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 485 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 70:

82

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 267 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

84

85

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 364 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

88

89

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 309 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 580 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 75:

93

94

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 233 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 76:

97

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 66 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

98

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 69 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

99

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 355 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 79:

100

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 205 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 286 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

103

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 173 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 83:

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 125 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

109

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 88 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

112

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 166 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

113

114

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ 10 NO: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ala Glu Arg Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 263 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

115

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 303 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

116

117

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{GLy Cys Gly Glu Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn}

\sac{Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID.NO: 95:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{GLy Cys Gly Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala}

\sac{Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 96:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{GLy Cys Gly Gln Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu}

\sac{Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 97:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Cys Gly Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr}

\sac{Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 98:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Cys Gly Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu}

\sac{Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 500 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 101

\vskip1.000000\baselineskip

118

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 102:

119

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 154 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 103:

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 104:

\vskip1.000000\baselineskip

121

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 282 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 105:

\vskip1.000000\baselineskip

122

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1565 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 106:

\vskip1.000000\baselineskip

123

124

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 391 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 107:

125

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 259 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 108:

127

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 109:

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1109 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 110:

129

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 341 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 111:

130

131

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1256 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 112:

132

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 432 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 113:

\vskip1.000000\baselineskip

133

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 368 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 114:

134

135

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 115:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 396 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 116:

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 117:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 80 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ 10 NO: 117:

\vskip1.000000\baselineskip

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 118:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 387 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 118:

\vskip1.000000\baselineskip

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 272 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 119:

\vskip1.000000\baselineskip

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 120:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Val Asp Ala Val Ile Asn Thr Thr Cys Asn Tyr Gly Gln Val}

\sac{Val Ala Ala Leu}

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 126:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 126:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Pro Pro}

\sac{Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 129:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 129:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Pro Asp Pro His Gln Xaa Asp Met Thr Lys Gly Tyr Tyr Pro}

\sac{Gly Gly Arg Arg Xaa Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 130:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 130:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Gly Tyr Thr Pro Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 131:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El Segundo Residuo Puede Ser Tanto una Pro como una Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 131:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Gly Phe Thr Gly Pro Gln Phe Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 132:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "El Tercer Residuo Puede Ser Tanto una Gln como una Leu"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 132:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Pro Xaa Val Thr Ala Tyr Ala Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 133:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 133:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Glu Lys Pro Phe Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 134:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 134:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Asp Ser Glu Lys Ser Ala Thr Ile Lys Val Thr Asp Ala Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 135:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 135:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gly Asp Thr Xaa Ile Tyr Ile Val Gly Asn Leu Thr Ala Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 136:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 136:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Pro Glu Ser Gly Ala Gly Leu Gly Gly Thr Val Gln Ala Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEO ID NO: 137:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 137:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Tyr Ile Ala Tyr Xaa Thr Thr Ala Gly Ile Val Pro Gly Lys Ile}

\sac{Asn Val His Leu Val}

Claims (36)

1. Un polipéptido aislado:

(i) que comprende una secuencia de aminoácidos de Mycobacterium tuberculosis de SEC ID Nº 107; o

(ii) que consiste en una porción inmunogénica de la misma.

2. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107.

3. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107.

4. Una molécula de ácido desoxirribonucleico recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107.

5. Una molécula de ácido desoxirribonucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107.

6. Una molécula de ácido desoxirribonucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 que comprende una secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 106.

7. Una molécula de ácido desoxirribonucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 que consiste en una secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 106.

8. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido desoxirribonucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

9. Una célula hospedante aislada transformada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 8.

10. La célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 9 donde la célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en E. coli, levadura y células de mamíferos.

11. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido:

(i) que comprende una secuencia de aminoácidos de Mycobacterium tuberculosis de SEC ID Nº 107; o

(ii) que consiste en una porción inmunogénica de la misma.

12. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107.

13. Un polipéptido de combinación que comprende una secuencia de aminoácidos de Mycobacterium tuberculosis SEC ID Nº 107 y una o más secuencias inmunogénicas adicionales de M. tuberculosis, que se unen a través de un enlace peptídico.

14. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido:

(i) que comprende una secuencia de aminoácidos de Mycobacterium tuberculosis de SEC ID Nº 107; o

(ii) que consiste en una porción inmunogénica de la misma; y un vehículo fisiológicamente aceptable.

15. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, donde el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

16. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido desoxirribonucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

17. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

18. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de combinación de acuerdo con la reivindicación 13 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

\newpage

19. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 para usar en la inducción de inmunidad protectora en un paciente.

20. Una vacuna que comprende un polipéptido:

(i) que comprende una secuencia de aminoácidos de Mycobacterium tuberculosis de SEC ID Nº 107; o

(ii) que consiste en una porción inmunogénica de la misma; y un intensificador no específico de la respuesta inmune.

21. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 20 donde el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107.

22. Una vacuna que comprende una molécula de ácido desoxirribonucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 y un intensificador no específico de la respuesta inmune.

23. Una vacuna que comprende una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 y un intensificador no específico de la respuesta inmune.

24. Una vacuna que comprende un polipéptido de combinación de acuerdo con la reivindicación 13 y un intensificador no específico de la respuesta inmune.

25. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, donde el intensificador no específico de la respuesta inmune es un adyuvante.

26. Uso de un polipéptido:

(i) que comprende una secuencia de aminoácidos de Mycobacterium tuberculosis de SEC ID Nº 107; o

(ii) que consiste en una porción inmunogénica de la misma;

en la fabricación de una vacuna para inducir la inmunidad protectora en un paciente.

27. Uso de acuerdo con la reivindicación 26, donde el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107.

28. Uso de un ácido desoxirribonucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, un polipéptido de combinación de acuerdo con la reivindicación 13 o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 en la fabricación de una vacuna para inducir la inmunidad protectora en un paciente.

29. Uso de un polipéptido:

(i) que comprende una secuencia de aminoácidos de Mycobacterium tuberculosis de SEC ID Nº 107; o

(ii) que consiste en una porción inmunogénica de la misma;

en la fabricación de un medio de diagnóstico para detectar tuberculosis en un paciente.

30. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, donde el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107.

31. Un equipo de diagnóstico que comprende:

(a) un polipéptido:

(i)

que comprende una secuencia de aminoácidos de Mycobacterium tuberculosis de SEC ID Nº 107; o

(ii)

que consiste en una porción inmunogénica de la misma; y

(b) un aparato apto para poner en contacto dicho polipéptido con las células dérmicas de un paciente.

32. Un equipo de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 31, que comprende:

(a) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107; y

(b) un aparato apto para poner en contacto dicho polipéptido con las células dérmicas de un paciente.

33. Un proceso para la producción de un polipéptido:

(i) que comprende una secuencia de aminoácidos de Mycobacterium tuberculosis de SEC ID Nº 107; o

(ii) que consiste en una porción inmunogénica de la misma; que comprende los pasos de:

(a)

insertar una secuencia de ADN que codifica dicho polipéptido en un vector de expresión;

(b)

transformar o transfectar una célula hospedante aislada apropiada con dicho vector de expresión; y

(c)

expresar el polipéptido en dicha célula hospedante.

34. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 33, donde el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 107.

35. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 33 o 34, donde la secuencia de ADN que codifica el polipéptido comprende una secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 106.

36. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 35, donde la secuencia de ADN que codifica el polipéptido consiste en una secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 106.